| 说明书全文 |
아미드계 유도체 화합물, 이의 생산 방법 및 용도{Amide-based derivative compound, preparing method and use thereof}
아미드계 유도체 화합물, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다.
미생물로부터 유래한 생리 활성 물질은 대체로 항박테리아, 항진균, 또는 항암제의 원천이었으며 이를 비롯한 다양한 질병 치료를 위한 신약으로 개발되거나 신약 개발의 바탕(template)이 되어 왔다. 미생물로부터 유래한 항생제는 예를 들면, 암포테리신(amphotericin), 에리트로마이신(erythromycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 및 반코마이신(vancomycin)이 대표적이다. 또한, 2003년에는 방선균인 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 분리된 댑토마이신(daptomycin)이 차세대 항생제로서 미국 식품의약안전청(FDA)의 승인을 받은 바 있다. 한편, 세균으로부터 유래한 항암제는 예를 들면, 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 미스라마이신(mithramycin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 펜토스타틴(pentostatin), 에포틸론(epothilone)이 있다. 구조적으로 새로운 항암제의 개발을 위하여, 유용한 생리 활성 물질을 생산하는 미생물을 선별하고, 이들이 생산하는 신규 화합물을 탐색, 발굴하는 것이 필요하다. 따라서, 새로운 세균을 선별하고 이로부터 항암 활성을 갖는 신규한 화합물을 탐색할 필요가 있다.
아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 균주를 제공한다. 아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 방법을 제공한다. 아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따르면, 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 다른 양상에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 스트렙토마이세스 속 HK10 균주를 제공한다. 다른 양상에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 양상에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 양상에 따르면, 상기 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 이용하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
아미드계 유도체 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염은 항암 활성을 갖고, 다양한 종류의 암을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.
도 1은 스트렙토마이세스( Streptomyces sp.) 속 HK10 균주를 배양한 배지의 사진이다.
일 양상은 식 1로 표시되는 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다: [식 1] . 상기 식 1로 표시되는 화합물은 아미드계 유도체 화합물이다. 상기 식 1로 표시되는 화합물은 솔턴아미드(Salternamide)로 명명된다. 상기 아미드계 유도체 화합물은 6각 고리에 2개의 탄소 사슬이 메타(meta) 위치로 결합한 화합물일 수 있다. 6각 고리는 예를 들어 카르보닐기를 포함할 수 있다. 6각 고리는 1개 내지 3개의 이중 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 6각 고리는 1개 또는 2개의 이중 결합을 포함할 수 있다. 탄소 사슬은 6각 고리의 각각 2번 및 4번 위치에 결합할 수 있다. 6각 고리의 2번 위치에 결합한 탄소 사슬은 아미드 결합에 의해 6각 고리에 결합할 수 있다. 탄소 사슬은 치환 또는 비치환된, 포화 또는 불포화 탄소사슬일 수 있다. 예를 들어, 6각 고리의 2번 위치에 결합한 탄소 사슬은 치환 또는 비치환된 불포화 탄소 사슬일 수 있다. 예를 들어, 6각 고리의 4번 위치에 결합한 탄소 사슬은 치환 또는 비치환된 포화 탄소 사슬일 수 있다.
상기 식 1에서, R 1 , R 2 , 및 R 3 은 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)R a , -C(=O)OR a , -OCO(OR a ), -C=N(R a ), -SR a , -S(=O)R a , -S(=O) 2 R a , 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알키닐기, C 2 -C 20 의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C 3 -C 30 의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서 R a 는 수소, C 1 -C 10 의 알킬기, 또는 C 6 -C 20 의 아릴기일 수 있다. 상기 식 1에서 점선은 선택적인 이중 결합을 나타낼 수 있다. 상기 점선은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다. 다만, 상기 식 1에서 R 1 과 R 2 는 서로 융합하여 고리를 형성하는 것을 제외할 수 있다. 상기 식 1에서, R 1 , R 2 , 및 R 3 은 서로 독립적으로, 수소, 히드록시기, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알킬기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 할로겐기는 -Cl, -F, -Br, 또는 -I일 수 있다. 상기 C 1 -C 20 의 알킬기는 예를 들어, C 1 -C 15 의 알킬기, C 1 -C 10 의 알킬기, C 1 -C 5 의 알킬기, C 1 -C 4 의 알킬기, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 또는 이소부틸일 수 있다. 상기 식 1로 표시되는 화합물은 식 2로 표시되는 화합물일 수 있다: [식 2] . 상기 식 2에서, R 1 은 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)R a , -C(=O)OR a , -OCO(OR a ), -C=N(R a ), -SR a , -S(=O)R a , -S(=O) 2 R a , 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알키닐기, C 2 -C 20 의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C 3 -C 30 의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서 R a 는 수소, C 1 -C 10 의 알킬기, 또는 C 6 -C 20 의 아릴기일 수 있다. 상기 식 2는 식 3일 수 있다: [식 3] . 상기 식 2 또는 식 3에서, R 1 은 수소 또는 할로겐기일 수 있다. 상기 할로겐기는 -Cl, -F, -Br, 또는 -I일 수 있다. R 1 이 Cl인 경우, 식 2 또는 식 3의 화합물은 솔턴아미드 A일 수 있다. R 1 이 H인 경우, 식 2 또는 식 3의 화합물은 솔턴아미드 B일 수 있다. 상기 식 1로 표시되는 화합물은 식 4로 표시되는 화합물일 수 있다: [식 4] . 상기 식 4에서, R 3 은 수소, 히드록시기, 할로겐기, 시아노기, -C(=O)R a , -C(=O)OR a , -OCO(OR a ), -C=N(R a ), -SR a , -S(=O)R a , -S(=O) 2 R a , 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 C 2 -C 20 의 알키닐기, C 2 -C 20 의 알킬렌 옥시드기, 치환 또는 비치환된 C 3 -C 30 의 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 C 6 -C 30 의 헤테로아릴기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 여기서 R a 는 수소, C 1 -C 10 의 알킬기, 또는 C 6 -C 20 의 아릴기일 수 있다. 상기 식 4에서, 4번 위치의 히드록시기는 (S) 배열 또는 (R) 배열일 수 있다. 상기 식 4에서, 5번 위치의 히드록시기는 (S) 배열 또는 (R) 배열일 수 있다. 상기 식 4는 식 5일 수 있다: [식 5] . 상기 식 4 또는 식 5에서, 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C 1 -C 20 의 알킬기일 수 있다. 상기 C 1 -C 20 의 알킬기는 예를 들어, C 1 -C 15 의 알킬기, C 1 -C 10 의 알킬기, C 1 -C 5 의 알킬기, C 1 -C 4 의 알킬기, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸일 수 있다. R 3 이 H인 경우, 식 4 또는 식 5의 화합물은 솔턴아미드 C일 수 있다. R 3 이 메틸인 경우, 식 4 또는 식 5의 화합물은 솔턴아미드 D일 수 있다. 상기 알케닐기는 C 2 내지 C 20 , C 5 내지 C 20 , C 10 내지 C 20 , 또는 C 10 내지 C 15 인 알케닐기일 수 있다. 상기 알카닐기는 C 2 내지 C 20 , C 5 내지 C 20 , C 10 내지 C 20 , 또는 C 10 내지 C 15 인 알카닐기일 수 있다. 상기 "치환된"에서의 "치환"은 유기 화합물 중의 수소 원자를 다른 원자단으로 치환하여 유도체를 형성한 경우 수소 원자 대신에 도입되는 것을 말하고, "치환기"는 도입된 원자단을 말한다. 치환기는 예를 들어, 히드록시기, 할로겐 원자, C 1 내지 C C20 의 알킬기, C 2 내지 C 20 의 알케닐기, C 2 내지 C 20 의 알키닐기, C 1 내지 C 20 의 헤테로알킬기, C 6 내지 C 20 의 아릴기, C 6 내지 C 20 의 아릴알킬기, C 6 내지 C 20 의 헤테로아릴기, 또는 C 6 내지 C 20 의 헤테로아릴알킬기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염일 수 있다. 상기 용어 "이성질체(isomer)"는 분자식은 같지만 분재 내에 있는 구성 원자의 연결 방식이나 공간 배열이 동일하지 않은 화합물을 말한다. 이성질체는 예를 들면, 구조 이성질체(structural isomers), 및 입체이성질체(stereoisomer)를 포함한다. 상기 용어 "유도체(derivative)"는 상기 화합물의 구조 일부를 다른 원자나 원자단으로 치환하여 얻어지는 화합물을 말한다. 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 무기 및 유기산 부가염을 말한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염, 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다.
다른 양상은 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 스트렙토마이세스 속 HK10 균주(수탁번호: KCTC12832BP)를 제공한다. 상기 식 1의 화합물, 이성질체, 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다. 상기 균주는 그의 변이체를 포함한다. 변이체는 예를 들면, 자연 돌연변이 또는 인위적 돌연변이에 의해 생긴 변이체일 수 있다. 인위적 돌연변이는 자외선 등 물리적 돌연변이원, 또는 염기 화합물 등 화학적 돌연변이원에 의해 발생할 수 있다. 상기 균주는 균주의 포자, 균체, 또는 이것의 배양물을 포함한다. 상기 균주는 염전 해수 또는 염전 흙으로부터 분리 또는 유래된 것일 수 있다.
다른 양상은 스트렙토마이세스 속 HK10 균주(수탁번호: KCTC12832BP)를 배양하는 단계; 및 상기 배양물으로부터 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는, 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 식 1의 화합물, 이성질체, 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다. 상기 방법은 스트렙토마이세스 속 HK10 균주(수탁번호: KCTC12832BP)를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 스트렙토마이세스 속 HK10 균주는 전술한 바와 같다. 배양하는 단계는 액체 배지 또는 고체 배지에서 균주를 배양하는 것일 수 있다. 상기 배지는 인공 바다 소금을 포함할 수 있다. 상기 배지는 탄소원으로서 예를 들어, 글루코스, 쌀, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 또는 식물유를 포함할 수 있다. 상기는 질소원으로서 예를 들면, 효모 추출물, 펩톤, 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 황산암모늄, 질산소다, 또는 요소를 포함할 수 있다. 배지는 필요에 따라, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산, 또는 기타 이온 생성을 촉진하는 무기염류를 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들어, 인공 바다 소금, 효모 추출물, 맥아 추출물, 또는 글루코스를 포함할 수 있다. 배양은 호기성 조건에서 진탕 또는 정치하면서 배양하는 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 37℃, 약 28℃ 내지 약 35℃, 또는 약 30℃일 수 있다. 배양 시간은 예를 들어 1 일 내지 2 개월, 1 일 내지 6 주, 1 일 내지 1 개월, 1 일 내지 2 주, 또는 1 일 내지 1 주일 수 있다. 상기 방법은 배양물으로부터 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 배양물 중 스트렙토마이세스 속 HK10 균주로부터 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리할 수 있다. 상기 배양물 중 스트렙토마이세스 속 HK10 균주를 포함하지 않는 배양액으로부터 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리할 수 있다. 상기 배양물으로부터 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 분리하는 단계는 배양물을 농축, 원심분리, 여과, 또는 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 배양물을 에틸아세테이트, 물, 또는 이들의 조합에 의해 추출할 수 있다. 수득된 농축물을 크로마토그래피로 분획하여 극성에 따라 6개의 분획물을 수득할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어 물, 메탄올, 디클로로메테인, 또는 이들의 조합을 이동상으로 하여 역상 크로마토그래피일 수 있다. 수득된 분획물 중 부피비 20%의 물/메탄올로 용출한 분획은 고속 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하여 상기 펩티드 화합물을 분리할 수 있다. 상기 HPLC는 45%의 물/아세토니트릴을 이동상으로 하고 역상 반분취 HPLC 칼럼을 이용하여 수행할 수 있다.
다른 양상은 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 식 1의 화합물, 이성질체, 유도체, 및 약학적으로 허용가능한 염은 전술한 바와 같다. 상기 암은 예를 들면 간내 담관암, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 균상식육종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 기저세포암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 남성 유방암, 뇌종양, 뇌하수체선종, 다발성 골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아 뇌종양, 소아 림프종, 소아 백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신경모세포종, 신우요관암, 신장암, 악성 연부 조직 종양, 악성 골종양, 악성 림프종, 악성 중피종, 악성 흑색종, 안종양, 외음부암, 요도암, 원발부위 불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관 간질 종양, 윌름 종양, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신 융모 질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 뇌종양, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수종양, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 후두암 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 폐암, 결장암, 위암, 백혈병, 간암, 또는 유방암일 수 있다. 상기 용어 "예방"은 조성물의 투여에 의해 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 상기 약학적 조성물은 항암 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트일 수 있다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 암의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 50 mg 내지 약 9 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 200 mg 내지 약 7 g, 약 300 mg 내지 약 6 g, 약 400 mg 내지 약 5 g, 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 3 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회, 1일 다회, 수일 1회 투여될 수 있다.
다른 양상은 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 식 1의 화합물, 이성질체, 유도체, 약학적으로 허용가능한 염, 암, 예방, 치료, 및 약학적 조성물은 전술한 바와 같다. 상기 개체는 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 원숭이, 및 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 상기 펩티드 화합물은 예를 들면, 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 식 1의 화합물, 이의 이성질체, 유도체, 또는 약학적으로 허용가능한 염은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 개, 소, 말, 원숭이, 및 인간을 포함한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방법은 경구, 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여 방법은 예를 들어, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 솔턴아미드의 분리 및 이의 항암 활성의 확인 1. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces species ) HK10 균주의 분리 항암 활성을 갖는 물질을 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여, 2011년 11월에 전라남도 신안군 신의면 상태서리 445-9 신안토판염전 영농조합 염전에서 채취한 염전 표층 흙으로부터 HK10 균주를 분리하였다. HK10 균주의 전체 게놈(whole genome)을 분리하고 16S ribosomal DNA을 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)으로 클로닝하고, 핵산 서열을 분석하였다(서열번호 1, GenBank Accession No. LC013479.1). 핵산 서열 분석 결과, 상기 HK10 균주는 스트렙토마이세스 라디오푸그난스( Streptomyces radiopugnans )와 계통분류학적으로 유사한 신규한 균주인 것으로 동정되었다. 이 균주를 스트렙토마이세스 속 HK10 균주로 명명하고, 상기 균주를 2015년 6월 04일자로 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC12832BP).
2. 스트렙토마이세스 속 HK10 균주의 배양 스트렙토마이세스 속 HK10 균주를 멸균된 YEME 고체 배지(물 1 L 당 10 g의 맥아 추출물, 4 g의 효모 추출물, 2 g의 글루코스, 33 g의 인공 바다 소금, 및 18 g의 한천)에 접종하고 약 27℃에서 수일 동안 1차 배양하였다. 1차 배양한 고체 배지로부터 HK10 균주를 멸균된 50 ㎖의 A1 + YPM 액체 배지(1 L 당 10 g의 전분, 6 g의 효모, 4 g의 펩톤, 4 g의 만니톨, 및 33 g의 인공 바다 소금)에 접종하고, 200 rpm으로 진탕하면서 약 30℃에서 2 일 동안 2차 배양하였다. 2차 배양한 배양물 10 ㎖를 1 L의 A1 + YPM 액체 배지에 접종하고, 180 rpm으로 진탕하면서 약 30℃에서 5 일 동안 2차 배양하였다.
3. 솔턴아미드의 분리 및 정제 실시예 1.2에서 3차 배양한 HK10 배양물을 수득하였다. 스탠드에 거치링을 장착하여 분별 깔때기(Separatory funnel, 용량 3 L) 를 고정시키고, 1 L의 HK10 배양물과 1 L의 에틸아세테이트(대정화금주식회사)를 주입하였다. 마개로 입구를 닫고, 30 초 동안 섞은 후 에틸아세테이트 층과 물 층으로 구분되도록 3분 동안 방치하였다. 배양물으로부터 물 층을 제거하고, 에틸아세테이트 층에 100 g의 무수 소듐 술페이트(Anhydrous Sodium Sulfate)(대정화금주식회사)를 첨가하여 배양물에 남아있는 물을 제거하였다. 수득된 에틸아세테이트 층을 거름 종이(Advantec)에 여과시키고, 둥근 플라스크에 옮긴 후 농축기를 이용하여 농축하였다. 남은 물 층은 다시 한번 1 L의 에틸아세테이트로 추출하였다. 이와 같은 과정을 반복하여 총 60 L의 HK10 배양물에서 5 g의 조(crude) 추출물을 수득하였다. 수득된 조 추출물을 역상 크로마토그래피(Sepak, C 18 resin 20 g, reversed-phase)를 이용하여 6개의 분획물(fraction)로 나누었다. 6개 분획물의 용리액은 80%(v/v)의 물/메탄올에서부터 물을 20%씩 감소시켜 사용하였고, 마지막 분획물은 50%의 메탄올/디클로로메테인으로 분획하여, 모두 6개의 분획물(각 200 ㎖)을 얻었다. 20%(v/v)의 물/메탄올로 분획한 분획물 4를 액체크로마토그램-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼 분석하였다. 분획물의 조성 확인은 아질런트(Agilent technologies) 사의 1200 시리즈 LC와 6130 시리즈 질량분석기를 연결한 LC/MS를 사용하였다. 질량(mass) 스펙트럼은 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사의 Q-High resolution ESI 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 액체 크로마토그래피-질량분석법과 수소 핵자기 공명 분광스펙트럼 분석을 통하여 상기 균주의 배양물에 신규한 이차 대사 물질이 함유되어 있다는 것을 확인하였다. 감압건조로 농축한 분획물 4를 2 ㎖의 메탄올(대정화금주식회사)에 용해시키고, 용해물을 45%(v/v)의 물/아세토니트릴의 등용매(isocratic) 조건 하에서 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C 18 reversed-phase semi-preparative HPLC column, 입자 직경 5 mm, 250 x 10 mm (길이 x 내경), 용출속도 2 ㎖/분, UV 검출기)(Kromasil)으로 분리하였다. 이에 의해, 약 28분, 약 25분, 약 21분, 및 약 29분의 용출 시간에서 각각 5.0 mg의 솔턴아미드 A, 8.0 mg의 솔턴아미드 B, 20.0 mg의 솔턴아미드 C, 및 3.0 mg의 솔턴아미드 D를 수득하였다.
4. 솔턴아미드 A 내지 D의 물리화학적 특성 분석 솔턴아미드 A 내지 D는 엷은 노란색 오일 상태이며, 상온에서 안정한 편이고 중간 정도 유기용매인 메탄올에 잘 녹았다. 솔턴아미드 A는 산성 환경에서 변성되는 경향이 있었다. 솔턴아미드 A 내지 D의 구조는 핵자기 공명 스펙트럼(nuclear magnetic resonance spectrum), 적외선 및 자외선 분광자료, 및 고해상 질량 분석 데이터로 결정하였다. 핵자기 공명 스펙트럼( 1 H NMR, 13 C NMR)은 브로커(Bruker) 사의 600 MHz 또는 500 MHz NMR을, 용매는 메탄올-d 4 를 사용하였다. 질량 스펙트럼은 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 사의 Q-High resolution ESI 질량 분석기를 사용하였고, 질량/전하(m/z)의 형태로 표시하였다. 적외선 스펙트럼은 써모(Thermo) 사의 NICOLET iS10 분광기를 사용하였다. 자외선 스펙트럼은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 사의 Lambda 35 UV/VIS 분광기를 사용하였다. 핵자기공명 스펙트럼에 의한 솔턴아미드 A 내지 D의 구조 위치 지정을 표 1 및 2에 나타내었다. [솔턴아미드(Salternamide) A] (1) 분자식 : C 23 H 32 ClNO 5 (2) 분자량 : 437 (3) 색깔 : 엷은 노란색 (4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3329, 2957, 2925, 1711, 1662, 1522 cm -1 (5) 1 H-NMR (MeOD, 500 MHz) : 표 1 참조 (6) 13 C-NMR (MeOD, 125 MHz) : 표 1 참조
[솔턴아미드 B] (1) 분자식 : C 23 H 33 NO 5 (2) 분자량 : 403 (3) 색깔 : 엷은 노란색 (4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3328, 2957, 2925, 1711, 1662, 1522 cm -1 (5) 1 H-NMR (MeOD, 600 MHz) : 표 1 참조 (6) 13 C-NMR (MeOD, 150 MHz) : 표 1 참조
[솔턴아미드 C] (1) 분자식 : C 23 H 35 NO 6 (2) 분자량 : 421 (3) 색깔 : 엷은 노란색 (4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3371, 2959, 2926, 1671, 1520 cm -1 (5) 1 H-NMR (MeOD, 600 MHz) : 표 2 참조 (6) 13 C-NMR (MeOD, 150 MHz) : 표 2 참조
[솔턴아미드 D] (1) 분자식 : C 24 H 37 NO 6 (2) 분자량 : 435 (3) 색깔 : 엷은 노란색 (4) 적외선 흡수대 (ZnSe) : 3372, 2958, 2928, 1673, 1518 cm -1 (5) 1 H-NMR (MeOD, 600 MHz) : 표 2 참조 (6) 13 C-NMR (MeOD, 150 MHz) : 표 2 참조
솔턴아미드 A 및 B의 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동값
| 위치 | 솔턴아미드 A a | 솔턴아미드 B b | | δ c , 유형 | δ H , mult ( Hz 중 J ) | d C , 유형 | δ H , mult ( Hz 중 J ) | | 1 | 176.0, C | | 181.8, C | | | 2 | 131.8, C | | 132.4, C | | | 3 | 134.7, CH | 7.68 d (2.0) | 134.1, CH | 7.63 d (3.0) | | 4 | 72.1, C | | 71.2, C | | | 5 | 151.2, CH | 7.14 d (2.0) | 155.4, CH | 6.94 dd (10.0, 3.0) | 6a
6b | 131.3, C | | 126.6, CH | 6.21 d (10.0) | | 7 | 41.7, CH 2 | 1.82 m | 41.6, CH 2 | 1.78 m | | 8 | 24.5, CH 2 | 1.33 m | 24.5, CH 2 | 1.31 m | | 9 | 26.4, CH 2 | 1.60 m | 26.3, CH 2 | 1.59 m | | 10 | 35.1, CH 2 | 2.25 t (7.0) | 34.9, CH 2 | 2.25 t (7.0) | | 11 | 177.7, C | | 177.5, C | | | 1' | 167.5, C | | 167.4, C | | | 2' | 122.6, CH | 6.16 d (15.5) | 121.3, CH | 6.14 d (15.5) | | 3' | 153.9, CH | 6.79 dd (15.5, 8.0) | 153.6, CH | 6.78 dd (15.5, 8.0) | | 4' | 35.8, CH | 2.33 m | 35.7, CH | 2.33 m | 5'a
5'a | 45.5, CH 2 | 1.34 m
1.28 m | 45.4, CH 2 | 1.33 m | | 6' | 31.5, CH | 2.43 m | 31.5, CH | 2.43 m | | 7' | 132.2, CH | 4.87 d (9.0) | 132.1, CH | 4.87 d (9.0) | | 8' | 130.7, C | | 131.2, C | | | 9' | 25.9, CH 3 | 1.66 d (1.0) | 25.9, CH 3 | 1.66 d (1.0) | | 10' | 18.1, CH 3 | 1.61 d (1.0) | 18.0, CH 3 | 1.61 d (1.0) | | 11' | 21.7, CH 3 | 0.91 d (7.0) | 21.6, CH 3 | 0.91 d (7.0) | | 12' | 19.8, CH 3 | 1.04 d (7.0) | 18.4, CH 3 | 1.03 d (7.0) | | 2'-CH 3 | | | | |
a : 1 H 500 MHz, 13 C 125 MHz. b : 1 H 600 MHz, 13 C 150 MHz.
솔턴아미드 C 및 D의 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동값
| 위치 | 솔턴아미드 C b | 솔턴아미드 D b | | δ c , 유형 | δ H , mult ( Hz 중 J ) | δ c , 유형 | δ H , mult ( Hz 중 J ) | | 1 | 194.1, C | | 194.4, C | | | 2 | 133.7, C | | 133.4, C | | | 3 | 133.0, CH | 7.57 s | 132.0, CH | 7.53 s | | 4 | 73.4, C | | 73.5, C | | | 5 | 70.9, CH | 3.96 dd (8.0, 4.0) | 70.9, CH | 3.99 dd (8.0, 4.0) | 6a
6b | 42.4, CH 2 | 2.81 dd (17.0, 8.0)
2.72 dd (17.0, 4.0) | 42.1, CH 2 | 2.84 dd (17.0, 8.0)
2.76 dd (17.0, 4.0) | | 7 | 39.3, CH 2 | 1.86 m
1.71 m | 39.3, CH 2 | 1.88 m
1.72 m | | 8 | 24.5, CH 2 | 1.50 m (13.0, 6.0) | 24.6, CH 2 | 1.52 m
1.50 m | | 9 | 26.6, CH 2 | 1.67 m
1.62 m | 26.9, CH 2 | 1.66 m | | 10 | 34.9, CH 2 | 2.32 t (7.0) | 35.5, CH 2 | 2.31 t (7.5) | | 11 | 177.6, C | | 178.3, C | | | 1' | 167.2, C | | 169.8, C | | | 2' | 122.7, CH | 6.11 dd (16.0, 1.0) | 130.4, CH | | | 3' | 153.5, CH | 6.76 dd (16.0, 7.0) | 145.4, CH | 6.19 dd (10.0, 1.5) | | 4' | 34.9, CH | 2.32 m | 32.6, CH | 2.55 m | 5'a
5'a | 45.4, CH 2 | 1.31 ddd (13.5, 9.0, 6.5)
1.28 ddd (13.5, 8.0, 6.0) | 46.0, CH 2 | 1.34 m
1.26 m | | 6' | 31.4, CH | 2.42 dq (9.0, 7.0, 6.0) | 31.9, CH | 2.39 m | | 7' | 132.1, CH | 4.85 d (9.0) | 132.3, CH | 4.88 d (9.0) | | 8' | 131.2, C | | 131.3, C | | | 9' | 25.9, CH 3 | 1.65 d (1.0) | 26.0, CH 3 | 1.66 d (1.0) | | 10' | 18.0, CH 3 | 1.60 d (1.0) | 18.1, CH 3 | 1.62 d (1.0) | | 11' | 21.6, CH 3 | 0.91 d (7.0) | 21.8, CH 3 | 0.91 d (6.5) | | 12' | 19.8, CH 3 | 1.02 d (7.0) | 20.3, CH 3 | 1.00 d (6.5) | | 2'-CH 3 | | | 12.7, CH 3 | 1.88 d (1.0) |
b : 1 H 600 MHz, 13 C 150 MHz. 핵자기공명 스펙트럼 자료로부터 분석된 솔턴아미드 A 내지 D의 화학구조식을 하기에 나타내었다. [솔턴아미드 A 및 B] 상기 화학구조식에서, 솔턴아미드 A는 R 1 이 Cl이고, 솔턴아미드 B는 R 1 이 H이다. [솔턴아미드 C 및 D] 상기 화학구조식에서, 솔턴아미드 C는 R 3 이 H이고, 솔턴아미드 D는 R 3 는 CH 3 이다.
5. 솔턴아미드 A 내지 D의 항암 활성 확인 세포 생존율 측정 방법인 SRB 검정을 이용하여, 폐암 세포주 A549(Korean Cell line Bank), 결장암 세포주 HCT116(Korean Cell line Bank), 위암 세포주 SNU638(Korean Cell line Bank), 백혈병 세포주 K562(Korean Cell line Bank), 간암 세포주 SK-HEP1(Korean Cell line Bank), 및 유방암 세포주 MDA-MB231(Korean Cell line Bank)에 대한 솔턴아미드 A 내지 D의 세포 사멸 효과를 측정하였다. 구체적으로, 96 웰 마이크로플레이트에 190 ㎕의 각 웰당 3.5x10 3 cells/㎖의 세포를 접종하였다. 세포가 접종된 각 웰에 0.8 μM, 4 μM, 20 μM, 또는 100 μM의 솔턴아미드 A 내지 D를 첨가하고, 세포를 37℃ 및 5% CO 2 조건의 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양하였다. 참조 약물로서 에토포시드(etoposide)(Sigma Aldrich)를 사용하였다. 그 후, 세포를 그 후, 각 웰당 50 ㎕의 50%(v/v) 트리클로로아세트산 용액(Sigma Aldrich)을 첨가하고 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션하여 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 물로 5번 세척하고, 공기 중에서 건조하였다. 그 후, 세포에 각 웰당 80 ㎕의 1%(v/v) 아세트산(DUKSAN)을 포함하는 0.4%(w/v) 술포로다민 B(Sulforhodamine B: SRB) 수용액(Sigma Aldrich)을 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 물로 세척하고 건조하였다. 각 웰당 200 ㎕의 10 mM Tris (pH 10.0)(Sigma Aldrich)을 첨가하여 세포를 녹였고, 515 nm에서 흡광도를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 암 세포주에 대한 화합물의 50% 성장 억제 농도, 즉 IC 50 (inhibitory concentration 50%)을 산출하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
솔턴아미드 A 내지 D의 50% 세포 성장 억제 농도(IC50 , μM)
| 시료 | A549
(폐암) | HCT116
(결장암) | SNU638
(위암) | K562
(백혈병) | SK - HEP1
(간암) | MDA - MB231
(유방암) | | 솔턴아미드 A | 36 | 0.96 | 0.96 | 8.9 | 2.7 | 8.9 | | 솔턴아미드 B | 82 | 55 | 27 | >100 | 56 | 27 | | 솔턴아미드 C | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | >100 | | 솔턴아미드 D | >100 | 34 | 15 | 59 | 32 | 92 | | 에토포시드 | 0.80 | 1.9 | 0.50 | 3.1 | 1.1 | 11 |
표 3에 나타난 바와 같이, 솔턴아미드 A는 폐암세포 A549, 결장암세포 HCT116, 위암세포 SNU638, 백혈병세포 K562, 간암세포 SK-HEP1, 및 유방암세포 MDA-MB231에 대한 IC 50 값은 각각 36 μM, 0.96 μM, 0.96 μM, 8.9 μM, 2.7 μM, 및 8.9 μM이었고, 이들 암 세포의 성장을 유의적으로 억제하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12832BP 20150604
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB Foundation <120> Salternamide compound, preparing method and use thereof <130> PN109901 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 676 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA of Streptomyces sp. HK10 <400> 1 ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcggaag tgacggtacc tgcagaagaa 60 gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttgtccgga 120 attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc ctgtcgcgtc ggatgtgaaa gcccggggct 180 taaccccggg tcggcattcg atacgggcag gctagagttc ggtaggggag atcggaattc 240 ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac cggtggcgaa ggcggatctc 300 tgggccgata ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg 360 gtagtccacg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtgggcgg cattccacgt cgtccgtgcc 420 gcagctaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg 480 aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgtggctt aattcgacgc aacgcgaaga 540 accttaccaa ggcttgacat acaccggaaa cggccagaga tggtcgcccc cttgtggtcg 600 gtgtacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 660 caacgagcgc aactcc 676 |
