一种超分子EUK-134及其制备方法与应用 |
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| 申请号 | CN202311467953.4 | 申请日 | 2023-11-06 | 公开(公告)号 | CN117946172A | 公开(公告)日 | 2024-04-30 |
| 申请人 | 哈尔滨敷尔佳科技股份有限公司; 深圳杉海创新技术有限公司; | 发明人 | 张立国; 张嘉恒; 王振元; 王巍; 王彪; 张旭; 魏蕾; 赵前; 张玉萍; 陈雪晴; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 医药技术领域，尤其涉及一种超分子EUK‑134及其制备方法与应用。所述超分子EUK‑134主要由EUK‑134和低共熔 溶剂 通过超分子自组装作用形成，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜 碱 ，所述丙二醇甜菜碱由丙二醇和甜菜碱通过氢键等弱相互作用形成。丙二醇甜菜碱作为溶剂解决了EUK‑134在 水 、酸中不稳定、易分解的问题及其在配方产品中使用的局限性问题，还可以作为EUK‑134的透皮载体，在保持其原有抗 氧 化活性的同时更为稳定，透皮效果更优，促进了其 皮肤 渗透 ，增大生物利用度。使用低共熔溶剂，规避了 有机溶剂 的影响，提高了EUK‑134的适用性，可将其应用于配方产品中，不会对人体皮肤产生刺激。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种超分子EUK‑134，其特征在于，所述超分子EUK‑134主要由EUK‑134和低共熔溶剂通过超分子自组装作用形成，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜碱，所述丙二醇甜菜碱由丙二醇和甜菜碱通过氢键作用形成，所述丙二醇甜菜碱的结构式为： |
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| 说明书全文 | 一种超分子EUK‑134及其制备方法与应用技术领域背景技术[0002] 皮肤是受到内源性和外源性(辐射、烟雾、化学空气污染物、风等)高度氧化应激的器官，其中最重要的是紫外线辐射。紫外线辐射诱导氧化损伤，诱导活性氧(ROS)，如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢，已被证明发生在脂质、蛋白质和DNA中。皮肤长时间暴露在紫外线下，会引起皮肤光老化，甚至导致皮肤癌等不良影响。皮肤中包含多种抗氧化酶(SOD、CAT等)和非酶抗氧化剂，SOD(超氧化物歧化酶)将超氧阴离子转化成过氧化氢，CAT(过氧化氢酶)将过氧化氢转化成完全无害的水和氧气，二者相辅相成，使得抗氧化系统处于动态平衡。 [0003] EUK‑134(乙基双亚氨基甲基愈创木酚锰氯化物)是一种合成的SOD/CAT类似物，结构上带有锰原子的中心结构，可模拟两种皮肤天然酶在皮肤上的作用，从而达到抗氧化、清除自由基、抗衰老和亮肤的效果。但是EUK‑134在水溶液中，难以长时间保持稳定；在强酸性环境中也容易氧化分解，影响使用效果。为了保护EUK‑134的活性，通常将其溶解在有机溶剂中，但是使用有机溶剂会对皮肤造成刺激。 [0004] 因此，现有技术仍有待于改进和发展。 发明内容[0005] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种超分子EUK‑134及其制备方法与应用，旨在解决EUK‑134在水溶液和酸性环境中易失活，使用有机溶剂对皮肤刺激性大的问题。 [0006] 低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，简写为DES)是指由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物，其凝固点显著低于各个组分纯物质的熔点。低共熔溶剂由Abbott等人于 2003年首次报道，其物理化学性质与离子液体非常相似，因此也有人把它归为一类新型离子液体或离子液体类似物，是一种新型的超分子溶剂。但与传统有机溶剂和离子液体相比，低共熔溶剂具有低熔点、低成本、低毒性、易制备、可再生、可生物降解等特点，还具有一般溶剂没有的结构可设计性和可调性的特点，可通过提高活性分子的溶解度，改善活性分子油水分配系数，同时降低渗透阻力等方式，促进活性分子的透皮吸收。 [0007] 本发明的技术方案如下： [0008] 本发明的第一方面，提供一种超分子EUK‑134，其中，所述超分子EUK‑134主要由EUK‑134和低共熔溶剂通过超分子自组装作用形成，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜碱，所述丙二醇甜菜碱由丙二醇和甜菜碱通过氢键作用形成，使用1,2‑丙二醇时，所述丙二醇甜菜碱的结构式为： 使用1,3‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： [0009] 可选地，所述低共熔溶剂中丙二醇和甜菜碱的摩尔比为1:1‑10:1。 [0010] 可选地，所述超分子EUK‑134中EUK‑134的质量占比为0.1％‑10％。 [0011] 本发明的第二方面，提供一种超分子EUK‑134的制备方法，其中，包括步骤： [0012] 提供EUK‑134； [0013] 提供低共熔溶剂，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜碱，使用1,2‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： 使用1,3‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： [0014] 在惰性气体保护下，将所述EUK‑134和所述低共熔溶剂混合，并搅拌，然后进行超声处理，得到所述超分子EUK‑134。 [0015] 可选地，所述超分子EUK‑134的制备方法，具体包括步骤： [0016] 提供EUK‑134； [0017] 在惰性气体保护下，将甜菜碱分多次加入丙二醇中，并搅拌，直至完全溶解，然后进行超声处理，得到所述低共熔溶剂； [0018] 将EUK‑134加入所述低共熔溶剂中，并搅拌，直至完全溶解，然后进行超声处理，得到所述超分子EUK‑134。 [0019] 可选地，所述惰性气体为氮气，所述氮气压力为0.1‑20MPa； [0021] 可选地，超声功率为20‑3000W，超声频率为5‑100kHz，超声时间为1‑4h。 [0022] 可选地，所述超声处理为：功率为100‑600W，频率为10‑50kHz下超声2s暂停2s，持续1‑4h。 [0023] 本发明的第三方面，提供一种如本发明所述的超分子EUK‑134在制备配方产品中的应用。 [0024] 可选地，所述超分子EUK‑134在所述配方产品中的质量占比为1.0％‑10.0％。 [0025] 有益效果：本发明提供了一种超分子EUK‑134及其制备方法与应用。所述超分子EUK‑134通过EUK‑134与低共熔溶剂丙二醇甜菜碱之间的超分子自组装作用得到，其制备工艺简单易操作，便于放大生产。丙二醇甜菜碱作为溶剂解决了EUK‑134在水、酸中不稳定、易分解的问题及其在配方产品中使用的局限性问题，还可以作为EUK‑134的透皮载体，在保持其原有抗氧化活性的同时更为稳定，透皮效果最高可提高约3.5倍，促进了EUK‑134的皮肤渗透，增大生物利用度。使用低共熔溶剂，规避了有机溶剂的影响，提高了EUK‑134在生物与医药、日化行业的适用性，可将其应用于精华液、乳液等配方产品中，不会对人体皮肤产生刺激。附图说明 [0026] 图1A是超分子EUK‑134的制备流程示意图。 [0027] 图1B是1,2‑丙二醇甜菜碱的分子对接图。 [0028] 图1C是1,2‑丙二醇甜菜碱的氢键长度图。 [0029] 图1D是超分子EUK‑134的相互作用力计算图。 [0030] 图2是超分子EUK‑134和EUK‑134单体在体外透皮扩散实验中的累计透过量图。 [0031] 图3是ROS含量荧光镜检图。 [0032] 图4是超分子EUK‑134和EUK‑134单体作用下ROS相对含量统计分析图。 [0034] 图6是EUK‑134单体作用下人皮肤成纤维细胞相对存活率趋势图。 [0035] 图7是超分子EUK‑134作用下B16小鼠黑色素瘤细胞相对存活率趋势图。 [0036] 图8是EUK‑134单体作用下B16小鼠黑色素瘤细胞相对存活率趋势图。 [0037] 图9是超分子EUK‑134和EUK‑134单体作用下黑色素相对含量统计分析图。 [0038] 图10是黑色素MI变化率结果图。 [0039] 图11是ITA°变化率结果图。 [0040] 图12是亮度L变化率结果图。 具体实施方式[0041] 本发明提供一种超分子EUK‑134及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。 [0042] 需要说明的是，如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包括”或“包含”为开放式用语，故应解释成“包括但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定的范围为准。 [0043] EUK‑134可模拟SOD和CAT活性，高效催化分解自由基，是一种新型的高效复合功能催化酶。但是EUK‑134在水溶液和酸性环境中易失活，为了保护其活性，通常将其溶解在有机溶剂中，就其应用而言，这降低了其适用性。 [0044] 基于此，本发明实施例提供了一种超分子EUK‑134，其中，所述超分子EUK‑134主要由EUK‑134和低共熔溶剂通过超分子自组装作用形成，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜碱，使用1,2‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： 使用1,3‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： [0045] 本实施例提供了一种超分子EUK‑134，所述超分子EUK‑134是一种水溶性良好、有特征性气味的棕色液体。丙二醇与甜菜碱之间存在氢键，形成丙二醇甜菜碱，EUK‑134与丙二醇甜菜碱之间也存在一定的弱相互作用，促使EUK‑134和低共熔溶剂丙二醇甜菜碱之间通过超分子自组装作用形成所述超分子EUK‑134。本实施例所述超分子EUK‑134的制备过程简单、易操作，便于放大生产且生产成本低。本实施例使用丙二醇甜菜碱作为溶剂解决了EUK‑134在水、酸中不稳定、易分解的问题，以及规避了有机溶剂的影响，还提高了EUK‑134的稳定性、对酸的耐受性和透皮效率。相较于EUK‑134，超分子EUK‑134极大提高了EUK‑134在配方产品中的适用性，可将其应用于精华液、乳液等相关产品中。 [0046] 本实施例中，初步筛选出了甜菜碱、苦参碱和左旋肉碱系列的低共熔溶剂，然后通过对比EUK‑134在不同低共熔溶剂中的溶解度、稳定性等，最终筛选出具备最佳溶解性和稳定性的丙二醇甜菜碱DES。丙二醇甜菜碱DES继承了丙二醇作为有机溶剂的优点，使得EUK‑134具有良好的溶解性并且相对稳定；相较于单独使用丙二醇作溶剂，丙二醇甜菜碱DES在提高EUK‑134渗透率的同时，进一步降低了对皮肤的刺激性。 [0047] 本实施例低共熔溶剂丙二醇甜菜碱由丙二醇和甜菜碱通过氢键作用形成，具体是甜菜碱羧基中羟基的氧原子与丙二醇的羟基共用一个氢，从而形成氢键。在一种实施方式中，所述低共熔溶剂中丙二醇和甜菜碱的摩尔比为1:1‑10:1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等；进一步优选为1:1‑5:1。 [0048] 在一种实施方式中，所述超分子EUK‑134中EUK‑134的质量占比为0.1％‑10％，例如0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等；进一步优选为1％，该质量占比是超分子EUK‑134体系能保持稳定时，EUK‑134的最大添加量。 [0049] 本发明实施例还提供一种如上所述的超分子EUK‑134的制备方法，其中，包括步骤： [0050] 提供EUK‑134； [0051] 提供低共熔溶剂，所述低共熔溶剂为丙二醇甜菜碱，使用1,2‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： 使用1,3‑丙二醇时所述丙二醇甜菜碱的结构式为： [0052] 在惰性气体保护下，将所述EUK‑134和所述低共熔溶剂混合，并搅拌，然后进行超声处理，得到所述超分子EUK‑134。 [0053] 本实施例通过EUK‑134与低共熔溶剂丙二醇甜菜碱之间的超分子自组装作用，得到超分子EUK‑134，制备工艺简单、易操作、便于放大生产。本实施例使用丙二醇甜菜碱作为溶剂解决了EUK‑134在水、酸中不稳定、易分解的问题，还可以作为EUK‑134的透皮载体，在保持其原有抗氧化活性的同时更为稳定，透皮效果最高可提高约3.5倍，促进了EUK‑134的皮肤渗透，增大了生物利用度。其主要原因可能是丙二醇甜菜碱具有亲水亲脂性，对皮肤的亲和性好，充当EUK‑134透皮的载体，从而提高EUK‑134的透皮效率，在一定程度上提高了其生物利用率。 [0054] 本实施例使用低共熔溶剂，规避了有机溶剂的影响，提高了EUK‑134在配方产品中的适用性，可将其应用于精华液、乳液等产品中，不会对人体皮肤产生刺激。 [0055] 在一种实施方式中，所述超分子EUK‑134的制备方法，具体包括步骤： [0056] 提供EUK‑134； [0057] 在惰性气体保护下，将甜菜碱分多次加入丙二醇中，并搅拌，直至完全溶解，然后进行超声处理，得到所述低共熔溶剂； [0058] 将EUK‑134加入所述低共熔溶剂中，并搅拌，直至完全溶解，然后进行超声处理，得到所述超分子EUK‑134。 [0059] 在一种实施方式中，所述惰性气体为氮气，所述氮气压力为0.1‑20MPa，进一步优选为10‑15MPa；例如，压力可以为0.1MPa、0.5MPa、1MPa、2MPa、3MPa、4MPa、5MPa、6MPa、7MPa、8MPa、9MPa、10MPa、11MPa、12MPa、13MPa、14MPa、15MPa、16MPa、17MPa、18MPa、19MPa、20MPa等。 [0060] 在一种实施方式中，所述搅拌的温度为0‑60℃，进一步优选为30‑40℃；例如，温度可以为0、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等。 [0061] 在一种实施方式中，所述搅拌的时间为1‑24h，进一步优选为1‑5h；例如，搅拌时间可以为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等。 [0062] 在一种实施方式中，所述搅拌的转速为100‑600rpm，进一步优选为300‑600rpm；例如，搅拌转速可以为100rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm等。 [0063] 在一种实施方式中，所述超声处理的超声功率为20‑3000W，进一步优选为100‑1000W；例如，超声功率可以为20W、50W、100W、150W、200W、300W、400W、500W、1000W、2000W、 3000W等。 [0064] 在一种实施方式中，所述超声处理的超声频率为5‑100kHz，进一步优选为10‑50kHz；例如，超声频率可以为5kHz、10kHz、20kHz、30kHz、40kHz、50kHz、60kHz、70kHz、 80kHz、90kHz、100kHz等。 [0065] 在一种实施方式中，所述超声处理的超声时间为1‑4h；例如，超声时间可以为1h、2h、3h、4h等。 [0066] 在一种实施方式中，所述超声处理为：功率为100‑600W，频率为10‑50kHz下超声2s暂停2s，持续1‑4h，以增加丙二醇和甜菜碱的分子间相互作用力。 [0067] 本发明实施例还提供一种如上所述的超分子EUK‑134在制备具有美白、祛斑等功效配方产品中的应用。 [0068] 在一种实施方式中，所述超分子EUK‑134在所述配方产品中的质量占比为1.0％‑10.0％，所述配方产品的形式可以为无水精华、乳、霜、精华、面膜等不限于此中的一种。 [0069] 下面通过具体的实施例对本发明进行进一步地详细说明。 [0070] 实施例1 [0071] 结合图1A所示，超分子EUK‑134的制备方法，具体步骤如下： [0072] 在氮气保护下、30℃、300rpm持续搅拌的状态下，将1.0当量甜菜碱少量多次地加入5.0当量的丙二醇(1,2‑丙二醇)中，持续搅拌4h，完全溶解后，使用超声反应器，300W、20kHz下超声2s暂停2s，持续1h，以增加丙二醇和甜菜碱的分子间相互作用力。在搅拌状态下将EUK‑134缓慢加入该体系并继续搅拌4h，再次使超声反应器超声，300W、20kHz下超声2s暂停2s，持续1h，即可制得超分子EUK‑134。 [0073] 超分子EUK‑134是一种水溶性良好、有特征性气味的棕色液体。25℃时，超分子EUK‑134质量占比0.3％的超分子EUK‑134水溶液的实测电导率为10.26μS/cm，实测pH值为6.07。 [0074] 为了探究该DES间氢键的作用位点，对甜菜碱和1,2‑丙二醇这两个分子进行了分子对接，在产生的十个构像中选取了最稳定的构像作为参考，确定了甜菜碱和1,2‑丙二醇的如下相互作用方式：甜菜碱羧基中羟基的氧原子与丙二醇的羟基共用一个氢，从而形成氢键，并且间距为1.922埃，见图1B、图1C所示。同时，对超分子EUK‑134内各组分的相互作用力进行计算分析，如图1D所示，除了丙二醇甜菜碱存在的氢键，EUK‑134与丙二醇甜菜碱间也存在一定的弱相互作用，促使三者之间通过自组装作用形成最后的超分子EUK‑134。 [0075] 1、测试实施例1制得的超分子EUK‑134的稳定性 [0076] 测试例1 [0077] 将实施例1制得的超分子EUK‑134常温静置，连续60天不间断记录其外观、气味、颜色和pH变化，以测试其稳定性。 [0078] 对比测试例1 [0079] 将实施例1制得的超分子EUK‑134置于寒冷(‑15℃)环境下，连续60天不间断记录其外观、气味、颜色和pH变化，以测试其稳定性。 [0080] 对比测试例2 [0081] 将实施例1制得的超分子EUK‑134置于寒冷(5℃)环境下，连续60天不间断记录其外观、气味、颜色和pH变化，以测试其稳定性。 [0082] 对比测试例3 [0083] 将实施例1制得的超分子EUK‑134置于干热(45℃)环境下，连续60天不间断记录其外观、气味、颜色和pH变化，以测试其稳定性。 [0084] 对比测试例4 [0085] 将实施例1制得的超分子EUK‑134置于日光环境下，连续60天不间断记录其外观、气味、颜色和pH变化，以测试其稳定性。 [0086] 稳定性测试结果： [0087] 表1、超分子EUK‑134稳定性测试结果 [0088] [0089] [0090] 从表1结果可知，在不同环境下保存60天，超分子EUK‑134的外观、气味、颜色和pH都基本保持不变。说明超分子EUK‑134耐寒、耐热且对光照不敏感，具备优异的稳定性。 [0091] 2、测试实施例1制得的超分子EUK‑134和EUK‑134单体的体外透皮扩散效果 [0092] 测试例2 [0093] 皮肤由角质层、表皮、真皮、皮下组织等组成。药物置于皮肤表面后向皮肤内渗透，通过表皮到达真皮，由于真皮内有丰富的毛细血管，药物能很快被吸收，然后进入体循环，因此药物在皮肤表面的浓度很低，即符合所谓“漏槽”条件，药物的浓度接近于0。体外透皮扩散实验可以预测药物经皮吸收的速度，研究介质、处方组成和经皮吸收促进剂等对药物经皮速度的影响，是药物经皮制剂有效性和安全性的前提保障。具体实验的方法： [0095] Ⅱ(固定皮肤)：将皮肤固定在Franz扩散池上，角质层面向给药室，真皮层朝向接收池，在接收池内加入17mL生理盐水，并排除气泡，确保皮肤真皮层与接收液之间无气泡。 [0097] Ⅳ(渗透)：设置搅拌速度为300rpm，且处于避光条件下。 [0098] Ⅴ(取样)：分别于2h、4h、6h、8h、24h特定时间点取接收池里1mL液体，采用孔径0.22μm的有机膜过滤后，进行液相检测，并计算累积透过量。 [0099] 对比测试例5 [0100] 对比测试例5与测试例2的区别之处在于，将测试例2中给药步骤的超分子EUK‑134替换为EUK‑134单体。 [0101] 累计透过量测试结果： [0102] 图2是体外透皮扩散实验中测试例2和对比测试例5的累计透过量统计图。如图2所示，在与皮肤孵育的各个时间节点，测试例2中超分子EUK‑134的累计透过量都远大于对比测试例5中的EUK‑134单体，显示了更加优异的透皮效果，最高可提升约3.5倍。其主要原因可能是丙二醇甜菜碱DES具有亲水亲脂性，对皮肤的亲和性好，充当EUK‑134透皮的载体，从而提高EUK‑134的透皮效率，在一定程度上提高了其生物利用率。 [0103] 3、测试实施例1制得的超分子EUK‑134的抗氧化能力 [0104] 测试例3 [0105] 1，1‑二苯基‑2‑三硝基苯(简称DPPH)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH乙醇溶液光吸收减弱。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可根据DPPH乙醇溶液在517nm处的吸光度值评价试验样品清除自由基的能力，即抗氧化活性的大小。具体实验步骤： [0106] 设立样品管(T)、样品本底(T0)、DPPH管(C)和溶剂本底(C0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(T)需设立3支平行管。在样品管(T)和样品本底(T0)中各加入1mL同浓度的样品溶液。在样品本底(T0)和溶剂本底(C)中加入样品剂补足2mL，混匀。在样品管(T)和DPPH管(C)中加入DPPH乙醇溶液1mL，轻轻摇匀，室温下静置5min。将各反应管溶液移入1cm比色皿中，在517nm处测定吸光值。 [0107] DPPH自由基清除率(％) [0108] DPPH自由基清除实验结果： [0109] 表2、超分子EUK‑134对DPPH自由基的清除率 [0110] [0111] [0112] 表3、EUK‑134单体对DPPH自由基的清除率 [0113] [0114] 备注：超分子EUK‑134含1％EUK‑134单体。 [0115] *表中数据为均值±相对偏差。 [0116] *统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；P>0.05，表示无统计学差异；0.01 [0117] 测试结果如表2、表3所示，当超分子EUK‑134浓度为100mg/mL时(实际EUK‑134单体浓度为1mg/mL)，对DPPH自由基清除的清除率为10.54％，具有抗氧化能力；当EUK‑134单体浓度为1mg/mL时，对DPPH自由基清除的清除率为6.50％，具有抗氧化能力；综合看来，在DPPH自由基清除实验中，超分子EUK‑134的抗氧化能力大于EUK‑134单体的抗氧化能力。 [0118] 对比测试例6 [0119] 通过测试待测样品对ABTS+自由基清除率，来评价其抗氧化活性。其检测原理与测+试例3方法类似：在氧化剂存在时，氧化剂将ABTS氧化为ABTS自由基，溶液将呈现绿色，在+ 734nm紫外波长处有强吸收。当体系中加入抗氧化剂时，ABTS的生成量将减少，溶液颜色将+ 变浅，由墨绿色逐渐变为浅绿色，在734nm处的吸光度将变小，以此来测定该物质的ABTS自由基清除率。具体实验步骤： [0120] 根据样品特性设置合适的质量浓度梯度，并以PBS缓冲液作为溶剂分别配制待测样液。设立样品管(As)、样品本底(Ab)、样品空白管(A0)，每一样品的每个受试浓度的样品管(As)需设立3支平行管，同时样品空白管(Ao)也需设立3支平行管。在样品管(As)和样品本底(Ab)中各加入0.2mL相同浓度的样品溶液，样品空白管(A0)则加入0.2mL PBS缓冲液。在样品+ 管(As)和样品空白管(A0)中各加入0.8mLABTS 工作液，样品本底(Ab)则加入0.8mLPBS缓冲液。避光反应6min。将各反应管溶液移入1cm比色皿中，在734nm处测定吸光值。 + [0121] ABTS自由基清除率(％) [0122] ABTS+自由基清除实验结果： [0123] 表4、超分子EUK‑134对ABTS+自由基的清除率 [0124] [0125] 表5、EUK‑134单体对ABTS+自由基的清除率 [0126] [0127] [0128] 备注：超分子EUK‑134含1％EUK‑134。 [0129] *表中数据为均值±相对偏差。 [0130] *统计方法：采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；P>0.05，表示无统计学差异；0.01 [0131] 测试结果如表4、表5所示，当超分子EUK‑134浓度为100mg/mL时(实际EUK‑134单体+浓度为1mg/mL)，对ABTS自由基清除的清除率为58.24％，具有抗氧化能力；当EUK‑134单体+ 浓度为1mg/mL时，对ABTS自由基清除的清除率为35.35％，具有抗氧化能力；综合看来，在+ ABTS自由基清除实验中，超分子EUK‑134的抗氧化能力大于EUK‑134单体的抗氧化能力。 [0132] 对比测试例7 [0133] 通过检测活性氧(ROS)含量的变化情况，来评价样品的抗氧化功效。活性氧被认为是导致皮肤老化的重要诱因，活性氧会导致皮肤变薄、产生皱纹等。紫外线辐照会导致胞内活性氧形成。通过检测成纤维细胞中ROS含量，可反映样品抗氧化功效。具体实验步骤： [0134] Ⅰ(接种)：将人皮肤成纤维细胞悬浮液接种至24孔板，孵育24h。 [0135] Ⅱ(配液)：根据表6测试方案分配受试物工作液。 [0136] Ⅲ(给药)：根据表6测试方案，进行分组加药，4h后进行UVA辐照，辐照剂量为4.8J/2 cm。UVA辐照完成后，各孔更换成新鲜含有受试物的培养基，培养20h。 [0137] Ⅳ(检测)：用无血清DMEM培养液清洗各孔细胞2次，加入10μmol/L的ROS染料DCFH‑DA，37℃避光孵育20min，无血清培养液再次洗涤3次，荧光显微镜20倍物镜下，每孔随机选取1个视野拍照每组3个复孔。 [0138] 表6、测试方案 [0139] [0140] [0141] 图3为ROS含量荧光镜检图，以此为基础进行统计分析。统计方法:采用t检验方法进行分析，检验水准α＝0.05；P≥0.05，表示无统计学差异；0.01 [0142] 其结果如图4所示，与NC组相比，M组的ROS相对含量显著上升(P<0.05)，说明本次试验刺激条件有效；与M组相比，PC组的ROS相对含量显著下降(P<0.05)，说明本次试验有效；与M组相比，超分子EUK‑134浓度为1.2mg/mL时(实际EUK‑134单体浓度为0.012mg/mL)，ROS相对含量显著下降(P<0.05)，抑制率为11.14％，则超分子EUK‑134在该浓度下，可抑制ROS分泌，达到抗氧化功效；EUK‑134单体在浓度为0.012mg/mL时，ROS相对含量显著下降(P<0.05)，抑制率为6.24％，也可抑制ROS分泌，达到抗氧化功效，但其功效劣于超分子EUK‑ 134。 [0143] 4、测试实施例1制得的超分子EUK‑134和EUK‑134单体的生物安全性 [0144] 测试例4 [0145] 通过超分子EUK‑134和EUK‑134单体对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性试验，测试其是否具备一定的生物安全性。在电子耦合试剂存在的情况下，WST‑8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲攒产物，其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比。对同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。具体实验步骤： [0146] Ⅰ：将人皮肤成纤维细胞悬浮液接种至96孔板，每孔100μL，孵育24h。 [0147] Ⅱ：细胞贴壁培养24h后，弃置培养基，每孔加入100μL待测样溶液，设置空白组、阴性组。 [0148] Ⅲ：细胞孵育培养24h后，每孔分别加入10μL CCK‑8溶液，置于培养箱中培养4h。 [0149] Ⅳ:用酶标仪测量450nm处吸光值(OD450nm)，与未用被试物质处理的对照样品比较并计算结果。 [0150] [0151] 式中: [0152] 相对存活率——相对OD450nm，％； [0153] Test OD450 nm——被试物质的平均OD450nm； [0154] Neg OD450 nm——阴性对照的平均OD450nm。 [0155] 超分子EUK‑134和EUK‑134单体对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性分别如图5、图6所示，超分子EUK‑134的IC50＝0.8257％(95％CI：0.6801％‑0.9975％)，IC90＝0.243％(95％CI:0.096％‑0.384％)；EUK‑134单体的IC50＝0.153mg/mL(95％CI：0.1254mg/mL‑0.1871mg/mL)，IC90＝0.026mg/mL(95％CI：0.013mg/mL‑0.040mg/mL)。总而言之，在超分子EUK‑134和EUK‑134单体的活性范围内，二者对人皮肤成纤维细胞不会造成显著性伤害，并且人皮肤成纤维细胞的存活率在90％以上，表现出一定的生物安全性，为超分子EUK‑134和EUK‑134单体开展后续人体实验奠定理论和事实基础。 [0156] 对比测试例8 [0157] 通过超分子EUK‑134和EUK‑134单体对B16小鼠黑色素瘤细胞的细胞毒性实验，以测试其是否具备一定的生物安全性。其具体操作步骤与测试例4保持一致。 [0158] 超分子EUK‑134和EUK‑134单体对B16小鼠黑色素瘤细胞的细胞毒性分别如图7、图8所示，超分子EUK‑134的IC50＝0.1437％(95％CI：0.1136％‑0.1853％)，IC90＝0.045％(95％CI：0.033％‑0.056％)；EUK‑134单体的IC50＝0.02284mg/mL(95％CI：0.01428mg/mL‑ 0.03786mg/mL)，IC90＝0.003mg/mL。可以得到与测试例4相同的结论，即超分子EUK‑134和EUK‑134单体都具备一定的生物安全性。 [0159] 5、测试实施例1制得的超分子EUK‑134和EUK‑134单体对体外黑素合成的抑制作用[0160] 测试例5 [0161] 酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，它主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成。一些美白剂如曲酸及其衍生物和熊果昔等，通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成。促黑色素细胞生长激素α‑MSH可以有效促进黑色素细胞的酪氨酸酶的活性，从而促进黑色素的合成。本方法通过α‑MSH诱导黑色素细胞，利用比色法检测样品对黑色素生成的影响，来评价其功效。基于B16小鼠黑色素瘤细胞开展体外黑色素合成抑制实验，比较不同样品的美白功效，具体实验步骤： [0162] Ⅰ(细胞铺板)：将B16小鼠黑色素瘤细胞悬浮液接种至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。 [0163] Ⅱ(配药)：根据表7的测试方案分别配制受试物工作液。 [0164] Ⅲ(给药)：根据表7测试方案，进行分组给药，每组3个复孔，培养箱(37℃、5％CO2)培养72h。 [0165] Ⅳ(检测)：孵育结束后，提取细胞至离心管中，加入含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液，置于80℃水浴1.5h，使细胞团块完全溶解。水浴结束后酶标仪检测405nm处吸光度。 [0166] [0167] 式中： [0168] T——受试样品孔吸光度； [0169] C——阴性对照组吸光度的3次平均值； [0170] C0——黑色素提取液本底吸光度。 [0171] 表7、测试方案 [0172] [0173] [0174] 其结果如图9所示，与NC组相比，M组和PC组黑色素相对含量显著上升(P<0.05)，说明本次试验刺激条件有效；与M组相比，超分子EUK‑134在0.04％测试浓度下(EUK‑134单体的实际浓度为0.004mg/mL)，黑色素相对含量显著降低(P<0.05)，抑制率为26.48％，则表示超分子EUK‑134在0.04％浓度下具有抑制黑色素合成的能力，达到美白功效；与M组相比，EUK‑134单体在0.004mg/mL测试浓度下，黑色素相对含量显著降低(P<0.05)，抑制率为16.94％，则表示EUK‑134单体在0.004mg/mL浓度下具有抑制黑色素合成的能力，达到美白功效。 [0175] 综上，在0.04％浓度下，超分子EUK‑134抑制黑色素合成的能力优于EUK‑134单体(P<0.05)，即超分子EUK‑134的美白功效大于EUK‑134单体。 [0176] 6、测试实施例1制得的超分子EUK‑134和EUK‑134单体对新西兰兔皮肤的刺激性和腐蚀性 [0177] 测试例6 [0178] 超分子EUK‑134在配方产品中的最大添加量为10wt％，因此，使用样品10wt％的稀释液进行测试。该实验由广州市微生物研究所集团股份有限公司代为检测。实验方法:试验前约24h，将试验动物(普通级新西兰兔，雌性，1998.06‑2030.41g)背部脊柱两侧毛剃掉，不损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取0.5mL受试物涂抹于面积为2.5cm×2.5cm的左侧剃毛皮肤上，另一侧皮肤作为对照。每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前剃毛，用温水清除残留受试物，1h后观察皮肤局部反应并进行评分，超分子EUK‑134和EUK‑134单体对皮肤的刺激性和腐蚀性实验结果分别如表8、表9所示。 [0179] 表8、超分子EUK‑134对皮肤的刺激性和腐蚀性实验结果 [0180] [0181] [0182] 表9、EUK‑134单体对皮肤的刺激性和腐蚀性实验结果 [0183] [0184] [0185] 由表8、表9可知，超分子EUK‑134和EUK‑134单体的稀释液对新西兰兔多次皮肤刺激性试验每天每只动物平均积分为0，根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)皮肤刺激性试验的皮肤刺激强度分级，属无刺激性。 [0186] 实施例2 [0187] 利用实施例1制备的超分子EUK‑134和EUK‑134单体，分别配制成超分子EUK‑134精华液和EUK‑134精华液，两者含EUK‑134浓度相同，其它成分相同，按质量百分比计，配方组成如下： [0188] 超分子EUK‑134精华液：水(89.3％)、甘油(3％)、乙氧基二甘醇(0.5％)、有机黄原胶(0.3％)、HA(0.3％)、尿囊素(0.1％)、海藻糖(1％)、对羟基苯乙酮(0.5％)、1,2‑已二醇(0.5％)、修护糖苷α+β(0.2％)、ArteChem 853(0.2％)、甘草酸二钾(0.1％)、丁二醇(3％)、超分子EUK‑134(1％)； [0189] EUK‑134精华液：水(89.3％)、甘油(3％)、乙氧基二甘醇(0.5％)、有机黄原胶(0.3％)、HA(0.3％)、尿囊素(0.1％)、海藻糖(1％)、对羟基苯乙酮(0.5％)、1,2‑已二醇(0.5％)、修护糖苷α+β(0.2％)、ArteChem 853(0.2％)、甘草酸二钾(0.1％)、丁二醇(3％)、1％的EUK‑134水溶液(1％)。 [0190] 测试例7 [0191] 测试实施例2制得的超分子EUK‑134精华液和EUK‑134精华液对人体皮肤是否会造成潜在的不良反应。 [0192] 斑试方法:选用合格的斑试器材，以封闭式斑贴试验方法，将受试物0.020‑0.025g置于斑试器材内，外用低致敏胶带贴敷于受试者前臂曲侧，24小时后去除受试物，分别于去除后0.5h、24h、48h观察皮肤反应，按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应分级标准记录结果如表10所示。受试者不同观察时间皮肤反应情况如表11所示。 [0193] 表10、人体斑贴试验结果汇总 [0194] [0195] 表11、受试者不同观察时间皮肤反应情况 [0196] [0197] [0198] [0199] 根据表10、表11可知，超分子EUK‑134精华液和EUK‑134精华液不会对人体皮肤产生潜在的不良反应。 [0200] 测试例8 [0201] 测试实施例2制得的超分子EUK‑134精华液和EUK‑134精华液的美白祛斑效果。募集30名合格受试者，左右脸分别使用超分子EUK‑134精华液和EUK‑134精华液连续28天，分别在0D、14D、28D采集皮肤数据，并对黑色素MI、皮肤颜色ITA°值、亮度L进行正态性验证以及SPSS处理，其结果分别如下图表所示： [0202] 表12、黑色素MI测试结果及SPSS处理结果(30人) [0203] [0204] *注：1.平均值1表示受试者在该时间点所测得的平均值±标准偏差。变化率2＝(使用后数值‑使用前数值)/使用前数值×100％。 [0205] 2“. ns”(表示无统计学差异)，P≥0.05；“*”(表示差异显著)，0.01≤P<0.05；“**”(表示非常显著)，0.001≤P<0.01；“***”(表示极度显著)，P<0.001。 [0206] 如表12、图10所示，使用产品14天、28天后，超分子EUK‑134精华液组黑色素MI变化率分别为0.43％(P>0.05)、‑0.93％(P<0.01)；EUK‑134精华液组黑色素MI的变化率分别为0.35％(P>0.05)、‑0.45％(P≥0.05)，14天、28天组间数据比较均无显著差异(P≥0.05)，但 28天超分子EUK‑134精华液组减少皮肤黑色素的变化率优于EUK‑134精华液组。 [0207] 表13、皮肤颜色ITA°测试结果及SPSS处理结果(30人) [0208] [0209] 如表13、图11所示，使用产品14天、28天后，超分子EUK‑134精华液组ITA°增加率分别为2.05％(P≥0.05)、5.11％(P<0.01)；EUK‑134精华液组ITA°增加率分别为1.89％(P≥0.05)、2.52％(P≥0.05)，14天、28天组间数据比较均无显著差异(P≥0.05)，但14天、28天超分子EUK‑134精华液组增加皮肤ITA°的变化率均优于EUK‑134精华液组。 [0210] 表14、亮度L测试结果及SPSS处理结果(30人) [0211] [0212] [0213] 如表14、图12所示，使用产品14天、28天后，超分子EUK‑134精华液组亮度变化率分别为‑0.05％(P≥0.05)、0.71％(P<0.05)；EUK‑134精华液组亮度L变化率分别为0.17％(P≥0.05)、0.27％(P≥0.05)，14天、28天组间数据比较均无显著差异(P≥0.05)，但28天超分子EUK‑134精华液组皮肤亮度L增加率优于EUK‑134精华液组。 [0214] 综上，超分子EUK‑134精华液与EUK‑134精华液均有祛斑美白效果，但超分子EUK‑134精华液显示出更优异的美白祛斑效果。 [0215] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 |
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