[0001] 本发明属于化学抗氧化剂技术领域，具体涉及一种新型多酚氧化酶(PPO) 抑制剂及制备方法与应用。

[0002] 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是一种由核基因编码的、结构复杂的、以Cu2+为辅基的氧化还原金属酶，广泛存在于植物、人体、动物、微生物等各种生物体中。PPO是引起果蔬褐变的重要的酶之一，果蔬的褐变引起了很大的经济损失。据研究表明，PPO是严格的质体酶，主要分布在完整细胞的有色体、叶绿体和白色体等质体中。果蔬的线粒体、叶绿体、过氧化物体和微体等细胞器、细胞壁和细胞膜上均含有PPO。PPO是一个二聚体，由2个相同的单体组成，每个单体含有四个螺旋束(α1、α2、α3、α4)，铜离子存在于PPO 的活性中心，大多数的PPO活性中心具有两个富含His残基的铜结合区域(CuA 和CuB)。通过NMR等方法得到的数据显示PPO活性中心位于四个螺旋束形成的疏水口袋的中央，每个铜离子分别与3个His残基中的N原子形成配位键，形成了具有特定三角锥形的活性中心，在配位键中其中两个为赤道面配位键，另一个为较弱的轴向配位键。位于活性中心的这两个铜离子以赤道面与不同数目的氧原子产生配位结合和形成电子通路。由于PPO可以和氧原子相结合，根据其结合氧原子数目的不同可产生三种形态：(1)氧化态酶(Oxyenated oxytyrosinase，Eoxy),由两个二价铜离子和一对氧原子组成，每个二价的铜离子通过一个纵向的Nhis或两个强的横向的Nhis配位体配位，这对氧原子以过氧化物的形式结合到这两个二价铜离子上，架起一个氧桥；(2)还原态酶 (Mettyrosinase，Emet)由两个二价铜离子和一个氧原子组成，这个氧原子是通过过氧化氢而不是通过一分子过氧化物结合到铜离子上形成一个内在的氧桥； (3)脱氧态(Deoxytyrosinase，Edeoxy)只含有两个相互分离的一价铜离子。 PPO的这三种形态之间可以相互转化：氧化态酶(Eoxy)失去氧转变为还原态酶(Emet)，还原态酶(Emet)脱去氧则生成脱氧态酶(Edeoxy),氧化态酶(Eoxy) 和脱氧态酶(Edeoxy)之间又可以通过释放氧气和结合氧气相互可逆转化。

[0003] PPO的作用机制主要与酶的这三种存在形式有关。其中之一是PPO通过三种形态的变化发挥双重催化作用的一种反应模型，该反应模型已得到了广泛认可。单酚或二酚底物最初与氧化态酶(Eoxy)的一个铜离子的轴向位置相结合，通过结合的过氧化物发生重排，使单酚的邻位被羟基化，形成(EmD)，EmD 分解产生了一个游离的醌并产生了脱氧态酶(Edeoxy)，脱氧态酶(Edeoxy) 又可以结合氧形成氧化态酶(Eoxy)又回到了循环的最开始，从而完成了单酚的催化循环。氧化态酶(Eoxy)与双酚结合产生EoxD，EoxD氧化双酚释放出水分子并产生醌，转化为还原态酶(Emet)，还原态酶(Emet)催化另一个双酚成醌，最终转化为脱氧态酶(Edeoxy)，脱氧态酶(Edeoxy)又可以结合氧形成氧化态酶(Eoxy)又回到了循环的最开始而完成催化双酚的循环。在图1 中存在一条不构成循环的死途径(Dead end-path way)，单酚与还原态酶(Emet) 结合生成的酶-单酚复合物(图1中的EmM1)，该复合物是一种终端复合物不能进一步发生反应，从而消耗循环中一部分的PPO，这会导致行使单酚酶活力时，在达到羟基化作用最大速率之前会出现一段特有的迟滞期，这一可逆结合达到平衡，迟滞期结束，反应速率大大最大。PPO催化单酚或双酚转变成醌后，醌可以和很多物质发生反应，自身聚合或无需酶的催化将被氧化成黑色素或褐色素，因而引发果蔬的褐变。

[0004] 健康与长寿自古至今都是人类一直追求的目标。经济的快速发展提高了人们的生活水平，使人们越来越重视健康，从而对新鲜果蔬的质量要求也越来越高，为保持果蔬的新鲜，需要用PPO抑制剂来抑制PPO的活性。目前已商品化的PPO抑制剂主要有抗坏血酸、柠檬酸、谷胱甘肽及植物提取物等，在食品的抗氧化中得到了广泛的应用，对食品的质量保障方面有重要的作用，然而这些 PPO抑制剂有的对人体有害或活性很差。因此，开发新型的高效安全的PPO抑制剂迫在眉睫。

[0005] PPO活性位点的抑制剂研究已有过报道。Thomas Klabunde等报道的PPO 晶体结构(PDB code:1BUG，1BT1)，对PPO的活性空腔及催化机理进行了一定的研究，研究结果揭示了PPO晶体结构中含有一个小分子苯基硫脲(PTU)，它与活性空腔的双铜离子形成共价键，从而阻挡底物进入催化中心，使PPO失去催化酚转化为醌的能力，起到竞争性抑制作用。

[0006] 鉴于，PPO活性空腔的特点及催化机理，我们采用计算机分子模拟与有机合成、酶体生物活性测定等技术相结合的方法，最终确定新型PPO抑制剂目标结构为：N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲，并采用一锅法合成了19个目标化合物。开发对该类物质的研究，对于我国开发具有自主知识产权的新型PPO抑制剂具有重要意义，为创制绿色环保型PPO抑制剂提供理论依据。

[0007] 为了解决当前PPO抑制剂活性较差的问题，本发明提供了一种用于抑制多酚氧化酶(OPP)活性的新的抑制剂。

[0008] 为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

[0009] 一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂，所述抑制剂为N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲类化合物，其化学结构式如通式(I)所示：

[0010]

[0011] 其中，基团R1为选自-NO2、Cl-和乙氧基羰基中的一种或两种；基团R2为 C6H5-、Cl-C6H4-、Br-C6H4-、OH-C6H4-、CH3-C6H4-、H-、中的一种。

[0012] 其中，所述多酚氧化酶(PPO)抑制剂的制备方法，具体步骤为：在100mL 的单口圆底烧瓶中依次加入1mmol取代异硫酸氰酯和1mmol取代酰肼，再加入15mL无水乙醇溶解，室温下反应2-6h，反应结束后，进行抽滤，得到的固体用无水乙醇重结晶，30℃真空干燥得到目标化合物。

[0013] 所述取代异硫酸氰酯和取代酰肼的结构式如下：

[0014] 取代异硫酸氰酯：

[0015] 取代酰肼：

[0016] 另外，本发明还要求保护所述N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲类化合物作为抑制剂在抑制多酚氧化酶(PPO)中的应用。

[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下的明显有益效果：

[0018] 本发明提供了一种新的多酚氧化酶(PPO)抑制剂，该抑制剂为N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲类化合物，对OPP具有十分优异的抑制效果。附图说明

[0019] 图1为PPO催化单酚和双酚底物氧化的循环图；

[0020] 图2为抗坏血酸对PPO抑制作用的标准曲线；

[0021] 图3为目标化合物A2对PPO抑制作用标准曲线。

[0022] 下面以具体实施例子，进一步阐述本发明。下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0023] 实施例1

[0024] 一种多酚氧化酶(PPO)抑制剂，所述抑制剂为N-取代苯基-取代酰肼氨基硫脲类化合物，其化学结构式如通式(I)所示：

[0025]

[0026] 表1化合物I(A1-A19)中的取代基团

[0027]

[0028] 对PPO抑制活性的测定

[0029] 实验方法：UV法测定。

[0030] 实验原理：在PBS(0.1M，pH6.8，含1％PVPP、1％TritionX-100)缓冲液的反应体系中，PPO能催化各种酚与O2氧化为褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的吸光值(OD值)发生变化，通过OD值的读数变化可确定PPO的酶活大小。

[0031] 实验步骤：

[0032] 1.PPO的提取

[0033] 马铃薯块茎组织在4℃下预冷24h后除去近表皮后称取20g，加入60mL PBS(0.1M，pH6.8，含1％PVPP、1％TritionX-100，4℃下预冷)低速匀浆后过滤，离心15min(4℃，12000r/min)，上清液即为PPO粗酶液，将粗酶液放在冰水中保存备用。

[0034] 2.不同浓度的抑制剂的配制

[0035] 称取24个筛选出的化合物20mg，分别用含有0.1％吐温-80的50ul DMSO 溶解后用950μL的PBS稀释配成20mg/mL的母液，在稀释成10mg/mL，7.5 mg/mL，5mg/mL，2.5mg/mL，
1mg/mL，0.75mg/mL，0.5mg/mL等浓度(个别化合物浓度有差异，对于活性较好的化合物重新设定浓度进行测定)，每个化合物设5个浓度梯度，每个浓度平行测定3次，并设定阳性对照和阴性对照。

[0036] 3.抑制剂的抑制活性的测定

[0037] 在90μL的PBS中依次加入100μL不同浓度的抑制剂溶液及10μL粗酶液， 30℃下保温3min后加入100ul邻苯二酚(20mM，PBS配制)溶液迅速混匀启动反应。在410nm波长处测定OD值，每10S记录一次，共记3min。空白对照和阳性对照分别用PBS和已商品化PPO抑制剂抗坏血酸(IC50为681.43μM) 代替抑制剂。以反应时间为横坐标，OD值为纵坐标作出OD值-时间曲线，从曲线最初的直线部分的斜率计算PPO的活力，每毫升酶液每分钟OD值变化 0.001为一个酶活力单位。

[0038] 抑制剂对PPO抑制率定义如下：

[0039]

[0040] 4.抑制剂对PPO活性抑制标准方程的确定

[0041] 本实验测定了每种抑制剂在5个浓度梯度下的PPO活性抑制率，以抑制剂浓度为横坐标，PPO活性抑制率为纵坐标，可作出抑制剂对PPO活性抑制标准方程。当抑制率为50％时，根据标准方程可求得对应的抑制剂的浓度(IC50值)。 19种化合物对PPO活性抑制标准方程见表2。

[0042] 表2目标化合物A1-A19抑制PPO酶活性测定结果

[0043]

[0044]

[0045] 已商品化PPO抑制剂抗坏血酸的IC50值为681.43μM。由表可知，目标化合物A2对PPO的生物抑制活性最高，其IC50值为33.16μM(IC50<681.43μM)。抗坏血酸和目标化合物A2对PPO抑制作用的标准曲线如图2、3所示，相同浓度下，目标化合物A2对PPO的生物抑制活性比抗坏血酸高。由表可知，这19种化合物的IC50值均小于681.43μM，说明本研究合成的化合物对PPO活性抑制效果均优于已商品化PPO抑制剂抗坏血酸(IC50<681.43μM)。

[0046] 上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。