植物来源“汤剂体”的提取和“本草体”的人工制备及其相关产品 |
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| 申请号 | CN201980023065.9 | 申请日 | 2019-03-05 | 公开(公告)号 | CN111971072B | 公开(公告)日 | 2023-06-13 |
| 申请人 | 中国医学科学院基础医学研究所; | 发明人 | 蒋澄宇; 李晓芸; 杜涧超; 梁竹; 王志清; 王晨轩; | ||||
| 摘要 | 提供制备本草体的方法，包括以下步骤：将一种或多种脂质成分和/或与下列任一项或多项混合：核酸，化合物，大分子；和对所得的混合物进行加 热处理 。还提供从 植物 提取 汤剂体的方法，包括以下步骤：用 溶剂 制备所述植物的提取液；对所述提取液进行差速离心；用 水 性溶液重悬所述沉淀物，以提供汤剂体。 | ||||||
| 权利要求 | 1.制备本草体的方法，其包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 植物来源“汤剂体”的提取和“本草体”的人工制备及其相关产品 [0001] 本申请要求申请日为2018年03月29日、发明名称为“化合物或中药提取物在制备核酸递送试剂中的应用及其相关产品”、申请号为PCT/CN2018/081155的PCT发明专利申请 的优先权，该专利的全部内容通过引用并入本文。 技术领域[0002] 本发明涉及活性物质汤剂体的提取方法以及本草体人工制备方法，具体地涉及从植物药提取活性物质的方法以及本草体人工制备的方法。 背景技术[0003] 在中国传统医学研究中，将中药饮片浸泡在水中后煎煮制作成有治疗疾病效果的汤剂。之前大多数有关植物药的研究主要集中在植物药的主要化学成分的功能研究，几乎 有很少数的研究关注在植物药中的核酸分子上。 [0004] 我们之前的研究表明，中草药中存在数百万种小RNA，饮用汤剂后，在人体器官和组织中发现了数以千计的植物药小RNA(Huang et al.，2018)。我们的研究结果表明小RNA 可能是植物药的功能成分，并且植物药中小RNA的递送机制可以帮助克服目前临床上治疗 性RNAi递送的挑战。自20世纪80年代以来，针对人类基因的核酸的传递药物具有潜在的数 万亿美元的市场。自上个世纪以来，FDA批准了六种小RNA药物，包括Vitravene，Macugen，Kynamro，Exondys 51，Defitelio，Spinraza，Patisiran。然而，其递送效果并不是很好，阻碍了核酸的发展。大多数小RNA药物以形成纳米颗粒的形式通过静脉注射递送。 [0005] 根据中医理论，不同药材的功能成分进入不同的人体器官和组织，针对不同的疾病。人类基因组由大约2万个基因组成，理论上，丰富的植物药小RNA能够调节所有这些基 因。我们之前的文章证明，HJT‑sRNA‑m7可同时下调至少三种纤维化基因(Du et al.， 2017)。同时我们实验室提供了筛选和鉴定有效治疗性的小RNA的实验方法和方案。我们认 为可以为每个基因鉴定出一种或者多种植物药小RNA，并且可以通过植物药小RNA来调节人 类基因的表达。由于许多疾病涉及不平衡的基因表达，植物药小RNA的组合可能精确地针对疾病中的不平衡基因并提供潜在的治愈效果。 [0007] 本领域需要分离从植物药分离活性组合物，即外泌体样纳米颗粒的新方法以及制备所述活性组合物的新方法。 发明内容[0008] 本发明部分基于发明人的下述发现：通过溶剂制备植物药的提取液，然后差速离心可以获得植物药的活性组合物，该活性组合物在用溶剂溶解后为膜结构的纳米颗粒状物 质，优选双层膜结构的纳米颗粒状物质，可以口服使用以用于降低一系列炎性因子并且治 疗其相关疾病。另外，本发明还部分基于发明的发现：通过加热核酸，特别是小RNA和脂质可以促进核酸插入脂质层中，增加了嵌入脂质膜过程的稳定性。本发明提供了植物活性组合 物的新的提取和制备方法以及制备本草体的方法，包括将一种或多种脂质成分或/和下列 任一项或多项混合并对混合物进行加热处理：一种或多种合成或提纯的核酸、一种或多种 合成或提纯的化合物，一种或多种合成或提纯的大分子。本发明还提供了使用汤剂体或本 草体作为有效的治疗疾病的方法。 [0009] 本发明提供了以下内容： [0010] 1.本草体(bencaosome)：人工制备的具有膜结构的纳米颗粒状物质。该膜结构包括一种或多种脂质成分，其特点为来源于化学合成或化学分离提纯，包括但不限于表1或表 10所示的脂质或与之有70％及以上近似性的脂质(脂质近似性由以下方法界定：有相同母 体结构)，杂质成份低于5％；将脂质与或/和与下列任意一项或多项混合：一种或多种核酸、一种或多种化合物、一种或多种大分子。本草体是通过加热脂质与其他物质，包括一种或多种核酸、一种或多种化合物和/或一种或多种大分子制备的膜结构的纳米颗粒状物质。在本申请中，本草体也可以称为膜结构的活性组合物，优选地通过前文实施方案1‑2、5‑9或20‑ 28的方法制备的活性组合物。所述一种或多种脂质成分可以是合成或提纯的，包括但不限 于表1或表10所示的脂质；所述一种或多种核酸成分可以是合成或提纯的，包括但不限于表 8、9或表13所示的RNA；所述一种或多种化合物可以是合成或提纯的，包括但不限于表2‑表5所示的化合物；所述一种或多种大分子成分可以是合成或提纯的，包括但不限于表6或表7 所示的蛋白。制备本草体的方法，其包括以下步骤： [0011] (1)一种或多种脂质成分和下列任一项或多项混合：一种或多种核酸、一种或多种化合物和/或一种或多种大分子； [0012] 优选地，所述一种或多种脂质成分是合成或纯化的，选自表1或表10所示的脂质； [0013] (2)对所得的混合物进行加热处理， [0015] 优选地，加热时间为约0分钟‑约24小时，约5分钟‑约20小时，约10分钟‑约16小时，约30分钟‑约12小时，约1小时‑约8小时，或者约0.5小时‑约4小时，优选5‑15分钟； [0017] 优选地，所述有机溶剂包括醇类、醚类、苯类有机溶剂，优选氯仿、乙醚、甲醇、或乙醇； [0018] 优选地，所述水性溶液选自水性缓冲液、盐水溶液、有机溶剂的水溶液或水； [0019] 优选地，其中所述本草体是膜结构的纳米颗粒状物质，优选双层膜结构的纳米颗粒状物质； [0020] 优选地，其中所述本草体用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用。 [0021] 2.根据项1所述的方法，其中所述脂质是Sphinganine(d22：0)，和/或所述小RNA是PGY‑sRNA‑6或HJT‑sRNA‑m7， [0022] 其中优选地，所述Sphinganine(d22：0)以10mg/ml氯仿溶液使用， [0023] 脂质∶sRNA＝0.1‑20ug∶0.1nmol； [0024] 其中优选地，所述本草体具有小于60mV、小于50mV、小于0、‑80至‑20或‑60至‑20的Zeta电势，并且具有50‑1000、90‑300或100‑200nm的平均粒径。 [0025] 3.根据项1或2所述的方法制备的本草体，其用于下列一项或多项： [0026] (1)降低纤连蛋白和/或alpha‑SMA的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； [0027] (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨酸； [0028] (3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化，优选在TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中和博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中； [0029] (4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha； [0030] (5)降低IL‑1alpha、IL‑1b、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中； [0031] (6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎，优选治疗肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、糖尿病和痛风；和 [0032] (7)使小RNA有效进入细胞；和/或 [0033] (8)降低RELA基因表达； [0034] 优选地，所述本草体降低纤维化相关蛋白纤连蛋白和alpha‑SMA的表达，和/或降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha的表达水平。 [0035] 4.根据项3所述的本草体用于下列一项或多项的用途，或在制备用于下列一项或多项的药物中的用途，或根据项3所述的本草体用于下列一项或多项的方法： [0036] (1)降低纤连蛋白和/或alpha‑SMA的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； [0037] (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨酸； [0038] (3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化，优选在TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中和博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中； [0039] (4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha； [0040] (5)降低IL‑1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中； [0041] (6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎，优选治疗肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、糖尿病和痛风；和 [0042] (7)使小RNA有效进入细胞；和/或 [0043] (8)降低RELA基因表达； [0044] 优选地，所述本草体降低纤维化相关蛋白纤连蛋白和alpha‑SMA的表达，和/或降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha的表达水平； [0045] 优选地，所述药物用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用。 [0046] 5.有助于核酸递送的方法，其包括将核酸和表1或表10中的一种或多种脂质，优选Sphinganine(d22：0)进行加热或升温处理，加热或升温的温度范围优选为约4℃至约100 ℃，约25℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，更优选约95℃至约100℃，特别优选约80℃至约100℃，例如4℃，37℃，60℃，80℃或100℃，其中优选地，所述核酸是小核酸，优选是单链或双链的，优选地所述小核酸的长度是14‑32bp、16‑28bp或18‑24bp，优选表8、9和13中的任一种或多种小RNA，优选PGY‑sRNA‑6或HJT‑sRNA‑m7；优选地，所述核酸递送通过口服进行；优选地，所述核酸用于治疗疾病，例如炎症相关疾病以及癌症，例如胃癌或肺癌，优选用于抗炎及抗纤维化，优选用于降低炎症相关因子IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，细胞因子风暴IL‑1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑ 13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gama、RANTES或MCP‑1beta，以及降低纤维化相关蛋白纤连蛋白和α‑SMA的表达。 [0047] 6.项5所述的方法，所述方法还包括进一步混合一种或多种化合物、一种或多种核酸、和/或一种或多种大分子；其中核酸包括DNA和RNA，优选RNA，更加优选小RNA； [0048] 优选混合表2‑表5所示的一种或多种化合物、一种或多种表8和/或表9和/或表13所示的小RNA、一种或多种DNA和/或表6或7所示的一种或多种大分子。 [0049] 或者，项5所述的方法，所述方法还包括进一步混合一种或多种化合物、一种或多种DNA、和/或一种或多种大分子； [0050] 优选混合表2或4所示的一种或多种化合物、表3或5所示的一种或多种化合物、一种或多种DNA和/或表6或7所示的一种或多种大分子。 [0051] 7.项1‑6中任一项的方法，其中所述多种脂质是选自下组的脂质组合：第8号∶第41号＝6∶1的脂质组合；第38号∶第41号＝6∶1的脂质组合；第39号∶第41号＝6∶1的脂质组合；第40号∶第41号＝6∶1的脂质组合；第38∶12∶41∶29号＝1∶2∶1∶1的脂质组合；第40∶12∶41号＝2∶4∶3的脂质组合；第12∶41号＝1∶6的脂质组合；第12∶41号＝1∶1的脂质组合；第12∶41号＝6∶1的脂质组合；第40∶12∶41号＝2∶2∶2的脂质组合；第4∶12∶41号＝1∶1∶1的脂质组合；第 1∶2∶3∶19∶35号＝1∶1∶1∶1∶1的DG组合；第6∶9∶10∶13∶15∶16∶18∶20∶21∶22∶23∶24∶25∶26∶27∶28∶32∶33号＝1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的TG组合；第36∶37号＝1∶1的LPC组合； 第11∶12号＝1∶1的PC组合；第8∶38号＝1∶1的PE组合；第4∶14号＝1∶1的Cer组合；第17∶30∶ 31号＝1∶1∶1的So组合；无第5、7号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、34号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、1、2、3、19、35号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、6、9、10、13、15、 16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、32、33号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、36、37号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、11、12号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、8号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、4、14号的第1‑36号的等体积组合；无第5、7、29号的第1‑ 36号的等体积组合；脂质第1号∶第34号＝2∶1；脂质第1号∶所述DG组合＝2∶1；脂质第1号∶所述TG组合＝2∶1；脂质第1号∶所述LPC组合＝2∶1；脂质第1号∶第8号＝2∶1；脂质第1号∶第12号＝2∶1；脂质第1号∶所述Cer组合＝2∶1；脂质第1号∶So组合＝2∶1；脂质第1号∶第29号＝2∶ 1；脂质第1号∶第8号∶第12号＝1∶1∶1；脂质第8号∶第34号＝2∶1；脂质第8号∶DG组合＝2∶1； 脂质第8号∶TG组合＝2∶1；脂质第8号∶LPC组合＝2∶1；脂质第8号∶第37号＝4∶1；脂质第8号∶第12号＝2∶1；脂质第8号∶Cer细合＝2∶1；脂质第8号∶So组合＝2∶1；脂质第8号∶第31号＝6∶ 1；脂质第8号∶第29号＝2∶1；第12号∶第34号＝2∶1；第12号∶DG组合＝2∶1；第12号∶TG组合＝ 2∶1；第12号∶LPC组合＝2∶1；第12号∶脂质第8号＝2∶1；第12号∶Cer细合＝2∶1；第12号∶So组合＝2∶1；第12号∶第29号＝2∶1；第12号∶脂质第8号∶第1&2号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第15号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第36&37号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第11号＝2∶1∶ 1；第12号∶脂质第8号∶第12号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第4号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第31号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第29号＝2∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第34号＝3∶2∶ 1；第12号∶脂质第8号∶第34号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶脂质第2号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶脂质第2号＝16∶8∶3；第12号∶脂质第8号∶第32号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第 37号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第11号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第38号＝4∶2∶3；第 12号∶脂质第8号∶第4号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第31号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第29号＝4∶2∶3；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号＝2∶1∶1∶1；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第34号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶脂质第2号＝4∶2∶2∶2∶ 5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第32号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第 31号∶第11号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第37号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第38号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第4号＝4∶2∶2∶2∶5；第12号∶脂质第8号∶第29号∶第31号∶第4号∶脂质第1号∶第16号＝2∶1∶1∶3∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶脂质第1&2号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第15号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第36&37号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第12号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第4号＝2∶2∶2∶ 3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第31号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶脂质第8号∶第12号∶第29号＝2∶2∶2∶3；脂质第8号∶第34号∶脂质第1&2号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第34号∶第15号＝2∶1∶ 1；脂质第8号∶第34号∶第36&37号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第34号∶第12号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第34号∶第4号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第34号∶第31号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第34号∶第29号＝2∶1∶1；脂质第8号∶第31号∶第34号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶脂质第2号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶第37号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶第11号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶第12号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶第4号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第31号∶第29号＝12∶3∶ 5；脂质第8号∶第31号∶第32号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第34号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第 4号∶脂质第2号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第37号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第12号＝ 12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第31号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第29号＝12∶3∶5；脂质第8号∶第4号∶第32号＝12∶3∶5；第38号∶第34号＝2∶1；第38号∶脂质第1号＝2∶1；第38号∶脂质第2号＝2∶1；第38号∶第1&2号＝2∶1；第38号∶第15号＝2∶1；第38号∶第32号＝2∶1；第38号∶第37号＝2∶1；第38号∶第37号＝4∶1；第38号∶第11号＝2∶1；第38号∶第12号＝2∶1；第38号∶第11&12号＝2∶1；第38号∶第12号＝4∶1；第38号∶脂质第8号＝2∶1；第38号∶第4号＝2∶1；第 38号∶So(30)＝2∶1；第38号∶第31号＝2∶1；第38号∶第29号＝2∶1；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第34号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第15号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第37号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶脂质第8号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第4号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第31号＝2∶2∶2∶3；脂质第1号∶第38号∶第12号∶第29号＝2∶2∶2∶3；第38号∶第34号∶脂质第1号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第15号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第37号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第12号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶脂质第8号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第4号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第31号＝2∶1∶3；第38号∶第34号∶第29号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶脂质第1号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶脂质第2号＝4∶1∶3；第38号∶第12号∶第15号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶第37号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶脂质第8号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶第4号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶第31号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶第29号＝2∶1∶3；第38号∶第12号∶脂质第1号∶第15号∶第34号＝22∶22∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶脂质第1号∶第15号∶第37号＝22∶22∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶脂质第1号∶第15号∶第4号＝22∶22∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶脂质第1号∶第15号∶第31号＝22∶22∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶脂质第1号∶第15号∶第29号＝22∶22∶22∶33∶36；第38号∶第34号∶第37号∶脂质第1号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第34号∶第37号∶第15号＝44∶22∶33∶ 36；第38号∶第34号∶第37号∶第12号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第34号∶第37号∶第4号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第34号∶第37号∶第31号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第34号＝ 44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶脂质第1号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第 15号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第37号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第37号＝8∶2∶5∶3；第38号∶第12号∶第4号∶第31号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第29号＝44∶22∶33∶36；第38号∶第12号∶第4号∶第29号∶第34号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第12号∶第4号∶第29号∶脂质第1号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第12号∶第4号∶第29号∶第 15号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第12号∶第4号∶第29号∶第37号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第12号∶第4号∶第29号∶第31号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第12号∶第4号∶脂质第2号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第4号∶第6号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第4号∶第17号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第4号∶第29号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第4号∶第34号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第4号∶第37号＝20∶10∶15∶9；第38号∶第12号∶第31号∶第 34号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第12号∶第31号∶脂质第1号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第12号∶第31号∶第 15号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第12号∶第31号∶第37号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第12号∶第31号∶第4号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第12号∶第31号∶第29号＝2∶1∶3∶3；第38号∶第34号∶第37号∶第31号∶脂质第1号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第34号∶第37号∶第31号∶第15号＝88∶44∶66∶72∶135； 第38号∶第34号∶第37号∶第31号∶第12号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第34号∶第37号∶第31号∶第4号＝88∶44∶66∶72∶135；第38号∶第34号∶第37号∶第31号∶第29号＝88∶44∶66∶72∶ 135；第38号∶第37号∶第34号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶脂质第1号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶脂质第2号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第1&2号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶脂质第2号＝32∶8∶ 5；第38号∶第37号∶第32号＝32∶8∶5；第38号∶第37号∶第15号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第32号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶脂质第8号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第11号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第12号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第11&12号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第12号＝4∶1∶1；第38号∶第37号∶第4号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第30号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第31号＝4∶2∶3；第38号∶第37号∶第29号＝4∶2∶3；脂质第8号∶第37号∶第32号＝4∶1∶2；脂质第8号∶第37号∶脂质第2号＝4∶1∶2；第38号∶第37号∶第15号∶第34号＝64∶16∶10∶45；第38号∶第 37号∶第15号∶脂质第1号＝64∶16∶10∶45；第38号∶第37号∶第15号∶第12号＝64∶16∶10∶45； 第38号∶第37号∶第15号∶第4号＝64∶16∶10∶45；第38号∶第37号∶第15号∶第31号＝64∶16∶10∶45；第38号∶第37号∶第15号∶第29号＝64∶16∶10∶45；第38号∶脂质第2号∶第37号＝4∶2∶3； 第38号∶脂质第2号∶第31号＝4∶2∶3；第38号∶脂质第2号∶第29号＝4∶2∶3；第38号∶脂质第2号∶第34号＝4∶2∶3；第38号∶脂质第2号∶第32号＝4∶2∶3；第38号∶脂质第2号∶第12号＝4∶2∶ 3；第38号∶脂质第2号∶第12号＝4∶5∶1；第38号∶脂质第2号∶第4号＝4∶2∶3，脂质第1&2号、第 11&12号或第36&37号分别表示任何比例的脂质第1和2号、第11和12号或第36和37号。 [0052] 8.促进核酸与脂质形成本草体的方法，其包括加热核酸和脂质的混合物以促进嵌入脂质膜，促进脂质‑核酸复合物的稳定性，如通过临界胶束浓度测定的； [0053] 其中核酸插入脂质层或被脂质层包裹形成本草体，其是膜结构的纳米颗粒状物质，优选双层膜结构的纳米颗粒状物质； [0054] 其中优选地，加热温度为约0℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，并且更优选约80℃至100℃，特别优选为约80℃至约90℃，优选90℃； [0055] 优选地，加热时间为约0分钟‑约24小时，约5分钟‑约20小时，约10分钟‑约16小时，约15分钟‑约12小时，约1小时‑约8小时，或者约2小时‑约4小时，优选15分钟； [0056] 优选地，所述脂质是表1或表10中的一种或多种脂质，优选Sphinganine(d22：0)，或项7中的脂质组合；优选地，所述核酸是小RNA，优选表8、9和13所示的一种或多种小RNA，优选PGY‑sRNA‑6或HJT‑sRNA‑m7。 [0057] 9.脂质递送蛋白质至细胞的方法，所述方法包括加热蛋白质和脂质，其中优选地，加热温度为约0℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，并且更优选约80℃至100℃，特别优选为约80℃至约90℃，优选90℃； [0058] 优选地，加热时间为约0分钟‑约24小时，约5分钟‑约20小时，约10分钟‑约16小时，约15分钟‑约12小时，约1小时‑约8小时，或者约2小时‑约4小时，优选6小时； [0059] 或者所述脂质递送蛋白质至细胞的方法包括将蛋白质溶液与脂质的有机溶剂溶液混合(v/v＝1/5)，挥发除去有机溶剂，并且用水性试剂水化；或用水煮法制备，向蛋白质溶液中加入脂质的有机溶剂溶液，混合后进行升温处理； [0060] 或者所述脂质递送蛋白质至细胞的方法包括将蛋白质与脂质的有机溶剂溶液混合，然后除去有机溶剂，并且用水性试剂水化； [0061] 优选地，所述脂质是表1或表10中的一种或多种脂质，优选sphinganine(d22：0)或PE(16：0/16：0)或PE(16：0/22：1)。 [0062] 10.汤剂体(decoctosome)：由脂质、蛋白质、核酸和化合物等物质构成的，来源于植物汤剂中的具有热稳定性的外泌体样的膜结构的纳米颗粒状物质。在本申请中，汤剂体也可以称为膜结构的活性组合物，优选地通过前文实施方案10‑13的方法制备的活性组合 物。从植物制备汤剂体的方法，所述方法包括以下步骤： [0063] (1)用溶剂，优选地水性溶剂制备所述植物的提取液， [0064] 其中优选地通过煎煮经所述溶剂浸泡的植物制备所述植物的提取液； [0065] 其中优选地，所述煎煮是强火煎煮15‑45min，优选20‑30min，优选30min，然后文火煎煮5‑30min，优选5‑20min，优选10min； [0066] 其中优选地，所述强火的温度是90℃以上，优选90℃‑2000℃，90℃‑1500℃，90℃‑1000℃，90℃‑500℃，90℃‑300℃，90℃‑250℃或90℃‑200℃； [0067] 优选地，所述文火的温度是50℃以上，优选50℃‑2000℃，50℃‑1500℃，50℃‑1000℃，50℃‑500℃，50℃‑300℃，50℃‑250℃，50℃‑200℃，50℃‑100℃，50℃‑80℃，50℃‑70℃或50℃‑60℃； [0068] 优选地，所述水性溶剂选自水性缓冲液、盐水溶液、有机溶剂的水溶液或水； [0069] (2)对所述提取液在适当的温度，优选0‑10℃，4℃条件下进行差速离心，优选以800‑5000g，优选1000g‑4000g，优选2000‑3000g，优选2000g离心20‑40min，优选30min离心，取上清液，然后对上清液以6000g‑15000g，优选7000g‑12000g，优选8000g‑11000g，优选 10000g离心20‑40min，优选30min，取上清液，然后对上清液以100000‑200000，优选200000g离心60‑120min，优选90min，取沉淀物，所述沉淀物是所述汤剂体的固体形式；以及 [0070] (3)任选地，用水性溶液，优选水性缓冲液，优选PBS缓冲液，更优选pH7‑9，优选pH7.4的PBS缓冲液重悬所述沉淀物，以提供汤剂体，其是膜结构的纳米颗粒状物质，优选双层膜结构的纳米颗粒状物质，所述水性溶液选自水性缓冲液、盐水溶液、有机溶剂的水溶液或水。 [0071] 11.通过根据项10所述的方法，其中所述汤剂体具有30‑1,000nm，优选80‑300nm的平均粒径，且具有20‑100mV的电位绝对值。 [0072] 12.通过根据项10或11所述的方法，其中所述植物选自蒲公英、红景天、穿心莲、卷心菜和木香等。 [0073] 13.通过根据项10‑12中任一项所述的方法，其中对于蒲公英，所述汤剂体具有30‑300nm，优选150‑200nm的平均粒径峰值，且具有‑39±3mV的Zeta电势；对于红景天，所述汤剂体具有50‑300nm，优选150‑210nm的平均粒径，且具有‑37±2mV的Zeta电势； [0074] 蒲公英汤剂体具有20‑100mV的电位绝对值范围；红景天汤剂体具有20‑100mV的电位绝对值范围。 [0075] 14.通过项10‑13中任一项所述的方法制备的汤剂体，其中所述汤剂体是固体形式或液体形式或胶体形式，所述汤剂体包含膜结构的纳米颗粒状物质，优选双层膜结构的纳 米颗粒状物质。 [0076] 15.根据项14所述的汤剂体，其包含表1或表10所示的一种或多种脂质成分、一种或多种化合物、一种或多种DNA、一种或多种大分子、和/或一种或多种RNA； [0077] 优选地，所述汤剂体包含表1或表10所示的一种或多种脂质成分、表2或4所示的一种或多种化合物、表3或5所示的一种或多种化合物、表6或7所示的一种或多种大分子、和/或表8、9或13所示的一种或多种小RNA。 [0078] 16.根据项14或15所述的汤剂体，其是用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用的组合物。 [0079] 17.根据项14‑16中任一项所述的汤剂体，其用于下列一项或多项： [0080] (1)降低纤连蛋白的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； [0081] (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨酸； [0082] (3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化； [0083] (4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha； [0084] (5)降低IL‑1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中； [0085] (6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎，优选治疗肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、糖尿病和痛风；和/或 [0086] (7)降低RELA基因表达。 [0087] 18.根据项14‑16中任一项所述的汤剂体用于制备药物的用途，所述药物用于下列一项或多项： [0088] (1)降低纤连蛋白的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； [0089] (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨酸； [0090] (3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化； [0091] (4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha； [0092] (5)降低IL‑1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中； [0093] (6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎，优选肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、糖尿病和痛风； [0094] (7)降低RELA基因表达； [0095] 其中所述药物用于口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用。 [0096] 19.用于以下目的的方法，所述方法包括使用根据项14‑16中任一项所述的汤剂体： [0097] (1)降低纤连蛋白的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； [0098] (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨酸； [0099] (3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化； [0100] (4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha； [0101] (5)降低IL‑1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中； [0102] (6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎；和/或[0103] (7)降低RELA基因表达。 [0104] 在各个实施方案中，本文所述的汤剂体、本草体、药物或组合物可以通过口服、静脉内施用，如推注或通过连续灌注一段时间，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、损伤内、或吸入路径如鼻内，通常通过静脉内或皮下施用。 [0105] 在各个实施方案中，本文所述的汤剂体或本草体可以用于(1)降低纤连蛋白和/或alpha‑SMA的表达，优选TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达； (2)减少羟脯氨酸，优选肺纤维化模型中的羟脯氨酸，优选小鼠肺纤维化模型中的羟脯氨 酸；(3)用于预防或治疗纤维化，优选肺纤维化，优选在TGF‑beta1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中和博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中；(4)降低IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑ alpha，优选poly(I：C)诱导的A549细胞模型中IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha；(5)降低IL‑ 1alpha、IL‑1beta、IL‑2、IL‑3、IL‑4、IL‑5、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑12p70、IL‑13、IL‑ 17A、GM‑CSF、IFN‑gamma或MCP‑1beta的水平，优选血浆水平，优选在小鼠炎症模型中；(6)或者用于治疗IL‑1beta、IL‑6和/或TNF‑alpha相关疾病，或者用于消炎；和(7)使小RNA有效进入细胞；和/或(8)降低RELA基因表达；可以用于治疗肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤、糖尿病和痛风。 [0106] 在各个实施方案中，核酸是合成或提纯的，选自RNA和DNA，例如选自单链或双链或部分双链的RNA和DNA。 [0107] 在各个实施方案中，RNA选自：信使RNA(mRNA)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、不均一核RNA(hnRNA)、小核RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、小胞质RNA、小RNA、转移‑信使RNA(tmRNA)、端粒酶RNA和反义RNA，优选小RNA，优选表8、9或13所示的一种或多种小RNA。 [0108] 在各个实施方案中，DNA选自：互补DNA(cDNA)、叶绿体DNA、多拷贝单链DNA(msDNA)、线粒体DNA(mtDNA)和核糖体DNA(rDNA)。 [0109] 在各个实施方案中，化合物是合成或纯化的，包括小分子药物和/或表2‑5所示的一种或多种化合物。 [0110] 在各个实施方案中，大分子是合成或纯化的，选自蛋白质或抗体或多糖，和/或表6或7所示的一种或多种大分子。 [0113] 图1.植物药汤剂体的制备流程示意图。 [0114] 图2.HJT汤剂体的透射电镜结果。 [0115] 图3.PGY汤剂体的透射电镜结果。 [0116] 图4.HJT汤剂体的粒径和Zeta电势结果。 [0117] 图5.PGY汤剂体的粒径和Zeta电势结果。 [0118] 图6.HJT水煎液可降低TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达。 [0119] 图7.HJT汤剂体可降低TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白的蛋白表达。 [0120] 图8A‑C.PGY水煎液可降低poly(I：C)诱导的A549细胞炎症模型中IL‑1β/IL‑6/TNF‑αmRNA的相对表达。 [0121] 图9A‑C.PGY汤剂体可降低poly(I：C)诱导的A549细胞炎症模型中IL‑1β/IL‑6/TNF‑αmRNA的相对表达。 [0122] 图9D‑E：PGY汤剂和汤剂体可降低A549细胞炎症模型中IL‑6的蛋白表达水平。 [0123] 图9F：HJT汤剂体RNA的RNA酶A和DNA酶I的酶切结果。 [0124] 图9G：PGY汤剂体RNA的RNA酶A和DNA酶I的酶切结果。 [0125] 图10.对照MX和HJT汤剂体在小鼠肺纤维化模型中降低羟脯氨酸表达的测定结果。 [0127] 图12.对照MX和HJT汤剂体缓解小鼠肺纤维化模型中的马松染色的统计结果。 [0128] 图13.对照MX和HJT汤剂体缓解小鼠肺纤维化模型中的病理学检测结果。 [0129] 图14A‑B.对照卷心菜和PGY汤剂体降低小鼠炎症模型中的血浆中细胞因子表达的检测结果。 [0130] 图15.HJT汤剂体中的脂质鉴定结果。 [0131] 图16.PGY汤剂体中的脂质鉴定结果。 [0132] 图17.HJT汤剂体中的小分子鉴定结果。 [0133] 图18.PGY汤剂体中的小分子鉴定结果。 [0134] 图19.HJT汤剂体中的蛋白质鉴定结果。 [0135] 图20.PGY汤剂体中的蛋白质鉴定结果。 [0136] 图21.HJT汤剂体中小RNA长度分布。 [0137] 图22.PGY汤剂体中小RNA长度分布。 [0138] 图23.本草体的制备流程示意图。 [0139] 图24.RT‑PCR检测HJT‑sRNA‑m7的相对表达。 [0140] 图25.流式细胞术检测HJT‑sRNA‑m7的进入。 [0141] 图26.细胞共聚焦实验检测Cy5标记的HJT‑sRNA‑m7的进入。 [0142] 图27.蛋白免疫印迹实验检测Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7加入后降低细胞纤维化相关蛋白纤连蛋白和α‑基质蛋白(α‑SMA)的表达。 [0143] 图28.RT‑PCR实验检测不同PGY小RNA在A549细胞炎症模型中降低IL‑1β/IL‑6/TNF‑α相对表达。 [0144] 图29A‑C.RT‑PCR检测转染PGY‑sRNA‑6降低poly(I：C)刺激A549细胞后IL‑1β/IL‑6/TNF‑α的相对表达。 [0145] 图30A‑C.RT‑PCR检测转染PGY‑sRNA‑6降低poly(I：C)刺激的PBMC细胞后IL‑1β/IL‑6/TNF‑α的相对表达。 [0146] 图31.RT‑PCR检测转染PGY‑sRNA‑6降低poly(I：C)刺激的A549细胞后RELA基因的相对表达。 [0147] 图32.双荧光报告基因检测RELA为PGY‑sRNA‑6的靶基因。 [0148] 图33.PGY‑sRNA‑6在PGY水煎液和PGY汤剂体中的峰度分析。 [0149] 图34.RT‑PCR检测PGY‑sRNA‑6的相对摄取量。 [0150] 图35.流式细胞术检测PGY‑sRNA‑6的进入。 [0151] 图36.细胞共聚焦实验检测Cy3标记的PGY‑sRNA‑6的进入。 [0152] 图37A‑C.RT‑PCR检测Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6降低poly(I：C)刺激的A549细胞中IL‑1β/IL‑6/TNF‑αmRNA的相对表达。 [0153] 图38.双荧光报告基因检测Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6加入后相对荧光强度。 [0154] 图39.Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7缓解小鼠肺纤维化模型中的病理学检测结果。 [0155] 图40.Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7缓解小鼠肺纤维化模型中的马松染色结果。 [0156] 图41.Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7缓解小鼠肺纤维化模型中的马松染色统计结果。 [0157] 图42A‑G：Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6降低小鼠炎症模型血浆中的细胞因子表达含量检测结果。 [0158] 图43：通过测定1，6‑二苯基1，3，5‑己三烯(DPH)荧光发射强度对表面活性剂浓度的依赖性，显示了仅小RNA以及仅Sphinganine的临界胶束浓度(cmc)值。 [0159] 图44A‑D：在加热处理和未加热处理的情况下，本草体sphinganine(So(d22：0))+200nM或600nM sRNA的CMC性质。 [0160] 图45：比较水、So(d22：0)、So(d22：0)+200nM、400nM或600nM sRNA的静态光散射强度。 [0161] 图46：比较So(d22：0)、So(d22：0)+200nM、400nM或600nM sRNA的Zeta电位。 [0162] 图47A‑B：So(d22：0)和So(d22：0)+600nM sRNA的粒径分布。 [0163] 图47C‑D：So(d22：0)和So(d22：0)+600nM sRNA的透射电镜。 [0164] 图48：不同类别脂质组合递送单链核酸进入MRC‑5。 [0165] 图49A‑B：脂质组合递送单链核酸进入MRC‑5或Caco‑2细胞。 [0166] 图50：脂质组合递送单链核酸进入细胞。 [0167] 图51：脂质组合递送单链核酸进入细胞。 [0168] 图52：脂质组合递送单链核酸进入细胞。 [0169] 图53：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0170] 图54：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0171] 图55：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0172] 图56：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0173] 图57：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0174] 图58：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0175] 图59：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0176] 图60：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0177] 图61：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0178] 图62：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0179] 图63：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0180] 图64：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞。 [0181] 图65：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0182] 图66：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0183] 图67：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0184] 图68：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0185] 图69：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0186] 图70：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0187] 图71：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0188] 图72：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0189] 图73：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0190] 图74：脂质组合递送双链核酸进入A549细胞。 [0191] 图75：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0192] 图76：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0193] 图77：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0194] 图78：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0195] 图79：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0196] 图80：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0197] 图81：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞。 [0198] 图82：脂质组合促进核酸通过消化道进入肺。 [0199] 图83：No.8(PE)：No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞降低纤连蛋白表达。 [0200] 图84：No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导siRNA进入A549细胞抑制相应蛋白表达。 [0201] 图85：No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导siRNA进入A549细胞抑制相应蛋白表达。 [0202] 图86：No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导siRNA进入THP‑1细胞抑制相应蛋白表达。 [0203] 图87：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞降低纤连蛋白表达。 [0204] 图88：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0205] 图89：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)。 [0206] 图90：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导NFκBsiRNA进入THP‑1细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0207] 图91：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.PC(11)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [0208] 图92：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.LPC(37)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [0209] 图93：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物介导CPSF4siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [0210] 图94：No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)。 [0211] 图95：No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [0212] 图96：No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)降低纤连蛋白表达。 [0213] 图97：No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0214] 图98：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶2.5)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)降低纤连蛋白表达。 [0215] 图99：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [0216] 图100：No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)降低纤连蛋白及alpha‑基质蛋白表达。 [0217] 图101：No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0218] 图102：No.38(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [0220] 图104：No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物介导抗纤维化小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)。 [0221] 图105：No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0222] 图106：No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物介导抗纤维化小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)。 [0223] 图107：No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法)。 [0224] 图108：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。 [0225] 图109：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入MRC‑5细胞。 [0226] 图110：脂质41通过水煮法法递送单链RNA进入A549及MRC‑5细胞。 [0227] 图111：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。 [0228] 图112：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。 [0230] 图114：Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率。 [0231] 图115：脂质单体No.41介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法)。 [0232] 图116：脂质组合1(No.8+No.41＝6∶1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6∶1)在核酸递送中的作用。 [0233] 图117：脂质组合3(No.39+No.41＝6∶1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6∶1)在核酸递送中的作用。 [0234] 图118：脂质组合5(38+12+41+29＝1∶2∶1∶1)在核酸递送中的作用。 [0235] 图119：脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶4∶3)在核酸递送中的作用。 [0236] 图120：脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1∶6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1∶1)在核酸递送中的作用。 [0237] 图121：脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6∶1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶2∶2)在核酸递送中的作用。 [0238] 图122：脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1∶1∶1)在核酸递送中的作用。 [0239] 图123：脂质38通过水煮法递送双链RNA进入A549细胞及MRC‑5细胞。 [0240] 图124：脂质38通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC‑5细胞。 [0241] 图125：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。 [0242] 图126：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。 [0243] 图127：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。 [0244] 图128：脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。 [0245] 图129：流式细胞技术检测脂质递送核酸效率。 [0246] 图130：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。 [0247] 图131：脂质40在水煮法和逆向蒸发法中的递送效果。 [0248] 图132：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。 [0249] 图133：共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位。 [0250] 图134：Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率。 [0251] 图135：脂质37通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC‑5细胞。 [0252] 图136：脂质39通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。 [0253] 图137：数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率。 [0254] 图138：脂质60通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。 [0255] 图139：脂质62通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。 [0256] 图140：脂质41可以促进小RNA进入血液，保护其在血液中不被降解。 [0257] 图141：脂质41可以促进小RNA进入胃部细胞，保护其在胃中不被降解。 [0258] 图142：脂质41可以促进小RNA进入小肠细胞，保护其在小肠中不被降解。 [0259] 图143：脂质41可以促进小RNA进入肝脏，保护其在肝脏中不被降解。 [0260] 图144：PE单体(No.38)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。 [0261] 图145：PE单体(No.40)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。 [0262] 图146：PE单体(No.64)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。 [0263] 图147：PE单体(No.71)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液。 [0264] 图148：脂质在不同温度梯度有效递送单链核酸进入MRC5细胞。 [0265] 图149A‑D：流式细胞术检测PE(16：0/22：1)‑GFP(逆向挥发法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 [0266] 图150A‑H：流式细胞术检测sphinganine(d22：0)‑GFP(逆向挥发法及水煮法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 [0267] 图151A‑D：流式细胞术检测PE(16：0/16：0)‑GFP(逆向挥发法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 [0268] 图152：流式细胞术检测PE(16：0/22：1)‑GFP(逆向挥发法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 [0269] 图153：荧光共聚焦显微镜检测sphinganine(d22：0)‑GFP(逆向挥发法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 [0270] 图154：荧光共聚焦显微镜检测PE(16：0/16：0)‑GFP(逆向挥发法)在A549细胞中GFP蛋白的进入。 具体实施方式[0271] 汤剂是经过热加工过的，其主要功能成分肯定是热稳定的。我们的研究首次证明小RNA在煎剂中是一类新的功能成分。我们从汤剂中提取具有热稳定性的“汤剂体” (decoctosome)，并对其进行成分鉴定，发现“汤剂体”中含有大量的脂质，化合物，蛋白质和核酸。在我们的实验室中通过比较证明“汤剂体”比汤剂有更好的疾病治疗效果。“汤剂体”首次被我们证实可以作为一种新型药物。我们还发现单一化合物鞘氨醇可在口服给药时在 小鼠体内传递植物药小RNA，从而达到改善疾病症状的目的。我们将单一化合物鞘氨醇与小RNA混合后，经过热处理，形成“本草体”(bencaosome)。我们也首次揭示了“本草体”的制作方法。这可能是精确医学中的组合药物，而且还为核酸疗法提供了有效的口服递送途径。 [0272] 经过大量实验，本发明人意外发现，一些植物药(包括红景天、蒲公英、穿心莲及金银花)中存在一些脂质组分，这些源自植物药的脂质能够促进核酸如小RNA吸收/进入细胞和/或有此需要的对象体内靶部位。在本发明中，脂质组分是合成的。 [0273] 发明人令人惊奇地发现，多种脂质均可以形成脂质核酸复合物，有效促进核酸的细胞吸收与进入，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。进一步研究表明，在不同细胞系上本申请的脂质核酸混合物均能促进核酸吸收与进入细胞的效率，但在不同细胞系上存在 差异，这为药物靶向递送提供了可能性。而且这种脂质核酸复合物的核酸递送不具有序列 的选择性，可以递送与小RNA大小对应(比如20bp左右)的不同序列的核酸片段。此外，共聚焦激光扫描显微镜实验(Confocal laser‑scanning microscopy)证实，人工合成的脂质形成的脂质核酸混合物可以有效促进外源核酸进入细胞质。发明人意外地发现，通过水煮法 或逆向蒸发法制备的脂质核酸混合物能够促进核酸如RNA通过非侵入式(如经消化道或经 呼吸道以及表面施用)途径进入血液循环中和目标组织中。发明人还意外地发现，本申请的脂质能够促进核酸如RNA进入细胞，并调控(如抑制)其目标序列的表达，而对非目标序列则不显示出这种调控作用，显示出其目标特异性的调控作用，可作为核酸药物的递送方式。 [0274] 表1.HJT汤剂体和PGY汤剂体中的脂质 [0275] [0276] [0277] [0278] [0279] [0280] [0281] [0282] [0283] [0284] [0285] [0286] [0287] [0288] [0289] [0290] [0291] [0292] [0293] [0294] 表2.HJT汤剂体中非功能性的小分子列表 [0295] [0296] [0297] [0298] 表3.HJT汤剂体中功能性的小分子列表 [0299] [0300] [0301] 表4.PGY汤剂体中非功能性的小分子列表 [0302] [0303] [0304] [0305] 表5.PGY汤剂体中功能性的小分子列表 [0306] [0307] [0308] 表6.HJT汤剂体中的蛋白列表 [0309] [0310] [0311] [0312] 表7.PGY汤剂体中的蛋白列表 [0313] [0314] [0315] [0316] [0317] [0318] [0319] [0320] [0321] 表8.HJT汤剂体中的小RNA序列 [0322] [0323] [0324] [0325] 表9.PGY汤剂体中的小RNA序列 [0326] [0328] 表10 合成的脂质列表 [0329] [0330] [0331] [0332] 表11：脂质1‑32的描述 [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] 表12：脂质33‑71的描述 [0338] [0339] [0340] [0341] [0342] [0343] 术语定义 [0344] 汤剂体(decoctosome)：由脂质、蛋白质、核酸和化合物等物质构成的，来源于植物汤剂中的具有热稳定性的外泌体样的膜结构的纳米颗粒状物质。在本申请中，汤剂体也可以称为膜结构的活性组合物，优选地通过前文项10‑13的方法制备的活性组合物。 [0345] 本草体(bencaosome)：人工制备的具有膜结构的纳米颗粒状物质。该膜结构包括一种或多种脂质成分，其特点为来源于化学合成或化学分离提纯，包括但不限于表1或表10所示的脂质或与之有70％及以上近似性的脂质(脂质近似性由以下方法界定：有相同母体 结构)，杂质成份低于5％；将脂质与或/和与下列任意一项或多项混合：一种或多种核酸、一种或多种化合物、一种或多种大分子。本草体是通过加热脂质与其他物质，包括一种或多种核酸、一种或多种化合物和/或一种或多种大分子制备的膜结构的纳米颗粒状物质。在本申请中，本草体也可以称为膜结构的活性组合物，优选地通过前文项1‑2、5‑9或20‑28的方法制备的活性组合物。 [0346] 所述一种或多种脂质成分可以是合成或提纯的，包括但不限于表1或表10所示的脂质；所述一种或多种核酸成分可以是合成或提纯的，包括但不限于表8、9或表13所示的 RNA；所述一种或多种化合物可以是合成或提纯的，包括但不限于表2‑表5所示的化合物；所述一种或多种大分子成分可以是合成或提纯的，包括但不限于表6或表7所示的蛋白； [0347] 本申请中所述的逆向蒸发法，是指将核酸/大分子/化合物的水溶液加入到脂质有机溶剂溶液中，超声，蒸发挥除有机溶剂后，水化得到脂质与核酸/大分子/化合物的混合 物。 [0348] 本申请所述的水煮法(也称加热法)，是指将脂质的有机溶剂溶液加到核酸/大分子/化合物的水溶液中，约90℃煮15min，得到脂质与核酸/大分子/化合物的混合物；该方法并不限于水煮升温，还可以通过其它现有技术中已知的升温或加热的方式实现。 [0349] 逆向蒸发法和水煮法，在受控的温度和混合条件下进行。合适的处理时间、和温度可以由本领域技术人员容易地确定。例如，逆向蒸发法的温度的范围优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，并且更优选约40℃至约60℃，特别是约55℃。水煮法温度的范围优选约0℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，并且更优选约70℃至约90℃，特别优选为约80℃至90℃。 [0350] 本申请所述的核酸包括合成的以及提纯的DNA和RNA，优选RNA，更加优选小RNA，例如所述小RNA长度可以是14‑32bp、16‑28bp、18‑24bp，具体地其长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。 [0351] 发明人令人惊奇地发现，多种脂质均可以形成脂质‑核酸/大分子/化合物复合物，有效促进核酸的细胞吸收与进入，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。进一步研究表明，在不同细胞系上本申请的脂质核酸混合物均能促进核酸吸收与进入细胞的效率，但在 不同细胞系上存在差异，这为药物靶向递送提供了可能性。而且这种脂质核酸复合物的核 酸递送不具有序列的选择性，可以递送与小RNA大小对应(比如20bp左右)的不同序列的核 酸片段。此外，共聚焦激光扫描显微镜实验(Confocal laser‑scanning microscopy)证实，人工合成的脂质形成的脂质核酸混合物可以有效促进外源核酸进入细胞质。发明人意外地 发现，通过水煮法或逆向蒸发法制备的脂质核酸混合物能够促进核酸如小RNA通过非侵入 式(如经消化道或经呼吸道以及表面施用)途径进入血液循环中和目标组织中。发明人还意 外地发现，本申请的脂质能够促进核酸如小RNA进入细胞，并调控(如抑制)其目标序列的表达，而对非目标序列则不显示出这种调控作用，显示出其目标特异性的调控作用，可作为核酸药物的递送方式。 [0352] 本申请的脂质化合物选自溶血卵磷脂、神经酰胺、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、甘油三酯、单半乳糖甘油二酯、(神经)鞘氨醇、磷脂酰乙醇、单酰基甘油、脂肪酸、血小板活化因子、或二甲基磷脂酰乙醇胺。在一个实施方案中，脂质是非天然的，例如合成的，或者发酵生产的。 [0353] 合成或提纯的脂质可以用于将核酸/大分子/化合物递送至靶细胞中。脂质可以用于将核酸/大分子/化合物递送至有此需要的对象体内，进入其血液循环和/或目标部位/细 胞中。 [0354] 合成或提纯的脂质可以选自磷脂酰胆碱，例如1‑硬脂酰‑2‑油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(PC(18：0/18：2)，即表1中第11号脂质)，和1‑棕榈酰‑2‑油酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(PC(16：0/18：2)，即表1中第12号脂质)。这两种磷脂酰胆碱(phosphocholine，PC)能够高效地包裹核酸或促进核酸进入细胞。脂质可以是表1中的第41号脂质，即二氢神经鞘氨醇(d22：0)，其能够高效地包裹核酸或促进核酸进入细胞。 [0355] 本申请提供组合物，其包含本文所述的脂质和核酸、大分子、化合物，优选地所述核酸为小RNA。 [0356] 可以将组合物配制成供非侵入式施用(如表面施用)和/或注射施用，例如配制成供经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。在一些情况下，优选使用侵入式施用途径(如注射施用，包括肌肉注射、皮下注射、静脉注射、动脉注射、腹腔注射、目标组织内注射)；而在另一些情况下，则优选使用非侵入式施用途径。 [0357] 在组合物中，至少一部分或者全部所述脂质和核酸可以配制成脂质核酸混合物形式。有多种不同的脂质核酸混合物的制备方法已经广泛公开，可以根据实际需要选择合适 的脂质核酸复合物的制备方案。 [0358] 本申请提供一种套装组合，其包含本申请所述的脂质以及核酸，其中所述脂质和核酸各自独立地提供于第一容器和第二容器中，所述第一容器和第二容器可以相同或不 同。在一些实施方案中，在临使用前将所述脂质和所述核酸至少部分地或全部地配制成脂 质核酸复合物。 [0359] 本申请提供一种将核酸、大分子、化合物递送至靶组织/细胞中的方法，其中以本申请所述药物组合物或者套装组合的形式提供所述核酸、大分子、化合物。 [0360] 本申请提供一种将核酸、大分子、化合物体内递送至有此需要的对象中的方法，其中以本申请所述药物组合物或者套装组合的形式提供所述核酸，例如将所述核酸体内递送至所述对象的血液循环中或者靶组织/细胞中，例如其中所述脂质与所述核酸经非侵入式 施用(如表面施用)和/或注射施用，例如经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。 [0361] 本申请提供一种预防和/或治疗能用汤剂体和本草体预防和/或治疗之疾病/病症的方法，其包括向有此需要的对象提供本申请所述的药物组合物或套装组合，例如其中所 述脂质与所述核酸经非侵入式施用(如表面施用)和/或注射施用，例如经消化道、经呼吸道和/或注射施用，例如口服、吸入和/或注射施用。令人惊奇地是，这种非侵入式的施用方式(例如经消化道、经呼吸道，包括口服、灌胃、吸入等)能够显著促进核酸的进入和发挥功能。 [0362] 本申请提供制备前述药物组合物或套装组合的方法，以及用于上述各方面中所述方法的药物组合物和/或套装组合的用途。此外还提供用于本申请上述各种方法的脂质、药物组合物和/或套装组合。 [0363] 核酸可以是小RNA，例如所述小RNA长度可以是14‑32bp、16‑28bp、18‑24bp，具体地其长度可以是14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32bp。此外，本申请所述小RNA可以是单链的，例如通过茎环结构连接起来，也可以是双链的。例如，本申请所述核酸可以是HJT‑sRNA‑m7，其具有如下序列：ugagguagua gguugugugg uuguaagc。 [0364] 本申请的组合物或套装组合或化合物可以用于治疗疾病，例如癌症，例如胃癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、多发性骨髓瘤；例如炎症，例如肺炎、心肌炎、急慢性胃炎、急慢性肠炎、急慢性肝炎、急慢性肾炎、皮炎、脑炎、淋巴炎、结膜炎、角膜炎、虹膜睫状体炎、中耳炎、过敏性鼻炎、哮喘、肺纤维化慢性阻塞性肺疾病、过敏性皮炎、镰状细胞病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎；以及纤维化等。 [0365] 本申请的组合物或套装组合或化合物可以用于在体外或在体内处理，例如抑制NCI‑N87细胞(胃癌细胞)，MRC‑5细胞(肺成纤维细胞)，A549细胞(肺癌细胞)的生长。 [0366] 在本申请的各种实施方案中，可以通过多种方式获得脂质核酸混合物，例如逆向蒸发法或水煮法。逆向蒸发法，将核酸的水溶液加入到脂质有机溶剂溶液中，超声，蒸发挥除有机溶剂后，水化得到脂质与核酸的混合物。本申请所述的水煮法，是指将脂质的有机溶剂溶液加到核酸的水溶液中，约100℃煮30min，得到脂质与核酸的混合物。逆向蒸发法和水煮法，在受控的温度和混合条件下进行。合适的处理时间和温度可以由本领域技术人员很 容易地确定。例如，逆向蒸发法的温度的范围优选约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65 ℃，更优选约40℃至约60℃，特别优选约55℃。水煮法(也称加热法)的温度范围优选约25℃至约100℃，更优选约50℃至约100℃，更优选约70℃至约90℃，特别优选约90℃。 [0367] 实施例 [0369] 材料和方法 [0370] 表13：实施例所用的部分小RNA及其序列 [0371] [0372] [0373] [0374] 说明：带有“si‑”前缀的符号标示为双链sRNA。 [0375] 表14：实施例中使用的部分抗体 [0376] [0377] 第一部分实验 [0378] 实施例1 [0379] 1.植物药水煎液的制备和汤剂体的提取 [0380] 1.1植物药水煎液的制备 [0381] 1)取200g植物药饮片(红景天，蒲公英，购自北京同仁堂药店)，加入1000ml ddH2O浸泡30min。 [0382] 2)煎煮锅强火煎煮30min，文火煎煮10min。 [0383] 3)煎煮后的汤剂红景天约250mL，蒲公英约360ml。 [0384] 1.2汤剂体的制备 [0385] 1)取200g饮片(红景天，蒲公英，购自北京同仁堂药店)，加入1000ml ddH2O浸泡30min。 [0386] 2)煎煮锅强火煎煮30min，文火煎煮10min。 [0387] 3)煎煮后的汤剂红景天约250mL，蒲公英约360ml。 [0388] 4)所得水煎液经4℃差速离心(2,000g 30min离心取上清，10,000g 30min离心取上清，200,000g 90min弃上清)后得沉淀。 [0390] 其他植物药的水煎液和汤剂体沉淀物的制备方法与1.1和1.2节中所述的方法相同。汤剂体的制备过程的示意图参见图1。 [0391] 2.植物药中汤剂体的特征 [0392] 2.1透射电镜观察植物药中汤剂体的形态 [0393] 用双蒸水重悬1.2节中获得的沉淀物以获得汤剂体溶液。 [0394] 2)将汤剂体进行透射扫描电镜的形态学观察。 [0395] 2.2植物药中汤剂体的粒径和Zeta电位检测 [0396] 1)用pH7.4的PBS缓冲液重悬1.2节中获得的沉淀物以获得汤剂体。 [0397] 2)用动态光散射技术(DLS)，仪器Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instrument，UK)检测汤剂体的粒径和Zeta电位，并进行数据分析。 [0398] 红景天和蒲公英的汤剂体的电镜观察结果分别参见图2和图3。红景天和蒲公英汤剂体的粒径分布和Zeta电位分别参见图4和图5。 [0399] 3.植物药中汤剂体的组分分析 [0400] 3.1植物药中汤剂体的蛋白质组学分析 [0401] 3.1.1试剂耗材： [0402] Milli‑Q water、Non‑powder gloves、Face mask、Hat、10μl和200μl tips(eppendorf)、乙腈(Fisher A/0626/17)、甲醇(Fisher)、硫代硫酸钠·5H2O(Sodium thiosulfate pentahydrate)(Sigma)、铁氰化钾(Potassium ferricyanide)(Sigma)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol)(PlusOne)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)(Sigma)、胰酶(Trypsin) (Promega V5280)、胰酶重溶液(Trypsin resolve solution)(Promega V530)、碳酸氢铵 (Ammonium bicarbonate)(Sigma A6141)、Zip Tip(Millipore)、FA甲酸(Sigma)、0.2ml和 0.5ml EP管(eppendorf)、50ml EP、15ml EP(Corning)。 [0403] 3.1.2主要仪器： [0404] Q Exactive mass spectrometer(Thermo fisher)、真空干燥仪、水浴锅、10μ和200μ移液器、废液缸、制冰和装冰设备、200μ管架、剪刀、能装放置了200μ管管架的塑料盒、 200μl管离心机 [0405] 3.1.2实验步骤 [0406] 1)蛋白提取： [0407] A.称取适量样品，加入5倍体积的预冷10％TCA‑丙酮震荡混合，‑20℃沉淀2小时或过夜。 [0408] B.4℃，12000g离心10分钟，收集沉淀。 [0409] C.加入适量体积的预冷丙酮震荡混合，4℃，12000g离心15分钟，收集沉淀，重复该步骤两次，彻底去除其他杂质。 [0410] D.常温下干燥，溶解于1ml样品溶解液中(9M尿素，4％CHAPS，1％IPG Buffer，1％DTT)，充分溶解蛋白，用于后续实验。 [0411] 2)酶切： [0412] 取浓度为15ng/μL的胰蛋白酶(用25mmol/L NH4HCO3稀释)，按照7‑10μL/管的量加入胰蛋白酶溶液，放入4℃冰箱孵育40min，取出后每管补加5‑10μL 25mmol/L NH4HCO3溶液，密封置于37℃水浴中酶切16h。 [0413] 3)肽段提取： [0414] 加提取液(5％TFA‑50％ACN‑45％水)100μL/管，37℃水浴1h后，超声5min，离心5min，将提取液移入另一新EP管中，重复提取一次，将提取液合并，真空离心干燥。 [0415] 4)质谱检测 [0416] A.肽段用样品溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈)溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4℃离心10分钟，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定； [0417] B.色谱柱信息： [0418] 300um i.d.x 5mm，填充有Acclaim PepMap RSLC C18，5um， nanoViper [0419] Acclaim PepMap 75um X 150mm，C18，3um，100A [0420] 流动相A：0.1％甲酸； [0421] 流动相B：0.1％甲酸，80％ACN； [0422] 流速：300nL/min； [0423] 每个组分分析时间：40min； [0424]时间 B相 0 5％ 5 5％ 25 50％ 30 90％ 35 90％ 45 5％ [0425] C.分离后的肽段直接进行在线检测，具体参数如下： [0426] 一级质谱参数： [0427] Resolution：70,000 [0428] AGC target：3e6 [0429] Maximum IT：40ms [0430] Scan range：350to 1800m/z [0431] 二级质谱参数： [0432] Resolution：17,500 [0433] AGC target：1e5 [0434] Maximum IT：60ms [0435] TopN：20 [0436] NCE/stepped NCE：27 [0437] 4)数据库检索 [0439] a)固定修饰(Fixed modifications)：Carbamidomethyl(C) [0440] b)可变修饰(Variable modifications)：Oxidation(M) [0441] c)酶(Enzyme)：Trypsin [0442] d)遗漏酶切位点(Maximum Missed Cleavages)：2 [0443] e)一级质谱误差(Peptide Mass Tolerance)：20ppm [0444] f)二级质谱误差(Fragment Mass Tolerance)：0.6Da [0445] g)肽段/碎片离子质量数(Mass values)：Monoisotopic(单同位素) [0446] h)显著性阈值(Significance threshold)：0.05 [0447] 3.1.3结果说明 [0448] Accession(蛋白在uniprot数据库中的ID号)，Description(蛋白注释)，Exp.q‑value(q‑value值，越小越好)，Sum PEP Score(蛋白打分，分数越高越好)，Coverage(鉴定到的肽段氨基酸占蛋白总氨基酸的覆盖度)，#Peptides(鉴定到的该蛋白的肽段数)，#PSMs(鉴定到相应蛋白的所有肽段总数)，#Unique Peptides(鉴定到对应蛋白的特异肽段的数 目)，#Protein Groups(鉴定到肽段对应的蛋白数)，#Aas(鉴定到相应蛋白的理论氨基酸个数)，MW[kDa](鉴定到相应蛋白的理论分子量)，calc.pI(鉴定到相应蛋白的理论等电点)，score：蛋白打分；Intensity：蛋白相对强度。 [0449] Sequence(肽段氨基酸序列)，#Proteins肽段对应蛋白的个数#PSMs鉴定到该肽段的次数，Master Protein Accessions肽段对应蛋白的ID，Theo.MH+[Da]肽段理论分子量。 [0450] 蛋白质组学分析测定结果参见上文表6和表7以及图19和20。 [0451] 3.2植物药中汤剂体的化合物代谢组学分析 [0452] 1)液相条件： [0453] 采用Waters H‑class型号超高效液相色谱对样品进行分离。分析条件如下：色谱柱：waters HSS C18(3.0X100mm，1.7um)，柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相为乙腈；分析梯度为：0‑1min，2％B；1‑3min，2％B‑15％B；3‑6min，15％B‑50％B；6‑9min，50‑95％B；9‑9.1min，95‑100％B‑2％B；9.1‑12min，100％B；流速为0.5ml/min；进样体积为5ul[0454] 2)质谱条件： [0455] UPLC质谱串联LTQ‑Orbitrap velos(Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA，USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45arbitrary units and 10arbitrary units；质谱扫描范围为100‑1000m/z；spray voltages设为 4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为 60000；二级分辨率为15000；二级采用数据依赖(data‑dependent)分析模式；动态排除时间为15s；碎裂方式选择HCD，相关参数设置如下：isolation width：3Da；碰撞能量：根据不同代谢物选择20％，40％和60％；activation time：30ms。 [0456] 3)结果分析： [0457] 由UPLC‑LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0，Nonlinear Dynamics，UK)软件进行处理。处理过程包括峰对齐，峰识别和峰校正及输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据根据质控样本的变异系数(CV)筛选CV小于30％的 变量进行后续多元统计分析。变量矩阵首先导入SIMCA‑P software 14.0(Umetrics AB， Umea，Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS‑DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1.5的变量认为是组间显著性差异变量，可作为侯选的潜在标志物。将鉴定得到的差异性变量进行代谢通路分析，分析与疾病进程相关性较强的代谢通路。 [0458] 红景天和蒲公英汤剂体中小分子分析结果参见表2‑5和图17‑18。 [0459] 3.3植物药中汤剂体的小RNA的高通量测序及分析 [0460] 1)提取过程中得到的植物药的汤剂体的沉淀，用Trizol(Sigma)裂解进行RNA提取。 [0461] 2)使用Illumina HiSeq2500平台测序，50SE，由北京贝瑞和康生物技术股份有限公司完成。 [0462] 3)使用fastx_toolkit软件(v0.0.13)去除测序读段的接头并保留长度大于等于18nt的小RNA序列(调用命令fastx_clipper)，去除质量较低的序列(调用命令fastq_ quality_filter，设置参数‑q10，‑p100)。 [0463] 4)对小RNA序列进行长度分布统计。 [0464] 5)对小RNA序列进行去冗余处理，去除重复的读段。 [0465] 6)用bowtie软件(http：//bowtie‑bio.sourceforge.net/index.shtml)对植物药汤汁、汤剂体中的小RNA序列进行建库(调用命令bowtie‑build)，并筛选出服用植物药(连续口服植物药(10g，约100ml)汤剂三天)后人血中既能匹配到植物药汤汁又能匹配到汤剂 体的小RNA序列(调用命令bowtie)。 [0466] 7)对于像红景天这种已知基因组的植物药，需要用bowtie软件将上述小RNA序列匹配植物药的基因组，获得能匹配的序列。 [0467] 8)从上述得到的小RNA中筛选出在植物药汤汁及汤剂体中读段数大于5，且服用植物药后人血中读段数高于服用植物药前人血中读段数的小RNA序列。 [0468] 9)对于上述有包含关系的小RNA序列，取长度最短的小RNA序列与在服用植物药(10g，约100ml)后的人血中读段数最高的序列。 [0469] 红景天和蒲公英汤剂体中小RNA分析结果参见表8‑9和图21‑22。 [0470] 3.4脂质质谱方法： [0471] 脂质提取及高效液相色谱‑二级质谱联用技术 [0472] 采用Bligh&Dyer法提取红景天汤剂体和蒲公英汤剂体中的脂质(Bligh and Dyer，1959)。高效液相色谱‑二级质谱连用分析由上海敏芯信息科技有限公司完成。色谱条件：柱温为45℃；流速0.4mL/min；二元梯度洗脱，70％流动相A 2min；线性增加至少20min至 100％流动相B；100％B 2min；70％A 5min；进样量4uL；阴离子模式质谱条件：源喷射电压为 3.0kV；加热毛细管温度300℃；鞘气流速为45Arb；辅助气流速为15Arb；扫气流速为1Arb；s‑lens RF水平30％；扫描范围m/z 200‑1，500；正离子模式质谱条件：源喷射电压为2.5kV；加热毛细管温度350℃；鞘气流速为45Arb；辅助气流速为10Arb；扫气流速为1Arb；s‑lens RF水平60％；扫描范围m/z 200‑1，500； [0473] LC‑MS数据利用Thermo SIEVE 2.1 Qualitative分析软件(Thermo Fisher Scientific，美国)进行初步分析。然后，将每个样品的数据均一化到总面积，并将具有峰值数[基于保留时间和质量电荷比(m/z)]、样品名称和均一化的峰值强度的所有数据导入 SIMCA‑P+13.0(Umetrics，瑞典)再次进行处理和分析。 [0474] 4.植物药水煎液和汤剂体的细胞模型中的功能验证试验 [0475] 4.1 MRC‑5细胞、A549细胞的培养 [0476] 实验所用人胚肺成纤维细胞系MRC‑5、人肺腺癌细胞系A549购自北京协和医学院细胞培养中心。细胞均置于37℃、5％CO2培养箱内培养。其中，MRC‑5细胞于EME培养基 (Gibco)中培养；A549细胞置于Ham’s F‑12培养基(HyClone)中培养；各培养基均含10％胎牛血清和一定比例的抗生素(青霉素100U/ml&链霉素100mg/ml)。 [0477] 4.2蛋白免疫印迹法(Western blot)检测红景天(HJT)水煎液和HJT汤剂体在TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞纤维化模型中纤连蛋白蛋白表达水平变化 [0478] 4.2.1水煎液相关实验分组如下： [0479] 1)未处理组：是指未经处理的MRC‑5细胞，该组作为空白对照组。 [0480] 2)TGF‑β1刺激组：是指3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech)处理72小时的MRC‑5细胞，该组作为阳性对照组。 [0481] 3)水煎液实验组：是指3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech)处理72小时的MRC‑5细胞，提前24小时加入对照植物木香(MX，木香水煎液制备方法与红景天水煎液的制备相同)和HJT的水煎液300ug/ml(每毫升培养液中加入水煎液300ug，水煎液定量以液体抽 干后沉淀量计)。 [0482] 4.2.2汤剂体相关实验分组如下： [0483] 1)未处理组：是指未经处理的MRC‑5细胞，该组作为空白对照组。 [0484] 2)TGF‑β1刺激组：是指3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech)处理72小时的MRC‑5细胞，该组作为阳性对照组。 [0485] 3)汤剂体实验组：是指3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech)处理72小时的MRC‑5细胞，提前24小时加入对照植物MX和HJT的汤剂体50ug/ml(每毫升培养液中加入汤剂体50ug，以液体抽干后沉淀量计)。 [0486] 4.2.3蛋白样品的收集与BCA法浓度测定： [0487] 1)提前24小时干预后TGF‑β1刺激72小时的MRC‑5细胞的蛋白样品的收集与BCA法测定蛋白浓度： [0488] A.弃去培养基，12孔板细胞(106)，每孔加入1mL PBS缓冲液清洗一遍，每孔加入100μL预冷的强RIPA裂解液(配方如下)，将细胞用枪头刮下并转移到离心管中，置冰上裂解 20min； [0489] [0490] B.4℃，12,000rpm，离心10min，转移上清至新的离心管中； [0491] C.将BCA试剂A与B(TIANGEN，#PA115)(50∶1，v/v)充分混匀，配制BCA工作液； [0492] D.分别取25μL新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到96孔板中，每孔中加入200μL BCA工作液，并充分混匀；37℃孵育30min； [0493] E.用紫外分光光度计(Synergy 4多功能酶标仪)于562nm处检测其吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度； [0494] F.用RIPA裂解液和Loading Buffer(10％SDS 20ml，蔗糖5g，溴酚蓝0.2g，beta‑巯基乙醇5ml)调节样品浓度，使各样品浓度一致(与最低浓度一致)； [0495] G.95℃，变性处理10min。 [0496] 4.2.4蛋白免疫印迹法检测(Western blot) [0497] A.制胶：采用10％浓度分离胶(下层胶)和5％浓度的浓缩胶(上层胶)，15孔梳子所做泳道，每个泳道样品蛋白上样量相等； [0498] B.蛋白电泳：加入电泳缓冲液，电泳起始电压80V；当溴酚兰染料到分离胶后，提高电压至120V继续电泳，直至溴酚兰染料达到分离胶底部或全部泳出凝胶； [0500] D.封闭：转膜结束后置于3％BSA封闭液中，室温封闭1h； [0501] E.一抗孵育：将封闭后的PVDF膜转移至杂交袋中，加入含有对应一抗(一抗的信息如下)的3％BSA封闭液，赶出袋中气泡，密封后4℃过夜孵育； [0502] 纤连蛋白抗体(sigma F7387) [0503] GAPDH抗体(protein tech 60004‑1) [0504] F.洗膜：将PVDF膜取出，用TBST洗膜3次，每次10min； [0505] G.二抗孵育：弃去TBST，加入含有带有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠的二抗(购自杭州联科生物技术有限公司)的3％BSA封闭液(二抗稀释比例1∶5000)，室温孵育1小时； [0506] H.洗膜：用TBST洗膜3次，每次10min； [0507] I.显影：配制Western显色液(1∶1，V/V，Merck Millipore，ECL化学发光显色液购自Millipore公司)，并将配制好的显色液均匀滴加于膜结合蛋白的一侧；用保鲜膜小心的将膜包好，显色后观察； [0508] J.分析：用Image J软件进行分析。 [0509] 4.3实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测PGY水煎液和PGY汤剂体在poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中IL‑1β/IL‑6/TNF‑α的mRNA表达水平 [0510] 4.3.1水煎液相关实验分组如下： [0511] 1)未处理组：是指未经处理的A549细胞，该组作为空白对照组。 [0512] 2)poly(I：C)刺激组：是指1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)处理的A549细胞6小时，该组作为阳性对照组。 [0513] 3)水煎液实验组：是指提前加入对照植物卷心菜(JXC)或蒲公英(PGY)的汤剂(10ug/ml、30ug/ml、100ug/ml)共孵育24小时后，1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理的A549细胞6小时。 [0514] 4.3.2汤剂体相关实验分组如下： [0515] 1)未处理组：是指未经处理的A549细胞，该组作为空白对照组。 [0516] 2)poly(I：C)刺激组：是指1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)处理的A549细胞6小时，该组作为阳性对照组。 [0517] 3)汤剂体实验组：是指1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)处理的A549细胞6小时，提前24小时加入对照植物卷心菜(JXC)和蒲公英(PGY)的 汤剂体(制备方法与红景天汤剂体的制备方法相同)2ug/ml、6ug/ml、20ug/ml。 [0518] 4.3.3细胞总RNA的提取 [0519] A.12孔板培养细胞(约1×106个细胞/孔)，弃培养液后每孔加入1mL TRIzol裂解液后，先置于冰上，待所有的样品都加入TRIzol后，室温放置5min，使其充分裂解； [0520] B.4℃，12,000rpm离心5min，弃沉淀，将TRIzol转移到新的离心管中； [0521] C.按200μL氯仿/mL TRIzol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min； [0522] D.4℃，12,000rpm，离心15min； [0523] E.吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5‑10min； [0524] F.4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底； [0525] G.加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0526] H.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0527] I.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase‑free的H2O溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。 [0528] 4.3.4将总RNA逆转录为cDNA [0529] 通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：上文提取的总RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，RT随机引物 2.0μL，MultiScribeTM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL(Invitrogen)，无核酸酶H2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。 [0530] 4.3.5定量PCR扩增反应 [0531] qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶ddH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设计和合成，引物 序列(内参基因UBC正向引物：CTGGAAGATGGTCGTACCCTG，内参基因UBC反向引物： GGTCTTGCCAGTGAGTGTCT；目的基因IL‑1β正向引物：CTCGCCAGTGAAATGATGGCT：目的基因IL‑1β反向引物：GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT；目的基因IL‑6正向引物：GGTACATCCTCGACGGCATCT：目的基因IL‑6反向引物：GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC；目的基因TNF‑α正向引物： CTGCCCCAATCCCTTTATT：目的基因TNF‑α反向引物：CCCAATTCTCTTTTTGAGCC)。 [0532] 4.3.6 mRNA的相对表达量的计算 [0533] 利用2‑ΔCt法(基因相对表达量＝2‑(Ct目的基因‑Ct内参基因))计算相对进入量(单链或双链RNA)。 [0534] 4.4双荧光报告基因验证PGY‑sRNA‑6的靶基因 [0535] HEK293T细胞经胰酶消化后加入48孔板培养约24h后，使用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX瞬时转染PGY‑sRNA‑6和NC阴性对照(单链NC序列 UUGUACUACACAAAAGUACUG)，终浓度为100nM，24h后使用转染试剂Lipofectamine 2000每孔 转染300ng野生型psiCHECK2‑3’‑UTR(购自Promega，#C8201)及突变型psiCHECK2‑3’‑mUTR质粒(生工合成，突变序列参见图32)，转染后48h按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Promega，#E1960)步骤收取细胞样品检测表达量。 [0536] 4.5酶联免疫印记实验(ELISA)检测蒲公英汤剂及汤剂体在poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中IL‑6的蛋白表达水平 [0537] 4.5.1水煎液汤剂相关实验分组如下： [0538] 1)空白组：是指未经处理的A549细胞，收取培养基上清液进行蛋白含量ELISA检测，该组作为空白对照组。 [0539] 2)poly(I：C)刺激组：是指1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)处理的A549细胞6小时，收取培养基上清液进行蛋白含量ELISA检测。该组作为阳性对照组。 [0540] 3)汤剂实验组：是指提前加入对照植物卷心菜(JXC)或蒲公英(PGY)的汤剂(10ug/ml、30ug/ml、100ug/ml)共孵育24小时后，1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理的A549细胞6小时。收取培养基上清液进行蛋白含量ELISA检测。 [0541] 根据图9D，100ug/ml汤剂可以降低poly(I：C)刺激引起的A549细胞白细胞介素6的表达。 [0542] 4.5.2汤剂体相关实验分组如下： [0543] 1)空白组：是指未经处理的A549细胞，该组作为空白对照对照组。 [0544] 2)poly(I：C)刺激组：是指1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)处理的A549细胞6小时，收取培养基上清液进行蛋白含量ELISA检测。该组作为阳性对照组。 [0545] 3)汤剂体实验组：是指提前加入对照植物卷心菜(JXC)或蒲公英(PGY)的汤剂体(2ug/ml、6ug/ml、20ug/ml)共孵育24小时后，1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理的A549细胞6小时。收取培养基上清液进行蛋白含量ELISA检测。 [0546] 根据图9E，20ug/ml汤剂体可以明显降低poly(I：C)刺激引起的A549细胞白细胞介素6的表达，有效性明显高出同剂量汤剂。 [0547] 4.6红景天汤剂体RNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测汤剂体中的小RNA [0548] 1)200g红景天饮片煎煮后差速离心法提取汤剂体； [0549] 2)汤剂体沉淀加6毫升TRIZol(sigma‑Aldrich)充分裂解，提取汤剂体RNA； [0550] 3)将提取后RNA均分4份分别如下处理：不加处理，加入5ul DNA酶I，加入5ul RNA酶A，加入5ul DNA酶I和RNA酶A，37度水浴消化过夜 [0551] 4)琼脂糖凝胶电泳：用1％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电泳条件90伏20分钟。结束后于紫外灯下观察。 [0552] 根据图9F，红景天汤剂体中存在小RNA，25bp左右。 [0553] 4.7蒲公英汤剂体RNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测汤剂体中的小RNA [0554] 1)200g蒲公英饮片煎煮后差速离心法提取汤剂体； [0555] 2)汤剂体沉淀加6毫升TRIZol(sigma‑Aldrich)充分裂解，提取汤剂体RNA； [0556] 3)将提取后RNA均分4份分别如下处理：不加处理，加入5ul DNA酶I，加入5ul RNA酶A，加入5ul DNA酶I和RNA酶A，37度水浴消化过夜 [0557] 4)琼脂糖凝胶电泳：用1％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，电泳条件90伏20分钟。结束后于紫外灯下观察。 [0558] 根据图9G，蒲公英汤剂体中存在小RNA，25bp左右。 [0559] 5.植物药汤剂体的动物模型中的功能验证试验 [0560] 5.1实验动物 [0561] 实验所用6‑8周龄的雄性C57BL/6J小鼠购于北京维通利华，并在北京协和医学院动物实验中心无菌条件下饲养。所有动物实验流程均遵循政府和动物护理和使用委员会的 指导方针。 [0562] 5.1.1博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型 [0563] 模型组按2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素(北京海正辉瑞制药有限公司)造模，对照组仅气管滴注生理盐水。在第21天牺牲小鼠，收取左右肺待检测。 [0564] 5.1.2小鼠急性肺损伤模型 [0565] 在无菌条件下，将poly(I：C)溶于PBS中配制贮存液浓度为10mg/mL。按每只小鼠给药500ug poly(I：C)的剂量，每管50uL分装。气管滴注法造急性肺损伤模型，9h后牺牲小鼠，收取血、肺泡灌洗液待检测。 [0566] 5.2HJT汤剂体在博来霉素诱导的小鼠纤维化模型中的作用 [0567] 5.2.1动物实验的分组如下： [0568] 1)对照组：该组仅气管滴注生理盐水，作为Saline对照组。 [0569] 2)博来霉素组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。该组作为阳性对照组。 [0570] 3)木香汤剂体实验组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天灌胃给予木香汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠40g木香汤剂来源汤剂体(500uL)。21天后 分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0571] 4)红景天汤剂体实验组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天灌胃给予红景天汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠40g红景天汤剂来源汤剂体(500uL)。 21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0572] 5.2.2动物肺组织羟脯氨酸含量的测定 [0573] 用羟脯氨酸测定试剂盒(#MAK008，Sigma Aldrich)测定小鼠肺的胶原含量。将小鼠右肺组织真空干燥，称重后在120℃下用6M盐酸水解3小时，按试剂盒说明书进行羟脯氨 酸含量测定。羟脯氨酸含量表示为“μg/右肺”，除非另有说明。 [0574] 5.2.3动物肺组织病理学检测 [0575] 1)组织石蜡包埋切片实验步骤 [0577] B.脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h‑85％酒精2h‑90％酒精2h‑95％酒精1h‑无水乙醇I 30min‑无水乙醇II 30min‑醇苯5‑ 10min‑二甲苯I 5‑10min‑二甲苯II 5‑10min‑蜡I 1h‑蜡II 1h‑蜡III 1h。 [0578] C.包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于‑20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。 [0579] D.切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。 [0580] 2)HE染色实验步骤 [0581] A.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I20min‑二甲苯II20min‑无水乙醇I10min‑无水乙醇II10min‑95％酒精5min‑90％酒精5min‑80％酒精5min‑70％酒精5min‑蒸馏水洗。 [0582] B.苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3‑8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。如果细胞浆有蓝色，则可以延长分化时间[0583] C.伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1‑3min。不要水洗， [0584] D.脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min‑95％酒精II 5min‑无水乙醇I 5min‑无水乙醇II 5min‑二甲苯I 5min‑二甲苯II 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。 [0585] E.显微镜镜检，图像采集分析。 [0586] F.染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色。 [0587] 5.2.4动物肺组织马松染色检测 [0588] 1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I 20min‑二甲苯II 20min‑无水乙醇I 10min‑无水乙醇II 10min‑95％酒精5min‑90％酒精5min‑80％酒精5min‑70％酒精 5min‑蒸馏水洗。 [0589] 2)苏木素染细胞核：masson染色试剂盒内Weigert氏铁苏木素染5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。 [0590] 3)丽春红染色：masson染色试剂盒内丽春红酸性品红液染5‑10min，蒸馏水快速漂洗。 [0591] 4)磷钼酸处理：masson染色试剂盒内磷钼酸水溶液处理约3‑5min。 [0592] 5)苯胺蓝染色：不用水洗，直接用masson染色试剂盒内苯胺蓝液复染5min。 [0593] 6)分化：1％冰醋酸处理1min。 [0594] 7)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min‑95％酒精II 5min‑无水乙醇I5min‑无水乙醇II5min‑二甲苯I5min‑二甲苯II5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。 [0595] 8)显微镜镜检，图像采集分析。 [0596] 染色结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。 [0597] 5.3 PGY汤剂体在poly(I：C)诱导的小鼠炎症模型中的作用 [0598] 5.3.1动物实验的分组如下： [0599] 1)对照组：该组仅气管滴注生理盐水，作为盐水对照组。 [0600] 2)poly(I：C)组：是指气管滴注500ug poly(I：C)造模，9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。该组作为阳性对照组。 [0601] 3)卷心菜(JXC)汤剂体实验组：是指提前‑72h，‑48h，‑24h，‑3h连续灌胃给予卷心菜汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠10mg卷心菜汤剂体(500uL)。气管滴注500ug poly(I：C)刺激建立炎症模型，建模3h后灌胃给与10mg卷心菜汤剂体(500uL)，气管滴注500ug poly(I：C)9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。 [0602] 4)蒲公英汤剂体实验组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注poly(I：C)造模，提前连续三天灌胃给予蒲公英汤剂来源汤剂体10mg(500uL)，。气管滴注500ug poly(I：C)造模，造模 3h后灌胃给与10mg卷心菜汤剂体(500uL)，造模9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。 [0603] 5.3.2 Bioplex小鼠23细胞因子试剂盒检测小鼠血浆中细胞因子的表达 [0604] 1)样品处理：小鼠全血收集至EDTA‑2K抗凝管中，经2000rpm，4℃离心10min收取血浆。血浆继续12000rpm，4℃离心10min，弃沉淀，上层血浆用于检测。 [0605] 2)Bioplex实验方法：小鼠肺泡灌洗液及血浆中细胞因子表达检测使用Bioplex小鼠23细胞因子检测试剂盒(Cat#M60009RDPD)根据说明书指示进行检测。标准品设置2个复 孔以提高检测结果准确性。 [0606] 5.4统计学分析 [0607] 数据以平均值±SEM形式表示。所有实验数据均经过两次或两次以上的独立重复实验验证，数据呈正态分布，组间差异无显著性。实验组与对照组之间的参数差异通过非配对t检验进行评估。羟脯氨酸含量检测数据及小鼠细胞因子表达含量检测采用GraphPad Prism5.0软件进行统计分析，马松染色结果采用Image Pro PLUS软件进行统计分析，小鼠 细胞因子表达含量以poly(I：C)组做均一化，马松染色结果统计以生理盐水组做均一化，P＜0.05被认为有统计学意义。 [0608] 6.本草体的制备以及其功能验证 [0609] 6.1本草体的制备过程 [0610] 6.1.1实验材料 [0611] 脂质Sphinganine(d22：0)(AVANTI，#792079P)购于美国Avanti Polar Lipids公司，以10mg/ml的浓度贮存于氯仿中。HJT‑sRNA‑m7购自广州锐博生物技术有限公司，PGY‑sRNA‑6购自苏州吉玛基因股份有限公司，贮存浓度20μMol。 [0612] 6.1.2制备方法 [0613] A.按照所需剂量将小RNA用去RNA酶的水稀释至100μL体系。 [0614] B.向小RNA稀释液中加入相应剂量的脂质贮存液。小RNA与脂质比例：0.1nmol‑20μg，0.2nmol‑25μg，0.4nmol‑200μg，充分混匀使组分充分分散。 [0615] C.将分散体系于90℃水浴锅中加热15min得到本草体均一体系。 [0616] 6.2本草体(Bencaosome)在细胞模型中的功能过程验证 [0617] 6.2.1 MRC‑5细胞、A549细胞和293T细胞的培养 [0618] 实验所用人胚肺成纤维细胞系MRC‑5、人肺腺癌细胞系A549、人胚肾细胞系HEK293T购自北京协和医学院细胞培养中心。细胞均置于37℃、5％CO2培养箱内培养。其中，MRC‑5细胞于EME培养基(Gibco)中培养；A549、HEK‑293T细胞分别置于Ham’s F‑12培养基(HyClone)和DMEM(Gibco)中培养，各培养基均含10％胎牛血清和一定比例的抗生素(青霉 素100U/ml&链霉素100mg/ml)。细胞培养至对数生长期，然后分别铺板到12孔板，细胞密度 5 为6×10/1ml培养基/孔；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验 [0619] 6.2.2实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测本草体在细胞模型上本草体递送核酸的表达量 [0620] 6.2.2.1本草体相关实验分组如下： [0621] 1)空白对照组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。 [0622] 2)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7或PGY‑sRNA‑6溶液(终浓度为100nM)，该组作为阴性对照组； [0623] 3)本草体处理组：将步骤2中制备的脂质与HJT‑sRNA‑m7或PGY‑sRNA‑6混合物加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7或PGY‑sRNA‑6的终浓度为100nM。 [0624] 6.2.2.2本草体递送核酸表达量检测 [0625] 与细胞共同孵育12‑24h后，用PBS清洗细胞2次，用TRIzol裂解液(Sigma)收取细胞，提取其总RNA，利用RT‑qPCR(SYBR Green染料法)检测进入细胞的HJT‑sRNA‑m7或PGY‑sRNA‑6丰度，具体步骤如下： [0626] A.提取细胞总RNA： [0627] 1)细胞加入Trizol后，先置于冰上，待所有的样品都加入Trizol后，室温放置5分钟，使其充分裂解； [0628] 2)12,000rpm离心5min，弃沉淀，将Trizol转移到新的离心管中； [0629] 3)按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min； [0630] 4)4℃，12,000rpm，离心15min； [0631] 5)吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5‑10min； [0632] 6)4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底； [0633] 7)加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0634] 8)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0635] 9)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase‑free的H2O溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。 [0636] B.将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，用茎环法(stem‑loop法)将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，U6 RT stem‑loop引物2.0μL，HJT‑sRNA‑m7RT stem‑loop引物2.0μL(或PGY‑sRNA‑6 RT stem‑loop引物2.0μL)，MultiScribeTM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂 1.0μL，无核酸酶H2O1.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min； (2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。该逆转录过程中使用的茎环法引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(U6内参RT引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG；HJT‑ sRNA‑m7RT stem‑loop引物：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAC AA)。PGY‑sRNA‑6 RT引物：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGGAC。 [0637] C.定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶dH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后 40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设 计和合成(U6正向引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT，HJT‑sRNA‑m7正向引物：TCGCGCTGAGGTAGTAGGTT，HJT‑sRNA‑m7反向引物：GTGCACGCTCCGAGGT)。PGY‑sRNA‑6引物：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGGAC。 [0638] E.利用2‑ΔCt法计算相对进入量。 [0639] 6.2.3实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测mRNA表达水平 [0640] 6.2.3.2实验分组如下： [0641] 1)空白组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。 [0642] 2)poly(I：C)处理组：加1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理A549细胞6小时。该组作为阳性刺激组。 [0643] 3)So(d22：0)‑NC组：加入So(d22：0)‑NC本草体溶液(终浓度为400nM)，共孵育24h后，加1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理A549细胞6小时。该组作为阴性对照组； [0644] 4)So(d22：0)‑PGY‑sRNA‑6本草体处理组：将步骤2中制备的So(d22：0)‑PGY‑sRNA‑6本草体加入细胞中核酸的终浓度为400nM。共孵育24h后，加1μg/mL双链RNA病毒模拟物 poly(I：C)处理A549细胞6小时。 [0645] 6.2.2.3用TRIzol裂解液裂解细胞，提取其中总RNA，利用RT‑qPCR(SYBRGreen染料法)检测相关基因的mRNA表达水平，具体步骤如下： [0646] 1)提取细胞总RNA： [0647] 细胞加入Trizol后，先置于冰上，待所有的样品都加入Trizol后，室温放置5分钟，使其充分裂解； [0648] 12,000rpm离心5min，弃沉淀，将Trizol转移到新的离心管中； [0649] 按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min； [0650] 4℃，12,000rpm，离心15min； [0651] 吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5‑10min； [0652] 4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底； [0653] 加入1mL75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0654] 4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1mL75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0655] 4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase‑free的H2O溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。 [0656] 2)将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，AppliedBiosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，随机引物(试剂盒中自带)2.0μL，MultiScribeTM逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃， 120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。 [0657] 3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶ddH2O。使用LightCycler480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后 40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设 计和合成。引物序列同上4.3.5节所述。 [0658] 4)利用2‑ΔCt法计算相对表达量。 [0659] 6.2.4蛋白免疫印迹法检测(Western blot)蛋白表达水平 [0660] 6.2.4.1实验分组如下： [0661] 1)空白组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。 [0662] 2)TGF‑β1处理组：给予刺激物3ng/mL转化生长因子TGF‑β1刺激MRC‑5细胞，作用72h后收取细胞，该组作为阳性刺激组。 [0663] 3)So(d22：0)‑NC组：加入So(d22：0)‑NC本草体溶液(终浓度为400nM)，共孵育24h后，给予刺激物3ng/mL转化生长因子TGF‑β1刺激MRC‑5细胞，作用72h后收取细胞。，该组作为阴性对照组； [0664] 4)So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7本草体处理组：将制备的So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7本草体加入细胞中(终浓度为400nM)，共孵育24h后，给予刺激物3ng/mL转化生长因子TGF‑β1刺激MRC‑5细胞，作用72h后收取细胞。 [0665] 6.2.4.2与细胞共同孵育24h后，给予刺激物3ng/mL转化生长因子TGF‑β1刺激MRC‑5细胞，作用72小时后，用强RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解液利用Western blot检测相关基因的蛋白表达水平。 [0666] 6.2.5酶联免疫法(ELISA)检测炎症细胞因子表达水平 [0667] 6.2.5.1实验分组如下： [0668] 1)空白组：是指未经处理的A549细胞上清，该组作为空白对照组。 [0669] 2)poly(I：C)处理组：加1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理A549细胞6小时细胞上清。该组作为阳性刺激组。 [0670] 3)So(d22：0)‑NC组：加入So(d22：0)‑NC本草体溶液(终浓度为400nM)，共孵育24h后，加1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理A549细胞6小时。收取细胞上清，该组作为阴性对照组； [0671] 4)So(d22：0)‑PGY‑sRNA‑6本草体处理组：将制备的So(d22：0)‑PGY‑sRNA‑6本草体加入细胞中核酸的终浓度为400nM。共孵育24h后，加1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)处理A549细胞6小时，收取细胞上清。 [0672] 6.2.5.2细胞上清于4℃，12,000rpm，离心5min，转移细胞上清至新1.5mLEP管中，加入100x x cock tail，利用ELISA检测炎症细胞因子的表达水平，具体步骤如下： [0673] 包被：采用R&D公司的自包被ELISA板(试剂盒为：IL‑1#DY201‑05，IL‑6#DY206‑05，TNF‑α#DY210‑05，其中包括了相关基因的Detection Antibody和Avidin‑HRP)，用PBS稀释Capture Antibody(IL‑1，IL‑6，TNF‑α)(根据说明书上的稀释比例)，室温包被过夜，约16‑18h； [0674] 洗板：取出包被好的ELISA板，将Capture Antibody液倒掉并在滤纸上将残余液体拍干，而后加入已配置好的洗液(PBS+0.1％tween 20)300μL进行清洗，每次停留1min(用 ELISA板振荡器)，每次也须将液体倒掉并在滤纸上将残余液体拍干(下同)，清洗4次； [0675] 封闭：清洗完毕后，加入300μL封闭液(PBS+1％BSA)，室温下温育1h； [0676] 准备：在1h间须准备相应标准品(IL‑1，IL‑6，TNF‑α)，根据说明书配好最高浓度后按照1/2的浓度梯度进行稀释，稀释7次，最后第八管加入稀释液作为0管； [0677] 洗板：温育1h后使用洗液清洗4次； [0678] 加样：将准备好的标准品加入ELISA板的左右两排，其他孔中加入样品，室温孵育2h； [0679] 加一抗：洗液清洗4次，加入100μL Detection Antibody，封好后室温孵育2h； [0680] 加二抗：洗液清洗4次，加入100μL Avidin‑HRP，封好后室温孵育20min； [0681] 加底物：洗液清洗4次，加入100μL TMB Substrate Solution，尽量在暗中操作，而后马上置于抽屉中暗置10～20min左右，带颜色变蓝后，加入100μL终止液终止反应，颜色由蓝变黄； [0682] 在30min内进行吸光度测定，450nm检测波长，570nm参考波长。 [0683] 6.3本草体在动物模型中的功能过程验证 [0684] 6.3.1实验步骤： [0685] 1)本草体制备：采用水煮加热法制备，400μL NC mimic(广州锐博生物技术有限公司提供)或HJT‑sRNA‑m7(10nmol)双链RNA DEPC处理的水溶液，分别加入10μL sphinganine(d22：0)脂质混匀后，90℃加热30min。 [0686] 2)6‑8周龄雄性C57小鼠灌胃给RNA：用灌胃针分别给予脂质与NC或HJT‑sRNA‑m7的本草体溶液体系，400μL/只，分组如下： [0687] 1)Saline对照组：是指不做任何处理，仅给予生理盐水的小鼠； [0688] 2)博来霉素组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。该组作为阳性对照组。 [0689] 3)脂质Sphinganine‑NC组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天灌胃给予脂质Sphinganine‑NC(0.1mg∶5nmol)组成的本草体。气管滴注博莱霉素造模后，第7‑14天给予同样剂量的脂质Sphinganine‑NC组成的本草体，21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0690] 4)脂质Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天给予脂质Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7(0.1mg∶5nmol)组成的本草体。气管滴注博莱霉素造模后，第7‑14天给予同样剂量的脂质Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7组成的本草体，21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0691] 6.3.2动物肺组织羟脯氨酸含量的测定 [0692] 用羟脯氨酸测定试剂盒(#MAK008，Sigma Aldrich)测定小鼠肺的胶原含量。将小鼠右肺组织真空干燥，称重后在120℃下用6M盐酸水解3小时，按试剂盒说明书进行羟脯氨 酸含量测定。羟脯氨酸含量表示为“μg/右肺”，除非另有说明。 [0693] 6.3.3动物肺组织病理学检测 [0694] 见5.2.3 [0695] 6.3.4动物肺组织马松染色检测 [0696] 见5.2.4 [0697] 实施例2.植物药汤剂体的特征检测 [0698] 基于图1的植物药的汤剂体的制备示意图，根据实施例1中的具体步骤制备红景天(HJT)和蒲公英(PGY)两种植物药的水煎液，再用差速离心的方式得到HJT和PGY两种植物药 的汤剂体沉淀，双蒸水溶解汤剂体沉淀并定量后检测其特征。透视电镜的结果如图2和图3 显示，HJT汤剂体和PGY汤剂体均呈现的外泌体样纳米颗粒状，最外面有双层膜包裹且直径 不均一，但大多数的汤剂体的直径集中在100nm到200nm之间。 [0699] 为了进一步观察汤剂体的特征，我们对其粒径和Zeta电势进行检测，图4和图5显示，HJT汤剂体的平均粒径峰值为197.6nm，PGY汤剂体的平均粒径峰值为153.2nm，粒径分散均一，呈正态分布。Zeta电势结果显示HJT汤剂体和PGY汤剂体电位绝对值大于30mV，体系呈较稳定状态。 [0700] 实施例3.植物药汤剂体的细胞模型中的功能验证 [0701] 将HJT水煎液和从水煎液中提取的HJT汤剂体进行定量后，选取水煎液浓度为300μg/ml，汤剂体浓度为50μg/ml在TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中验证其功能。结果如图6和图7显示，无论是HJT水煎液还是HJT汤剂体与同浓度同方法制备的对照木香(MX)的 水煎液和汤剂体相比，都可以有效的降低TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞中纤维蛋白纤连蛋白的表达。 [0702] 将PGY水煎液和从水煎液中提取的PGY汤剂体进行定量后，选取水煎液浓度为10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml，PGY汤剂体浓度为2μg/ml、6μg/ml、20μg/ml时在poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中验证其功能。结果如图8A‑C和图9A‑E显示，无论是PGY水煎液还是PGY汤剂体与同浓度同方法制备的对照卷心菜(JXC)的水煎液和汤剂体相比，都可以有效的 降低poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α的mRNA的相对表达。 [0703] 上述结果在细胞模型中完成，HJT和PGY两种植物药的水煎液和汤剂体分别存在抗纤维化和抗炎功能，水煎液的有效浓度明显高于汤剂体的有效浓度，可以证明汤剂体可能 是草药的主要发挥功能的混合物的一种存在形式。 [0704] 实施例4.植物药汤剂体的动物模型中的功能验证 [0705] 将从水煎液中提取的HJT汤剂体进行定量后，选取上文制备的(先前以200g制备)红景天熬煮而得汤剂来源HJT汤剂体在博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中验证其抗纤维 化的功能。动物实验的分组如下： [0706] 1)对照组：该组仅气管滴注生理盐水，作为Saline对照组。 [0707] 2)博来霉素组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。该组作为阳性对照组。 [0708] 3)木香汤剂体对照组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天灌胃给予木香汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠40g木香汤剂来源汤剂体(500uL)。21天后 分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0709] 4)红景天汤剂体对照组：是指2.5U/kg的剂量气管滴注博莱霉素造模，提前连续三天灌胃给予红景天汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠40g红景天汤剂来源汤剂体(500uL)。 21天后分别收取小鼠左右肺进行检测。 [0710] 结果如图10‑图13显示，HJT汤剂体与同样剂量的同方法制备的对照MX汤剂体相比，可以有效的降低博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中小鼠肺部羟脯氨酸的水平(图 10)，有效降低博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中小鼠肺部纤维化程度(图11和图12)，有效降低博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中小鼠肺部病理改变程度(图13)。 [0711] 将从水煎液中提取的PGY汤剂体进行定量后，选取PGY汤剂体量为10mg/只时在poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中验证其功能。动物实验的分组如下： [0712] 1)对照组：该组仅气管滴注生理盐水，作为盐水对照组。 [0713] 2)poly(I：C)组：是指气管滴注500ug poly(I：C)造模，9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。该组作为阳性对照组。 [0714] 3)卷心菜(JXC)汤剂体对照组：是指提前‑72h，‑48h，‑24h，‑3h连续灌胃给予卷心菜汤剂来源汤剂体，剂量为每只小鼠10mg卷心菜汤剂体(500uL)。气管滴注500ug poly(I：C)刺激建立炎症模型，建模3h后灌胃给与10mg卷心菜汤剂体(500uL)，气管滴注500ug poly(I：C)9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。 [0715] 4)蒲公英汤剂体对照组：是提前连续三天灌胃给予蒲公英汤剂来源汤剂体10mg(500uL)，气管滴注500ug poly(I：C)造模，造模3h后灌胃给与10mg蒲公英汤剂体(500uL)，造模9h后收取小鼠肺泡灌洗液及全血样品。 [0716] 结果如图14A‑B显示，PGY汤剂体与同样剂量的同方法制备的对照JXC汤剂体相比，可以有效的降低poly(I：C)诱导的小鼠炎症模型中小鼠血浆中各种细胞因子的表达水平。 [0717] 上述结果在动物模型中完成，HJT和PGY两种植物药的汤剂体分别存在抗纤维化和抗炎功能。结合实施例3中汤剂体的细胞模型中的功能验证，证实了汤剂体可能是植物药发挥功能的重要单元。 [0718] 实施例5.植物药汤剂体的各组分鉴定 [0719] 既然植物药汤剂体在其药用价值中发挥很重要的作用，研究清楚汤剂体的组成成分至关重要。还是以HJT和PGY两种植物药为例，首先我们对这两种汤剂体利用HPLC‑MS/MS鉴定其脂质成分，共鉴定出25大类脂质成分，如图15红景天汤剂体脂质鉴定、图16红景天汤剂体脂质鉴定显示。其中TG、Cer、DG、PE和PC的含量均占汤剂体中脂质的主要部分。 [0720] 通过对HJT汤剂体和PGY汤剂体的化合物成分分析，图17显示，共鉴定出HJT汤剂体中含有36类化合物。图18显示，共鉴定出PGY汤剂体中含有47类化合物。 [0721] 通过蛋白组分分析，图19显示，鉴定出HJT汤剂体中的38种蛋白。同样图20显示，鉴定出PGY汤剂体中的140种蛋白。并且对这些蛋白进行简单的分类，这些鉴定出来的汤剂体中的蛋白成分主要是与代谢、信号转导、泛素化和转录以及翻译相关。 [0722] 通过提取汤剂体沉淀中的RNA，进行小RNA测序分析，如图21和图22显示，HJT汤剂体和PGY汤剂体中的小RNA的长度主要分布在18nt到25nt。表8‑9显示了HJT汤剂体和PGY汤 剂体中的小RNA序列的主要信息，HJT汤剂体中鉴定了80,573种小RNA的存在，PGY汤剂体中 鉴定了614,545种小RNA的存在。 [0723] 综上所述，汤剂体中的成分包括脂质、化合物，蛋白和小RNA。 [0724] 实施例6.本草体的制备和功能鉴定 [0725] 我们定义本草体为人工制备的由一种或多种合成的脂质与包括但不限于以下：合成或提取脂质、人工表达或改造的蛋白质、人工合成或纯化的核酸(包括DNA，RNA，包括小RNA)，人工合成或提纯的化合物等物质构成的，具有热稳定性的外泌体样的膜结构的纳米 颗粒状物质。如图23所示，本草体是人为将脂质、化合物、小RNA和蛋白等两种或者多种有效成分组合在一起，通过加热处理后形成的物质。 [0726] 我们的研究证实了红景天水煎液中的小RNA：HJT‑sRNA‑m7在TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中和博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中均有很有效的抗纤维化作用(Du.et al.，2017)。我们将一定比例的脂质Sphinganine与HJT‑sRNA‑m7混合，加热水煮后形成Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7的本草体。如图24‑图26显示，运用RT‑PCR检测MRC‑5细胞中HJT‑sRNA‑m7的相对表达量，流式细胞术检测MRC‑5细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入以及细胞共聚焦实验检测Cy5标记的HJT‑sRNA‑m7在A549细胞中的进入及分布，均可以证明 Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7的本草体可以使得HJT‑sRNA‑m7有效的进入细胞中。图27显示Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7在TGF‑β1诱导的MRC‑5细胞的纤维化模型中发挥着抗纤维化的作用，Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7可有效降低纤维化相关蛋白纤连蛋白和α‑SMA的表达。 [0727] 我们通过合成并筛选了PGY水煎液中峰度最高的前20种小RNA(PGY‑sRNA‑1～20)对其进行抗炎的功能验证。图28显示在poly(I：C)诱导的A549的炎症模型中，PGY‑sRNA‑6最有效的降低A549细胞IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的表达。将PGY‑sRNA‑6在poly(I：C)刺激的A549细胞和PUMC细胞炎症模型中验证，图29A‑C和图30A‑C显示PGY‑sRNA‑6可有效的降低poly(I： C)刺激的A549细胞和PBMC细胞中IL‑1β、IL‑6和TNF‑αmRNA的相对表达。同时运用生物信息学分析与双荧光报告基因检测方法，图31和图32显示，RELA(p65，Gene ID：5970)为PGY‑sRNA‑6的直接靶基因。如图33显示，生物信息学分析PGY‑sRNA‑6均在PGY水煎液和PGY汤剂体中存在且后者中含有更高的峰度。我们将一定比例的脂质Sphinganine与PGY‑sRNA‑6混合，加热水煮后形成Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6的本草体。如图34‑图36显示，运用RT‑PCR检测A549细胞中PGY‑sRNA‑6的相对表达量，流式细胞术检测A549细胞中PGY‑sRNA‑6‑FAM的进入以及细胞共聚焦实验检测Cy5标记的PGY‑sRNA‑6在A549细胞中的进入及分布，均可以证明Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6的本草体可以使得PGY‑sRNA‑6有效的进入细胞中。图37A‑C显示Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6在poly(I：C)刺激的A549细胞的炎症模型中发挥着抗炎作用，Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6可有效降低细胞中IL‑1β、IL‑6和TNF‑αmRNA的相对表达。图38显示Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6在HEK 293T细胞中有效降低PGY‑sRNA‑6靶基因RELA的3’UTR的表达。 [0728] 脂质Sphinganine与两种有功能的小RNA HJT‑sRNA‑m7或PGY‑sRNA‑6合并后形成的本草体均在纤维化和炎症的细胞模型中发挥着有效的抗纤维化和抗炎作用。Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7的本草体如图39‑41所示，Sphinganine‑HJT‑sRNA‑m7可以有效的降低博来霉素诱导的小鼠的纤维化模型中小鼠肺部病例改变程度(图39)，有效降低博来 霉素诱导的小鼠的纤维化模型中小鼠肺部纤维化程度(图40和图41)。 [0729] 实施例7：Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6合并后形成的本草体在小鼠的炎症模型中发挥着有效的抗炎作用。 [0730] 1)本草体制备：采用水煮加热法制备，500μL NC mimic或PGY‑sRNA‑6(5nmol)单链RNA DEPC处理的水溶液，分别加入10μL sphinganine(d22：0)脂质混匀后，90℃加热15min。 [0731] 2)6‑8周龄雄性C57小鼠，用灌胃针分别给予脂质与NC或PGY‑sRNA‑6的本草体溶液体系，500μL/只，分组如下： [0732] 1)空白组：是指不做任何处理的小鼠； [0733] 2)poly(I：C)组：是指500μg的剂量气管滴注poly(I：C)刺激造模，给予刺激9小时后收取小鼠血浆进行细胞因子检测。该组作为阳性对照组。 [0734] 3)脂质Sphinganine‑NC组：是指提前48h，24h，3h给予脂质Sphinganine(d22：0)‑NC组成的本草体后，气管滴注500μg的剂量poly(I：C)刺激造模，给与刺激3h后再次给予脂质Sphinganine(d22：0)‑NC本草体。刺激9小时后收取小鼠血浆进行细胞因子检测。 [0735] 4)脂质Sphinganine‑PGY‑sRNA‑6组：是指提前48h，24h，3h给予脂质Sphinganine(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7组成的本草体后，气管滴注500μg的剂量poly(I：C)刺激造模，给与刺激3h后再次给予脂质Sphinganine(d22：0)‑PGY‑sRNA‑6本草体。刺激9小时后收取小鼠血浆TM进行细胞因子检测。用试剂盒BIO‑Plex Pro Mouse Cytokines Standard 23‑Plex，Group I kit(#60009RDPD，BIO‑RAD)测定小鼠血浆细胞因子表达含量。取全血于EDTA‑2K抗凝管，于4度2000g离心10分钟，取上层血浆，4度12,000g离心10分钟，取上清用于细胞因子检测。 [0736] 结果参见图42A‑G，本草体有效降低图中所示的细胞因子的水平。 [0737] 实施例8：不同方式检测本草体的理化性质 [0738] 1.临界胶束浓度(CMC)检测： [0739] 用0.25％四氢呋喃：99.75％水(v/v)配置6μM的1，6‑二苯基‑1，3，5‑己三烯(DPH)溶液。于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到50μL实验组溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光，激发光波长350纳米，发射光波长420nm。 [0740] 2sRNA组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到50μL sRNA溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0741] 3Sphinganine(So，d22：0)组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到50μL So(d22：0)溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0742] 4本草体组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到50μL本草体溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0743] A加热法So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(200nM)本草体组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到加热法制备的50μL So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(200nM)本草体溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0744] B加热法So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(600nM)本草体组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到加热法制备的50μL So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(600nM)本草体溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0745] C未加热So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(200nM)本草体组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到直接混合制备的50μL So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(200nM)本草体溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0746] D未加热So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(600nM)本草体组：于黑色96孔板每孔加入50μL DPH溶液加到直接混合制备的50μL So(d22：0)‑HJT‑sRNA‑m7(600nM)本草体溶液中，室温避光孵育1小时后，检测DPH荧光。 [0747] 如图43‑图44所示，本草体的中小RNA可能以嵌入脂质膜的形式存在，加热可以促进本草体的中小RNA嵌入脂质膜过程的稳定性。 [0748] 2：静态光散射方式检测本草体的几何分布和zeta电势结果 [0749] 本草体的粒径和Zeta电位检测 [0750] 1)本草体制备：100微升RNA溶液中(2μM，4μM，6μM)，各加入30ug脂质，充分混匀后90度水浴加热15分钟。测量时用ddH2O稀释至1毫升。 [0751] 2)粒径测量：1毫升体系转移至比色皿，使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instrument，UK)仪器测量。测量温度25度。 [0752] 3)Zeta电势测量：使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instrument，UK)仪器测量。测量温度25度。 [0753] 3：本草体的粒径分布，zeta电势检测以及透射电镜形态观察 [0754] 本草体制备：100微升水或RNA溶液(6μM)中，各加入30ug脂质，充分混匀后90度水浴加热15分钟。测量时用ddH2O稀释至1毫升。 [0755] 1)粒径测量：1毫升体系转移至比色皿，使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instrument，UK)仪器测量。测量温度25度。 [0756] 2)zeta电势检测：1毫升体系转移至比色皿，使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instrument，UK)仪器测量。测量温度25度。 [0757] 3)透射电镜观察：向200目铜网上滴一滴本草体溶液，多余液体用滤纸吸走。滴加2％磷钨酸(w/w，pH 7.0)负染2分钟，用滤纸吸走多余液体后室温晾干1小时。于JEOL JEM‑ 1400PLUS透射电镜观察。观察条件电压80kV。 [0758] 本草体的几何分布见图45，zeta电势结果见图46以及粒径分布参见图47A‑47D。本草体粒径分布100纳米左右，静态光散射强度在50‑120kcps，zeta电势小于60mV，绝对值大于20mV。 [0759] 实施例9：本草体的蛋白质递送效率和定位 [0760] 1.流式细胞技术检测脂质40PE(16：0/22：1)递送蛋白的效率 [0761] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达，200nM)，脂质40PE(16：0/22：1)(10mg/mL)， C6仪器(购自美国BD公司) [0762] 实验方法：用乙醚逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，1ug，3ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用 C6仪器测定。 [0763] 根据图149A‑D，绿色荧光蛋白自由进入A549细胞效率是3.6％，10ug/mL脂质40递送绿色荧光蛋白进入A549细胞效率是7.2％，30ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549细 胞效率是9.1％，脂质递送效率更高。脂质40可递送蛋白进入A549细胞。 [0764] 2.流式细胞技术检测脂质41sphinganine(d22：0)递送蛋白的效率 [0765] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质41sphinganine(d22：0)(10mg/mL)， C6仪器(购自美国BD公司) [0766] 实验方法：用逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，1ug，3ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用 C6仪器测定。 [0767] 根据图150A‑D，绿色荧光蛋白自由进入A549细胞效率是3.6％，10ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549细胞效率是23.4％，30ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549 细胞效率是26.6％，脂质递送效率更高。脂质41可高效递送蛋白进入A549细胞。 [0768] 3.流式细胞技术检测脂质41sphinganine(d22：0)递送蛋白的效率 [0769] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质41sphinganine(d22：0)(10mg/mL)， C6仪器(购自美国BD公司) [0770] 实验方法：加热法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于100ul水中，分别加入含0uL，1uL，3uL的脂质，充分混合后，90度加热15min得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用 C6仪器测定。 [0771] 根据图150E‑H，绿色荧光蛋白自由进入A549细胞效率是3.6％，10ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549细胞效率是5.5％，30ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549细 胞效率是9.5％，脂质递送效率更高。脂质41可高效递送蛋白进入A549细胞。 [0772] 4.流式细胞技术检测脂质71PE(16：0/16：0)递送蛋白的效率 [0773] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质71PE(16：0/16：0)(10mg/mL)， C6仪器(购自美国BD公司) [0774] 实验方法：用逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，1ug，3ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用 C6仪器测定。 [0775] 根据图151A‑D，绿色荧光蛋白自由进入A549细胞效率是3.6％，10ug/mL脂质71递送绿色荧光蛋白进入A549细胞效率是7.1％，30ug/mL脂质41递送绿色荧光蛋白进入A549细 胞效率是9.1％，脂质递送效率更高。脂质71可有效递送蛋白进入A549细胞。 [0776] 5.共聚焦荧光显微镜观察脂质40PE(16：0/22：1)递送蛋白质在细胞中的定位 [0777] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质40PE(16：0/22：1)(10mg/mL)，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa 488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购 自美国sigma公司) [0778] 实验方法：用逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，0.25ug，0.75ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片观察。 [0779] 根据图152，共聚焦显微镜观察下，能明显观察到绿色荧光蛋白的进入，脂质40可有效递送蛋白进入A549细胞。 [0780] 6.共聚焦荧光显微镜观察脂质41sphinganine(d22：0)递送蛋白质在细胞中的定位 [0781] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质41sphinganine(d22：0)，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa 488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [0782] 实验方法：用逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，0.25ug，0.75ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片观察。 [0783] 根据图153，共聚焦显微镜观察下，能明显观察到绿色荧光蛋白的进入，脂质41可高效递送蛋白进入A549细胞。 [0784] 7.共聚焦荧光显微镜观察脂质71PE(16：0/16：0)递送蛋白质在细胞中的定位 [0785] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，绿色荧光蛋白(内部构建质粒表达)，脂质71PE(16：0/16：0)，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa 488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [0786] 实验方法：用逆向挥发法制备本草体。将绿色荧光蛋白0.2nmol溶解于20ul水中，分别加入含0ug，0.25ug，0.75ug的100ul脂质乙醚溶液，充分混合后，超声3min，60度挥发除去有机溶剂后，以100uL opti‑MEM水化得到本草体溶液。之后将本草体加入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488 phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片观察。 [0787] 根据图154，共聚焦显微镜观察下，能明显观察到绿色荧光蛋白的进入，脂质71可高效递送蛋白进入A549细胞。 [0788] 第二部分实验 [0789] 方法 [0790] 1.植物药中脂质的提取 [0791] 1.1植物药的煎煮制备 [0792] 1)取100g饮片(红景天，蒲公英，金银花，穿心莲，购自北京同仁堂药店)，加入1000mL ddH2O浸泡30min。 [0793] 2)煎煮锅强火煎煮15min，弱火煎煮20min。 [0794] 3)煎煮后的药液400mL加入旋转蒸发仪，60℃，60rpm，30min浓缩至100mL。 [0795] 1.2脂质的提取 [0796] 1)向160mL根据以上1.1项所得汤剂(旋转蒸发仪浓缩)中加入氯仿‑甲醇混合液(氯仿∶甲醇＝1∶2，v/v)600mL，使得氯仿∶甲醇∶水＝1∶2∶0.8，搅拌混匀10‑15min。 [0797] 2)向锥形瓶中加入200mL氯仿，搅拌混匀10min。 [0798] 3)向锥形瓶中加入200mL ddH2O，使得氯仿∶甲醇∶水＝2∶2∶1.8，搅拌混匀10min。 [0799] 4)除去上层液体和中间层的不溶性物质，取下层的氯仿层，‑40℃冻存。 [0800] 1.3HPLC‑MS/MS鉴定脂质成分 [0801] 仪器条件 [0802] 1)色谱条件： [0803] 仪器：Ultimate 3000；色谱柱：Kinetex C18(100×2.1mm，1.9μm)；柱温：45℃；流动相：A：乙腈∶水(V/V，60∶40)，溶液含10mmol/L甲酸铵，流动相B：乙腈∶异丙醇(10∶90，V/V)，溶液含10mmol/L甲酸铵和0.1％甲酸。流速：0.4mL/min；进样量：4μL。 [0804] 2)质谱参数： [0805] a)正模式：Heater Temp 300℃，Sheath Gas Flow rate，45arb，Aux Gas Flow Rate，15arb，Sweep Gas Flow Rate，1arb，spray voltage，3.0KV，Capillary Temp，350℃，S‑Lens RF Level，30％.Scan ranges：200‑1500。 [0806] b)负模式：Heater Temp 300℃，Sheath Gas Flow rate，45arb，Aux Gas Flow Rate，15arb，Sweep Gas Flow Rate，1arb，spray voltage，2.5KV，Capillary Temp，350℃，S‑Lens RF Level，60％.Scan ranges：200‑1500。 [0807] 1.4植物药来源的脂质鉴定 [0808] 利用HPLC‑MS/MS鉴定其中的脂质成分，共鉴定植物药来源的脂质成分138种，其中阳离子模式鉴定125种，阴离子模式鉴定13种。取表10中所示的化合物1‑69继续进行下面的实验。需要说明的是，下文测试的脂质均为商业购买或商业合成的，并且使用方式如表10所述。 [0809] 2.制备脂质核酸复合物 [0810] 2.1逆向蒸发法： [0811] 制备100μL的脂质乙醚溶液，并按照表1中所示的脂质编号进行分组(脂质浓度见下表)，以5∶1的体积比将脂质溶液加入20μL核酸溶液(HJT sRNA或siRNA)，超声3min后，经 55℃挥发除去乙醚，然后加入100μL的DEPC处理的水水化，得到核酸脂质混合物。 [0812] 表15 [0813] [0814] [0815] 2.2水煮法： [0816] 100μL的核酸溶液(HJTsRNA或siRNA)加入2‑5μL的脂质溶液(浓度见表1)，混匀后，80‑100℃加热15‑30min，获得核酸脂质混合物。 [0817] 3.脂质核酸复合物的体外递送实验 [0818] 3.1实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测细胞内脂质递送核酸的表达量 [0819] 3.1.1培养MRC‑5细胞(肺胚胎成纤维细胞)，A549细胞(人肺腺癌细胞)，Caco‑2细胞(人结肠腺癌细胞)(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)至对数生长期，5 然后分别铺板到12孔板，细胞密度为6×10 /1mL培养基/孔；其中MRC‑5和Caco‑2细胞培养于Eagle′s MEM培养基(MEM，Gibco)中；A549细胞培养于Ham’s F‑12培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。 [0820] 3.1.2实验分组如下： [0821] 1)未处理组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。 [0822] 2)RNAiMAX处理组：分别用100μL opti‑MEM培养基(购自Invitrogen，Thermo TM Fisher Scientific)稀释2μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(试剂全称为 Lipofectamine RNAimax，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和HJT‑sRNA‑m7溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7的终浓度为100nM，该组作为阳性对照组。 [0823] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7溶液(终浓度为100nM)，该组作为阴性对照组； [0824] 4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7的终浓度为100nM。 [0825] 3.1.3与细胞共同孵育12‑24h后，用PBS清洗细胞2次，用TRIzol裂解液(购自Sigma‑Aldrich)收取细胞，提取其中总RNA，利用RT‑qPCR(SYBR Green染料法)检测进入细胞的HJT‑sRNA‑m7丰度，具体步骤如下： [0826] 1)提取细胞总RNA： [0827] A.12孔板培养的细胞(约1×106个细胞/孔)，每孔加入1mL TRIzol裂解液后，先置于冰上，待所有的样品都加入TRIzol后，室温放置5min，使其充分裂解； [0828] B.4℃，12,000rpm离心5min，弃沉淀，将TRIzol转移到新的离心管中； [0829] C.按200μL氯仿/mL TRIzol加入氯仿，充分振荡，混匀后室温放置5min； [0830] D.4℃，12,000rpm，离心15min； [0831] E.吸取上层水相，至另一离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5‑10min； [0832] F.4℃，12,000rpm，离心15min，弃上清，RNA沉于管底； [0833] G.加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0834] H.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0835] I.4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，室温晾干，用50μL RNase‑free的H2O溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。 [0836] 2)将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，用茎环法(stem‑loop法)(参见例如Real‑time quantification of microRNAs by stem‑loop RT‑PCR，Nucleic Acids Res.2005 Nov 27；33(20)：e179，通过引用并入本文)将sRNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μL，U6 TM RT stem‑loop引物2.0μL，HJT‑sRNA‑m7 RT stem‑loop引物2.0μL，MultiScribe 逆转录酶 1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H2O1.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃，5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。该逆转录过程中使用的茎环法引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成(U6 RT引物，因为RT‑qPCR反应对小RNA的定量只能是相对定量，所以以U6作为标准的参考基因，计算其相对表达量)：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGACAAAAATATG；HJT‑sRNA‑m7RT stem‑loop引物：GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTACAA)。 [0837] 3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶dH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后 40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设 计和合成(U6正向引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT，HJT‑sRNA‑m7正向引物：TCGCGCTGAGGTAGTAGGTT，HJT‑sRNA‑m7反向引物：GTGCACGCTCCGAGGT)。 [0838] 4)利用2‑ΔCt法(基因相对表达量＝2‑(Ct目的基因‑Ct内参基因))计算相对进入量(单链或双链RNA)。 [0839] 3.2实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)检测mRNA表达水平 [0840] 3.2.1培养THP‑1细胞(人单核细胞)至对数生长期，然后分别铺板到12孔板，细胞5 密度为6×10/1mL培养基/孔；THP‑1细胞培养于RPMI‑1640培养基(HyClone)中；37℃过夜 孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。 [0841] 3.2.2实验分组如下： [0842] 1)未处理组：是指未经处理THP‑1细胞，该组作为空白对照组。 [0843] 2)RNAiMAX处理组：分别用100μLopti‑MEM(Invitrogen，Thermo Fisher TM Scientific)培养基稀释2μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(nvitrogen，Thermo Fisher Scientific)和核酸溶液(TNF‑αsiRNA)，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM，该组作为阳性对照组。 [0844] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液(TNF‑αsiRNA，终浓度为400nM)，该组作为阴性对照组； [0845] 4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。 [0846] 3.2.3处理细胞24h后，给予1μg/mL大肠杆菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli 0111：B4，L4391，Sigma‑Aldrich)刺激，9h后用TRIzol裂解液收取细胞，提取其中总RNA，利用RT‑qPCR(SYBR Green染料法)检测TNF‑α(后续实施例的目标基因视类型而定，结果均显示在图中)的mRNA表达水平，具体步骤如下： [0847] 1)提取细胞总RNA：，步骤同3.1.3细胞总RNA的方法。 [0848] 2)将总RNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μTM L，随机引物2.0μL，MultiScribe 逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃， 5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。 [0849] 3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μL，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL逆转录得到的cDNA，3μL无RNA酶ddH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环； 最后40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公 司设计和合成，引物序列(内参基因UBC正向引物：CTGGAAGATGGTCGTACCCTG，内参基因UBC反向引物：GGTCTTGCCAGTGAGTGTCT；目的基因TNF‑α正向引物：CTGCCCCAATCCCTTTATT：目的基因TNF‑α反向引物：CCCAATTCTCTTTTTGAGCC)。 [0850] 4)利用2‑ΔCt法计算相对表达量，同上。 [0851] 3.3蛋白免疫印迹法检测(Western blot)蛋白表达水平 [0852] 3.3.1培养MRC‑5细胞(肺胚胎成纤维细胞)或A549细胞(人肺腺癌细胞)至对数生5 长期，然后分别铺板到12孔板，细胞密度为6×10 /1mL培养基/孔；其中MRC‑5细胞培养于 Eagle′s MEM培养基(MEM，Gibco)中；A549细胞培养于Ham’s F‑12培养基(HyClone)中；37℃过夜孵育，待细胞贴壁后进行后续实验。 [0853] 3.3.2实验分组如下： [0854] 1)未处理组：是指未经处理的细胞，该组作为空白对照组。 [0855] 2)RNAiMAX处理组：分别用100μL opti‑MEM培养基(Invitrogen，Thermo Fisher TMScientific)稀释2μL Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和核酸溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为 400nM，该组作为阳性对照组。 [0856] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液(终浓度为400nM)，该组作为阴性对照组； [0857] 4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。 [0858] 3.3.3与细胞共同孵育24h后，给予刺激物(1μg/mL双链RNA病毒模拟物poly(I：C)(P1530，Sigma‑Aldrich)或3ng/mL转化生长因子TGFβ1(Pepro Tech))刺激细胞，作用一定时间后，用强RIPA裂解液收取细胞，利用Western blot检测相关基因(相关基因类型视具体情况而定，均显示在相应的图中)的蛋白表达水平(A549细胞经poly(I：C)刺激后24h检测 REL‑A的蛋白表达水平，内参蛋白为β‑肌动蛋白；MRC‑5细胞经TGF‑β1刺激72h后检测纤连蛋白和α‑SMA蛋白的表达，内参蛋白为GAPDH；siRNA的递送实验检测相应的敲低基因的蛋白表达，内参蛋白为β‑肌动蛋白)，具体步骤如下： [0859] 1)蛋白样品的收集与BCA法浓度测定 [0860] H.弃去培养基，12孔板细胞，每孔加入1mL PBS缓冲液清洗一遍，每孔加入100μL预冷的强RIPA裂解液，将细胞用枪头刮下并转移到离心管中，置冰上裂解20min； [0861] I.4℃，12,000rpm，离心10min，转移上清至新的离心管中； [0862] J.将BCA试剂A与B(50∶1，v/v)充分混匀，配制BCA工作液； [0863] K.分别取25μL新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到96孔板中，每孔中加入200μLBCA工作液，并充分混匀；37℃孵育30min； [0864] L.用紫外分光光度计(Synergy 4多功能酶标仪)于562nm处检测其吸光度，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度； [0865] M.用RIPA裂解液和Loading Buffer调节样品浓度，使各样品浓度一致； [0866] N.95℃，变性处理10min。 [0867] 2)蛋白免疫印迹法检测(Western blot) [0868] E.制胶：采用10％浓度分离胶(下层胶)和5％浓度的浓缩胶(上层胶)，15孔梳子所做泳道，每个泳道样品蛋白上样量相等； [0869] F.蛋白电泳：加入电泳缓冲液，电泳起始电压80V；当溴酚兰染料到分离胶后，提高电压至120V继续电泳，直至溴酚兰染料达到分离胶底部或全部泳出凝胶； [0870] G.湿法转膜：按照转膜夹板(负极)‑海绵‑滤纸‑凝胶‑PVDF膜‑滤纸‑海绵‑转膜夹板(正极)的顺序进行组装；安装后并将整个转膜装置置于4℃冷室；恒定电流300mA，转膜120min； [0871] H.封闭：转膜结束后置于3％BSA封闭液中，室温封闭1h； [0872] I.一抗孵育：将封闭后的PVDF膜转移至杂交袋中，加入含有对应一抗(一抗的信息如下)的3％BSA封闭液，赶出袋中气泡，密封后4℃过夜孵育； [0873] J.洗膜：将PVDF膜取出，用TBST洗膜3次，每次10min； [0874] K.二抗孵育：弃去TBST，加入含有带有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠的二抗(购自杭州联科生物技术有限公司)的3％BSA封闭液(二抗稀释比例1∶5000)，室温孵育1小时； [0875] L.洗膜：用TBST洗膜3次，每次10min； [0876] M.显影：配制Western显色液(1∶1，V/V，Merck Millipore，ECL化学发光显色液购自Millipore公司)，并将配制好的显色液均匀滴加于膜结合蛋白的一侧；用保鲜膜小心的将膜包好，显色后观察； [0877] N.分析：用Image J软件进行分析。 [0878] 4.脂质核酸混合物的体内递送实验 [0879] 4.1实验步骤： [0880] 1)脂质核酸混合物制备：采用水煮法制备，400μL HJT‑sRNA‑m7(5nmol)单链RNA DEPC处理的水溶液，分别加入9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)，混匀后，100℃加热30min。 [0881] 2)6‑8周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠灌胃给RNA：用灌胃针分别给予HJT‑sRNA‑m7水溶液或脂质与HJT‑sRNA‑m7的混合溶液，400μL/只(HJT‑sRNA‑m7，5nmol/只)，分组如下： [0882] A.对照组(未处理组)：不做任何处理的小鼠； [0883] B.阴性对照组(lipid组)：灌胃9μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)； [0884] C.自由摄食组(Free uptake)：直接灌胃HJT‑sRNA‑m7单链RNA溶液； [0885] D.脂质与核酸混合物组：灌胃给脂质组合与HJT‑sRNA‑m7单链RNA的混合物。 [0886] 3)收样：灌胃给药3h后，用3mL TRIzol裂解小鼠全肺，匀浆后‑80℃冻存。 [0887] 4)总RNA提取： [0889] B.按200μL/mLTRIzol的比例加入氯仿，充分振荡混匀，室温放置15min； [0890] C.12,000rpm，4℃，离心15min，吸取上层水相，至另一离心管中； [0891] D.重复上述步骤，按上层水相加入等量的氯仿，充分混匀后室温放置10min； [0892] E.12,000rpm，4℃，离心15min； [0893] F.吸取上层水相至另一新EP管中，按0.5mL/mLTRIzol加入异丙醇混匀，室温放置5‑10min； [0894] G.12,000rpm，4℃，离心15min，弃上清； [0895] H.加入1mL 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀； [0896] I.12,000rpm，4℃，离心10min尽量弃上清； [0897] J.室温晾干5‑10min，用50μL DEPC处理过的H2O溶解RNA样品。 [0898] 5)RT‑qPCR(SYBR Green通用染料法)检测HJT‑sRNA‑m7的丰度。除非另有说明，HJT‑sRNA‑m7单链溶液指HJT‑sRNA‑m7单链的DEPC处理水溶液。HJT‑sRNA‑m7双链溶液指HJT‑sRNA‑m7双链的DEPC处理水溶液。 [0899] 实施例1‑1：不同类别脂质组合递送单链核酸进入MRC‑5细胞 [0900] (一)实验分组： [0901] 1)未处理组：未经处理的MRC‑5细胞； [0902] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μLRNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链的DEPC处理水溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为200nM； [0903] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为200nM)； [0904] 4)脂质与核酸混合物处理组：将3μL脂质单体或脂质组合分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。 [0905] (二)实验过程 [0906] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质单体或脂质组合的氯仿溶液(脂质No1/2/4/9/14/18/19/20/21/22/23/24/25/26/27/28/29/30/32氯仿溶液浓度为5mg/mL，脂质No3/8/10/11/12/13/33/34/35/36氯仿溶液浓度为10mg/mL，脂质No6/15/16/ 17/31氯仿溶液浓度为1mg/mL)，100℃，加热30min； [0907] a)脂质组合： [0908] b)MG(monoglyceride，单酰基甘油)：3μLNo34脂质； [0909] c)DG(diglyceride，甘油二酯)：3μL No1/2/3/19/35等体积氯仿溶液的混合物； [0910] d)TG(triglyceride，甘油三酯)：3μL No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33等体积氯仿溶液的混合物； [0911] e)LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：3μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物； [0912] f)PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：3μL No11/12等体积氯仿溶液的混合物； [0913] g)PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：3μL No8/38等体积氯仿溶液的混合物； [0914] h)Cer(Ceramides，神经酰胺)：3μL No4/14等体积氯仿溶液的混合物； [0915] i)So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：3μL No17/30/31等体积氯仿溶液的混合物； [0916] j)FA(fatty acid，脂肪酸)：3μL No29 [0917] k)混合物：3μL No1‑36(无No5/7)等体积氯仿溶液的混合物； [0918] l)混合物1：3μL No1‑36(无No5/7/34)等体积氯仿溶液的混合物； [0919] m)混合物2：3μL No1‑36(无No5/7/1/2/3/19/35)等体积氯仿溶液的混合物； [0920] n)混合物3：3μL No1‑36(无No5/7/6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33)等体积氯仿溶液的混合物； [0921] o)混合物4：3μL No1‑36(无No5/7/36/37)等体积氯仿溶液的混合物； [0922] p)混合物5：3μL No1‑36(无No5/7/11/12)等体积氯仿溶液的混合物； [0923] q)混合物6：3μL No1‑36(无No5/7/8)等体积氯仿溶液的混合物； [0924] r)混合物7：3μL No1‑36(无No5/7/4/14)等体积氯仿溶液的混合物； [0925] s)混合物8：3μL No1‑36(无No5/7/29)等体积氯仿溶液的混合物； [0926] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度200nM，加入细胞12h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [0927] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图48)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，混合物2、混合物3、混合物5、混合物7、混合物8介导核酸进入MRC‑5细胞的量较高。 [0928] 实施例1‑2：脂质组合递送单链核酸进入MRC‑5细胞和Caco‑2细胞 [0929] (一)实验分组： [0930] 测试细胞为MRC‑5细胞和Caco‑2细胞 [0931] 1)未处理组：未经处理的细胞； [0932] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为200nM； [0933] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为200nM)； [0934] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No1或No8或No12)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。 [0935] 5)脂质组合混合物与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(No1/8/12等体积混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。 [0936] 6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质单体No1或No8或No12与1μL下述脂质类别(MG、DG、TG、LPC、Cer、So或FA)混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为200nM。在图49A和图49B中，该处理组分别共同表示为No.1 2μL+mix 1μL、No.82μL+mix 1μL、和No.12 2μL+mix 1μL，其中横向涵盖范围内，MG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μL MG，DG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLDG，TG表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLTG，LPC表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLLPC，Cer表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLCer，So表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLSo，FA表示2μL脂质单体No1或No8或No12+1μLFA。 [0937] (二)实验过程 [0938] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质单体(脂质No1氯仿溶液浓度为5mg/mL，No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [0939] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：2μL No34脂质； [0940] DG(diglyceride，甘油二酯)：2μL No1/2/3/19/35等体积氯仿溶液的混合物； [0941] TG(triglyceride，甘油三酯)：2μL No6/9/10/13/15/16/18/20/21/22/23/24/25/26/27/28/32/33等体积氯仿溶液的混合物； [0942] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：2μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物； [0943] Cer(Ceramides，神经酰胺)：2μL No4/14等体积氯仿溶液的混合物； [0944] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：2μL No17/30/31等体积氯仿溶液的混合物； [0945] FA(fatty acid，脂肪酸)：2μL No29 [0946] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度200nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的细胞进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [0947] 结论：结果表明，对于MRC‑5细胞，混合物(No1/8/12等体积混合)，No.1 2μL+No.8 1μL，No.1 2μL+No.12 1μL，No.1 2μL+MG 1μL，No.8 2μL+MG 1μL，No 12 2μL+No.8 1μL以及No 12 2μL+So 1μL较为有效递送核酸。 [0948] 对于Caco‑2细胞，混合物(No1/8/12等体积混合)，No.1 2μL+No.8 1μL，No.1 2μL+No.12 1μL，No.1 2μL+MG 1μL，No.8 2μL+MG 1μL，No 12 2μL+No.8 1μL，No 12 2μL+LPC 1μL以及No 12 2μL+So 1μL较为有效递送核酸。 [0949] 实施例1‑3：脂质组合递送单链核酸进入细胞 [0950] 细胞类型：A549、MRC‑5和Caco‑2细胞 [0951] (一)实验分组： [0952] 1)未处理组：未经处理的细胞； [0953] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [0954] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [0955] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No8或No12)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [0956] 5)脂质组合PC(No12)&PE(No8)与核酸混合物处理组：将2.25μL脂质组合(PC(No12)&PE(No8)，2∶1，V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [0957] 6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.25μL脂质组合PC(No12)&PE(No8)与0.75μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图50中， 2.25μL+0.75μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。 [0958] (二)实验过程 [0959] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入脂质单体(脂质No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [0960] DG(diglyceride，甘油二酯)：0.75μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物； [0961] TG(triglyceride，甘油三酯)：0.75μL No15氯仿溶液； [0962] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物； [0963] PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No12氯仿溶液； [0964] Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.75μL No4氯仿溶液； [0965] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.75μL No31氯仿溶液； [0966] FA(fatty acid，脂肪酸)：0.75μL No29 [0967] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [0968] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图50)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [0969] 对于A549、MRC‑5和Caco‑2细胞，2.25μLPC(No12)&PE(No8)+0.75μL DG(No1/2等体积氯仿溶液的混合物)取得最佳的递送效率。 [0970] 实施例1‑4：脂质组合递送单链核酸进入细胞 [0971] 细胞类型：A549、MRC‑5和Caco‑2细胞 [0972] (一)实验分组： [0973] 1)未处理组：未经处理的细胞； [0974] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [0975] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [0976] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体(No1或No8或No12)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [0977] 5)脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)，1∶1∶1，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [0978] 6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与1μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图51中，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)+1μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。 [0979] (二)实验过程 [0980] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质单体(脂质No1氯仿溶液浓度为5mg/mL，No8/12氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [0981] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物； [0982] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [0983] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物； [0984] PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No12氯仿溶液； [0985] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [0986] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [0987] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29 [0988] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [0989] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图51)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [0990] 对于细胞类型A549、MRC‑5和Caco‑2细胞，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No8)&PC(No12)与1μL TG(15)取得最佳的递送效果。 [0991] 实施例1‑5：脂质组合递送单链核酸进入细胞 [0992] 细胞类型：A549、MRC‑5和Caco‑2细胞 [0993] (一)实验分组： [0994] 1)未处理组：未经处理的细胞； [0995] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [0996] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [0997] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No8与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM； [0998] 5)脂质组合PE(No8)&MG(No34)与核酸混合物处理组：将上述2.25μL脂质组合(PE(No8)&MG(No34)，2∶1，V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [0999] 6)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.25μL脂质组合PE(No8)&MG(No34)与0.75μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。在图52中， 2.25μL脂质组合PE(No8)&MG(No34)+0.75μL上方横线涵盖的处理组即为该混合物处理组。 [1000] (二)实验过程 [1001] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入脂质单体(脂质No8氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [1002] DG(diglyceride，甘油二酯)：0.75μL No1/2等体积氯仿溶液的混合物； [1003] TG(triglyceride，甘油三酯)：0.75μL No15氯仿溶液； [1004] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No36/37等体积氯仿溶液的混合物； [1005] PC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.75μL No12氯仿溶液； [1006] Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.75μL No4氯仿溶液； [1007] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.75μL No31氯仿溶液； [1008] FA(fatty acid，脂肪酸)：0.75μL No29 [1009] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1010] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图52)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1011] 对于细胞类型A549、MRC‑5和Caco‑2细胞，2.25μL PE(No8)&MG(No34)+0.75μL So(31)取得最佳的递送效果。 [1012] 实施例1‑6：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1013] (一)实验分组： [1014] 1)未处理组：未经处理的A549细胞； [1015] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1016] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1017] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No38与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1018] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μL脂质单体No38与1μL下述脂质类别MG、DG、TG、LPC、PC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1019] (二)实验过程 [1020] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质单体(1ipidNo38氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [1021] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1022] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1023] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1024] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液； [1025] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1026] PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液； [1027] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1028] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1029] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1030] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1031] 结论：对于A549细胞，与自由摄取组相比，2μL脂质单体No38与1μL LPC(37)、TG(15)、PC(12)、DG(1)可以有效递送核酸进入细胞(见图53)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1032] 实施例1‑7脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1033] (一)实验分组： [1034] 1)未处理组：未经处理的A549细胞； [1035] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1036] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1037] 4)脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)，1∶1∶1，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1038] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与1μL下述脂质类别MG、TG、LPC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1039] (二)实验过程 [1040] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1041] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1042] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1043] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液； [1044] PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液； [1045] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1046] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1047] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1048] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1049] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，2μL脂质组合DG(No1)&PE(No38)&PC(No12)与1μLTG(15)、Cer(4)、So(31)、FA(29)、LPC(37)、PE(8)均可以有效递送核酸进入A549细胞(见图54)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1050] 实施例1‑8脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1051] (一)实验分组： [1052] 1)未处理组：未经处理的A549细胞； [1053] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1054] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1055] 4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&MG(No34)，2∶1，V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1056] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)与1μL下述脂质类别DG、TG、LPC、PC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1057] (二)实验过程 [1058] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1059] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1060] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1061] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液； [1062] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1063] PE(phosphatidylethanolanine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液； [1064] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1065] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1066] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1067] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1068] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图55)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)与1μLLPC(37)取得最佳的递送效果。 [1069] 实施例1‑9脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1070] (一)实验分组： [1071] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1072] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1073] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1074] 4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)，2∶1，V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1075] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)与1μL下述脂质类别MG、DG、TG、LPC、PE、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1076] (二)实验过程 [1077] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1078] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1079] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1080] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1081] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液； [1082] PE(phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺)：1μL No8氯仿溶液； [1083] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1084] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1085] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29 [1086] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1087] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图56)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)与1μLCer(4)取得最佳的效果。 [1088] 实施例1‑10脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1089] (一)实验分组： [1090] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1091] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1092] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1093] 4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)，2∶2∶2∶3，V/V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为 100nM。 [1094] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与0.8μL下述脂质类别MG、LPC、Cer、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为 100nM。 [1095] (二)实验过程 [1096] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1097] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：0.8μL No34脂质； [1098] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.8μL No37氯仿溶液； [1099] Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.8μL No4氯仿溶液； [1100] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液； [1101] FA(fatty acid，脂肪酸)：0.8μL No29 [1102] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1103] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图57)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)，以及2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&DG(No1)&TG(No15)与0.8μLLPC(37)或So(31)取得较好的递送效率。 [1104] 实施例1‑11脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1105] (一)实验分组： [1106] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1107] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1108] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1109] 4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)，4∶2∶3，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1110] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)与0.8μL下述脂质类别DG、TG、PC、Cer、或So混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1111] (二)实验过程 [1112] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1113] DG(diglyceride，甘油二酯)：0.8μL No1氯仿溶液； [1114] TG(triglyceride，甘油三酯)：0.8μL No15氯仿溶液； [1115] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：0.8μL No12氯仿溶液； [1116] Cer(Ceramides，神经酰胺)：0.8μL No4氯仿溶液； [1117] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液； [1118] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1119] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图58)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1120] 实施例1‑12脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1121] (一)实验分组： [1122] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1123] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1124] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1125] 4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)，4∶2∶3，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1126] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与0.8μL下述脂质类别MG、DG、TG、LPC、So或FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1127] (二)实验过程 [1128] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1129] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：0.8μL No34脂质； [1130] DG(diglyceride，甘油二酯)：0.8μL No1氯仿溶液； [1131] TG(triglyceride，甘油三酯)：0.8μL No15氯仿溶液； [1132] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：0.8μL No37氯仿溶液； [1133] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：0.8μL No31氯仿溶液； [1134] FA(fatty acid，脂肪酸)：0.8μL No29氯仿溶液。 [1135] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1136] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图59)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中，2.2μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)与0.8μLFA(29)递送效率最佳。 [1137] 实施例1‑13脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1138] (一)实验分组： [1139] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1140] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1141] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1142] 4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)，44∶22∶33∶36，V/V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为 100nM。 [1143] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)&FA(No29)与1μL下述各脂质类别混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1144] (二)实验过程 [1145] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1146] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1147] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1148] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1149] LPC(Lysophosphatidylcholine，溶血卵磷脂)：1μL No37氯仿溶液； [1150] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液。 [1151] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1152] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图60)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1153] 实施例1‑14：脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1154] (一)实验分组： [1155] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1156] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1157] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1158] 4)脂质组合PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&PC(No12)&So(No31)，2∶1∶3，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1159] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μL PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与1μL下述各脂质类别MG、DG、TG、LPC、Cer、FA)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1160] (二)实验过程 [1161] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1162] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1163] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1164] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1165] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1166] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1167] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1168] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图61)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中以2μL PE(No38)&PC(No12)&So(No31)与1μLFA(29)递送效果最佳。 [1169] 实施例1‑15脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1170] (一)实验分组： [1171] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1172] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1173] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1174] 4)脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)，44∶22∶33∶36，V/V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为 100nM。 [1175] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)与1μL下述各脂质类别DG、TG、PC、Cer、FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1176] (二)实验过程 [1177] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1178] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1179] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1180] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1181] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1182] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1183] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1184] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，在2μLPE(No38)&MG(No34)&LPC(No37)&So(No31)的基础上，添加1μL1ul DG(1)、TG(15)、PC(12)、Cer(4)和FA(29)均可以有效递送核酸进入细胞(见图62)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。其中添加1μLPC(12)核酸递送效率最佳能够加强核酸递送效率。 [1185] 实施例1‑16脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1186] (一)实验分组： [1187] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1188] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1189] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1190] 4)脂质组合PE(No38)&LPC(No37)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合PE(No38)&LPC(No37)，2∶1，V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1191] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&LPC(No37)与1μL下述各脂质类别MG、DG、TG、PC、Cer、So、FA混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1192] (二)实验过程 [1193] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1194] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1195] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1196] TG(triglyceride，甘油三酯)：1μL No15氯仿溶液； [1197] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1198] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1199] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1200] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1201] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1202] 结论：结果表明，与自由摄取组相比，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图63)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。在2μL脂质组合PE(No38)&LPC(No37)基础上，添加1μLTG(15)核酸递送效果最佳。 [1203] 实施例1‑17脂质组合递送单链核酸进入A549细胞 [1204] (一)实验分组： [1205] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1206] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1207] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7单链溶液(终浓度为100nM)； [1208] 4)脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)，32∶8∶5，V/V/V)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1209] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将3μL脂质组合(2μLPE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)与1μL下述各脂质类别(MG、DG、PC、Cer、So或FA)混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1210] (二)实验过程 [1211] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1212] MG(monoglyceride，单酰基甘油)：1μL No34脂质； [1213] DG(diglyceride，甘油二酯)：1μL No1氯仿溶液； [1214] PC(phosphatidylcholine，磷脂酰胆碱)：1μL No12氯仿溶液； [1215] Cer(Ceramides，神经酰胺)：1μL No4氯仿溶液； [1216] So(Sphingoshine，(神经)鞘氨醇)：1μL No31氯仿溶液； [1217] FA(fatty acid，脂肪酸)：1μL No29氯仿溶液。 [1218] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法DG、检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1219] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图64)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)有效递送核酸进入细胞。在该脂质组合PE(No38)&LPC(No37)&TG(No15)基础上进一步添加其它脂质类别未 能加强这种效果。 [1220] 实施例2‑1：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1221] (一)实验分组： [1222] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1223] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1224] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链RNA溶液(终浓度为100nM)； [1225] 4)脂质单体与核酸处理组：将3μL脂质单体No38与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1226] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μL脂质单体No38与1μL脂质氯仿溶液No.8、1、2、11、12、34、37、4、30、31、29、32、1+2(等体积混合)或11+12(等体积混合)混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1227] (二)实验过程 [1228] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质单体(lipidNo38氯仿溶液浓度为10mg/mL)或脂质组合，100℃，加热30min； [1229] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1230] 结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图65)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质单体38能够有效递送双链核酸进入MRC‑ 5细胞，效果接近转染试剂RNAiMAX。在此基础上增加其他脂质未能进一步加强这种效果。 [1231] 实施例2‑2：脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1232] (一)实验分组： [1233] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1234] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1235] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1236] 4)脂质组合(No38&No37，2∶1，V/V)与核酸处理组：将3μL脂质组合与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1237] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μLNo38&No37混合物与1μL脂质氯仿溶液No.8、1、2、11、12、34、37、4、30、31、29、32、1+2(等体积混合)或11+12(等体积混合)混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1238] (二)实验过程 [1239] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1240] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1241] 结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图66)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。No38&No37混合物可以有效将双链核酸递送 到MRC‑5细胞中。在2μL No38&No37混合物基础上增加1μL除11和34号脂质外的脂质均能够加强这种效果。此外，出乎意料的是，以2μL No38&No37混合物基础上增加1μL脂质32取得了最佳的效果，甚至明显好于RNAiMAX的效果。 [1242] 实施例2‑3脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1243] (一)实验分组： [1244] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1245] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1246] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1247] 4)脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4))与核酸处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)，4∶2∶3，V/V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1248] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2.5μLPE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)混合物与0.5μL脂质(DG(2)、TG(6)、So(17)、FA(29)、MG(34)和LPC(37))混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1249] (二)实验过程 [1250] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1251] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法(SYBR Green通用染料法)检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1252] 结论：结果表明，上述脂质单体及脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图67)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。在LPE(No38)&PC(No12)&Cer(No4)混合物的 基础上添加1/5的LPC(37)能够显著增加核酸的递送效果。此外，添加DG(2)和TG(16)也可以增加进一步加强递送效果。 [1253] 实施例2‑4脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1254] (一)实验分组： [1255] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1256] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1257] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1258] 4)脂质组合(PE(No38)&DG(No2))与核酸处理组：将3μL脂质组合(PE(No38)&DG(No2))，2∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1259] 5)脂质组合与核酸混合物处理组：将上述3μL脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)混合物与1μL其他脂质No.37、31、29、34、12或4混合)分别与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1260] (二)实验过程 [1261] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，100℃，加热30min； [1262] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1263] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图68)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)混合物可以有效递送双链核酸进入A549细胞。与该脂质组合相比，以2∶1的比例混合的脂质组合(2μLPE(No38)&DG(No2)和37、31、12或4可以增加递送效果。 [1264] 实施例2‑5脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1265] (一)实验分组： [1266] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1267] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1268] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1269] 4)脂质组合((PE(No38)&LPC(No37)，4∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1270] (二)实验过程 [1271] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，70℃，加热30min； [1272] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1273] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图69)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果接近RNAiMAX。 [1274] 实施例2‑6脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1275] (一)实验分组： [1276] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1277] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1278] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1279] 4)脂质组合((PE(No38)&PC(No12)，4∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1280] (二)实验过程 [1281] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，70℃，加热30min； [1282] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1283] 结论：结果表明，上述脂质组合均可以有效递送核酸进入细胞(见图70)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果好于RNAiMAX或与RNAiMAX相等。 [1284] 实施例2‑7脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1285] (一)实验分组： [1286] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1287] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1288] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1289] 4)脂质组合((PE(No38)&PC(No12)&DG(No2)，4∶1∶5，V/V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1290] (二)实验过程 [1291] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min； [1292] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1293] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图71)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合((PE(No38)&PC(No12)&DG(No2)，4∶1∶5，V/V/V)的对A549细胞的双链核酸递送效果好于RNAiMAX。 [1294] 实施例2‑8脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1295] (一)实验分组： [1296] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1297] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1298] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1299] 4)脂质组合((PE(No38)&LPC(No37)&DG(No2)，32∶8∶5，V/V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1300] (二)实验过程 [1301] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min； [1302] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1303] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图72)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率，效果接近RNAiMAX。 [1304] 实施例2‑9脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1305] (一)实验分组： [1306] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1307] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1308] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1309] 4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1∶2，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1310] (二)实验过程 [1311] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min； [1312] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1313] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图73)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1∶2，V/V)的对A549细胞的双链核酸递送效果明显好于RNAiMAX。 [1314] 实施例2‑10脂质组合递送双链核酸进入A549细胞 [1315] (一)实验分组： [1316] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1317] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1318] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1319] 4)脂质组合((PE(No8)&LPC(No37)，4∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1320] (二)实验过程 [1321] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min； [1322] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1323] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图74)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1324] 实施例2‑11脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1325] (一)实验分组： [1326] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1327] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1328] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1329] 4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)，1∶2，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM； [1330] 5)脂质组合与HJT‑sRNA‑m7混合物处理组：3μL脂质组合(2μL PE(No8)&PC(No12)与1μL其他类别脂质(MG(34)、DG(2)、TG(32)、LPC(37)、PC(11)、PE(38)、Cer(4)、So(31)或FA(29))混合)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1331] (二)实验过程 [1332] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，80℃，加热30min； [1333] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1334] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图75)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。PE(No8)&PC(No12)可以有效递送核酸进入细胞，并且效果明显优于RNAiMAX。与PE(No8)&PC(No12)相比，以2∶1的比率混合的PE(No8)&PC(No12)和Cer (4)或PE(38)可以增强这种效果。 [1335] 实施例2‑12脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1336] (一)实验分组： [1337] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1338] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1339] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1340] 4)脂质组合((PE(No8)&PC(No12)&DG(No2)，8∶16∶3，V/V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1341] 5)实验过程 [1342] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，80℃，加热30min； [1343] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1344] 结论：结果表明，与自由摄取和RNAiMAX组相比，脂质组合((PE(No8)&PC(No12)&DG(No2)，8∶16∶3，V/V/V)的递送效果明显高于RNAiMAX的效果(见图76)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1345] 实施例2‑13脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1346] (一)实验分组： [1347] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1348] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1349] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1350] 4)脂质组合与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1351] 混合物1：PE(8)∶LPC(37)∶TG(32)‑4∶1∶2 [1352] 混合物2：PE(8)∶LPC(37)∶DG(2)‑4∶1∶2 [1353] 混合物3：PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1 [1354] 5)实验过程 [1355] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2.5μL脂质组合，90℃，加热15min； [1356] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1357] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图77)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。与RNAiMAX相比，混合物1：PE(8)∶LPC(37)∶TG(32)‑4∶1∶2和混合物2：PE(8)∶LPC(37)∶DG(2)‑4∶1∶2的递送效果是相当的，而混合物3：PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1的效果明显更好。 [1358] 实施例2‑14脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1359] (一)实验分组： [1360] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1361] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1362] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1363] 4)脂质组合混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：3μL脂质组合混合物(PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM； [1364] 5)脂质组合与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：3μL脂质组合(2μL脂质组合mix与1μL图78中其他类别脂质即脂质34、2、32、11、37、38或4混合)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1365] (二)实验过程 [1366] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入3μL脂质组合，90℃，加热15min； [1367] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1368] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图78)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。混合物(PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1)的递送效果明显好于RNAiMAX的递送效果。与混合物(PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1)相比，以2∶1的比率添加的混合物(PE(8)∶PC(12)∶So(31)∶FA(29)‑1∶2∶1∶1)与脂质2、38或4可以明显提高这种递送效果。 [1369] 实施例2‑15脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1370] (一)实验分组： [1371] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1372] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1373] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1374] 4)脂质组合((PE(No8)&So(No31)，6∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1375] 5)实验过程 [1376] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min； [1377] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞24h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1378] 结论：结果表明，脂质组合((PE(No8)&So(No31)，6∶1，V/V)的递送效果明显好于RNAiMAX的递送效果(见图79)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 [1379] 实施例2‑16脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1380] (一)实验分组： [1381] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1382] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1383] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1384] 4)脂质组合(PE(8)∶So(31)，4∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：2μL脂质组合与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM； [1385] 5)脂质组合与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：脂质组合(PE(8)∶So(31)，4∶1，V/V)与其他类别脂质(MG(34)、DG(2)、LPC(37)、PC(12)、PC(11)、Cer(4)、FA(29)或TG(32))混合(12∶3∶5，V/V，图80)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1386] (二)实验过程 [1387] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min； [1388] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞12h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1389] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图80)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。PE(8)∶So(31)(4∶1，V/V)可以有效递送核酸进入细胞，效果接近RNAiMAX。与PE(8)∶So(31)相比，以12∶3∶5的比例混合的PE(8)∶So(31)∶MG(34)、DG(2)、PC(12)、PC(11)、或TG(32)可以增加核酸递送效果，并且PE(8)∶So(31)∶)PC(11)的效果最佳，明显好于RNAiMAX。 [1390] 实施例2‑17脂质组合递送双链核酸进入MRC‑5细胞 [1391] (一)实验分组： [1392] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1393] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1394] 3)自由摄取(Free uptake)组：直接加入HJT‑sRNA‑m7双链溶液(终浓度为100nM)； [1395] 4)脂质组合(PE(8)∶Cer(4)，4∶1，V/V)与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：2μL脂质组合与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM； [1396] 5)脂质组合与HJT‑sRNA‑m7混合物作用组：脂质组合PE(8)∶Cer(4)与其他类别脂质MG(34)、DG(2)、LPC(37)、PC(12)、PC(31)、FA(29)或TG(32)混合(12∶3∶5，V/V，图81)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1397] (二)实验过程 [1398] 1)水煮法条件：100μL HJT‑sRNA‑m7双链溶液加入2μL脂质组合，90℃，加热15min； [1399] 2)实验条件：HJT‑sRNA‑m7终浓度100nM，加入细胞12h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的进入量。具体实验方法参见上文“实时荧光定量PCR检测细胞内脂质递送核酸的表达量”。所有实验一式三份进行。 [1400] 结论：结果表明，上述脂质组合可以有效递送核酸进入细胞(见图81)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。脂质组合PE(8)∶Cer(4)可以有效递送核酸进入细胞，效果接近RNAiMAX。与PE(8)∶So(31)相比，以12∶3∶5的比例混合的PE(8)∶So(31)∶DG(2)、FA(29)、或TG(32)可以增加核酸递送效果，并且FA(29)可以显著提高PE(8)∶So(31)的递送效果，明显好于RNAiMAX。 [1401] 实施例3脂质组合促进核酸通过消化道进入肺 [1402] 脂质组合如下： [1403] 脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V [1404] 1.脂质‑核酸复合物的制备： [1405] 方法：水煮法 [1406] 400μL HJT‑sRNA‑m7(5nmol)单链RNA的DEPC处理的水溶液，分别加入9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)，混匀后，100℃加热30min。 [1407] 2.核酸的消化道递送实验 [1408] 6‑8周龄雄性C57小鼠灌胃给RNA：用灌胃针分别给予HJT‑sRNA‑m7水溶液或脂质与HJT‑sRNA‑m7的混合溶液，400μL/只(HJT‑sRNA‑m7，5nmol/只)，分组如下： [1409] (1)对照组(未处理组)：不做任何处理的小鼠； [1410] (2)阴性对照组(脂质组)：灌胃9μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)； [1411] (3)自由摄食组(Free uptake)：直接灌胃HJT‑sRNA‑m7单链RNA； [1412] (4)脂质与核酸混合物组：灌胃给脂质组合与HJT‑sRNA‑m7单链RNA的混合物。 [1413] 灌胃给药3h后，用3mL TRIzol裂解小鼠全肺，提取总RNA，RT‑qPCR检测HJT‑sRNA‑m7的丰度。 [1414] 结论：如图82所示，与自由摄食组相比，9μL或18μL脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)显著促进小片段核酸进入肺组织(*表示P值小于0.05)。经过这种(非侵入式)灌胃施用，脂质组合(脂质PE(No38)&LPC(No37)&TG(No32)，4∶2∶3，V/V/V)可促进小片段核酸进入肺组织，可作为核酸药物的递送方式。 [1415] 实施例4脂质混合物介导双链核酸进入细胞的功能实验 [1416] 1 No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1417] 实验方法：蛋白免疫印迹法，具体参见上文“蛋白免疫印迹法检测蛋白表达水平”。 [1418] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7双链进入MRC‑5细胞 [1419] 如图83所示，通过水煮法和逆向蒸发法，No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1420] 未处理组：是指未经处理的MRC‑5细胞，即空白对照组； [1421] TGFβG1组：MRC‑5细胞加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1422] NC组：用脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与NC mimics双链混合物加入MRC5细胞中混匀，核酸的终浓度为200nM，24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，TGFβ1刺激72h后收样； [1423] M7组：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与HJT‑sRNA‑m7双链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为200nM，24h后加入TGFβ1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。 [1424] 2)No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导siRNA进入A549细胞 [1425] 如图84和85所示，通过加热法，No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥敲低蛋白表达作用。 [1426] 图84中的未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1427] si‑NC：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑NC(广州锐博公司合成，序列未知)混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。 [1428] si‑CPSF30：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑CPSF30混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。 [1429] si‑LAMP1：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑LAMP1混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。 [1430] si‑LAMP2：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑LAMP2混合物加入A549细胞中，混匀，终浓度400nM；48h后收取细胞，RIPA强裂解液裂解细胞收取蛋白样品。 [1431] 图85中自由摄取(Free uptake)组：直接加入核酸溶液 [1432] Lipo 2000组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)和si‑NFκB溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，核酸溶液终浓度为400nM；24h后加入polyI：C刺激(浓度1μg/mL1ug/mL)，6h后收取蛋白样品。 [1433] No.8(PE)∶No.12(PC)(1∶2)：通过加热法，No.8(PE)∶No.12(PC)(1∶2)与si‑NFκB溶液混合，加入细胞中，核酸溶液终浓度为400nM；24h后加入polyI：C刺激(浓度1μg/mL)，6h后收取蛋白样品。 [1434] 上述核酸的类型和序列：见表2。 [1435] 3)No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)介导siRNA进入THP‑1细胞 [1436] 如图86所示，通过水煮法，No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1437] naive组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1438] LPS组：未加入siRNA，只加入LPS刺激，终浓度1μg/mL，9h后收取RNA样品及细胞上清； [1439] si‑NC组：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑NC混合物加入THP‑1细胞中，混匀，终浓度400nM；24h后加入LPS，终浓度1μg/mL，刺激9h后收取细胞TRIzol裂解样品，收集上清做ELISA检测。 [1440] si‑TNFα组：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v＝1∶2)与si‑TNFα双链混合物加入THP‑1A549细胞中，混匀，终浓度400nM，24h后加入LPS，终浓度1μg/mL，刺激9h后收取细胞TRIzol裂解样品，收集上清做ELISA检测。 [1441] 2 No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1442] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞 [1443] 如图87所示，通过水煮法，No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)可以有效递送抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5MRC5细胞降低纤连蛋白蛋白表达。 [1444] 2)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达 [1445] 如图88所示，通过水煮法，在No.8(PE)、No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物基础上加入No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1446] 未处理组：未处理的A549细胞； [1447] NCsiRNA组：No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物与si‑NC经过水煮法制备的siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1448] XRN2 siRNA组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.2(DG)(v∶v∶v＝2∶4∶3)脂质混合物与XRN2 siRNA经过水煮法制备的混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1449] 3 No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1450] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法) [1451] 如图89所示，通过水煮法，在No.8(PE)∶No.12(PC)(v∶v∶v＝1∶2)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物可以有效递送抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5MRC5细胞发挥降低纤维化蛋白表达的作用。 [1452] 未处理组：未处理的细胞； [1453] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1454] NC组：用脂质组合No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1TGFb 1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1455] m7组：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)与HJT‑sRNA‑m7双链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。 [1456] 2)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导NFκBsiRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法) [1457] 如图90所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1458] 未处理组：未处理的细胞； [1459] siNC组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与si‑NCsiNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1460] si‑NFκB组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.4(Cer)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与NFκB siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1461] 4 No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.PC(11)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1462] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.PC(11)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达 [1463] 如图91所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物基础上加入No.11(PC)(v∶v∶v＝1∶2∶1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1464] 未处理组：未处理的细胞； [1465] si‑NC组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.PC(11)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与si‑NCsiNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1466] si‑XRN2组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.PC(11)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1467] 5 No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.LPC(37)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1468] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.LPC(37)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物介导XRN2siRNA双链核酸进入A549细胞抑制基因表达 [1469] 如图92所示，在No.8(PE)、No.12(PC)(v∶v＝1∶2)脂质混合物基础上加入No.37(LPC)(v∶v∶v＝1∶2∶1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1470] 未处理组：未处理的细胞； [1471] siNC组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.LPC(37)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1472] si‑XRN2组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.LPC(37)(v∶v∶v＝1∶2∶1)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1473] 6 No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1474] 1)No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物介导CPSF4siRNA进入A549细胞抑制基因表达 [1475] 未处理组：未处理的细胞； [1476] si‑NCsiNC组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物与si‑NCsiNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1477] si‑CPSF4组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物与CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1478] 如图93所示，No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.MG(34)(v∶v∶v＝2∶3∶1)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1479] 7 No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1480] 1)No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法) [1481] 如图94所示，与对照相比，m7明细条带变浅。M7的作用并不足以使细胞恢复到未加刺激的水平。 [1482] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1483] TGFβ1组：加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1484] NC组：用脂质组合No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)递送NC mimics 24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1485] m7组：脂质组合No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)与HJT‑sRNA‑m7双链混合物加入MRC‑5MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGFβ1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样。 [1486] 2)No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达 [1487] 如图95所示，No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1488] siNC组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1489] si‑XRN2组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.32(TG)(v∶v∶v＝32∶8∶5)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1490] 8 No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1491] 1)如图96所示，No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7进入MRC‑5细胞(水煮法) [1492] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1493] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1494] NC组：用脂质组合No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1495] M7组：脂质组合No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)与HJT‑sRNA‑m7单链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1496] 2)如图97所示，No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法) [1497] No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1498] siNC组：表示No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1499] si‑XRN2组：表示No.1(DG)、No.8(PE)、No.12(PC)、No.4(Cer)、No.31(So)、No.29(FA)、No.16(TG)(v∶v∶v∶v∶v∶v∶v＝2∶1∶2∶2∶3∶1∶3)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1500] No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1501] 1)如图98所示，No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶2.5)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(水煮法) [1502] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1503] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1504] NC组：用脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1505] M7组：脂质组合No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)与HJT‑sRNA‑m7单链混合物加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1506] 2)如图99所示，No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法) [1507] No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1508] siNC组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1509] si‑XRN2组：表示No.8(PE)∶No.12(PC)∶No.31(So)∶No.29(FA)∶No.4(Cer)(v∶v∶v∶v∶v＝2∶4∶2∶2∶5)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1510] 10 No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1511] 1)如图100所示，No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)介导具有抗纤维化效应的HJT小RNA HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(水煮法)[1512] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1513] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1514] NC组：用脂质组合No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1515] M7组：脂质组合No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7加入MRC5细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM；24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1516] 2)如图101所示，No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物介导XRN2siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法) [1517] No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1518] siNC组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1519] si‑XRN2组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物与XRN2siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1520] 11 No.38(PE)∶No.12(PC)∶No2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1521] 如图102所示，No.38(PE)∶No.12(PC)∶No2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达。 [1522] 将No.8(PE)替换为No.38(PE)，与No.12(PC)、No.2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)混合的脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1523] siNC组：表示No.38(PE)∶No.12(PC)∶No2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1524] si‑XRN2组：表示No.38(PE)∶No.12(PC)∶No2(DG)(v∶v∶v＝4∶1∶3)脂质混合物与XRN2 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1525] 12 No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.12(PC)(v∶v∶v＝4∶1∶1)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1526] 如图103所示，No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.12(PC)(v∶v∶v＝4∶1∶1)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(逆向蒸发法) [1527] 在No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物基础上加入No.12(PC)(v∶v∶v＝4∶1∶1)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用抑制基因表达。 [1528] siNC组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.12(PC)(v∶v∶v＝4∶1∶1)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1529] si‑RNA组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)∶No.12(PC)(v∶v∶v＝4∶1∶1)脂质混合物与XRN2 siRNA、β‑肌动蛋白siRNA、Ssu 72 siRNA或CPSF4 siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1530] 13 No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1531] 1)如图104所示，在No.38(PE)、No.37(LPC)、No.12(PC)脂质混合物基础上加入No.4(Cer)，No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物抗纤维化HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入MRC5细胞发挥功能，降低纤维化蛋白纤连蛋白表达水平(水煮法) [1532] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1533] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1534] NC组：用脂质组合No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1535] HJT‑3&a2&H3组：表示No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3双链核酸混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1536] m7：表示No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1537] 2)如图105所示，No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA，v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)可以有效递送核酸进入细胞发挥作用抑制基因表达。 [1538] siNC组：表示No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1539] si‑XRN2组：表示No.4(Cer)∶No.12(PC)∶No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v∶v∶v＝5∶2∶8∶3)脂质混合物与XRN2混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1540] 14 No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物介导核酸进入细胞发挥功能 [1541] 1)如图106所示，No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物介导抗纤维化HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3、HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入MRC5细胞发挥功能，降低纤维化蛋白纤连蛋白表达水平(水煮法) [1542] 未处理组：是指未经处理的细胞，即空白对照组； [1543] TGF‑β1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1544] NC组：用脂质组合No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1545] HJT‑3&a2&H3组：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1546] m7：表示No.38(PE)∶No.37(LPC)(v∶v＝4∶1)脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1547] 2)如图107所示，No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物介导XRN2 siRNA进入A549细胞抑制基因表达(水煮法) [1548] No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物可以有效递送核酸进入细胞发挥作用。 [1549] siNC组：表示No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1550] si‑XRN2组：表示No.38(PE)∶No.2(DG)∶No.31(So)(v∶v∶v＝4∶2∶3)脂质混合物与XRN2混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1551] 实施例5：脂质41及其组合物的效果验证 [1552] (一)脂质单体通过不同制备方法(逆向蒸发法及水煮法)递送核酸(双链RNA及单链RNA)进入细胞 [1553] 脂质41.Sphinganine(d22：0) [1554] [1555] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1556] 如图108所示，脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在水煮法的情况下，脂质41的递送效果是RNAimax的效果的约2倍，而在逆向蒸发法的情况下，脂质41的递送效果也明显高于RNAimax的效果。 [1557] 如图109所示，脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入MRC5细胞。对于MRC5细胞，在水煮法的情况下，脂质41递送双链RNA进入MRC5细胞，而在逆向蒸发法的情况下，脂质41的递送效果明显高于RNAimax的效果。 [1558] 如图110所示，脂质41通过水煮法递送HJT‑sRNA‑m7单链RNA进入A549及MRC5细胞。 [1559] 2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率 [1560] 2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购 自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio‑rad公司。 [1561] 2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反 应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用 QuantaSoft软件对结果进行分析。其中分组情况：(1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；(3)RNAimax组：用RNAimax将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测；(4)No.41组：脂质41通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。 [1562] 实验结果与分析：如图111所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.41脂质均可以有效递送HJT‑sRNA‑m7 dsRNA进入A549细胞，水煮法的效果优于逆向蒸发法。 [1563] 3.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率 [1564] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM‑sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质41， C6仪器(购自美国BD公司) [1565] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑FAM溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，收样检测，先用PBS清洗三遍后，用胰酶消化三分钟后，移去胰酶，再用PBS清洗后吹下来。用 C6仪器测定。 [1566] 如图112所示，实验结果：脂质41递送PGY‑sRNA‑6单链RNA效率是94.1％，比阳性对照RNAiMAX的69.4％相比，递送效率更高。同时脂质41递送PGY‑sRNA‑6双链RNA效率是96.7％，比阳性对照RNAiMAXd的94.9％相比，递送效率也更高，脂质41可高效递送单链及双链核酸进入A549细胞。 [1567] 4.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位 [1568] 实验材料：A549细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY‑sRNA‑6‑Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质41，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [1569] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑Cy3溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。 [1570] 如图113所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY‑sRNA‑6‑Cy3的进入，脂质41可有效递送双链核酸进入A549细胞。 [1571] 5.Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率 [1572] 如图114，脂质单体No.41介导sRNAi进入MRC5A549细胞发挥敲低蛋白表达作用(逆向蒸发法)。在蛋白质水平上，脂质单体No.41介导蛋白敲低效果显著高于RNAimax介导的 HJT‑sRNA‑m7抑制效果。 [1573] 未处理：未处理的MRC5A549细胞 [1574] siNC：表示脂质单体No.41与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1575] siRNA：表示脂质单体No.41与LAMP2、XPN2、Ssu72、CPSF4或β肌动蛋白siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1576] 自由摄取组：直接加入测试物 [1577] RNAimax：分别用100ul opti‑MEM培养基稀释2ul RNAiMAX转染试剂和核酸溶液，二者混匀后放置15min，加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。 [1578] So(41)(逆向蒸发法)：将脂质41与核酸混合物加入细胞中，混匀，核酸的终浓度为400nM。 [1579] 如图115，脂质单体No.41介导抗纤维化HJT‑sRNA‑m7双链进入MRC5细胞(逆向蒸发法)。在蛋白质水平上，脂质单体No.41介导的HJT‑sRNA‑m7抑制效果高于RNAimax介导的HJT‑sRNA‑m7抑制效果。 [1580] TGFβ1组：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1581] NC组：用脂质单体No.41递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1582] HJT‑3&a2&H3组：表示脂质单体No.41与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1583] m7：表示脂质单体No.41与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1584] 6.脂质41体内实验结果汇总 [1585] 【实验方法】6‑8周龄小鼠，22‑24g，饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心SPF级动物房，小鼠灌胃前禁食12h，将小鼠随机分为3组，分别为：(1)对照组，灌胃400ul DEPC处理的水；(2)自由摄取组，灌胃小RNA(PGY‑sRNA‑26与PGY‑sRNA‑32及PGY‑sRNA‑23，每条小RNA 1nmol/只，溶于400ulDEPC处理的水；(3)脂质41组：灌胃小RNA(PGY‑sRNA‑26与PGY‑sRNA‑32)和脂质41用加热法制备的混合物，每条小RNA 1nmol/只，脂质4110ul/只，溶于400ul DEPC处理的水。灌胃6h后收取各组织器官样品。所有的小RNA为3p末端2‑O‑甲基化修饰的单链RNA。 [1586] 【实验结果】 [1587] 如图140所示，脂质41可以促进小RNA进入血液，保护其在血液中不被降解 [1588] 如图141所示，脂质41可以促进小RNA进入胃部细胞，保护其在胃中不被降解 [1589] 如图142所示，脂质41可以促进小RNA进入小肠细胞，保护其在小肠中不被降解 [1590] 如图143所示，脂质41可以促进小RNA进入肝脏，保护其在肝脏中不被降解 [1591] 7.包含脂质41的脂质组合在核酸递送中效果 [1592] (1)脂质组合1(No.8+No.41＝6∶1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6∶1)在核酸递送中的作用 [1593] 如图116所示，脂质组合1(No.8+No.41＝6∶1)与脂质组合2(No.38+No.41＝6∶1)介导抗纤维化HJT‑3&a2&H3，HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT‑sRNA‑m7抑制效果显著。 [1594] TGF：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1595] NC组：表示用脂质单体No.41递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1596] HJT‑3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1597] HJT‑m7：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1598] (2)脂质组合3(No.39+No.41＝6∶1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6∶1)在核酸递送中的作用 [1599] 如图117所示，脂质组合3(No.39+No.41＝6∶1)与脂质组合4(No.40+No.41＝6∶1)介导抗纤维化HJT‑3&a2&H3，HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT‑sRNA‑m7抑制效果显著。 [1600] TGF：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1601] NC组：表示表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1602] HJT‑3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1603] HJT‑m7：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1604] (3)脂质组合5(38+12+41+29＝1∶2∶1∶1)在核酸递送中的作用 [1605] 如图118所示，脂质组合5(38+12+41+29＝1∶2∶1∶1)介导抗纤维化HJT‑3&a2&H3，HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(加热法)，在蛋白质水平上介导的HJT‑sRNA‑m7抑制效果显著。 [1606] TGF：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1607] NC组：表示表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1608] HJT‑3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1609] HJT‑m7：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1610] (4)脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶4∶3)在核酸递送中的作用 [1611] 如图119所示，脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶4∶3)介导抗纤维化HJT‑3&a2&H3，HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞(加热法及逆向蒸发法)，在蛋白质水平上介导的HJT‑3&a2&H3，HJT‑sRNA‑m7抑制效果显著。 [1612] TGF：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1613] 3’‑NC组：表示表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1TGFb1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1614] 3’‑3&a2&H3组：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑3、HJT‑sRNA‑a2、HJT‑sRNA‑h3混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1615] 3’‑m7：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1616] 右图：通过逆向蒸发法制备脂质‑RNA混合物，脂质组合6(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶4∶3)可有效递送XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。 [1617] siNC：表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1618] siRNA：表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1619] (5)脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1∶6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1∶1)在核酸递送中的作用 [1620] 如图120所示，采用逆向蒸发法，脂质组合7(12(PC)+41(So)＝1∶6)和脂质组合8(12(PC)+41(So)＝1∶1)可有效递送Ssu72、CPSF4siRNA进入A549细胞(逆向蒸发法)，在蛋白水平上显著降低表达水平。 [1621] siNC：表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1622] siRNA：表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1623] (6)脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6∶1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶2∶2)在核酸递送中的作用 [1624] 如图121所示，采用逆向蒸发法，脂质组合9(12(PC)+41(So)＝6∶1)和脂质组合10(40(PE)+12(PC)+41(So)＝2∶2∶2)可有效递送XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。 [1625] siNC：表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1626] siRNA：表示脂质混合物与XRN2、Ssu72、CPSF4siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1627] (7)脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1∶1∶1)在核酸递送中的作用 [1628] 如图122所示，采用逆向蒸发法，脂质组合11(4(Cer)+12(PC)+41(So)＝1∶1∶1)可有效递送Ssu72siRNA进入A549细胞，在蛋白水平上显著降低表达水平。 [1629] siNC：表示脂质混合物与siNC混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM； [1630] siSsu72：表示脂质混合物与Ssu72siRNA混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1631] 实施例6：脂质38及其组合物的效果验证 [1632] 脂质38.PE(16：0/16：1) [1633] [1634] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1635] (1)脂质38通过水煮法递送双链RNA进入A549细胞及MRC5细胞 [1636] 如图123所示，脂质38通过加热法递送双链RNA进入A549细胞及MRC5细胞。对于MRC5细胞，在加热法的情况下，脂质38对双链RNA的递送效果是RNAimax的效果的约2倍。 [1637] (1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1638] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终浓度100nM； [1639] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1640] 4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.38与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。(2)脂质38通过水煮法递送HJT‑sRNA‑m7单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞 [1641] 如图124所示脂质38通过加热法递送HJT‑sRNA‑m7单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞，递送效率远远高于RNAimax的效果。 [1642] (1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1643] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7单链核酸溶液与细胞共同孵育12h，核酸终浓度100nM； [1644] (3)RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1645] (4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.64与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。 [1646] 2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率 [1647] 2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购 自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio‑rad公司。 [1648] 2.2实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反 应。具体操作步骤参考QX200Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用 QuantaSoft软件对结果进行分析 [1649] (1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1650] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h； [1651] (3)RNAimax组：用RNAimax将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测； [1652] (4)No.38组：脂质38通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。 [1653] 实验结果与分析：如图125所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.38脂质均可以有效递送HJT‑sRNA‑m7 dsRNA进入A549细胞。 [1654] 3.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率 [1655] 实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM‑sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质38， C6仪器(购自美国BD公司) [1656] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑FAM溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备脂质‑sRNA混合物，加入A549细胞中，混匀，共孵育6h后收样检测。PBS清洗三遍后，用胰酶消化细胞为单个细胞，PBS重悬，利用 C6仪器检测相对进入量。 [1657] 如图126所示，实验结果：脂质38递送单链RNA效率是72.5％，接近阳性对照RNAiMAX递送效率。 [1658] 4.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位 [1659] 实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY‑sRNA‑6‑Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质38，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [1660] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。 [1661] 如图127所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY‑sRNA‑6‑Cy3的进入，水煮法制备No.38脂质‑sRNA混合物均可以有效递送双链进入A549细胞。 [1662] 实施例7：脂质64及其组合物的效果验证 [1663] 脂质64.PE(15：0/24：1(15Z)) [1664] [1665] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1666] (1)脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入A549细胞 [1667] 如图128所示，脂质64通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送HJT‑sRNA‑m7双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在水煮法的情况下，脂质64的递送效果是RNAimax的效果的约3倍。 [1668] (3)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1669] (4)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终浓度100nM； [1670] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1671] 4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.64与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。 [1672] 2.流式细胞技术检测脂质递送核酸效率 [1673] 实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，FAM‑sRNA(购自锐博生物科技有限公司)，脂质64， C6仪器(购自美国BD公司) [1674] 实验方法：将FAM‑sRNA溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。脂质‑sRNA混合物，加入A549细胞中，混匀，共孵育6h后收样检测。PBS清洗三遍后，用胰酶消化细胞为单个细胞，PBS重悬，利用 C6仪器检测相对进入量。 [1675] 如图129所示，实验结果：脂质64递送PGY‑sRNA‑6单链RNA效率可达到阳性对照RNAiMAX的约1/2。 [1676] 3.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位 [1677] 实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY‑sRNA‑6‑Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质64，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [1678] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片。 [1679] 如图130所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY‑sRNA‑6‑Cy3的进入。脂质64递送单链RNA进入A549细胞。 [1680] 实施例8：脂质40及其组合物的效果验证 [1681] 脂质40.PE(16：0‑22：1) [1682] [1683] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1684] 脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞 [1685] 如图131所示，脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞。对于A549细胞，在逆向蒸发法的情况下，脂质40的递送效果是RNAimax的效果的约1/2。 [1686] 组：不做任何处理的A549细胞； [1687] 自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育12h；核酸终 [1688] 浓度100nM； [1689] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1690] 4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.40与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法或逆向蒸发法制备混合物，加入A549细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。 [1691] 2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率 [1692] 2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂TM 解液购自Sigma公司，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription KitHigh逆转录试剂盒 购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，数字PCR相关试剂购自Bio‑rad公司。 [1693] 2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用TaqManTM MicroRNA Reverse Transcription KitHigh逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用 QuantaSoft软件对结果进行分析。 [1694] (1) 组：不做任何处理的A549细胞； [1695] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h； [1696] (3)RNAimax组：用RNAimax将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h后收样检测； [1697] (4)No.40组：脂质40通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞，6h后收样检测。 [1698] (5)实验结果与分析：如图132所示，在水煮法或逆向蒸发法中，No.40脂质均可以有效递送HJT‑sRNA‑m7 dsRNA进入A549细胞。 [1699] 3.共聚焦荧光显微镜观察脂质递送核酸在细胞中的定位 [1700] 实验材料：A549cells(购自中国医学科学院细胞中心)，PGY‑sRNA‑6‑Cy3(购自锐博生物科技有限公司)，脂质40，Zeiss LSM780(购自德国Zeiss公司)，Alexa488phalloidin(购自美国invitrogen)，DAPI(购自美国invitrogen)，多聚甲醛(购自美国 sigma公司) [1701] 实验方法：将PGY‑sRNA‑6‑Cy3溶解于100ul水中，并与4ul脂质混合，用水煮法制备。之后将混合物丢入A549细胞中，共孵育6h后，PBS清洗三遍后，4％的多聚甲醛固定，PBS清洗三遍后，Alexa 488phalloidin染色30min，PBS清洗三遍后，Dapi染色5min，PBS清洗，后封片观察。 [1702] 如图133所示，实验结果：共聚焦显微镜观察下，能明显观察到红色PGY‑sRNA‑6‑Cy3的进入，No.40脂质均可以有效递送HJT‑sRNA‑m7 dsRNA进入A549细胞。 [1703] 4.Western Blotting实验检测脂质递送核酸的效率 [1704] 如图134所示，磷脂酰乙醇胺类脂质单体脂质40介导抗纤维化双链RNA HJT‑sRNA‑m7进入MRC5细胞，下调纤连蛋白蛋白表达水平 [1705] TGF：加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1706] 3’‑NC组：表示表示用脂质混合物递送NC mimics 24h后加入TGF‑β1蛋白(终浓度3ng/mL)刺激，72h后收样； [1707] 3’‑m7：表示脂质混合物与HJT‑sRNA‑m7双链核酸溶液混合物加入细胞，混匀，核酸终浓度为：400nM。 [1708] 实施例8：脂质37的效果验证 [1709] lipid 37.LPC(18：3) [1710] [1711] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1712] 脂质37通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞 [1713] 如图135所示，通过水煮法递送单链RNA进入A549细胞及MRC5细胞。 [1714] 未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1715] 自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育3h；核酸终浓度100nM； [1716] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1717] 脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.39与HJT‑sRNA‑m7的单链核酸溶液经水煮法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。3h后收样检测进入量。 [1718] 实施例9：脂质39的效果验证 [1719] 脂质39.PE(16：1‑18：1) [1720] [1721] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1722] 如图136所示，脂质39通过不同制备方法(水煮或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞 [1723] (5) 组：不做任何处理的A549细胞； [1724] (6)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM； [1725] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1726] 4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.39与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测进入量。 [1727] 2.数字PCR(ddPCR)技术检测脂质递送核酸效率 [1728] 2.1实验材料：A549细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，TRIzol裂解液购自Sigma公司，High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录试剂盒购 自美国ABI公司，数字PCR相关试剂购自Bio‑rad公司。 [1729] 2.3实验方法：按照前述方法用TRIzol裂解液收集并提取细胞总RNA，使用High capacity cRNA Reverse Transcription Kit逆转录为cDNA，将不同组cDNA进行数字PCR反 应。具体操作步骤参考QX200 Droplet Reader and QuantaSoft Software说明书，利用 QuantaSoft软件对结果进行分析。 [1730] (1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1731] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；12h； [1732] (3)RNAimax组：用RNAimax将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA转染进入A549细胞，6h12h后收样检测； [1733] (4)No.39组：脂质39通过逆向蒸发法递送双链RNA进入A549细胞，6h12h后收样检测。 [1734] 如图137所示，通过逆向蒸发法，No.39脂质可以有效递送HJT‑sRNA‑m7双链核酸进入A549细胞。 [1735] 实施例10：脂质60和62的效果验证 [1736] 脂质60.dMePE(16：1/16：1) [1737] [1738] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1739] 如图138所示，脂质60通过不同制备方法(水煮法或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞 [1740] 未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1741] 自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM； [1742] RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1743] 4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.60与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测。 [1744] 脂质62.dMePE(16：1/18：1) [1745] 1.荧光实时定量PCR(real‑time PCR)检测脂质递送核酸效率 [1746] 如图139所示，脂质62通过不同制备方法(水煮或逆向蒸发法)递送双链RNA进入A549细胞 [1747] (1)未处理组：不做任何处理的A549细胞； [1748] (2)自由摄取组：直接将HJT‑sRNA‑m7 dsRNA与细胞共同孵育6h；核酸终浓度100nM； [1749] (3)RNAimax组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7双链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7双链的终浓度为100nM； [1750] (4)脂质与核酸处理组：将2.5μL脂质单体No.62与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经水煮法和逆向蒸发法两种方法制备混合物，加入细胞中，RNA的终浓度为100nM。12h后收样检测。 [1751] 脂质核酸复合物的体内递送实验 [1752] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1753] 2.脂质混合物制备：按照每只小鼠10ul脂质‑1nmol sRNA剂量进行制备，sRNA各1nmol用500ul DEPC水于玻璃管中溶解，加入10ul相应脂质，吹打使充分混匀，90℃水浴加热15min后自然冷却，灌胃。 [1754] 3.sRNA：PGY‑sRNA‑26，PGY‑sRNA‑32 [1755] 4.实验分组： [1756] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1757] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1758] 3)自由摄取组：直接灌胃sRNA溶液(1nmol/只，500ul)，该组作为阴性对照组； [1759] 4)脂质核酸混合物处理组：将步骤2中制备的脂质‑sRNA混合物进行灌胃。 [1760] 5.相对进入量检测： [1761] 1)组织取样提取RNA：小鼠灌胃6h后，眼球取血500ul，加入1.5ml Trizol Reagent LS充分混匀裂解，组织样品取部分加入3ml Trizol Reagent(购自Invitrogen)匀浆使充分裂解，组织取样：肝/胃/小肠。 [1762] 2)将sRNA逆转录为cDNA：通过逆转录试剂盒(High‑Capacity cDNA Reverse Transcription Kits，Applied Biosystems，cat.no.4368813)，将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系如下：模板RNA(150ng/μL)10μL，10X RT缓冲液2.0μL，25X dNTP Mix(100mM)0.8μTM L，随机引物2.0μL，MultiScribe 逆转录酶1.0μL，RNA酶抑制剂1.0μL，无核酸酶H2O 3.2μL，瞬时离心后，放入PCR仪反应，反应条件如下：(1)25℃，10min；(2)37℃，120min；(3)85℃， 5min；(4)4℃，终止反应。反应结束后加入20μL无RNA酶ddH2O，补足终体积至40μL。 [1763] 3)定量PCR扩增反应：qPCR反应体系总体积10μl，包括：5μL 2×SYBR Green Master Mix，0.5μl正向引物(10μM)，0.5μl反向引物(10μM)，1μl逆转录得到的cDNA，3μl无RNA酶dH2O。使用LightCycler 480荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃，持续5min预变性，开始进入PCR扩增循环：(1)95℃，10s；(2)55℃，10s；(3)72℃，20s；总共进行40个循环；最后 40℃持续10s降温。扩增反应正向引物和反向引物均由北京擎科新业生物技术有限公司设 计和合成(U6 F引物：GCGCGTCGTGAAGCGTTC，U6 R引物：：GTGCAGGGTCCGAGGT)。 [1764] 3)利用2‑ΔCt法计算相对表达量。 [1765] 实施例11‑1：脂质单体No.41递送单链核酸进入体内 [1766] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1767] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1768] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1769] 3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)； [1770] 4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链混合溶液(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠 [1771] 5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No41)与sRNA单链混合溶液(PGY‑sRNA‑23，PGY‑sRNA‑26和PGY‑sRNA‑32)(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1772] 2.灌胃12h后，眼球取血，同时取各组织(肝脏/胃/小肠)，TRIzol充分裂解后提取RNA检测进入量。 [1773] 结论： [1774] 如图140所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液保护sRNA不受降解，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。 [1775] 如图141所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠胃部，保护sRNA不受降解。 [1776] 如图142所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠小肠，保护sRNA不受降解。 [1777] 如图143所示，PE单体(No.41)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠肝脏，保护sRNA不受降解。 [1778] 实施例11‑2：脂质单体No.38递送单链核酸进入体内 [1779] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1780] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1781] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1782] 3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)； [1783] 4)POPC与核酸处理组：将10μL POPC与sRNA单链PGY‑sRNA‑32混合溶液(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1784] 5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No38)与sRNA单链混合溶液(PGY‑sRNA‑32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1785] 2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。 [1786] 结论：如图144所示，PE单体(No.38)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。 [1787] 实施例11‑3：脂质单体No.40递送单链核酸进入体内 [1788] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1789] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1790] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1791] 3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)； [1792] 4)POPC与核酸处理组：将10μL POPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1793] 5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No40)与sRNA单链混合溶液(PGY‑sRNA‑26和PGY‑sRNA‑32)(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1794] 2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。 [1795] 结论：如图145所示，PE单体(No.40)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。 [1796] 实施例11‑4：脂质单体No.64递送单链核酸进入体内 [1797] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1798] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1799] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1800] 3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)； [1801] 4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1802] 5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No64)与sRNA单链混合溶液(PGY‑sRNA‑32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1803] 2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。 [1804] 结论：如图146所示，PE单体(No.64)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。 [1805] 实施例11‑5：脂质单体No.71递送单链核酸进入体内 [1806] 1.实验动物：C57小鼠，雄性，约6周龄。 [1807] 1)未处理组：灌胃500ul生理盐水； [1808] 2)RNAimax处理组：每只小鼠按照10ul RNAimax‑1nmol sRNA混匀，灌胃。该组作为阳性对照组。RNAimax购自Invitrogen。 [1809] 3)自由摄取(free uptake)组：直接加入sRNA单链混合溶液(各1nmol)； [1810] 4)POPC与核酸处理组：将10μLPOPC与sRNA单链混合溶液(各1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1811] 5)脂质单体与核酸处理组：将10μL脂质单体(No71)与sRNA单链混合溶液(PGY‑sRNA‑32)(1nmol)经加热法处理后的混合物以灌胃方式给小鼠。 [1812] 2.灌胃12h后，眼球取血，TRIzol法裂解提取RNA检测进入量。 [1813] 结论：如图147所示，PE单体(No.71)可以有效口服递送sRNA单链核酸进入小鼠血液，且递送效果优于POPC与Lipofectamine RNAimax。 [1814] 实施例12：脂质在不同温度梯度有效递送单链核酸进入MRC5细胞 [1815] (一)实验分组： [1816] 1)未处理组：未经处理的细胞； [1817] 2)RNAiMAX组：分别用100μL opti‑MEM培养基稀释2μL RNAiMAX转染试剂和HJT‑sRNA‑m7单链溶液，二者混匀后放置15min后，加入细胞中，混匀，HJT‑sRNA‑m7单链的终浓度为100nM； [1818] 3)脂质单体与核酸处理组：将2.5μL脂质单体(No.38)与HJT‑sRNA‑m7的双链核酸溶液经不同温度水煮法处理后的混合物加入细胞中，混匀，RNA的终浓度为100nM。 [1819] 4℃：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，4℃放置15min；加入细胞6h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的表达量。 [1820] 37℃：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，37℃放置15min；加入细胞6h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的表达量。 [1821] 60℃：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，50℃加热15min；加入细胞6h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的表达量。 [1822] 80℃：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，80℃加热15min；加入细胞6h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的表达量。 [1823] 100℃：100μL HJT‑sRNA‑m7单链溶液加入2.5μL脂质单体，100℃加热15min；加入细胞6h后，经RT‑qPCR法检测细胞中HJT‑sRNA‑m7的表达量。 [1824] 结论：如图148所示，结果表明，脂质在水煮法不同温度条件下可以有效递送核酸进入细胞(统计学意义上有显著差异，p＜0.01)，有希望提高临床上核酸药物递送的效率。 |
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