含有自由羟基(OH)或伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法

本发明涉及一种在非降解的条件下可重现地制备磺化化合物的 方法，所述方法适用于制备对分子构成有严格要求的化合物，例如在 治疗药剂中。

本发明的方法可用于所有包含自由羟基(OH)或任选取代的伯胺 或仲胺的单体、低聚和聚合化合物。本发明更具体地涉及一种用于对 聚合物进行官能化的O和N磺化方法。

在现有技术中报道的磺化化合物的制备方法中，通常在O或N磺化期间会引起聚合物链的断裂，并由此形成潜在的有毒反应残基。 本发明的方法的目的是通过在特定条件下控制磺酸根基团的加入来 精确地避免这种缺点，从而不会改变最初聚合物(例如低聚糖)的结 构完整性。

具有抗凝性能的官能化聚合物在现有技术中是已知，并且它们是 通过在葡聚糖(D)链上取代有羧甲基(CM)、甲基-苄基酰胺(B)和磺化 甲基-苄基酰胺(S)基团获得的一系列衍生物，缩写为CMDBS。这些 聚合物的制备方法具体描述在法国专利公布2 461 724以及美国专利 公布4,740,594中。这两个专利都未提供最终聚合物结构的精确分析， 并且这两种方法都不能提供证据证明最终产物是均一的。这两个专利 中所述的磺化反应的实验条件促使砜与糖苷残基的自由OH基结合， 并且所给的分析不能清楚地证实磺化苄胺基团的存在。

CMDBS家族的其它成员(“肝素结合生长因子”，HBGF)，在美 国专利公布5,693,625中被描述为结瘢剂。在其它的文献中还描述了 HBFGPP的激发肌肉组织(法国专利2 718 024)、神经组织(法国专利2 718 026)和消化道组织(法国专利2 718 023)中的损害的修复和再生的 性能及其消炎性能(法国专利2 718 025)。这些专利建立了一系列筛选 可生物相容的聚合物的功能标准，其中包括如下四种功能特性：

-保护肝素结合生长因子(HBGF)(如成纤维细胞生长因子，如 FGF1&2)或者转化因子(如抗蛋白水解降解的TGF-β)，以及在细 胞培养时在一系列试验中强化其生物活性。

-呈现低于10国际单位/mg的抗凝活性。

-在生理条件下抑制白细胞弹性蛋白酶的活性。

-在生理条件下抑制纤维蛋白溶酶的活性。

法国专利申请98 09309报道了一类呈现HBGFPP性能的聚合物 (命名为“再生剂”，RGTA)的结构，并且描述了其制备方法和性能。 这些RGTA呈现抗纤维变性效果，特别是能够改善皮肤伤痕愈合的质 量；呈现抗氧化剂效果，特别是用于治疗自由基的有害影响(电离辐 射之后或者在局部缺血引起的氧化应激期间)；以及呈现调节组织内 环境稳定性特别是骨质内环境稳定性的性能。这些性能是对前述 HBGFPP特性的补充。

法国专利98 09309中所述的聚合物如下式所示：

AaXxYy        (I)

其中：

A是单体；X代表RCOOR′基团；Y代表A上结合的O-或N-磺 化基团并且并且对应于下式之一：ROSO3R′或RNSO3R′；这些R基团 是任选支化和/或不饱和并且可以含有一个或多个芳环的脂族烃链， 所述芳环不包括不包括苄胺和磺化苄胺基团；R′代表氢原子或阳离 子；a代表单体的数量；x代表A单体被X基团取代的水平或程度； y代表A单体被Y基团取代的水平或程度。

在法国专利98 09309中所述的聚合物中，我们可以引证葡聚糖 衍生物如CMDS。CMDS型的聚合物也被描述为抗凝剂(Maiga等人， Carbohydrate Polymers，1997，32，89-93)。

在现有技术的所有这些实例中，所述的这些合成方法都不符合再 现性标准，难以确保获得保持分子完整性和没有污染物的产物。事实 上，尽管在现有技术中描述了很多羧基取代的方法，并且采用这些方 法可以控制取代以确保足够的再现性，但是磺化方法的控制较为困 难。

所述磺化方法是在非常低的pH值下进行的，它不能保持聚合物 链的完整性，特别是当该链由天然糖构成时。而且，这些磺化条件导 致脱羧作用，这是非常难控制的。

因此，现有技术中的许多研究描述了对Aa型多糖进行硫酸化的 方法。因此，例如，葡聚糖硫酸酯(或O-磺酸酯)(DS)、羧甲基葡聚糖 硫酸酯(CM-D-S)(或O-磺酸酯)和其它硫酸化(或O-磺化)低聚糖(如 木聚糖或淀粉)是通过美国专利4,814,437中所述类型的方法硫酸化 (或O-磺化)的。在这些方法中，许多专家提出了使用强酸作为磺化剂 磺化多糖方法。例如，美国专利4,740,594和4,755,379、和法国专利 2 772 382描述了用二氯甲烷(CH2Cl2)作为溶剂用氯磺酸处理来制备 CM-D-S和DM-D-B-S型的分子。在较早的研究中对这种方法已经做 了广泛的描述，这是由于氯磺酸被用于用吡啶作为碱性溶剂的DS合 成方法(Ricketts，Biochem J，51，210-133，1952)。在有甲酰胺的情况 下硫酸和磺酸也用于在低温下制备DS，如美国专利3,498,972和 3,141,014所述。已知这些强酸反应条件会使得产物部分降解，即使 在有碱性溶剂的情况下或者低温下。在为聚合物产物的情况下它们导 致大分子链的明显断裂，并且使得待磺化的分子中所含的某些官能团 部分水解。就这些强酸性条件而言已提出了许多改进，其中包括使用 更好的缓冲介质或低酸性介质。因此，与使用已经提出的硫酸和磺酸 相比，使用三氧化硫(SO3)络合物作为磺化剂降低了磺化反应的苛刻 度(Archives of Biochemistry and Biophysics，95，36-41，1961； Tetrahedron Letters，29，7，803-806，1988；J.Chem.Soc.Perkin trans.1, 157,1995)。SO3胺型的许多络合物已能商购获得，例如SO3-ME3N(三 甲胺)、SO3-Et3N(三乙胺)、SO3-吡啶和SO3-哌啶。这些试剂用于例 如DMF、甲酰胺和DMSO等溶剂的无水介质中。尽管这些方法已用 于制备硫酸化多糖，特别是用于硫酸化带有酯、醚或酰胺官能团的葡 聚糖衍生物，但是它们由于引起如下问题而存在严重缺陷：

-这些聚合物的大分子链随机断裂，尽管比磺酸磺化的断裂比例 低；

-上述聚合物上已有的官能团部分水解；和

-通过形成胺产生污染制品的副产物，活体接种实验显示这些副 产物有毒(Brain Res，16，208-2，473-478，1981)。

为了尽可能去除这些毒性剩余物，已对这些技术进行了更进一步 的改进，并且针对吡啶提出了美国专利4,814,437中所述的方法。事 实上，该方法中所用的SO3-胺与大多数多糖的还原端的醛基反应，尤 其在葡聚糖中，并且由此形成的键是共价的，因此非常牢固。

通过使用例如SO3-DMF和SO3-FA的SO3-胺型络合物克服了使 用SO3-胺络合物的缺陷。例如，通过使用甲酰胺作为溶剂，使用SO3与甲酰胺的络合物(SO3-FA)对葡聚糖进行O-磺化制得DS盐，更具体 地说是钠盐，如美国专利4,855,416中所述用。该方法包括原位形成 SO3-FA络合物，然后将其与葡聚糖反应。SO3-FA络合物的强反应性 导致反应介质的强酸性，尽管使用惰性环境(N2)和无水溶剂。这也导 致了大分子链的降解。

另一种广泛使用的非活化络合物是SO3-DMF。事实上在法国专 利2 772 382中提出了CM-D-S和CM-D-B-S型的硫酸化多糖的合成。 然而，SO3-DMF络合物，与SO3-FA络合物类似，使得反应介质为强 酸性，这样也导致了大分子链的断裂和不稳定的水解基团水解，导致 对合成和最终产物失去控制。因此在制备高分子量多阴离子聚合物 (不希望以随机、非控制的方式断裂)的情况下，这种方法没有其它方 法好。

因此希望改进法国专利97 15702中所述的制备CMDBS和 CMDS的合成方法。根据法国专利97 15702，这种改进一方面能够制 得分子量更均一的葡聚糖衍生物，另一方面能够控制取代比例，由此 确保这些结构更均一和更加确定。然而，同现有技术类似，法国专利 97 15702中所述的方法是基于使用SO3-胺(DMF、吡啶或三乙胺)来磺 化多糖，并且在所给的实例中仅使用了SO3-吡啶。而且这种方法导致 形成剩余痕量的对人有毒的吡啶，并且难以看出其能避免形成多糖链 片段。

更具体地，本发明的目的是提供新的通用磺化方法，使用该方法 能够高度精确地控制含有羟基官能团或者伯胺或仲胺官能团的化合 物上的磺化基团取代条件。

该目的是通过一种对含有一个或多个自由羟基官能团和/或一个 或多个取代或未取代的伯胺或仲胺官能团的化合物的磺化方法来实 现的，其特征在于它包括在有捕酸剂的情况下用SO3-DMF络合物来 处理所述化合物。

术语“捕酸剂”是指能够选择性地与溶液中的自由质子反应的物 质或这些物质的混合物。向反应介质中加入这种捕酸剂之后，质子被 这些捕酸剂捕获并且不再参与pH值的降低，因为它们不再具有反应 性。

所述捕酸剂例如选自：沸点低于100℃的链烯烃或链炔烃或这二 者的混合物。

所述捕酸剂有益地是丁烯如2-甲基-2-丁烯(2M2B)、2-甲基-丙烯、 2-甲基-戊烯、或其异构体或它们的混合物。

本发明的方法的特别之处在于其能够避免使用过低的pH值，并 因此避免了处理过的化合物的断裂。而且本发明还具有不加入难以除 去或者难以完全除去的有毒物质的益处。

更具体地，本发明的方法包括以下步骤：

a)在无水溶剂或共溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)或由甲酰胺和二 甲基甲酰胺组成的共溶剂中将待磺化的化合物溶解或者制成一均匀 溶液；

b)室温(20-22℃)下加入摩尔过量的可混溶于共溶剂中的捕酸 剂，例如2-甲基-2-丁烯；

c)在搅拌下快速加入SO3-DMF络合物；

d)在低于30℃的控制温度下将前面步骤中获得的混合物搅拌 1-2小时；

e)将所述混合物逐步加入到一碱性溶液，例如2％的碳酸氢钠 (NaHCO3)或另一碱的溶液中使反应停止，同时监控pH值，使其从不 低于4，以便获得磺化化合物的盐。

本发明的方法有益地包括将步骤(e)中所得的磺化化合物纯化，例 如通过相对水经超滤膜以1000道尔顿的截止阈值切向超滤(所述水满 足人体注射用水的质量要求)。

步骤(a)中所用的溶剂优选不是二甲亚砜(DMSO)，这是由于在本 发明的框架内进行的研究证实非常难从所述磺化多糖制品中除去该 溶剂，因此对其在药品中的使用构成障碍。

当待磺化的化合物不易溶于无水溶剂或共溶剂中时，本方法的一 个特定实施方式包括将所述化合物质子化以便促进其溶解。本文中我 们例如通过将待磺化的化合物通过阳离子交换柱来处理该化合物，所 述化合物是取代有一个或多个羧酸根合基团的糖聚合物，例如葡聚 糖，其质子化导致形成-COOH基团。

因此磺化条件得到很好的控制，避免了最初取代有羧基的聚合物 的脱羧。因此，优选如下的磺化条件：

将待磺化的化合物溶解于无水溶剂中(参见实施例II.1)。加入摩 尔过量的捕酸剂(例如链烯烃2M2B)。加入磺化剂(SO3)如络合物 SO3-DMF，并且该反应在低于捕酸剂的蒸发温度的温度下进行。通过 加入碱性溶液如NaHCO3使反应停止。

本发明的方法可用于单体、低聚物和聚合物。更具体地，它适合 诸如前述的HBGFPP或RGTA等的聚合物，尤其是得自葡聚糖的化 合物和苹果酸的共聚物。因此本发明特别适用于下式的聚合物：

AaXxYy        (I)

其中：

其中A是单体；X代表RCOOR′基团；Y代表相连于A上的O- 或N-磺化基团并且对应于下式之一：ROSO3R′或RNSO3R′；这些R 基团是任选支化和/或不饱和并且可以含有一个或多个芳环的脂族烃 链，所述芳环不包括苄胺和磺化苄胺基团；R′代表氢原子或阳离子； a代表单体的数量；x代表A单体被X基团取代的水平或程度；y代 表A单体被Y基团取代的水平或程度。

本发明的方法可用于制备聚合物，尤其是式(I)所示的聚合物，其 中在单体单元之间或者单体单元与其取代基之间(例如式(I)的聚合物 中的A-A或A-X键)存在由在酸性介质中不稳定的官能团(尤其是 酯、酰胺、醚、缩醛(糖苷)官能团或其它基团)形成的键。

本发明的方法因此尤其适用于制备硫酸化糖单体或低聚物，例如 某些肝素片段，或者适用于制备RGTA类的聚合物，尤其是当A是 糖苷单体时，例如在为葡聚糖-基聚合物或所有其它多糖化合物的情 况下。

下面针对实施本发明方法，通过实施例并参照附图，对本发明的 其它优点和特征作更详细的解释，其中：

-图1显示了具有末端醛基的CMDS分子。就值x和y不是0 的CMDS而言，有三种Z单元：a)醛或半缩醛，b)羧甲基糖苷和 c)磺酸酯基糖苷。

-图2代表取代的葡聚糖的末端单元的醛官能团和半缩醛之间的 转化平衡。端基异构位置的取代单元不参与该平衡。

-图3代表具有表3中所述结构特征的CMDS型分子的色谱图。

-图4显示了相同产物PA 07在不同凝胶过滤柱上获得的色谱 图。

-图5显示了CMDS的结构。

这些实施例还包括将本发明的方法与现有技术的方法进行比较， 尤其是对于得自葡聚糖的聚合物(如CMDS或CMDBS)的磺化。通 过比较发现法国专利FR 97 15702和FR 99 07636中提出的方案不能 很好地保持葡聚糖聚合物分子的完整性，因为它们产生可以通过简单 方法检测和定量的片段，并且会使接枝在大分子链上的基团发生水 解。

I-磺化的评价

I.1-羧基和磺化基团的测定方法

为了能够对不同的磺化方法进行比较，我们测定了单位葡萄糖中 羧基(x)和磺化基团(y)的取代度(ds)。葡聚糖是葡萄糖聚合物，它在每 个葡萄单元上有3个反应性OH基团。因此理论最大值是3。通过滴 定分析法和根据现有技术中描述的常规方法的元素分析进行定量测 定。

滴定分析测定结合元素分析能够确定羧甲基醚(x)和磺酸根合(y) 基团的总取代比例(x和y)。

I.2-取代基团的位置的测定

为了确定接枝于糖苷单元上的基团的位置，我们在本领域专家已 知的标准条件下使用NMR(质子核磁共振)分析法(J.Biol.Chem.275， 38，29383-29390，2000)。我们使用Bruker 200-MHz核磁共振仪。

I.3-聚-糖苷链的片段的测定方法

为了确定磺化基团加成反应之前和之后的聚合物链的完整性，测 定溶液中的产物中的醛。

如图1所示，由于仅在聚合物的还原末端具有醛基，因此通过测 定醛能够确定产物的还原末端。由此测得待磺化的产物上的醛基的数 量。在此该数值等于每克产物1微摩尔醛。如果在反应期间不发生断 裂的话，该值在所有情况下都保持低于或等于最初产物的值。

事实上，磺化反应之后测定的醛值低于加入磺化基团之前测定的 值(对0.5mmol/g的CMDS而言为1.0μmol/g)。对x＝0.5且y＝1.25 的CMDS产物通常发现的自由醛值接近0.4微摩尔醛/克产物。相反， 如果该数值超过最初值(1.0)，那么必定形成了断裂。

由于每一链断裂产生一个新的可测定的反应醛，因此这种方法能 够测定片段的形成。

I.4-分子量的测定方法和制品表观均匀性的研究方法

分子量的测定是通过高效空间排阻色谱法于0.1M NaNO3中在 KB-804和KB-805过滤凝胶(Shodex Japon)串联柱上以0.7ml/min进 行的。在柱出口使用Dawn光散射微型检测器和RID 10型折射计测 定产物(J.Biol.Chem.275，38，29383-29390，2000)。制品的均匀性是由 分子量的分布曲线和峰宽度的量度(在半高)以及通过测定曲线的对称 性来反映的。

二级HPLC-凝胶过滤工艺可以根据分子量分布得出分子均一性。 图3中显示了所得的高斯分布。

色谱条件是：柱：TSKgelG4000PWX(TOSOHAAS)，30℃下， 7.8mm ID×30cm；流动相：NaCl0.3M；流速：0.7ml/min；测定： IR0.06。

对于采用所述工艺使用SO3-胺络合物合成的产物而言，发现制 品的均匀性随所用的色谱系统而变化。

当通过Shodex柱分离产物时，峰不对称，但是当使用二级色谱 分离系统时，相应于相同产物的峰显示是对称的，如图4所示。这说 明这些制品以及现有技术的制品中分子量分散的均匀性与所用分离 系统有关。

 II-使用本发明方法的羧甲基葡聚糖的O-磺化的实例以及与现有技 术的比较

下面实施例中描述了通过使用诸如氯磺酸的试剂、或者使用SO3- 胺络合物、使用SO3-DMF络合物、和在有捕酸剂2-甲基-2-丁烯的情 况下使用SO3-DMF络合物(SO3-DMF/2M2B)(本发明方案)来进行 不同的O-磺化反应。

为了进行对比，选用羧甲基葡聚糖作为最初聚合物。

II.1-在有捕酸剂的情况下与络合物SO3-DMF/2-甲基-2-丁烯的反应

在500-ml烧瓶中，将5g酸式羧甲基葡聚糖(CMDH+)(24.27mmol) 溶解在40ml的甲酰胺中，然后在搅拌下加入40ml的2-甲基-2-丁烯 (25当量)。加入7.90g的SO3-DMF(5当量/单位葡聚糖)。在30℃、 搅拌下将反应进行2小时。

通过将反应介质慢慢倒入200ml 2％的NaHCO3中使反应停止。 其pH必需接近7。如果不是这种情况，加入苏打或HCl将该溶液中 和。在任何情况下溶液的pH值必需不低于5，以避免产物降解。

在减压下通过旋转蒸发去除过量的水、DMF和2M2B之后，产 物经过切向超滤来纯化，然后冷冻干燥。获得6g磺化产物白色粉末。

下表1显示了对CMDH+(x＝0.52)的O-磺化的再现性，其中每单 位葡萄糖用5当量SO3-DMF和25当量2M2B。测定由相同CMD制 得的产物的平均偏差(MD)百分比。

                                       表1 磺化前 的(x) 磺化后的COO-(以mEq/g 计)(x)|平均偏差％ SO3-(以mEq/g 计)(y)|平均偏差％ 醛(以μmol/g计)| 平均偏差％  10.52     1.58(0.53)| 2   3.82(1.28)| 5     0.35| 5  20.52     1.54(0.50)| 1   3.76(1.25)| 1     0.49| 3  30.52     1.57(0.52)| 1   3.79(1.26)| 1     0.55| 3  40.52     1.52(0.48)| 2   3.64(1.17)| 1     0.60| 8

下表2显示了作为试剂SO3-DMF/2M2B(1∶5)的量的函数的 CMDH+的O-磺化。

                            表2   SO3/DMF(2M2B)当量/葡萄糖单元     取代度(ds)     x       y     0.0     0.50    -     2.0(10.0)     0.49    0.42     2.5(12.5)     0.52    0.89     3.0(15.0)     0.52    1.00     4.0(20.0)     0.49    1.10     5.0(25.0)     0.52    1.20

根据该方案进行10个独立的操作：5个严格地按照与表1第1-4 项相同的方案进行，其中使用5当量的SO3-DMF和25当量的2M2B。 在进行另外5个操作时，将试剂SO3-DMF/2M2B的量在2-5当量试 剂/葡萄糖单位之间变化。SO3-DMF与2M2B之比保持恒定，为1∶5(表 2，第1-5项)。

结果显示该方法可再现地制备具有醚基和糖苷键的产物。

在所有情况下，平均偏差(MD)百分比低于10％的最大限度。

应注意到，(x)没有显著变化(MD＜2％)(没有脱羧作用)并且 (y)＜3％。

分子量测定证实没有出现不均一的情况(图3对应于表1第4项 中所述的产物)MW＝67500+/-7500。

所得结果证实在有2M2B的情况下，所得磺化比例是反应的化学 计量比的函数。而且，反应条件不影响前面接枝于CMD上的羧乙基 醚基的水平。

II.2-通过质子的NMR分析确定分子

使用包括滴定分析定量测定、元素分析、还原糖定量分析和 HPLC/凝胶上过滤结合MALLS测定并补充1H NMR光谱的分析技术 分析合成的产物。

1H NMR光谱法为我们提供了不同基团在最初葡聚糖的糖苷单 元的C-2、C-3和C-4三个反应性羟基上的取代位置以及取代速率之 比。下表3显示了在实例CM-D-S型葡聚糖中通过NMR分析得出的 X和Y在A上的取代位置。

                                           表3

                                基团的位置和以ds计的取代度   聚合   物     ds     X     Y   分子   量   X   Y   OH   C2    C3+C4  C2  C3+C4  CMDS   0.50±   0.4  1.20  ±0.4   1.30±   0.4   0.35    0.15  0.52   0.68   67,000±   5,000

d.s：各基团在每个葡萄糖单元(A)上的取代度。X＝CM；CH2COONa；Y＝ SO3Na。

OH：表示没有与单体A反应的OH基数。

d.s.是由没有被取代的剩余羟基计算得到的(每个葡萄糖A单体 中自由OH的最初值是3；(n＝3))。

C3+C4：在位置C-3和C-4的总取代，以X、Y和自由OH基计 算，为总d.s.与C-2位测定的d.s.之差。

III-与现有技术相比

III.1-使用氯磺酸的O-磺化。与ClSO3H反应

将5g羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1当量/葡萄糖单元)加入到162 ml二氯甲烷中。获得一不均匀混合物。将该混合物剧烈搅拌以获得 产物在二氯甲烷中的均匀悬液。

将1.5mL氯磺酸(24.27mmol，1当量/葡萄糖单元)缓慢加入到该 混合物中。将该反应介质持续搅拌2小时。反应期间形成棕色的产物 聚集体。将该混合物过滤(在4号多孔玻璃漏斗上)并且回收的产物用 100ml二氯甲烷洗涤2次，用100ml二氯甲烷/二噁烷(1∶1)混合物洗 涤3次，并用100ml二噁烷洗涤最后一次。将所得产物溶解在200ml 蒸馏水中并通过加入2M的苏打使溶液的pH上升至9.5，然后加入 0.05mol/l的HCl使溶液的pH为7。

将溶液过滤，浓缩并经500ml甲醇沉淀。然后在烘箱中将最终 沉淀物干燥，之后纯化。

按照本方案进行3个独立的操作：

一个是在室温下用1当量的氯磺酸。

一个是在室温下用2当量的氯磺酸。

一个是在4℃下用2当量的氯磺酸。

III.2-与SO3-胺和酰胺络合物的反应

使用以SO3为基础的不同络合物：SO3-吡啶、SO3-三甲胺、SO3- 三乙胺和SO3-DMF(二甲基甲酰胺)实施上面概括的方案。

下表4显示了通过使用SO3的不同络合物进行CMD的O-磺化 (d.s.C＝0.56)获得的产物的结构和生理特性。

在500ml烧瓶中，将5g的羧甲基葡聚糖(24.27mmol，1当量/ 葡萄糖单元)溶解在50ml的甲酰胺中。为了加速该羧甲基葡聚糖的溶 解，将反应介质的温度升高至50℃。一旦产物溶解之后，使溶液回 到室温。为了进行每一反应，在50ml的甲酰胺中单独地制备下表4 所示的含有每一络合物的溶液，并在搅拌下加入羧甲基葡聚糖。反应 在室温下进行2小时。

加入2升4℃下的蒸馏水使反应停止。进行混合并通过加入2M 的NaOH溶液使介质的pH升至7.5-8。

在减压下旋转蒸发除去过量水之后，通过切向超滤将产物纯化， 然后冷冻干燥。获得6g白色粉末形式的硫酸化产物。

按照该方案进行4个独立的操作：

一个是室温下用2当量的SO3-吡啶络合物；

一个是在室温下用2当量的SO3-三甲胺络合物；

一个是在室温下用2当量的SO3-三乙胺络合物；

一个是在室温下用2当量的SO3-DMF络合物。

另外，严格按照法国专利FR 97 15702的实施例5中所述的方法 进行反应(表4第8行)，其中通过形成三甲基铵盐来溶解CMD。将 SO3-吡啶络合物以0.4倍的自由OH基的量(相当于2当量的络合物/ 葡萄糖单元)溶解在DMSO中并加入到聚合物溶液中。该反应在二甲 基甲酰胺中于室温下进行。

表4显示了按照不同方法合成不同的CMDS型聚合物的结构特 征。本发明的方法相应于表4的第10和11项，并且所用条件描述于

实施例1中。

                                            表4     磺化反应 反应条件   x      y 末端醛 (μmol/g) 活性 (体内) 毒性 (体内) 1 -    -  0.56   0.0     1.00   (-)   (-) 2 ClSO3H  1 eq/22℃  0.41   0.22     12.7   可变   可变 3 ClSO3H  2 eq/22℃  0.37   0.35     11.0   可变   可变 4 ClSO3H  2 eq/4℃  0.51   0.35     4.0   可变   可变 5 SO3-Me3N  2 eq/22℃  0.50   0.00     1.9   (+)   (+) 6 SO3-Et3N  2 eq/22℃  0.29   0.40     1.6   (+)   (+) 7 SO3-吡啶  2 eq/22℃  0.44   0.17     1.8   (+)   (+) 8 SO3-吡啶  2 eq/22℃  1.00* 0.35     1.9   (-)   (-) 9 SO3-DMF  2 eq/22℃  0.37   0.23     1.5   n.d.   n.d. 10 SO3-DMF/2M2B  2 eq/22℃  0.57   0.62     0.8   (+)   (-) 11 SO3-DMF/2M2B  5 eq/22℃  0.55   1.15     0.5   (+)   (-)

n.d.＝未检出

*本试验的最初产物是在CM中以1残基/葡萄糖单元的量取代 的。

DCS型的不同产物是由单批次的羧基化葡聚糖(表4，第1项)以 x＝0.56的羧酸根合的取代度进行合成的。在纯化之后，产物通过不 同结构分析技术表征。

滴定分析结果显示，使用氯磺酸和SO3-酰胺或胺络合物的O-磺 化反应导致接枝羧基的醚键断开(dsC或x)和大分子链的降解(分子量 和还原糖的定量测定)。该断开随着加入试剂的当量数的增加而更加 显著。降低反应介质的温度可以抑制该降解。

应注意的是，使用络合物SO3-Et3N(表4，第6项)制得的产物是 磺化最充分的产物，而且也是脱羧作用最严重的产物。这种趋势由其 它产物得到证实。

该表的最后两项(第10和11项)使用起捕酸剂作用的2M2B以限 制接枝的羧酸根合基团的醚键和大分子链的降解和主链的降解。

应注意的是，在有2M2B的情况下，磺化之后获得的产物的dsC 与前体的dsC相同。这与试剂的加入量无关。事实上，用2.5倍以上 的络合物SO3-DMF(第11项)，我们获得更高dsS，但是毕竟dsC没 有改变。由此证实了使用2M2B的方案的效果。

然而就目前已知的O-磺化技术而言，存在脱羧作用和大分子链 的降解，在有2M2B的情况下的O-磺化技术使其能够解决接枝在葡 聚糖上的羧酸根合基团损失的问题。

体内活性以及体内毒性的测定是在成年大鼠的后爪趾长伸肌的 肌肉再生模型上进行的，在破碎之后按照Gautron J.、Kedzia C.、 Husmann I.和Barritault D的“葡聚糖衍生物对成年大鼠骨骼肌再生的 促进作用”，C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de la Vie(1995)， 318：671-676中所述的试验条件来进行。该再生是通过在组织学部分 通过测定再生肌肉纤维的量来定量的。通过纤维形成的减少(与注入 生理血清的对照相比)以及通过分析再生的外观并揭示再生的异常区 或者形成异常区或者形成炎症区显示肌肉组织退化来测定其毒性。

IV-本发明方法在其它类型的聚合物合成中的推广应用

表5显示了使用本发明的方法对式AaXxYy所示的各种聚合物的 合成以及所述聚合物的分析特性，其中A是糖，并且a大于1。

                               表5   最初产品dsC   规模   dsS   dsC   末端醛   (μmol/g)   1 葡聚糖(D)     2g   1.19   -   0.15   2 D     2g   1.24   -   0.15   3 CM50-D     2g   1.22   0.5   0.20   4 CM50-纤维素(C)     2g   1.23   0.5   0.20   5 CM50-D     10g   1.17   0.5   0.20   6 CM50-C     10g   1.22   0.5   0.20   7 CM60-B60-D     50g   1.24   0.5   0.20   8 CM60-B20-C     10g   1.23   0.6   0.05   9 CM60-PhA60-D     10g   1.23   0.6   0.05   10 CM60-PhA60-C     10g   1.22   0.6   0.05