可用作药物的具有至少一个羧基、磺基或酰胺基的2,5-或2,6-二取代的氢醌衍生物 |
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| 申请号 | CN202180019787.4 | 申请日 | 2021-03-08 | 公开(公告)号 | CN115279730A | 公开(公告)日 | 2022-11-01 |
| 申请人 | OM药物公司; | 发明人 | J·鲍尔; O·马丁; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了新的式(I)的氢醌衍 生物 、制备方法以及 治疗 和/或 预防 例如自身免疫、免疫、 风 湿病、血管病症、眼科病症、 纤维 化病症、代谢和胃肠病症、神经炎性和神经退行性 疾病 、 肿瘤 和癌症相关病症、 激素 相关疾病和由病毒和细菌感染性疾病引起的免疫病症及其并发症的药物组合物和方法，其中R1为COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10；R2和R3之一是H，另一个是R5。 | ||||||
| 权利要求 | 1.式(I)的取代的氢醌： |
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| 说明书全文 | 可用作药物的具有至少一个羧基、磺基或酰胺基的2,5‑或2,6‑二取代的氢醌衍生物 技术领域[0001] 本发明总体上涉及新的氢醌衍生物、其制备以及通过将这样的化合物给予需要其的温血动物来治疗病症的方法。本发明还涉及可用于预防和/或治疗自身免疫、免疫、风湿病、血管病症、眼科病症、纤维化病症、代谢和胃肠病症、神经炎性和神经退行性疾病、肿瘤和癌症相关病症、激素相关疾病和由病毒和细菌感染性疾病引起的免疫病症及其并发症的 化合物。 背景技术[0002] 一些基于氢醌的衍生物，例如2,5‑二羟基苯磺酸衍生物，特别是羟苯磺酸钙、酚磺乙胺钙和2,5‑二羟对苯二磺酸钙(calcium persilate)，是本领域已知的单独或与其他药剂联合治疗男性性功能障碍和其他内皮源性血管病症的活性剂。例如，美国专利号6,147, 112记载了使用2,5‑二羟基苯磺酸衍生物，优选羟苯磺酸钙、酚磺乙胺钙和二羟对苯二磺酸钙的方法。化学名称为2,5‑二羟基苯磺酸钙盐的羟苯磺酸钙或氢醌磺酸钙正在以Dexium (Delalande)和Doxium(Carrion)的名称出售，其制备方法记载于美国专利号3,509,207中。 [0003] 有许多含有苯酚或儿茶酚基团的药物，其口服给药后在吸收过程中会在羟基处发生过早代谢。以前保护羟基的努力通常是不成功的，因为所用的保护基团太不稳定(O═COR或O═CR)或太稳定(CH3)。因此，本发明的目的是提供新的氢醌衍生物、其药学上可接受的盐和制剂。这些新的氢醌衍生物具有特别有效的抗纤维化、抗炎和抗血管生成特性。 [0005] Richter等人在Synthesis,1976,1976(3),192‑194中公开了双‑N‑芳基氨基甲酸酯和2,5‑二羟基‑3,6‑双[N‑芳基甲酰胺基]‑1,4‑苯醌及其由2,5‑二羟基‑1,4‑苯醌和异氰酸芳酯制备的方法。 [0006] 日本公开JP 51026839A公开了苯甲酰苯胺I(R＝H、OH)具有抗结核、镇痛、抗炎和排尿酸的活性： [0007] [0008] 美国授权专利US 3,973,038还公开了具有以下通式的苯甲酰苯胺化合物； [0009] [0010] 其中(R1＝OH、酰氧基；R2＝H、OH、低级烷基、卤素、酰氧基；R3＝Cl、Br、低级烷基；R4＝OH、NH2、低级烷氧基、酰氧基；R5＝H、卤素、CO2H、低级烷基、酰氧基)具有体内酶抑制特性，特别是组胺脱乙酰酶和黄嘌呤氧化酶。 [0011] 然而，现有技术文献均未公开本发明的新型氢醌衍生化合物，其特别用于预防和/或治疗多种疾病，包括自身免疫、免疫、风湿病、血管病症、眼科病症、纤维化病症、代谢和胃肠病症、神经炎性和神经退行性疾病、肿瘤和癌症相关病症、激素相关疾病和由病毒和细菌感染性疾病引起的免疫疾病及其并发症。 [0012] 本发明还涉及代谢病症如糖尿病和肥胖症的治疗、预防和减轻。随着餐后血糖水平的升高，胰岛素被分泌并刺激外周组织(骨骼肌和脂肪)的细胞主动从血液中摄取葡萄糖 作为能量来源。由于错误的胰岛素分泌或作用导致的葡萄糖稳态丧失通常会导致代谢病 症，如糖尿病，这可能由肥胖共同引发或进一步恶化。因为这些疾病通常是致命的，所以需要采取策略恢复血流中足够的葡萄糖清除率。随着工业化国家人口的老龄化和久坐不动的 生活方式变得越来越普遍，代谢病症，特别是葡萄糖和脂质调节性病症变得越来越普遍。此类病症通常相互关联，并且通常是彼此的预测因素或结果。 [0013] 例如，糖尿病是由胰岛素抵抗和胰腺β细胞分泌胰岛素缺陷共同引起的。胰岛素抵抗个体通常有腹部肥胖、血脂异常、高血压、葡萄糖耐受不良和血栓前状态(代谢综合征)。相应地，肥胖个体整体上获得胰岛素抵抗的风险更高。因此，代谢途径的破坏可引发大量病症，如高脂血症、肥胖症、糖尿病、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征和高血压，而这些病症又可引发进一步的代谢功能障碍，从而导致全身性问题，并使个体面临额外并发症和过早发病的风险。葡萄糖和脂质水平部分受肝脏调节，肝脏在葡萄糖、蛋白质和脂质的合成、储存、分泌、转化和分解中发挥作用。疾病或外伤会大大降低肝脏进行这些正常活动的能力。因此，肝功能障碍的大多数临床表现源于细胞损伤和正常肝功能损害。肝功能障碍可由遗传疾病、炎性病症、毒素(如药物和酒精)、免疫病症、血管病症或代谢疾病引起。无论是何种原因造成的，肝损伤都可对代谢过程的功能以及血糖和血脂水平的调节产 生全身性影响，加剧慢性疾病状态，并导致进一步疾病和发病的风险增加。血糖水平的升高和降低都会引发旨在恢复葡萄糖稳态的激素反应。低血糖会触发胰腺a细胞释放胰高血糖 素。高血糖会触发胰腺b细胞释放胰岛素。垂体释放的ACTH和生长激素通过抑制肝外组织摄取来增加血糖。糖皮质激素还通过抑制葡萄糖摄取来增加血糖水平。皮质醇是肾上腺皮质 释放的主要糖皮质激素，响应于循环ACTH的增加而分泌。肾上腺髓质激素肾上腺素通过响 应应激刺激激活糖原分解来刺激葡萄糖的产生。影响葡萄糖和脂质代谢的代谢病症如高脂 血症、肥胖症、糖尿病、胰岛素抵抗、高血糖症、葡萄糖耐受不良、代谢综合征和高血压会导致包括心血管疾病和过早发病的慢性疾病的长期健康后果。此类代谢和心血管病症可能相 互关联、加重或触发，并产生难以中断的反馈机制。目前代谢和心血管病症的药物治疗包括降脂药物、降糖药物、抗高血压药物、饮食和运动的联合治疗。然而，复杂的治疗方案可能会导致副作用增加、药物间相互作用、依从性失败和用药错误增加等多重用药问题。因此，在本领域中存在迫切的、未满足的需求，即鉴定新的化合物、制剂和方法以安全有效地治疗代谢和心血管病症以及与代谢病症相关的疾病。 [0014] 代谢疾病的实例包括但不限于疼痛、伤口愈合、发热、神经炎性和神经退行性疾病、炎症、产热、恒温、甘油三酯分解、糖酵解、克雷布斯循环、发酵、光合作用、代谢率、生物和非生物应激、分泌物、氧化应激、应激、肿瘤生长、皮肤疾病、心血管疾病、神经炎性和神经退行性疾病、精神和行为病症。此类过程或情况可发生在细胞、细胞群或整个生物体中。 [0015] 分子医学的最新进展使肿瘤疾病的诊断和治疗有了一定的改善。尽管取得了部分成功，但这些病状仍然是相当大的挑战。对于某些类型的癌症，当前的治疗在某些情况下因多种原因而导致失败。一方面是肿瘤细胞固有的抗性、肿瘤细胞不断突变和逃避治疗的能 力，另一方面也是肿瘤环境的异质性。研究表明，从个体受试者基因组谱的角度来看，同一类型的肿瘤对个体受试者来说差异很大，这表明了所谓的“个人”治疗的必要性。更大的问题是同一肿瘤中突变的异质性，正如最近在肾脏肿瘤中所显示的那样，预期其他类型的肿 瘤也可发生这种情况。为此，有必要寻找新的方法和对肿瘤中所有或大多数恶性细胞共同 的恒定的干预点，其优选影响癌细胞中的基本功能。似乎这样的干预点可在代谢水平，例如线粒体，即对于细胞中所有生理以及病理生理过程所必需的能量的产生是基础的细胞器。 尽管肿瘤细胞从很大程度上利用所谓的有氧糖酵解来产生能量，但线粒体呼吸(即消耗与 ATP形成相关的氧气)是大多数(如果不是全部)类型的肿瘤所固有的。因此，在本领域中存 在未满足且迫切的需求，即鉴定新的化合物、制剂和方法以安全且有效地治疗此类肿瘤病 症。 发明内容[0016] 本发明提供了新的氢醌衍生物、新的制备方法和新的关键中间体。本发明还涉及包含治疗有效量的此类氢醌衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。 [0017] 本发明还提供了治疗和/或预防血管生成(血管)、炎性和/或纤维化病理生物学的方法，因为它们具有抗纤维化、抗炎和抗血管生成作用。因此，本发明最终提供了治疗和/或预防疾病或病症的方法，所述疾病或病症包括免疫/风湿病/血管病症、眼科病症、纤维化病症、代谢和胃肠病症、肿瘤和癌症相关病症，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效剂量的如上所述的本发明的化合物和/或药物组合物。特别地，本发明提供了治疗和/或预 防疾病或病症的方法，所述疾病或病症包括自身免疫、免疫、风湿病、血管病症、眼科病症、纤维化病症、代谢和胃肠病症、神经炎性和神经退行性疾病、肿瘤和癌症相关病症、激素相关疾病和由病毒和细菌感染性疾病引起的免疫病症及其并发症。 附图说明 [0018] 图1：(A)在每个实验组的代表性小鼠中，通过Evans蓝染料渗漏在视网膜全标本(whole mounts)中评估血管渗透性的共焦免疫荧光图像。箭头表示外渗位置。比例尺，30μm。(B)通过评估每个视野(0.44mm2)的外渗数量来量化血管渗漏。通过将血管渗漏减少至与非糖尿病对照组出现的水平相同的水平，Ia‑007a滴眼液的效果显著。与其他组相比，*p< 0.01。 [0019] 图2：(A)Schmidt评分是根据四项组织病理学评估标准对化合物功效的评估，该标准根据以下四个参数的评分(括号内的数字)描述胰腺损伤。(a)水肿间质性水肿，评分为 (0)无(1)小叶间(2)涉及小叶的(3)分离的岛状腺泡细胞。(b)炎性浸润＝白细胞浸润，评分为(0)无，(1)<20％，(2)20％‑50％，(3)>50％。(c)实质坏死＝腺泡细胞坏死，评分(0)无，(1)<5％，(2)5％‑20％，(3)>20％。(d)出血，评分(0)无，(1)1‑2分，(2)3‑5分，(3)>5分。 Schmidt最高分＝10为雨蛙素诱导的+载体处理，最低分＝0为非诱导的动物。Schmidt评分 为a+b+c+d评分之和，＊＊＊＊意味着与雨蛙素诱导组有统计学意义的差异，如图2所示。与雨蛙素对照动物相比，所有产品都显示出改善的Schmidts评分。 [0020] 图3A‑D：图3A‑B显示了选定疾病中涉及的主要细胞因子的疾病列表(Akdis M.et al,J Allergy Clin Immunol 2016；138:984‑1010)，图3C显示了部分检索结果，其中细胞因子和基因按评分排序，并且可能涉及在https://www.targetvalidation.org/中检索后作为实例“糖尿病视网膜病变”给出的所选疾病。在图3D中，使用VEGFA作为细胞因子进行检索，以查找提及VEGFA的疾病列表。图3D仅显示了VEGFA参与的部分疾病，参考：Open Targets Platform:new developments and updates two years on.Denise Carvalho et al(Nucleic Acids Research,Volume 47,Issue D1,08January 2019,D1056–D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gky1133)。 [0021] 图4(A‑D)：显示了列出如实施例1.1至1.4中所述的Ia‑Id型化合物的条件和收率的表格。由原料2,5‑二羟基对苯二甲酸计算的总收率。 [0022] 图5(A‑C)：显示了列出如实施例1.5至1.7中所述的IIa‑IIc型化合物的条件和收率的表格。 [0023] 图6：显示了列出如实施例1.8和1.9中所述的IIIa和IIIb型化合物的条件和收率的表格。 [0024] 图7：显示了列出如实施例1.10中所述的IIIc型化合物的条件和收率的表格。 [0025] 图8：是列出了如实施例1.12中所述的关于化合物V型的脱保护步骤的表格。 [0026] 图9：显示了STZ诱导的糖尿病模型中各组所有动物在给药前第0天后以及通过静脉注射或通过os途径每天给药7天和14天后取样的非空腹血糖水平(所有动物的平均值± stdev)。 [0027] 图10：显示了在每天通过静脉注射或通过os途径给药7天后取样的每组3只动物的STZ诱导的糖尿病模型中加速伤口愈合。 [0028] 图11：图11A显示了处理第21天肺纤维化的代表性图像；(A1)非诱导的(健康)；A2，博莱霉素诱导的，用载体处理；A3，博莱霉素诱导的，用吡非尼酮100mg/kg处理；A4，博莱霉素诱导的，用IVc‑059a处理。图11B显示了健康、博莱霉素诱导的未处理的相对于吡非尼酮相对于IVc‑059a的Ashcroft评分。 具体实施方式[0029] 本文公开了用于治疗患有疾病、病症或功能障碍的受试者的新的化合物。这些疾病、病症或功能障碍的实例包括但不限于自身免疫、代谢性、炎性、退行性和肿瘤性病症，特别是炎性病状、血管生成疾病和/或纤维化病症，例如糖尿病视网膜病、糖尿病肾病、强直性脊柱炎、慢性胰腺炎、肝纤维化、肾纤维化，以及由胰腺功能障碍引起的代谢性疾病。 [0030] 在下文中，除非另有说明，可使用本文公开的新的化合物治疗的疾病、病症或功能障碍的集合统称为“医疗疾病”。 [0031] 本文所用的术语“受试者”包括任何和所有生物体，并包括术语“患者”。要根据本文所述的方法进行治疗的受试者可以是已经被执业医师诊断为患有医疗疾病的受试者。可通过任何合适的方法进行诊断。本领域技术人员将理解，要根据本公开内容进行治疗的受 试者可能已经接受了标准测试以诊断医疗疾病。如本领域普通技术人员所知，本文所公开 类型的医疗疾病的临床特征根据病理机制而变化。 [0032] 本文中的“治疗”是指将所公开的化合物用于治疗目的。例如，可以对患有该医疗疾病的受试者给予治疗性治疗，以改善或稳定受试者的疾病。因此，在本文所述的权利要求和实施方案中，治疗是指受试者为了治疗目的而接受本文所公开的方法。 [0033] 本文所用的前药是指任何广泛的前药策略。例如，前药策略在1958年被Adrian Albert正式认可(Albert,A.Chemical aspects of selective toxicity.Nature,1958, 182,421–422)，但始于上个世纪初，如乌洛托品、非那西汀和百浪多息。前药通常是具有很少或没有药理活性但具有内在的结构不稳定性的分子，无论是偶然还是设计的，其允许在 体内生物转化为活性药物。转化可以通过化学或酶促过程或两者的结合来实现。活性分子 通常与不期望的理化特性有关，这对它们向适当的生物靶点的递送产生了相当大的挑战。 前药可改善通常归因于肝代谢的代谢不稳定性。同样，可以通过选择性前药策略来克服药 物的不想要的肠道代谢。这种不稳定性可极大地减少到达体循环及其靶点的药物总量。前 药可用于保护活性药物免受这种首过效应的影响，方法是掩蔽代谢不稳定但药理学上必需 的官能团，如苯酚，以避免快速代谢。 [0034] 通过药物的结构修饰获得的前药旨在影响分子的固有理化特性，以实现其递送。在发现阶段，这些发展并不总是被整合到新分子的设计中。通常，模拟优化是优选的前进途径。实施早期前药策略可能会导致更快的临床开发，并最终实现药品的商业化。 [0035] 许多前药策略可用于影响母体药物的亲脂性。药物的亲脂性已通过短链烃前部分掩蔽其极性和离子化功能而得到改善。亲水性羟基、羧基、磷酸盐或氨基以及其他带负电荷或正电荷的基团已成功转化为更亲脂性的烷基或芳基酯或N‑酰基衍生物，它们在体内被普遍存在的酯酶或肽酶迅速水解回母体药物。 [0036] 因此，本发明提供了式(I)的化合物： [0037] [0038] 其中： [0039] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0040] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0041] R2和R3是H或R5，条件是当R2和R3之一是R5时，另一个是H，当R2和R3之一是H时，另一个是R5； [0042] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0043] R5＝R6、R7或R8； [0044] R6＝CONH‑R9、CONHCOR9、CONH(CH2)n‑R9或CONHCH(COOR4)(CH2)kR9、杂芳基‑R9，其中k＝0‑4； [0045] R7＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的苯并杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H、OR4、唑[5元含N杂环]或氟； [0046] R8＝(CH2)mX(CH2)pR9； [0047] X＝O、S、SO2、NH、NAc或N(CH2)qR9； [0048] R9＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基或杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]、氟、C＝O、NHCO‑R10； [0049] R10＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基或杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]、氟； [0051] 本发明还提供了式(I)的化合物： [0052] [0053] 其中： [0054] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基，C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0055] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0056] R2和R3是H或R5，条件是当R2和R3之一是R5时，另一个是H，当R2和R3之一是H时，另一个是R5； [0057] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0058] R5＝R6或R7； [0059] R6＝CONH‑R9、CONHCOR9、CONH(CH2)n‑R9或CONHCH(COOR4)(CH2)kR9，其中k＝0‑4； [0060] R7＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的苯并杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H、OR4、唑[5元含N杂环]或氟； [0061] R9＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基、杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]、氟、C＝O或NHCO‑R10； [0062] R10＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基、杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]或氟；其中R9和R10的芳基是含有6至14个碳原子的芳族基团，选自苯基、萘基、联苯基；R9和R10的杂芳基是含有1至14个碳原子和一个或多个氮的芳族基团；n独立地为1‑4。 [0063] 本发明还提供了式(I)的化合物： [0064] [0065] 其中： [0066] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0067] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0068] R2和R3是H或R5，条件是当R2和R3之一是R5时，另一个是H，当R2和R3之一是H时，另一个是R5； [0069] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0070] R5＝R8； [0071] R8＝(CH2)mX(CH2)pR9； [0072] X＝O、S、SO2、NH、NAc或N(CH2)qR9； [0073] R9＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基、杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]、氟、C＝O、NHCO‑R10； [0074] R10＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的芳基、杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、(CH2)nSO3H、OR4、SO3H、唑[5元含N杂环]、氟； [0075] 其中R9和R10的芳基是含有6至14个碳原子的芳族基团，选自苯基、萘基、联苯基；R9和R10的杂芳基是含有1至14个碳原子和一个或多个氮的芳族基团；n、m、p和q独立地为1‑4。 [0076] 表述“烷基”是指含有1至20个碳原子，优选1至12个碳原子，特别是1至6个(例如1、2、3或4个)碳原子的饱和直链或支链烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。此外，术语烷基是指其中一个或多个氢原子被卤素原子(优选F或Cl)替代的基团，例如2,2,2‑三氯乙基或三氟甲基。 [0077] 表述“酰基”是指基团(烷基)‑C(O)‑、(芳基)‑C(O)‑、(杂芳基)‑C(O)‑、(杂烷基)‑C(O‑)和(杂环烷基)‑C(O)‑，其中基团通过羰基官能团与母体结构连接。在一些实施方案中，它是C1‑C4酰基，其是指酰氧基的烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基部分的链或环原子加上酰基的羰基碳的总数，即三个其他的环或链原子加上羰基。 [0078] 表述“芳基”是指含有一个或多个含有6至14个环碳原子，优选6至10个(特别是6个)环碳原子的环的芳族基团。 [0079] 表述“芳烷基”或“芳基C1‑4烷基”是指含有根据上述定义的芳基以及烷基、烯基、炔基和/或环烷基的基团，但不限于苄基、2‑苯基乙基、3‑苯基丙基和2‑萘‑2‑基乙基。芳烷基优选包含一个或两个含有6至10个碳原子的芳环体系(1或2个环)和一个或两个含有1或2至6个碳原子的烷基、烯基和/或炔基，以及/或者含有5或6个环碳原子的环烷基。 [0080] 表述“杂芳基”是指这样的芳族基团，其含有一个或多个含有5至14个环原子，优选5至10个(特别是5或6或9或10个)环原子的环，并含有一个或多个(优选1、2、3或4个)氧、氮、磷或硫环原子(优选O、S或N)的芳族基团。实例是吡啶基(例如4‑吡啶基)、咪唑基(例如2‑咪唑基)、苯基吡咯基(例如3‑苯基吡咯基)、噻唑基、异噻唑基、1,2,3‑三唑基、1,2,4‑三唑基、噁二唑基、噻二唑基、吲哚基、吲唑基、四唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、吲唑基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、吡咯基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、嘧啶基、2,3‑联呋喃基、吡唑基(例如3‑吡唑基)和异喹啉基。 [0081] 表述“苯并杂芳基”或“苯并杂芳族”是指包含与单环杂芳族环稠合的苯环的双环。苯并杂芳基的实例包括苯并异噁唑基、苯并噁唑基、苯并异噻唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(包括S‑氧化硫和二氧化硫)、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、吲哚基等。 [0082] 术语“唑”是指具有氮环原子和0至3个选自N、O或S的额外环杂原子的五元杂芳基。咪唑、噁唑、噻唑和四唑是代表性的唑基。 [0083] 表述“环烷基”是指饱和的或部分不饱和的(例如环烯基)环状基团，其包含一个或多个环(优选1或2个)，并且包含3至14个环碳原子，优选3至10个(特别是3、4、5、6或7个)环碳原子。环烷基的具体实例是环丙基、环丁基、环戊基。 [0084] 表述“任选取代的”是指其中至少一个或任选地两个、三个或更多个氢原子可以被氟、氯、溴、碘原子或被OH、═O、SH、═S、NH2、═NOH、N3或NO2基团替代的基团。此外，该表述还指可被至少一个、两个、三个或更多个未取代的C1‑C10烷基、C2‑C10烯基、C2‑C10炔基、杂烷基、C3‑C18环烷基、C2‑C17杂环烷基、C4‑C20烷基环烷基、C2‑C19杂烷基环烷基、C6‑C18芳基、C1‑C17杂芳基、C7‑C20芳烷基或C2‑C19杂芳烷基取代的基团。此外，该表述特别是指可被一个、两个、三个或更多个未取代的C1‑C6烷基、C2‑C6烯基、C2‑C6炔基、C1‑C6杂烷基、C3‑C10环烷基、C2‑C9杂环烷基、C7‑C12烷基环烷基、C2‑C11杂烷基环烷基、C6‑C10芳基、C1‑C9杂芳基、C7‑C12芳烷基或C2‑C11杂芳烷基取代的基团。 [0085] 根据优选的实施方案，本文所述的所有烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、烷基环烷基、杂烷基环烷基、芳烷基和杂芳烷基可以任选地被取代。 [0086] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0087] (A) [0088] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0089] R1＝COOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0090] R2＝H；R3＝R5；和 [0091] R5＝R6＝CONH‑R9； [0092] 或者 [0093] (B) [0094] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0095] R1＝COOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0096] R3＝H；R2＝R5；和 [0097] R5＝R6＝CONH‑R9。 [0098] 因此，在第一个实施方案中，本发明包括表1的化合物： [0099] 表1 [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] 优选地，本发明提供了式(I)的化合物，其中： [0106] (A) [0107] Ra、Rb＝H； [0108] R1＝SO3H； [0109] R2＝H；R3＝R5；和 [0110] R5＝R6＝CONH‑R9； [0111] 或者 [0112] (B) [0113] Ra、Rb＝H； [0114] R1＝SO3H； [0115] R3＝H；R2＝R5；和 [0116] R5＝R6＝CONH‑R9。 [0117] 在第二个实施方案中，本发明包括表2的化合物： [0118] 表2 [0119] [0120] [0121] [0122] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0123] (A) [0124] Ra、Rb＝H； [0125] R1＝(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0126] R2＝H；R3＝R5；和 [0127] R5＝R6＝CONH‑R9； [0128] 或者 [0129] (B) [0130] Ra、Rb＝H； [0131] R1＝(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0132] R3＝H；R2＝R5；和 [0133] R5＝R6＝CONH‑R9。 [0134] 在第三个实施方案中，本发明包括表3的化合物： [0135] 表3 [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0142] (A) [0143] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0144] R1＝CONH‑R10；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0145] R2＝H；R3＝R5；和 [0146] R5＝R6＝CONH‑R9； [0147] 或者 [0148] (B) [0149] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0150] R1＝CONH‑R10；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0151] R3＝H；R2＝R5；和 [0152] R5＝R6＝CONH‑R9。 [0153] 在第四个实施方案中，本发明包括表4的化合物: [0154] 表4 [0155] [0156] [0157] [0158] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0159] (A) [0160] Ra、Rb＝H； [0161] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0162] R2＝H；R3＝R5；和 [0163] R5＝R6＝CONHCOR9； [0164] 或者 [0165] (B) [0166] Ra、Rb＝H； [0167] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0168] R3＝H；R2＝R5；和 [0169] R5＝R6＝CONHCOR9。 [0170] 在第五个实施方案中，本发明包括表5的化合物： [0171] 表5 [0172] [0173] [0174] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中 [0175] (A) [0176] Ra、Rb＝H； [0177] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0178] R2＝H；R3＝R5；和 [0179] R5＝R6＝CONH(CH2)n‑R9； [0180] 或者 [0181] (B) [0182] Ra、Rb＝H； [0183] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0184] R3＝H；R2＝R5；和 [0185] R5＝R6＝CONH(CH2)n‑R9。 [0186] 在第六个实施方案中，本发明包括表6的化合物： [0187] 表6 [0188] [0189] [0190] [0191] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0192] Ra、Rb＝H； [0193] R1＝SO3H； [0194] R2＝H；R3＝R5；和 [0195] R5＝R6＝CONH(CH2)n‑R9。 [0196] 根据第七个实施方案，本发明包括下表7的化合物： [0197] 表7 [0198] [0199] 优选地，本发明涉及式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0200] (A) [0201] Ra、Rb＝H； [0202] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0203] R2＝H；R3＝R5；和 [0204] R5＝R6＝CONHCH(COOR4)(CH2)k‑R9； [0205] 或者 [0206] (B) [0207] Ra、Rb＝H； [0208] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4；R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0209] R3＝H；R2＝R5；和 [0210] R5＝R6＝CONHCH(COOR4)(CH2)k‑R9。 [0211] 根据第八个实施方案，本发明包括下表8的化合物： [0212] 表8 [0213] [0214] 在特定实施方案中，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中 [0215] (A) [0216] Ra、Rb＝H； [0217] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0218] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0219] R2＝H；R3＝R5；和 [0220] R5＝R6＝杂芳基‑R9； [0221] 或者 [0222] (B) [0223] Ra、Rb＝H； [0224] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0225] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0226] R3＝H；R2＝R5；和 [0227] R5＝R6＝杂芳基‑R9。 [0228] 根据第九个实施方案，本发明包括表9的化合物： [0229] 表9 [0230] [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0236] (A) [0237] Ra、Rb＝H； [0238] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0239] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0240] R2＝H；R3＝R5；和 [0241] R5＝R7＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的苯并杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H、OR4、唑[5元含N杂环]或氟； [0242] 或者 [0243] (B) [0244] Ra、Rb＝H； [0245] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0246] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0247] R3＝H；R2＝R5；和 [0248] R5＝R7＝被至少一个或多个选自以下的基团取代的苯并杂芳基：COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H、OR4、唑[5元含N杂环]或氟。 [0249] 根据第十个实施方案，本发明包括表10的化合物： [0250] 表10 [0251] [0252] [0253] 优选地，本发明提供了式(I)的氢醌衍生化合物，其中： [0254] (A) [0255] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0256] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0257] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0258] R2＝H；R3＝R5；和 [0259] R5＝R8＝(CH2)mX(CH2)pR9； [0260] 其中X＝O、S、SO2、NH、NAc或N(CH2)qR9； [0261] 或者 [0262] (B) [0263] Ra、Rb＝H、C1‑4酰基、芳基C1‑4烷基、C6‑C10芳基CO、HOOC(CH2)nCO、C1‑C7烷基NHCO、膦酰基、膦酰基氧基甲基、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基或C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基； [0264] R1＝COOR4、(CH2)nCOOR4、SO3H、(CH2)nSO3H或CONH‑R10； [0265] R4＝H、C1‑4烷基、芳基C1‑4烷基、官能化的C1‑C6烷基包括吗啉代‑C1‑C6烷基、吡咯烷基‑C1‑C6烷基、N‑甲基哌嗪基‑C1‑C6烷基、C6‑C10芳基包括o‑甲氧基苯基(愈创木酚酯)、C1‑C6酰氧基甲基、C1‑C6酰氧基‑1‑乙基、C1‑C6烷氧基羰基氧基甲基、C1‑C6烷氧基羰基氧基‑1‑乙基或(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基； [0266] R3＝H；R2＝R5；和 [0267] R5＝R8＝(CH2)mX(CH2)pR9； [0268] 其中X＝O、S、SO2、NH、NAc或N(CH2)qR9。 [0269] 根据第十一个实施方案，本发明包括表11的化合物： [0270] 表11 [0271] [0272] [0273] [0274] [0275] 根据又另一个实施方案，本发明包括表12的化合物： [0276] 表12 [0277] [0278] [0279] 本发明还涉及用于制备式(I)的氢醌衍生化合物的方法，其包括： [0281] 步骤(b)：通常通过皂化反应对酯官能团进行脱保护；和 [0282] 步骤(c)：通常通过催化氢化对酚官能团进行脱保护。 [0283] 或者，替代地， [0284] 步骤(d)：还原在酚官能团处受保护的氢醌衍生的羧酸，以产生苄醇 [0286] (f)通常通过皂化反应对酯官能团进行脱保护；和 [0287] (g)通常通过催化氢化对酚官能团进行脱保护。 [0288] 该过程示意性地表示如下： [0289] [0290] 本发明的氢醌衍生化合物可以其旋光体(立体异构体)、E/Z异构体、对映异构体、外消旋体、非对映异构体及其水合物和溶剂合物存在。化合物的溶剂合物是由于化合物分 子和所用惰性溶剂之间的相互吸引。溶剂合物，例如一水合物、二水合物或醇化物。 [0291] 本发明的氢醌衍生物还可以药学上可接受的盐存在，其中母体氢醌衍生物通过制备其酸性或碱性盐进行改性。 [0292] 药学上可接受的盐的实例尤其包括碱性残基如胺的无机或有机酸盐；和酸性残基如羧酸等的碱性或有机盐。药学上可接受的盐可包括常规的无毒盐或季铵盐，其适用于化 合物的所有给药途径，例如来自无毒有机酸或无机酸。例如，所述常规无毒盐包括衍生自无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的那些；以及由有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、hydroxyleleic、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、硫烷基(sulfanyl)、2‑乙酰氧基‑苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、三氟乙酸等制备的盐。 [0293] 阳离子和阴离子的药学上可接受的盐记载于“Pharmaceutical salts:A summary on doses of salt formers from the Orange Book.Saal C,European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,49,614–623”。作为阳离子的实例，我们可以列举出铝、精氨酸、苄星青霉素、钙、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、镁、组氨酸、锂、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、三乙胺、锌。作为阴离子的实例，我们可以列举出乙酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯甲酸盐、苯磺酸(besylate)、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、癸酸盐、依地酸盐、乙磺酸盐(esylate)、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、己酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、辛酸盐、油酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、8‑氯茶碱盐(teoclate)、甲苯磺酸盐。替代地，两性离子可以用作盐，如游离氨基酸精氨酸或赖氨酸作为阳离子抗衡离子，谷氨酸或天冬氨酸作为阴离子抗衡离子。作为精氨酸或赖氨酸重复 单位的短肽(2至20个氨基酸)及其与其他中性氨基酸的组合。这些阳离子细胞穿透肽(CPP) 可用作药物渗透进入细胞的促进剂。 [0294] 可用于本发明的化合物的药学上可接受的盐可以例如由含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学步骤合成。通常，所述盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱性 形式与在水中或有机溶剂中或两者的混合物中的化学计量量的适当的碱或酸反应来制备； 通常，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985, p.1418，其公开内容通过引用纳入本文，列出了合适的盐。 [0295] 根据本发明和如本文在各种实施方案中所述的合适的剂量可以根据受试者的状况、年龄和物种而变化，并且可以由本领域技术人员容易地确定。在兽医和人类医学中使用的总日剂量将合适地在0.01‑2000mg/kg体重，优选0.1‑1000mg/kg体重，优选1‑100mg/kg体重，并且这些可以单剂量或分剂量给药，此外，当发现有指示时，也可以超过上限。这种剂量可以根据每种情况下的个体要求进行调整，包括所给予的具体化合物、给药途径、所治疗的疾病以及所治疗的患者。然而，这些化合物也可以每周、每月或甚至更长时间间隔作为长效制剂(植入物、缓释制剂等)给药。在这种情况下，剂量可远高于每日剂量，并可根据给药形式、体重和具体适应症进行调整。合适的剂量可以通过进行常规模型测试，优选动物模型来确定。一般而言，在对体重约70kg的成年人口服或肠胃外给药的情况下，约10mg至约 10.000mg，优选约200mg至约1000mg的日剂量应该是合适的，尽管当指示时可能超过上限。 应当理解，上述治疗有效剂量不必是单次给药的结果，通常是多个单位剂量给药的结果。那些单位剂量又可以包括日剂量或周剂量的部分，因此，在治疗(接触)期间确定治疗有效剂 量。例如，对于口服给药，日剂量可以是约0.04至约1.0mg/kg体重，更优选约0.04至约 0.20mg/kg/天，还更优选约0.05至约0.15mg/kg/天，最优选约0.1mg/kg体重。一般而言，活性物质的给药量可以在相对较宽的范围内变化，以达到并优选保持所需的血浆浓度。活性 成分的单位剂型可含有约0.1毫克至约15毫克活性成分。优选的单位剂型含有约0.1至约1 毫克的药剂，并且可以每天给药2至5次。然而，应注意，也考虑了其他替代途径，例如以经设计以保持上述血浆浓度的速率连续输注。特定治疗的持续时间也可以变化，取决于疾病的 严重程度、治疗是用于急性表现还是用于预防目的以及类似的考虑因素。典型给药持续约5至约14天，通常为7天时间过程。 [0296] 给药疗程(周期)也可按月间隔重复，或按周间隔递送肠胃外单位剂量。口服单位剂量可以每隔一至几天给药，以提供确定的治疗有效剂量。本发明化合物的合适剂量将取 决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、给予药剂是为了预防还是治疗目的、患者的病史和对化合物的反应以及负责医生的标准。确定合适的剂量或给药途径显然是当前医 生力所能及的。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。有效剂量的物种 间标度可以按照由Mordenti,J.and Chappell,W."The use of interspecies scaling in toxicokinetics",in Toxicokinetics and New Drug Development,editors Yacobi et al.,Pergamon Press,New York,1989,pp.42‑96所建立的原则进行。 [0297] 本发明还提供了药物组合物，其包含(i)治疗有效量的式(I)的氢醌衍生化合物或其药学上可接受的盐、或其前药或立体异构体，和(ii)一种或多种药学上可接受的赋形剂。 [0299] 具有一种或多种药物组分的本发明化合物的药物组合物可以与所述赋形剂一起配制成液体药物、固体或半固体药物和/或气体药物。 [0300] 当它们存在于固体制剂中时，这些可以包括但不限于颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、粉剂、薄膜剂、锭剂、可压片剂、可溶解片剂、崩解片剂、分散片剂、薄膜包衣片剂，以及任何上述固体形式的受控、持续、延长或延缓释放的形式。此类制剂也可以是立即释放、延迟释放或延缓释放的形式。此外，立即释放组合物可以是常规的、可分散的、可咀嚼的、口溶的或速溶的制剂，延缓释放组合物可包含亲水性或疏水性、或亲水性和疏水性的组合、释放速率受控物质以形成基质或储库或基质和储库体系的组合。 [0301] 所述组合物可以使用任何一种或多种技术制备，例如直接混合、干法制粒、湿法制粒、均质化、研磨、微粉化、挤出和滚圆。组合物可以以未包衣、薄膜包衣、糖衣、粉末包衣、肠溶包衣和缓释包衣形式存在。当它们存在于液体制剂中时，这些可以包括但不限于任何液体形式，例如溶液、悬浮液、纳米悬浮液、分散体、胶体、乳液、洗剂、霜剂、软膏、酊剂和冻干组合物。当它们存在于气态制剂中时，这些可以包括但不限于碎粉或混合物、微粉化粉末或混合物、纳米悬浮液、气雾剂、喷雾剂、液滴、薄雾、雾化溶液或悬浮液和/或雾化蒸汽。 [0303] 本发明的药物组合物和化合物可以配制成通过以下途径给药：肠内途径，例如口服途径；通过注射的肠胃外途径，例如静脉、皮下、眼内、肌内或腹腔注射；局部途径，例如眼部途径、粘膜和跨粘膜途径，包括舌下/颊部途径；以及肺、鼻、鼻内、支气管内、肺内途径。眼部给药途径包括局部眼部给药、眼内给药、玻璃体内给药或眼球后给药。 [0304] 本发明的化合物的优选制剂包括液体口服制剂、眼部制剂以及静脉注射和腹腔注射制剂。 [0305] 液体口服制剂是用于口服药物给药的溶液和悬浮液形式，常见、方便且被认为安全。它们可用于递送相对大量的药物，常用于儿科人群和吞咽片剂或胶囊有困难的人群。通过胃肠道引入可实现快速溶解和药物吸收，但必须考虑耐受性和与胃肠道中其他物质的相 互作用。活性药物成分(API)的特性可以使其配制成简单的水基口服溶液，然而，当API的溶解性较差时，需要围绕分子来设计制剂，以提高溶解度和生物利用度。表面活性剂、溶剂、缓冲剂和油的引入增加了溶解度，减少了与胃液相互作用时的沉淀和/或降解。在需要悬浮液的情况下，通常会减小和控制粒径，以提高药物溶解度、渗透性和最终的药物吸收。随着制剂开发的进展，引入了防腐剂和调味剂，以确保患者依从性和保质期的适当性。 [0306] 眼部制剂是直接递送至眼睛的眼部制剂，通常为溶液或悬浮液形式的液体。眼部给药可避免胃肠道的代谢，可用于当口服给予时吸收不良的药物。滴眼剂是无菌和等渗的，标称pH值为4‑8，以避免刺激眼睛。将包括增溶剂、螯合剂、聚合物、表面活性剂、渗透促进剂和环糊精在内的赋形剂添加到制剂中，以改善稳定性、改变粘度或增加难溶性药物的溶解 度、渗透性和生物利用度。 [0307] 静脉注射制剂允许在整个剂量的肠胃外药物递送到达患者系统后迅速吸收，从而立即产生反应。这种引入方式避免了胃肠道的代谢，可用于当口服给予时口服吸收不良的 药物。注射剂通常为无菌、等渗的水基溶液，并设计为在给药时不会引起疼痛。对于难溶性药物，用有机助溶剂、表面活性剂和缓冲液对制剂进行改性，以增加溶解度，纳米悬浮制剂也是可以接受的。对于那些在溶液中不稳定的分子，可将制剂冻干以在使用时进行稀释。 [0308] 本发明还提供了试剂盒，其包含含有治疗有效剂量的一种或多种本发明化合物或其制剂的组合物，以及用于给予所述组合物或制剂的递送装置，并且还包含含有使用说明 书的药品说明书(package insert)。 [0309] 为了制备本发明的药物组合物，根据常规药物配制技术，本发明的活性成分可以与药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂混合。可用于本发明组合物的药学上可接受的载体包括任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。组合物还可含有固体药物赋形剂，如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂乳粉等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、聚乙二醇、水、乙醇和各种油，其包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是用于注射溶液的液体载体，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇。有关载体、稳定剂和佐剂的实例，参见E.W.Martin编辑的Remington's Pharmaceutical Sciences,(Mack Publishing Company,18th ed.,1990)。 [0310] 组合物还可包含稳定剂和防腐剂。可用于本发明组合物的药学上可接受的溶剂的实例可在参考书中找到，如Handbook of Pharmaceutical Excipients(第九版, Pharmaceutical Press,London and American Pharmacists Association,Washington, 2020)、Aulton's Pharmaceutics,The Design and Manufacture of Medicines.(第五版, 编辑:Kevin Taylor and Michael Aulton,Elsevier,2017)、"Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,6th Ed."(多个编辑,1989‑1998,Marcel Dekker)和" Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems"(ANSEL et al.,1994et 2011,WILLIAMS&WILKINS)。可用于本发明组合物的药学上可接受的溶剂的非限制性实例包 括但不限于丙二醇(也称为1,2‑二羟基丙烷、2‑羟基丙醇、甲基乙二醇(methyl ethylene glycol)、甲基乙二醇(methyl glycol)或丙烷‑1,2‑二醇)、乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇、甘油、聚乙二醇(PEG)、乙二醇、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)或任何形式的聚乙氧基化蓖麻油、二丙二醇、二甲基异山梨醇、碳酸丙烯酯、N‑甲基吡咯烷酮、糖原质(glycofurol)、四甘醇、丙二醇脂肪酸酯及其混合物。 [0311] 本发明的化合物已显示出抗纤维化、抗炎和抗血管生成作用。下文所列的几种疾病不仅涉及一个靶标，还涉及两个甚至三个靶标。疾病类别显示主要的血管生成(血管)、炎性和/或纤维化病理生物学。 [0312] 在一些实施方案中，本发明涉及本发明的化合物的前药。此类前药的益处通过本领域技术人员已知的方法获得，例如通过加入合适的可裂解官能团，所述官能团将产生例 如用于肠胃外递送或用于口服递送的更好的水溶性。 [0313] 特别优选表现出强极性和带电荷特性的本发明分子的前药，因为这些官能团可以积极地影响跨生物膜的被动渗透性。极性和带电荷药物的主要障碍是它们的膜渗透性差， 这通常导致低的和可变的口服吸收以及低的口服生物利用度。此外，极性和带电荷药物的 口服吸收通常与大量的种间变异有关。即使在局部给药后，渗透性差的药物在特定靶器官 中的暴露水平也很低。提高膜渗透性是迄今为止前药研究最富有成效的领域之一。 [0314] 已经为本发明的药物开发了不同的前药策略，以克服眼睛上的局部途径屏障、口腔粘膜屏障、转运体效应或其他局部用途。 [0315] 前药策略于1958年被Adrian Albert正式认可(Albert,A.Chemical aspects of selective toxicity.Nature,1958,182,421–422)，但始于上个世纪初，例如乌洛托品、非那西汀和百浪多息。前药是具有很少或没有药理活性但具有内在的结构不稳定性的分子， 无论是偶然的还是通过设计的，其允许在体内生物转化为活性药物。这种转化可以通过化 学或酶促过程或两者的结合来实现。活性分子通常与不期望的理化特性相关，这对它们递 送到合适的生物靶标产生了相当大的挑战。 [0316] 通过药物结构修饰获得的前药旨在影响分子的固有理化特性，以实现其递送。在发现阶段，这些发展并不总是被整合到新分子的设计中。通常，模拟优化是优选的前进途 径。实施早期前药策略可能会导致更快的临床开发，并最终实现药物产品的商业化。 [0317] Rautio J,2018(Jarkko Rautio et al,Nature Reviews Drug Discovery,2018,17,559‑587)中记载了母体药物上最常见官能团的前药策略。本综述记载了前药在当代药 物设计和开发中不断扩大的作用，以及针对母体药物上最常见官能团的前药策略。 [0318] 通过添加合适的可裂解官能团来获得前药的益处，这些官能团将产生例如用于肠胃外递送或口服递送的更好的水溶性。另一方面，对于极性很强且带有电荷的分子，这些官能团可能会积极地影响跨生物膜的被动渗透性。极性和带电荷药物的主要障碍是它们的膜 渗透性差，这通常导致低的和可变的口服吸收以及低的口服生物利用度。 [0319] 此外，极性和带电荷药物的口服吸收通常与大量的种间变异有关。即使在局部给药后，渗透性差的药物在特定靶器官中的暴露水平也很低。改善膜渗透性一直是迄今为止 前药研究中最富有成效的领域之一。许多前药策略可用于影响母体药物的亲脂性。药物的 亲脂性已通过短链烃前部分掩蔽其极性和离子化功能而得到改善。亲水性羟基、羧基、磷酸盐或胺以及其他带负电荷或正电荷的基团已成功转化为更亲脂性的烷基或芳基酯或N‑酰 基衍生物，它们在体内被普遍存在的酯酶或肽酶迅速水解回母体药物。 [0320] 大多数亲脂性前药已被开发用于改善膜渗透性和口服吸收。相同的前药策略可用于改善通过皮肤或眼睛吸收的母体药物的局部给药。在眼部局部给药期间，前药在滴注后 容易穿透角膜，在角膜中主要被眼部羧酸酯酶水解。 [0321] 前药还可以利用载体介导的转运。这些转运蛋白是膜蛋白，其在控制关键极性内源性营养物的摄入和排出方面发挥重要作用。它们的特异性并不局限于内源性底物，与内 源性底物具有密切结构相似性的药物也可以通过转运蛋白携带穿过细胞膜。载体介导的转 运对于极性和带电荷药物尤为重要，因为它们穿过生物膜上的被动扩散可以忽略不计。可 以利用载体介导的转运机制的前药为药物设计提供了有趣的靶点。同样，前药可以改善代 谢稳定性。 [0322] 前药可改善通常归因于肝代谢的代谢不稳定性。同样，可以通过选择性前药策略来克服药物不想要的肠道代谢。这种不稳定性可极大地减少药物到达体循环及其靶点的总 量。前药可用于保护活性药物免受这种首过效应的影响，其通过掩蔽代谢不稳定但药理学 上必需的官能团，如苯酚，以避免快速代谢。 [0323] 为了解决血浆水平不足和延长作用持续时间的问题，药物通常由制剂例如悬浮液和聚合物基质控制，其控制药物释放，并且避免峰效应和延长其作用。前药可用于通过以影响活性药物的释放速率、吸收速率或其组织分布的方式改变其水溶性和溶出特性来实现活 性药物的控释。 [0324] 前药在开发数种皮下或肌肉内缓释长效注射剂中特别有用，这些注射剂可将母体药物的治疗血浆水平维持数周至数月。这些前药通常是脂肪酸酯，如癸酸酯、棕榈酸酯、庚酸酯、环戊丙酸酯或戊酸酯，它们被配制在油基载体中，导致前药缓释，并因此调节母体药物的处置。这些前药的高亲脂性还会导致与血液和组织蛋白的结合，从而减慢酶转化，并因此导致活性药物在体循环中缓慢出现。 [0325] 通常通过靶向在肿瘤组织的酸性环境中，在具有酸不稳定前药的核内体或溶酶体中裂解的前药实现更好的靶向性和更低的副作用。使用位点特异性酶也实现了类似的方 法，且前药主要在酶浓度最高的所需器官或组织中裂解。对于带电荷的药物，细胞内裂解导致带负电荷或带正电荷的药物的细胞浓度很高，它们被限制在靶细胞内。 [0326] 已经为本发明的药物开发了不同的前药策略，以克服眼睛上的局部途径屏障、口腔粘膜屏障、转运体效应或其他局部用途。 [0328] 本发明的化合物带有羧基官能团和酚基。可考虑衍生自这些官能团的多种前药：例如，羧酸最常被转化为酯：简单烷基酯(甲基、乙基、异丙基和更长的链)、官能化烷基酯如吗啉代烷基酯、吡咯烷基烷基酯、N‑甲基哌嗪基‑烷基酯，以及芳基酯如愈创木酚衍生的酯； 混合缩醛酯如酰氧基甲基(或1‑乙基)或烷氧基羰基氧基甲基(或1‑乙基)酯和(氧代间二氧杂环戊烯基)甲基酯也是羧酸的有效前药官能团。多种酯和官能化醚已用作基于酚的前药： 简单脂族酯、芳族酯、二羧酸的半酯、氨基酸酯、氨基甲酸酯、磷酸单酯、膦酰基氧基甲基醚、酰氧基甲基(或1‑乙基)醚、烷氧基羰基氧基甲基(或1‑乙基)醚、氨基酰氧基甲基醚等。 [0329] 因此，本发明提供了一种治疗和/或预防疾病或病症的方法，所述疾病或病症为自身免疫、免疫、风湿病、血管病症、眼科病症、纤维化病症、代谢和胃肠病症、神经炎性和神经退行性疾病、肿瘤和癌症相关病症、激素相关疾病和由病毒和细菌感染性疾病引起的免疫 性病症及其并发症，所述方法包括向有需要的受试者给予治疗有效剂量的上述本发明的化 合物和/或药物组合物。 [0330] 本发明的药物组合物和方法特别适合于人或非人动物受试者。 [0331] 本发明的化合物可以基于它们各自的细胞因子谱靶向疾病，如针对几种化合物提供的生物数据中所述(参见图3A‑D)。以下网址Open Targets Platform(URL:https:// www.targetvalidation.org/,Denise Carvalho et al,Nucleic Acids Research,Volume 47,Issue D1,08 January 2019,D1056–D1065,https://doi.org/10.1093/nar/gky1133) 提供了基于当前文献目录信息的完整的图片，并可通过疾病或细胞因子进行检索。 [0332] 两个典型的实例：(a)对糖尿病视网膜病变的疾病特异性检索导致下列细胞因子被描述为与该疾病高度相关(图3C)。前三种细胞因子作为糖尿病视网膜病变检索的实例， 表示VEGFA评分＝1(血管内皮生长因子A)，HFE评分＝1(稳态铁调节剂)，和TNF评分＝0.86 (肿瘤坏死因子)；和(b)检索VEGFA：导致神经系统疾病、血管疾病、眼病、视网膜病变及其他几种疾病，如图3D所示。 [0333] 为了说明化合物对一小群炎性细胞因子的效力，评估了化合物对人全血的作用(实施例3.6)及其对LPS诱导的炎症的抑制作用的IC50值(表13，以μM计)。 [0334] 表13： [0335] [0336] [0337] 免疫/风湿病/血管病症可包括例如腹膜炎、川崎病(KD)、大动脉炎(TA)、显微镜下多血管炎(MP)、巨细胞动脉炎(GCA)、抗磷脂综合征(APS)、白塞病(BD)、肉芽肿性多血管炎(GPA)或韦格纳肉芽肿(WG)、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、Churg‑Strauss综合征(EGPA)和酒渣鼻(RO)。 [0338] 风湿病尤其会影响关节肌腱、韧带和骨骼，伴有疼痛、运动丧失和炎症。这些包括多种类型的关节炎，如骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)、狼疮、脊椎关节炎：强直性脊柱炎(AS)和银屑病关节炎(PsA)、干燥综合征、痛风、硬皮病、感染性关节炎、幼年特发性关节炎、风湿性多肌痛。 [0339] 腹膜炎是通常由细菌或真菌感染引起的腹膜炎症。腹膜炎有两种类型。第一种类型是自发性腹膜炎，可发展为肝病的并发症如肝硬化或肾病。继发性腹膜炎可由腹部穿孔 引起，或作为其他医疗疾病的并发症。如果不进行治疗，腹膜炎可能会导致严重的、可能危及生命的感染。 [0341] 大动脉炎是一种罕见的血管炎，是一组导致血管炎症的病症。在大动脉炎中，炎症会损害主动脉及其主要分支。这种疾病可导致动脉变窄或阻塞，或导致动脉瘤。大动脉炎还可导致手臂或胸部疼痛、高血压，最终导致心力衰竭或中风。需要药物来控制动脉炎症并预防并发症。 [0342] 肉芽肿性多血管炎是一种罕见疾病，可引起鼻、鼻窦、喉咙、肺和肾的血管的炎症。以前称为韦格纳肉芽肿，这种疾病是一组称为血管炎的血管病症之一。它减缓血液流向某 些器官。受影响的组织会形成称为肉芽肿的炎症区域，从而影响这些器官的工作方式。如果不进行治疗，这种疾病可能是致命的。 [0343] 巨细胞动脉炎是动脉内壁的炎症。最常见的是，它会影响头部的动脉，尤其是太阳穴。因此，巨细胞动脉炎有时被称为颞动脉炎。巨细胞动脉炎常引起头痛、头皮压痛、颌骨疼痛和视力问题。未经治疗，可能导致失明。 [0344] 当免疫系统错误地产生抗体，使血液更容易凝结时，就会发生抗磷脂综合征。这会导致腿、肾、肺和脑出现危险的血块。对于孕妇，抗磷脂综合征还可能导致流产和死产。抗磷脂综合征没有治愈方法。只有可用的药物才能降低血块的风险。 [0345] 白塞病又称白塞氏综合征，是一种引起血管炎症的罕见疾病。该疾病可导致许多起初看似不相关的体征和症状。它们可能包括口腔溃疡、眼部炎症、皮疹和病变以及生殖器溃疡。目前的治疗可有助于减轻白塞病的症状，并预防严重的并发症，如失明。 [0346] Churg‑Strauss综合征是一种以血管炎症为标志的病症。这种炎症会限制血液流向器官和组织，有时会对它们造成永久性损害。这种情况也称为嗜酸性肉芽肿性多血管炎 (EGPA)。哮喘是Churg‑Strauss综合征最常见的体征。这种病症还会导致其他问题，如花粉热、皮疹、胃肠道出血以及手脚疼痛和麻木。Churg‑Strauss综合征无法治愈。目前的药物包括类固醇和其他强效免疫抑制药物，以帮助控制症状。 [0347] 酒渣鼻是一种常见的皮肤病，其会导致面部发红和可见的血管。它也可能产生小的、红色的、充满脓液的肿块。这些体征和症状可能持续数周至数月，然后消失一段时间。酒糟鼻可能被误认为痤疮，其他皮肤问题或自然红肿。酒渣鼻无法治愈，但治疗可控制和减轻体征和症状。骨关节炎是最常见的关节炎形式，影响着全球范围内数百万人。当保护性软骨随着时间的推移而磨损时，就会发生这种情况。虽然骨关节炎可损害任何关节，但这种病症最常影响手、膝、髋和脊柱的关节。骨关节炎症状通常可以得到控制，尽管关节损伤无法逆转。 [0348] 狼疮是一种自身免疫性疾病。它会导致免疫系统产生称为自身抗体的蛋白质，其攻击自身的组织和器官，包括肾。狼疮性肾炎是系统性红斑狼疮(通常称为狼疮)患者的常 见并发症。当狼疮自身抗体影响肾结构时，就会发生狼疮性肾炎。这会导致肾炎，并可能导致尿血、尿蛋白、高血压、肾功能损伤甚至肾功能衰竭。 [0349] 硬皮病是一组罕见的涉及皮肤和结缔组织硬化和收紧的疾病。硬皮病有许多不同的类型。在某些人中，硬皮病只影响皮肤。但对许多人来说，硬皮病还会损害皮肤以外的结构，如血管、内脏和消化道(系统性硬皮病)。硬皮病无法治愈。 [0350] 干燥综合征是一种免疫系统病症，由其两种最常见的症状鉴定：眼干和口干。这种疾病通常会伴随其他免疫系统病症，如类风湿性关节炎和狼疮。在干燥综合征中，眼睛和口腔的粘膜和分泌水分的腺体通常首先受到影响——导致眼泪和唾液减少。 [0351] 感染性或脓毒性关节炎是一种关节疼痛性感染，其可由细菌从身体另一部位经血流传播而来。当穿透性损伤(如动物咬伤或外伤)将细菌直接递送到关节时，也可能发生脓 毒性关节炎。有人工关节的人也有患脓毒性关节炎的风险。膝最常受到影响，但脓毒性关节炎也可以影响髋、肩和其他关节。感染可迅速且严重损害关节内的软骨和骨骼，因此及时治疗至关重要。 [0352] 幼年特发性关节炎，以前称为幼年类风湿性关节炎，是16岁以下儿童最常见的关节炎类型。幼年特发性关节炎可导致持续性关节疼痛、肿胀和僵硬。有些儿童可能仅出现几个月的症状，而有些儿童则可能出现多年的症状。某些类型的幼年特发性关节炎可导致严 重的并发症，如生长问题、关节损伤和眼部炎症。 [0353] 风湿性多肌痛是一种会导致肌肉疼痛和僵硬，尤其是在肩部和髋部的炎性病症。风湿性多肌痛的体征和症状通常开始很快，且在早上更严重。大多数患风湿性多肌痛的人 超过65岁。这种疾病与另一种称为巨细胞动脉炎的炎症有关。 [0354] 眼科病症可包括例如但不限于：年龄相关性黄斑变性(AMD或ARMD，干型和湿型)、翼状胬肉(PTE)、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病黄斑水肿(DME)、Stargardt病(SD)、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、干眼综合征(DYS)、眼内炎、中心性浆液性脉络膜视网膜病变 (CSC)、色素性视网膜炎(RP)、青光眼和青光眼相关并发症以及葡萄膜炎(UVE)。 [0355] 湿性黄斑变性是一种引起视力模糊或视野盲点的慢性眼部病症。它通常是由异常血管渗出液体或血液到黄斑引起的。黄斑位于视网膜负责中央视觉的部分。湿性黄斑变性 是年龄相关性黄斑变性的两种类型之一。湿型总是从干型开始。干性黄斑变性较为常见，且不太严重。由于黄斑变薄，还会导致中央视觉模糊或降低。干性黄斑变性可能首先在一只或两只眼睛中发展，然后影响两只眼睛。视力丧失通常是中央性的，但仍保留在周边视觉中。 [0356] 糖尿病视网膜病变是一种影响眼睛的糖尿病并发症。它是由视网膜的血管损伤引起的。起初，糖尿病视网膜病变可能不会引起任何症状，或者只会引起轻微的视力问题。最终，它会导致失明。这种疾病可能发生在任何患有1型或2型糖尿病的人身上。DME是一种严重的眼部并发症，当微动脉瘤从血管壁突出，使液体和血液渗漏或渗出到视网膜，从而引起黄斑水肿时就会发生。 [0357] Stargadt病是一种导致儿童和年轻人视力丧失的眼病。这是一种遗传性疾病，因此会由其父母传给孩子。Stargardt病是黄斑变性的一种形式，且常被称为青少年黄斑变 性。 [0358] PVR是一种发展为孔源性视网膜脱离并发症的疾病。约8‑10％接受原发性视网膜脱离手术的患者会出现PVR，这会妨碍孔源性视网膜脱离的成功手术修复。PVR可以通过手 术重新附着脱落的视网膜进行治疗，但手术的视觉效果非常差。 [0359] 干眼病是一种常见疾病，当泪液不能为眼睛提供足够的润滑时就会发生。由于许多原因，泪液可能不足和不稳定。例如，如果你不能产生足够的泪液或如果你产生低质量的泪液，可能会出现干眼病。这种泪液不稳定会导致眼睛表面发炎和损伤。 [0360] 眼内炎是一种眼内炎症，其可能在眼部注射或手术后发生。体征通常为：视力模糊或其他视力变化、眼睛疼痛、眼睛发红、眼睛对光敏感或流泪。 [0361] 色素性视网膜炎(RP)是一组罕见的遗传性疾病，其涉及视网膜细胞的分解和丢失，视网膜是排列在眼睛后部的光敏组织。常见症状包括夜间视力困难和侧(外周)视力丧 失。 [0362] 青光眼是一组损伤视神经的眼部疾病，视神经的健康对良好的视力至关重要。这种损伤通常是由异常高的眼压引起的。青光眼是导致60岁以上人群失明的主要原因之一。 它可以发生在任何年龄，但更常见于老年人。许多类型的青光眼都没有警告信号。这种影响是渐进的，直到疾病发展到晚期，视力才会发生变化。 [0363] 葡萄膜炎是一种眼部炎症。它会影响眼壁或葡萄膜的中间组织层。葡萄膜炎的警告体征通常会突然出现，并迅速恶化。它们包括眼睛发红、疼痛和视力模糊。葡萄膜炎的可能原因是感染、损伤或自身免疫性或炎性疾病。葡萄膜炎可能很严重，会导致永久性视力丧失。 [0364] 本发明的化合物和药物组合物还可用于治疗和/或预防选自糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎的视网膜神经退行性疾病的方法。 [0365] 视网膜神经退行性疾病是指以进行性神经元丧失为特征的视网膜疾病。糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、青光眼和视网膜色素变性被认为是神经变性起重要作用 的视网膜疾病。 [0366] 根据该优选实施方案，本发明的化合物可与其他活性剂组合以增强待治疗病症的治疗功效，特别是与二肽基肽酶‑4抑制剂(DPPIV)或其药学上可接受的盐组合以用于局部 眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病。DPPIV抑制剂可选自西他列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力列汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、奥格列汀、其药学上可接受的盐及其混合物。 [0367] 本发明的化合物还可以有利地与抗VEGF治疗组合，以减少患者所需的眼内抗VEGF抗体注射的次数。对患有视网膜神经退行性疾病(例如糖尿病视网膜病、年龄相关性黄斑变性)的患者给药可减缓这些疾病的进展并减少患者所需的抗VEGF药物治疗。 [0368] 纤维化病症可包括例如但不限于囊性纤维化、腹膜后纤维化、特发性肺纤维化、肺纤维化合并肺气肿(CPFE)、嗜酸性血管中心性纤维化、肠纤维化、卵巢纤维化、肾病性系统性纤维化、口腔粘膜下纤维化(OSMF)和肝纤维化。 [0369] 囊性纤维化(CF)是一种遗传性病症，其会对肺、消化系统和身体其他器官造成严重损害。它会影响产生粘液、汗液和消化液的细胞。分泌物不是作为润滑剂，而是堵塞管道、导管和通道，尤其是在肺和胰腺中。 [0370] 肺纤维化是肺组织损伤和瘢痕化时发生的一种肺病。这种增厚、僵硬的组织使肺部更难正常工作。与肺纤维化相关的瘢痕化可由多种因素引起。肺纤维化引起的肺损伤无 法修复，但药物和治疗有时能帮助缓解症状并提高生活质量。 [0371] 肺气肿是一种导致气促的肺病。肺泡受损，随着时间的推移，肺泡内壁会变弱并破裂，形成更大的空气空间，而不是许多小的空气空间。这会减少肺的表面积，进而减少到达血流的氧气量。受损的肺泡无法正常工作，导致旧空气被截留，没有空间让新鲜、富氧空气进入。 [0372] 代谢和胃肠道病症可包括例如但不限于糖尿病诱导的并发症：糖尿病肾病(DN)、糖尿病视网膜病变(DR)、糖尿病心肌病(DCDM)或糖尿病足溃疡(DFU)。肝病可包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原发性胆汁性胆管炎(PBC)、肝纤维化或肝硬化(HF)、炎性肠病(IBD)：溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠纤维化。除糖尿病肾病外，其他肾病可包括多囊肾病(PKD)、慢性肾病(CKD)、肾源性系统性纤维化(NSF)和胰腺炎(急性和慢 性)。 [0373] 糖尿病肾病是1型糖尿病和2型糖尿病的严重肾脏相关并发症。也称糖尿病肾病。大约25％的糖尿病患者最终会患上肾病。糖尿病肾病会影响肾脏进行清除体内废物和多余 液体的日常工作的能力。多年后，该疾病会缓慢损伤肾脏脆弱的过滤系统，并可能发展为肾功能衰竭，也称为终末期肾病。肾功能衰竭是一种危及生命的疾病。 [0374] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是影响少量饮酒或不饮酒人群的一系列肝病的总称。顾名思义，NAFLD的主要特征是肝细胞中储存的脂肪过多。最常见的慢性肝病形式。一些NAFLD患者可发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，一种侵袭性脂肪肝病，其以肝脏炎症为特征，并可能发展为晚期瘢痕形成(肝硬化)和肝功能衰竭。这种伤害类似于大量饮酒造成的 伤害。 [0375] 原发性胆汁性胆管炎是一种肝脏胆管被缓慢破坏的慢性自身免疫性疾病。当胆管受损时，胆汁会回流到肝脏中，有时会导致不可逆的肝硬化。遗传和环境因素的结合会引发这种疾病。 [0376] IBD描述了涉及消化道慢性炎症的病症。IBD的类型包括溃疡性结肠炎(其涉及沿结肠和直肠表层的溃疡)，以及克罗恩病(其以消化道内层炎症为特征，通常可涉及消化道 深层)。溃疡性结肠炎和克罗恩病通常都以腹泻、直肠出血、腹痛、疲劳、体重减轻为特征，有时还会导致危及生命的并发症。 [0377] 肿瘤和癌症相关病症可以包括例如但不限于胰腺癌：主要是纤维化、肾细胞癌、辐射诱导的纤维化、原发性骨髓纤维化、结缔组织增生、纤维肉瘤、肝细胞癌、视网膜母细胞瘤、眼内淋巴瘤和黑色素瘤(结缔组织增生、结膜、葡萄膜)。 [0378] 本发明还涉及通过结合病毒蛋白硫酸乙酰肝素结合位点来治疗、预防和减少病毒感染。本发明的化合物与生长因子(FGF、VEGF和其他生长因子)和生长因子受体(FGFR、 VEGFR和其他)的硫酸乙酰肝素结合区相互作用。已知许多病毒利用其对结合于细胞膜的硫 酸乙酰肝素部分的亲和力与哺乳动物细胞相互作用。在其表面蛋白上携带硫酸乙酰肝素 (HS)结合结构域的病毒使用这种HS亲和力作为接近和感染细胞的主要入口之一，并与附着 在细胞上的硫酸乙酰肝素结合。当附着在HS时，病毒能够利用各种病毒特有的入侵机制感 染细胞。本发明的化合物与蛋白质特别是病毒蛋白质的乙酰肝素结合结构域的强相互作用 防止了存在于口、鼻粘膜和肺以及胃肠道中的血细胞、血管和器官内皮细胞以及表面上皮 细胞的病毒感染。已知几种病毒对硫酸乙酰肝素具有高亲和力，例如但不限于呼吸道合胞 病毒、人偏肺病毒、流感(H1N1等)、人鼻病毒(HRV)、鼻合胞病毒(RV)、基孔肯雅病毒、冠状病毒如CoV、SARS‑CoV、MERS‑Cov、COVID‑19(SARS‑CoV‑2及其变体)。HS是SARS‑CoV‑2感染的必要辅助因子。HS与邻近ACE2的SARSCoV‑2刺突糖蛋白的受体结合结构域相互作用，将刺突结构转变为开放构象以促进ACE2结合。病毒和细菌感染性疾病还可包括脓毒性休克、眼部炎 症，如手术或感染引起的眼内炎。 [0379] 实施例 [0380] 实施例1：化合物和中间体的合成 [0381] 实施例1.1：Ia型分子：单酰胺，25个实施例 [0382] [0383] 前体的合成 [0384] 方案1.合成中间体KI‑1和KI‑6 [0385] [0386] 步骤： [0387] KI‑1和KI‑6的合成(步骤[1]、[2]) [0388] 2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸二乙酯(KI‑0)(步骤[1])。在环境温度下，在15min内将碳酸钾‑325目(326.1g，2.4mol)分批加入到2,5‑二羟基对苯二甲酸二乙酯(200.0g，0.79mol)于DMF(800.0mL)中的搅拌溶液中。然后在30min内将苄基溴(280.0mL，2.4mol)以 滴加方式加入到反应烧瓶中，并将所得混合物在100℃下加热2h，形成浓稠的奶油色沉淀。 将反应混合物冷却至环境温度，并用氯化铵饱和水溶液(2L)处理。将所得悬浮液搅拌 30min，然后过滤。用氯化铵饱和水溶液(2×200mL)洗涤固体物质。然后将固体悬浮在乙醇 (400mL)中，过滤并在真空烘箱中干燥，得到所需产物，为白色固体(341.0g，0.785mol， 99.8％) [0389] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.36min，未观察到电离，峰面积>95％ [0390] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.51–7.44(m,6H),7.44–7.36(m,4H),7.36–7.28(m,2H),5.17(s,4H),4.29(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(t,J＝7.1Hz,6H)。 [0391] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1)和2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸(KI‑6)(步骤[2]) [0392] 将氢氧化钾(14.2g,0.25mol)于水(200.0mL)中的溶液迅速加入到2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸二乙酯(100g,0.23mol)于1,4‑二噁烷(1L)中的溶液中，并将所得混合物在 环境温度下搅拌过夜。真空除去溶剂，形成白色浆液。将粗产物悬浮在EtOH(500mL)中并过滤，将收集的固体在真空烘箱中干燥，得到纯的2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸二乙酯(23.0g， 0.053mol，23％) [0393] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.36min，未观察到电离，峰面积98％ [0394] 浓缩乙醇滤液，得到油。加入乙酸乙酯(500mL)形成沉淀，过滤并用乙酸乙酯(200mL)洗涤，得到2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸(KI‑6)，为白色固体(18.9g，0.042mol， 18％)。 [0395] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.22min，m/z 377.1[M–H]–，峰面积95％ [0396] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.52–7.45(m,4H),7.41–7.33(m,4H),7.33–7.26(m,4H),5.13(s,4H)。 [0397] 用碳酸钠饱和水溶液(200mL)、1M含水盐酸(500mL)和盐水(500mL)洗涤滤液，然后干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩至干燥，得到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1)，为白色固体(53g，0.130mol，57.0％)。 [0398] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.22min，m/z 405.3[M‑H]‑，峰面积96％ [0399] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.52–7.27(m,13H),5.17(s,4H),4.28(q,J＝7.1Hz,2H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0400] 用于合成KI‑1的大规模方案 [0401] 在10L夹套容器中装入2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸二乙酯(500.00g，1.15mol)、1,4‑二噁烷(2.5L)、氢氧化钾(71.00g，1.26mol)和水(500mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。LCMS分析显示反应已完成一半，还显示副产物(二酸)和原料(二酯)的比例(二酯:一元 酸:二酸＝28:58:14)。(二酸:4.44rt，一元酸:5.08rt，二酯:5.68rt)。在此阶段，真空除去溶剂。在10L夹套容器中，将粗产物加入乙醇:水的2:1混合物(3L)中，搅拌过夜并过滤，得到： [0402] 固体:(二酯:一元酸:二酸＝86:12:2，110.00g，无色固体) [0403] 滤液:(二酯:一元酸:二酸3:63:34) [0404] 真空浓缩滤液，得到油。将该油加入乙酸乙酯(2.5L)中，在10L夹套容器中搅拌过夜，并过滤，得到白色固体(150.00g)。 [0405] 固体:(二酯:一元酸:二酸＝微量:40:60)。 [0406] 收集滤液，用碳酸氢钠饱和水溶液(100mL)、1N盐酸溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并过滤。减压除去溶剂，得到所需产物2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1)，为白色固体，将其在真空烘箱中于50℃干燥48h(225.00g，49％收率)(收率在49‑65％之间变化)。 [0407] 方案2：合成中间体KI‑1Bn [0408] [0409] 步骤： [0410] KI‑1Bn的合成： [0411] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(苄氧基羰基)苯甲酸(KI‑1Bn)。在0℃在搅拌下，向2,5‑二羟基对苯二甲酸(1.97g，10mmol)于DMF(20mL)中的溶液中加入氢化钠(2.0g，50mmol)，然后在5min内滴加苄基溴(5.95mL，50mmol，5eq)，并将所得混合物保持在室温下2h。然后将混合物在60℃下加热18h。将反应混合物冷却至环境温度，并用MeOH(5mL)小心处理。减压浓缩混合物，残余物质与庚烷共蒸发(3x)。将残余物置于DCM(30mL)中，有机相用1M HCl(25mL)洗涤，分离的水层用DCM(3x30mL)萃取，合并的有机相干燥(MgSO4)并浓缩。粗固体用EtOH(～ 30mL)重结晶，得到纯KI‑0Bn(2.286g，41％)。将KI‑0Bn(282mg，0.5mmol)样品加入1,4‑二噁烷(10mL)和氢氧化锂水合物(22mg，0.52mmol)的混合物中，并将混合物加热至80℃持续3d。 将混合物冷却至室温，置于AcOEt(30mL)中，溶液用1M HCl(2mL)洗涤。干燥并浓缩有机相，残余物进行柱色谱分离，得到被约16％的二酯KI‑0Bn污染的单酯KI‑1Bn。 [0412] KI‑0Bn:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.51(s,2H),7.36–7.30(m,20H),5.34(s,4H),5.11(s,4H)。 [0413] KI‑1Bn:1H NMR(250MHz,CDCl3):δ7.86(s,1H),7.61(s,1H),7.41–7.30(m,20H),5.36(s,2H),5.26(s,2H),5.16(s,2H)。 [0414] 单酰胺的合成 [0415] 方案3.单酰胺Ia的合成 [0416] [0417] 酰胺偶联的通用步骤A[3A] [0418] 从KI‑1或KI‑6通过酰氯偶联 [0419] 模型反应(Ia‑013a) [0420] 2‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酰基氨基)间苯二甲酸二甲酯。将2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1，1.1g，2.8mmol)溶于亚硫酰氯(6mL)中，并将所得混合物搅拌5min。加入几滴DMF，将所得混合物在环境温度下搅拌18h。真空除去过量的亚硫酰氯，将残余物与甲苯(3×20mL)共蒸馏，得到酰氯。在环境温度下，将酰氯于DCM(10mL)中的溶液迅速加入胺(2‑氨基间苯二甲酸二甲酯，210mg，3.1mmol)和N,N‑二异丙基乙胺(0.53mL，3.045mmol)于DCM(10mL)中的溶液中，并将反应搅拌18h。用DCM(70mL)稀释反应，并用1M含水盐酸(100mL)、水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩得到粗产物，其通过硅胶色谱纯化，用乙酸乙酯(0至25％)于异己烷中梯度洗脱，得到所需产物，为白色固体 (1.24g,2.075mmol,75％)。 [0421] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.37min；m/z＝598.2[M+H]+，峰面积>95％ [0422] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.60(s,1H),8.02(d,J＝7.8Hz,2H),7.69(s,1H),7.59–7.23(m,12H),5.49(s,2H),5.19(s,2H),4.28(q,J＝7.1Hz,2H),3.71(s,6H),1.26(t, J＝7.1Hz,3H)。 [0423] 酰胺偶联的通用步骤B[3B] [0424] 从KI‑1或KI‑6使用缩合剂偶联 [0425] 模型反应(Ia‑001a) [0426] 2‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酰基氨基)苯甲酸甲酯。在环境温度下，将1‑甲基咪唑(13.0mL，163mmol)加入到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1，12.95g，32mmol)和邻氨基苯甲酸甲酯(5.729g，38mmol，1.190eq)于MeCN(150mL)中的混合物中。在30min内分批加入氯‑N,N,N’,N’‑四甲基氟代脲六氟磷酸盐(TCFH)(10.728g， 0.038mol)，并将所得混合物在环境温度下搅拌过夜。用1M含水盐酸(700mL)处理反应混合 物。将所得悬浮液搅拌10min，然后过滤。用水(2×200mL)洗涤固体物质。然后将固体悬浮在乙醇(200mL)中，过滤，用乙醚(100mL)洗涤，并在真空烘箱中干燥，得到所需产物，为白色固体(14.7g，27mmol，86％) [0427] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.43min；m/z＝540.2[M+H]+，峰面积>99％ [0428] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.87(s,1H),8.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.98(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.81–7.61(m,2H),7.59–7.12(m,12H),5.41(s,2H),5.20(s,2H),4.28(q,J＝ 7.1Hz,2H),3.74(s,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0429] 通用脱保护步骤[4]、[5] [0430] 皂化 [0431] 模型反应(Ia‑013a) [0432] 2‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑羧基苯甲酰基氨基)间苯二甲酸。将氢氧化锂(42mg，1mmol)于水(4mL)中的溶液加入到2‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酰基氨基)间苯二甲酸二甲酯(100mg，0.167mmol)于THF(6mL)中的溶液中，并将所得混合物在环境温度 下搅拌18h。将另外的LiOH(6eq)于水(4mL)中加入到反应混合物中，再搅拌23h。完成后，将水(50mL)加入到反应中，混合物用乙酸乙酯(50mL)洗涤。水层用1M含水盐酸酸化至pH＝2，并用乙酸乙酯(2X50mL)萃取。收集有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，得到标题化合物，为白色固体(82mg，0.151mmol，91％)。 [0433] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.02min；m/z＝542.1[M+H]+，峰面积>95％ [0434] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.18(s,2H),11.74(s,1H),8.00(d,J＝7.8Hz,2H),7.71(s,1H),7.58–7.43(m,5H),7.40–7.24(m,7H),5.47(s,2H),5.14(s,2H)。 [0435] 脱苄基作用 [0436] 模型反应(Ia‑013a) [0437] 2‑(2,5‑二羟基‑4‑羧基苯甲酰基氨基)间苯二甲酸(Ia‑013a)。将Pd/C(94mg，10％)加入到2‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑羧基苯甲酰基氨基)间苯二甲酸(0.94g，1.74mmol)于EtOH和DCM的10:30混合物中的溶液中。将混合物在大气压和环境温度下置于氢气下，并搅 拌18h。完成后，将混合物通过硅藻土过滤，并用DCM和MeOH洗涤。合并滤液和洗涤液，减压浓缩，得到所需产物Ia‑013a，为黄色固体(644mg，1.69mmol，98％)。 [0438] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.91min；m/z＝362.0[M+H]+，峰面积>98％ [0439] 1H NMR(DMSO‑d6)δ:13.11(s,2H),11.70(s,1H),11.13(s,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,2H),7.47(s,1H),7.41(s,1H),7.38(t,J＝7.7Hz,1H) [0440] 方案4a.从KI‑1Bn合成单酰胺Ia [0441] [0442] 从KI‑1Bn的通用步骤 [0443] 通过酰氯偶联 [0444] 模型反应：Ia‑032a的合成 [0445] 4‑(2,5‑双(苄氧基)‑4‑(苄氧基羰基)苯甲酰基氨基)苯乙酸苄酯。向KI‑1Bn(233mg，84％纯度)于DCM(10mL)中的溶液中加入SOCl2(1.8mL，60eq)，并将混合物在50℃下加热3h。蒸发溶剂，残余物与甲苯(3x10mL)共蒸发，得到粗酰氯(237mg，99％)。将该物质溶于DCM(3mL)中，并加入二异丙基乙胺(0.08mL，1.15eq)，然后加入4‑氨基苯乙酸苄酯(92mg， 0.95eq)于DCM(3mL)中的溶液。最终反应体积为10mL。将反应混合物在室温下搅拌18h。混合物用DCM(15mL)稀释，用氯化铵饱和水溶液(12mL)洗涤。分离的水相用DCM(2x2mL)萃取，合并有机相，干燥(MgSO4)，并浓缩。将粗产物进行柱色谱(Pet.Et./DCM 1:1，然后梯度至 100％DCM)，得到纯KI‑0Bn的第一级分和含纯的所需产物的第二级分(237mg，86％，校正了KI‑1Bn的纯度)。 [0446] 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.10(s,1H),8.08(s,1H),7.65(s,1H),7.53‑7.30(m,20H),7.22–7.13(br AB,4H),5.39,5.22,5.21,5.12(4s,4x 2H),3.61(s,2H)。 [0447] 4‑(4‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸(Ia‑032a)。向上述制备的前体(225mg，0.33mmol)于DCM(20mL)中的溶液中加入5％Pd/炭(72mg)，然后加入EtOH(20mL)。用Ar(3x)冲洗烧瓶，然后充入氢气(大气压)，混合物在室温下搅拌2h。用微孔过滤器过滤除去催化剂，蒸发滤液，干燥残余物，得到产物Ia‑032a，为浅黄色固体(107mg，99％)。 [0448] 1H NMR(250MHz,DMSO‑d6):δ12.28(br,1H),10.92(s,1H),10.44(s,1H),7.65(br d,2H),7.41(s,1H),7.38(s,1H),7.25(br d,2H),3.55(s,2H)。 [0449] 例如： [0450] [0451] [0452] 条件和收率：参见图4A‑D [0453] 1)4‑(2‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑001a [0454] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝0.95min，m/z＝316[M‑H]‑，峰面积>97％ [0455] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.22(s,1H),10.85(s,1H),8.65(d,J＝8.4Hz,1H),8.01(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.71–7.56(m,1H),7.41(d,J＝6.9Hz,2H),7.22(t,J＝7.6Hz, 1H)。 [0456] HRMS:[M+H]+,C15H12NO7计算值:318.06083,实际值:318.06080。 [0457] 生物数据:Ia‑001a:FGF‑1 IC50[μM]＝41；FGF‑2 IC50[μM]＝39；VEGF‑A1 IC50[μM]＝7.3；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.25；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝48；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.355；中性粒细胞粘附抑制[％]＝44.3；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝30.5；IL‑1βIC50[μM]＝34.4；IL‑2 IC50[μM]＝94.3；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝1.24；IL‑9 IC50[μM]＝5.63；IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝1.5；IL‑13 IC50[μM]＝26.4；IL‑17A IC50[μM]＝0.1；IL‑ 17F IC50[μM]＝14.7；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑33 IC50[μM]＝ 19.3；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.02；TNFβIC50[μM]＝13.2 [0458] 二乙酯： [0459] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.39min，m/z＝372.2[M‑H]‑，峰面积>98％ [0460] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.96(s,1H),11.05(s,1H),9.87(s,1H),8.57(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.99(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.65(ddd,J＝8.7,7.3,1.7Hz,1H),7.49(s, 1H),7.40(s,1H),7.25(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),4.35(m,4H),1.33(m,6H)。 [0461] HRMS:[M+H]+,C19H20NO7的计算值:374.12342,实际值:374.12354 [0462] 生物数据:Ia‑001a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝9.2；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝123；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.25；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝51.47；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.58；中性粒细胞粘附抑制[％]＝50.5 [0463] 2)4‑(2‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑001aTz： [0464] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.17min；m/z＝342.0[M+H]+，峰面积>96％ [0465] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.60(s,1H),10.90(s,2H),8.47(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝7.9Hz,1H),7.61(t,J＝7.9Hz,1H),7.50–7.32(m,3H)。 [0466] HRMS:[M+H]+,C15H12N5O5的计算值:342.08329,实际值:342.08318 [0467] 生物数据:Ia‑001a‑Tz:FGF‑1 IC50[μM]＝6.2；FGF‑2 IC50[μM]＝20；VEGF‑A1 IC50[μM]＝17；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.23；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝54.33；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.54；中性粒细胞粘附抑制[％]＝69.75；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝>100；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝7.99；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.75；IL‑9 IC50[μM]＝8.63；IL‑10 IC50[μM]＝26.1；IL‑12p70 IC50[μM]＝32.4；IL‑13 IC50[μM]＝32.1；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.11；IL‑17F IC50[μM]＝46.5；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑33 IC50[μM]＝23.6；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.63；TNFβIC50[μM]＝53[0468] 乙酯： [0469] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.08min，m/z＝370.1[M+H]+，峰面积>97％ [0470] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.48(s,1H),9.88(s,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.6,7.4,1.6Hz,1H),7.47(s,1H),7.42–7.34(m,2H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0471] HRMS:[M+H]+,C17H16N5O5的计算值:370.11460,实际值:370.11458 [0472] 生物数据:Ia‑001a‑Tz‑E1:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝3.8；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝75.97；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝98.88 [0473] 二乙酸乙酯: [0474] UPLC‑MS(酸性法，4min):r.t＝1.57min，m/z＝454.1[M+H]+，峰面积>97％ [0475] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.23(s,1H),8.23(d,J＝8.6Hz,1H),7.96(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.84(s,1H),7.73(s,1H),7.64(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(td,J＝7.6,1.2Hz,1H), 4.32(q,J＝7.1Hz,2H),2.34(s,3H),2.18(s,3H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0476] HRMS:[M+H]+,C21H20N5O7的计算值:454.13572，实际值:454.13542 [0477] 生物数据:Ia‑001a‑Tz‑E1‑A2:FGF‑1 IC50[μM]＝60；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝49.85；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝98.2 [0478] 3)2,5‑二羟基‑4‑(2‑磺基苯基氨基羰基)苯甲酸，化合物Ia‑001c： [0479] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.73min；m/z＝352.0[M‑H]‑，峰面积>99％ [0480] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.54(s,1H),10.99(s,1H),8.34(d,J＝8.2Hz,1H),7.74(dd,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.42–7.28(m,3H),7.12(td,J＝7.5,1.2Hz,1H)。 [0481] HRMS:[M+H]+,C14H12NO8S的计算值:354.02781,实际值:354.02754。 [0482] 生物数据:Ia‑001c:FGF‑1 IC50[μM]＝21；FGF‑2 IC50[μM]＝13；VEGF‑A1 IC50[μM]＝100；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝3.31；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝40.36；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.4；中性粒细胞粘附抑制[％]＝31.33；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝0.44；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝12.8；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.95；IL‑9 IC50[μM]＝46.9；IL‑10 IC50[μM]＝1.9；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.44；IL‑13 IC50[μM]＝86.1；IL‑17A IC50[μM]＝0.09； IL‑17F IC50[μM]＝89.7；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑33 IC50[μM]＝>100；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.05；TNFβIC50[μM]＝29.7 [0483] 4)4‑(3‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑002a： [0484] 1H‑NMR(250MHZ,DMSO‑d6)δ～13(v br,1H),10.82(br s,1H),10.60(br s,1H),8.38(s,1H).7.92(d,1H),7.71(d,1H),7.49(t,1H),7.39(s,2H) [0485] 生物数据:1a‑002a:FGF‑1 IC50[μM]＝20；FGF‑2 IC50[μM]＝59；VEGF‑A1 IC50[μM]＝71；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝5.7；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝42.1；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.312；中性粒细胞粘附抑制[％]＝27.92 [0486] 5)4‑(3‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑002aTz： [0487] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.13min；m/z＝342.0[M+H]+，峰面积>99％ [0488] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.81(s,1H),10.67(s,1H),8.54(s,1H),7.91–7.84(m,1H),7.79(dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.60(t,J＝7.9Hz,1H),7.41(d,J＝2.2Hz,2H)。 [0489] HRMS:[M+H]+,C15H12N5O5的计算值:342.08329,实际值:342.08317 [0490] 生物数据:Ia‑002a‑Tz:FGF‑1 IC50[μM]＝10；FGF‑2 IC50[μM]＝53；VEGF‑A1 IC50[μM]＝57；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝66.61；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.86；中性粒细胞粘附抑制[％]＝38.5 [0491] 6)2,5‑二羟基‑4‑(3‑磺基苯基氨基羰基)苯甲酸，化合物Ia‑002c： [0492] 1H‑NMR(250MHZ,DMSO‑d6)δ11.04(s,1H),10.53(s,1H),7.96(s,1H),7.69(d,1H),7.43(s,2H)和7.40‑7.28(m,2H) [0493] 生物数据:Ia‑002c:FGF‑1 IC50[μM]＝14；FGF‑2 IC50[μM]＝150；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝38.9；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.405；中性粒细胞粘附抑制[％]＝1.87 [0494] 7)4‑(4‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑003a： [0495] 1H‑NMR(250MHz,DMSO‑d6)δ12.8(br,1H),10.73(s,1H),10.68(s,1H),7.94(d of AB,2H),7.84(d of AB,2H),7.39(s,1H),7.34(s,1H) [0496] HRMS(AX033) [0497] 生物数据:Ia‑003a:FGF‑1 IC50[μM]＝12；FGF‑2 IC50[μM]＝34；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝44.4；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.414；中性粒细胞粘附抑制[％]＝39.1 [0498] 8)4‑(4‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑003aTz: [0499] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.79min；m/z＝342.0[M+H]+，峰面积>97％ [0500] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.77(s,1H),10.70(s,1H),8.04(d,J＝8.7Hz,2H),7.96(d,J＝8.5Hz,2H),7.41(s,1H),7.37(s,1H)。 [0501] HRMS:[M+H]+,C15H12N5O5的计算值:342.08329,实际值:342.08326 [0502] 生物数据:Ia‑003a‑Tz:FGF‑1 IC50[μM]＝6.7；FGF‑2 IC50[μM]＝45；VEGF‑A1 IC50[μM]＝13；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝6.4；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝62.21；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.49；中性粒细胞粘附抑制[％]＝30.33；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝2.95；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝43；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝1.41；IL‑9 IC50[μM]＝3.62；IL‑10 IC50[μM]＝6.94；IL‑12p70 IC50[μM]＝1.26；IL‑13 IC50[μM]＝89.6；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.07；IL‑17F IC50[μM]＝83.9；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝1.49；IL‑33 IC50[μM]＝72.2；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.18；TNFβIC50[μM]＝55。 [0503] 9)2,5‑二羟基‑4‑(4‑磺基苯基氨基羰基)苯甲酸，化合物Ia‑003c: [0504] 1H‑NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.90(s,1H),10.51(s,1H),7.66(AB的d,2H),7.58(AB的d,2H),7.40(s,1H),7.39(S,1H) [0505] 生物数据:Ia‑003c:FGF‑1 IC50[μM]＝35；FGF‑2 IC50[μM]＝150；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.4；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝N.D.；PMN ROS抑制IC50[μM]‑；中性粒细胞粘附抑制[％]＝N.D. [0506] 10)4‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑004a: [0507] UPLC‑MS(酸性法，6.5min):rt＝1.40min；m/z＝332.0[M‑H]‑，峰面积>96％ [0508] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.94(s,1H),10.37(s,1H),8.20(d,J＝2.7Hz,1H),7.74(dd,J＝8.9,2.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.34(s,1H),6.93(d,J＝8.9Hz,1H)。 [0509] HRMS:[M+H]+,C15H12NO8的计算值:334.05574,实际值:334.05572 [0510] 生物数据:Ia‑004a:FGF‑1 IC50[μM]＝32；FGF‑2 IC50[μM]＝15；VEGF‑A1 IC50[μM]＝28；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝7.7；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝64.61；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0；中性粒细胞粘附抑制[％]＝28.38 [0511] 乙基甲基酯: [0512] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.16min，m/z＝376.1[M+H]+，峰面积>95％ [0513] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.90(s,1H),10.50(s,1H),10.36(s,1H),9.91(s,1H),8.26(d,J＝2.7Hz,1H),7.76(dd,J＝8.9,2.8Hz,1H),7.43(s,1H),7.36(s,1H),7.01 (d,J＝8.9Hz,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),3.91(s,3H),1.34(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0514] HRMS:[M+H]+,C18H18NO8的计算值:376.10269,实际值:376.10259 [0515] 生物数据:Ia‑004a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝35；FGF‑2 IC50[μM]＝36；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝6.1；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝85.34；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝97.65 [0516] 11)4‑(2‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑006a: [0517] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.81min；m/z＝334.0[M+H]+，峰面积>96％ [0518] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.33(s,1H),11.86(s,1H),10.90(s,1H),9.66(s,1H),8.39(d,J＝9.0Hz,1H),7.40(d,J＝6.8Hz,2H),7.03(dd,J＝9.0,3.0Hz,1H)。 [0519] HRMS:[M+H]+,C15H12NO8的计算值:334.05574,实际值:334.05562。 [0520] 生物数据:Ia‑006a:FGF‑1 IC50[μM]＝89；FGF‑2 IC50[μM]＝224；VEGF‑A1 IC50[μM]＝100；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝11.8；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝60.56；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.2；中性粒细胞粘附抑制[％]＝25.33 [0521] 12)3‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)邻苯二甲酸，化合物Ia‑011a: [0522] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.69min；m/z＝360.1[M‑H]‑，峰面积>89％ [0523] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.46(s,2H),11.37(s,1H),10.97(s,1H),8.33(dd,J＝8.2,1.3Hz,1H),7.63(dd,J＝7.7,1.3Hz,1H),7.57(t,J＝7.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.44(s, 1H)。 [0524] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05065,实际值:362.05036 [0525] 生物数据:Ia‑011a:FGF‑1 IC50[μM]＝35；FGF‑2 IC50[μM]＝110；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝57.71；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝42.32 [0526] 13)2‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)对苯二甲酸，化合物Ia‑012a: [0527] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.12min；m/z＝362.1[M+H]+，峰面积>96％ [0528] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.41(brs,2H),12.29(s,1H),10.94(s,1H),9.26(d,J＝1.7Hz,1H),8.09(d,J＝8.2Hz,1H),7.73(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.42(s,2H)。 [0529] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05065,实际值:362.05046。 [0530] 生物数据:Ia‑012a:FGF‑1 IC50[μM]＝38；FGF‑2 IC50[μM]＝36；VEGF‑A1 IC50[μM]＝30；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝59.52；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.85；中性粒细胞粘附抑制[％]＝28.5 [0531] 14)2‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物Ia‑013a: [0532] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.91min；m/z＝362.0[M+H]+，峰面积>98％ [0533] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.11(s,2H),11.70(s,1H),11.13(s,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,2H),7.47(s,1H),7.41(s,1H),7.38(t,J＝7.7Hz,1H) [0534] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05065,实际值:362.05041 [0535] 生物数据:Ia‑013a:FGF‑1 IC50[μM]＝29；FGF‑2 IC50[μM]＝18；VEGF‑A1 IC50[μM]＝17；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝38.52；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.38；中性粒细胞粘附抑制[％]＝27.67 [0536] 15)4‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)邻苯二甲酸，化合物Ia‑014a: [0537] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.98min；m/z＝362.1[M+H]+，峰面积>94％ [0538] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.76(s,1H),10.70(s,1H),8.14(s,1H),7.94–7.84(m,2H),7.38(s,1H),7.30(s,1H)。 [0539] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05065,实际值:362.05047 [0540] 生物数据:Ia‑014a:FGF‑1 IC50[μM]＝20；FGF‑2 IC50[μM]＝20；VEGF‑A1 IC50[μM]＝88；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝61.3；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1；中性粒细胞粘附抑制[％]＝9.667 [0541] 16)5‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物Ia‑015a: [0542] 1H NMR(250MHz,DMSO‑d6)δ10.74(s,1H),8.56(窄d,2H),8.22(窄t,1H),7.41(s,1H)和7.37(s,1H) [0543] 生物数据:Ia‑015a:FGF‑1 IC50[μM]＝20；FGF‑2 IC50[μM]＝9.3；VEGF‑A1 IC50[μM]＝19；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.15；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝43.8；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.387；中性粒细胞粘附抑制[％]＝17.38；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝2.76；IFNγIC50[μM]＝>100；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝7.08；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.77；IL‑9 IC50[μM]＝1.47；IL‑10 IC50[μM]＝5.27；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.12；IL‑13 IC50[μM]＝0.15；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.05；IL‑17F IC50[μM]＝0.15；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝57.2；IL‑33 IC50[μM]＝0.24；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.17；TNFβIC50[μM]＝0.3。 [0544] 17)3‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)异烟酸，化合物Ia‑023a: [0545] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.63min；m/z＝319.1[M+H]+，峰面积>93％ [0546] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.17(s,1H),11.03(s,1H),9.78(s,1H),8.46(d,J＝5.0Hz,1H),7.82(d,J＝5.0Hz,1H),7.45(s,1H),7.43(s,1H)。 [0547] HRMS:[M+H]+,C14H11N2O7的计算值:319.05608,实际值:319.05610 [0548] 生物数据:Ia‑023a:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝63；VEGF‑A1 IC50[μM]＝143；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝61.95；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0；中性粒细胞粘附抑制[％]＝13.37 [0549] 二乙酯: [0550] UPLC‑MS(酸性法，4min):r.t＝1.87min，m/z＝375.1[M+H]+，峰面积>98％ [0551] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.79(s,1H),11.23(s,1H),9.87(s,1H),9.68(s,1H),8.50(d,J＝5.0Hz,1H),7.81(dd,J＝5.1,0.7Hz,1H),7.53(s,1H),7.41(s,1H),4.46–4.27 (m,4H),1.41–1.25(m,6H)。 [0552] HRMS:[M+H]+,C18H19N2O7的计算值:375.11867,实际值:375.11867 [0553] 生物数据:Ia‑023a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝76；VEGF‑A1 IC50[μM]＝141；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝6.6；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝69.47；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0；中性粒细胞粘附抑制[％]＝34 [0554] 18)4‑(4‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑032a: [0555] 1H NMR(250MHz,DMSO‑d6):δ12.28(br,1H),10.92(s,1H),10.44(s,1H),7.65(br d,2H),7.41(s,1H),7.38(s,1H),7.25(br d,2H),3.55(s,2H)。 [0556] 生物数据:Ia‑032a:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝91；VEGF‑A1 IC50[μM]＝N.D.；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝N.D.；PMN ROS抑制IC50[μM]‑；中性粒细胞粘附抑制[％]＝N.D. [0557] 19)4‑(3‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑033a: [0558] UPLC‑MS(酸性法，6.5min):rt＝1.71min；m/z＝332.1[M+H]+，峰面积>99％ [0559] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.89(s,1H),10.46(s,1H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,1H),7.40(s,1H),7.38(s,1H),7.03(d,J＝7.6Hz,1H),3.57(s,2H)。 [0560] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07647,实际值:332.07644 [0561] 生物数据:Ia‑033a:FGF‑1 IC50[μM]＝60；FGF‑2 IC50[μM]＝165；VEGF‑A1 IC50[μM]＝281；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝57.73；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.32；中性粒细胞粘附抑制[％]＝38 [0562] 20)4‑(2‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑034a: [0563] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.82min；m/z＝332.1[M+H]+，峰面积>98％ [0564] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.78(d,J＝8.1Hz,1H),7.31(d,J＝3.0Hz,2H),7.28(d,J＝7.6Hz,2H),7.15(t,J＝7.4Hz,1H),3.63(s,2H)。 [0565] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07641 [0566] 生物数据:Ia‑034a:FGF‑1 IC50[μM]＝79；FGF‑2 IC50[μM]＝14；VEGF‑A1 IC50[μM]＝102；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝49.07；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.28；中性粒细胞粘附抑制[％]＝15 [0567] 21)4‑(3,4‑二羟基苯基甲基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑035a: [0568] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.02min；m/z＝320.1[M+H]+，峰面积>91％ [0569] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.56(s,1H),9.21(t,J＝5.9Hz,1H),8.91(s,1H),8.79(s,1H),7.46(s,1H),7.28(s,1H),6.72(d,J＝2.1Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,1H),6.57(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),4.32(d,J＝5.8Hz,2H)。 [0570] HRMS:[M+H]+,C15H14NO7的计算值:320.07648,实际值:320.07650 [0571] 生物数据:Ia‑035a:FGF‑1 IC50[μM]＝20；FGF‑2 IC50[μM]＝71；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝36；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝75.13；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.41；中性粒细胞粘附抑制[％]＝27 [0572] 22)4‑(2‑(3,4‑二羟基苯基)乙基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑035a‑2: [0573] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.77min；m/z＝332.0[M‑H]‑，峰面积>99％ [0574] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.50(s,1H),8.85(t,J＝5.6Hz,1H),8.76(s,1H),8.66(s,1H),7.41(s,1H),7.28(s,1H),6.67–6.60(m,2H),6.48(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),3.44(q,J＝6.8Hz,2H),2.67(dd,J＝8.6,6.0Hz,2H).δ11.56(s,1H),9.21(t,J＝5.9Hz,1H),8.91 (s,1H),8.79(s,1H),7.46(s,1H),7.28(s,1H),6.72(d,J＝2.1Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz, 1H),6.57(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),4.32(d,J＝5.8Hz,2H)。 [0575] HRMS:[M+H]+,C16H16NO7的计算值:334.09213,实际值:334.09242 [0576] 生物数据:Ia‑035a‑2:FGF‑1 IC50[μM]＝10；FGF‑2 IC50[μM]＝65；VEGF‑A1 IC50[μM]＝109；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝10；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝58.81；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.1；中性粒细胞粘附抑制[％]＝21.5 [0577] 23)4‑(1‑羧基‑2‑(3,4‑二羟基苯基)乙基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑035a‑3: [0578] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.70min；m/z＝376.0[M‑H]‑，峰面积>99％ [0579] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.90(s,1H),11.11(s,1H),8.98(d,J＝7.4Hz,1H),8.73(d,J＝13.1Hz,2H),7.45(s,1H),7.31(s,1H),6.61(dd,J＝5.1,2.9Hz,2H),6.47(dd,J ＝8.1,2.1Hz,1H),3.01(dd,J＝13.9,4.9Hz,1H),2.96–2.84(m,1H)。 [0580] HRMS:[M+H]+,C17H16NO9的计算值:378.08196,实际值:378.08195 [0581] 生物数据:Ia‑035a‑3:FGF‑1 IC50[μM]＝34；FGF‑2 IC50[μM]＝207；VEGF‑A1 IC50[μM]＝198；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝10；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝79.62；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.66；中性粒细胞粘附抑制[％]＝22 [0582] 24)4‑(羧基(3,4‑二羟基苯基)甲基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑036a: [0583] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.62min；m/z＝362.1[M‑H]‑，峰面积>92％ [0584] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.00(s,1H),9.32(d,J＝6.7Hz,1H),9.05(s,1H),8.97(s,1H),7.40(s,1H),7.34(s,1H),6.81(d,J＝2.1Hz,1H),6.75–6.64(m,2H),5.29(d,J＝6.6Hz,1H)。 [0585] HRMS:[M+H]+,C16H14NO9的计算值:364.06630,实际值:364.06615 [0586] 生物数据:Ia‑036a:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝37；VEGF‑A1 IC50[μM]＝123；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.6；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝87.17；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝30.77 [0587] 25)4‑(2‑羧基苯基甲基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑053a: [0588] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.08min；m/z＝332.0[M+H]+，峰面积>97％ [0589] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.09(s,1H),11.19(s,1H),9.34–9.27(m,1H),7.91(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.55(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.46(d,J＝7.9Hz,2H),7.39(td,J＝ 7.5,1.4Hz,1H),7.32(s,1H),4.82(d,J＝5.9Hz,2H)。 [0590] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07622 [0591] 生物数据:Ia‑053a:FGF‑1 IC50[μM]＝150；FGF‑2 IC50[μM]＝124；VEGF‑A1 IC50[μM]＝210；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝52.92；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.5；中性粒细胞粘附抑制[％]＝18.67 [0592] 方案4b.4‑氨基‑2,5‑二苄氧基苯甲酸乙酯(苯胺A)的合成 [0593] [0594] 方案：苯胺A的合成 [0595] 4‑氨基‑2,5‑二苄氧基苯甲酸乙酯(苯胺A)。在惰性气氛(N2)下，向2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1)(2.0g，4.9mmol)和Et3N(1.6mL，11.3mmol)于THF(25mL)中的冷却溶液(冰浴)中缓慢加入DPPA(1.1mL，5.2mmol)。将混合物缓慢加热至r.t，并在此温度下搅拌3h。然后加入水(8mL)，并将反应混合物加热至70℃2h。将反应混合物倒入碳酸氢钠饱和溶液(250mL)中并搅拌5min，然后用EtOAc(3x100mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到无色油。残余物通过快速柱色谱(异己烷/EtOAc 1:0，然后梯度至30％EtOAc)纯化，得到标题化合物苯胺A，为灰白色固体(1.0g，53％)。 [0596] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.26min；m/z＝378.2[M+H]+，峰面积94％ [0597] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.54–7.46(m,4H),7.44–7.36(m,4H),7.35–7.25(m,3H),6.46(s,1H),5.65(s,NH2),5.06(s,2H),5.02(s,2H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),1.22(t,J ＝7.1Hz,3H)。 [0598] 26)4‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ia‑056a: [0599] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.90min；m/z＝348.0[M‑H]‑，峰面积97％ [0600] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.28(brs,1H),11.26(s,1H),9.97(s,1H),8.09(s,1H),7.48(s,1H),7.42(s,1H),7.26(s,1H)。 [0601] 二乙酯: [0602] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.86min；m/z＝404.2[M‑H]‑，峰面积92％ [0603] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.48(brs,1H),11.32(brs,1H),10.28(s,1H),10.07(brs,1H),9.88(s,1H),8.12(s,1H),7.58(s,1H),7.39(s,1H),7.28(s,1H),4.46–4.27(m, 4H),1.46–1.12(m,6H)。 [0604] 实施例1.2‑Ib型分子：来自二胺的二酰胺，1个实施例 [0605] [0606] 方案5.Ib型二酰胺的合成 [0607] [0608] 合成步骤：参见通用步骤，步骤[3]、[4]、[5] [0609] 实施例： [0610] [0611] 条件和收率：参见图4A‑D [0612] 27)3,5‑双(2,5‑二羟基‑4‑羧基苯甲酰基氨基)苯甲酸，化合物Ib‑010a: [0613] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.98min；m/z＝511.0[M‑H]‑，峰面积>93％ [0614] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.81(s,2H),10.65(s,2H),8.38(d,J＝2.0Hz,1H),8.12(d,J＝2.0Hz,2H),7.39(d,J＝2.3Hz,4H)。 [0615] HRMS:[M+H]+,C23H17N2O12的计算值:513.07760,实际值:513.07736, [0616] 生物数据:Ib‑010a:FGF‑1 IC50[μM]＝14；FGF‑2 IC50[μM]＝3.8；VEGF‑A1 IC50[μM]＝15；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.6；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝71.84；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.06；中性粒细胞粘附抑制[％]＝1.5；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝2.22；IL‑1βIC50[μM]＝33.3；IL‑2 IC50[μM]＝2.74；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝1.02；IL‑9 IC50[μM]＝11.58；IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.27；IL‑13 IC50[μM]＝>100；IL‑17A IC50[μM]＝0.42； IL‑17F IC50[μM]＝>100；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝67.8；IL‑33 IC50[μM]＝31.3；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.31；TNFβIC50[μM]＝49.3 [0617] 三乙酯： [0618] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.29min，m/z＝597.1[M+H]+，峰面积>96％ [0619] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.80(s,2H),10.68(s,2H),9.95(s,2H),8.40(t,J＝2.0Hz,1H),8.15(d,J＝2.0Hz,2H),7.42(s,2H),7.39(s,2H),4.42–4.33(m,6H),1.38–1.33(m,9H)。 [0620] HRMS:[M+H]+,C29H29N2O12的计算值:597.17150,found:597.17131 [0621] 生物数据:Ib‑010a‑E3:FGF‑1 IC50[μM]＝26；FGF‑2 IC50[μM]＝226；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.09；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝36.41；PMN ROS抑制IC50[μM]＝6.52；中性粒细胞粘附抑制[％]＝79.5；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝2.79；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝36.2；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.24；IL‑9 IC50[μM]＝26.8； IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.84；IL‑13 IC50[μM]＝33；IL‑17A IC50[μM]＝0.52；IL‑17F IC50[μM]＝34.2；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑ 33 IC50[μM]＝20；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.98；TNFβIC50[μM]＝38.2。 [0622] 四乙酸三乙酯： [0623] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.19min，m/z＝782.1[M+NH4]+，峰面积91％ [0624] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.84(s,2H),8.40(m,1H),8.08(d,J＝2.0Hz,2H),7.80(s,2H),7.63(s,2H),4.45–4.22(m,6H),2.32(s,6H),2.23(s,6H),1.38–1.27(m,9H)。 [0625] 生物数据:Ib‑010a‑E3‑A4:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.54；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝54.86；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.49；中性粒细胞粘附抑制[％]＝96 [0626] 实施例1.3.Ic型分子：来自二酸的二酰胺，4个实施例 [0627] [0628] 方案6.R＝R’的Ic型酰胺的合成 [0629] [0630] 步骤：参见KI‑6的通用步骤[3]、[4]、[5] [0631] 实施例： [0632] [0633] 条件和收率：参见图4A‑D [0634] 28)N1,N4‑双(2‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基)‑2,5‑二羟基对苯二甲酰胺，化合物Ic‑001aTz2: [0635] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.97min；m/z＝485.1[M+H]+，峰面积>97％ [0636] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.53(s,1H),10.98(s,1H),8.49(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),7.90(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.58(s,1H),7.37 (td,J＝7.6,1.2Hz,1H)。 [0637] HRMS:[M+H]+,C22H17N10O4的计算值:485.14287,实际值:485.17274 [0638] 生物数据:Ic‑001aTz2:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝70；VEGF‑A1 IC50[μM]＝45；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.2；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝60.64；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝97.15；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝1.38；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝9.45；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.52；IL‑9 IC50[μM]＝9.13；IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝29.1；IL‑13 IC50[μM]＝0.12；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.31；IL‑17F IC50[μM]＝0.15；IL‑18 IC50[μM]＝33.9；IL‑21 IC50[μM]＝32；IL‑33 IC50[μM]＝0.23；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.1；TNFβIC50[μM]＝0.41。 [0639] 29)5‑(4‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸，化合物Ic‑007a: [0640] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.80min；m/z＝469.1[M+H]+，峰面积>91％ [0641] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.08(s,2H),7.65(s,2H),7.59(s,2H),7.30–6.89(m,5H),6.79(d,J＝8.8Hz,2H)。 [0642] 13C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ172.1,165.2,158.3,150.1,130.2,129.2(CH),122.8,122.6(CH),117.7(CH),117.3(CH),113.3。 [0643] HRMS:[M+H]+,C22H17N2O10的计算值:469.08777,实际值:469.08739 [0644] 生物数据:Ic‑007a:FGF‑1 IC50[μM]＝13；FGF‑2 IC50[μM]＝5.4；VEGF‑A1 IC50[μM]＝3.2；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.09；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝57.99；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.7；中性粒细胞粘附抑制[％]＝57.5；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝1.44；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝>100；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.09；IL‑9 IC50[μM]＝27.1；IL‑10 IC50[μM]＝12.5；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.49；IL‑13 IC50[μM]＝30.1；IL‑17A IC50[μM]＝0.04； IL‑17F IC50[μM]＝22.9；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝1.9；IL‑33 IC50[μM]＝18.4；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.27；TNFβIC50[μM]＝6.52 [0645] 二甲酯： [0646] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.13min，m/z＝497.0[M+H]+，峰面积>95％ [0647] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.08(s,2H),10.48(s,2H),10.38(s,2H),8.27(d,J＝2.8Hz,2H),7.89–7.74(m,2H),7.56(s,2H),7.03(d,J＝8.9Hz,2H),3.93(s,6H)。 [0648] HRMS:[M+H]+,C24H21N2O10的计算值:497.11907,实际值:497.11874。 [0649] 生物数据:Ic‑007a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝23；FGF‑2 IC50[μM]＝49；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.25；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝21.33；PMN ROS抑制IC50[μM]＝7.9；中性粒细胞粘附抑制[％]＝2 [0650] 替代的，Ic‑007a的大规模合成 [0651] a)5‑(4‑(3‑甲氧基羰基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二苄氧基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸甲酯 [0652] 将2,5‑双(苄氧基)对苯二甲酸(KI‑6，141.00g，0.373mol)、苄基三乙基氯化铵(850mg，3.73mmol，0.01eq)和氯仿(2.5L)装入5L法兰烧瓶中。然后，它配有氮气入口、温度计、均压滴液漏斗、空白Dreschel瓶的出口和氢氧化钠鼓泡器。将搅拌后的溶液加热至55 ℃，并在40min内滴加亚硫酰氯(59mL，0.802mol，2.15eq)。将溶液在55℃下保持6h，然后冷却至室温过夜。将等分试样在乙醇中超声处理5min，然后通过LCMS分析，仅显示二乙酯。将混合物转移到两个圆底烧瓶中，真空除去挥发物；酰氯与甲苯(每个烧瓶中800mL)共沸。在 10L夹套容器中加入5‑氨基‑2‑羟基苯甲酸甲酯(137.00g，0.819mol，2.2eq)和二氯甲烷(2.5L，18体积)；将溶液冷却至15℃。将酰氯置于二氯甲烷(2.5L,18体积)中并加入到搅拌的反应中。反应立即形成大量固体，搅拌变得困难；此外，反应放热至30℃。然而，在长时间搅拌下，混合物变成粉红色/紫色细悬浮液。将混合物在25℃下搅拌72h。过滤悬浮液，用二氯甲烷(2L，14体积)洗涤，所得固体在真空烘箱中干燥，得到240.00g产物(94％收率)。 [0653] b)5‑(4‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸，Ic‑007a [0654] 皂化：在5L 3颈圆底烧瓶中加入新研磨的5‑(4‑(3‑甲氧基羰基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二苄氧基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸甲酯(150.00g，0.22mol)和异丙醇(1.5L，10体积)。将混合物加热至50℃，并加入氢氧化四丁基铵(444mL，0.67mol，3eq)和水(1.1L，7体积)。1h后仍残留一些固体，因此再加入60mL的氢氧化四丁基铵溶液和水(120mL)，将混合物在50℃下搅拌6h，然后冷却至室温过夜。加入另外的氢氧化四丁基铵(80mL)，将混合物在 60℃下再搅拌1h，直至无固体残留。 [0655] 氢解：将反应脱气(使用N2循环3次)，然后将催化剂(30.00g，10％Pd/C)作为浆料加入水中(100mL)。将反应进一步脱气(使用N2循环3次，使用H2循环2次)，并在50℃下置于H2下(气囊压力)过夜。向反应中再加入氢气，并在50℃下再保持4h，之后LCMS分析显示反应完全。将反应混合物脱气(用N2循环3次)，通过硅藻土垫过滤，并用温水/异丙醇(1L，1:1，60℃)洗涤。真空下将体积减至～1.2L。将混合物转移到盛有水(～3L)的5L法兰烧瓶中。烧瓶配有顶部搅拌器(大锚式)，并用盐酸(35％)酸化。在添加过程中，形成了大量沉淀。将混合物在55℃下加热6h，然后在72h内冷却至室温。过滤混合物，将固体在1M含水HCl(3L)中制成浆状，并加热至50℃3h，然后冷却至室温过夜。过滤混合物，用1M含水HCl(2L)、水(1.5L)和丙酮(1L)洗涤。在真空烘箱中干燥固体，得到100.00g仍被～5mol％四丁基铵盐(NMR)污染 的产物。将该固体在70℃下在1M含水盐酸(3L)中搅拌8h，然后让其冷却至室温过夜。过滤固体，用水洗涤，并在真空烘箱中干燥。四丁基铵的量减少到～0.62mol％(85.90g，82％收率)(棕色粉末)。 [0656] 30)2‑(2,5‑二羟基‑4‑(4‑羟基‑2‑羧基苯基氨基羰基)苯甲酰胺基)‑5‑羟基苯甲酸，化合物Ic‑009a： [0657] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.85min；m/z＝469.0[M+H]+，峰面积>98％ [0658] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.31(s,2H),11.93(s,2H),10.85(s,2H),9.64(s,2H),8.41(d,J＝9.0Hz,2H),7.55(s,2H),7.39(d,J＝3.0Hz,2H),7.03(dd,J＝9.0,3.0Hz,2H)。 [0659] HRMS:C22H17N2O10的计算值:469.08777,实际值:469.08755 [0660] 生物数据:Ic‑009a:FGF‑1 IC50[μM]＝32；FGF‑2 IC50[μM]＝202；VEGF‑A1 IC50[μM]＝208；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝72.85；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝72.21 [0661] 二甲酯： [0662] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.03min，m/z＝497.1[M+H]+，峰面积>92％ [0663] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.69(s,2H),11.01(s,2H),9.75(s,2H),8.36(d,J＝9.0Hz,2H),7.62(s,2H),7.37(d,J＝3.0Hz,2H),7.07(dd,J＝9.0,3.0Hz,2H),3.87(s,6H)。 [0664] HRMS:C24H21N2O10的计算值:497.11907,实际值:497.11913 [0665] 生物数据:Ic‑009a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝23；FGF‑2 IC50[μM]＝30；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.02；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝24.12；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝41.05 [0666] 方案7.R≠R’的Ic型酰胺的合成 [0667] [0668] 合成步骤：参见KI‑1的通用步骤。 [0669] 实施例： [0670] [0671] [0672] 条件和收率：参见图4A‑D [0673] 31)5‑(4‑(2‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸，化合物Ic‑001aTz/004a： [0674] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.40min；m/z＝477.2[M‑H]‑，峰面积>99％ [0675] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.92(s,1H),10.42(s,1H),8.47(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.25(d,J＝2.7Hz,1H),7.98–7.88(m,1H),7.76(dd,J＝8.9,2.8Hz,1H),7.63–7.56(m, 2H),7.51(s,1H),7.37(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.97(d,J＝8.9Hz,1H)。 [0676] HRMS:[M+H]+,C22H17N6O7的计算值:477.11532,实际值:477.11475 [0677] 生物数据:Ic‑001a‑Tz/004a:FGF‑1 IC50[μM]＝19；FGF‑2 IC50[μM]＝87；VEGF‑A1 IC50[μM]＝25；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.6；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝82.83；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝96.99；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝3.4；IFNγIC50[μM]＝0.61；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝4.91；IL‑ 4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝3.04；IL‑9 IC50[μM]＝8.48； IL‑10 IC50[μM]＝19.5；IL‑12p70 IC50[μM]＝12.2；IL‑13 IC50[μM]＝1.5；IL‑17A IC50[μM]＝0.02；IL‑17F IC50[μM]＝2.4；IL‑18 IC50[μM]＝46.6；IL‑21 IC50[μM]＝0.3；IL‑ 33 IC50[μM]＝1.67；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.002；TNFβIC50[μM]＝3.02[0678] 甲酯： [0679] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.06min，m/z＝491.1[M+H]+，峰面积>89％ [0680] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.55(s,1H),10.90(s,1H),10.45(s,1H),10.37(s,1H),8.47(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.30(d,J＝2.7Hz,1H),7.91(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H), 7.76(dd,J＝8.9,2.7Hz,1H),7.63(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.58(s,1H),7.51(s,1H), 7.38(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),3.93(s,4H)。 [0681] HRMS:[M+H]+,C23H19N6O7的计算值:491.13097,实际值:491.13071 [0682] 生物数据:Ic‑001a‑Tz/004a‑E1:FGF‑1 IC50[μM]＝104；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝35；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.1；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝73.97；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝97.56 [0683] 实施例1.4.Id型分子：苯并咪唑连接的，1个实施例 [0684] [0685] 方案8.Id型化合物的合成 [0686] [0687] 合成步骤：参见KI‑1的通用步骤[3]、[4]、[5] [0688] 环化步骤：参见图4A‑D [0689] 实施例： [0690] [0691] 32)2‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基)‑1H‑苯并[d]咪唑‑4‑甲酸，化合物Id‑030a： [0692] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.99min；m/z＝313.1[M‑H]‑，峰面积>97％ [0693] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.10(d,J＝8.2Hz,1H),8.05(d,J＝7.7Hz,1H),7.80(s,1H),7.68(t,J＝8.0Hz,1H),7.62(s,1H) [0694] 生物数据‑在DMSO中不稳定 [0695] 乙基甲基酯： [0696] UPLC‑MS(酸性法，4min):r.t＝2.09min，m/z＝357.1[M+H]+，峰面积>89％ [0697] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6+D2O 10％)δ7.97(d,J＝8.0Hz,1H),7.90–7.83(m,2H),7.44–7.36(m,2H),4.35(q,J＝7.1Hz,2H),3.94(s,3H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0698] HRMS:[M+H]+,C18H17N2O6的计算值:357.10811,实际值:357.10827 [0699] 生物数据:Id‑030a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝115；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.33；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝0；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0；中性粒细胞粘附抑制[％]＝43 [0700] 实施例1.5：IIa型分子：单酰胺，16个实施例 [0701] [0702] 前体的合成 [0703] 方案9a.中间体KI‑2和KI‑7的合成 [0704] [0705] 步骤： [0706] KI‑2和KI‑7的合成 [0707] 2,6‑二(乙氧基羰基)环己烷‑1,4‑二酮[步骤1][参考文献：Rodriguez et al.Synth.Comm.28(1998)2259‑69]：在回流温度下，在30min内，将1,3‑二氯丙酮(12.5g， 0.1mol)于THF(500mL)中滴加到1,3‑丙酮二甲酸二乙酯(18mL，0.1mol)和碳酸钾‑325目 (21.5g，0.15mol)于THF(1L)中的悬浮液中。2h后，反应完全，将混合物冷却至室温，然后通过 过滤；固体残余物用THF(200mL)洗涤，然后减压除去溶剂。粗产物通过快速柱色 谱(己烷/EtOAc 0至20％)纯化，得到标题化合物(9.3g，37％收率)。 [0708] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.01min；m/z＝257.1[M+H]‑，峰面积>74％ [0709] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)烯醇和顺/反异构体的复杂混合物δ12.10(s),4.23(q,J＝7.1Hz),4.11(m),3.85–3.77(m),3.70(s),3.10–2.89(m),2.89–2.80(m),2.62–2.58(m), 1.25(t,J＝7.1Hz),1.22–1.15(m,9H)。 [0710] 2,5‑二羟基间苯二甲酸二乙酯[步骤2]：[方案取自Zhong et al.:Chem Eur.J.25(2019)8177‑8169]：在室温下，在30min内，向2,6‑二(乙氧基羰基)‑环己烷‑1,4‑二酮(5.0g，20mmol)于AcOH(17mL)中的搅拌溶液中分批加入NBS(3.5g，20mmol)。另外20min后，加入水(100ml)淬灭反应。分离出的所需产物为固体。过滤和干燥后，分离出白色固体的标题化合物(4.6g，93％收率)。 [0711] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.00min；m/z＝253.1[M‑H]‑，峰面积>90％ [0712] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.85(s,1H),9.57(s,1H),7.39(s,2H),4.32(q,J＝7.1Hz,4H),1.31(t,J＝7.1Hz,6H)。 [0713] 2,5‑双(苄氧基)间苯二甲酸二乙酯[步骤3]：在10min内，向2,5‑二羟基间苯二甲酸二乙酯(19.0g，75mmol)和碳酸钾‑325目(82.6g，598mmol)于DMF(83mL)中的悬浮液中滴加苄基溴(43.0mL,362mmol)。将反应混合物在100℃加热2小时。冷却至室温后，减压除去溶剂。然后向残余物中加入水(500mL)。混合物用EtOAc(3x250mL)萃取，收集的有机层用盐水(300mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，然后减压浓缩。粗物质通过快速柱色谱(己烷/EtOAc 0至15％)纯化，得到标题化合物(29.4g，90％收率)。 [0714] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.38min；m/z＝435.2[M+H]+，峰面积>90％ [0715] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.50(s,2H),7.49–7.45(m,2H),7.44–7.37(m,5H),7.37–7.29(m,3H),5.17(s,2H),4.95(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,4H),1.22(t,J＝7.1Hz, 6H)。 [0716] 2,5‑双(苄氧基)‑3‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑2)[步骤4]：将氢氧化钾(4.4g，79mmol)于水(66mL)中的溶液迅速加入到2,5‑双(苄氧基)间苯二甲酸二乙酯(31.3g, 72mmol)于1,4‑二噁烷(430mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1.5h。减压除去1, 4‑二噁烷，然后加入Na2CO3饱和水溶液(1L)，水层用EtOAc(3x500mL)萃取，用Na2SO4干燥，过滤，真空除去溶剂。残余物通过硅胶垫过滤纯化，使用己烷/EtOAc(1/1)，然后EtOAc(1％v/v AcOH)作为洗脱剂，得到两种不同的级分： [0717] 原料：2,5‑双(苄氧基)间苯二甲酸二乙酯(20.4g，65％收率)。 [0718] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.38min；m/z＝435.2[M+H]+，峰面积>78％ [0719] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.50(s,2H),7.49–7.45(m,2H),7.44–7.37(m,5H),7.37–7.29(m,3H),5.17(s,2H),4.95(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,4H),1.22(t,J＝7.1Hz, 6H)。 [0720] 所需产物2,5‑双(苄氧基)‑3‑(乙氧基羰基)苯甲酸，为白色蓬松固体，(KI‑2)(3.5g，12％收率)。 [0721] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.22min；m/z＝405.1[M‑H]‑，峰面积>90％ [0722] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.30(s,1H),7.48(t,J＝3.0Hz,2H),7.46–7.42(m,5H),7.39(m,3H),7.37–7.31(m,2H),5.17(s,2H),4.96(s,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),1.22 (t,J＝7.1Hz,3H) [0723] 然后使用浓盐酸将原始Na2CO3饱和水溶液酸化至pH～7。然后用EtOAc(2x500mL)萃取，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到KI‑2和KI‑7的混合物(3.0g，11％收率)。 [0724] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.00min；m/z＝377.1[M‑H]‑，峰面积25％，rt＝‑1.22min；m/z＝405.1[M‑H]，峰面积56％ [0725] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.23(s,2H),7.52–7.29(m,12H),5.17(s,2H),4.97(s,2H)。 [0726] 方案9b：KI‑7的替代合成 [0727] [0728] 2,6‑二甲基‑1,4‑亚苯基二乙酸酯[步骤1]：向2,6‑二甲基氢醌(5.0g，36mmol)于吡啶(10mL)中的搅拌溶液中快速加入乙酸酐(10mL)。将溶液在室温下搅拌18h。然后减压除去溶剂，残余物用EtOAc(250mL)溶解，随后用盐酸水溶液(1M，250mL)、NaHCO3饱和水溶液(250mL)和水(250mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤，真空除去溶剂，得到标题化合物(7.4g，92％)，为白色固体。 [0729] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.07min；m/z＝240.2[M+NH4]+，峰面积>90％ [0730] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ6.88(HAr,2H),2.37–2.30(m,3H),2.27–2.21(m,3H),2.12–2.02(m,6H)。 [0731] 2,6‑双(二溴甲基)‑1,4‑亚苯基二乙酸酯[步骤2]：向2,6‑二甲基‑1,4‑亚苯基二乙酸酯(6.34g，29mmol)于1,2‑二氯乙烷(130mL)中的搅拌溶液中依次加入2,2’‑偶氮双(2‑甲基丙腈)(AIBN)(0.93g，6mmol)和N‑溴代琥珀酰亚胺(NBS)(25.39g，143mmol)。将溶液回流搅拌24h。加入另外的2,2’‑偶氮双(2‑甲基丙腈)(AIBN)(0.93g，6mmol)和N‑溴代琥珀酰亚胺(NBS)(5.08g，28.6mmol)，并将反应混合物再回流搅拌24h。将反应冷却至室温，通过过滤除去残余固体，并用DCM(250mL)洗涤。用碳酸氢钠饱和水溶液(250mL)、盐酸水溶液(1M，250mL)和盐水(250mL)洗涤滤液。然后用硫酸钠干燥有机层，过滤并减压浓缩，得到橙油状标题化合物(9.38g，61％)。 [0732] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.23min；m/z＝553.1[M+NH4]+，峰面积>88％ [0733] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.69(s,2H),7.31(s,2H),2.49(s,3H),2.32(s,3H)。 [0734] 2,5‑二羟基间苯二甲醛[步骤3]：向2,6‑双(二溴甲基)‑1,4‑亚苯基二乙酸酯(3.89g，7.23mmol)于甲酸(50mL)中的搅拌悬浮液中加入水(5mL)。将混合物回流搅拌18h。 然后将反应混合物缓慢倒入碳酸氢钠饱和水溶液(300mL)中。然后过滤分离形成的沉淀，得到标题化合物(0.94g，78％)，为棕色固体。 [0735] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.74min；m/z＝165.0[M‑H]‑，峰面积>98％ [0736] 2,5‑双(苄氧基)间苯二甲醛[步骤4]：在环境温度下，将碳酸钾‑325目(2.34g，17.0mmol)加入到2,5‑二羟基间苯二甲醛(0.94g，5.7mmol)于DMF(6mL)的搅拌溶液中。然后向反应烧瓶中加入苄基溴(2.0mL，17.0mmol)，并将所得混合物在100℃下加热18h。将反应混合物冷却至环境温度，并用氯化铵饱和水溶液(100mL)处理。将所得悬浮液搅拌30min，然后过滤。用氯化铵饱和水溶液(2×50mL)洗涤固体物质。然后用乙醇(5mL)研磨固体，抽吸干燥，得到所需产物，为棕色固体(1.58g，68％) [0737] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.28min，未观察到电离，峰面积78％ [0738] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.14(s,2H),7.63(s,2H),7.53–7.28(m,10H),5.23(s,2H),5.21(s,2H)。 [0739] 2,5‑双(苄氧基)间苯二甲酸(KI‑7)[步骤5]：将2,5‑双(苄氧基)间苯二甲醛(1.58g，4.5mmol)溶于2‑甲基‑2‑丁烯溶液于THF(2.0M，25mL)中。然后加入亚氯酸钠(5.1g， 45.0mmol)和磷酸二氢钾(4.6g，33.8mmol)于水(25mL)中的溶液，并将反应混合物在室温下搅拌18h。然后将反应混合物倒入NaHCO3饱和水溶液(400mL)中。水层用EtOAc(3x100mL)洗 涤，然后用浓盐酸(pH～1)酸化。然后用DCM(2x150mL)和Et2O(2x200mL)萃取水层，收集的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。然后用正戊烷(3x50mL)研磨残余物，得到标题化合物KI‑7，为白色固体(0.98g，58％)。 [0740] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.03min，m/z＝379.1[M+H]+，峰面积>96％ [0741] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.23(s,2H),7.57–7.28(m,12H),5.17(s,2H),4.97(s,2H)。 [0742] 方案9c：KI‑2Ac2的合成 [0743] [0744] 2,5‑二乙酰氧基‑3‑甲基苯甲酸甲酯。如Nudenberg et al(J.Org.Chem.1943,8,500‑508)中所报告的，用过硫酸盐氧化3‑甲基水杨酸。将3‑甲基水杨酸(15.0g，98.6mmol)溶于氢氧化钠(15.0g，375mmol，3.8eq.)溶液于水(37.5mL)中的溶液中。将浅棕色溶液冷却至20℃，并在搅拌下用7.75mL份的40％氢氧化钠和33.8mL份的10％过硫酸钾溶液处理，从 氢氧化物开始，保持温度为30‑35℃的速度，直至各加入10份。添加完成后，继续搅拌1h，使混合物在室温下静置16‑20h，然后加入浓HCl，直至蓝色变成刚果色。此时，未反应的3‑甲基水杨酸以固体形式分离，并通过过滤除去。用乙醚萃取滤液数次(5x50mL)，以回收剩余的3‑甲基水杨酸。然后用浓HCl(100mL)处理水溶液，然后回流2h以分解中间体单硫酸盐。让温热的溶液冷却至室温，过滤沉淀的几乎为黑色的结晶固体，用水洗涤并干燥。用醚萃取含水滤液，得到另一批棕色固体的2,5‑二羟基‑3‑甲基苯甲酸(总共：7.71g，47％)。Mp 212‑214℃ 1 ；H NMR(250MHz,DMSO):δ10.94(br.s.,1H),7.00(dd,J＝3.0和0.75,1Har),6.86(dd,J＝ 3.0和0.75,1Har),2.12(s,3H)。 [0745] 酯化。在0℃和氮气下，向2,5‑二羟基‑3‑甲基苯甲酸(2.05g，12.2mmol)于MeOH(7mL)中的溶液中小心地加入浓硫酸(0.7mL)。然后将反应混合物在100℃下搅拌6h。冷却至室温后，减压除去溶剂。所得粗产物溶于乙酸乙酯(50mL)中，溶液用水(20mL)洗涤、10％含水NaHCO3(20mL)、5％含水HCl(20mL)和盐水(20mL)，然后干燥(MgSO4)。过滤后，真空浓缩有机层，得到残余物，通过硅胶快速色谱(石油醚/乙酸乙酯＝9/1)纯化，得到白色固体的2,5‑1 二羟基‑3‑甲基苯甲酸甲酯(370mg，75％)。Mp 101‑103℃；H NMR(250MHz,CDCl3):δ10.56(d,J＝0.50Hz,1H),7.12(dd,J＝3.25和0.50Hz,1Har),6.90(dt,J＝3.00和0.50Hz,1Har), + + 4.45(s,3H),,2.24(s,3H)；HRMS(ESI):C9H11O4[M+H] 的m/z计算值:183.0652；实际值 183.0651。 [0746] 乙酰化。在氩气下，向2,5‑二羟基‑3‑甲基苯甲酸甲酯(4.43g，24.3mmol)于吡啶(10mL)中的溶液中加入过量乙酸酐(10mL)。在室温下搅拌12h后，通过与甲苯(25mL)在减压下共蒸发除去吡啶和乙酸酐。然后将粗产物溶于乙酸乙酯(15mL)中，溶液依次用2％含水HCl(5mL)、NaHCO3饱和水溶液(5mL)和盐水(5mL)洗涤。干燥(MgSO4)有机相，减压蒸发溶剂。 所得无色油通过硅胶快速色谱(石油醚/乙酸乙酯＝8/2)纯化，得到白色固体的乙酰化标题 1 产物(2,5‑乙酰氧基‑3‑甲基苯甲酸酯)(6.25g，97％)。Mp 69‑71℃；H NMR(250MHz,CDCl3): δ7.58(dd,J＝3.00和0.50Hz,1Har),7.18(dd,J＝3.00和0.75Hz,1Har),3.85(s,3H),2.37 + + (s,3H),2.30(s,3H),2.22(s,3H)；HRMS(ESI):C13H18NO6[M+NH4]的m/z计算值:284.1129；实际值284.1128。 [0747] 2,5‑二乙酰氧基‑3‑二溴甲基苯甲酸甲酯。2,5‑乙酰氧基‑3‑甲基苯甲酸甲酯(2.15g，8.08mmol)、N‑溴代琥珀酰亚胺(2.87mg，16.2mmol，2.0eq.)和偶氮二异丁腈(AIBN，27.0mg,0.162mmol,0.02eq.)于四氯化碳(45mL)中回流约12h，直到白色固体漂浮在表面 上。冷却后，过滤混合物，然后减压浓缩滤液。所得无色油通过硅胶快速色谱(石油醚/乙酸 1 乙酯＝9/1)纯化，得到白色固体的二溴化产物(3.29g，84％)。Mp 117‑119℃；H NMR (250MHz,CDCl3):δ7.86(d,J＝2.75Hz,1Har),7.78(d,J＝2.75Hz,1Har),6.81(s,1H),3.86 + + (s,3H),2.42(s,3H),2.33(s,3H)；HRMS(ESI ):C13H12Br2NaO6[M+Na] 的m/z计算值: 444.8893；实际值444.8896。 [0748] 2,5‑二乙酰氧基‑3‑甲酰基苯甲酸甲酯。将2,5‑二乙酰氧基‑3‑二溴‑甲基苯甲酸甲酯(2.30g，5.42mmol)和硝酸银(2.29g，13.5mmol，2.5eq.)于混合物丙酮‑H2O(4.7:1,40mL)中的溶液，在室温和黑暗条件下搅拌12h。然后过滤混合物，用乙酸乙酯(2x20mL)萃取滤液。合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。如此获得的无色油通过硅胶快速色谱(石油醚/乙酸乙酯＝9/1)纯化，得到黄色固体的醛(1.14g，75％)。MP 102‑ 104℃；IHNMR(250MHz,CDC13):10.17(s,1H),8.00(d,J＝3.00Hz,1Har),7.82(d,J＝ 3.00Hz,1Har),3.90(s,3H),2.44(s,3H),2.34(s,3H)。 [0749] 2,5‑二乙酰氧基间苯二甲酸单甲酯(KI‑2Ac2)。将磷酸氢钠(1.35g，9.81mmol，2.5eq.)于水(3.5mL)中的溶液滴加到2,5‑二乙酰氧基‑3‑甲酰基苯甲酸甲酯(1.10g， 3.93mmol)于DMSO(14mL)中的溶液中。然后将混合物冷却至0℃，并缓慢加入亚氯酸钠 (1.06g，9.34mmol，2.4eq.)于水(3.5mL)中的溶液。在室温下搅拌72h后，用NaHCO3饱和水溶液(10mL)淬灭混合物，并用乙酸乙酯(2x30mL)萃取。然后用1M HCl将水相酸化至pH＝1，并用乙酸乙酯(2x30mL)萃取。合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。获得的橙油用于下一步，不进行任何纯化。 [0750] 单酰胺的合成 [0751] 方案10.单酰胺IIa的合成 [0752] [0753] 方案：单酰胺的合成 [0754] 酰胺偶联和脱保护步骤 [0755] 参见KI‑1和KI‑6的通用步骤[3]、[4]、[5]，KI‑2、KI‑2Ac2和KI‑7的相同步骤[0756] 实施例 [0757] [0758] [0759] 条件和收率：参见表2(图5A‑C) [0760] 33)3‑(2‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑001a: [0761] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.86min；m/z＝318.0[M+H]+，峰面积>92％ [0762] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.49(s,1H),12.16(s,1H),9.54(s,1H),8.70(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.99(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.70–7.51(m,2H),7.42(d,J＝3.3Hz,1H), 7.20(td,J＝7.6,1.2Hz,1H)。 [0763] HRMS:[M+H]+,C15H12NO7的计算值:318.06083,实际值:318.06082 [0764] 生物数据:IIa‑001a:FGF‑1 IC50[μM]＝8.6；FGF‑2 IC50[μM]＝11；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝30.5；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.408；中性粒细胞粘附抑制[％]＝36.24 [0765] 34)3‑(2‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑001aTz: [0766] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.71min；m/z＝342.1[M+H]+，峰面积>99％ [0767] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.40(s,1H),9.49(s,1H),8.51(d,J＝8.3Hz,1H),7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.72–7.51(m,2H),7.51–7.26(m,2H) [0768] HRMS:[M+H]+,C15H12N5O5的计算值:342.08329,实际值:342.08317 [0769] 生物数据:IIa‑001a‑Tz:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝9.8；VEGF‑A1 IC50[μM]＝187；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝74.15；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝24.18 [0770] 乙酯 [0771] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.46min；m/z＝370.1[M+H]+，峰面积>92％ [0772] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.51(s,1H),11.37(s,1H),9.63(s,1H),8.47(d,J＝8.3Hz,1H),7.92(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.66–7.57(m,2H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.38 (td,J＝7.6,1.2Hz,1H),4.40(q,J＝7.1Hz,2H),1.36(t,J＝7.1Hz,3H)， [0773] HRMS:[M+H]+,C17H16N5O5的计算值:370.11460,实际值:370.11444 [0774] 生物数据:IIa‑001aTz‑E1:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝42；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝68.86；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝81.94 [0775] 35)2,5‑二羟基‑3‑(2‑磺基苯基氨基羰基)苯甲酸，化合物IIa‑001c: [0776] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.63min；m/z＝354.0[M+H]+，峰面积>80％ [0777] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.18(s,1H),9.48(s,1H),8.34–8.27(m,1H),7.72(dd,J＝7.7,1.7Hz,1H),7.52(d,J＝3.2Hz,1H),7.41–7.31(m,2H),7.08(td,J＝7.5,1.2Hz,1H)。 [0778] HRMS:[M+H]+,C14H12NO8S的计算值:354.02781,实际值:354.02781 [0779] 生物数据:IIa‑001c:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝71；VEGF‑A1 IC50[μM]＝283；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝72.62；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝43.53 [0780] 36)3‑(3‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑002a: [0781] 1H NMR(250MHz,CD3OD):δ8.37(t,1H),7.93(br d,1H),7.81(br d,1),7.76(d,1H),7.52(d,1H),7.48(t,1H)。 [0782] HRMS(ESI‑):[M‑H]‑,C15H10NO7的计算值:316.0461,实际值:318.0463 [0783] 生物数据:IIa‑002a:FGF‑1 IC50[μM]＝19；FGF‑2 IC50[μM]＝131；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝43.3；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.299；中性粒细胞粘附抑制[％]＝17.39 [0784] 37)3‑(4‑羧基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸)酰胺，化合物IIa‑003a: [0785] 1H NMR(250MHz,CD3OD):8.06(AA’BB’的BB’,2H),7.85(AA’BB’的AA’,2H),7.75(d,1H),7.58(d,1H) [0786] HRMS(ESI‑):C15H10NO7[M‑H]‑的计算值:316.0461；实际值316.0462 [0787] 生物数据:IIa‑003a:FGF‑1 IC50[μM]＝22；FGF‑2 IC50[μM]＝13；VEGF‑A1 IC50[μM]＝150；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.5；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝59.3；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝35.27 [0788] 38)3‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑004a: [0789] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.76min；m/z＝334.0[M+H]+，峰面积>99％ [0790] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ14.02(brs,1H),11.07(brs,1H),10.32(s,1H),9.47(brs,1H),8.27(d,J＝2.7Hz,1H),7.76(dd,J＝8.9,2.7Hz,1H),7.42(d,J＝3.2Hz,1H), 7.36(d,J＝3.2Hz,1H),6.96(d,J＝8.9Hz,1H)。 [0791] HRMS:[M+H]+,C15H12NO8的计算值:334.05574,实际值:334.05571 [0792] 生物数据:IIa‑004a:FGF‑1 IC50[μM]＝47；FGF‑2 IC50[μM]＝33；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝63.5；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.002；中性粒细胞粘附抑制[％]＝36 [0793] 39)3‑(2‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑006a: [0794] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.65min；m/z＝334.0[M+H]+，峰面积>99％ [0795] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.36(s,1H),11.83(s,1H),9.62(s,1H),9.47(s,1H),8.47(d,J＝9.1Hz,1H),7.64(d,J＝3.3Hz,1H),7.41(d,J＝3.2Hz,1H),7.37(d,J＝3.0Hz, 1H),7.03(dd,J＝9.1,3.0Hz,1H)。 [0796] HRMS:[M+H]+,C15H12NO8的计算值:334.05574,实际值:334.05548 [0797] 生物数据:IIa‑006a:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝43；VEGF‑A1 IC50[μM]＝121；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.9；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝84.29；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝20.29 [0798] 40)3‑(3‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)邻苯二甲酸，化合物IIa‑011a: [0799] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.72min；m/z＝360.1[M‑H]‑，峰面积>77％ [0800] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.83(s,1H),9.55(s,1H),8.43(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.73(d,J＝3.3Hz,1H),7.63–7.53(m,2H),7.46(d,J＝3.3Hz,1H), [0801] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05066,实际值:362.05045, [0802] 生物数据:IIa‑011a:FGF‑1 IC50[μM]＝141；FGF‑2 IC50[μM]＝123；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝58.1；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.18；中性粒细胞粘附抑制[％]＝26 [0803] 41)2‑(3‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)对苯二甲酸，化合物IIa‑012a: [0804] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.73min；m/z＝362.0[M+H]，峰面积>97％ [0805] 1H NMR(DMSO‑d6)δ:13.81(s,1H),13.34(s,1H),12.23(s,1H),9.50(s,1H),9.30(d,J＝1.6Hz,1H),8.06(d,J＝8.2Hz,1H),7.71(dd,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.64(d,J＝3.3Hz, 1H),7.43(d,J＝3.3Hz,1H), [0806] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05066,实际值:362.05046, [0807] 生物数据:IIa‑012a:FGF‑1 IC50[μM]＝150；FGF‑2 IC50[μM]＝150；VEGF‑A1 IC50[μM]＝32；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝3.31；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝44.8；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.313；中性粒细胞粘附抑制[％]＝7.5 [0808] 42)2‑(3‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物IIa‑013a: [0809] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.68min；m/z＝362.0[M+H]+，峰面积>96％ [0810] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.12(brs,3H),11.71(s,1H),9.47(s,1H),7.96(s,1H),7.94(s,1H),7.66(d,J＝3.3Hz,1H),7.44(d,J＝3.3Hz,1H),7.35(t,J＝7.8Hz,1H)。 [0811] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05066,实际值:362.05047 [0812] 生物数据:IIa‑013a:FGF‑1 IC50[μM]＝137；FGF‑2 IC50[μM]＝12；VEGF‑A1 IC50[μM]＝34；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝57.68；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.54；中性粒细胞粘附抑制[％]＝15.75 [0813] 43)4‑(3‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)邻苯二甲酸，化合物IIa‑014a: [0814] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.63min；m/z＝362.1[M+H]+，峰面积>88％ [0815] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.80(s,1H),9.45(s,1H),8.01(d,J＝2.2Hz,1H),7.86(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.5Hz,1H),7.45–7.33(m,2H), [0816] HRMS:[M+H]+,C16H12NO9的计算值:362.05066,实际值:362.05048 [0817] 生物数据:IIa‑014a:FGF‑1 IC50[μM]＝40；FGF‑2 IC50[μM]＝61；VEGF‑A1 IC50[μM]＝91；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝17.6；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝73.94；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝21.5 [0818] 44)5‑(3‑羧基‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物IIa‑015a: [0819] 1H NMR(250MHz,CD3OD):δ8.60(d,J＝1.5Hz,2H),8.44(t,J＝1.5Hz,1H),7.75(d,J＝3.2Hz,1H),7.56(d,J＝3.2Hz,1) [0820] HRMS(ESI+):m/z C16H12NO9[M+H]+的计算值:362.0507；实际值362.0505[LM‑163] [0821] 生物数据:IIa‑015a:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝125；VEGF‑A1 IC50[μM]＝N.D.；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝N.D.；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝N.D. [0822] 45)(3‑(3‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑033a: [0823] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.78min；m/z＝330.1[M‑H]‑，峰面积>98％ [0824] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.40(s,1H),9.45(s,1H),7.66(t,J＝1.9Hz,1H),7.63–7.57(m,1H),7.45(d,J＝3.3Hz,1H),7.38(d,J＝3.2Hz,1H),7.29(t,J＝7.8Hz,1H), 7.05–6.95(m,1H),3.56(s,2H)。 [0825] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07644， [0826] 生物数据:IIa‑033a:FGF‑1 IC50[μM]＝35；FGF‑2 IC50[μM]＝32；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝4.9；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝50.64；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.914；中性粒细胞粘附抑制[％]＝11.75 [0827] 46)3‑(2‑(羧基甲基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑034a: [0828] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.74min；m/z＝332.0[M+H]+，峰面积>95％ [0829] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.48(s,1H),10.65(s,1H),9.30(s,1H),7.97(d,J＝8.3Hz,1H),7.64(d,J＝3.2Hz,1H),7.40(d,J＝3.3Hz,1H),7.33–7.26(m,2H),7.13(td,J＝ 7.5,1.3Hz,1H),3.70(s,2H)。 [0830] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07653 [0831] 生物数据:IIa‑034a:FGF‑1 IC50[μM]＝22；FGF‑2 IC50[μM]＝5.7；VEGF‑A1 IC50[μM]＝86；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝100；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝69.2；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝26.58 [0832] 二乙酯 [0833] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.12min；m/z＝388.1[M+H]+，峰面积>99％ [0834] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.81(s,1H),9.58(s,1H),7.77(t,J＝8.5Hz,1H),7.65(d,J＝3.4Hz,1H),7.42(d,J＝3.4Hz,1H),7.36–7.31(m,2H),7.20(t,J＝7.4Hz,1H),4.39(q,J＝7.1Hz,2H),4.05(q,J＝7.1Hz,2H),3.77(s,2H),1.36(t,J＝7.1Hz,3H),1.13(t,J＝ 7.1Hz,3H)。 [0835] HRMS:[M+H]+,C20H22NO7的计算值:388.13907,实际值:388.13887 [0836] 生物数据:IIa‑034a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝164；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝68.73；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝11.86 [0837] 47)3‑(3,4‑二羟基苯基甲基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑035a: [0838] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.69min；m/z＝318.0[M‑H]‑，峰面积>99％ [0839] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.38(s,1H),8.84(s,1H),8.75(s,1H),7.55(d,J＝3.2Hz,1H),7.34(d,J＝3.2Hz,1H),6.74(d,J＝2.1Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,1H),6.58 (dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),4.34(d,J＝5.7Hz,2H)。 [0840] HRMS:[M+H]+,C15H14NO7的计算值:320.07647,实际值:320.07625. [0841] 生物数据:IIa‑035a:FGF‑1 IC50[μM]＝16；FGF‑2 IC50[μM]＝61；VEGF‑A1 IC50[μM]＝45；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.52；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝76.99；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1；中性粒细胞粘附抑制[％]＝36.67 [0842] 48)3‑(2‑羧基苯基甲基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIa‑053a: [0843] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.08min；m/z＝332.0[M+H]+，峰面积>97％ [0844] 1H NMR(DMSO‑d6)δ:13.13(brs,1H),12.73(brs,1H),9.40(s,1H),9.05(s,1H),7.91(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.65–7.29(m,5H),4.80(d,J＝6.1Hz,2H)。 [0845] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07626 [0846] 生物数据:IIa‑053a:FGF‑1 IC50[μM]＝84；FGF‑2 IC50[μM]＝18；VEGF‑A1 IC50[μM]＝37；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.27；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝63.13；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.62；中性粒细胞粘附抑制[％]＝20；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝1.04；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝1.67；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝2.2；IL‑9 IC50[μM]＝1.41；IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.27；IL‑13 IC50[μM]＝29.9；IL‑17A IC50[μM]＝>100；IL‑ 17F IC50[μM]＝28.8；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑33 IC50[μM]＝ 12.1；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.02；TNFβIC50[μM]＝91.5。 [0847] 实施例1.6.IIb型分子：来自二胺的二酰胺，1个实施例 [0848] [0849] 方案11.IIb型二酰胺的合成 [0850] [0851] 步骤：参见KI‑1的通用步骤[3]、[4]、[5] [0852] 例如： [0853] [0854] 条件和收率：参见表2(图5A‑C) [0855] 49)3,5‑双(2,5‑二羟基‑3‑羧基苯甲酰基氨基)苯甲酸，化合物IIb‑010a: [0856] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.98min；m/z＝511.1[M‑H]‑，峰面积>93％ [0857] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.81(s,2H),10.65(s,2H),8.38(m,1H),8.12(d,J＝2.0Hz,2H),7.39(d,J＝2.3Hz,4H)。 [0858] HRMS:[M+H]+,C23H17N2O12的计算值:513.07760,实际值:513.07774 [0859] 生物数据:IIb‑010a:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝102；VEGF‑A1 IC50[μM]＝28；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝81.87；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝59.84 [0860] 实施例1.7.IIc型分子：来自二酸的二酰胺，2个实施例 [0861] [0862] 方案12.R＝R’的IIc型酰胺的合成 [0863] [0864] 步骤：参见KI‑6的通用步骤[3]、[4]、[5] [0865] 例如 [0866] [0867] 条件和收率：参见表2(图5A‑C) [0868] 50)5‑(3‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸，化合物IIc‑007a: [0869] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.20min；m/z＝469.1[M+H]+，峰面积>91％ [0870] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.41(s,2H),9.51(s,1H),8.22(d,J＝2.7Hz,2H),7.79(dd,J＝9.0,2.7Hz,2H),7.58(s,2H),6.98(d,J＝8.9Hz,2H), [0871] 13C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ172.1,166.1,158.3,152.0,149.4,130.2,129.5(CH),122.8(CH),120.3,119.8(CH),117.7(CH).113.0。 [0872] HRMS:[M+H]+,C22H17N2O10的计算值:469.08777,实际值:469.08803 [0873] 生物数据:IIc‑007a:FGF‑1 IC50[μM]＝11；FGF‑2 IC50[μM]＝91；VEGF‑A1 IC50[μM]＝8.2；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.44；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝93.04；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝64.61；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝26；IFNγIC50[μM]＝0.11；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝12.8；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.05；IL‑9 IC50[μM]＝2.14；IL‑10 IC50[μM]＝17.9；IL‑12p70 IC50[μM]＝3.37；IL‑13 IC50[μM]＝0.25；IL‑17A IC50[μM]＝0.01； IL‑17F IC50[μM]＝0.26；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝9.41；IL‑33 IC50[μM]＝0.18；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.03；TNFβIC50[μM]＝0.29 [0874] IIc‑007a的替代的大规模合成 [0875] 2,5‑二苄氧基间苯二甲酸(KI‑7) [0876] 向5L夹套容器中装入2,5‑二苄氧基间苯二甲醛(方案9b)(300g，866mmol)、间苯二酚(286g，2.60ml)、KH2PO4(354g，2.60ml)、丙酮(1.5L)和水(516ml)。将浆液在15‑25℃下搅拌。在90min内，在15‑30℃(放热)下，装入80％NaClO2(294g，2.60mol)于水(1L)中的溶液。添加完成后，将反应在15‑25℃下搅拌1hr。在10min内，在T<30℃(放热)下，装入85％H3PO4(85ml，1.24mol)于水(1175ml)中的溶液[～1M]，得到沉淀。将批料冷却至0‑5℃并过滤。用水(3x1.2L)洗涤固体，并在烘箱中干燥(50℃)，得到325.6g二酸KI‑7。HPLC：98.9％；NMR> 95％。校正收率(90.6％)。 [0877] 5‑(3‑(3‑甲氧基羰基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二苄氧基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸甲酯。向2L夹套容器中装入二酸KI‑7(80g，211mmol)、HBTU(2‑(1H‑苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基脲六氟磷酸盐)(176.8g，466mmol)和THF(560ml)。将批料在15‑25℃下搅拌，并装入N‑甲基咪唑(50.6ml，635mmol)。30min后，装入5‑氨基‑2‑羟基苯甲酸甲酯(77.8g，466mmol)，并将反应在25℃搅拌过夜。加入水(1.2L)，并将批料在20℃搅拌30min。 过滤该批料，用水(2x480ml)洗涤，然后用MeCN(320ml)洗涤。将所得固体(236g)与MeCN (800ml)一起装回容器中。将浆液加热至50℃40min，然后冷却至20℃。过滤该批料，并用 MeCN(320ml)洗涤。固体(156g)的NMR分析显示无TMU、HOBt、NMI或HBTU。将物质在50℃下干燥过夜，得到125g二酰胺。HPLC：98.2％。NMR:>97％。收率:88％。 [0878] 5‑(3‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二苄氧基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸。向2L夹套容器中装入先前的二酰胺(110g，163mmol)、THF(550ml)和水(1100ml)。将批料在15‑25℃下搅拌，并加入85％KOH(32.2g，488mmol)(放热很小)。将溶液加热至50℃4h，然后冷却至20℃并搅拌过夜。然后在15‑25℃下，在30min内装入6M含水AcOH(550ml，3.3mol)。添加完成后，将批料搅拌30min，然后过滤。用水(3x550ml)洗涤固体，然后在50℃烘箱干燥。 产生了102g的游离二酸。HPLC:98.9％(0.3％单酰胺，0.19％单酸)。NMR:>97％。收率:97％。 [0879] 5‑(3‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑2‑羟基苯甲酸IIc‑007a。在N2下，向2L夹套容器中装入10％Pd/C(10g，50％湿，87L型)，然后装入先前的二酸(100g，154mmol)、AcOH(5ml，88mmol)和THF(1200ml)。搅拌该批料，然后用H2喷雾并加热至40℃2hr。用N2喷雾干燥该批料，然后过滤(GF/F)。用THF(300ml)冲洗容器，并用冲洗液洗涤过滤器上的催化剂。将滤液装入容器中，并用THF(400ml)将体积调节至2L。将溶液加热至30℃，装入SPM32(10g)，并将批料在30℃下搅拌过夜。滤出SPM32，并用THF(200ml)洗涤。真空除去溶剂，得到淡黄色固体(110g)。NMR分析显示28％THF。将该物质在EtOH(1L)中于20℃下制浆2hr，然后滤出。用EtOH(400ml)洗涤固体，并在60℃下烘箱干燥过夜。NMR显示8.7％EtOH，无THF。将该物质在80℃进一步干燥4夜，得到66.5g IIc‑007a，为灰白色固体，收率为 92％。HPLC:99.5％(0.31％单酰胺)。NMR:4.6％EtOH，无THF。通过ICP‑OES的Pd：<2pm。 [0880] IIc‑007a‑THF溶剂合物：浓缩THF滤液得到黄色固体，通过NMR分析，通常含有25‑30％THF，不能通过干燥除去，表明为非化学计量溶剂合物。 [0881] 将一小份THF溶剂合物(1.45g)于THF(10ml)中加热至50℃1hr，冷却至RT并分离，用3ml THF洗涤。得到了1.13g IIc‑007a‑THF。NMR:27％THF。HPLC:99.6％(0.1％单酰胺)。 通过过滤分离THF溶剂合物可提高纯度，并将主要杂质(单酰胺，IIa‑004a)从0.7％有效清除至0.1％。回收率:78％。THF溶剂合物在THF中的溶解度，按20℃下计算为约～25mg/ml。 [0882] 在丙酮、EtOH和EtOAc中对物质进行了去溶剂化试验。每批在50℃下20体积溶剂中加热1hr，然后在RT下分离并烘箱干燥(60℃)。选择乙醇作为脱溶剂，是因为干燥后产物中掺入的EtOH含量低，而且系统中的THF清除效果极佳。对12.1g产物(25％THF)进行去溶剂化步骤。向物质中装入EtOH(20体积)，并将批料在RT下搅拌过夜。滤出样本，表明在RT下成功去溶剂化。总收率：8.67g。HPLC：99.4％。NMR:>97％(0.8％EtOH)。XRPD表明分离产物的结晶度很高。 [0883] 产物IIc‑007a也形成DMSO溶剂合物(DMSO：产物的比例为3:2)。 [0884] 51)2‑(3‑(2‑羧基‑4‑羟基苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)‑5‑羟基苯甲酸，化合物IIc‑009a： [0885] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.79min；m/z＝469.1[M+H]+，峰面积>95％ [0886] 1H NMR(400MHz,DMF‑d7)δ10.11(s,1H),10.01(s,2H),8.71(d,J＝9.0Hz,2H),8.01(s,2H),7.82(d,J＝3.0Hz,2H),7.46(d,J＝8.9Hz,2H)。 [0887] HRMS:[M+H]+,C22H17N2O10的计算值:469.08777,实际值:469.08714 [0888] 生物数据:IIc‑009a:FGF‑1 IC50[μM]＝30；FGF‑2 IC50[μM]＝N.D.；VEGF‑A1 IC50[μM]＝182；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.7；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝75.31；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝53.15；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝0.54；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝19.6；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.27；IL‑9 IC50[μM]＝18.9；IL‑10 IC50[μM]＝11.31；IL‑12p70 IC50[μM]＝>100；IL‑13 IC50[μM]＝0.13；IL‑17A IC50[μM]＝0.001；IL‑17F IC50[μM]＝0.13；IL‑18 IC50[μM]＝2.95；IL‑21 IC50[μM]＝8.01；IL‑33 IC50[μM]＝0.29；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.11；TNFβIC50[μM]＝6.94。 [0889] 实施例1.8：IIIa型分子：单酰胺，4个实施例 [0890] [0891] 前体的合成 [0892] 方案13.合成中间体：来自KI‑1的KI‑8和KI‑9 [0893] [0894] 合成方案 [0895] 中间体KI‑8和KI‑9(通过KI‑10和KI‑11) [0896] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(羟基甲基)苯甲酸乙酯(KI‑10)[步骤1]：在惰性气体(N2)正流下，向KI‑1(62.3g，153mmol)于THF(700mL)中的‑20℃的冷却溶液中缓慢加入预冷却的BH3.THF(615.0mL，615mmol)溶液(在‑10℃下)。以此种方式添加时，反应的内部温度不得超过‑15℃。稍微加热反应，不允许内部温度超过‑7℃。将混合物在此温度下保持2.5h。然后将反应混合物倒入冰/水(8L)中。将获得的浑浊白色混合物在室温下搅拌2h，通过烧结漏斗(孔隙率3)过滤残余的白色悬浮液。将如此获得的白色固体进一步在40℃下在真空烘箱中 干燥过夜，得到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(羟基甲基)苯甲酸乙酯(KI‑10)(60.5g，97％收率)，其为白色固体。 [0897] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.25min；m/z＝391.2[M‑H]‑，峰面积>68％ [0898] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.54–7.48(m,2H),7.48–7.43(m,2H),7.43–7.35(m,4H),7.35–7.27(m,4H),5.28(t,J＝5.4Hz,1H),5.13(s,2H),5.11(s,2H),4.58(d,J＝ 5.4Hz,2H),4.25(q,J＝7.1Hz,2H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0899] 替代的中间体KI‑10可通过混合酸酐(在三乙胺存在下，用氯甲酸异丁酯于THF中处理KI‑1)从KI‑1获得，然后用硼氢化钠于THF中还原混合酸酐(收率85‑90％，150g规模)。 [0900] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氯甲基)苯甲酸乙酯(KI‑11)[步骤2]：将甲苯磺酰氯(17.0g，70mmol)缓慢加入到KI‑10(25.0g，64mmol)、DIPEA(12.2mL，70mmol)和DMAP(0.778g，6mmol)于DCM(260mL)中的冷却溶液(冰浴)中。将反应混合物在60℃搅拌30h，由此判定反应完全。 加入DCM(100mL)，分离有机层，用饱和碳酸氢钠水溶液(4x50mL)、水(2x50mL)和盐水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。将粗产物进行柱色谱(己烷/EtOAc 0‑20％)，得到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氯甲基)苯甲酸乙酯(KI‑11)(23.5g，75％)。 [0901] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.39min；m/z＝无离子，峰面积>84％。 [0902] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.54–7.44(m,4H),7.43–7.36(m,6H),7.36–7.28(m,2H),5.18(s,2H),5.13(s,2H),4.76(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0903] 替代的中间体KI‑11可以通过在‑10℃下用亚硫酰氯(1.14当量)于二氯甲烷中处理KI‑10，然后蒸发溶剂并从庚烷中沉淀出来来获得(收率90％，300g规模)。 [0904] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氰基甲基)苯甲酸乙酯[步骤3]：用氰化钾(1.8g，27.4mmol)处理KI‑11(7.5g，18.2mmol)于EtOH(90mL)和H2O(45mL)的混合物中的悬浮液。将反应混合物加热至75℃，并在此温度下搅拌16h。用水(500mL)稀释反应混合物，用EtOAc(2x200mL)萃取，然后用盐水(200mL)洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。分离出粗产物，为2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氰基甲基)苯甲酸乙酯和2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氰基甲基)苯甲酸(7.1g)的混合物，产物用于下一步，不进一步纯化。 [0905] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.30min；m/z＝402.2[M+H]+，峰面积>65％，和rt＝+1.15min；m/z＝374.1[M+H]，峰面积>8％。 [0906] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.56–7.27(m,12H),5.19(s,2H),5.14(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),3.95(s,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0907] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(羧基甲基)苯甲酸(KI‑9)[步骤4]：向2,5‑双(苄氧基)‑4‑(氰基甲基)苯甲酸乙酯(7.1g，13.2mmol)于EtOH(20mL)中的悬浮液中加入氢氧化钠(8.5g，212.5mmol)于水(50mL)中的溶液，并将反应混合物在回流下搅拌18h。用水(100mL)稀释反 应混合物，并将所得溶液用EtOAc(2x100mL)洗涤，如此得到的有机层用水(100mL)萃取，收集所有水层。然后用饱和柠檬酸水溶液将水层酸化至pH～3，过滤形成的沉淀，减压干燥。将固体在真空烘箱中在40℃下进一步干燥过夜，得到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(羧基甲基)苯甲酸(KI‑9)(6.4g，92％收率)，为淡黄色固体。 [0908] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.07min；m/z＝393.2[M+H]+，峰面积>74％。 [0909] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.46(s,2H),7.55–7.27(m,11H),7.19(s,1H),5.11(s,2H),5.09(s,2H),3.61(s,2H)。 [0910] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑(2‑乙氧基羰基甲基)苯甲酸(KI‑8)[步骤5]：将KI‑9(5.5g，14.0mmol)悬浮在EtOH(30mL)中，用亚硫酰氯(0.52mL，7.1mmol)处理该悬浮液，并将反应混合物在室温下搅拌24h。然后，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(1L)中，得到白色悬浮液。过滤分离固体，并用Et2O(2x20mL)进一步研磨。固体在真空烘箱中进一步干燥过夜，得到2,5‑双(苄氧基)‑4‑(2‑乙氧基羰基甲基)苯甲酸(KI‑8)(4.2g，64％)，为白色固体。 [0911] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.23min；m/z＝419.3[M‑H]‑，峰面积>79％。 [0912] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.68(brs,1H),7.58–7.27(m,11H),7.19(s,1H),5.11(s,2H),5.08(s,2H),4.01(q,J＝7.1Hz,2H),3.66(s,2H),1.11(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0913] 单酰胺的合成 [0914] 方案14.单酰胺IIIa的合成 [0915] [0916] 合成方案 [0917] 酰胺偶联和脱保护步骤： [0918] 参见KI‑1和KI‑6的通用步骤，步骤[3]、[4]、[5] [0919] 实施例 [0920] [0921] [0922] 条件和收率：参见表3(图6) [0923] 52)2‑(4‑(羧基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)苯甲酸，化合物IIIa‑001a： [0924] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.89min；m/z＝332.1[M+H]+，峰面积>98％ [0925] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.38(s,1H),12.17(s,1H),10.67(s,1H),9.23(s,1H),8.64(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),8.00(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.62(ddd,J＝8.7,7.3, 1.7Hz,1H),7.33(s,1H),7.19(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),6.80(s,1H),3.49(s,2H)。 [0926] HRMS:[M+H]+,C16H14NO7的计算值:332.07648,实际值:332.07666 [0927] 生物数据:IIIa‑001a:FGF‑1 IC50[μM]＝62；FGF‑2 IC50[μM]＝10；VEGF‑A1 IC50[μM]＝32；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝74.79；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝30.4 [0928] 乙基甲基酯 [0929] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.14min；m/z＝374.2[M+H]+，峰面积>96％。 [0930] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.91(s,1H),10.78(s,1H),9.25(s,1H),8.60(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.97(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.64(ddd,J＝8.7,7.3,1.7Hz,1H),7.38(s, 1H),7.26–7.18(m,1H),6.81(s,1H),4.08(q,J＝7.1Hz,2H),3.88(s,3H),3.56(s,2H),1.19 (t,J＝7.1Hz,3H)。 [0931] HRMS:[M+H]+,C19H20NO7的计算值:374.12342,实际值:374.12333 [0932] 生物数据:IIIa‑001a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝33；VEGF‑A1 IC50[μM]＝43；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝69.66；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝44.46 [0933] 53)(2‑(1H‑四唑‑5‑基)苯基氨基羰基)‑2,5‑二羟基苯基)乙酸，化合物IIIa‑001aTz： [0934] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.87min；m/z＝356.1[M+H]，峰面积>95％。 [0935] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.22(s,1H),11.43(s,1H),10.74(s,1H),9.21(s,1H),8.46(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(td,J＝8.6,7.9,1.6Hz,1H), 7.39–7.30(m,2H),6.80(s,1H),3.48(s,2H)。 [0936] HRMS:[M+H]+,C16H14N5O5的计算值:356.09894,实际值:356.09889 [0937] 生物数据:IIIa‑001aTz:FGF‑1 IC50[μM]＝51；FGF‑2 IC50[μM]＝14；VEGF‑A1 IC50[μM]＝12；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.71；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝69.35；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝39.74；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝18.9；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝>100；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝1.98；IL‑9 IC50[μM]＝3.01；IL‑10 IC50[μM]＝7.78；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.48；IL‑13 IC50[μM]＝0.15；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.17；IL‑17F IC50[μM]＝0.16；IL‑18 IC50[μM]＝27.7；IL‑21 IC50[μM]＝3；IL‑33 IC50[μM]＝0.14；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.31；TNFβIC50[μM]＝0.23。 [0938] 乙酯： [0939] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.56min；m/z＝384.2[M+H]+，峰面积>95％。 [0940] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.34(s,1H),10.73(s,1H),9.25(s,1H),8.45(dd,J＝8.5,1.2Hz,1H),7.85(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.61(ddd,J＝8.7,7.4,1.6Hz,1H),7.39– 7.30(m,2H),6.80(s,1H),4.08(q,J＝7.1Hz,2H),3.56(s,2H),1.19(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0941] HRMS:[M+H]+,C18H18N5O5的计算值:384.13024,实际值:384.12999 [0942] 生物数据:IIIa‑001aTz‑E1:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.32；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝70.03；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝91.76 [0943] 54)2‑(4‑(羧基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物IIIa‑013a： [0944] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.82min；m/z＝376.0[M+H]+，峰面积>89％。 [0945] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.67–11.48(m,3H),10.82(s,1H),9.19(s,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,2H),7.36(s,1H),7.33(t,J＝7.8Hz,1H),6.79(s,1H),3.48(s,2H)。 [0946] HRMS:[M+H]+,C17H14NO9的计算值:376.06630,实际值:376.06638 [0947] 生物数据:IIIa‑013a:FGF‑1 IC50[μM]＝17；FGF‑2 IC50[μM]＝31；VEGF‑A1 IC50[μM]＝43；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.3；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝76.55；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝30.667；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝27.8；IFNγIC50[μM]＝0.15；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝57.1；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝3.55；IL‑9 IC50[μM]＝11.9；IL‑10 IC50[μM]＝37.3；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.5；IL‑13 IC50[μM]＝0.37；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.15；IL‑17F IC50[μM]＝0.41；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝1.63；IL‑33 IC50[μM]＝1.11；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.51；TNFβIC50[μM]＝0.89。 [0948] 55)5‑(4‑(羧基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酰胺基)间苯二甲酸，化合物IIIa‑015a： [0949] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.93min；m/z＝376.0[M+H]+，峰面积>96％。 [0950] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6+10％D2O)δ8.34(s,2H),8.18(s,1H),7.38(s,1H),6.71(s,1H),3.39(s,2H)。 [0951] HRMS:[M+H]+,C17H14NO9的计算值:376.06630,实际值:376.06665 [0952] 生物数据:IIIa‑015a:FGF‑1 IC50[μM]＝16；FGF‑2 IC50[μM]＝114；VEGF‑A1 IC50[μM]＝202；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.89；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝78.76；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝12.13 [0953] 乙基二甲基酯 [0954] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.69min；m/z＝432.1[M+H]+，峰面积>97％。 [0955] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.23(s,1H),8.58(s,1H),8.58(s,1H),8.23–8.21(m,1H),7.31(s,1H),6.81(s,1H),4.08(q,J＝7.0Hz,2H),3.91(s,6H),3.58(s,2H),1.19(t,J ＝7.1Hz,3H), [0956] HRMS:[M+H]+,C21H22NO9的计算值:432.12891,实际值:432.02903 [0957] 生物数据:IIIa‑015a‑E3:FGF‑1 IC50[μM]＝N.D.；FGF‑2 IC50[μM]＝191；VEGF‑A1 IC50[μM]＝87；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝7.2；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝91.37；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝61.22 [0958] 实施例1.9.IIIb型分子：来自二胺的二酰胺，1个实施例 [0959] [0960] 方案15.IIIb型二酰胺的合成 [0961] [0962] 步骤：参见KI‑1的通用步骤，步骤[3]、[4]、[5] [0963] 例如： [0964] [0965] 条件和收率：参见表3(图6) [0966] 56)3,5‑双(2,5‑二羟基‑4‑羧基甲基苯甲酰基氨基)苯甲酸，化合物IIIb‑010a: [0967] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.08min；m/z＝539.2.1[M‑H]‑，峰面积80％。 [0968] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.85(brs,2H),10.57(brs,2H),9.20(s,2H),8.26(m,1H),8.09(d,J＝2.0Hz,2H),7.36(s,2H),6.82(s,2H),3.50(s,4H)。 [0969] HRMS:[M+H]+,C23H17N2O12的计算值:513.07760,实际值:513.07774 [0970] 三乙酯 [0971] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.81min；m/z＝623.3[M‑H]‑，峰面积94％。 [0972] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.87(s,2H),10.65(s,2H),9.23(s,2H),8.31–8.28(m,1H),8.10(d,J＝2.0Hz,2H),7.35(s,2H),6.81(s,2H),4.35(q,J＝7.1Hz,2H),4.08(q,J＝ 7.1Hz,4H),3.58(s,4H),1.35(t,J＝7.1Hz,3H),1.19(t,J＝7.1Hz,6H)。 [0973] 生物数据:IIIb‑010a‑E3:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.65；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝N.D.；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝0 [0974] 实施例1.10：IIIc型分子二聚体，6个实施例 [0975] [0976] 合成方案和步骤 [0977] 方案16：X＝O [0978] [0979] 合成步骤 [0980] 从KI‑10和KI‑11形成醚键 [0981] 2,5‑二苄氧基‑4‑[(2,5‑二苄氧基‑4‑乙氧基羰基苯基)甲氧基甲基]苯甲酸乙酯[步骤1]：向KI‑11(340mg，0.83mmol)和KI‑10(250mg，0.64mmol)于DMF(6mL)中的溶液(在冰浴中冷却后)中，分批加入氢化钠(76mg，1.9mmol)。1h后，将反应混合物倒入饱和氯化铵水溶液(50mL)中，用EtOAc(3x30mL)萃取该物质，用水(2x50mL)和盐水(50mL)进一步洗涤有机相，用硫酸钠干燥并减压浓缩。通过快速柱色谱(己烷/EtOAc 0至20％)纯化粗产物，得到标题化合物(161mg，33％收率)，为棕色固体。 [0982] 脱保护步骤： [0983] 参见通用步骤[4]、[5] [0984] 例如 [0985] [0986] 条件和收率：参见表4(脱保护)(图7) [0987] 57)4‑((2,5‑二羟基‑4‑羧基苯基)甲氧基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIIc‑060a： [0988] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.94min；m/z＝349.1[M‑H]‑，峰面积>90％。 [0989] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.20(s,2H),6.92(s,2H),4.56(s,4H), [0990] 生物数据:IIIc‑060a:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝51；VEGF‑A1 IC50[μM]＝114；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝1.3；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝86.84；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝41.38 [0991] 方案17：X＝NH [0992] [0993] 合成步骤 [0994] 通过KI‑10和KI‑11从KI‑12和KI‑13形成胺键 [0995] 2,5‑双(苄氧基)‑4‑甲酰基苯甲酸乙酯(KI‑12)：向KI‑10(3.4g，8.6mmol)于二氯甲烷(50mL)中的溶液中加入二氧化锰(4.5g，51.9mmol)。所得悬浮液在回流下搅拌4h。通过垫过滤反应液，固体用二氯甲烷(300mL)洗涤，然后减压除去溶剂，得到标题化合物(3.2g，94％收率)，为淡黄色固体。 [0996] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.33min；m/z＝无离子，峰面积>93％ [0997] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.39(s,1H),7.56(s,1H),7.54–7.26(m,11H),5.28(s,2H),5.20(s,2H),4.30(q,J＝7.1Hz,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H)。 [0998] 4‑(叠氮甲基)‑2,5‑双(苄氧基)苯甲酸乙酯：向KI‑10(3.0g，7.6mmol)和1,8‑二氮杂双环[5.4.0]十一碳‑7‑烯(DBU)(1.5mL.9.9mmol)于甲苯(30mL)中的悬浮液中加入二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)(2mL，9.1mmol)。将所得混合物在室温下搅拌18h。加入1M盐酸水溶液(200mL)，产物用EtOAc(3x100mL)萃取，合并的有机层用水(2x50mL)洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过快速柱色谱(己烷/EtOAc 0至20％)纯化，得到标题化合物 (3.1g，98％)，为无色油，其随时间推移变成白色固体。 [0999] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.37min；m/z＝390.2，[M+H‑N2]+，峰面积>93％ [1000] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.53–7.46(m,4H),7.44–7.26(m,8H),5.16(s,2H),5.14(s,2H),4.48(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)。 [1001] 4‑(氨基甲基)‑2,5‑双(苄氧基)苯甲酸乙酯(KI‑13)：向4‑(叠氮甲基)‑2,5‑双(苄氧基)苯甲酸乙酯(2.8g，6.7mmol)于THF(60mL)和水(6mL)中的溶液中加入与聚合物结合的三苯基膦(4.7g，～3mmol/g装载量)，并将所得混合物在室温下搅拌18h。通过过滤除去树 脂，用水(100mL)和EtOAc(2x100mL)洗涤。分离各相，水层用EtOAc(100mL)进一步萃取，收集的有机层用盐水(200mL)洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到标题化合物(KI‑13)(1.8g，70％收率)，为白色固体。 [1002] UPLC‑MS(碱性法，2min):rt＝1.20min；m/z＝392.2，[M+H]+，峰面积>93％ [1003] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.60–7.22(m,12H),5.14(s,2H),5.10(s,2H),4.24(q,J＝7.1Hz,2H),3.75(s,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)。 [1004] 将2,5‑二苄氧基‑4‑[(2,5‑二苄氧基‑4‑乙氧基羰基苯基)甲基氨基甲基]苯甲酸乙酯：将KI‑12(500mg，1.3mmol)和KI‑13(641mg，1.6mmol)溶于DCM(35mL)中，然后加入活性分子筛(10粒珠子)。将所得混合物在室温下搅拌5h。然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(654mg，3.1mmol)，并将所得混合物在室温下搅拌18h。加入DCM(25mL)，将反应混合物倾入分液漏斗中，用水(50mL)洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩。残余物通过快速柱色谱(己烷/EtOAc 0至 50％)纯化，得到标题化合物(631mg，64％收率)，为无色油，随时间推移变成固体。 [1005] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.37min；m/z＝766.3，[M+H]+，峰面积>92％ [1006] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.47–7.42(m,4H),7.38–7.25(m,20H),5.08(s,4H),5.04(s,4H),4.25(q,J＝7.1Hz,4H),3.76(s,4H),1.25(t,J＝7.1Hz,6H)。 [1007] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1008] 条件和收率：参见图7。 [1009] 例如 [1010] [1011] 58)双(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基甲基)胺，化合物IIIc‑056a: [1012] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.57min；m/z＝350.0[M+H]+，峰面积>96％。 [1013] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.97(s,2H),9.08(s,2H),7.31(s,2H),7.02(s,2H),4.11(s,4H)。 [1014] HRMS:[M+H]+,C16H16NO8的计算值:350.08704,实际值:350.08706 [1015] 生物数据:IIIc‑056a:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝35；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝90.07；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝35 [1016] 方案18：X＝NAc [1017] [1018] 合成步骤N,N‑双‑[2,5‑二苄氧基‑4‑乙氧基羰基苯基甲基]乙酰胺：在氮气气氛下，向N,N‑双‑[2,5‑二苄氧基‑4‑乙氧基羰基苯基甲基]胺(300mg，0.39mmol)和吡啶(0.2mL，2.4mmol)于DCM(6mL)中的溶液中加入乙酸酐(0.2mL，2.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，并减压浓缩。残余物通过快速柱色谱(己烷/EtOAc，0至50％)纯化，得到标题化合物(316mg，92％收率)，为无色油。 [1019] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.44min；m/z＝808.2[M+H]+，峰面积>95％。 [1020] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.49–7.17(m,22H),6.92(s,1H),6.72(s,1H),5.03(s,2H),5.00(s,2H),4.96(s,2H),4.94(s,2H),4.46(s,4H),4.31–4.16(m,4H),1.96(s,3H), 1.28–1.20(m,6H)。 [1021] 脱保护步骤： [1022] 参见通用步骤[4]、[5] [1023] 例如 [1024] [1025] 条件和收率：参见图7(脱保护) [1026] 59)N,N‑双(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基甲基)乙酰胺，化合物IIIc‑057a： [1027] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.84min；m/z＝392.1[M+H]+，峰面积>99％。 [1028] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.50(s,1H),9.34(s,1H),7.22(s,1H),7.17(s,1H),6.63(s,1H),6.53(s,1H),4.48(s,2H),4.39(s,2H),2.11(s,3H)。 [1029] HRMS:[M+H]+,C18H18NO9的计算值:392.09761,实际值:392.09766 [1030] 生物数据:IIIc‑057a:FGF‑1 IC50[μM]＝87；FGF‑2 IC50[μM]＝77；VEGF‑A1 IC50[μM]＝38；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.2；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝90.34；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝40.04；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝0.9；IL‑1βIC50[μM]＝16.2；IL‑2 IC50[μM]＝24.2；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.19；IL‑9 IC50[μM]＝11.1；IL‑10 IC50[μM]＝>100；IL‑12p70 IC50[μM]＝0.73；IL‑13 IC50[μM]＝4.73；IL‑17A IC50[μM]＝ 1.32；IL‑17F IC50[μM]＝5.06；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝1.56；IL‑33 IC50[μM]＝2.93；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.15；TNFβIC50[μM]＝1.58。 [1031] 方案19：X＝NCH2C6H3(OH)2COOH [1032] [1033] 合成步骤 [1034] 从KI‑11与NH3形成叔胺 [1035] 三(4‑乙氧基羰基‑2,5‑二苄氧基苯基甲基)胺：向密封管中装入KI‑11(32.5g，79mmol)、碘化钠(0.79g，5mmol)、氨于MeOH(7N)中的溶液(38mL，264mmol)和EtOAc(80mL)。 然后密封试管，将反应混合物在60℃加热24h。24h后，消耗原料(KI‑11)，反应混合物包含所需产物，还包含单体和二聚体结构。加入水(100mL)，所得混合物用EtOAc(3x100mL)萃取，收集的有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将所得残余物溶于EtOAc(165mL)中，加入KI‑11(2.5g，6mmol)、碘化钠(0.79g，5mmol)、DIPEA(10mL，58mmol)，并将所得溶液在60℃下加热。 18h后，加入水(100mL)，将所得混合物用EtOAc(3x100mL)萃取，将收集的有机层用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。使用EtOH/EtOAc 95/5(20mL)作为溶剂，通过重结晶纯化残余物，得到标题化合物(15.0g，50％)，为白色晶体。 [1036] UPLC‑MS(碱性法，2min):rt＝1.71min；m/z＝1140.3[M+H]+，峰面积>99％。 [1037] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ6.56–6.49(m,12H),6.48–6.38(m,24H),4.22(s,6H),4.04(s,6H),3.42(q,J＝7.1Hz,6H),3.00(s,6H),0.42(t,J＝7.1Hz,9H)。 [1038] 替代地，可通过硅胶快速柱色谱纯化产物：规模，最高270g；仪器:Combiflash Torrent；柱：RediSep柱，硅胶3kg；装载类型:原油溶于1L庚烷:甲苯(1:1)。用乙酸乙酯/庚烷洗脱。检测:UV–240nm [1039] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1040] 条件和收率：参见图7(脱保护) [1041] 替代的大规模脱保护步骤： [1042] 皂化。向5L圆底烧瓶中加入三(4‑乙氧基羰基‑2,5‑二苄氧基苯基甲基)胺(95.00g，0.083mol)、氢氧化钠(40.00g，0.99mol)、水(570mL)和四氢呋喃(1.9L)。使用温度块将反应混合物在80℃(回流温度为65℃)下加热48h，然后在室温下搅拌24h。然后真空除 去溶剂。收集粗物质，并用水(2.85L)进一步稀释。在另一个10L烧瓶中，室温下搅拌乙酸 (180mL)和水(950mL)的混合物。将粗产物于水中的混合物在30min内加入乙酸混合物中，同时用塔顶搅拌器搅拌，并沉淀出霜状固体。将反应混合物再搅拌1h，过滤时分离固体；母液pH为4.2。将分离出的固体用水(1425mL)搅拌1h，然后过滤。母液pH为4.5。将回收的固体用更多的水(1425mL)搅拌1h，然后过滤；母液pH为4.5。用丙酮(950mL)搅拌上述固体1h，并过滤。在分析之前，在50℃的真空烘箱中干燥乳白色固体48h(82.00g，93％收率)(收率在90‑ 95％之间变化)。 [1043] 注意：为了使产物保持游离酸形式并去除产物中的过量乙酸，pH是洗涤过程中的一个关键参数。 [1044] 理想pH：4.2至4.5(最终钠含量在2ppm‑20ppm之间变化)。 [1045] 氢解和分离。在2L圆底烧瓶中装入三(4‑羧基‑2,5‑二苄氧基苯基甲基)胺(58.00g，54.00mmol，1eq)和四氢呋喃(1160mL)。用氮气对混合物脱气，然后用氢气冲洗/真空循环4‑5次。向反应混合物中加入钯/碳(JM10％424Pd/C，70g，15％装载量)，并在25℃下搅拌5‑6h。然后将反应液脱气，通过硅藻土垫过滤除去催化剂，硅藻土垫用四氢呋喃(3× 1160mL)洗涤。最后，减压浓缩滤液。收集粗固体，用庚烷(1160mL)搅拌并过滤，得到灰色固体，将其在50℃的真空烘箱中干燥过夜(32.50g，>100％收率，基于粗产物)。将收集的粗物质溶于乙醇(325mL)中，并加热至60℃(透明溶液)。然后，在60℃下在15‑20min内缓慢加入水(325mL)(在加入过程中保持温度至少为50℃)。在此阶段，观察到浑浊的液体。将浑浊的反应混合物在回流温度下搅拌30min。 [1046] 在此时间之后，使反应混合物再冷却至室温30min。过滤时分离沉淀的固体，并用乙醇:水的1:1混合物(66mL)洗涤。在分析之前，在真空烘箱中于50℃干燥固体至少72h，得到所需产物IIIc‑061a(22.00g，76％收率)(收率在65‑75％之间变化)。LCMS:>95％，NMR:> 95％纯度。 [1047] [1048] 三(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基甲基)胺，化合物IIIc‑061a: [1049] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.74min；m/z＝516.0[M+H]+，峰面积>86％。 [1050] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.27(s,3H),6.83(s,3H),4.33(s,6H)。 [1051] 13C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ172.0,154.3,148.3,134,117.8(CH),114.9(CH),112.4,53.6(CH2)。 [1052] HRMS:[M+H]+,C24H22NO12的计算值:516.11365,实际值:516.11389 [1053] 生物数据:IIIc‑061a:FGF‑1 IC50[μM]＝9；FGF‑2 IC50[μM]＝7.6；VEGF‑A1 IC50[μM]＝21；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝4.3；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝92.5；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝58.69；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝31.2；IFNγIC50[μM]＝2.48；IL‑1βIC50[μM]＝>100；IL‑2 IC50[μM]＝>100；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.18；IL‑9 IC50[μM]＝8.85；IL‑10 IC50[μM]＝17.9；IL‑12p70 IC50[μM]＝37.2；IL‑13 IC50[μM]＝0.31；IL‑17A IC50[μM]＝ 0.04；IL‑17F IC50[μM]＝0.32；IL‑18 IC50[μM]＝32.4；IL‑21 IC50[μM]＝6.38；IL‑33 IC50[μM]＝0.31；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.03；TNFβIC50[μM]＝0.81[1054] 三乙酯 [1055] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.05min；m/z＝600.2[M+H]+，峰面积>82％。 [1056] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.02(s,3H),9.54(s,3H),7.17(s,3H),7.00(s,3H),4.33(q,J＝7.1Hz,6H),3.59(s,6H),1.31(t,J＝7.1Hz,9H)。 [1057] HRMS:[M+H]+,C30H34NO12的计算值:600.20755,实际值:600.20790 [1058] 生物数据:IIIc‑061a‑E3:FGF‑1 IC50[μM]＝200；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.34；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝N.D.；PMN ROS抑制IC50[μM]＝N.D.；中性粒细胞粘附抑制[％]＝10.4 [1059] 方案20：X＝S [1060] [1061] 合成步骤 [1062] 从KI‑11形成硫醚键 [1063] 参见方案21。产生硫醚键的条件相同。 [1064] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1065] 例如 [1066] [1067] 条件和收率：参见图7(脱保护) [1068] 60)4‑((2,5‑二羟基‑4‑羧基苯基)甲硫基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IIIc‑058a: [1069] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.84min；m/z＝365.1[M‑H]‑，峰面积>79％ [1070] 1H NMR(400MHz,甲醇‑d4)δ7.25(s,2H),6.83(s,2H),3.69(s,4H)。 [1071] HRMS:[M+H]+,C16H15O8S的计算值:367.04822,实际值:367.04768, [1072] 生物数据:IIIc‑058a:FGF‑1 IC50[μM]＝12；FGF‑2 IC50[μM]＝12；VEGF‑A1 IC50[μM]＝124；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.29；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝61.22；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1.17；中性粒细胞粘附抑制[％]＝23 [1073] 方案21：X＝SO2 [1074] [1075] 合成步骤 [1076] 硫醚键的氧化 [1077] 参见IVc‑059a的制备：相同的氧化条件。 [1078] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1079] 例如 [1080] [1081] 条件和收率：参见图7(脱保护) [1082] 61)4‑((2,5‑二羟基‑4‑羧基苯基)甲基磺酰基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物Ic‑059a: [1083] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.72min；m/z＝397.1[M‑H]‑，峰面积>97％ [1084] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.94(brs,2H),10.63(brs,2H),9.71(s,2H),7.27(s,2H),6.91(s,2H),4.44(s,4H)。 [1085] HRMS:[M+H]+,C16H15O10S的计算值:399.03804,实际值:399.03768 [1086] 生物数据:IIIc‑059a:FGF‑1 IC50[μM]＝47；FGF‑2 IC50[μM]＝50；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝3.61；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝66.39；PMN ROS抑制IC50[μM]＝1；中性粒细胞粘附抑制[％]＝14.67 [1087] 实施例1.11：IVc型化合物 [1088] [1089] 方案22：X＝S [1090] 通过二甲醚合成 [1091] [1092] 合成步骤 [1093] 5‑O‑甲基龙胆酸的合成 [1094] 3‑甲酰基‑2‑羟基‑5‑甲氧基苯甲酸。向2‑羟基‑5‑甲氧基苯甲酸(24.0g，0.143mol)于三氟乙酸(190.0mL)中的混合物中加入环六亚甲基四胺(40.019g，0.285mol)。 反应回流18h。完成后，将反应冷却至环境温度，并将2M盐酸溶液(700mL)加入到混合物中，在环境温度下搅拌24h。过滤沉淀，用水(500mL)洗涤，并在真空烘箱中干燥，得到3‑甲酰基‑ 2‑羟基‑5‑甲氧基苯甲酸，为淡黄色固体(21.30g，0.11mol，77.0％)。 [1095] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.69min；m/z＝195.1[M‑H]‑，峰面积>98％ [1096] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.36(s,1H),7.62(d,J＝3.4Hz,1H),7.44(d,J＝3.4Hz,1H),3.78(s,3H)。 [1097] 3‑甲酰基‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯。向3‑甲酰基‑2‑羟基‑5‑甲氧基苯甲酸(10.0g，0.05mol)和碳酸钾‑325目(28.18g，0.20mol)于DMF(100.0mL)中的混合物中加入碘甲烷(6.7mL，0.107mol)。将所得混合物在环境温度下搅拌18h。将反应冷却至环境温度，并用冷水(400mL)处理，形成沉淀。将所得悬浮液搅拌10min，然后过滤并在真空烘箱中干燥，得到3‑甲酰基‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯，为黄色固体(8.90g,0.04mol,78.0％)。 [1098] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.95min；m/z＝225.1[M+H]+，峰面积>98％ [1099] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.27(s,1H),7.55(d,J＝3.4Hz,1H),7.41(d,J＝3.4Hz,1H),3.88(s,3H),3.87(s,3H),3.83(s,3H)。 [1100] 3‑(羟基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯。在0℃下，将硼氢化钠(16.198g，0.428mol)缓慢加入3‑甲酰基‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(48.0g，0.214mol)于MeOH(900mL)中的溶液中，并将所得混合物在环境温度下搅拌15min。真空除去溶剂，残余物溶于DCM (200mL)中，然后用水(200mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥，过滤，浓缩至干燥，得到3‑(羟基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯，为白色固体(45.6g,0.20mol,95.0％)。 [1101] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.84min；无电离，峰面积>98％ [1102] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.20(d,J＝3.2Hz,1H),7.08(d,J＝3.3Hz,1H),5.24(t,J＝5.7Hz,1H),4.54(d,J＝5.6Hz,2H),3.83(s,3H),3.76(s,3H),3.68(s,3H)。 [1103] 3‑(氯甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯。在环境温度下，在30min内向3‑(羟基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(45.60g，0.20mol)溶液中滴加亚硫酰氯(17.2mL，0.235mol)。将所得混合物在环境温度下搅拌18h。完成后，用饱和碳酸钠水溶液(3x500mL)和盐水(500mL)洗涤反应混合物。有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥，得到3‑(氯甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯，为棕色固体(49.1g,0.18mol,90％) [1104] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.10min；无电离，峰面积>92％ [1105] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.29(d,J＝3.2Hz,1H),7.22(d,J＝3.3Hz,1H),4.74(s,2H),3.85(s,3H),3.77(s,3H),3.76(s,3H)。 [1106] 3‑(乙酰基硫代甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯。在环境温度下，将硫代乙酸钾(15.54g，0.136mol)加入到3‑(氯甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(22.20g，0.091mol)于THF(500.0mL)中的溶液中。将反应混合物在75℃搅拌18h。完成后，减压除去溶剂，得到红色油状残余物，其用饱和盐水溶液(500mL)处理，然后用二乙醚(2x250mL)萃取。合并有机相，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥，得到3‑(乙酰基硫代甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯，为棕色固体(25.50g，0.09mol，99％)。 [1107] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.10min；无电离，峰面积>92％ [1108] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.12(d,J＝3.3Hz,1H),7.10(d,J＝3.2Hz,1H),4.10(s,2H),3.84(s,3H),3.74(s,3H),3.70(s,3H),2.35(s,3H)。 [1109] 3‑(巯基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯。在0℃下，在氮气气氛下向3‑(乙酰基硫代甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(25.5g,89.68mmol)于干甲醇(800mL)中的溶液中以滴加方式加入甲醇钠(5.81g,107.62mmol)溶液。将混合物在室温下搅拌45min，然后用Dowex + X8(H)离子交换树脂淬灭，并搅拌15min。过滤后，减压蒸发溶剂，得到棕色油状粗产物(其含有所需产物和相应的二硫化物化合物，比例为2:1)。将残余物溶于DMF(400.0mL)中，并在氮气气氛下用二硫苏糖醇(DTT)(33.95g，0.26mol)处理。将反应混合物在75℃搅拌18h。完成二硫化物向硫醇的转化后，蒸发溶剂。将所得残余物溶于DCM(1L)，用盐水(7x500mL)洗 涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥，得到均质的3‑(巯基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯，为棕色油(21.40g，88.32mmol，99％)。 [1110] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.05min；m/z＝243.1[M+H]+，峰面积>95％ [1111] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.19(d,J＝3.2Hz,1H),7.09(d,J＝3.3Hz,1H),3.83(s,3H),3.76(s,3H),3.73(s,3H),3.71(d,J＝8.0Hz,2H),2.93(t,J＝8.0Hz,1H)。 [1112] 二甲基3,3’‑(硫代双(亚甲基))双(2,5‑二甲氧基苯甲酸酯)。在氮气气氛下，向3‑(巯基甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(21.40g，88.32mmol)和3‑(氯甲基)‑2,5‑二甲氧基苯甲酸甲酯(22.69g，92.74mmol)的溶液中加入三乙胺(19.0mL，136.61mmol)。反应在环境温度下搅拌18h。完成后，在真空下除去溶剂，得到棕色油状残余物，其用水(1L)处理，然后用二乙醚(3x500mL)萃取。合并有机相，用盐水(5×250mL)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并浓缩至干燥，得到棕色油状的粗产物，其通过硅胶色谱纯化：用乙酸乙酯(0至20％)于异己烷中进行梯度洗脱，得到二甲基3,3’‑(硫代双(亚甲基))双(2,5‑二甲氧基苯甲酸酯)，为棕色固体(29.9g，66.37mmol，76％)。 [1113] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.22min；m/z＝451.2[M+H]+，峰面积>92％ [1114] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.12–7.08(m,4H),3.83(s,6H),3.76(s,4H),3.73(s,6H),3.67(s,6H)。 [1115] 3,3’‑(硫代双(亚甲基))双(2,5‑二甲氧基苯甲酸)。将氢氧化锂一水合物(1.0g，23.83mmol)于水(30.0mL)中的溶液加入到二甲基3,3’‑(硫代双(亚甲基))双(2,5‑二甲氧基苯甲酸酯)(2.0g，4.44mmol)于THF(100.0mL)中的溶液中。将反应在环境温度下搅拌48h。 完成后，向反应中加入水(100mL)，并用乙酸乙酯(100mL)洗涤混合物。水层用1M含水盐酸酸化至pH＝2，并用乙酸乙酯(3X100mL)萃取。收集有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩，得到3, 3’‑(硫代双(亚甲基))双(2,5‑二甲氧基苯甲酸)，为棕色固体(1.91g，4.11mmol，93％)。 [1116] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.93min；m/z＝421.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1117] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ12.96(s,2H),7.10(d,J＝3.3Hz,2H),7.08(d,J＝3.2Hz,2H),3.76(s,4H),3.73(s,6H),3.69(s,6H)。 [1118] 3‑[(2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基)甲硫基甲基]‑2,5‑二羟基苯甲酸。在0℃下，向先前的硫醚(5.0g，0.01mol)于DCM(200.0mL)中的溶液中缓慢加入三溴硼烷于DCM(100.7mL，0.101mol)中的1M溶液，并将反应混合物回流48h。之后，过滤固体，用DCM(500mL)洗涤，然后悬浮在1M盐酸溶液(50mL)中。将所得混合物回流2h。过滤并干燥所得棕色悬浮液，得到粗产物，其通过反相柱色谱(25g，MeCN:H2O 5％至95％，12CV)纯化，得到2,5‑二羟基‑3‑[(2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基)甲硫基甲基]苯甲酸，为白色固体(1.1g，0.003mol，26％)。 [1119] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.70min；m/z＝365.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1120] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.86(s,2H),11.09(s,2H),9.14(s,2H),7.08(d,J＝3.1Hz,2H),7.02(d,J＝3.1Hz,2H),3.65(s,4H)。 [1121] 实施例： [1122] 62)3‑((2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基)甲硫基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IVc‑058a： [1123] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.70min；m/z＝365.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1124] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.86(s,2H),11.09(s,2H),9.14(s,2H),7.08(d,J＝3.1Hz,2H),7.02(d,J＝3.1Hz,2H),3.65(s,4H)。 [1125] HRMS:[M+H]+,C16H15O8S的计算值:367.04822,实际值:367.04734 [1126] 生物数据:IVc‑058a:FGF‑1 IC50[μM]＝36；FGF‑2 IC50[μM]＝4.9；VEGF‑A1 IC50[μM]＝83；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝0.53；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝77.04；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.29；中性粒细胞粘附抑制[％]＝43.5；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝10.6；IL‑1βIC50[μM]＝27.5；IL‑2 IC50[μM]＝3.82；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.21；IL‑9 IC50[μM]＝31.1；IL‑10 IC50[μM]＝16.4；IL‑12p70 IC50[μM]＝4.23；IL‑13 IC50[μM]＝55.9；IL‑17A IC50[μM]＝0.1； IL‑17F IC50[μM]＝86.8；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝3.2；IL‑33 IC50[μM]＝33.9；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.18；TNFβIC50[μM]＝59.3。 [1127] 方案23：X＝SO2 [1128] [1129] 从化合物IVc‑058a的合成 [1130] 3‑((2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基)甲基磺酰基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸。向硫醚IVc‑058a(4.25g，9.28mmol)于DMF(20.0mL)中的溶液中缓慢加入3‑氯苯‑1‑碳过氧酸(mCPBA纯度等级≤77％，5.80g，25.88mmol)于DMF(20.0mL)中的溶液。反应混合物在环境温度下搅拌 18h。将粗产物进行HPLC纯化(参见通用条件)，得到白色固体(3.20g)，其用1M HCl(50mL)研磨，得到所需产物，为白色固体(2.55g，6.40mmol，56％)。 [1131] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.68min；m/z＝397.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1132] 63)3‑((2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基)甲基磺酰基甲基)‑2,5‑二羟基苯甲酸，化合物IVc‑059a: [1133] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.68min；m/z＝397.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1134] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.24(s,1H),9.32(s,1H),7.21(d,J＝3.1Hz,1H),7.09(d,J＝3.1Hz,1H),4.44(s,2H)。 [1135] 13C NMR(100MHz,DMSO‑d6)δ172.4,153.4,149.2,117.4,116.1(CH),113.3(CH),53.6(CH2)。 [1136] HRMS:[M+H]+,C16H15O10S的计算值:399.03804,实际值:399.03775 [1137] 生物数据:IVc‑059a:FGF‑1 IC50[μM]＝6.7；FGF‑2 IC50[μM]＝2.7；VEGF‑A1 IC50[μM]＝12；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝4.8；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝74；PMN ROS抑制IC50[μM]＝0.147；中性粒细胞粘附抑制[％]＝10；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝>100；IFNγIC50[μM]＝4.34；IL‑1βIC50[μM]＝38.6；IL‑2 IC50[μM]＝21.2；IL‑4 IC50[μM]＝> 100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.11；IL‑9 IC50[μM]＝0.4；IL‑10 IC50[μM]＝1.31；IL‑12p70 IC50[μM]＝42；IL‑13 IC50[μM]＝>100；IL‑17A IC50[μM]＝0.16；IL‑ 17F IC50[μM]＝>100；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝1.87；IL‑33 IC50[μM]＝ 27.5；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.16；TNFβIC50[μM]＝0.33 [1138] 二甲酯 [1139] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.94min；m/z＝427.1[M+H]+，峰面积>95％ [1140] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.28(s,2H),9.43(s,2H),7.21(d,J＝3.1Hz,2H),7.13(d,J＝3.1Hz,2H),4.47(s,4H),3.91(s,6H)。 [1141] HRMS:[M+H]+,C18H19O10S的计算值:427.06934,实际值:427.06942 [1142] 生物数据:IVc‑059a‑E2:FGF‑1 IC50[μM]＝78；FGF‑2 IC50[μM]＝94；VEGF‑A1 IC50[μM]＝200；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝2.7；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝45.67；PMN ROS抑制IC50[μM]＝2.64；中性粒细胞粘附抑制[％]＝50.5 [1143] 四乙酸二甲酯 [1144] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.05min；m/z＝593.1[M‑H]‑，峰面积>95％ [1145] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.75(d,J＝2.8Hz,2H),7.53(d,J＝2.9Hz,2H),4.65(s,4H),3.81(s,6H),2.31(s,6H),2.23(s,6H)。 [1146] HRMS:[M+H]+,C26H27O14S的计算值:595.11160,实际值:595.11149 [1147] 生物数据:IVc‑059a‑E2‑A4:FGF‑1 IC50[μM]＝54；FGF‑2 IC50[μM]＝200；VEGF‑A1 IC50[μM]＝25；VEGFR‑磷酸化抑制IC50[μM]＝ND；PMN ROS[在0.3μM的抑制[％]＝29.17；PMN ROS抑制IC50[μM]＝4.13；中性粒细胞粘附抑制[％]＝87.5；全血:GM‑CSF IC50[μM]＝1.83；IFNγIC50[μM]＝3.5；IL‑1βIC50[μM]＝14.1；IL‑2 IC50[μM]＝10.4；IL‑4 IC50[μM]＝>100；IL‑5 IC50[μM]＝>100；IL‑6 IC50[μM]＝0.99；IL‑9 IC50[μM]＝2.9；IL‑ 10 IC50[μM]＝16.8；IL‑12p70 IC50[μM]＝51.4；IL‑13 IC50[μM]＝18.7；IL‑17A IC50[μM]＝0.02；IL‑17F IC50[μM]＝25.8；IL‑18 IC50[μM]＝>100；IL‑21 IC50[μM]＝>100；IL‑ 33 IC50[μM]＝23.2；TGFβIC50[μM]＝>100；TNFαIC50[μM]＝0.3；TNFβIC50[μM]＝19.4[1148] IVc‑059a的替代的、可扩展的合成 [1149] 方案24：由2,5‑二苄氧基邻苯二甲醛合成IVc‑059a [1150] [1151] 2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲醛[步骤1]：将2,5‑双(苄氧基)‑间苯二甲醛(25.0g，72.1mmol)(参见方案9b)溶于THF(150mL)中，并加入EtOH(15mL)。将棕色溶液保持在正氮气流下，并在室温下搅拌10min，然后在20min内分批加入固体NaBH4(695mg，18.37mmol)，不允许反应的内部温度超过25℃(使用水浴)。将反应混合物在室温下搅拌 30min，然后每隔15min加入另外的NaBH4，直至原料完全转化(总计：107mg，分两份)。然后将反应混合物倒入水(1.2L)中并搅拌20min。通过过滤分离如此形成的棕色沉淀，所得固体在 40℃真空烘箱中进一步干燥，直至质量恒定，得到标题化合物(22.9g，76％校正收率)，为棕色油。NMR谱显示83％的所需产物、15％的过度还原的二醇、2％的原料，该物质进入下一步，不进一步纯化。 [1152] UPLC‑MS(酸性法，2min):r.t＝1.19min，86％，m/z＝347.2[M‑H]‑ [1153] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.11(s,1H),7.52–7.28(m,11H),7.19(d,J＝3.3Hz,1H),5.34(t,J＝5.6Hz,1H),5.15(s,2H),4.99(s,2H),4.60(d,J＝5.6Hz,2H)。 [1154] 2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲酸[步骤2]：将2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲醛(44.3g，103mmol，81％纯度)和KH2PO4(25.9g，190mmol)溶于丙酮(440mL)和水(130mL)中。加入间苯二酚(21.0g,191mmol)，将反应混合物在室温下搅拌10min。在30min内缓慢加入亚氯酸钠(21.5g，191mmol)于水(60mL)中的溶液，使内部温度不超过25℃。将反应混合物在室温下搅拌3h，加入2M H3PO4水溶液(95mL)。将混合物搅拌20min，用冰浴冷却至6℃，然后过滤。将固体进一步用水洗涤，直至滤液的pH值为～6。将所得固体悬浮在水中 (c.a.300mL)，加入预先冷却的(5‑10℃)NaOH(17g，412mmol)于水(200mL)中的溶液。将悬浮液在室温下搅拌30min，然后在烧结漏斗上过滤。分离出的固体进一步用1M含水NaOH (2x50mL)和水(50mL)洗涤。然后使用预冷(5‑10℃)的6N HCl水溶液将碱液酸化至pH～1。将所得悬浮液磁力搅拌20min，然后过滤，所得固体在40℃真空烘箱中进一步干燥，直至质量恒定，得到标题化合物，为浅米色固体(34.8g，88％)。 [1155] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.06min，99％，m/z＝363.2[M‑H]‑。 [1156] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.02(s,1H),7.51–7.31(m,10H),7.28(d,J＝3.2Hz,1H),7.22(d,J＝3.3Hz,1H),5.21(s,1H),5.12(s,2H),4.88(s,2H),4.53(s,2H)。 [1157] 2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲酸乙酯[步骤3]：将2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲酸(32.5g，89.3mmol)和Cs2CO3(32.3g，99.2mmol)悬浮在DMF(200mL)中，并向反应混合物中加入碘乙烷(9.0mL，112mmol)。在室温下搅拌3h后，将反应混合物倒入NH4Cl饱和水溶液(1L)中，并加入固体NaCl(～30g)。搅拌10min后，用EtOAc(2x500mL)萃取该物质。将收集的有机层用盐水(2×500mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到棕色油状残余物(42.0g，粗，89.3mmol)。粗物质用于下一步，不进一步纯化。 [1158] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.24min，93％，m/z＝弱电离。 [1159] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.51–7.32(m,10H),7.31(d,J＝3.3Hz,1H),7.22(d,J＝3.3Hz,1H),5.24(t,J＝5.6Hz,1H),5.13(s,2H),4.87(s,2H),4.54(d,J＝5.6Hz,2H), 4.26(q,J＝7.1Hz,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H) [1160] 2,5‑双(苄氧基)‑3‑(氯甲基)苯甲酸乙酯(KI‑14)[步骤4]：在惰性气氛(N2)下，将2,5‑双(苄氧基)‑3‑(羟基甲基)苯甲酸乙酯(42g前步骤的粗物质，89.3mmol)溶于DCM (200mL)中，然后在0℃(冰浴)下加入SOCl2(9.8mL，133.9mmol)，使反应混合物升温至室温。 2h后，减压除去挥发物，然后用甲苯(3×100mL)进行共沸蒸馏，得到半固体棕色油(38.0g，粗，89.3mmol)。 [1161] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.40min，91％，m/z＝弱电离。 [1162] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.54–7.26(m,12H),5.14(s,2H),4.95(s,2H),4.71(s,2H),4.28(q,J＝7.1Hz,2H),1.28–1.22(t,J＝7.1Hz,3H)。 [1163] 双(2,5‑二苄氧基‑3‑乙氧基羰基苯基甲基)硫醚[步骤5]：向KI‑14(38.0g，粗物质，89.3mmol)于DMF(420mL)中的溶液中加入硫代乙酰胺(8.4g，111.8mmol)，然后加入K2CO3‑325目(16.7g，120.8mmol)。将反应在45℃加热48h。将反应冷却至室温，然后加入硫代乙酰胺(2.5g,33.3mmol)和K2CO3‑325目(5.0g,36.1mmol)，并在45℃进一步搅拌18h，以完成反应。将反应混合物倒入水(4L)中。将反应混合物搅拌20min，然后加入EtOAc(2L)，然后加入固体NaCl(～60g)。分离各相，然后使用EtOAc(1.5L)再萃取。将收集的有机层用盐水 (1.5L)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到粗标题化合物(39.8g，44.6mmol)，为棕色油，其用于下一步，不进行纯化。 [1164] UPLCMS(酸性法，2min):rt＝1.57min，m/z＝800.5[M+NH4]+，峰面积77％。 [1165] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.46–7.17(m,24H),5.05(s,4H),4.83(s,4H),4.23(q,J＝7.1Hz,4H),3.73(s,4H),1.20(t,J＝7.1Hz,6H)。 [1166] 双(2,5‑二苄氧基‑3‑乙氧基羰基苯基甲基)砜[步骤6]：向双(2,5‑二苄氧基‑3‑乙氧基羰基苯基甲基)硫化物(39.8g粗品，44.6mmol)于乙酸(850mL)中的溶液中缓慢加入30重量％的过氧化氢溶液(50mL，490mmol)。将反应在室温下搅拌18h。将反应混合物倒入冰/水(5L)中，在室温下搅拌30min，然后加入EtOAc(2L)和固体NaCl(～40g)。相分离后，水层用EtOAc(1L)再萃取一次。收集的有机层用盐水(1.5L)洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩，得到棕色固体。将固体悬浮在MTBE(250mL)中，磁力搅拌30min，然后过滤，用MTBE(150mL)进一步研磨，得到标题化合物(23.56g，28.9mmol，经过4个步骤收率为64％)。 [1167] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.48min；m/z＝832.5[M+NH4]+，峰面积96％ [1168] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.50–7.24(m,24H),5.08(s,4H),4.85(s,4H),4.50(s,4H),4.26(q,J＝7.1Hz,4H),1.25–1.17(m,6H)。 [1169] 双(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基苯基甲基)砜[步骤7]：将氢氧化锂(9.7g，233mmol)于水(100mL)中的溶液加入到双(2,5‑二苄氧基‑3‑乙氧基羰基苯基甲基)砜(33.3g，38.8mmol)于THF(350mL)中的溶液中，并将所得混合物在回流下搅拌18h。在此之后，减压除去大部分THF，得到白色悬浮液。加入水(3L)和氢氧化钠水溶液(1M，1L)后，混合物仍为悬浮液。将悬浮液在室温下搅拌18h，加入6M盐酸水溶液将水层酸化至pH～1，过滤收集所得固体，用水洗涤，直至液体呈中性，将由此获得的白色固体在40℃的真空烘箱中进一步干燥，直至质量恒定，得到标题化合物，其为白色固体(29.4g，38.7mmol，99％)。 [1170] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.39min；m/z＝757.1[M‑H]‑，峰面积100％ [1171] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.23(s,2H),7.47–7.25(m,24H),5.08(s,4H),4.88(s,4H),4.48(s,4H)。 [1172] 双(2,5‑二羟基‑3‑羧基苯基甲基)砜[步骤8]，IVc‑059a：向双(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基苯基甲基)砜(10.08g，13.28mmol)于EtOH(140mL)和THF(140mL)中的悬浮液中加入钯/炭(20重量％，2g)(为在水中的悬浮液(20mL))。几个真空/氢气循环后，将混合物保持在25℃的H2气氛下并搅拌20h。完成后，使用THF通过 过滤混合物。减压浓缩滤液，得到 灰白色固体。然后将残余物悬浮在乙腈(100mL)中，并在磁力搅拌下加热至回流，然后将混合物冷却至‑5℃，然后过滤并进一步用冷乙腈洗涤。产物在40℃真空烘箱中进一步干燥，直至质量恒定，得到所需产物，为白色固体(5.35g,12.78mmol,96％)。 [1173] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.67min；m/z＝397.1[M‑H]‑，峰面积100％ [1174] NMR数据：参见上文。 [1175] 实施例1.12‑V型分子：参考化合物 [1176] 衍生自5‑羟基间苯二甲酸的二酰胺 [1177] 2个实施例 [1178] [1179] 合成方案和步骤 [1180] 方案25：V‑001a的合成 [1181] [1182] 酰胺键的形成 [1183] 参见使用苯胺A(2摩尔)或5‑氨基水杨酸甲酯进行酰胺偶联的通用步骤B[3B] [1184] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1185] 详情参见图8 [1186] 例如 [1187] [1188] 64)5‑羟基间苯二甲酸双‑N‑(4‑羧基‑2,5‑二羟基苯基)酰胺(V‑001a) [1189] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝0.72min；m/z＝483.0[M+H]+，峰面积>95％ [1190] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.28(s,1H),9.83(s,2H),9.48(s,2H),7.92(s,1H),7.68(s,2H),7.52(d,J＝1.5Hz,2H),7.30(s,2H)。 [1191] 二乙酯 [1192] UPLC‑MS(酸性法，2min):rt＝1.09min；m/z＝539.2[M‑H]‑，峰面积94％ [1193] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.23(s,2H),9.92(s,2H),9.49(s,2H),7.91(s,1H),7.73(s,2H),7.51(d,J＝1.5Hz,2H),7.32(s,2H),4.35(q,J＝7.1Hz,4H),1.34(t,J＝ 7.1Hz,6H)。 [1194] [1195] 65)5‑羟基间苯二甲酸双N‑(3‑羧基‑4‑羟基苯基)酰胺(V‑002a) [1196] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.00min；m/z＝451.1[M‑H]‑，峰面积97％ [1197] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.31(s,2H),10.11(s,1H),8.28(d,J＝2.7Hz,2H),7.98(m,1H),7.89(dd,J＝9.0,2.7Hz,2H),7.50(d,J＝1.5Hz,2H),6.97(d,J＝9.0Hz,2H)。 [1198] 脲连接的龙胆酸单元1个实施例 [1199] [1200] 合成方案和步骤 [1201] 方案26：V‑003a的合成 [1202] [1203] 尿素键的形成 [1204] 从KI‑1的步骤： [1205] N,N’‑双(2,5‑二苄氧基‑4‑乙氧基羰基苯基)脲。在惰性气氛(N2)下，向2,5‑双(苄氧基)‑4‑(乙氧基羰基)苯甲酸(KI‑1)(2.0g，4.9mmol)和Et3N(1.6mL，11.3mmol)于THF(25mL)中的冷却溶液(冰浴)中缓慢加入DPPA(1.1mL，5.2mmol)。将混合物缓慢升温至室温，并在此温度下搅拌3h。然后加入tBuOH(8mL)，并将反应混合物在室温下搅拌18h。反应曲线显示大部分脲键产物，而不是所需的Boc‑苯胺。将混合物倒入饱和碳酸氢钠溶液(250mL) 中，搅拌5min，然后用EtOAc(3x50mL)萃取。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到无色油。残余物通过快速柱色谱(异己烷/EtOAc 1:0，然后梯度至30％EtOAc)纯化，得到标题化合物(1.1g，56％)，为灰白色固体。 [1206] UPLC‑MS(碱性法，2min):rt＝1.50min；m/z＝781.2[M+H]+，峰面积85％ [1207] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ9.49(s,2H),8.18(s,2H),7.58–7.45(m,8H),7.43–7.35(m,8H),7.35–7.28(m,6H),5.27(s,4H),5.11(s,4H),4.22(q,J＝7.1Hz,4H),1.24(t,J＝7.1Hz,6H)。 [1208] 脱保护步骤：参见通用步骤[4]、[5] [1209] 详情参见图8 [1210] 例如 [1211] 66)N,N’‑双(2,5‑二羟基‑4‑羧基苯基)脲(V‑003a) [1212] [1213] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝0.90min；m/z＝363.1[M‑H]‑，峰面积93％ [1214] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ13.36(s,2H),10.86(s,2H),9.64(s,2H),9.48(s,2H),7.77(s,2H),7.17(s,2H)。 [1215] 二乙酯 [1216] UPLC‑MS(酸性法，4min):rt＝1.79min；m/z＝419.2[M‑H]‑，峰面积97％ [1217] 1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ10.26(s,2H),9.74(s,2H),9.53(s,2H),7.81(s,2H),7.20(s,2H),4.32(q,J＝7.1Hz,4H),1.33(t,J＝7.1Hz,6H)。 [1218] 实施例1.13：盐的形成 [1219] a)固体。 [1220] 通用方案：通过以下步骤得到固体形式的盐：向所需化合物于水中的溶液或悬浮液中加入适量当量的碱，超声处理直至完全溶解，根据需要加入含水HCl或过量碱将pH值调节至7.0至7.4，然后冻干溶液。替代地，可以通过溶解在DMSO中，然后用EtOH沉淀，来获得某些盐(IIc‑007a)。固体由以下碱生成：氢氧化钠、二乙胺(DEA)、赖氨酸(Lys)、葡甲胺(Meg)、三乙醇胺(TEA)。 [1221] 例如： [1222] 根据通用方案，在不调整pH值的情况下，获得了固体形式的Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a的钠盐和二乙铵盐(DEA)。 [1223] ‑在水中的近似溶解度： [1224] Ic‑007a‑DEA2:<10mg/mL [1225] Ic‑007a‑DEA3:>20mg/mL [1226] IIc‑007a‑DEA1:>10mg/mL [1227] IIc‑007a‑DEA2:>20mg/mL [1228] IIIc‑061a‑DEA3:>25mg/mL [1229] ‑游离酸和盐作为固体的稳定性： [1230] 游离酸Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a和以下盐Ic‑007a‑DEA2、IIc‑007a‑DEA2、IIIc‑061a‑DEA3在4℃、20℃和40℃温度下以固体形式稳定达56d；盐Ic‑007a‑DEA3在相同温度下稳定达36d。 [1231] b)溶液 [1232] 通用方案：通过以下步骤获得溶液形式的盐：通过向所需化合物于水中的溶液或悬浮液中加入适量当量的碱，超声处理直至完全溶解，并在需要时通过加入含水HCl或过量碱将pH值调节至7.0至7.4。研究了以下碱：乙胺、三乙胺、乙二胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胆碱、葡甲胺、赖氨酸和精氨酸。 [1233] 例如： [1234] Ic‑007a的盐： [1235] 在40℃下搅拌混合物2d后，用葡甲胺、赖氨酸和二乙醇胺获得可溶性盐。通过用乙醇沉淀，从DMSO获得固体形式的Ic‑007a‑Lys2盐。该盐在室温下作为水溶液稳定至少7d。 [1236] IIc‑007a的盐： [1237] DEA1‑盐：在小规模中，通过通用步骤获得单二乙基铵盐，无需调整pH值。溶解度：母体二酸为17.4mg/mL相对于1.8mg/mL [1238] 大规模工艺和表征： [1239] 向IIc‑007a(20g，42.7mmol)中装入EtOH(200ml)。在RT下搅拌反应，得到浆液。装入DEA(4.4ml，42.7mmol)，反应在50℃下加热2h。将批料冷却至室温(RT)，滤出固体。用EtOH(50mL)洗涤滤饼，并在40℃下烘干，得到21.5g黄色固体的单‑DEA盐，收率为98％。NMR:1.6％EtOH，1.04eq DEA.HPLC:99.6％。 [1240] IIc‑007a的单‑DEA盐的固态数据在XRPD分析中显示出清晰的结晶模式。TGA迹线显示EtOH<120℃的少量损失，这表明EtOH可在60‑80℃下干燥。然后观察到与DSC中的熔体吸热(峰值在273.8℃)相关的DEA(1:1盐理论上为13.5重量％)的损失，随后是游离酸形式 的熔融。 [1241] DEA2‑盐，pH调节：通过pH调节的通用步骤获得(达到pH＝7.25还需要0.51当量的Et2NH)。溶液中的盐在40℃下21d后出现明显降解，在80℃下24h后出现大量降解。 [1242] DEA2‑盐，pH未调节：通过通用步骤获得，无需pH调节。溶液的pH＝5.87。在4℃、20℃和40℃下21d后，溶液中的盐未表现出降解。 [1243] Lys2‑盐，pH未调节：使用2当量L‑赖氨酸通过通用步骤获得。溶液的pH＝5.74。 [1244] 注：与2‑羟基间苯二甲酸的双(N‑甲基)酰胺类似(苯酚的pKa＝6.81)，IIc‑007a的间苯二甲酸双酰胺核的2‑OH基团呈显著酸性，其电离导致分子降解。对于Ic‑007a未观察到这种影响(酚官能团的预期pKa在9.8‑10.0范围内)。因此，不调节IIc‑007a双阳离子盐溶液的pH值很重要。 [1245] IIIc‑061a的盐： [1246] DEA3‑盐，pH调节：通过具有pH调节的通用步骤使用3当量的Et2NH获得(达到最终pH＝7.22还需要0.8当量的HCl(0.5M))。溶液中的盐在4℃、20℃下21d后未降解，在40℃下 33d后略有降解。 [1247] Meg3‑盐，pH调节：通过通用步骤使用3当量的葡甲胺获得，其中pH调节至最终pH＝7.22(HCl 0.5M)。在4℃、20℃下21d和40℃下14d后，溶液中的盐未降解。 [1248] IVc‑059a的盐， [1249] DEA2‑盐，pH调节：通过具有pH调节的通用步骤获得(达到pH＝7.3还需要0.32当量的Et2NH)。溶液中的盐在4℃、20℃和40℃下26d后表现出稳定性。 [1250] 实施例1.14：前药 [1251] Ic‑007a的前药 [1252] 1)2‑吗啉代乙基5‑[[2,5‑二羟基‑4‑[[4‑羟基‑3‑(2‑吗啉代乙氧基羰基)苯基]氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基苯甲酸酯(Ic‑007a‑mpe2) [1253] [1254] 酯化。在室温下搅拌5‑[[2,5‑二苄氧基‑4‑[(3‑羧基‑4‑羟基苯基)氨基甲酰基]‑苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(130mg，0.2mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(4ml)中的悬浮液。加入N,N‑二甲基吡啶‑4‑胺(49mg，0.4mmol)和2‑吗啉代乙醇(53mg，0.4mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(0.5ml)中的溶液。加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(115mg， 0.6mmol)，将反应混合物在微波反应器中于60℃加热1.5小时。过滤反应混合物，用四氢呋喃稀释滤液，蒸发溶剂。残余物通过硅胶色谱纯化，用0‑40％甲醇于二氯甲烷中洗脱，得到标题产物，为白色固体(80mg，45％)。LCMS(m/z)[M+H]875.1。 [1255] 氢解：制备上述获得的二酯(80mg，0.092mmol)于四氢呋喃(12ml)和水(4ml)中的溶液，加入10％钯/碳(50mg，10％糊剂)。将反应混合物在氢气气氛下搅拌17小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂。残余物通过反相制备型HPLC在C18柱上使用10‑97％(乙腈+0.1％甲酸): (水+0.1％甲酸)的梯度纯化。将残余物用二乙醚研磨，真空干燥，得到标题产物Ic‑007a‑mpe2，黄色固体的(22mg，35％)。 [1256] 1H NMR(d6‑DMSO ppm)δ11.16‑11.00(br s,1H),10.46(s,1H),10.45‑10.15(br s,1H),8.25(d,J＝2.7Hz,1H),7.77(dd,J＝9.0,2.7Hz,1H),7.53(s,1H),7.01(d,J＝9.0Hz,1H),4.46(t,J＝5.4Hz,2H),3.62‑3.56(m,4H),2.77‑2.69(m,2H),2.56‑2.50(m,4H,被DMSO峰部分遮挡)。LCMS(m/z)[M+H]695.0。 [1257] 2)5‑[[2,5‑二羟基‑4‑[[4‑羟基‑3‑(2‑吗啉代乙氧基羰基)苯基]氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(Ic‑007a‑mpe1) [1258] [1259] 酯化。在室温下搅拌5‑[[2,5‑二苄氧基‑4‑[(3‑羧基‑4‑羟基‑苯基)‑氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(324mg，0.5mmol)和三乙胺(101mg，0.15ml，1mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(7ml)中的溶液。加入2‑吗啉代乙醇(66mg，0.5mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(1ml)和N,N‑二甲基吡啶‑4‑胺(122mg，1mmol)中的溶液。加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(115mg，0.6mmol)，将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后在微波中于 60℃加热4小时。以类似的规模重复该反应，并将反应混合物合并。蒸发溶剂，残余物用乙醚研磨，得到单酯和二酯的混合物(230mg)。LCMS(m/z)[M+H]762.0(单酯)。 [1260] 氢解。将上述获得的单酯和二酯的混合物(230mg)溶解在乙酸(10ml)、四氢呋喃(15ml)和水(5ml)中，加入10％钯/碳(150mg，10％糊剂)。将反应混合物在氢气气氛下搅拌 16小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂，得到黄色胶状物(140mg)。残余物通过反相制备型HPLC在C18柱上使用10‑70％(乙腈+0.1％甲酸):(水+0.1％甲酸)的梯度纯化。残余物用二乙醚 研磨，真空干燥，得到标题单酯Ic‑007a‑mpe1，为黄色固体(11mg)。 [1261] 1H NMR(d6‑DMSO ppm)δ11.33‑11.29(br s,1H),11.13‑10.08(br s,1H),10.50‑10.44(br s,2H),10.36‑10.30(br s,1H),8.25(d,J＝2.4Hz,1H),8.06‑8.02(m,1H),7.78 (dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),7.69‑7.60(m,2H),7.52(s,1H),7.01(d,J＝9.0Hz,1H),6.75(d,J ＝8.7Hz,1H),4.50‑4.45(m,2H),3.65‑3.55(m,4H),2.81‑2.71(m,2H),2.60‑2.50(m,4H,被DMSO峰部分遮挡)。LCMS(m/z)[M+H]582.0。 [1262] 3)1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙基5‑[[4‑[[3‑[1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙氧基羰基]‑4‑羟基‑苯基]氨基甲酰基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸酯(Ic‑007a‑pive2) [1263] 和 [1264] 4)5‑[[4‑[[3‑[1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙氧基羰基]‑4‑羟基‑苯基]氨基甲酰基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(Ic‑007a‑pive1) [1265] [1266] 酯化。将5‑[[2,5‑二苄氧基‑4‑[(3‑羧基‑4‑羟基‑苯基)氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(324mg，0.5mmol)和三乙胺(152mg，0.21mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液在0℃下搅拌，加入1‑碘乙基2,2‑二甲基丙酸酯(572mg，2mmol)。使反应混合物升温至室温，在室温下搅拌24小时。蒸发二甲基甲酰胺，残余物在二氯甲烷和含水焦亚硫酸钠之间分配。有机相用无水硫酸镁干燥并蒸发，得到单酯和二酯的1:1混合物(187mg)。重复该反应，并将酯的1:1混合物合并。LCMS(m/z)[M+H]777.0(单酯)和905.1(二酯)。 [1267] [1268] 氢解 [1269] 将上述获得的单酯和二酯的混合物(320mg)溶于四氢呋喃(50ml)和水(5ml)中，并加入10％钯/碳(300mg，10％糊剂)。将反应混合物在氢气气氛下搅拌20小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂。LCMS显示仅实现了部分脱保护。将残余物溶于四氢呋喃(36ml)和水(6ml)中，加入10％钯/碳(600mg，10％糊剂)。将反应混合物在氢气气氛下搅拌22小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂。残余物通过反相制备型HPLC在C18柱上使用40‑97％(乙腈+0.1％甲酸):(水+ 0.1％甲酸)的梯度纯化。残余物用乙醚研磨，真空干燥，得到标题产物： [1270] 二酯(Ic‑007a‑pive2)：黄色固体(60mg)。1H NMR(d6‑DMSO ppm)δ11.05(s,1H),10.46(s,1H),10.18(s,1H),8.18(br s,1H),7.83‑7.77(m,1H),7.52(s,1H),7.05‑6.96(m, 2H),1.58(d,J＝5.5Hz,3H),1.17(s,9H)。LCMS(m/z)[M+H]724.9。 [1271] 生物数据:T1/2(小鼠血浆):62.2min(酯裂解；1h后剩余65％)；T1/2(人血浆):>180min。 [1272] 单酯(Ic‑007a‑pive1)：黄色固体(35mg)。1H NMR(d6‑DMSO ppm)δ11.13(s,1H),11.06(s,1H),10.46(s,1H),10.42(s,1H),10.18(s,1H),8.21‑8.18(m,2H),8.78‑8.72(m, 2H),7.55(s,1H),7.52(s,1H),7.03‑6.92(m,3H),1.58(d,J＝5.5Hz,3H),1.17(s,9H).LCMS (m/z)[M+H]596.9 [1273] 生物数据：T1/2(小鼠血浆):44.6min(酯裂解；1h后剩余49％)；T1/2(人血浆):>180min。 [1274] IIc‑007a的前药 [1275] 1)2,2‑二甲基丙酰基氧基甲基5‑[[3‑[[3‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基甲氧基羰基)‑4‑羟基‑苯基]氨基甲酰基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸酯(IIc‑007a‑pivm2) [1276] [1277] 酯化。制备5‑[[2,5‑二苄氧基‑3‑[(3‑羧基‑4‑羟基‑苯基)氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(280mg，0.432mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺中的溶液，加入2,2‑二甲基丙酸氯甲酯(137μL，0.95mmol)，然后加入三乙胺(167μL，1.2mmol)和碘化钠(143mg，0.95mmol)。将搅拌后的溶液在50℃下加热18小时。然后将溶液冷却，并在氯化铵饱和溶液和乙酸乙酯之间分配。有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶柱色谱，使用 100％异己烷至50％乙酸乙酯、50％异己烷的梯度纯化，得到二酯，为无色胶状物(192mg， 51％)。LCMS(m/z)[M+H]876.9。 [1278] 氢解：制备上述获得的二酯(192mg，0.219mmol)于四氢呋喃(4.5mL)中的溶液，加入到10％钯/碳(40mg，0.04mmol)于水(1.5mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置 于氢气气氛下18小时。过滤反应物，除去催化剂，蒸发溶液，得到乳白色固体(142mg)。固体通过HPLC在C18柱上使用60％乙腈、40％水至100％乙腈(0.1％甲酸)的梯度纯化，得到标题 1 二酯IIc‑007a‑pivm2，为白色固体(75mg，49％)。H NMR(DMSO‑D6 ppm)δ13.03(br s,1H), 10.43(br s,2H),10.16(s,2H),9.52(br s,1H),8.17(d,J＝2.7Hz,2H),7.82(dd,J＝ 8.9Hz,2.7Hz,2H),7.55(s,2H),7.02(d,J＝8.9Hz,2H),5.98(s,4H),1.17(s,18H)。LCMS(m/ z)[M‑H]694.9。 [1279] 2)5‑[[3‑[[3‑[1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙氧基羰基]‑4‑羟基‑苯基]氨基甲酰基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(IIc‑007a‑pive1) [1280] [1281] 酯化。在0℃下，搅拌5‑[[2,5‑二苄氧基‑3‑[(3‑羧基‑4‑羟基‑苯基)氨基甲酰基]苯甲酰基]氨基]‑2‑羟基‑苯甲酸(324mg，0.5mmol)和三乙胺(101mg，0.14ml，1.0mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液。加入1‑碘乙基2,2‑二甲基丙酸酯(154mg，0.6mmol)。将反应混合物在室温下搅拌21小时。加入另外的三乙胺(0.14ml，1.0mmol)和1‑碘乙基2,2‑二甲基丙酸酯(154mg，0.6mmol)，将反应混合物在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂。残余物在二氯甲烷和焦亚硫酸钠溶液中分配。合并有机萃取物，用盐水洗涤，并使溶液通过疏水玻璃料干燥。蒸发滤液，得到单酯和二酯的混合物。残余物通过硅胶色谱纯化，使用5‑100％乙酸乙酯于异己烷中洗脱，然后用10％甲醇于二氯甲烷中洗脱，得到单酯，为黄色固体(121mg)。LCMS(m/z)[M+H]777。 [1282] 氢解。将上述获得的单酯(121mg,0.15mmol)于四氢呋喃(16ml)和含有10％钯/碳(250mg，10％糊剂)的水(4ml)中的溶液在氢气气氛下搅拌18小时。过滤除去催化剂，蒸发溶剂。残余物通过反相制备型HPLC，使用40‑97％(乙腈+0.1％甲酸):(水+0.1％甲酸)的梯度 1 纯化，得到单酯IIc‑007a‑pive1，为黄色固体(34mg)。H NMR(DMSO‑D6”ppm)δ13.15(br s, 1H),10.47(br s,2H),10.18(s,1H),9.47(br s,1H),8.21(d,J＝3Hz1H),8.17(d,J＝3Hz 1H),7.82(dd,J＝9,3Hz 1H),7.78(dd,J＝9,3Hz 1H),7.59‑7.55(m,2H),7.03(d,J＝9Hz 1H),6.99(q,J＝5.4Hz 1H),7.96(d,J＝9Hz 1H),1.58(d,J＝5.4Hz,3H),1.17(s,9H)。LCMS (m/z)[M‑H]595.1。 [1283] IVc‑059a的前药 [1284] 1)2,5‑二羟基‑3‑[[2,5‑羟基‑3‑(2‑吗啉代乙氧基羰基)苯基]甲基磺酰基甲基]苯甲酸(IVc‑059a‑mpe1) [1285] [1286] 酯化。制备2,5‑二苄氧基‑3‑[(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基苯基)甲基磺酰基‑甲基]苯甲酸(300mg，0.40mmol)和2‑吗啉代乙醇(53mg，0.40mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(93mL)中的溶液，加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC，93mg，0.48mmol)和N,N‑二甲基吡啶‑4‑胺(10mg,0.08mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将所得溶液蒸发至干燥，残余物通过HPLC在C18柱上，使用30％乙腈、70％水至100％乙腈(0.1％甲酸)的梯度纯化，得到吗啉代乙酯，为无色胶状物(111mg，32％)。LCMS(m/z)[M+H]872.1。 [1287] 氢解。将上述单酯(111mg，0.127mmol)于四氢呋喃(3mL)中的溶液加入到10％钯/碳(20mg，0.019mmol)于水(1mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢气气氛下 18小时。 [1288] 过滤反应物除去催化剂，蒸发溶液，得到棕色固体。固体通过HPLC在C18柱上使用10％乙腈、90％水至60％乙腈、40％水(0.1％甲酸)的梯度纯化，得到白色固体(20.5mg)。固体用二乙醚研磨，真空干燥，得到标题产物IVc‑059a‑mpe1，为白色固体(5mg，8％)。 [1289] 1H NMR(DMSO‑d6 ppm)δ10.33(br s,1H),9.30(s,1H)8.92(s,1H),7.08‑7.15(m,3H),6.91(d,J＝3.1Hz,1H),4.40(t,J＝5.0Hz,2H),4.36(s,2H),3.65‑3.72(m,4H),3.05 (t,J＝5.0Hz,2H),2.78‑2.87(m,4H)。LCMS(m/z)[M+H]511.9。 [1290] 生物数据：在小鼠血浆中稳定达60min [1291] 2)2,5‑二羟基‑3‑[[2,5‑羟基‑3‑(2‑吗啉代乙氧基羰基)苯基]甲基磺酰基‑甲基]苯甲酸2‑吗啉代乙酯(IVc‑059a‑mpe2) [1292] [1293] 制备2,5‑二苄氧基‑3‑[(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基苯基)甲基磺酰基甲基]苯甲酸(69mg，0.091mmol)和2‑吗啉代乙醇(25mg，0.19mmol)于N,N‑二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液，加入1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺(42mg，0.48mmol)和N,N‑二甲基吡啶‑4‑胺(5mg,0.04mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将所得溶液蒸发至干燥，残余物通过硅胶柱色谱，使用10％甲醇、90％二氯甲烷纯化，得到标题产物，为无色胶状物(58mg，65％)。LCMS(m/z)[M+H]985.0。 [1294] 制备上述获得的二酯(58mg,0.059mmol)于四氢呋喃(1.5mL)中的溶液，并加入到10％钯/碳(5mg,0.005mmol)于水(0.5mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢 气气氛下18小时。过滤反应物除去催化剂，蒸发溶液，得到棕色固体。固体通过HPLC在C18柱上使用10％乙腈、90％水至60％乙腈、40％水(0.1％甲酸)的梯度纯化，得到白色固体 (13.7mg)。 [1295] 固体用二乙醚研磨并在真空下干燥，得到标题产物IVc‑059a‑mpe2，为白色固体(9.1mg，25％)。 [1296] 1H NMR(CD3OD ppm)δ8.34(br s,2H),7.32(d,J＝3.1Hz,2H),7.16(d,J＝3.1Hz,2H),4.52(t,J＝5.5Hz,4H),4.45(s,4H),3.68‑3.73(m,8H),2.83(t,J＝5.5Hz,4H),2.58‑ 2.65(m,8H)。LCMS(m/z)[M+H]625.0。 [1297] 生物数据：在小鼠血浆中稳定达60min；T1/2(人血浆)：>180min。 [1298] 3)3‑[[3‑[1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙氧基羰基]‑2,5‑二羟基‑苯基]甲基‑磺酰基‑甲基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酸1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙酯(IVc‑059a‑pive2)[1299] [1300] 酯化。制备2,5‑二苄氧基‑3‑[(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基‑苯基)甲基‑磺酰基甲基]苯甲酸(200mg，0.263mmol)于无水N,N‑二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液，并加入三乙胺(88μL，0.63mmol)、碘化钠(8mg，0.053mmol)和粗1‑碘乙基2,2‑二甲基丙酸酯(约4.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将所得溶液蒸发至小体积，残余物在二氯甲烷和硫代硫酸钠 溶液之间分配。有机层通过疏水玻璃料过滤并蒸发。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用100％异己烷至50:50乙酸乙酯/异己烷的梯度洗脱，得到二酯，为无色胶状物(110mg，41％)。LCMS(m/z)[M+Na]1037.0 [1301] 还从同一柱中分离出无色胶状物的单酯(90mg，40％)。LCMS(m/z)[M+Na]909.6。 [1302] 氢解： [1303] [1304] 将上述分离的二酯(110mg，0.108mmol)于四氢呋喃(3mL)中的溶液加入到10％钯/碳(20mg，0.02mmol)于水(1mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢气气氛下48小时。过滤反应混合物除去催化剂，蒸发溶液，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用100％二氯甲烷至10％甲醇、90％二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物IVc‑059a‑pive2，为乳白色固体(55mg，78％)。 [1305] 1H NMR(CDCl3 ppm)δ10.55(s,2H),7.24‑7.28(m,2H),7.14‑7.18(m,2H),7.05(q,J＝5.4Hz,2H),6.18(br s,2H),4.30‑4.50(m,4H),1.60(d,J＝5.4Hz,6H),1.21(s,18H)。LCMS(m/z)[M‑H]653.9。 [1306] 生物数据：在小鼠和人血浆中迅速水解 [1307] 4)3‑[[3‑[1‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基)乙氧基羰基]‑2,5‑二羟基‑苯基]甲基磺酰基‑甲基]‑2,5‑二羟基‑苯甲酸(IVc‑059a‑pive1) [1308] 氢解： [1309] [1310] 将上述分离的单酯(90mg，0.104mmol)于四氢呋喃(3mL)中的溶液加入到10％钯/碳(20mg，0.02mmol)于水(1mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢气气氛下48小时。过滤反应液除去催化剂，蒸发溶液，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用100％二氯甲烷至 20％甲醇、80％二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物IVc‑059a‑pive1，为乳白色固体 (22.5mg，43％)。 [1311] 1H NMR(CD3OD ppm)δ7.39(d,,J＝3.1Hz,1H),7.25(d,J＝3.1Hz,1H),7.18(d,J＝3.1Hz,1H),7.05(q,J＝5.4Hz,1H),6.96(d,J＝3.1Hz,1H),4.40‑4.45(m,4H),1.61(d,J＝ 5.4Hz,3H),1.21(s,9H)。LCMS(m/z)[M‑H]524.9。 [1312] 生物数据：在小鼠血浆中快速水解 [1313] 5)2,2‑二甲基丙酰基氧基甲基2,5‑二羟基‑3‑[[2,5‑二羟基‑3‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基甲氧基羰基)苯基]甲基磺酰基甲基]苯甲酸酯(IVc‑059a‑pivm2) [1314] [1315] 酯化。制备2,5‑二苄氧基‑3‑[(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基‑苯基)甲基磺酰基‑甲基]苯甲酸(100mg，0.131mmol)于无水N,N‑二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液，加入2,2‑二甲基丙酸氯甲酯(91μL，0.631mmol)，然后加入三乙胺(110μL，0.789mmol)和碘化钠(87mg，0.579mmol)。将反应混合物在50℃加热6.5小时。蒸发所得溶液，残余物在乙酸乙酯和水之间分配。有机层用硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用100％异己烷至50％乙酸乙酯、50％异己烷的梯度洗脱，得到二酯产物无色胶状物的(85mg，66％)。LCMS(m/z)[M+Na] 1010.0。 [1316] 氢解：将上述获得的二酯(85mg，0.086mmol)于四氢呋喃(3mL)中的溶液加入到10％钯/碳(20mg，0.02mmol)于水(1mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢气 气氛下18小时。过滤反应液除去催化剂，蒸发溶液，残余物通过硅胶柱色谱纯化，用100％异己烷至60％乙酸乙酯、40％异己烷的梯度洗脱，得到白色固体的二酯IVc‑059a‑pivm2 (31mg，57％)。 [1317] 1H NMR(CDCl3 ppm)δ7.29(d,J＝2.9Hz,2H),7.19(d,J＝2.9Hz,2H),5.97(s,4H),4.42(s,4H),1.22(s,18H)。LCMS(m/z)[M‑H]624.8。 [1318] 生物数据：在小鼠血浆中迅速水解，T1/2＝14.1min；T1/2(人血浆)：>180min。 [1319] 6)2,5‑二羟基‑3‑[[2,5‑二羟基‑3‑(2,2‑二甲基丙酰基氧基甲氧基羰基)苯基]甲基‑磺酰基甲基]苯甲酸(IVc‑059a‑pivm1) [1320] [1321] 酯化：制备2,5‑二苄氧基‑3‑[(2,5‑二苄氧基‑3‑羧基苯基)甲基磺酰基甲基]苯甲酸(300mg，0.395mmol)于无水N,N‑二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液，加入2,2‑二甲基丙酸氯甲酯(57μL，0.395mmol)，然后加入三乙胺(68μL，0.489mmol)和碘化钠(129mg，0.870mmol)。将反应混合物在50℃加热4小时。将所得溶液冷却，然后蒸发。残余物通过硅胶柱色谱纯化，用20％乙酸乙酯、80％异己烷至80％乙酸乙酯、20％异己烷的梯度洗脱，得到单酯产物，为白色固体(121mg，35％)。LCMS(m/z)[M‑H]871.0。 [1322] 氢解：将上述获得的单酯(121mg，0.138mmol)于四氢呋喃(3mL)中的溶液加入到10％钯/碳(20mg，0.02mmol)于水(1mL)中的搅拌悬浮液中。将搅拌的反应混合物置于氢气 气氛下48小时。过滤反应液除去催化剂，蒸发溶液，残余物通过HPLC在C18柱上纯化，用30％乙腈、70％水至100％乙腈(0.1％甲酸)的梯度洗脱，得到单酯IVc‑059a‑pivm1，为白色固体(30mg，42％)。 [1323] 1H NMR(CD3OD ppm)δ7.34(d,J＝3.0Hz,1H),7.27(d,J＝3.1Hz,1H),7.20(d,J＝3.1Hz,1H),7.08(d,J＝3.0Hz,1H),6.01(s,2H),4.45(s,4H),1.22(s,9H)。LCMS(m/z)[M‑H] 510.9。 [1324] 生物数据：在小鼠血浆中迅速水解，T1/2＝6.7min；T1/2(人血浆)：>180min。 [1325] 实施例2：通用实验方法 [1326] NMR光谱 [1327] 在Bruker Advance III NMR光谱仪上在400MHz下记录了1H NMR光谱。在氘代氯仿(CDCl3)或二甲基亚砜(DMSO‑d6)中制备样本，并使用Mnova NMR软件处理原始数据。使用 MaXis ESI qTOF超高分辨率质谱仪记录高分辨率质谱。 [1328] UPLC‑MS分析 [1329] UPLC‑MS分析在Waters Acquity UPLC系统上进行，该系统由Acquity I类样本管理器‑FL、Acquity I类二元溶剂管理器和Acquity I类UPLC柱管理器组成。UV检测采用 Acquity I类UPLC PDA检测器(扫描范围为210‑400nm)实现，而质量检测采用Acquity QDa 检测器(质量扫描范围为100‑1250Da；正负模式同时进行)实现。使用Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1×50mm，1.7mm)实现分析物的分离。 [1330] 通过将样本溶解(用或不用超声处理)到1mL的MeCN于H2O中的1:1(v/v)混合物中制备样本。将得到的溶液通过0.45μm注射器过滤器过滤，然后进行分析。使用的所有溶剂(包括甲酸和36％氨溶液)均用作HPLC级。 [1331] 这项工作使用了四种不同的分析方法，详细内容如下。 [1332] 酸性运行(2min)：0.1％v/v甲酸于水中[洗脱剂A]；0.1％v/v甲酸于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.8mL/min；注射体积2μL，样品间平衡时间1.5min。 [1333] 表14： [1334]时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％) 0.00 95 5 0.25 95 5 1.25 5 95 1.55 5 95 1.65 95 5 2.00 95 5 [1335] 酸性运行(4min)：0.1％v/v甲酸于水中[洗脱剂A]；0.1％v/v甲酸于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.8mL/min；注射体积2μL，样本间平衡时间1.5min。 [1336] 表15： [1337] 时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％)0.00 95 5 0.25 95 5 2.75 5 95 3.25 5 95 3.35 95 5 4.00 95 5 [1338] 酸性运行(6.5min)：10mM甲酸铵+0.1％v/v甲酸[洗脱剂A]；0.1％v/v甲酸于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.6mL/min；注射体积2μL。 [1339] 表16： [1340] [1341] [1342] 碱性运行(2min)：0.1％氨于水中[洗脱剂A]；0.1％氨于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.8mL/min；注射体积2μL，样本间平衡时间1.5min。 [1343] 表17： [1344] 时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％)0.00 95 5 0.25 95 5 1.25 5 95 1.55 5 95 1.65 95 5 2.00 95 5 [1345] 碱性运行(4min)：0.1％氨于水中[洗脱剂A]；0.1％氨于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.8mL/min；注射体积2μL，样本间平衡时间1.5min。 [1346] 表18： [1347] 时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％)0.00 95 5 0.25 95 5 2.75 5 95 3.25 5 95 3.35 95 5 4.00 95 5 [1348] 碱性运行(6.5min)：10mM碳酸氢铵+0.1％v/v 35％氨溶液[洗脱剂A]；0.1％v/v甲酸于MeCN中[洗脱剂B]；流速0.6mL/min；注射体积2μL。 [1349] 表19： [1350]时间(min) 洗脱剂A(％) 洗脱剂B(％) 0.00 95 5 0.50 95 5 4.00 5 95 4.50 5 95 4.52 95 5 6.50 95 5 [1351] 制备型HPLC纯化 [1352] 制备型HPLC采用配备有XBridge Prep C18柱(19x150mm)的Waters自动纯化系统进行。Waters系统由Waters 2545二元制备泵、Waters 2767样本管理器、Waters SFO柱管理器、Waters 2998DAD、Waters 515补给泵和Acquity QDa质谱仪组成。 [1353] 纯化系统由带有开放访问登录模块的MassLynx软件(4.2版)控制。 [1354] 流动相由(A)10mM甲酸铵(+0.1％v/v甲酸)和(B)乙腈(+0.1％v/v甲酸)组成。 [1355] 样本通过溶于10％v/v水于DMSO中来制备，浓度为～150mg/mL。将体积为320mL的制备好的样本装载到柱上，并在室温下以25mL/min的流速使用梯度洗脱进行纯化。进样之 间有1.5分钟的平衡时间。 [1356] 表20：梯度： [1357]时间(min) ％(A) 0.0 95 0.5 95 14.5 0 17.4 0 17.5 95 18.0 95 [1358] 实施例3：体外筛选方法 [1359] 实施例3.1：体外HUVEC细胞FGF1、FGF2和VEGF‑A抑制方法 [1360] 该体外方法的目的是在基于球状体的细胞血管生成试验中评估化合物对FGF‑2、FGF‑1或VEGF‑A诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)萌发的影响。在向细胞中加入生长因子之前，将它们与化合物预孵育。舒尼替尼作为对照进行测试(无预孵育)。 [1361] 如所预期的，舒尼替尼对照抑制FGF‑2、FGF‑1和VEGF‑A诱导的HUVEC萌发。测定的测试化合物IC50值以微M[μM]表示，在化学表征后的实施例中各化合物之后列出了FGF‑1、FGF2和VEGF‑A诱导的生长(萌发)的抑制值。 [1362] 将溶于DMSO的化合物进行萌发测试，达到100倍浓缩原液，并溶于培养基中。作为参考化合物的舒尼替尼由ProQinase GmbH提供。生长因子购自rhFGF‑碱性(FGF‑2), Peprotech,New Jersey,USA,#100‑18C,批号#0415571；rhFGF‑酸性(FGF‑1),Peprotech,New Jersey,USA,#100‑17A,批号#031207；hVEGF‑A165(ProQinase GmbH,Freiburg, Germany；05.02.2010)，用于刺激HUVEC细胞生长。 [1363] 测试系统：将来自合并供体的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与70％培养基、20％FCS、6 10％DMSO以约1x10 细胞/安瓿冷冻保存。HUVEC细胞，即原代人脐静脉内皮细胞 (PromoCell,Heidelberg,Germany)，在第3至4代后使用。细胞形态为贴壁、单层鹅卵石样生长，在内皮细胞生长培养基和基础培养基(ECGM/ECBM，PromoCell)中培养。传代培养物分裂 4 2 为1:3；每3‑5天，以约1×10 个细胞/cm接种，并在37℃下与5％CO2孵育，倍增时间24‑48小时 [1364] 测试化合物的稀释：使用适当的溶剂(于DMSO或水中)制备每种测试化合物的100倍浓缩溶液(与最终试验浓度相关)。将这些100倍化合物溶液在内皮细胞生长和基础培养 基(ECBM)中以1:7.5进一步稀释，得到13.33倍浓缩溶液。随后，将75μl的13.33倍溶液与25μl的40倍浓缩刺激物(溶解在ECBM中)混合，得到10倍浓缩刺激物/化合物混合物。将该混合 物(100μl)在37℃下孵育30min，然后加入到900μl含HUVEC球状体的凝胶中(得到最终试验浓度)。 [1365] 测试方法：实验是采用最初公布的方案(Korff and Augustin:J Cell Sci 112:3249‑58,1999)的修改方案进行的。简而言之，如(Korff and Augustin:J Cell Biol 143: 1341‑52,1998)中所述的来制备球状体，以悬滴法将400HUVEC移液到塑料皿上，使球状体聚集过夜。然后将50个HUVEC球状体接种在0.9ml的胶原凝胶中，并移液到24孔板的各个孔中，以使聚合。将测试化合物与生长因子(FGF‑1、FGF‑2或VEGF‑A最终浓度25ng/mL)在10倍浓缩溶液中预孵育，随后将100μl该溶液添加到聚合凝胶的顶部。首先将所有化合物在溶剂 (DMSO或水)中稀释为100倍原液(这意味着在溶剂中制备了每种最终试验浓度的100倍原 液)。随后，将这些原液在培养基中进一步稀释(得到每种最终试验浓度的13.33倍原液)，最‑6 终测试浓度：100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56x10 M。将板在37℃下孵育24小时，然后加入4％PFA(Roth,Karlsruhe,Germany)固定。 [1366] 生长因子抑制的定量：用生长因子和抑制剂处理的HUVEC球状体的萌发强度，通过确定每个球状体的累积萌发长度(CSL)的图像分析系统进行定量。使用倒置显微镜和数字 成像软件NIS‑Elements BR 3.0(Nikon)拍摄单个球状体的照片。随后，将球状体照片上传到Wimasis公司的主页进行图像分析。使用成像分析工具WimSprout测定每个球状体的累积 萌发长度。将10个随机选择的球状体的累积萌发长度的平均值作为单个数据点进行分析。 对于IC50测定，将原始数据转换为相对于溶剂对照(含刺激物)(设定为100％)和基础对照 (不含刺激物)(设定为0％)的HUVEC萌发百分比。IC50值使用GraphPad Prism 5软件测定， 下限为0，上限为100，使用具有可变希尔斜率的非线性回归曲线拟合。 [1367] 结果：评估了所有化合物对生长因子诱导的内皮细胞萌发的剂量反应关系。IC50值使用标准参数测定，其基于溶剂对照信号作为上限(100％HUVEC萌发)，基础对照信号作 为下限(0％)。每种化合物对FGF1、FGF2和VEGFA的各自IC50值总结在生物数据段落中每种 化合物的化学特性下方。 [1368] 实施例3.2：静态条件下的体外中性粒细胞粘附，方法 [1369] 将从健康供体的血沉棕黄层获得的人中性粒细胞以3x106/ml的浓度悬浮在粘附缓冲液(含1mM CaCl2/MgCl2和10％FCS的PBS，pH 7.2)中。中性粒细胞在37℃下与40μM和80μM的化合物预孵育30min。 [1370] 在18孔载玻片上进行粘附试验，于4℃下用人纤维蛋白原(20μg/孔，于无内毒素PBS中)涂覆18h。向每个孔中加入20μl细胞悬浮液，并在37℃下用5μl的fMLP 1nM最终浓度刺激1min。洗涤后，将贴壁细胞固定在1.5％戊二醛于PBS中，通过计算机辅助计数进行计 数。通过计算平均值和标准差(SD)进行统计分析；采用不配对t检验计算显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件)进行。 [1371] 以[％]表示的每种化合物对中性粒细胞粘附的各自抑制总结在生物数据段落中每种化合物的化学特性下方。 [1372] 实施例3.3：抑制人中性粒细胞中活性氧(ROS)产生的体外测试 [1373] NADPH氧化酶位于质膜和特定颗粒的膜中，产生超氧阴离子，其他ROS如过氧化氢、单线态氧、次氯酸盐和活性羟基从中产生。ROS被释放到周围介质中或被膜包裹的亚细胞器中。测量这些代谢产物生成的一种快速、灵敏的方法是化学发光(CL)。异鲁米诺扩增的CL技术非常灵敏，并广泛用于研究中性粒细胞诱导的呼吸爆发(主要是细胞外ROS的产生)。 [1374] 从健康供体获得的血沉棕黄层中分离人中性粒细胞。将分离的中性粒细胞6 (3X10 /ml)悬浮在含有钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中。将中性粒细胞与不同浓度 (0.1、0.3、1、3和10μM)的化合物在37℃下预孵育30min。用人纤维蛋白原(0.25mg/ml于PBS中)包覆黑色96孔细胞培养板，并在4℃下孵育过夜或在37℃下孵育2小时。然后用不含内毒素的PBS洗涤板。将中性粒细胞与TNF‑α(20ng/ml)在37℃下孵育(引发)10分钟。随后向每个孔中加入75μl细胞悬液和75μl(异鲁米诺+HRP溶液)。使用Multilabel Reader victor3 (Perkin Elmer,USA)在fMLP(1μM)活化后记录化学发光(每25秒一次，持续250秒)。从所有读数(CPS，每秒计数)中减去背景值(其定义为在HBSS中稀释的异鲁米诺的平均化学发光 值)。试验进行两次或三次。 [1375] 从异鲁米诺扩增的CL试验获得的结果显示，在fMLP+TNF‑α刺激的PMN中，化合物以浓度依赖性方式强烈降低ROS水平。 [1376] 将以[％]和IC50[μM]表示的0.3μM下的PMN ROS抑制总结在生物数据段落中每种化合物的化学特性下方。 [1377] 实施例3.4：体外人中性粒细胞和人单核细胞炎性细胞因子的产生，方法 [1378] 在无内毒素条件下，从健康供体的血沉棕黄层中分离出中性粒细胞和单核细胞。简而言之，在Ficoll‑Paque PLUS梯度上对血沉棕黄层进行分层，然后在室温下以400x g离心30min。然后收集中性粒细胞并进行葡聚糖沉淀，然后进行低渗裂解以去除红细胞。在 6 Percoll梯度离心后，从PBMC中分离单核细胞。人中性粒细胞和单核细胞分别以5×10/ml 6 和2.5×10 /ml的浓度悬浮于补充了10％低内毒素FBS(<0.5EU/ml；来自BioWhittaker‑ Lonza,Basel,Switzerland)的RPMI 1640培养基中，然后在37℃、5％CO2气氛下，在存在或不存在不同浓度(20‑40μM)的化合物的情况下置于24孔组织培养板中。药物处理1h后，用 0.1μg/ml来自大肠杆菌(E.coli)0111:B4株的超纯LPS(InvivoGen)刺激单核细胞，而用1μg/ml来自大肠杆菌0111:B4株的超纯LPS(InvivoGen)刺激中性粒细胞。LPS刺激6h后，收集 中性粒细胞和单核细胞，以300x g旋转5min。立即将无细胞上清液在‑80℃冷冻。 [1379] 通过市售可得的ELISA试剂盒测量无细胞上清液中的细胞因子浓度，人特异性的：CXCL8、IL‑6、TNF‑α(Mabtech,Sweden)。这些ELISA的检测限为：CXCL8为4pg/ml，IL‑6为 10pg/ml，TNF‑α为4pg/ml。 [1380] 通过计算平均值和标准偏差(SD)进行统计分析；采用不配对t检验计算显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件)进行。 [1381] 以ng/ml表示每种化合物的细胞因子值，并总结在生物数据段落中每种化合物的化学特性下方。 [1382] 实施例3.5：由VEGF‑165化合物诱导的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上的VEGF‑受体磷酸化的体外抑制，方法 [1383] 细胞培养：原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在0.1％明胶预包覆的烧瓶或培养皿中常规培养，直至第6代。使用Tecan酶标仪(Genios)通过CCK‑8试剂盒评估不同浓度(0、1.25、 2.5、5、10和20μM)的单独化合物对细胞活力的影响。为了测量化合物对VEGF诱导的细胞活力的影响，在不含血清和生长因子的培养基(饥饿培养基)中，用与各种浓度的化合物(0、 4 1.25、2.5、5、10和20μM)预混合的VEGF(25ng/ml)处理HUVEC(1×10个细胞/孔)24h和48h。 在此浓度范围内的化合物不影响细胞活力。 [1384] VEGFR‑2、p‑Tyr1175的兔原代抗体获自Cell Signaling Technology(Leiden,The Netherlands)。磷酸‑VEGFR‑2(Tyr1175)夹心ELISA试剂盒来自Cell Signaling Technology。 [1385] 将HUVEC与0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20μM的化合物预孵育60min，随后用温培养基进行三次洗涤步骤，然后用VEGF165(25ng/mL)刺激2min。使用抗‑磷酸‑VEGFR‑2抗体进行免疫印迹分析，膜剥离后使用总VEGFR‑2作为负载对照。 [1386] VEGFR‑2磷酸化抑制结果以IC50(微M[μM])表示，相对于未添加抑制性化合物的VEGF处理的HUVEC对照。 [1387] 以[μM]值表示的每种化合物的各自IC50汇总在生物数据段落中每种化合物的化学特性下方。 [1388] 实施例3.6：LPS诱导人全血后化合物的体外细胞因子释放抑制作用 [1389] 该体外方法的目的是评估化合物对脂多糖(LPS)诱导的炎性反应后全血中一组细胞因子的释放的影响。在LPS诱导前，将全血与化合物一起孵育1h。使用基于多重FACS的板测量血液中的细胞因子水平。 [1390] 列出了以微M[μM]表示的测试化合物测定的IC50值以及每种化合物的细胞因子抑制值。 [1391] 对溶解在DMSO或H2O中达到10倍浓缩原液并溶解在培养基中的化合物进行对LPS诱导后细胞因子释放的影响。 [1392] 测试系统：从单个供体中取出全血(移入肝素锂包覆管中；BD Vacutainer；367886)，并用RPMI 1640(Thermo Fisher,61870036)以1:5稀释。在采样30分钟内，在LPS刺激(O111:B4–Sigma L4391；10ng/ml最终浓度)前，将血液与化合物一起孵育1h。在标准细胞培养条件(37℃，5％CO2)下继续刺激过夜(18h)，然后离心板，取出上清液，在‑80℃下冷冻，直至用于分析。 [1393] 测试化合物的稀释：使用合适的溶剂(在DMSO或水中)制备每种测试化合物的10x浓缩溶液(与最终试验浓度相关)。然后将这10x的化合物溶液(10μl)加入到90μl预稀释全血(全血：RPMI1640，1:5)中，得到最终试验浓度。 [1394] 测试方法：将稀释的全血(80μl)与化合物(10μl)预孵育，得到最终试验浓度100、‑630、10、3、1、0.3和0.1x10 M。血液在37℃和5％CO2下孵育1h。将LPS在细胞培养基中稀释至 110ng/ml的浓度；向全血中加入10μl，使最终浓度为10ng/ml。将板在37℃孵育18h。以3, 000RPM在4℃下将板离心5分钟，取出上清液并在‑80℃下冷冻，直至进行FACS分析。 [1395] 根据制造商的说明，使用定制的多重系统(ELISA Genie)测量细胞因子释放。将制备的样本放在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上运行。 [1396] 细胞因子释放抑制的定量：运行已知浓度的标准物作为细胞因子组的一部分，以定量每个样本中的每种细胞因子浓度。这是使用FCAP阵列v3.0软件进行的。对于IC50测定，原始数据被转换为相对于溶剂对照(设定为100％)的浓度百分比。IC50值使用GraphPad Prism 8软件测定，下限为0，上限为100，使用具有可变希尔斜率的非线性回归曲线拟合。 [1397] 结果：评估了所有化合物在LPS诱导全血炎性反应后细胞因子释放的剂量反应关系。测定了每种化合物的一组细胞因子(GM‑CSF、IFN‑γ、IL‑1β、IL‑2、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑ 8、IL‑9、IL‑10、IL‑12p40、IL‑13、IL‑17A、IL‑17F、IL‑18、IL‑21、IL‑22、IL‑33、TGF‑β、TNF‑α、TNF‑β)的IC50值。 [1398] 以[μM]值表示的每种化合物的各自细胞因子IC50总结在生物数据段落中每种化合物的化学特性下方和表13中。 [1399] 实施例4：化合物制剂 [1400] 实施例4.1：化合物Ic‑007a的口服制剂 [1401] 开发并审查了五种制剂的适用性。这些都是悬浮液和溶液，其具体组分见下表。 [1402] 表21：化合物Ic‑007a的悬浮液和溶液的制剂细节。 [1403] [1404] 制备：悬浮液A和溶液D： [1405] 100mL(根据所需最终体积适当缩放)的方法实施例。通过将5mL DMSO称量到干净的容器中来制备溶剂原液。称取正确量的化合物Ic‑007a，并逐渐加入到DMSO溶液中，同时在振荡器、涡旋器或超声仪上混合。将Solutol在60℃的水浴中在清洁干燥的容器中熔化。 由于solutol在室温下固化，在制剂制备过程中，将熔化的Solutol保存在60℃的水浴中。将 10g(10％w/v)熔化的Solutol加入温热的适当标记的(最终体积为100mL)容器中。将10mL PEG 400加入到于温热的100mL容器中的Solutol中。将DMSO药物原液加入到Solutol和 PEG400混合物中，立即混合内容物，并加入35mL去离子水，在40℃水浴中混合，同时进行间歇涡流以溶解大颗粒。将制剂冷却至室温，并用去离子水补足至最终100mL体积。 [1406] 溶液A、B和C的制备： [1407] 100mL(根据所需最终体积适当缩放)的方法实施例。通过将5mL DMSO称量到干净的容器中来制备溶剂原液。称取1g化合物Ic‑007a，逐渐加入到DMSO溶液中，同时在振荡器、涡旋器或超声仪上混合(如需要)。将Solutol在60℃的水浴中在清洁干燥的容器中熔化。由于Solutol在室温下固化，在制剂制备过程中，将熔化的Solutol保存在60℃的水浴中。称取 10g(10％w/v)熔化的Solutol到温热的适当标记的(最终体积为100mL)容器中。将10mL PEG 400加入到温热的100mL容器中的Solutol中。将DMSO药物原液加入到有标记的Solutol和 PEG 400混合物容器中，并立即与内容物混合。加入35mL去离子水并与内容物混合，置于40℃水浴中，同时进行间歇涡流以溶解大颗粒。将制剂冷却至室温，并使用1M氢氧化钠(NaOH)溶液进一步将制剂的pH值调节至pH 6、7、8和9。初始制剂按1mL规模制备，起始pH值为4.3。 加入3μL NaOH1M，以达到pH 6(溶液A)，22μL以达到pH 8(溶液B)，43μL以达到pH 9(溶液C)。 这些制剂在制备后立即给药。 [1408] 发现10mg/mL悬浮液制剂和1mg/mL溶液制剂在环境条件下两周内是物理稳定的。 [1409] 实施例4.2：化合物Ia‑001a‑Tz的口服制剂 [1410] 将化合物Ia‑001a‑Tz制备为10mg/mL口服溶液，制剂中的载体组成如下表所示。 [1411] 载体是用作溶剂(或稀释剂)的运载体(carrier)或惰性介质，在其中配制和/或给予药物活性剂。 [1412] 表22：化合物Ia‑001aTz口服制剂的制剂细节。 [1413] 载体 组成A 40％PEG400,10％Transcutol,10％Solutol HS15,40％1型水 B 40％PEG400,10％Transcutol,10％Solutol HS15,40％含0.5％HPMC 606的水溶液 C 40％PEG400,10％Transcutol,10％Solutol HS15,40％含0.5％Kollidon VA 64的水溶液 D 40％PEG400,10％Transcutol,10％Cremophor RH40,40％1型水 E 40％PEG400,10％Transcutol,10％维生素E TPGS,40％1型水 F 40％PEG400,10％Transcutol,5％Solutol HS15,45％1型水 G 40％PEG400,10％Transcutol,5％Solutol HS15,45％含1％Kollidon VA 64的水溶液 [1414] 制备方法 [1415] 为了制备10mg/g的溶液，准确称取10mg化合物放入小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1416] 载体制备 [1417] 制剂A：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入1g Solutol HS15，然后加入4g 1型水。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1418] 制剂B：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入1g Solutol HS15。通过称取50mg HPMC 606到干净的玻璃瓶中制备0.5％HPMC606水溶液。向其中加入9.95g 1型水。在室温下将各组分搅拌 1h，以确保充分混合。然后向PEG400、Transcutol和Solutol HS15的溶液中加入4g含0.5％HPMC 606的水溶液。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1419] 制剂C：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入1g Solutol HS15。通过称取50mg Kollidon VA64到干净的玻璃瓶中，制备0.5％Kollidon VA64水溶液。向其中加入9.95g 1型水。在室温下将各组分搅拌1h，以确保充分混合。然后向PEG400、Transcutol和Solutol HS15的溶液中加入4g含Kollidon VA64的水溶液。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1420] 制剂D：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入1g Cremophor RH40，然后加入4g 1型水。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1421] 制剂E：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入1g维生素E TPGS，然后加入4g 1型水。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1422] 制剂F：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入0.5g Solutol HS15，然后加入4.5g 1型水。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1423] 制剂G：通过称取4g PEG400到干净的20mL玻璃容器中，制备10g载体。加入1g Transcutol，搅拌混合各组分。向其中加入0.5g Solutol HS15。通过称取100mg Kollidon VA64到干净的玻璃瓶中制备1％Kollidon VA64水溶液。向其中加入9.9g 1型水。将各组分 在室温下搅拌1h，以确保充分混合。然后向PEG400、Transcutol和Solutol HS15的溶液中加入4.5g含Kollidon VA64的水溶液。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1424] 实施例4.3.化合物IIc‑007a、IVc‑059a、IIIc‑061a的口服制剂 [1425] 化合物IIc‑007a、IVc‑059a、IIIc‑061a使用下表中详述的组分制备为口服制剂。 [1426] 表23：化合物IIc‑007a、IVc‑059a、IIIc‑061a口服制剂的口服制剂细节 [1427] [1428] 50mL规模的15％SLS水溶液的制备： [1429] 准确称取7.5g SLS到50mL容量瓶中。向50mL体积中加入水并搅拌，直至获得完全溶解。 [1430] 制剂载体的制备： [1431] 制剂1：通过称取40g PEG 400(40.0％)到塑料烧杯中制备100g载体。3.5g Transcutol(3.5％)、12.5g Cremophor RH40(12.5％)、4.0g葡甲胺(4.0％)、5g DMSO (5.0％)和35g 15％SLS水溶液(35.0％，最终SLS5.25％)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1432] 制剂2：通过称取40g PEG 400(40.0％)到塑料烧杯中制备100g载体。10.0g Transcutol(10.0％)、15.0g Cremophor RH40(15.0％)、4.0g葡甲胺(4.0％)、5g DMSO (5.0％)和35g 15％SLS水溶液(35.0％，最终SLS 5.25％)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1433] 将载体直接加入到每种化合物中，然后涡旋和超声处理10分钟。如果需要，用1M氢氧化钠或1M盐酸调节制剂的pH值，使其达到适合口服给药的pH值范围。IIc‑007a溶液的浓度最高可达并包括70mg/mL。IIIc‑061a溶液的浓度最高可达并包括40mg/mL。IVc‑059a溶液的浓度最高可达并包括150mg/mL。 [1434] 实施例4.4：静脉注射(IV)制剂 [1435] 将化合物Ia‑001a、Ia‑001a‑Tz、Ia‑001a‑Tz/004a、Ic‑007a、Ib‑010a、IVc‑059a、IIIc‑061a制备为静脉注射制剂。 [1436] 将下表24中给出的制剂细节用于不同的临床前体内模型中的IV给药。通过用氢氧化钠溶液调节pH直至获得溶液来制备每种化合物的溶液。 [1437] 表24：IV制剂组成 [1439] 制备方法： [1440] 10mL(根据所需最终体积适当缩放)的方法实施例。通过将0.5mL DMSO称量到干净的容器中来制备溶剂原液。称取100mg每种化合物，并逐渐加入到DMSO溶液中，同时在振荡器、涡旋器或超声仪上混合(如需要)。将Solutol在60℃水浴中在干净干燥的容器中熔化。 由于Solutol在室温下固化，在制剂制备过程中，将熔化的Solutol保存在60℃的水浴中。称取1g(10％w/v)熔化的Solutol到温热的适当标记的(最终体积为10mL)容器中。将1mL PEG 400加入到在温热的10mL容器中的Solutol中。将DMSO药物原液加入到有标记的Solutol和 PEG 400混合物的容器中，并立即与内容物混合。加入0.9％盐溶液*以达到85％的目标体 积，并在40℃水浴中混合内含物，同时进行间歇涡流以溶解大颗粒。将制剂冷却至室温，用 0.9％盐溶液*补足至最终目标体积(10mL)，并用1M氢氧化钠(NaOH)溶液将制剂的pH值调节 至pH 7.4。使用0.2μm过滤器将制剂过滤到II类生物罩内的无菌小瓶中。制剂用于动物给 药。 [1441] *对于某些化合物，用0.9％盐溶液代替pH 7.4的PBS溶液。 [1442] 实施例4.5：静脉注射(IV)和腹腔注射(IP)制剂 [1443] 化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059a、IIIc‑061a制备为静脉注射和腹腔注射给药制剂。制剂含有水和二乙胺，其以表25中详述的每种对应化合物的摩尔当量计。这些制剂用于不同临床前体内模型中的IV和IP给药。 [1444] 制备方法： [1445] 1mL(根据所需最终体积适当缩放)的方法实施例。准确称取10mg每种化合物到干净的小瓶中。向小瓶中加入相应量的二乙胺。然后加入水，使体积达到1mL。将内容物涡旋或超声处理以形成溶液。必要时，使用1M盐酸改变溶液的pH值，使其处于适合IV或IP给药的范围内。 [1446] 表25：IV和IP制剂中化合物所需的二乙胺摩尔当量。 [1447] [1448] 实施例4.6：眼部制剂 [1449] 本发明的几种化合物被提交用于将制剂开发成眼用形式。下表26列出了化合物、其最终浓度和形式。 [1450] 表26：眼部制剂 [1451] 化合物 浓度(％w/v) 悬浮液/溶液IVc‑059a 5mg/mL(0.5) 溶液 Ia‑001a‑Tz/004a 5mg/mL(0.5) 溶液 Ia‑001a‑Tz 10mg/mL(1.0) 溶液 IIIc‑061a 10mg/mL(1.0) 溶液 Ia‑001a 10mg/mL(1.0) 溶液 Ic‑007a 5mg/mL(0.5) 悬浮液 Ib‑010a 10mg/mL(1.0) 悬浮液 [1452] 组成：制剂组成详见下表27。API的浓度及其生成的形式各不相同。 [1453] 表27：眼部制剂组成。 [1454] 组分 量(％)API原料药 参见上表 Kolliphor EL 5％w/v 聚维酮 0.5％w/v HPMC 0.5％w/v 聚山梨醇酯80 0.1％v/v pH 7.4PBS缓冲液(用1M NaOH调节pH) 至体积 [1455] 制备方法： [1456] 对于产生溶液的那些化合物，遵循以下制备方法： [1457] 称取总计50mg的Kolliphor EL到干净的干燥容器中。称取正确量的化合物，并逐渐加入到Kolliphor EL中，同时在磁力搅拌器上混合。加热至30℃有助于将药物混合到 Kolliphor制剂中。在单独的容器中，制备0.5％w/v HPMC、0.5％w/v聚维酮和0.1％聚山梨醇酯80在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的水溶液。向Kolliphor EL和药物中加入 体积为600μL的水溶液，同时混合，并立即涡旋。在制剂中使用1M NaOH将pH值调节至7.4，同时混合。使用水溶液将体积调节至目标体积。使用0.2μm过滤器将制剂过滤到II级生物罩内的无菌小瓶中。制剂已准备好给药。 [1458] 对于产生悬浮液的化合物，遵循以下制备方法：称取50mg的Kolliphor EL到干净的干燥容器中。称取正确量的不同化合物，并逐渐加入到Kolliphor EL中，同时在磁力搅拌器上混合。加热至30℃有助于将药物混合到Kolliphor中。在单独的容器中，制备0.5％w/v HPMC、0.5％w/v聚维酮和0.1％聚山梨醇酯80在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的水 溶液。使用0.22μm过滤器过滤水溶液。向Kolliphor和药物中加入体积为600μL的水溶液，同时混合，然后立即涡旋。使用过滤的1M NaOH将pH值调节至7.4，同时连续混合制剂。使用水溶液将体积调节至目标体积。在给药前对制剂进行超声处理，以使絮凝物破碎和分散。 [1459] 化合物Ic‑007a、IIc‑007a的眼部制剂 [1460] 表28：含有Ic‑007a和IIc‑007a的眼部制剂的组成。 [1461] [1462] 制备方法： [1463] 称取总计50mg的Kolliphor EL到干净的干燥容器中。称取正确量的化合物，并逐渐加入到Kolliphor EL中，同时在磁力搅拌器上混合。加热至30℃有助于将药物混合到 Kolliphor制剂中。在单独的容器中，制备0.5％w/v HPMC、0.5％w/v聚维酮和0.1％聚山梨醇酯80在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的水溶液。向Kolliphor EL和药物中加入 体积为600μL的水溶液，同时混合，并立即涡旋。在制剂中使用1M NaOH将pH值调节至7.4，同时混合。使用水溶液将体积调节至目标体积。使用0.2μm过滤器将制剂过滤到II级生物罩内的无菌小瓶中。 [1464] 化合物IIc‑007a的溶液：称取总计50mg Kolliphor EL到干净的干燥容器中。称取正确量的化合物(目标浓度5mg/mL)，并逐渐加入到Kolliphor EL中，同时在磁力搅拌器上混合。加热至30℃有助于将药物混合到Kolliphor制剂中。在单独的容器中，制备0.5％w/v HPMC、0.5％w/v聚维酮和0.1％聚山梨醇酯80在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的水 溶液。向Kolliphor EL和药物中加入体积为600μL的水溶液，同时混合，并立即涡旋。在制剂中使用0.5M NaOH将pH值调节至7.4，同时混合。使用水溶液将体积调节至目标体积。使用 0.2μm过滤器将制剂过滤到II级生物罩内的无菌小瓶中。制剂已准备好给药。使用前，将化合物IIc‑007a溶液涡旋2分钟，并在10分钟内使用。 [1465] *可能观察到凝胶/胶体结构的出现，但在涡旋后会重新分散。 [1466] 化合物Ic‑007a的悬浮液：称取总计50mg Kolliphor EL到干净的干燥容器中。称取正确量的化合物(目标浓度5mg/mL)，并逐渐加入到Kolliphor EL中，同时在磁力搅拌器 上混合。加热至30℃有助于将药物混合到Kolliphor制剂中。在单独的容器中，制备0.5％w/v HPMC、0.5％w/v聚维酮和0.1％聚山梨醇酯80在pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的 水溶液。 [1467] 使用0.22μm过滤器过滤水溶液。向Kolliphor EL和药物中加入体积为600μL的水溶液，同时混合，并立即涡旋。在制剂中使用0.5M NaOH将pH值调节至7.4，同时混合。使用水溶液将体积调节至目标体积。 [1468] 使用前，使用以下方案对化合物Ic‑007a的悬浮液进行超声处理，以破碎絮凝物/聚集体：在超声发生器内的小培养皿/烧杯中装满水。将小瓶放入烧杯/培养皿中，在40℃下超声处理10分钟。10分钟后，取出小瓶并涡旋2分钟，然后再次超声处理10分钟。重复该过程共50分钟。 [1469] IIc‑007a的眼部制剂 [1470] 载体的组成和化合物浓度如表29所示。 [1471] 表29：制剂A、B和C的组成 [1472] [1473] 为了制备10mg/g溶液，准确称取10mg化合物到小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1474] 为了制备5mg/g溶液，准确称取5mg化合物到小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1475] 载体制备 [1476] 制剂A：通过称取0.25g HPMC(0.5％w/w)到100mL duran玻璃瓶中制备50g载体。然后向瓶中加入49.25g 1型水，随后加入0.200g TRIS(0.4％w/w)、50mg Tween 80(0.1％w/ w)和0.25g PVP K30(0.5％w/w)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1477] 制剂B：通过称取2.5g cremophor EL(5％w/w)到100mL duran玻璃瓶中制备50g载体。然后向瓶中加入47.3g 1型水，随后加入200mg TRIS(0.4％w/w)。 [1478] 制剂C：通过称取2.5g cremophor EL(5％w/w)到100mL duran玻璃瓶中制备50g载体。然后向瓶中加入46.45g 1型水，随后加入450mg TRIS(0.9％w/w)和600mg PVP K90 (1.2％w/w)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1479] 制剂D：二乙胺0.3％w/v：9.9g二乙胺载体通过在14mL玻璃瓶中加入9869μL 1型水来制备。然后用移液管向小瓶中加入44.2μL(31.3mg)二乙胺。将溶液搅拌5分钟，以确保均质性。 [1480] IVc‑059a的眼部制剂 [1481] 载体的组成和化合物浓度如表30所示。 [1482] 表30：制剂A、B和C的组成 [1483] [1484] 为了制备10mg/g溶液，准确称取10mg化合物到小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1485] 载体制备 [1486] 制剂A：通过称取2.5g cremophor EL(5％w/w)到100mL duran玻璃瓶中来制备50g载体。然后向瓶中加入46.45g 1型水，随后加入450mg TRIS(0.9％w/w)和600mg PVP K90 (1.2％w/w)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1487] 制剂B：二乙胺0.3％v/v:9.9g二乙胺载体通过在14mL玻璃瓶中加入9869μL 1型水制备。然后用移液管向小瓶中加入44.2μL(31.3mg)二乙胺。将溶液搅拌5分钟，以确保均质性。 [1488] 制剂C：通过称取49.45g PBS(制备方法如下)到100mL duran玻璃瓶中制备50g载体。依次向玻璃瓶中加入250mg HPMC(0.5％w/w)、250mg PVP K30(0.5％w/w)和50μL(液体置换移液管)tween 80(0.1％w/w)。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1489] PBS制备：准确称取799.1mg NaCl、21.6mg KCl、24.9mg KH2PO4、180.4mg Na2HPO4·2H2O，并溶于100mL 1型水中。溶液的pH值为7.6。 [1490] Ic‑007a和IIc‑007a的眼部制剂 [1491] 将化合物配制成表31所示载体中的溶液。 [1492] 表31：制剂A、B、C和D的组成 [1493] [1494] 50g规模的载体制备 [1495] 载体A：通过向47.05g水(94.1％w/w)中加入0.45g TRIS(0.9％w/w)和2.5g Cremphor EL(5.0％w/w)制备50g载体。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1496] 载体B：通过向46.95水(93.9％w/w)中加入0.45g TRIS(0.9％w/w)、2.5g Cremphor EL(5.0％w/w)，然后加入0.1g Kolliphor RH40(0.2％w/w)制备50g载体。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1497] 载体C：通过向46.75水(93.5％w/w)中加入0.45g TRIS(0.9％w/w)、2.5g Cremphor EL(5.0％w/w)，然后加入0.1g Kolliphor RH40(0.2％w/w)和0.2g PEG400制备 50g载体。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1498] 载体D：通过向46.45水(92.9％w/w)中加入0.45g TRIS(0.9％w/w)、0.5g葡甲胺(1.0％w/w)、2.5g Cremphor EL(5.0％w/w)，然后加入0.1g Kolliphor RH40(0.2％w/w)制备50g载体。将混合物在室温下搅拌1h，使所有组分溶解。 [1499] 将载体直接添加到API中，以产生表32中所列的浓度。对样本进行涡旋和超声处理，直至获得溶液。 [1500] 表32：使用载体A、B、C和D的制剂中的化合物浓度 [1501] [1502] [1503] 为了制备10mg/g溶液，准确称取10mg化合物到小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1504] 为了制备20mg/g溶液，准确称取20mg化合物到小瓶中，将1ml载体直接加入API中并涡旋，得到溶液。 [1505] 实施例5：化合物的治疗活性 [1506] 实施例5.1：急性胰腺炎的治疗和/或预防 [1507] 在急性胰腺炎小鼠模型上评估本发明的化合物的治疗功效。获得组织样本以进行胰腺炎参数的生存期后分析。还获得了血浆样本，以评估化合物给药后的动物暴露水平。 [1508] 动物：总计70只8‑10周龄、体重约20‑25g的雌性Balb/c小鼠用于本研究(Charles River)。适应7天后，将它们分配到不同组。将小鼠饲养在IVC笼子中(每个笼子中最多5只小鼠)，通过尾部标记识别个体小鼠。使用前，对笼子、垫子和水进行消毒。向动物提供了玉米芯富集垫料，以提供环境富集和筑巢材料。所有动物都可以自由获取经过认证的标准商业饮食和水。动物饲养室保持如下‑室温20‑24℃，湿度30‑70％，使用12h光/暗循环。尽管本研究中使用的动物具有免疫能力，但给药溶液的制备和动物的给药/称重是在无菌生物安全 柜中进行的。 [1509] 测试物质和制剂：在第一个实验中，称取化合物Ia‑001a、Ia‑001aTz、Ic‑001aTz/004a、Ic‑007a、Ib‑010a、IIIc‑061a、IVc‑059a，并将其溶解在DMSO中。最终制剂为5％DMSO、 10％Solutol、10％PEG400、75％0.9％盐水，并用0.5M NaOH溶液将pH值调至7。 [1510] 在第二个实验中，称取化合物Ic‑001aTz2、IIc‑007a、IIIa‑001aTz、IIIc‑061a、IIIc‑061a‑E3、IVc‑059a，并将其溶解于DMSO中。最终制剂为5％DMSO、10％Solutol、10％PEG400、75％0.9％盐水，并用0.5M NaOH溶液将pH值调至7。对于口服(PO)给药，IVc‑059a在水中配制。在给药当天配制药物溶液。 [1511] 本研究的目的是评估急性胰腺炎模型(14天)中的功效化合物，生成组织样本以允许对胰腺炎参数进行生存期后分析，并生成四份血浆样本以评估第一次和最后一次注射后 的动物暴露水平，这些血浆样本是从第一次和最后一次注射后1h和24h采集的血液样本中 获得的。 [1512] 研究设计：在第一个研究日，将动物随机分配到治疗组，确保体重均匀分布。小鼠(阴性对照组除外)在雨蛙素给药前5分钟用测试化合物处理，随后在研究期间每天通过腹腔注射途径(IP)以2μg/kg注射雨蛙素。 [1513] 表33：第一个实验。 [1514] 组 动物数量 药剂 给药水平；途径1 3 阴性对照(非诱导的) 载体(tbc)；IV 2 3 阴性对照(诱导的) 载体(tbc)；IV 3 8 吡非尼酮 40mg/kg；IV 4 8 Ia‑001a 15mg/kg；IV 5 8 Ia‑001aTz 15mg/kg；IV 6 8 Ic‑001aTz/004a 15mg/kg；IV 7 8 Ic‑007a 15mg/kg；IV 8 8 Ib‑010a 150mg/kg；PO 9 8 IIIc‑061a 15mg/kg；IV 10 8 IVc‑059a 150mg/kg；PO [1515] 表34：第二个实验。 [1516]组 动物数量 化合物 给药水平；途径 1 3 阴性对照(非诱导的) 载体(tbc)；IV 2 3 阴性对照(诱导的) 载体(tbc)；IV 3 8 吡非尼酮 40mg/kg；IV 4 8 Ic‑001aTz2 15mg/kg；IV 5 8 IIc‑007a 15mg/kg；IV 6 8 IIIa‑001aTz 15mg/kg；IV 7 8 IIIc‑061a 15mg/kg；IV 8 8 IIIc‑061a‑E3 150mg/kg；PO 9 8 IVc‑059a 15mg/kg；IV 10 8 IVc‑059a 150mg/kg；PO [1517] 雨蛙素给药前5分钟用测试品化合物处理。 [1518] 表35：研究时间表。 [1519] [1520] [1521] 连续观察 [1522] 体重：每天测量并记录研究中所有小鼠的体重；该信息用于计算每只动物的精确剂量。 [1523] 一般体征和症状：每天观察小鼠，注意任何痛苦体征或一般状况变化，如皮毛呈星形、缺乏运动、呼吸困难。 [1524] 取样和生存期后分析：在上述时间点，从尾侧静脉取全血样本(60μl)到包覆有K2‑EDTA的管中。制备血浆样本并在‑20℃下冷冻储存。将血浆样本送至客户生物分析供应商Eurofins(FR)进行化合物定量。 [1525] 终末取样：终止前，对动物称重。通过吸入CO2扑杀终末研究动物。通过心脏穿刺采集终末血样并制备血浆。通过ELISA法使用市售可得的ELISA试剂盒测量脂肪酶和淀粉酶活性。储存剩余血浆，用于将来的细胞因子分析。切除胰腺组织并称重，对切片(50μg)进行速冻并分析，以定量胰腺样本中的化合物。处理切片(50μg)，通过ELISA法测量MPO活性、IL‑33和TGF‑B水平。剩余部分用福尔马林固定，并包埋在固体石蜡中。进行H&E染色，使用 Schmidts标准评分系统评估切片，检查：水肿、炎性浸润、实质坏死、出血。进行Massons’Trichrome染色，并使用QuPath软件对纤维化组织覆盖的区域进行数字量化。使用IdeXX CHEM15和LYTE4 clip，使用终末血清样本评估血液化学(每个治疗组4只动物)。 [1526] IV处理15天后的急性胰腺炎结果 [1527] 基于4项标准进行胰腺损伤的组织病理学评估：水肿、炎性浸润、实质坏死、出血，评分如下所述。 [1528] 表36：基于4项标准的评分水平 [1529] [1530] 表37：动物组的结果评分水平 [1531] [1532] Schmidt评分 [1533] Schmidt评分是基于下表所述的四项组织病理学标准对化合物功效的评估。Schmidt评分增加的化合物顺序(最高分＝10为雨蛙素诱导+载体处理，最低分＝0为非诱导 的动物)。与雨蛙素对照动物相比，图2中化合物的Schmidt评分图是所有产品均显示出提高的Schmidt评分。 [1534] 表38：Schmidt评分及四个参数表 [1535] [1536] 如下表所示，与“诱导”组相比，所有化合物Ia‑001a、Ia‑001aTz、Ic‑001aTz/004a、Ic‑007a、Ib‑010a、IIIc‑061a、IVc‑059a的IL33胰腺组织水平均显著降低。Ic‑007a、Ib‑010a、IIIc‑061a、IVc‑059a的TGF‑B水平显著下降。所有化合物的全球Schmidt评分尤其提高，尤其是化合物IIIc‑061a、IVc‑059a。 [1537] 下表39和40显示了胰腺组织样本中MPO的终末胰腺浓度、IL33组织浓度和TGF‑B浓度。 [1538] 表39： [1539] [1540] 表40： [1541] [1542] 在第二个实验中，使用吡非尼酮100mg/kg作为阳性对照，在相同模型中以15mg/k评估化合物Ic‑001a‑TZ(2)、IIc‑007a、Ia‑015a、IIIc‑061a、IVc‑059a。 [1543] 表41：结果 [1544] [1545] 淀粉酶：除Ia‑015a外，所有测试化合物均导致淀粉酶活性水平显著低于诱导的载体处理的对照，但未达到非诱导动物的水平。 [1546] 脂肪酶：用载体诱导和处理的动物血清中的脂肪酶活性高于非诱导的动物。使用阳性对照吡非尼酮、Ia‑015a、IIIc‑061a和IVc 059a处理导致脂肪酶活性显著低于载体处理的动物。 [1547] 髓过氧化物酶(MPO)：用载体诱导和处理的动物胰腺组织中的MPO活性显著高于非诱导的动物，表明存在胰腺炎。使用阳性对照吡非尼酮、IIIc‑061a和IVc‑059a处理均导致MPO活性水平显著低于诱导的载体处理的对照。 [1548] IL‑33和TGF‑B：除IIIc‑061a和IVc‑059a PO给药外，所有处理均导致胰腺IL‑33水平低于诱导的载体处理的对照。与血清TGF‑B水平相比，TGF‑B水平显著低于诱导的载体处理的对照。 [1549] 基于间质水肿、白细胞浸润、腺泡细胞坏死和出血的临床使用的Schmidt评分标准用于评估H&E染色的胰腺组织切片。所有测试化合物均导致Schmidt评分显著低于诱导的载 体处理的对照，IIIc‑061a(IV)和IVc‑059a(IV)评分低于阳性对照吡非尼酮。 [1550] 纤维化染色：使用市售可得的染色试剂盒(Abcam；ab150686，Trichrome染色)对胰腺组织切片进行胶原染色。使用QuPath数字成像软件定量胶原(蓝色)染色覆盖的面积百分比。所有测试化合物均导致trichrome染色面积显著低于诱导的载体处理的对照。 [1551] 实施例5.2：胰腺癌和肾癌的治疗和/或预防： [1552] 本研究的目的是临床前评价本发明的化合物用于治疗雌性C57BL/6小鼠的皮下鼠胰腺癌同基因模型(Pan02)和雌性BALB/c小鼠的肾癌同基因模型(Renca)的体内治疗功效 研究。 [1553] 动物：C57BL/6小鼠雌性(Pan02模型)；BALB/c小鼠雌性(Renca模型)，6‑8周，>17g，每个笼子最多5只小鼠 [1554] Pan02模型处理和组：化合物Ia‑001a‑Tz、Ic‑007a、Ib‑010a、IVc‑059a、IIc‑007a，每日一次，5天/周，持续2周，通过IV弹丸式注射(bollus injection)，剂量为15mg/kg。 [1555] Renca模型处理和组：化合物Ia‑001a‑Tz、Ic‑007a、Ib‑010a、IVc‑059a、IIc‑007a，每日一次，7天/周，持续3周，通过IV弹丸式注射，剂量为15mg/kg。 [1557] 细胞培养：用补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、5％CO2空气气氛下体外维持Pan02肿瘤细胞。肿瘤接种前，收获指数生长期细胞，并用细胞计数器定量。 [1558] Renca模型肿瘤接种：每只小鼠右后侧区域皮下接种0.1mL PBS中的Renca肿瘤细6 胞(1x10)，用于肿瘤发育。 [1559] Pan02模型肿瘤接种：每只小鼠右前侧区域皮下接种0.1mL PBS中的Pan02肿瘤细6 胞(3x10)，用于肿瘤发育。 [1560] 随机化：当平均肿瘤大小达到约100(80‑110)mm3时开始随机化。对于这两种模型，48只小鼠参加了本研究。所有动物被随机分配到6个研究组。基于“匹配分布”法，采用多任务方法(StudyDirectorTM软件，版本3.1.399.19)进行随机化。随机化日期表示为第0天。 [1561] 观察与数据收集：肿瘤细胞接种后，每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测期间，检查动物的肿瘤生长和处理对行为的任何影响，如活动能力、食物和水消耗量、体重增加/减少(随机化后每周测量两次体重)、眼睛/毛发失去光泽和任何其他异常情况。详细记录个体动物的死亡率和观察到的临床体征。 [1562] 随机化后，使用卡尺在两个维度上每周测量两次肿瘤体积，体积用公式以mm3表示:“V＝(L x W x W)/2，其中V为肿瘤体积，L为肿瘤长度(最长肿瘤尺寸)，W为肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。在研究结束时测量肿瘤重量。在层流柜中进行给药以及肿瘤和体 重测量。 [1563] 研究终点：肿瘤生长抑制(TGI)：使用TGI％作为抗肿瘤活性的指征，并表示为：TGI(％)＝100*(1‑T/C)，T和C分别是治疗组和对照组在给定日期的平均肿瘤体积(或重量)。 [1564] 使用以下方法之一对各组之间的平均肿瘤体积差异进行统计分析： [1565] 尽管个体终末日期不同，但对每个单独组使用在最后一次给药/观察日收集的数据。 [1566] 使用载体组的平均肿瘤体积达到人道终点当天收集的数据，以便可以得出本研究中参加的所有/大多数小鼠的TGI。 [1567] 使用在任何治疗组或对照组被终止的当天收集的数据，即使其余组按计划进行处理。 [1568] AUC差异(ΔAUC)＝采用线性混合效应回归模型进行的统计分析。 [1569] 研究终止：进行为期3周的功效研究。 [1570] 统计分析：为比较不同组在预先指定日的肿瘤体积，首先使用Bartlett检验来检查所有组方差均质性假设。当Bartlett检验的p值≥0.05时，使用单因素方差分析检验所有组的平均值的总体相等性。如果单因素方差分析的p值<0.05，则通过运行Tukey HSD(诚实 显著性差异)检验对所有成对比较进行事后检验，并运行Dunnett检验对每个治疗组与载体 组的比较进行事后检验。当Bartlett检验的p值<0.05时，使用Kruskal‑Wallis检验来检验所有组中位值的总体相等性。如果Kruskal‑Wallis检验的p值<0.05，则通过运行Conover非参数检验对所有成对比较或每个治疗组与载体组的比较，进行事后检验，两者均采用单步p值调整。所有统计分析均在用于统计计算和图形的R‑a语言和环境(3.3.1版)中完成。除非另有说明，所有检测都是双向的，p值<0.05视为具有统计学意义。 [1571] 结果 [1572] 表42：第13天采集的数据的测试物质的抗肿瘤活性 [1573] [1574] 表43：第13天采集的数据的肿瘤体积统计分析 [1575] [1576] 结果总结 [1577] 在本研究中，评估了测试化合物IVc‑059a在雌性C57BL/6小鼠中治疗皮下鼠胰腺癌同基因模型(Pan02)的体内治疗功效。以15mg/kg I.V.给药的化合物IVc‑059a显著抑制 了肿瘤生长，其中TGI值为20.98％(P<0.05)。 [1578] 表44：肿瘤体积Pan02模型的平均抑制％ [1579]天 0 3 6 9 13 IVc‑059a ‑0.11％ 19.86％ 18.64％ 18.49％ 20.98％ [1580] 平均抑制％＝(平均值(对照NaCl)‑平均值(Cpd处理))/平均值(C对照NaCl)*100％ [1581] 表45：肿瘤体积Renca模型的平均抑制％ [1582]天 0 3 6 9 13 16 IVc‑059a 0.05％ ‑0.90％ 5.02％ 14.83％ 23.07％ 19.42％ [1583] 实施例5.3：糖尿病视网膜病变(DR)的治疗和/或预防 [1584] 动物模型：使用db/db小鼠模型，并与作为非糖尿病对照的db/+小鼠比较。db/db小鼠携带瘦素受体基因的突变，并是肥胖诱导的2型糖尿病的模型。Bogdanov et al.PLoS One,2014,9,e97302报告称，db/db小鼠再现了人糖尿病眼中发生的神经退行性过程的特 征。此外，该模型还出现了由糖尿病诱导的早期微血管异常(血管渗漏)(Hernández et al.Diabetes 2016,65,172‑187；Hernandez et al.Diabetologia 2017,60,2285‑2298)。 因此，该模型被认为是测试本发明化合物用于治疗早期糖尿病视网膜病变(DR)的功效的合 适模型。 [1585] 在db/db小鼠模型中测试了含Ia‑007a的滴眼液对糖尿病诱导的血管渗漏的作用。小鼠，8周龄的db/db(BKS.Cg‑Dock7m+/+Leprdb/J)小鼠和非糖尿病(db/+)小鼠购自 Charles River Laboratories(Calco,Italy)。 [1586] 动物可自由获取随意食物(ENVIGO Global Diet Complete Feed for Rodents,Mucedola,Milan,Italy)和过滤水。小鼠被保持在温度(20℃)和湿度(60％)的严格环境条 件下。此外，他们有12h/12h光/暗周期。 [1587] 干预研究：db/db小鼠10周龄时，使用注射器将Ia‑007a滴眼液或载体滴眼液随机直接给药在每只眼睛的上角膜表面。向每只眼睛给药一滴(5μL)Ia‑007a(5mg/mL)或向每只眼睛给药一滴载体(5μL 0.9％氯化钠)，每日两次，持续14天。在第15天，在尸检前约1小时，向动物眼睛滴入一滴Ia‑007a或载体。所有实验均按照欧洲共同体(86/609/CEE)的原则进 行。 [1588] 通过使用Evans Blue白蛋白法评估白蛋白从血管渗漏到视网膜，离体检查视网膜脉管系统的渗透性。为此，向每组四只动物腹腔注射Evans Blue(E2129 SIGMA,Sant Louis,Missouri,USA)(5mg/mL，溶于PBS pH7.4中)的溶液。注射后，动物变蓝，证实染料吸收和分布。2h后，通过颈椎脱位处死小鼠，摘除眼睛。分离每只动物的视网膜，称重并迅速避光保护。获得固定封装的载玻片，用一滴封固剂Prolong Gold抗褪色剂(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific,Oregon,USA)盖上盖片。使用共焦激光扫描显微镜(FV1000； Olympus,Hamburg,Germany)使用561‑nm激光线以×60获取来自所有视网膜不同随机视野 的数字图像，并且以1024像素×1024像素的大小以相同的光束强度记录每幅图像。对于白 2 蛋白结合Evans Blue的定量分析，计算了每0.44mm视野的外渗数量。该分析是由不了解小 鼠所接受处理的研究人员进行的。 [1589] 结果 [1590] 用Ia‑007a滴眼液处理的db/db小鼠在处理结束时的血糖浓度和体重与用载体处理的db/db小鼠相似。在糖尿病小鼠视网膜中确定了Evans Blue的血管外位置(图1，白色箭头)。Ia‑007a局部处理能够显著减少每个视野的外渗数量，从而防止因血视网膜屏障破坏而导致的血管渗漏。 [1591] 实施例5.4：腹膜炎的治疗和/或预防 [1592] 使用如Cook AD et al.(J Immunol.2003；171(9):4816‑4823)和Tsai JM et al.(Blood Adv.2019；3(18):2713–2721.doi:10.1182/bloodadvances.2018024026)所述的巯基乙酸盐诱导的腹膜炎鼠模型评估本发明化合物的治疗功效。 [1593] 在诱导腹膜炎前1h，向C57BL/6J小鼠腹腔注射(i.p.)1mL 50m g/kg的化合物。然后用1ml无菌巯基乙酸盐肉汤4％(重量/体积)或PBS作为对照诱导腹膜炎。3h后，用含有 5mg/ml氯胺酮和1mg/ml甲苯噻嗪的PBS溶液通过i.p.注射麻醉小鼠，并用5ml含2mM EDTA的 冰冷无菌Ca2+/Mg2+游离HBSS 1X洗涤腹腔。在4℃下以1200rpm离心腹腔渗出液细胞(PEC) 5min，裂解红细胞。洗涤PEC，重悬于PBS 10％FBS中，与抗CD16/CD32和mIgG FcR阻断剂一起孵育，然后用荧光偶联抗体染色以表征迁移的白细胞(抗CD45、抗CD11b、抗Ly6G、抗CD8a、抗CD4、抗CD3)。通过7‑AAD排除法测量细胞活力。使用MACSQuant分析仪(Miltenyi Biotec)通过流式细胞术采集样品，并使用FlowJo软件进行分析。 [1594] 动物：对于每种化合物，每组中四只C57BL/6J小鼠相对于四只载体处理的小鼠。 [1595] 用cpd处理：通过i.p.注射化合物50mg/kg。 [1596] ‑Ic‑007a：注射体积：Ic‑007a 68.5μl化合物于DMSO(1.375mg)+431.5μl PBS(总体积500μl，5.87mM)中，小鼠约28g [1597] ‑IIc‑007a：注射体积：67.25μl化合物于DMSO(1.345mg)+431.5μl PBS(总体积500μl，5.74mM)中，小鼠约27g [1598] ‑IIIc‑061a：注射体积：58.75μl化合物于DMSO(1.175mg)+441.25μl PBS(总体积500μl，4.56mM)中，小鼠约23.5g [1599] ‑IVc‑059a：注射体积：52.25μl化合物于DMSO(1.045mg)+447.75μl PBS(总体积500μl，5.25mM)中，小鼠约20.9g [1600] 在巯基乙酸盐诱导的腹膜炎发生前60min，用产品Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a、IVc‑059a处理。巯基乙酸盐注射后1h进行读出。 [1601] 读出方法：使用抗CD45、抗CD11b、抗Ly6G、抗CD8a、抗CD4、抗CD3，流式细胞术来表征迁移的白细胞。 [1602] 结果与统计分析：结果采用FlowJo软件分析。数据显示为平均值±SEM。统计分析使用显著性水平为0.05的双尾学生t检验。 [1603] 结果 [1604] 表46：化合物Ic‑007a的数据实例 [1605] [1606] 表47：四种化合物的结果总结 [1607] [1608] 化合物Ic‑007a具有最强的抗炎作用并减少白细胞的募集(48％)，其中对PMN(80％)、CD8+淋巴细胞(71％)和CD4+淋巴细胞(35％)具有非常强的作用 [1609] 实施例5.5：糖尿病心肌病的治疗和/或预防 [1610] 使用Li C et al.(Cardiovasc Diabetol.2019；18(1):15.公开于2019年2月2日，doi:10.1186/s12933‑019‑0816‑2)记载的糖尿病心肌病鼠模型来测试本发明化合物的治疗功效。 [1611] 动物步骤和药物处理：将30只8周大的KK‑Ay小鼠(遗传性2型糖尿病模型)和C57BL/6J小鼠饲养在笼子中(每个笼子4‑6只)，可自由获取饮水/饲料箱。小鼠饲养于24℃的房间中，12:12h光/暗循环。 [1612] 向2型糖尿病模型小鼠喂食高脂肪饮食。每日测量血糖。将连续2周血糖浓度大于15mM(200mg/dL)的小鼠用于以下实验。随后，将动物随机分组(每组15只)，饲养8周。各组包括对照组：(1)未经处理的健康C57BL/6J小鼠；(2)未经处理的2型糖尿病KK‑Ay小鼠；和(3)用本发明化合物处理的2型糖尿病KK‑Ay小鼠。 [1613] 超声心动图评估：在实验干预前和研究期结束时进行超声心动图测量。使用配备TM 17.5MHz线性阵列换能器系统(Vevo 2100 高分辨率成像系统；Visual Sonics)的M型超声 心动图。评估心率(HR)和以下结构变量：舒张期左心室内径(LVIDD)、收缩期左心室内径 (LVIDS)、收缩期室间隔厚度(IVSs)和舒张期室间隔厚度(IVSd)以及收缩期LV后壁厚度 3 3 (LVPWs)和舒张期LV后壁厚度(LVPWd)。LV质量使用公式[(LVIDd+LVPWd+IVSd)‑(LVIDd) × 1.04×0.8+0.6]计算。LV功能通过以下参数评估，其包括缩短分数(FS)、射血分数(EF)和E/A比。所有测量均由对实验组不知情的一名研究人员进行。 [1614] 心肌羟脯氨酸浓度：测量左心室的心肌羟脯氨酸浓度，以估计心肌胶原含量。根据制造商的方案，使用市售试剂盒(BioVision,Mountain View,CA,USA)通过分光光度计进行测量。 [1615] 血脂、葡萄糖、胰岛素和HbA1c水平的检测：在研究结束时，通过吸入空气中的3％异戊烷对小鼠进行麻醉。通过舌下静脉从每只动物采集空腹血样到含有肝素锂作为抗凝剂的市售试管中，并以3000rpm/min的速度离心6min。血浆保存在普通试管中，并在‑20℃下储存，直至进行分析。通过分光光度法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL‑C)血浆浓度。使用血糖仪(ACCU‑CHEK,Roche,USA)测量血糖水平。空腹过夜后，分别使用小鼠胰岛素和胰岛素原酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Nanjing Jiancheng Biotech,China)测定空腹胰岛素和胰岛素原水平。还保留血液，以用于通过色谱‑分光光度法‑离子交换试剂盒(Biosystems,Spain)测量HbA1c。 [1616] 心脏组织氧化应激的评估：将动物处死，取出心脏，并在研究结束时使用Krebs‑Ringer溶液(115mM NaCl、5mM KCl、1.2mM KH2PO4、25mM NaHCO3、1.2mM MgSO4、1.25mM CaCl2和11mM葡萄糖)颠倒冲洗。灌注溶液的温度保持在37℃。然后对心脏称重，并将心脏组织在冰上在pH 7.4、含1mM EDTA的冷却磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质化。将匀浆在冷盐水中以 7000rpm/min离心10min。上清液中的蛋白浓度通过将牛血清白蛋白试剂盒作为标准进行测 定。上清液用于分析脂质氢过氧化物水平和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。根据制造商的方案，使用市售试剂盒(Solarbio,China)通过 分光光度计进行测量。脂质氢过氧化物水平以nmol/mg蛋白表示。GSH‑Px、SOD和MDA水平分别以μmol/mg蛋白、nmol/mg蛋白和mmol/mg蛋白表示。通过蛋白免疫印迹测量NOX4的表达水平。使用小鼠单克隆抗Nox4(1:1000，Abcam)和辣根过氧化物酶偶联二抗(CWBIO)。β‑肌动蛋白(1:1000，Abcam)用作参考物。 [1617] 组织学和免疫组织化学分析：将心脏组织固定在4％多聚甲醛于0.1M磷酸盐缓冲液中48h，脱水并包埋在石蜡中，以4‑μm厚度切片，并封装在载玻片上。Masson’s trichrome染色用于评估心肌纤维化程度。 [1618] 对于抗原回收，将脱蜡后的载玻片在100℃下保存在10mM柠檬酸钠(pH 6.0)溶液中10min。然后将切片在3％过氧化氢中孵育，以阻断内源性过氧化物酶活性，并在室温下与一抗(针对TGF‑β1、I型胶原和III型胶原的小鼠单克隆抗体；Abcam)孵育1.5h，然后与相应的二抗孵育2.5h。随后，将切片在PBS中洗涤3次，并在0.02％二氨基联苯胺溶液中孵育2‑ 8min。用苏木精复染后，简单洗涤载玻片，用树脂封装，并在光学显微镜下观察。 [1619] 通过蛋白免疫印迹分析Nrf2/ARE和TGF‑β/SMAD途径：蛋白免疫印迹方案在我们之前的研究中有所描述。简而言之，在冰冷的RIPA缓冲液(150mM氯化钠、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5％脱氧胆酸钠、1.0％NP‑40、PMSF 1mM和50mM Tris，pH 8.0)中裂解心肌组织以提取总蛋白。通过BCA蛋白测定试剂盒(Medchem Express，USA)对总蛋白浓度进行定量。通过12％SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离等量的蛋白质。然后，将蛋白质从凝胶转移到聚偏氟乙烯膜上。用5％脱脂乳封闭后，将膜在一抗(Nrf2、HO‑1、TGF‑β1、p‑Smad2、Smad2、p‑Smad3、Smad3、Smad7、α‑SMA 1:1000，Abcam)中孵育过夜。使用特异性辣根过氧化物酶偶联二抗(CWBIO)检测条带。β‑肌动蛋白(1:1000，Abcam)用作总细胞蛋白的参考物。 [1620] 实施例5.6：糖尿病和糖尿病伤口愈合的治疗和/或预防 [1621] 使用链脲佐菌素的糖尿病鼠模型(STZ诱导的糖尿病)用于评估本发明化合物对于糖尿病伤口愈合的功效并产生组织样品以允许皮肤组织的生存期后分析。 [1622] 动物：共植入104只5‑7周龄、体重约25‑30g的雌性CD‑1小鼠用于研究。这些动物购自Charles River，抵达后适应了7天。 [1623] 动物饲养：将小鼠饲养在IVC笼子(每个笼子最多5只小鼠)，通过尾部标记识别个体小鼠。笼子、垫子和水在使用前都经过消毒。向动物提供了玉米芯富集垫料，以提供环境富集和筑巢材料。每个笼子都用卡片清楚地标记，标明了动物数量、性别、品系、DOB、研究编号以及开始日期和处理。每周更换一次笼子，必要时更换食物和水。 [1624] 动物饲养室保持如下：‑室温为20‑24℃，湿度为30‑70％，采用12h光/暗循环。 [1625] 无菌技术和给药：尽管本研究中使用的动物具有免疫能力，但给药溶液的制备和动物的给药/称重是在无菌生物安全柜中进行的。IV给药：将化合物配制在5％DMSO:10％ Solutol:10％PEG400:75％PBS中，并用0.5M NaOH溶液将pH值调至7。PO给药：制剂在水中。 [1626] 在给药当天配制药物溶液，将给药结束时剩余的任何药物溶液储存在‑20℃下。 [1627] 研究设计：小鼠(阴性对照组除外)每日注射STZ(55mg/kg；IP)，连续5天。小鼠在注射前饥饿6小时。诱导完成后一周，监测葡萄糖水平，将水平低于15mml/L(280mg/gL)的小鼠从研究中移除，因为它们未达到理想的糖尿病严重程度。对动物进行麻醉，并使用无菌活检穿孔器造成全厚6mm的伤口。对伤口进行成像(第0天)。每2天对动物进行处理并成像，直至第14天(当对照组非糖尿病小鼠伤口愈合时)。伤口图像以数字方式评估伤口面积和闭合百分比随时间的变化，并以图形方式绘制。 [1628] 表48： [1629] 组 动物数量 测试的化合物 剂量水平；途径1 3(3) 阴性对照(非诱导的) 载体；IV 2 3(3) 阴性对照(诱导的) 载体；IV 3 8(3) 吡非尼酮 250mg/kg；PO 4 8(3) Ia‑001a 15mg/kg；IV 5 8(3) Ia‑001aTZ 15mg/kg；IV 7 8(3) Ib‑010a 15mg/kg；IV 8 8(3) IIIc‑061a 15mg/kg；IV 9 8(3) IVc‑059a 15mg/kg；IV 10 8(3) IVc‑059a 150mg/kg；PO [1630] 处理将持续2周(14天)。括号中的动物数量给药7天，然后取样用于研究中期PD分析。 [1631] 表49：研究时间表： [1632] [1633] 连续观察 [1634] 体重：每天测量并记录研究中所有小鼠的体重；该信息用于计算每只动物的精确剂量。 [1635] 一般体征和症状：每天观察小鼠，注意任何痛苦体征或一般状况变化，如皮毛呈星形、缺乏运动、呼吸困难。 [1636] 研究中期取样：给药7天后，处死每组3只动物，取出伤口组织，分为2个部分(A)和(B)： [1637] (A)第一部分为FFPE，并用以下染色：H&E、Masson’s Trichrome、CD31、TGF‑β。 [1638] (B)将第二部分均质化并用于以下ELISA：SOD、GTPx、过氧化氢酶、TNF‑α、IL‑6、TGF‑β水平。 [1639] 终止：通过吸入CO2扑杀终末研究动物。终止前，对动物称重。提前终止：如果测量到体重减轻≥20％，并且任何受损动物表现出严重体征和症状或无法进食/饮水，则进行动物的提前终止。 [1640] 结果： [1641] 血糖：与非诱导的载体对照相比，用STZ诱导导致血糖显著升高。与诱导的载体对照相比，用Ia‑001a、IIIc‑061a和IVc‑059a IV处理导致血糖水平显著降低。7天后，在STZ诱导的糖尿病模型中，所有化合物已经显示出一定程度的加速伤口愈合(图10，在给药7天后 每组取样3只动物)。对皮肤组织进行取样。 [1642] 实施例5.7：糖尿病足溃疡的治疗和/或预防 [1643] 使用如Zhang Y et al.(J Diabetes Res.2016,2016,5782904.doi:10.1155/2016/5782904)所述的糖尿病溃疡的大鼠模型来测试本发明的化合物。 [1644] 皮肤和其他粘膜组织的伤口愈合涉及一系列复杂的事件，其包括凝血情况、急性和慢性炎症、再上皮化、肉芽组织形成、伤口收缩和结缔组织重塑。然而，一些遗传性和获得性疾病，如衰老、营养不良(如维生素C和蛋白质缺乏)、感染、缺氧和遗传性疾病如Ehlers‑Danlos综合征，均可损伤这一修复过程。在这些疾病中，糖尿病是伤口受损或无法愈合的最常见原因。例如，令人震惊的数据显示，85％的不愈合糖尿病足溃疡最终需要截肢，这突显了长期高血糖的临床意义。最近一项研究的作者概述的“慢性伤口途径”集中于以巨噬细胞活化(以及中性粒细胞积聚)为特征的长期或慢性炎症，这导致促炎细胞因子、活性氧、基质金属蛋白酶(MMP)和其他中性蛋白酶(如弹性蛋白酶)水平升高。这种情况，加上内源性蛋白酶抑制剂的缺乏，都会导致“基质过度降解、生长因子降解和上皮形成受损”。 [1645] 在第一个实验中，通过尾静脉向15只成年雄性Sprague‑Dawley大鼠(体重300‑325g，Charles River Laboratories International,Inc.,Wilmington,MA)注射10mM柠檬 酸盐缓冲液pH 4.5(非糖尿病对照，NDC)或含有链脲佐菌素的相同溶液(STZ；ENZO Life Sciences,Inc.,Plymouth Meeting,PA；70mg/kg体重)，以诱导I型糖尿病。然后将大鼠分为下述5个实验组(n＝3只大鼠/组)。所有大鼠都可以无限制地获取物和水。在48小时内，注射STZ的大鼠在其尿液中显示出严重升高的葡萄糖水平。在诱导糖尿病三周后，剃去所有大鼠的背部皮肤，并使用外科环钻在每只大鼠中制造一系列六个标准伤口，每个伤口的直径为 6mm。建立以下5个实验组(本初始实验中，所有组均处理7天；在以下的实验3中描述了一项长期研究)：通过每天局部施用白色凡士林(“载体”)处理的非糖尿病对照(NDC)大鼠；每日单独用载体局部处理的糖尿病大鼠(D组)；用测试化合物处理的糖尿病大鼠。 [1646] 在该时间段结束时，通过用卡尺测量以毫米计的伤口直径，对每只大鼠的六个圆形伤口进行临床评估，采集血样，处死大鼠，并解剖皮肤样本以进行组织学/组织化学和生物化学评估，如下所述。 [1647] 创建标准化伤口后的第7天，将所有动物麻醉，并采集血样以测量血糖(一触式超血糖仪；Johnson&Johnson,New Brunswick,NJ)和HbA1c(Bayer A1CNow Selfcheck, Sunnyvale,CA)，并且在完成以下步骤后，通过吸入CO2处死大鼠。 [1648] 拍摄照片用于临床测量，以评估伤口闭合情况(每个实验组18处伤口)。通过在治疗方案前后测量每个伤口的直径(以毫米计)，来计算伤口表面的减少百分比。 [1649] 在第7天，从每只大鼠的两个部位切除伤口组织，并合并用于生物化学分析。将每个组织池均质化，在4℃下用5M尿素在含0.2M NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris‑HCl缓冲液 (pH 7.8)中萃取过夜，然后在11,000×g下离心1小时，如我们之前所述。将上清液用Tris‑HCl、NaCl和CaC12缓冲液透析，并通过加入硫酸铵使蛋白酶部分纯化至60％饱和度。沉淀的蛋白酶通过ELISA分析胶原酶MMP‑8(Sigma‑Aldrich Life Sciences Inc.,St.Louis,MO) 和MMP‑13(TSZ Scientific LLC,Framingham,MA)。 [1650] 取两个伤口部位(包括周围非伤口组织)的活检组织，并在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后转移至50％乙醇中，然后进行粗化、醇脱水、二甲苯清除、石蜡包埋和切片。用H&E和Masson's Trichrome对5微米切片进行染色，并使用校准的目镜测微计和确认 的图像分析从组织形态计量学角度测量伤口边缘之间的距离。解剖每只大鼠最后两处伤 口，水解，并分析羟脯氨酸，如下所述。 [1651] 在14天和30天处理方案结束时，物理测量以及组织学和组织化学评估与上述7天实验所述的那些相同。此外，在所有三个时间段内，来自6mm穿孔活检的组织样本在2N NaOH中在120℃下水解两次，每次1小时。然后分析50μL等份的皮肤组织水解产物中的羟脯氨酸，羟脯氨酸是一种基本上只存在于胶原中的氨基酸。 [1652] 实施例5.8：糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病的治疗和/或预防 [1653] 本发明的化合物的治疗功效使用糖尿病小鼠模型来评估，所述糖尿病小鼠模型使用具有STZ诱导的糖尿病和随后的糖尿病视网膜病变(包括肾功能损伤)的DBA/2小鼠品系。 在连续5天通过低剂量STZ注射诱导糖尿病5周后，与年龄匹配对照的36.9倍相比，尿白蛋 白:Cr比值为424倍。 [1654] 对于糖尿病肾病的治疗，使用STZ(连续5天低剂量)诱导DBA/2小鼠。诱导完成后一周，监测葡萄糖水平，并将水平低于15mml/L(280mg/0.1L)的小鼠从研究中移除，因为它们未发生足以导致肾功能损伤的严重糖尿病。每周和STZ诱导后5周监测血糖水平。通过测量 尿白蛋白和肌酐水平并确认其在所需范围内，来进行肾功能损伤的生物化学评估。在成功 完成该阶段后，将动物分配到治疗组。 [1655] 治疗进行四周(IV给药)，其中每周评估血糖和尿白蛋白/肌酐水平。在动物治疗期结束时，采集下列样本： [1656] ‑用于测量血糖和血尿素氮(BUN)的血液 [1657] ‑用于测量血清肌酸酐的血液 [1658] ‑最终白蛋白/肌酸酐比值的尿液 [1659] ‑切除肾脏并进行FFPE：进行Picro‑Sirius Red、Masson’s Trichrome和H&E染色，以确定纤维化区域，以及系膜硬化、小动脉透明变性、肾小球基底膜(GBM)增厚的证据。 [1660] 为了评估化合物对糖尿病视网膜病变的作用，动物每周通过眼底照相机拍摄图像。就在处死之前，通过尾静脉向动物注射FITC‑葡聚糖。取样时，取眼睛，并固定在福尔马林中。制备视网膜铺片(Flatmount)并进行荧光检查，观察化合物对血管分布和血管渗漏的作用(通过高背景染色指示)。动物组(n＝8只小鼠/组): [1661] 表50： [1662]组 动物数量 化合物 1 3 阴性对照(非诱导的) 2 3 阳性对照(诱导的) 3 8 卡托普利50mg/kg 4 8 Ia‑001a 15mg/kg I.V. 5 8 Ia‑001aTZ 15mg/kg I.V. 6 8 Ic‑007a 15mg/kg I.V. 7 8 Ib‑010a 15mg/kg I.V. 8 8 IIIc‑061a 15mg/kg I.V. 9 8 IVc‑059a 15mg/kg I.V. 10 8 IVc‑059a 150mg/kg P.O. [1663] 治疗持续4周(28天)，其中每周测量血糖和尿白蛋白/肌酸酐。 [1664] 最后一次化合物(药剂)给药、器官和血液取样后处死。 [1665] 表51：研究时间表 [1666] [1667] 连续观察 [1668] 体重：每天测量并记录研究中所有小鼠的体重；该信息用于计算每只动物的精确剂量。 [1669] 一般体征和症状：每天观察小鼠，注意任何痛苦体征或一般状况变化，如皮毛呈星形、缺乏运动、呼吸困难。 [1670] 取样和生存期后分析 [1671] ●在终末取样前，每组4只动物注射FITC‑葡聚糖，以用于视网膜铺片评估。 [1672] ●终末取样： [1673] ○通过心脏穿刺采集终末血样，并从每只动物制备血浆/血清。 [1674] ■测量血糖 [1675] ■测量血清肌酸酐 [1676] ■测量BUN [1677] ■尿ALB/肌酸酐 [1678] ■CRP、TNF‑α、IL‑6和TGF‑β的ELISA [1679] ■储存剩余血浆用于细胞因子分析 [1680] ○切除肾组织并称重 [1681] ■将一个肾速冻，以用于可能的生物分析或其他分析。 [1682] ■将一个肾固定在福尔马林中，并包埋在石蜡中。 [1683] ●H&E和Masson’s Trichrome染色筛查 [1684] ○系膜和肾小球硬化， [1685] ○小动脉透明变性 [1686] ○GBM增厚 [1687] ○眼组织为FFPE [1688] ■另一只眼(每个治疗组4只)用于视网膜铺片分析，以测量血管模式 [1689] ■血管覆盖的区域 [1690] ■血管渗漏评估 [1691] 终止：通过吸入CO2扑杀终末研究动物。终止前，对动物称重。 [1692] 结果：化合物Ia‑001a、IIIc‑061和IVc‑059a显著降低了具有STZ诱导的糖尿病的DBA/2小鼠品系中的血糖水平，如图9所示(显示了一周和两周)。 [1693] 实施例5.9：白塞病(BD)的治疗和/或预防 [1694] 使用如ZHENG et al.(Acta Derm Venereol 2015；95:952–958)所述的白塞病鼠模型测试本发明的化合物的治疗功效。 [1695] 白塞病是一种慢性、复发性、多系统性、炎性病症，其主要影响口腔和泌尿生殖粘膜及葡萄膜。虽然尚不清楚白塞病的病因和发病机制，但已提出了许多病因，包括环境、感染和免疫因素；以循环免疫复合物和补体激活为特征的自身免疫基础获得了越来越多的接受。为了测试和了解白塞病的免疫发病机制，基于环境污染物、细菌和人热休克蛋白衍生肽以及病毒注射建立了动物模型。单独和/或同时使用这些动物模型可以更有效地研究白塞 病。 [1696] 最近已经开发了动物模型来寻找有效和安全的治疗方案。中性粒细胞活化是BD免疫发病机制之一。中性粒细胞在先天性免疫反应中起关键作用。由于典型的BD病变如脓疱 性毛囊炎、过应性反应和眼前房积脓有明显的中性粒细胞浸润，因此研究了中性粒细胞功 能和活化状态。关于BD中增加、正常或减少的基础和fMLP刺激的超氧化物生成、吞噬作用、趋化性和中性粒细胞‑内皮粘附的报告相互矛盾。在BD的HLA‑转基因mic假定模型中，观察到的唯一异常是对fMLP反应的超氧化物释放增加。在同一研究中，HLA‑B51+患者和健康对照者中也存在高超氧化物反应。 [1697] 通过在4‑5周龄雄性癌症研究所(ICR)小鼠中接种在Vero细胞中生长的HSV 1型，建立白塞病样小鼠模型。简而言之，用针划破实验小鼠的耳垂，然后用病毒接种两次，间隔 10天。在最后一次接种后观察感染小鼠16周。将出现至少2种白塞病样症状的接种HSV的小 鼠用作BD样小鼠模型(n＝5)。未感染的ICR小鼠(n＝2)和接种HSV但无症状的小鼠。 [1698] 实施例5.10：葡萄膜炎(UVE)的治疗和/或预防 [1699] 本发明化合物的治疗功效使用如Fruchon S et al.(Molecules.2013；18(8):9305–9316.公开于2013年8月5日，doi:10.3390/molecules18089305)所述的大鼠自身免疫性葡萄膜炎(包括内毒素诱导的葡萄膜炎(EIU))的动物模型来测试。该模型被认为是人前 葡萄膜炎的临床相关模型。它包括全身给予脂多糖(LPS)，这会导致眼睛前段和后段的急性炎性反应，并导致血眼屏障破坏和炎性细胞浸润。EIU的临床体征反映了在人疾病中观察到的变化。因此，与“黄金标准”地塞米松相比，在大鼠的EIU模型中测试了本发明化合物的治疗效果。 [1700] 动物：仅纳入无可见眼缺陷体征的动物。在预测试期间对动物进行检查，并特别注意眼睛。在实验前对它们进行为期一周的观察。动物被单独饲养在标准笼子里，可以自由获取食物和自来水。 [1701] 眼耐受性研究：本研究由三组三只雄性Sprague‑Dawley大鼠组成。第0天，对动物称重，进行麻醉，并在双眼中进行单次5μL玻璃体内注射给药。第一组接受盐水载体(NaCl 0.9％)，其他组接受不同剂量的本发明化合物。然后通过临床观察和眼部检查评估每只动 物。眼部检查包括眼底镜检查和使用荧光素染料对角膜进行裂隙灯检查(SLE)，以实现 McDonald‑shaddak评分。McDonald‑Shadduck评分系统针对：结膜参数(充血、肿胀和分泌物)、房水闪光(Tyndall现象的强度)作为血水屏障破坏的推定证据；虹膜中的第二和第三 血管的注射；角膜的混浊度、其相对面积、新血管形成和上皮完整性(荧光素标记)；晶状体的完整性。最后一次眼部检查后，处死所有动物。尸检时采集眼球，在改良的Davidson溶液中固定12h，然后在10％中性缓冲福尔马林中固定，并进行组织学处理。由经过委员会认证的兽医病理学家通过光学显微镜评估苏木精‑伊红染色的组织切片。 [1702] 内毒素诱导的葡萄膜炎(EIU)大鼠模型：将36只雌性白化Lewis大鼠随机分为6组，每组6只动物。通过100μL爪垫注射含200μg LPS(来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的脂多糖，Sigma‑Aldrich,Saint‑Quentin,France)的无菌无热原盐水溶液来诱导EIU。在EIU诱导前，立即对动物进行处理，在双眼中进行5μL玻璃体内注射不含活性成分的盐溶液(NaCl 0.9％)，或使用测试化合物或20μg地塞米松。在第24h(即此模型中疾病的临床峰值)，通过裂隙灯(SLE)检查动物。每只眼的临床眼部炎症强度评分等级为0至5。 0级表示无炎症。1级表示存在最小程度的虹膜和结膜血管扩张，但未观察到前房(AC)内有 闪光或细胞。2级表示存在中度虹膜和结膜血管扩张，但AC中无明显闪光或细胞。3级表示在AC中存在强烈的虹膜血管扩张、闪光和每个裂隙灯视野中少于10个细胞。4级表示存在比3 级更严重的临床体征，其中AC中每个裂隙灯视野中有十个以上的细胞，有或没有眼前房积 脓的形成。5级表示存在强烈的炎性反应，AC中形成纤维蛋白，瞳孔完全闭塞。实验结束时，即LPS攻击后24h，通过腹腔注射戊巴比妥(30mg/kg)麻醉大鼠，然后用致死剂量的戊巴比妥处死大鼠。 [1703] 眼液中细胞因子浓度的测量：处死后，取每只动物双眼的房水和玻璃体。通过多重分析测定促炎性T辅助细胞因子TNFα、IL‑1β、IL‑2、IL‑6、IL‑17、IFNγ以及抗炎性细胞因子IL‑4和IL‑10的数量。 [1704] 血清中细胞因子浓度的测量：实验结束时采集三组大鼠的血清(盐水载体、化合物10μg和地塞米松)，并储存在‑80℃下。根据制造商的说明，他们用于在FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)上使用流式微珠阵列(大鼠CBA Flex set，BD Biosciences，San Jose，CA，USA)同时测定五种细胞因子(IFNγ、TNFα、IL‑2、IL‑4和IL‑10)水平。使用FCAP阵列软件(BD Biosciences)相对于标准曲线分析每种细胞因子的量。 [1705] 实施例5.11：糖尿病感觉运动性多发性神经病和糖尿病性神经病的治疗和/或预防 [1706] 使用糖尿病周围神经病的大鼠模型测试本发明化合物的治疗功效(Kambiz S.et al.(PLoS One.2015；10(6):e0131144]；PLoS One.2015；10(5):e0126892.公开于2015年5月18日，doi:10.1371/journal.pone.0126892)。 [1707] 动物：WAG/RijHsd雌性大鼠(n＝27，10周龄，体重130‑150克)购自Charles River(l'Arbresle,France)。将动物在室温下按照12小时光/暗时间表，成对饲养在带罩笼子中，并随意给予水和食物。 [1708] 糖尿病诱导：如前所述，通过在0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中以65mg/kg体重的剂量单次腹腔注射STZ(Sigma‑Aldrich,St.Louis,MO,USA)在21只大鼠中诱导糖尿 病。大鼠随机分为3组：A、B和C(每组n＝7)。糖尿病诱导后，A组在4周后处死，B组在6周后处死，C组在8周后处死。对照组由6只大鼠组成，它们接受单次腹腔注射等体积的不含STZ的载体。对照组大鼠随访8周。血糖由血糖仪(OneTouch,LifeScan,Milpitas,California,USA) 从尾静脉血液中测量。当诱导糖尿病后的整个4周内血糖水平高于20mmol/L时，大鼠被诊断为糖尿病。 [1709] 足底后爪皮肤的血流量和氧合：使用组合式激光多普勒血流计和分光光度法系统(O2C,LEA Medizintechnik,Giessen,Germany)无创测量无毛足底后爪的血流量和氧饱和 度。在糖尿病大鼠和对照大鼠中，在第4、6和8周评估氧饱和度百分比和皮肤血流量。 [1710] 冷暴露后的复温率：使用内置红外数码摄像机(320×240像素)通过1Hz数据采集系统(ThermaCAM Researcher 2001HS；FLIR Systems,Berchem,Belgium)来评估皮肤温度，所有数据均由笔记本电脑连续采集。相机和后爪之间的距离是13cm±2cm。温度记录的像素 大小为0.8×0.8mm。将动物置于14℃平板上5秒钟后固定动物时，记录整个足底后爪的皮肤 温度。使用ThermaCAM Researcher Pro(2001‑HS版；FLIR Systems,Wilsonville,Oregon,USA)将足底后爪的最低温度导出为文本文件。通过在整个足底后爪周围画一条线来选择目 的区域。平均复温率显示为每120秒皮肤温度的升高。 [1711] 热敏性：如前所述，进行冷板和热板测试，以确定是否出现热敏性。简而言之，将大鼠置于透明壁的开放式室中，其中表面温度为5℃(冷板)或50℃(热板)。这些实验在不同的日期进行，以防止干扰。观察到后爪缩回或舔舐的时间。 [1712] VonFrey测试：在用于测定伤害性感觉的机械敏感阈值的Von Frey测试中，将每只大鼠放入有网状金属底板的室中。然后，如前所述，使用2至300克的von Frey毛发5次，并当观察到最少3次爪轻弹(动物的反射性退缩反应)时，评分为阳性。对照组作为参考组。 [1713] 肌电图(EMG)：通过记录糖尿病组和对照动物腓肠肌诱发的CMAP峰‑峰振幅和潜伏期，来评估肌肉中运动轴突的神经支配。记录CMAP峰‑峰振幅和潜伏期，并对一批20个响应进行平均。将每个糖尿病组的平均振幅与对照组进行比较。MNCV计算为刺激电极至记录电 极的距离(mm)/潜伏期(ms)。 [1714] 组织制备：4、6或8周后，使用过量戊巴比妥(100mg/kg ip)处死动物。对于每只大鼠，解剖后爪足底皮肤，并在4℃下直接浸入固定在2％多聚甲醛‑溶素‑高碘酸盐(PLP)中24小时。如前所述，对皮肤进行进一步处理并包埋在明胶中。最后，将包埋的皮肤用冷冻切片机在40μm处切片，并收集在甘油中，以便在‑20℃下长期储存。 [1715] 取大鼠胰腺组织，固定于10％中性缓冲福尔马林溶液中，并包埋在石蜡中。随后，用苏木精和曙红(H&E)对这些样本进行染色。每个样本使用亮视野显微镜评估，并扫描到数字载玻片上(Nanozoomer 2.0系列,Hamamatzu,Japan)。 [1716] 免疫组织化学：如前所述，进行皮肤切片的免疫组织化学，以半定量支配皮肤的感觉神经纤维的密度，并评估CD‑31阳性内皮细胞的存在。将皮肤切片在含有稀释的一抗蛋白基因产物9.5(PGP9.5,1/10.000,抗大鼠,Enzo Life Sciences,New York,USA)或抗‑CD31+(1/5000,抗大鼠,Spring Bioscience,California,USA)的2％BSA混合液中于4℃孵育48小 时。随后，将皮肤切片与用辣根过氧化物酶(HRP)(1/200,Biotine,Sigma‑Aldrich, St.Louis,MO,USA)标记的适当二级生物素化的抗体在室温下孵育90min。然后，使用3,‑3’二氨基联苯胺(DAB)反应来揭示一抗的抗原结合位点。此后，将切片封装在载玻片上，并用 0.05％硫素将CD31+染色切片染色4分钟，其使角质形成细胞呈蓝色。最后，使用无水乙醇(< 0.01％甲醇)对所有皮肤切片进行脱水，转移至二甲苯中，并用Permount(Fisher Scientific,Hampton,NH)盖上盖片。 [1717] 通过Nanozoomer 2.0系列(Nanozoomer 2.0系列,Hamamatzu,Japan)对每块皮肤切片进行3层每层8μm扫描。使用ImageScope软件(Aperio ImageScope v11.1.2.760)中的 40倍物镜，对足底后爪的4个近端和4个远端皮肤切片进行足底后爪中心部分(80.000μm2) 中的表皮神经纤维的定量。计算每只大鼠每mm2的平均标记的神经纤维和平均表皮厚度。通过Leica Cell‑D(Olympus,Imaging software for life science microscopy,USA)在足 底后爪的整个真皮上部的4个近端和4个远端皮肤切片中计算CD31阳性细胞百分比。 [1718] 实施例5.12：肠纤维化的治疗和/或预防 [1719] 使用如Pham BT et al.(Physiol Rep.2015；3(4):e12323.doi:10.14814/phy2.12323)所述的大鼠或鼠模型来测试本发明化合物的治疗功效。 [1720] 大鼠和小鼠肠芯的制备：使用成年非禁食雄性Wistar大鼠和C57BL/6小鼠(Harlan PBC,Zeist,The Netherlands)。将大鼠和小鼠饲养在温度和湿度受控的室中，进行12h光/ 暗循环，其中随意喂食食物(Harlan chow no 2018,Horst,The Netherlands)和水。使动物在实验开始前适应至少7天。 [1721] 大鼠和小鼠用异氟烷/O2(Nicholas Piramal,London,UK)麻醉。切除大鼠空肠(距胃远端约25cm，长15cm)和小鼠空肠(距胃远端约15cm，长10cm)，并保存在补充有25mm d‑葡萄糖(Merck,Darmstadt,Germany)、25mm NaHCO3(Merck)、10mm HEPES(MP Biomedicals, Aurora,OH)、饱和碳合气(95％O2/5％CO2)的冰冷Krebs‑Henseleit缓冲液(KHB)中，并调节至pH 7.4。通过内腔冲洗KHB而清洁空肠，随后将其分成2cm的片段。这些片段在37℃下用 3％(w/v)琼脂糖溶液于0.9％NaCl中填充，并包埋在琼脂糖芯包埋单元中。 [1722] 人肠芯的制备：从接受胰十二指肠切除术的患者切除的肠中获取健康的人空肠组织用于研究。 [1723] 将健康的空肠保存在冰冷的KHB中，直至进行包埋步骤。在收集组织后一小时内，小心地从粘膜上去除粘膜下层、肌层和浆膜。粘膜分为0.4cm×1cm片。将这些片在37℃下包埋在于0.9％NaCl中的3％琼脂糖(w/v)溶液中，并插入包埋单元。 [1724] PCIS的制备：PCIS由Krumdieck组织切片器(Alabama Research and Development)在冰冷的KHB中制备。湿重为3‑4mg的切片估计厚度为300‑400μm。切片在冰冷的KHB储存，直至实验开始。 [1725] 肠切片的孵育：切片在用于人PCIS(hPCIS)和大鼠PCIS(rPCIS)的12孔板中孵育，或在用于小鼠PCIS(mPCIS)的24孔板中孵育。hPCIS和rPCIS在1.3mL以及mPCIS在0.5mL含有 L‑谷氨酰胺(Invitrogen,Paisly,UK)，并补充有25mm葡萄糖、50μg/mL庆大霉素 (Invitrogen)和2.5μg/mL两性霉素B(Invitrogen)的Williams培养基E中单独孵育。在孵育箱(MCO‑18M,Sanyo)中孵育(37℃，80％O2/5％CO2)期间，以90rpm(振幅2cm)水平摇动板。孵育rPCIS长达24h，孵育mPCIS和hPCIS长达72h，含或不含浓度范围为1至10ng/mL的人TGF‑β1(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)。所有孵育均以多种方式进行(使用3‑6个切片在单独孔中单独孵育)，并对3至16个不同的人、大鼠或小鼠的肠重复进行。 [1726] 活力和形态：通过测量PCIS的三磷酸腺苷(ATP)含量评估活力。简而言之，孵育后，将切片转移至1mL超声处理溶液(含70％乙醇和2mm EDTA)，在液氮中速冻并在‑80℃下储存。为测定活力，使用ATP生物发光试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)，超声处理45秒并在4℃下以16.000×g离心2min的样本上清液中测量ATP水平。ATP值(pmol)归一 化为通过Lowry方法(BIO‑rad RC DC Protein Assay,Bio Rad,Veenendaal,The Netherlands)估算的PCIS总蛋白含量(μg)。为了评估形态，将培养的切片固定在4％福尔马林中，并包埋在石蜡中。切割4μm的切片，并用苏木精和曙红(HE)染色。HE切片根据改良的Park评分进行评分，该评分描述了缺血和再灌注后肠组织损伤的发展顺序。PCIS的七个部 分的完整性以0到3的等级评分。上皮、间质、隐窝和肌肉层的活力分别评分：如果没有坏死，评分为0；如果存在大面积坏死，评分为3。肠切片的其他部分评分如下：上皮形态：0＝立方上皮，3＝2/3以上细胞扁平，绒毛扁平：0＝正常，3＝2/3以上绒毛扁平，水肿量：0＝无水肿， 3＝重度水肿。最高分21表示严重损伤。在人样本中，粘膜肌层的形态评分在“肌肉层”部分测定。B.T.P.、W.T.v.H.和J.N.进行盲法评分；计算三个总分的平均值。 [1727] 基因表达：纤维化基因，即COL1A1、αSMA、HSP47、CTGF、FN2、TGF‑β1、PAI‑1、SYN的表达采用Taqman或SYBRgreen法测定。在hPCIS中，还采用SYBRgreen法测量了ELA基因的表达。 [1728] 肠纤维化是炎性肠病(IBD)患者的一种严重但常见的结果。尽管在开发控制IBD的慢性肠道炎症特征的新治疗方法方面取得了进展，但迄今为止还不存在有效的抗纤维化治 疗。因此，更深入地了解肠纤维化的分子机制和相关动物模型的可用性对于推进这一研究 领域至关重要。 [1729] IL‑17和相关介质：Th17细胞定义了T辅助细胞的一个亚群，主要产生IL‑17A，还产生IL‑17F、IL‑21和IL‑22，并且越来越多地被认为在几种慢性炎性病症包括IBD(7)中至关重要。IL‑17A与多个器官的纤维化有关，包括肺(8)、肝(9)和心脏(10)；最近的研究也支持其在肠中的作用，将IL‑17/Th17免疫应答和其他相关介质与肠纤维化的发病机制联系起来。 [1730] 下文描述了肠纤维化的其他动物模型： [1731] 表52： [1732] [1733] 实施例5.13：卵巢纤维化的治疗和/或预防 [1734] 使用Pala et al.(Drug Des Devel Ther.2015；9:1761–1766.公开于2015年3月24日，doi:10.2147/DDDT.S75266)记载的卵巢过度刺激综合征(OHSS)鼠模型测试本发明化 合物的治疗功效，以在实验环境中检查测试化合物对卵巢过度刺激综合征(OHSS)的卵巢组 织病理学、血清VEGF和内皮素1水平的影响。 [1735] 动物：使用22日龄的雌性Wistar白化大鼠，随机分组。在15只大鼠中连续4天皮下给予促卵泡激素10IU，其中第5天用30IU人绒毛膜促性腺激素进行OHSS诱导。第1组包括35 日龄的对照大鼠，第2组包括35日龄的OHSS大鼠，第3组包括接受测试化合物7天的27日龄的OHSS大鼠。然后在第35天将所有大鼠断头。评估所有大鼠的血清VEGF、内皮素1和卵巢滤泡储备。 [1736] 在第13天进行血细胞比容和体重测量，在第35天在全身麻醉下，通过腹腔注射给予氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)进行断头。 [1737] 酶联免疫吸附试验：从每只断头大鼠中获得约3mL血样。通过以2,500rpm离心血样4分钟来分离血清，并在‑20℃下保存，直至进行VEGF和内皮素1检测。使用小鼠VEGF酶联免疫吸附测定试剂盒(ELM‑VEGF‑001；RayBio,USA)测定VEGF，使用内皮素1E/试剂盒(EK‑023‑ 01；Phoenix Pharmaceuticals,USA)测量内皮素。 [1738] 卵巢形态：剖腹手术后，取出卵巢，清除培养基中的粘附组织，并称重。卵巢组织用10％甲醛固定，然后将石蜡包埋的组织样本切成4μm横截面，用于估计平均卵巢卵泡计数。 将切片用Masson’s trichrome染色，以在光学显微镜(Olympus BX‑50)下测定OFR。根据之前描述的方法，将4μm厚的横截面以50μm的间隔封装在显微镜载玻片上，以防止对同一结构计数两次。12卵泡分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和三级卵泡。闭锁卵泡(AF)定义为具有十个以上致密核的卵泡；对于最小的卵泡，闭锁的标准是退化的卵母细胞，早熟的窦形 成，或两者兼有。 [1739] 主要结果测量：主要结果测量为年龄(天)、体重(g)、血细胞比容(％)、卵巢重量(mg)、VEGF(pg/mL)和内皮素1(ng/mL)的血清水平以及总卵泡计数，同时测定原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和三级卵泡的数量。 [1740] 实施例5.14：多囊卵巢综合征(PCOS)的治疗和/或预防 [1741] 使用如Wang D et al.(J Ovarian Res.2018；11(1):6.公开于2018年1月10日，doi:10.1186/s13048‑017‑0375‑7)所述的DHEA诱导的卵巢过度纤维化动物模型来测试本发明化合物的治疗功效。 [1742] 多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的代谢和内分泌病症，其病理机制尚不清楚。以下研究探讨了脱氢表雄酮(DHEA)诱导的多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠模型中通过转化生 长因子‑β(TGF‑β)信号通路形成卵巢过度纤维化。 [1743] 动物：本试验使用30只21日龄、体重～50g的雌性Sprague‑Dawley(SD)大鼠。将动物饲养在无特定病原体(SPF)环境中，温度为22±1℃，相对湿度为50±1％，光/暗循环为12/12h。可自由获取食物和水。 [1744] 方法：将30只雌性Sprague‑Dawley大鼠随机分为空白组(n＝6)、油组(n＝6)、油+DHEA诱导的模型组(n＝6+12)。通过连续35天皮下注射DHEA来建立模型组。将大鼠另外分为载体组(n＝6)和治疗组(n＝6)。处理每天1次，持续35天。治疗后18天，通过连续14天判断细胞类型，每天从所有大鼠中采集阴道涂片，以每天测定其发情周期。第36天，将空白组和油处理组的所有大鼠以及DHEA诱导模型组的6只大鼠处死(使用腹腔注射过量5％水合氯醛)，采集血液(从上腔静脉)，解剖双侧卵巢和子宫。 [1745] 卵巢在4％多聚甲醛中于4℃固定24h，然后包埋于石蜡中。将其余组织在‑80℃下冷冻，用于进一步蛋白免疫印迹和实时聚合酶链式反应(RT‑PCR)分析。 [1746] 来自DHEA诱导模型组的其余12只大鼠被随机分为另外两组：治疗组和载体治疗组(对照组)，每组6只大鼠。在此治疗期间，不再给予大鼠DHEA。治疗持续2周，然后将所有动物处死，采集血液，并按照上述说明解剖双侧卵巢和子宫。 [1747] 使用H&E染色、免疫组织化学和天狼星红染色检测卵巢形态、纤维蛋白和胶原在卵巢中的定位和表达。使用蛋白免疫印迹和RT‑PCR检查卵巢蛋白和RNA。 [1748] 发情周期：DHEA处理后第18天，从所有大鼠中采集阴道涂片。然后用甲苯胺蓝处理样本30min，然后在光学显微镜(Leica Microsystems,Germany)下检查细胞形态和发情周期。 [1749] 血清激素水平：从上腔静脉采集血样。立即分离血清并储存在‑20℃下，以便通过酶联免疫吸附试验(ELISA)进一步测定激素(睾酮(T)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH))(大鼠T、E2、LH和FSH ELISA试剂盒，USCN,Wuhan,China)。 [1750] 实施例5.15：原发性胆汁性胆管炎(PBC)的治疗和/或预防 [1751] 使用如Hohenester S et al.(Cells.2020,9(2),281.doi:10.3390/cells9020281)所述的PBC鼠模型来评估本发明化合物的治疗功效。 [1752] 胆汁淤积性肝病，如原发性胆汁性胆管炎(PBC)或原发性硬化性胆管炎(PSC)是慢性进行性疾病， [1753] 常导致肝硬化及其后续并发症。疏水性胆汁盐被认为可促进胆汁淤积中的肝纤维化。然而，这一被广泛接受的假设的证据仍然很少。 [1754] 在已建立的胆汁淤积动物模型中，例如通过Mdr2敲除，胆汁淤积和纤维化均继发于胆管损伤。 [1755] 因此，为了测试胆汁盐积聚对胆汁淤积性疾病中肝纤维化的特定贡献，使用了胆酸盐喂养的Atp8b1G308V/G308V小鼠中诱导性肝细胞胆汁淤积的独特模型。如HPLC所证实，补充甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)可使鼠胆汁盐池人源化。定量胆汁淤积和肝纤维化的生物标 记物。用胆汁盐刺激从野生型小鼠分离的肝星状细胞(HSC)。测定HSC的增殖、细胞积累和胶原沉积。在胆汁淤积性Atp8b1G308V/G308V小鼠中，αSMA和胶原1a mRNA的肝表达增加以及过量的肝胶原沉积表明仅在补充GCDCA后出现肝纤维化。在体外，与疏水性而非亲水性胆汁盐孵育后，肌成纤维细胞数量和胶原沉积增加，并与EGFR和MEK1/2活化有关。胆汁盐可能对HSC具有直接的促纤维化作用，推测涉及EGFR和MEK1/2信号。 [1756] 动物实验：8周龄的雄性动物用于体内研究。将动物置于12h光暗循环中，饲养在丰富的环境中，随意获取食物和水。 [1757] 血清生物化学和血清胆汁盐测量：在 910全自动分析仪(DiaSys,Holzheim,Germany)中从新鲜血清中定量碱性磷酸酶、胆红素和丙氨酸转氨酶的血清水平。 根据制造商的说明，使用Diazyme总胆汁盐试剂盒(Diazyme Laboratories,Poway,CA,USA) 对总血清胆汁盐水平进行酶法定量。 [1758] 肝组织学、免疫组织化学和羟脯氨酸定量：将石蜡块切成4μm厚切片，并封装在显微镜载玻片(Superfrost plus,Thermo Scientific/Menzel,Braunschweig,Germany)上。逐步脱蜡和再水化后，按照标准步骤用苏木精和曙红对载玻片进行染色。使用单克隆兔抗α平滑肌肌动蛋白抗体(Abcam,Cambridge,UK)对α‑SMA进行免疫组织化学。对于胶原定量，将载玻片用Direct Red 80(Sirius Red,Sigma‑Aldrich,Darmstadt,Germany)染色1h，并在 乙醇中脱色两次，在二甲苯中脱色一次。为了定量总DNA作为细胞数量的替代物，将HSC与 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)一起孵育，并使用CytoFluor 4000系统 (PerSeptive Biosystems,Framingham,MA,USA)检测荧光信号。根据制造商的说明，使用 BrdU测定试剂盒(Roche,Penzberg,Germany)对HSC的增殖进行定量。为了定量总细胞计数，将接种在Lab‑Tek II室载玻片(Nunc,Rochester,NY,USA USA)中的HSC封装在带有 Vectashield封固剂(包括DAPI(Vector,Burlingame,CA,USA))的盖玻片上。使用 Pannoramic Midi载玻片扫描仪(3DHistech,Budapest,Hungary)扫描载玻片，并使用 ImageJ2软件对完整载玻片(0.7cm2)进行细胞核计数。 [1759] 体外胶原定量：细胞用PBS洗涤，并用0.1％天狼星红于饱和苦味酸中染色1h。然后用100％乙醇洗涤细胞三次，将结合的染料溶于50％甲醇/氢氧化钠(50mmol/L)中，并在540nm下测量吸收。 [1760] 实施例5.16：肝纤维化或肝硬化(HF)的治疗和/或预防 [1761] 使用如Fransén Pettersson et al.(PLoS One.2018；13(9):e0203228.doi:10.1371/journal.pone.0203228)记载的已建立的NOD‑炎症纤维化(N‑IF)鼠模型来评估本发明的化合物抑制自发性、慢性肝炎症和纤维化的治疗功效。 [1762] 动物：N‑IF小鼠在免疫缺陷型NOD.Rag2‑/‑小鼠中产生的T细胞受体(TCR)转基因自然杀伤T(NKT)‑II细胞的驱动下，自发产生慢性炎症和肝纤维化。N‑IF小鼠肝病理学的几个组分与人疾病的那些重叠，其中进行性慢性炎症先于纤维化发展。此外，已证明N‑IF小鼠肝中发生的纤维化与表达α‑SMA的肝星状细胞的积累有关。与其他可用的肝纤维化啮齿动物模型相比，这些表型相似性使N‑IF小鼠模型具有独特性，并为测试抗纤维化候选药物的功效提供了新工具。 [1763] 每天观察动物的健康不良体征，采集尿液，并测量尿液中的蛋白质。解剖时记录肝脏和肾脏重量。解剖每只动物的肝脏和肾脏，固定、切片并使用天狼星红和H&E染色。每个肝脏的一片用于羟脯氨酸测量。 [1764] 羟脯氨酸测量：使用羟脯氨酸比色测定试剂盒(BioVision,Milpitas,CA,USA)测定肝脏和脾脏中的羟脯氨酸含量。 [1765] 组织学：处理后，将小鼠麻醉，并通过心脏内穿刺用PBS灌注。称量肝脏和脾脏，将器官活检固定在4％中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中并切片。 [1766] 实施例5.17：非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗和/或预防 [1767] 使用如Barbara Ulmasov B.et al.(Hepatology Communications,2018,3(2)‑https://doi.org/10.1002/hep4.1298)记载的NASH鼠模型来评估本发明的化合物的治疗 功效。 [1768] 小鼠：将5周龄C57BL/6J雄性小鼠饲养在标准设施中，在温度、湿度和12小时/12小时光/暗循环的受控条件下，可自由饮水。 [1769] 胆碱缺乏、L‑氨基酸定义的、高脂肪NASH小鼠模型：胆碱缺乏、氨基酸定义的、高脂肪饮食(CDAHFD)22获得自Research Diets(A06071309；New Brunswick,NJ)。该饮食被配制为高脂肪、缺乏胆碱的饮食，包括0.1％蛋氨酸和45％Kcal％脂肪(20％猪油，25％大豆油)。对照饮食是标准的啮齿动物食物，含有13.6％的脂肪热量。从6周龄开始，将30只小鼠置于CDAHFD，将30只小鼠置于标准饮食。在6周结束时，将来自每个饮食组的10只小鼠禁食5小时并处死。采集血液和肝脏样本。将肝脏分成切片，将其固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林 中，冷冻在液氮中，或置于RNA稳定溶液中以供将来评估。其余小鼠继续进食4周，共10周，然后禁食、处死并采集样本。 [1770] 生物化学分析：根据制造商的说明，使用甘油三酯比色测定试剂盒(Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)测量肝甘油三酯含量。通过高等兽医实验室(Saint Louis,MO) 对丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、葡萄糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇的血浆水平进行了商业测量。 [1771] RT‑PCR：进行实时定量逆转录聚合酶链式反应，以计算mRNA丰度的变化。 [1772] 组织病理学：将福尔马林固定的肝脏切片包埋在石蜡中，切片为5μm，并使用标准方案通过苏木精和曙红(H&E)染色进行显微镜评估。为了评估肝脏胶原含量，石蜡包埋的肝脏切片用天狼星红/固绿染料染色。天狼星红与所有类型的胶原结合，而固绿染色非胶原蛋白。 [1773] 对肝切片进行预处理以去除石蜡，并使用Weigert的铁苏木精溶液对细胞核进行染色。清洗后，用0.1％天狼星红(Direct Red 80；Sigma,Saint Louis,MO)，0.1％FCF认证的固绿(Sigma)于饱和苦味酸中染色2小时。然后，将载玻片在水中洗涤，用乙醇和二甲苯脱水，最后封装在Permaslip(Alban Scientific,Inc.,Saint Louis,MO)中。通过形态计量学分析评估胶原积累的程度。 [1774] 肝羟脯氨酸含量的测定：羟脯氨酸含量被确定为肝中存在的总胶原的量的量度。将肝组织在蒸馏水中均质化，用三氯乙酸沉淀，并在12N HCl中于105℃下水解48小时。将样本蒸发，并将干燥丸剂在蒸馏水中重构。将重构样本以13,000g离心10分钟，上清液用12N HCl稀释，使最终样本中的HCl浓度达到4N。肝羟脯氨酸含量使用敏感组织羟脯氨酸测定法 测定。 [1775] 免疫组织化学：通过标准方法对福尔马林固定的肝组织进行预处理以去除石蜡。通过在3.3％过氧化氢于甲醇中于室温下孵育1小时阻断内源性过氧化物酶活性。 [1776] 肝组织中的凋亡细胞检测：使用ApopTag过氧化物酶检测试剂盒(Millipore,Temecula,CA)，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法 (TUNEL)标记和检测DNA链断裂来鉴定肝组织中的凋亡细胞。计数具有肝细胞形态的染色的 凋亡细胞。为了检测HSC形态的凋亡细胞，TUNEL染色的肝组织随后用针对结蛋白(HSC的标 记物)的抗体染色，但用ImmPACT VIP过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories)检测 二抗过氧化物酶活性除外。 [1777] 蛋白免疫印迹：蛋白免疫印迹如所述，使用以下一抗进行：抗磷酸化母系抗十瘫同系物(decapentaplegic homolog)3(p‑SMAD3)，ab52903,1:1,000(Abcam)；抗甘油醛3‑磷酸脱氢酶(anti‑GAPDH)，sc‑25778(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Dallas,TX)。 [1778] 实施例5.18：糖尿病肾病或糖尿病肾脏疾病(DN或DKD)的治疗和/或预防 [1779] 使用I型糖尿病小鼠模型(STZ诱导的糖尿病)在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1780] 动物模型：将雄性10周龄129/SV小鼠(Charles River,Germany)关在单独通风的笼子中，接受标准饮食，可自由获取自来水。体重匹配的129/SV小鼠在第1天和第4天接受 125mg/kg体重STZ(Sigma‑Aldrich)于50mM柠檬酸钠(pH 4.5)或柠檬酸钠缓冲液(非糖尿病 对照组)中腹腔注射，用于诱导高血糖症(葡萄糖>15mmol/l)。在研究期间，小鼠不接受胰岛素。 [1781] 给予糖尿病小鼠安慰剂(盐水)或测试化合物12周。每周测量体重和血糖水平。在第6周和第12周测量HbA1c(Olympus AU400)和肾功能(血清肌酸酐)。使用小鼠白蛋白ELISA 试剂盒评估蛋白尿。 [1782] 在第6周和第12周，用2％异氟烷麻醉的小鼠中进行感觉神经传导速度(NCV)研究。通过在记录的3cm距离处沿尾部向近端刺激来测定尾部感觉NCV。测量时，使用Toennies Inc.的神经屏幕(neuro‑screen)。随访12周后，将小鼠处死，并进行双侧开胸和剖腹手术，经左心室用冰冷的盐溶液灌注肾脏。 [1783] 免疫组织化学：对于免疫荧光，处理多聚甲醛固定和石蜡包埋的组织切片(2μm)。用10％兔血清封闭后，石蜡切片用抗pP38和F4/80抗体以及与Cy3偶联的二抗染色。 [1784] 实施例5.19：STZ诱导的糖尿病模型中糖尿病肾病、糖尿病肾脏疾病和糖尿病视网膜病变的治疗和/或预防。 [1785] 总计70只5‑7周龄、体重约25‑30g的雌性CD‑1小鼠用于本研究。这些小鼠购自Charles River,UK，有7天的适应期。将动物饲养在IVC笼子中(每个笼子中最多5只)，通过尾部标记识别个体小鼠。在研究期间，允许所有动物自由获得标准认证的商业饮食和消毒 过的水。饲养室保持在标准条件下：18‑24℃，55‑70％湿度，12h光/暗循环。 [1786] 本研究中使用的所有方案均已获得动物福利和伦理审查委员会的批准，且所有程序均按照1986年动物(科学程序)法的指导方针进行。 [1787] 小鼠(阴性对照组除外)每天注射STZ(55mg/kg；IP)，连续5天。在注射前使小鼠饥饿6小时。诱导完成后一周，监测葡萄糖水平，将水平低于15ml/L(280mg/gL)的小鼠从研究中移除，因为它们未达到理想的糖尿病严重程度。每周且在STZ诱导后5周监测血糖水平。通过测量尿白蛋白和肌酸酐水平并确认其在所需范围内，进行肾功能损伤的生物化学评估。 在成功完成该阶段后，将动物分配到治疗组。 [1788] 表53： [1789]组 动物数量 药剂 剂量水平；途径 1 3 阴性对照(非诱导的) 载体；IV 2 3 阴性对照(诱导的) 载体；IV 33 8 Ia‑001a 15mg/kg；IV 4 8 Ia‑001a‑TZ 15mg/kg；IV 5 8 Ic‑001a‑Tz/1‑004a 15mg/kg；IV 6 8 Ic‑007a 15mg/kg；IV 7 8 Ib‑010a 15mg/kg；IV 8 8 IIIc‑061a 15mg/kg；IV 9 8 IVc‑059a 15mg/kg；IV 10 8 卡托普利 50mg/kg；PO [1790] 治疗持续4周(28天)，每周测量血糖和尿白蛋白/肌酸酐。研究时间表详见下文，观察每周(第5至9周)血糖水平、尿白蛋白肌酸酐比率以及终末(第9周)血液化学和细胞因子、肾脏组织学和眼视网膜渗漏。 [1791] 表54： [1792] [1793] 结果 [1794] 临床体征：许多治疗组均观察到体重最初下降，这是可以预料的，在大多数情况下，体重在给药期快结束时逐渐恢复。一些动物的体重下降到初始体重的90％以下，但是没有动物必须停止给药。 [1795] 血糖：与非诱导的载体对照相比，用STZ诱导导致血糖显著升高(表55)。在第28天，与诱导的载体对照相比，用IVc‑059a IV处理导致血糖水平显著降低**。用IIIc‑061a IV处理也导致血糖水平降低，但未达到统计学意义。 [1796] 表55：STZ诱导的糖尿病模型中雌性ICR‑CD1小鼠第0天和第28天的平均血糖浓度。所示值为平均值±SD；对于非诱导的和诱导的载体组，n＝3；对于所有其他治疗组，n＝8。 [1797] [1798] 肾脏重量：湿肾脏重量或肾脏重量占动物体重的百分比均无统计学差异。 [1799] 尿白蛋白：肌酸酐(ALB:CRE)：每周采集尿液，并对每个治疗组进行合并。在处死前的第28天最后治疗日(时间表的第9周)，用Ib‑010a、IIIc‑061a和IVc‑059a处理导致降低的ALB:CREA(表56)。 [1800] 血尿素氮(BUN)：用Ic‑007、Ib‑010a、IIIc‑061a和IVc‑059a处理导致显著低于诱导的载体对照的血尿素氮水平。 [1801] ELISA：在治疗期结束时，采集血液并加工成血清。使用市售可得的ELISA试剂盒对CRP、TGF‑β、IL‑6和TNF‑α的血清水平进行定量，结果如表56所示。 [1802] 血清CRP：28天治疗后，在STZ诱导的糖尿病模型中雌性ICR‑CD1小鼠的血清CRP水平。在STZ诱导的动物中，血清CRP水平显著升高。与载体诱导的对照相比，用Ia‑001a、Ia‑ 001aTz和对照卡托普利处理导致显著降低的血清CRP水平(分别为**p＝0.0074，*p＝ 0.0304和**p＝0.0026，单因素方差分析，表56)。 [1803] 血清TGF‑β：在STZ诱导的对照中，血清TGF‑β水平显著升高。用除Ic‑007a和IIIc‑061a以外的所有化合物处理导致TGF‑β水平显著低于载体诱导的对照(p≤0.05；单因素方差分析，表56)。 [1804] 在STZ诱导的对照中，血清IL‑6水平显著升高。用除IVc‑059a和对照化合物卡托普利以外的所有化合物处理导致IL‑6水平显著低于载体诱导的对照(p≤0.05；单因素方差分析，表56)。 [1805] 在STZ诱导的对照中，血清TNF‑α水平显著升高。用Ia‑001a、Ia‑001aTz、Ic‑001aTz/1‑004a和IIIc‑061a处理导致TNF‑α水平显著低于载体诱导的对照(p≤0.05；单因素方差分析，表56)。 [1806] 肾脏组织学：胶原定量在给药期结束时进行。处死动物并切除肾脏。组织固定在福尔马林中，并包埋在石蜡中，然后根据制造商的说明用Masson’s Trichrome染色。使用Chen et al.,2017公开的方法对胶原进行定量。与非诱导的载体对照相比，STZ诱导的载体对照中的胶原覆盖率显著增加。与诱导的载体对照相比，用IIIc‑061a和IVc‑059a处理导致显著降低的胶原蛋白水平(分别为p＝0.0210和p＝0.0134；单因素方差分析，表56)。 [1807] 疾病评分：使用H&E染色以及系膜和肾小球硬化、小动脉透明变性和GBM增厚的评估来定量肾脏疾病评分。显然，与非诱导的载体对照相比，STZ诱导的载体对照中的疾病评分显著升高。与诱导的载体对照相比，用除Ic‑001aTz/1‑004a以外的所有化合物处理导致显著降低的疾病评分(p≤0.005；单因素方差分析，表56)。 [1808] 眼睛视网膜组织学：给药期结束时，即在终末取样前，向每组4只动物注射FITC‑葡聚糖用于视网膜铺片评估，处死动物并切除眼睛。制备视网膜铺片，并使用荧光显微镜(EVOS，Thermo Fisher)成像。与非诱导的载体对照相比，STZ诱导的载体对照中脉管系统所覆盖的面积显著增加。与诱导的载体对照相比，用Ic‑007a、IIIc‑061a和IVc‑059a处理导致脉管系统覆盖率显著降低(分别为p＝0.0432，p＝0.0337和p＝0.0131；单因素方差分析，表 56)。 [1809] 表56：处理第28天(时间表的第9周)的尿白蛋白肌酸酐比值(ALB:CRE)、血‑BUN、血‑CRP、血‑TGF‑β、血‑IL‑6、血‑TNF‑α、Trichrome染色(肾纤维化)、疾病评分和眼区[1810] [1811] 实施例5.20：多囊肾病(PKD或PCKD)的治疗和/或预防 [1812] 使用Lee EC et al.(Nat Commun 10,4148(2019)描述的Pcy小鼠模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1813] 临床前模型：pcy小鼠，一种遗传相关的啮齿动物PKD模型，与人疾病密切相关，可用于新药功效评估。该模型开发了与引起人疾病的基因相关的PKD，提供了可翻译的啮齿动物模型，其密切反映了人PKD的发展。它已针对疾病进展和对治疗反应进行了全面表征，为药物发现研究提供了高度的信心。 [1814] 动物模型：pcy小鼠，CD‑1‑pcyIusm品系(CrownBio)，其携带与引起人3型肾消耗病的同一基因相关的基因突变。疾病症状和进展为缓慢进展的肾囊性疾病，囊肿在集合小管和肾单位的其他部分中随着疾病的进展变成囊性。雄性和雌性小鼠同样受到该疾病的影 响。小鼠为5周龄，分别接受正常饮食、含有载体的正常饮食(阴性对照)、均与正常饮食混合的阳性对照和测试化合物。对照：将用于化合物的载体在一个动物组中用作阴性对照，将血管加压素受体‑2(V2)拮抗剂托伐普坦在一个动物组中用作阳性对照。 [1815] 读出和终点：每周记录肾囊肿体积和纤维化，包括组织学验证、肾重量、血清BUN、血液中测试品浓度、体重和食物摄入量。 [1816] 实施例5.21：辐射诱导的纤维化(RIF)的治疗和/或预防 [1817] 使用如Ryu SH et al.(Oncotarget.2016,7(13),15554–15565,doi:10.18632/oncotarget.6952)记载的RIF小鼠模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1819] 放射诱导的纤维化(RIF)的特征是皮肤和软组织中细胞外基质过度积累，成纤维细胞增殖是放射治疗最常见的晚期并发症之一。此外，RIF是死亡纤维组织的不可逆过程，也是与重新激活的肌成纤维细胞重塑瘢痕组织相关的动态过程。 [1820] RIF小鼠模型：雄性BALB/c小鼠用于RIF小鼠模型。在麻醉下，每只小鼠右后肢用直线加速器接受44Gy(22Gy×2次，2周)放射剂量。专门设计的防护罩用于保护身体的其他部分，在皮肤上涂抹1cm厚的丸剂，以确保后腿表面有足够的放射剂量。放射后，将小鼠随机分为两组。每组每天用盐水(对照组)或化合物(治疗组)处理1次。将未接受放射或药物的小鼠用作阴性对照组。 [1821] 为了证明化合物在受辐射腿部的皮肤和软组织中的抗纤维化作用，使用H&E染色测量了从表皮表面到真皮底部的上皮厚度。 [1822] 实施例5.22：Stargard病(SD)的治疗和/或预防 [1823] 使用如Fang Y.et al.(Faseb Journal,2020,DOI:10.1096/fj.201901784RR)记载的SD小鼠模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1824] 动物：有色小鼠Abca4‑/‑小鼠(129S4/SvJae‑Abca4tm1Ght)购自Jackson实验室(Bar Harbor,Maine,USA)。有色野生型(WT)小鼠(129S2/SvPas)获得自Janvier Labs(Le Genest‑Saint‑Isle,France)。每组的雄雌比例为1:1。饲养小鼠并将其关在12:12‑h光(笼子中约50勒克斯)‑暗循环中，随意进食和饮水。 [1825] 蓝光照射(BLI)：对年龄匹配的有色Abca4‑/‑和WT小鼠(9个月)用三组分麻醉剂腹腔注射麻醉，三组分麻醉剂包括：0.05mg/kg芬太尼、5mg/kg咪达唑仑和0.5mg/kg美托咪定。用0.5％托吡卡胺和2.5％盐酸去氧肾上腺素的混合物扩张瞳孔。使用METHOCEL(Omni Vision,Puchheim,Germany)润湿角膜。在光照过程中，将玻璃片放在暴露眼睛的角膜上。将每只小鼠的照射的眼睛暴露在强度为50mW/cm2的蓝光(波长：430‑nm)下15分钟。将作为对照的未照射的眼睛仔细覆盖以屏蔽杂散光。 [1827] 实施例5.23：增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的治疗和/或预防 [1828] 使用Hou H et al.(Ophthalmic Res 2018；60:195‑204.doi:10.1159/000488492)或Márkus B.et al.(FEBS Open Bio.2017；7(8):1166–1177.公布于2017年6月 29日，doi:10.1002/2211‑5463.12252)记载的PVR小鼠模型在体内研究本发明的化合物的 治疗功效。 [1829] 动物样本：通过玻璃体内注射蛋白水解酶分散酶来使用PVR的小鼠模型。已知该模型可诱导神经胶质活化以及视网膜前膜和视网膜下膜形成。 [1830] 用戊巴比妥(90mg·kg‑1，i.p.)麻醉4至6个月大的雌性野生型，还接受一滴1％盐酸普鲁卡因(Novocaine,EGIS,Budapest,Hungary)进行局部麻醉，和一滴1％托吡卡胺 (Mydrum,Chauvin Aubeans,Montpellier,France)进行虹膜扩张。将四微升分散酶(Sigma‑‑1 Aldrich；0.4U·μL ，溶于无菌生理盐水溶液)在立体显微镜控制(Ctrl)下使用自动移液器玻璃体内注射到右眼。Ctrl动物接受4μL无菌生理盐水溶液。在注射后拍摄Stratus光学相干断层扫描图像(OCT；Carl Zeiss Meditec,Dublin,CA,USA)，以确认PVR诱导并监测疾病 进展。在注射后第14天，当PVR形成体征明显时：OCT检查中存在视网膜前膜和/或视网膜脱离，处死Ctrl和分散酶处理的小鼠。 [1831] 样本制备和纯化：使用解剖刀刀片，将角膜和巩膜galler一起切除后分离小鼠玻璃体，然后切除晶状体。使用含有7m尿素、30mm Tris、2m硫脲和4％CHAPS的裂解缓冲液(pH 8.5)溶解玻璃体后，将裂解物在冰冷水浴中超声处理5min，并在4℃下以16900g离心10min。 将上清液转移至LoBind Eppendorf管中，并根据制造商的方案通过Ready‑Prep 2‑D CleanUp Kit(Bio‑Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)进行纯化。简而言之，沉淀和离心后，将丸剂干燥并重新悬浮在240μL再水化缓冲液中，该缓冲液含有7m尿素、2m硫脲、4％w/v CHAPS、1％二硫苏糖醇(DTT)、2％v/v Bio‑Lyte(Bio‑Rad)和0.001％溴酚蓝，并立即用于等电聚焦。 [1832] 2D凝胶电泳：对来自每组的3份玻璃体样本进行2‑DE。在20℃下使用被动再水化过夜，用提取的玻璃体蛋白再水化带有IPG(24cm,pH4‑7；Bio‑Rad)的第一个固定化pH梯度(IPG)条带。然后通过施加300V3h进行等电聚焦，其在5h内逐渐升高至3500V，然后在3500V下保持18h。等电聚焦后，立即将IPG条带置于‑70℃下，直至平衡。IPG条带在含有0.6％DTT的平衡缓冲液(500mm Tris/HCl，pH 8.5，6m尿素，2％SDS，20％甘油)中平衡15min，并在含有1.2％碘乙酰胺的平衡缓冲液中平衡15min。在第二维度中，将条带置于12％聚丙烯酰胺 凝胶之上，并用琼脂糖覆盖。使用Protean Plus Dodeca Cell(Bio‑Rad)以每凝胶100mA进行电泳24h，直至溴酚蓝染料到达凝胶底部。所有12种凝胶在相同条件下一起运行。使用内部制备的钌II三(红菲绕啉二磺酸酯)荧光染料25对蛋白质进行染色，并使用Pharos FX Plus Molecular Imager(Bio‑Rad)记录凝胶图像。在所有情况下都分析三个生物学重复，来自Ctrl和分散酶处理组的样本在同一天一起处理。 [1833] 实施例5.24：湿性和干性年龄相关性黄斑变性(ARMD或AMD)的治疗和/或预防 [1834] 使用Matsuda Y et al.(Mol Ther Nucleic Acids.2019；17:819–828.doi:10.1016/j.omtn.2019.07.018)记载的AMD鼠模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1835] 动物：雌性C57BL/6J小鼠获得自Charles River Laboratories Japan。获得雄性BN大鼠。雄性新西兰白兔(NZW)获得自Kitayama Labes,Japan。小鼠、大鼠和兔在特殊的无病原体条件下饲养。 [1836] RPE细胞的EMT试验：将37℃培养的RPE细胞以1×105个细胞/孔接种到96孔微量滴定培养板中。培养24h后，用含或不含本发明的化合物的FGF2(2ng/mL)和TGF‑β2(3ng/mL)处理细胞3天。使用定量实时PCR评估EMT生物标记物α‑SMA和I型胶原的mRNA表达水平。 [1837] 基质胶塞试验：将0.5mL基质胶GFR(生长因子减少)‑PRF(无酚红)(BD Biosciences)溶液与1μg FGF2混合，皮下植入雌性C57BL/6J小鼠(8周，n＝3)右侧。腹腔注射给予本发明的化合物，并在植入后第7天取出基质胶塞并拍照。根据制造商的说明，使用氰化高铁血红蛋白方法，通过基质胶塞中的血红蛋白浓度确定血管生成的分级。在酶标仪 中测量样本在540nm处的光密度(OD540)值，并根据血红蛋白标准品(Sigma‑Aldrich)计算 血红蛋白浓度。 [1838] 小鼠激光诱导的CNV模型：将Mydrin‑P眼睛溶液滴入雄性C57BL/6J小鼠的眼睛内，以扩大瞳孔。然后使用裂隙灯(SL‑130)和多色激光光凝器(MC‑300)在眼睛的6个位点进行激光辐照(波长532nm；光斑大小50μm；辐照时间0.1s；激光输出120mW)，避免大的视网膜毛细血管。在通过激光辐照进行CNV诱导后，立即通过玻璃体内注射给予本发明的测试化合物和对照。激光辐照7天后，以0.5ml/只动物的体积向尾静脉中给药4％FITC‑葡聚糖溶液。FITC‑葡聚糖给药后1至5分钟，通过颈椎脱位处死动物。取出眼球，在4％多聚甲醛‑磷酸盐缓冲液中固定12‑24h。在立体显微镜下制备脉络膜铺片。使用共聚焦显微镜拍摄CNV位点的照片。在整个激光诱导的CNV动物实验中，每次辐照均证实成功辐照，因为动物模型的眼睛中形成了气泡。 [1839] 大鼠激光诱导的CNV和视网膜下纤维化模型：在使用雄性BN大鼠的大鼠模型中使用相同的技术。对于CNV模型，激光设置为光斑大小为80μm，辐照时间为0.05s，以120mW在视网膜‑脉络膜的8个位点。对于视网膜下纤维化CNV模型，使用的激光功率为240mW。激光辐照后，立即用对照和本发明的测试化合物进行玻璃体内注射。对于视网膜下纤维化CNV研究，使用(1)盐水载体和(2)本发明的化合物(15μg/只眼睛，每隔2周单次注射，或2或3次注射)。 激光辐照后，对于CNV研究，在激光辐照后14天使用如上所述的FITC‑葡聚糖方案，制备摘除眼用于铺片脉络膜的共聚焦显微镜检查。对于视网膜下纤维化研究，6周后，处死动物，制备摘除眼用于组织病理学研究，以使用光学显微镜定量视网膜下纤维化。将眼睛包埋在石蜡 块中，切片，并根据常规方法用Masson trichrome染色。由两名或三名独立研究人员根据以下等级以盲法对纤维化进行分级：0级，无；1级，最低；2级，轻度；3级，中度；4级，重度。 [1840] 实施例5.25：翼状胬肉(PTE)的治疗和/或预防 [1841] 通过使用脉络膜新生血管鼠模型(CNV)、直接体内血管生成试验(DIVAA)和翼状胬肉鼠模型来评估本发明的化合物对脉络膜血管生成和翼状胬肉生长的治疗功效。 [1842] 翼状胬肉是眼表的良性纤维血管生长，通常与不适和红眼有关，随着疾病的进展，在严重情况下常与视力下降(地形散光)和眼球运动受限有关。由纤维化生长因子、氧化应激和DNA甲基化诱导的多种促炎细胞因子参与了翼状胬肉的发病机制。由于其中一些因素 会受到暴露于紫外线(UV)光的影响，目前来自多个来源的证据表明，高度暴露在阳光下的 个体患翼状胬肉的风险增加。尽管进行了广泛的研究，但对翼状胬肉的发病机制尚无明确 的认识，但促成该发病机制的最重要因素之一是与UV光暴露相关的角膜缘干细胞的肿瘤性 改变以及致癌病毒(人乳头瘤病毒)的可能作用。 [1843] 到目前为止，描述了三种翼状胬肉动物模型，在兔和小鼠中注射人翼状胬肉上皮细胞、外源性细胞外基质或UV散射辐射。使用UV散射光的兔模型的结果集中在组织生长的 大小和形状的计算预测上，没有进行组织学分析。小鼠模型显示了人翼状胬肉的组织学特 征，然而，鉴于兔的眼结构和大小更类似于人的眼结构和大小，因此对兔进行眼科手术操作更容易。 [1844] 方法：小鼠接受含或不含测试化合物的水。对于CNV，在激光诱导后7天，使用共聚焦显微镜在脉络膜‑视网膜色素上皮(RPE)铺片上测定新生血管病变体积。对于DIVAA，将含有10,000个人翼状胬肉上皮细胞的硅胶囊植入小鼠侧翼皮下。11天后，在小鼠尾静脉注射异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖后，使用荧光光谱测定法定量新生血管(NV)。通过向 无胸腺裸鼠鼻结膜下腔注射10,000个人翼状胬肉上皮细胞，建立翼状胬肉上皮细胞模型。 [1845] 主要结果测量：使用学生t检验评估CNV和DIVAA模型的数据，使用组织学制剂评估翼状胬肉病变。 [1846] 实施例5.26：中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSC)的治疗和/或预防 [1847] 使用Wei‑Da Chio,et al.,Life Sci J 2019；16(12):115‑126].ISSN:1097‑8135)记载的CSC动物模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1848] 中心性浆液性脉络膜视网膜病变(CSC)的发病机制尚不完全清楚。皮质类固醇的参与是无可争议的，尽管它们的确切作用尚未明确；CSC潜在机制的其他部分已主要通过成像技术如荧光素和吲哚菁绿血管造影阐明。尽管大多数CSC病例是自限性的，但仍存在严重以及复发性病程，且对于这些患者，只有有限数量的治疗方案可用：激光光凝术(有暗点和脉络膜新生血管风险)和光动力治疗。 [1849] 方法：对患有CSCR的雄性SD大鼠进行处理。将病例右眼随机分为2组(含对照和测试化合物)，每周进行一系列检查包括间接检眼镜检查和OCT扫描。首先将所有SD大鼠诱导 为CSCR模型。如果OCT成像显示CSCR消失，则认为该化合物有效。 [1850] 实施例5.27：影响肺部以及胰腺、肝脏、肾脏和肠道的囊性纤维化(CF)的治疗和/或预防 [1851] 使用McCarron A et al.(Respir Res.2018；19(1):54.公布于2018年4月2日，doi:10.1186/s12931‑018‑0750‑y)记载的CF鼠模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1852] 在人中，囊性纤维化(CF)肺病的特征为慢性感染、炎症、气道重塑和粘液阻塞。CF小鼠模型中缺乏肺部表现阻碍了气道疾病发病机制的研究以及潜在治疗的开发和测试。然而，最近生成的CF动物模型(包括大鼠、雪貂和猪模型)显示了一系列具有不同严重程度的 良好表征的肺病表型。目前可用的CF动物模型的不同的气道表型是可用的，并展示了每种 模型在气道相关CF研究中的潜在应用。特别是，已开发了引入到小鼠CFTR序列中的具有常 见人CF致病突变(如Phe508del或Gly551Asp)的突变等位基因。 [1853] 实施例5.28：特发性肺纤维化(IPF)的治疗和/或预防 [1854] 使用Chen SS et al.(J Thorac Dis.2017；9(1):96–105.doi:10.21037/jtd.2017.01.22)记载的IPF动物模型在体内研究本发明的化合物的治疗功效。 [1855] IPF是一种慢性进行性间质性肺病，伴有严重的肺纤维化。IPF的病因尚不清楚。患者在被诊断出患有IPF后通常仅存活2‑3年。IPF的发生和发展与上皮细胞损伤、纤维细胞增殖、炎性反应和细胞外基质沉积有关。IPF的病理表现为常见的间质性肺炎(UIP)。目前，IPF患者的死亡率相当高。然而，缺乏对IPF的有效治疗。IPF相关死亡的主要原因是IPF急性加重(AE‑IPF)，占IPF相关死亡的50％以上。大多数AE‑IPF患者由于病情危重无法耐受支气管镜检查或肺活检。AE‑IPF活检的缺乏极大地限制了对AE‑IPF的深入研究。能够模拟AE‑IPF的实验动物模型将是研究AE‑IPF的有用工具。 [1856] 使用博莱霉素(BLM)诱导的IPF的动物模型。通过BLM气管内灌注建立IPF大鼠模型。理论上，使用BLM进行第二次气管内灌注应在从第一次灌注后已经发展为肺纤维化的大鼠中诱导额外的肺损伤。额外的肺损伤可能类似于AE‑IPF的病理特征。 [1857] 将Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为不同的组：单独使用化合物处理的对照组、使用化合物+BLM+BLM组的AE‑IPF模型组、AE‑IPF模型组(cpd+BLM+BLM组)、使用化合物处理的IPF模型组(Cpd+BLM组)、IPF模型组(BLM组)和不含BLM的正常对照组。 [1858] BLM+BLM组的大鼠在第一次BLM灌注后第28天接受第二次BLM灌注。其他两组大鼠接受盐水作为第二次灌注。分别在第一次灌注后第31天、第35天和第42天处死每组6只大 鼠。 [1859] BLM+BLM组大鼠的病理生理学特征类似于AE‑IPF患者，如所述(Chen SS,J Thorac Dis 2017；9(1):96‑105)，第二次BLM灌注似乎诱导肺纤维化的急性加重，并可用于大鼠AE‑IPF模型。 [1860] 在使用单次和分别两次气管内博来霉素灌注诱导的AE‑IPF的大鼠模型中，化合物制剂的作用应改善组织病理学发现(分析H&E和Masson染色的切片并对急性肺损伤进行评 分)以及生存率。 [1861] 实施例5.29：博莱霉素诱导C57BL/6小鼠肺纤维化21天 [1862] 共使用40只8‑10周龄的雄性Balb/c小鼠进行研究。这些小鼠购自Charles River,UK，有7天的适应期。将动物饲养在IVC笼子中(每个笼子中最多5只)，通过尾部标记识别个体小鼠。在研究期间，允许所有动物自由获得标准认证的商业饮食和消毒过的水。饲养室维持在标准条件下：18‑24℃，55‑70％湿度，12h光/暗循环。 [1863] 本研究中使用的所有方案均已获得动物福利和伦理审查委员会的批准，且所有程序均按照1986年动物(科学程序)法的指导方针进行。 [1864] 使用IP注射甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉小鼠。达到适当的麻醉平面后，通过气管内途径向动物滴注1.0U/kg的硫酸博来霉素。液体总体积为50μL。将小鼠随机分配到下表57所示的治疗组： [1865] 表57： [1866] [1867] [1868] 博莱霉素滴注后24小时开始IV和阳性对照(吡非尼酮)给药。 [1869] 给药前立即配制药物溶液。对于15mg/kg的剂量(足够12只，30g小鼠)，称取4.5mg化合物。加入75μl(5％)DMSO并混合，直至药物溶解。加入150μl(10％)solutol并轻轻涡旋，加入150μl(10％)PEG400并轻轻涡旋。加入1000μl PBS(pH7)，测量基质，确保保持在pH 7.0。加入剩余的PBS(总计1500μl)。化合物保留在溶液中。 [1871] 血清：处死后立即经心脏穿刺采血，置于Eppendorf管中。将管在室温下储存至少20分钟，然后以6,000rpm离心5分钟。样本储存在‑80℃下。 [1872] 肉眼尸检(Gross Necropsy)：终止后，暴露并观察内脏器官。未发现任何异常。 [1873] 肺：切除前用福尔马林对肺充气。简而言之，暴露小鼠的气管，用刀片做一个小切口。将缝合材料轻轻地放在切口下方的气管后部周围，并松散捆绑。将福尔马林轻轻插入肺中，并将缝线紧密闭合，以确保充气。将肺置于福尔马林中，用Trichrome和H&E染色剂染色，分析胶原沉积和疾病进展(Ashcroft评分)。将一片肺组织速冻。 [1874] Ashcroft评分： [1875] 0正常肺 [1876] 1肺泡或细支气管血管轻度纤维化增厚 [1877] 2在轻度和中度之间 [1878] 3壁中度增厚，对肺结构无明显损伤 [1879] 4中度与加重纤维化之间，伴有肺结构损伤 [1880] 5纤维化加重，肺结构明确受损，形成纤维带或小纤维块 [1881] 6纤维化加重与肺结构严重扭曲之间 [1882] 7结构严重扭曲，大纤维面积；“蜂窝肺” [1883] 8全纤维性视野闭塞 [1884] 结果 [1885] 临床体征：研究期间未注意到体重变化，没有动物必须停止给药。 [1886] Ashcroft评分：根据内部方案，对每只动物的肺进行FFPE、切片和H&E染色。载玻片在Glissando载玻片扫描仪上成像，得到完整的载玻片图像。根据Hübner等人，2008，使用Ashcroft分级系统对每个肺进行评分，以测量炎症/纤维化程度。评分以盲法进行。100mg/kg的吡非尼酮和15mg/kg的IVc‑059a均降低了小鼠肺纤维化的发生(分别为p＝0.0018和0.0130，ANOVA)。吡非尼酮处理对纤维化发生的影响与用IVc‑059a处理的影响相同(p＝ 0.4441，2尾T检验)。代表性图像如图11A所示。 [1887] 图11A显示了处理第21天肺纤维化的代表性图像：结缔组织trichrome染色的实例图像(x20)；(A1)非诱导的(健康)；A2，博莱霉素诱导的，用载体处理；A3，博莱霉素诱导的，用吡非尼酮100mg/kg处理；A4，博莱霉素诱导的，用IVc‑059a处理。图11B显示了健康、博莱霉素诱导的未处理的相对于吡非尼酮相对于IVc‑059a的Ashcroft评分。 [1888] 将每只动物的整个肺用福尔马林固定，并储存在70％乙醇中。将这些切片在增加浓度的乙醇中脱水，然后包埋在石蜡中。切片以5μM切割，并在Superfrost载玻片上烘烤2h。 使用市售可得的结缔组织试剂盒(Abcam ab150686)对切片进行染色。使用Qupath和ImageJ 软件对trichrome染色覆盖的面积百分比进行定量。 [1889] 实施例5.30：体外结果和ADME‑毒理学 [1890] 对化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a和IVc‑059a进行ADME毒理学综合评估。 [1891] 在Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a和IVc‑059a上评估心脏离子通道试验(CiPA)核心QPatch组：以下三项试验用于CiPA：基于Nav1.5人钠离子通道细胞的QPatch CiPA试验、基于hERG人钾离子通道细胞的QPatch CiPA试验、基于Cav1.2(L型)人钙离子通道细胞的QPatch CiPA试验。 [1892] 评估肝细胞微粒体和人肝细胞代谢。评估一套全面的结合试验、酶和摄取试验以及溶液性质、体外吸收、代谢和毒性。使用AMES*和微核试验评估遗传毒性(Gebnetic toxicity)。 [1893] *Ames是一种细菌试验，用于鉴定可产生基因突变的化合物，它在啮齿动物致癌性测试中显示出很高的预测价值。在体外 [1894] **在用于鉴定诱导染色体损伤的化合物(染色体断裂剂(clastogen)和非整倍体诱发剂(aneugen))的体外微核试验中 [1895] 结果 [1896] 高极性化合物在肝微粒体中的代谢很低，半衰期大于60min。从活力来看，未观察到对肝细胞的显著毒性作用。大多数带负电荷的化合物与血浆蛋白高度结合。未观察到遗 传毒性作用。浓度为5μM至0.1mM的化合物对Ames波动测试*TA100‑S9、TA100+S9、TA1535‑S9、TA1535+S9、TA1537–S9、TA1537+S9、TA98–S9、TA98+S9没有显著影响。在TA100‑S9、TA1535‑S9、TA1537‑S9、TA98‑S9上未观察到细菌毒性。 [1897] 微核试验中，在8μM至1mM的评估浓度范围内未观察到作用。 [1898] 在CiPA组中，使用了三种基于细胞的试验：基于Cav1.2(L型)人钙离子通道细胞的自动膜片钳CiPA试验、基于hERG人钾离子通道细胞的自动膜片钳CiPA试验和基于Nav1.5人 钠离子通道细胞的自动膜片钳CiPA试验：所有均在3个浓度水平下进行评估，在0.1μM和10μM之间未观察到显著抑制。 [1899] 在一项安全性小组试验中，化合物对下列酶系统没有抑制作用或抑制作用很低，显示出对以下的良好安全性特征：5‑HT转运蛋白人(h)(拮抗剂放射性配体)；5‑HT1A(h)(激动剂放射性配体)；5‑HT1B(h)(拮抗剂放射性配体)；5‑HT2A(h)(激动剂放射性配体)；5‑HT2B(h)(激动剂放射性配体)；5‑HT3(h)(拮抗剂放射性配体)；A2A(h)(激动剂放射性配 体)；乙酰胆碱酯酶(h)；α1A(h)(拮抗剂放射性配体)；α2A(h)(拮抗剂放射性配体)；AR(h)(激动剂放射性配体)；β1(h)(激动剂放射性配体)；β2(h)(拮抗剂放射性配体)；BZD(中枢)(激动剂放射性配体)；Ca2+通道(L，二氢吡啶位点)(拮抗剂放射性配体)；CB1(h)(激动剂放射性配体)；CB2(h)(激动剂放射性配体)；CCK1(CCKA)(h)(激动剂放射性配体)；D1(h)(拮抗剂放射性配体)；D2S(h)(激动剂放射性配体)；δ(DOP)(h)(激动剂放射性配体)；多巴胺转运蛋白(h)(拮抗剂放射性配体)；ETA(h)(激动剂放射性配体)；GR(h)(激动剂放射性配体)；H1(h)(拮抗剂放射性配体)；H2(h)(拮抗剂放射性配体)；κ(h)(KOP)(激动剂放射性配体)；KV通道(拮抗剂放射性配体)；Lck激酶(h)；M1(h)(拮抗剂放射性配体)；M2(h)(拮抗剂放射性配体)；M3(h)(拮抗剂放射性配体)；MAO‑A(拮抗剂放射性配体)；mu(MOP)(h)(激动剂放射性配体)；N神经元α4β2(h)(激动剂放射性配体)；Na+通道(位点2)(拮抗剂放射性配体)；NMDA(拮抗剂放射性配体)；去甲肾上腺素转运蛋白(h)(拮抗剂放射性配体)；PDE3A(h)；PDE4D2(h)；钾通道hERG(人)‑[3H]多非利特；V1a(h)(激动剂放射性配体)。 [1900] 化合物的抗炎作用与部分环氧化酶抑制一致，例如Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a和IVc‑059a显示部分抑制COX2(环氧化酶‑2)。 [1901] 实施例5.31：使用BioMap Plus进行体外分析 [1902] 使用基于人原代细胞的试验进行了一系列体外试验，该试验对器官(脉管系统、免疫系统、皮肤、肺)的复杂组织和疾病生物学以及一般组织生物学进行建模，以便在保留与体内结果相关的串扰和反馈机制的条件下对化合物进行表型分析。 [1903] 使用BioMaps Plus表型细胞试验(Eurofins‑DiscoverX,San Francisco,CA,USA)，对化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IIIc‑061a、IVc‑059a在30μM、10μM、3.3μM、1.1μM的浓度下对以下细胞系统的效力、选择性、安全性、作用机制和疾病指征进行评估： [1904] ‑小静脉内皮细胞，评估心血管疾病、慢性炎症、哮喘、过敏、自身免疫性疾病、特应性疾病 [1905] ‑PBMC与小静脉内皮细胞，评估心血管疾病、慢性炎症、自身免疫性疾病、慢性炎症； [1906] ‑B细胞与PBMC，评估自身免疫性疾病、炎症； [1907] ‑支气管上皮细胞，评估肺部炎症、COPD [1908] ‑冠状动脉平滑肌细胞，评估心血管炎症、再狭窄 [1909] ‑真皮成纤维细胞，评估纤维化、慢性炎症、伤口愈合、组织重塑、基质调节 [1910] ‑角质形成细胞/真皮成纤维细胞，评估银屑病、皮炎、皮肤生物学 [1911] ‑肺成纤维细胞，评估纤维化、慢性炎症、基质重塑 [1912] ‑小静脉内皮细胞与巨噬细胞，评估心血管炎症、再狭窄、慢性炎症 [1913] BioMpas Plus参考文献:Book:Phenotypic Drug Discovery,Chapter2‑Development and Validation of Disease Assays for Phenotypic Screening.Ellen L.Berg,Sheryl P.Denker and Alison O'Mahony.https://doi.org/10.1039/ 9781839160721‑00020ISBN 978‑1‑83916‑072‑1 [1914] Assessing bioactivity‑exposure profiles of fruit and vegetable extracts in the BioMAP profiling system.Wetmore BA,Clewell RA,Cholewa B,Parks B,Pendse SN,Black MB,Mansouri K,Haider S,Berg EL,Judson RS,Houck KA,Martin M, Clewell HJ 3rd,Andersen ME,Thomas RS,McMullen PD.Toxicology in Vitro.2019,54, 41–57。 [1915] 结果 [1916] Ic‑007a在本研究测试的浓度下无细胞毒性。Ic‑007a对人原代T细胞(30μM)和成纤维细胞(30μM、10μM、3.3μM、1.1μM)具有抗增殖作用。Ic‑007a具有20个带注释读数的活性，按生物学和疾病分类列出了关键生物标记物活性的介导变化。主要是Ic‑007a影响炎症相关活性(VCAM‑1、sTNFα、MIP‑1α、I‑TAC、MIG降低；IL‑8增加；IP‑10调节)、免疫调节活性(CD40、M‑CSF降低)和组织重塑活性(I型胶原、IV型胶原、TIMP‑1、tPA、III型胶原、PAI‑1、uPAR、bFGF降低)。 [1917] IIc‑007a在本研究测试的浓度下无细胞毒性。IIc‑007a在测试浓度下对这些人原代细胞没有任何抗增殖作用。 [1918] IIc‑007a具有12个带注释读数的活性，按生物学和疾病分类列出了关键生物标记物活性的介导变化。主要是IIc‑007a影响炎症相关活性(sTNFα、MIP‑1α降低；IL‑8增加； MCP‑1调节)、免疫调节活性(sIL‑10、sIL‑2降低)和组织重塑活性(I型胶原、IV型胶原、III型胶原、PAI‑1降低)。 [1919] IIIc‑061a在本研究测试的浓度下无细胞毒性。IIIc‑061a在测试浓度下对这些人原代细胞没有任何抗增殖作用。IIIc‑061a具有六个带注释读数的活性，按生物学和疾病分类列出了关键生物标记物活性的介导变化。IIIc‑061a影响炎症相关活性(I‑TAC、MIG降低)、免疫调节活性(sIL‑17A降低)和组织重塑活性(I型胶原、III型胶原、PAI‑1降低)。 [1920] IVc‑059a在本研究测试的浓度下无细胞毒性。IVc‑059a对人原代内皮细胞具有抗增殖作用(1.1μM)。IVc‑059a具有三个带注释读数的活性，按生物学和疾病分类列出了关键生物标记物活性的介导变化。IVc‑059a影响炎症相关活性(sTNFα降低)和免疫调节活性(sIL‑10、sIL‑2降低)。 [1921] 实施例5.32：人视网膜色素上皮细胞(RPE)ARPE‑19和人视网膜内皮细胞(HREC)的体外结果 [1922] 评估了化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059a和贝伐单抗(BEVA)对糖尿病引起的内外血视网膜屏障破坏的作用。评估了25μM和50μM Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059a两种不同浓度的化合物。通过使用RT‑PCR检测荧光葡聚糖和促炎细胞因子产生的mRNA表达水平来评估对荧光葡聚糖和促炎细胞因子产生的渗透性，探索测试处理的抗渗透性作用所涉及的作用机制。 [1923] 外血视网膜屏障疾病：人视网膜色素上皮细胞(RPE)培养物ARPE‑19，一种自发性永生化的人RPE细胞系，获得自美国菌种保藏中心(Manassas,VA,USA)。将ARPE‑19细胞在正常血糖条件(D‑葡萄糖(D‑Glc)，5.5mmol/L)和高血糖条件(D‑葡萄糖，25mmol/L)下于37℃、 5％(体积/体积)CO2下在补充10％(体积/体积)FBS(Hyclone；Thermo Fisher Scientific，UT，USA)和1％(体积/体积)青霉素/链霉素(Hyclone；Thermo Fisher Scientific)的培养 基中培养18天。使用来自第20代的ARPE‑19细胞，每3‑4天更换培养基。对于渗透性研究，将 2 ARPE‑19细胞以400,000个细胞/ml(80,000个RPE细胞/孔)接种于0.33cm的HTS‑Transwell (Costar；Corning,NY,USA)中。对于实时PCR，蛋白免疫印迹分析和免疫荧光细胞以20,000个细胞/ml接种。 [1924] 实验条件和处理：除正常血糖条件外，在25mmol/L D‑葡萄糖下培养的细胞中测试18种不同条件： [1925] 条件1)对照细胞未接受任何5mM D‑葡萄糖处理 [1926] 条件2)用糖尿病环境25mM D‑葡萄糖+载体(第15、16和17天，一次施用/天)处理细胞，以评估其在预防由糖尿病环境引起的细胞损伤中的作用。 [1927] 条件3、4、5、6、7、8)用25mM D‑葡萄糖和两种不同浓度的每种产物：Ic‑007a(3、4)25μg/mL(＝53μM)和50μg/mL(＝107μM)；IIc‑007a(5、6)25μg/mL(＝53μM)和50μg/mL(＝107μM)；IVc‑059a(7、8)20μg/mL(＝50μM)和40μg/mL(＝100μM)，处理细胞72h(第15、16和17天，一次施用/天)，以评估其潜在的细胞毒性作用。 [1928] 条件9)用25mM D‑葡萄糖和贝伐单抗(0.2mg/ml)处理细胞72h(第15、16和17天，一次施用/天)，以评估其潜在的细胞毒性作用。 [1929] 条件10)＝糖尿病环境；用25mM D‑葡萄糖+IL‑1β(10ng/ml)+TNF‑α(25ng/ml)+VEGF(25ng/ml)处理细胞48h(第16和17天，一次施用/天)，以引起单层的破坏。 [1930] 条件11、12、13、14、15、16)用糖尿病环境(25mM D‑葡萄糖+IL‑1β(10ng/ml)+TNF‑α(25ng/ml)+VEGF(25ng/ml))+两种浓度的新化合物(Ic‑007a、IIc‑007a和IVc‑059a(第15、16和17天，一次施用/天))处理细胞，以评估其在预防由糖尿病环境引起的细胞损伤中的作用。 [1931] 条件17)用糖尿病环境(25mM D‑葡萄糖+IL‑1β(10ng/mL)+TNF‑α(25ng/mL)+VEGF(25ng/mL))+贝伐单抗(0.2mg/mL)(第15、16和17天，一次施用/天)处理细胞，以评估其在预防由糖尿病环境引起的细胞损伤中的作用。 [1932] ARPE‑19渗透性的测量：按照Villarroel et al.Exp Eye Res,2009,89,913–920先前报告的步骤，在第18天通过测量FITC葡聚糖(40kDa)(Sigma,St Louis,MI,USA)的顶端 至基底外侧的运动来测定RPE细胞的渗透性。 [1933] 内血视网膜屏障疾病：原代人视网膜内皮细胞(HREC)获得自购自Innoprot(Vizcay,Spain)的一瓶冷冻保存细胞。这些细胞从尸体眼睛的人视网膜组织中分离出来， 用0.1mg/mL I型胶原酶在37℃下消化1小时。然后，最终用CD31抗体包被的磁珠 (DynaBeads；Dynal,Oslo,Norway)选择内皮细胞。在实验室中解冻HREC，并在内皮基础培养基(EBM)中培养，其中含有5.5mM D‑葡萄糖、5％FBS(胎牛血清)、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和ECG(内皮细胞生长补充剂)补充剂(Innoprot,Vizcay,Spain)。使用5μg/mL的人纤连蛋白(MerckMillipore,Madrid,Spain)进行细胞附着。第2‑3代的细胞将用于实验。对于实验，使HREC生长至汇合，然后将细胞培养基更换为补充有1％FBS的培养基24h，然后暴露于不同处理。 [1934] 条件/处理：使用与在ARPE‑19细胞中的实验所指定的相同条件。 [1935] HREC渗透性的测量：在12x105个细胞/孔(24孔，PCF过滤器，Merk Millipore)的可渗透支持物上获得HREC单层的渗透性。将插入物在37℃5％CO2‑空气中孵育48小时，形成单层。最后，在继续处理前24h，将培养基中的血清耗尽。下室装有600μL的完全EBM培养基，上室装有100μL的已耗尽血清的细胞悬液(1％)。 [1936] 为了检测渗透性的变化，在插入物的上侧加入100μg/ml的荧光FITC‑葡聚糖(Sigma,Madrid,Spain)。在SpectraMax Gemini(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中，以 485/528nm的激发/发射波长每30min读取来自基底室的200μL等分试样。最后，通过外推标准曲线中的荧光读数测定葡聚糖浓度。每种条件测试三次。 [1937] 细胞活力和增殖：在HREC中进行细胞计数和MTT试验，以评估细胞在测试条件下的活力。测量HREC的活力和增殖。简而言之，用DAPI对细胞进行染色，并在荧光倒置显微镜 (Olympus iX71 with V‑RFL‑T Olympus)下拍照(20x)。借助Image J软件，在每个条件的三个不同视野中对细胞核进行计数。实验重复三次。此外，使用MTT试验(Sigma,Madrid, Spain)来评估细胞的活力。简而言之，处理后向每个孔中加入10μl的5mg/ml MTT于PBS中，并在37℃下再孵育1h。除去培养基，将获得的甲瓒颗粒溶于100％二甲基亚砜(DMSO)中，用ELISA酶标仪(ELx800.Bio‑Tek Instruments,VT,USA)在562nm处检测吸光度。该试验排除 了由于不同条件下细胞增殖变化引起的结果中的潜在偏差。 [1938] 作用机制： [1939] ‑通过RT‑PCR评估ARPE‑19细胞中的促炎细胞因子，使用双δCT方法2‑ΔΔCT测量了IL‑6、TNF‑α、IL‑1β、IL‑18、VEGF、IL‑10、FGF的mRNA，使用目标基因和内源性人B‑肌动蛋白的Ct值获得ΔCT；mRNA值表示为相对于条件25mM D‑葡萄糖的相对变化。(参考文献：Livak KJ,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real‑Time Quantitative PCR and the 2‑ΔΔCT Method,Methods,2001,25(4),402‑408,doi 10.1006/meth.2001.1262) [1940] ‑使用Cell Biolabs’OxiSelectTM细胞内ROS试验(Green Fluorescence)(Bionova,Madrid,Spain)评估ROS产生。该试验使用了可透过细胞的荧光探针2’,7’‑二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH‑DA)，通过细胞ROS氧化为高荧光性2’,7’‑二氯二氢荧光素 (DCF)。 [1941] ‑通过免疫组织化学分析和RT‑PCR在HREC单层中分析内皮素‑1、PDGF和VCAM‑1的表达。 [1942] ‑通过免疫组织化学分析在ARPE‑19和HREC单层中分析TJ表达(ZO)。 [1943] 结果： [1944] 表58显示了外血视网膜屏障(ARPE19单层)和内血视网膜屏障(HREC)的渗透性结果。化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059a降低了外单层和内单层的渗透性。 [1945] 表59显示了化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059a对暴露于非糖尿病和糖尿病环境的ARPE19单层细胞中ROS和TNF‑α、IL‑1β、IL6、IL‑18和VEGF‑mRNA的产生的作用。 [1946] 表58：使用FITC‑葡聚糖荧光渗漏的外血视网膜屏障和内血视网膜屏障的渗透性2 (ng/mL/cm)。 [1947] [1948] 与糖尿病环境(25mM D‑葡萄糖+VEGF、TNF‑α、IL‑1β)相比，90min后测得的以[ng/2 mL/cm]计的FITC葡聚糖渗漏的*p<0.05 [1949] 表59：ARPE19单层细胞在非糖尿病和糖尿病环境中产生的ROS和TNF‑a、IL‑1b、IL‑6、IL‑18和VEGF mRNA。 [1950] [1951] ROS％至25mM D‑葡萄糖；R.Q.＝细胞因子和生长因子值的相对定量mRNA，表示为相对于25mM D‑葡萄糖条件的相对变化。 [1952] 25mM D‑Glc+VEGF+TNF‑α+IL‑1β(糖尿病环境)与化合物Ic‑007a、IIc‑007a、IVc‑059之间的*p<0.05。 |
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