[0001] 本发明涉及化合物领域，具体涉及1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物。

[0002] 肥胖症是一种慢性疾病，据世界卫生组织统计，是最容易被人们忽视，但发病率却急剧上升的一种疾病，肥胖症患者常合并高血脂症。肥胖症与许多重大疾病如糖尿病、心脑血管疾病、癌症、睡眠呼吸暂停综合症等有密切关系，预防和治疗肥胖症已成为全球面临的挑战。

[0003] 每个成人体内，大约含有300亿个脂肪细胞，每个脂肪细胞中，都含有三酰甘油脂，俗称脂肪球。脂肪球量变大，脂肪细胞体积就扩增，造成肥胖。前脂肪细胞3T3-L1能特异性地诱导分化成成熟的脂肪细胞，是研究功能性成分对体外脂肪细胞增殖分化过程的重要的细胞模型。

[0004] 人体呼吸过程中会吸入氧气，但氧在人体代谢过程中，会失去一个电子而产生自由基，由于自由基处于极不稳定的状态，所以会抢夺体内其它物质如蛋白质、酶、DNA等的电子（氧化过程）而趋于稳定，使这些物质遭到破坏，产生各种疾病，自由基是使人们逐渐衰老、产生各种疾病的主要原因之一，故而具有自由基清除作用的化合物可以减少自由基对机体的损伤，发挥抗衰老功能以及抵抗各种疾病的发生。

[0005] DPPH基（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波长517nm呈强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤对电子被配对，从而使其褪色，褪色程度与其电子接收程度呈定量关系，因而可用比色法进行定量分析。DPPH法被广泛用于定量测定功能性成分的清除自由基及抗氧化能力。

[0006] 窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz）为蔷薇科鲜卑花属植物，为藏族民间常用药物，其叶和嫩枝入药，又名柳茶，具有清胃热、助消化、调节脂代谢的功效以及其提取物具有抗氧化作用。

[0007] 本发明人对窄叶鲜卑花进行提取以及溶剂萃取，得到有效部位提取物，对有效部位提取物通过正相硅胶与葡聚糖凝胶色谱法反复纯化，得到具有抑制前脂肪细胞增殖分化和清除DPPH自由基作用的一个活性化合物，又经1D NMR、2D NMR、ESI-MS以及HR-ESI-MS技术确定其化学结构，该结构为前人未报道的结构新颖的苯丙素酚多元醇酯化合物1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯,本发明人并通过合成的方法制备了具通式I的1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物。通式（I）化合物，结构骨架中含有酚羟基、醇羟基，或可分解出酚羟基、羧基和/或氨基，可提供淬灭活性自由基所需的氢从而消除自由基，可螯合金属离子使其失去催化脂质氧化的能力，从而阻碍氧化反应的发生；可与胆固醇或胆酸结合，形成难吸收的大分子物质通过肠道排出体外，减少脂肪的吸收；具有抑制前脂肪细胞增殖分化活性和清除自由基活性。因此可用于肥胖症以及由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的预防和治疗，以及用于延缓衰老、提高机体免疫力、预防癌症等的医药或保健用途，可以作为食品等的抗氧化剂。

[0008] 本发明的目的是提供一种具有抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖分化的化合物1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物以及可药用盐。

[0009] 本发明的另一目的是提供1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物用于预防和治疗肥胖症以及由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的药物以及与上述疾病有关的医药和保健品用途。

[0010] 本发明的再一目的是提供1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物用于延缓衰老、提高机体免疫力、预防癌症等的医药或保健用途。

[0011] 本发明的再一目的是提供1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物作为食品等抗氧化剂的用途。

[0012] 本发明制备的1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯及其衍生物，其通式如下：

[0013]

[0014] 其中，R1可以表示单取代或多取代的H、OH、C1-5的烷氧基、C1-5的烷基、亚甲二氧基；R2可以表示单取代或多取代的H、OH、C1-5的烷氧基、C1-5的烷基、亚甲二氧基；X可以表示O、NH、S等；Y可以表示O、NH、S等。

[0015] 其中，化合物1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯：R1为3’，4’-二羟基，R2为3”，4”-二羟基，其化学结构式如（1）：

[0016]

[0017] 根据本发明，上述通式（I）的化合物药学上可接受的盐，可以是与下列胺基或金属离子形成的加成盐：NH4+、Na+、K+、Mg2+、Li+、Ca2+、Sr2+、Ca2+、Zn2+等。

[0018] 式（1）主要来源于窄叶鲜卑花（Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz），其可以是窄叶鲜卑花任一部位，即可以是根、茎、叶、花、果实、种子，也可以是混合部位，优选地上部分。

[0019] 根据本发明，式（1）化合物的提取方法包括以下步骤：

[0020] （1）取干燥粉碎的窄叶鲜卑花叶和嫩枝，用热水(可以用甲醇（10-70%）水溶液、乙醇（10-70%）溶液、丙酮（10-70%）溶液)回流提取，减压浓缩除去溶剂得1.2kg半流体状浸膏；

[0021] （2）半流体状浸膏加水（1L）分散后，依次用石油醚（3×1L）、二氯甲烷（3×1L）、乙酸乙酯（3×1L）进行萃取，浓缩萃取液，得石油醚浸膏（150g）二氯甲烷浸膏（420g）、乙酸乙酯浸膏（210g）；

[0022] （3）对乙酸乙酯浸膏（100g）经硅胶柱色谱,采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得A（35g）、B（45g）、C（8g）三部分浸膏。对C浸膏再次经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯（3：1-0：1，体积比）洗脱，得化合物（1）粗品（3.2g）。化合物（1）粗品经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱（洗脱用甲醇（10%-70%）水溶液梯度洗脱），得纯品化合物（1）（350mg），20
其收率为0.0035%。化合物（1），淡黄色粉末，可溶于甲醇、乙醇及水，[α]D -7.2(c0.50，MeOH)，分子量为506，可以用分子式C24H26O12表示，命名为1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯。

[0023] 根据本发明，通式（Ⅰ）化合物的制备可通过下面所示的反应路线来制备:

[0024]

[0025] 其中，式II和III化合物中，R1可以表示单取代或多取代的H、OH、C1-5的烷氧基、C1-5的烷基、亚甲二氧基；R2可以表示单取代或多取代的H、OH、C1-5的烷氧基、C1-5的烷基、亚甲二氧基；Z是指卤素，具体是指氯、溴、氟或碘。

[0026] 其中，式IV化合物中，X可以表示O、NH、S等；Y可以表示O、NH、S等。

[0027] 对于通式化合物（I）具体合成步骤如下：利用TBSCl对式II、III及IV各化合物的羟基进行预先保护，然后在有机溶剂中，在碱存在或不存在下，在伴随搅拌下进行反应，得到化合物V，在室温下对化合物V利用TBAF进行去硅化处理，生成通式化合物（I）。其中有机溶剂选自吡啶、三乙胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、已腈、丙酮等，碱选自有机碱或无机碱，如咪唑、吡啶、三乙胺、K2CO3、Na2CO3、NaHCO3、KHCO3等。

[0028] 本发明的特点是，从窄叶鲜卑花提纯的化合物（1）及其衍生物（见通式（I））具有重要的生物活性，具有抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖分化和清除DPPH自由基的作用，提供了可用于肥胖症以及肥胖引起的的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝、冠心病、睡眠呼吸暂停综合症等疾病的药物以及与上述疾病有关的医药和保健品用途，提供了用于延缓衰老、提高机体免疫力、预防癌症等的医药或保健用途，以及用于食品等抗氧化剂的用途。附图说明

[0029] 图1所示是化合物（1）的1H NMR谱，（400MHz，CD3OD）δ。

[0030] 图2所示是化合物（1）的13C NMR谱，（100MHz，CD3OD）δ。

[0031] 图3所示是化合物（1）的DEPT-135谱（100MHz，CD3OD）δ。

[0032] 图4所示是化合物（1）的1H-1H COSY谱。

[0033] 图5所示是化合物（1）的HSQC谱。

[0034] 图6所示化合物（1）的HMBC谱。

[0035] 图7所示化合物（1）的ESI-MS谱。

[0036] 图8所示是化合物（1）对前脂肪细胞3T3-L1的早期克隆增殖分化抑制作用。

[0037] 图9显示化合物（1）对前脂肪细胞3T3-L1LDH释放率。

[0038] 图10显示油红O染色法研究化合物（1）处对前脂肪细胞3T3-L1的分化抑制（490nm处吸光度值）。

[0039] 通过下面实施例对本发明进一步详细描述，但这些实施例并不意味着对本发明任何限制。

[0040] 实施例1

[0041] 化合物(1)的制备

[0042] 取干燥粉碎的窄叶鲜卑花叶和嫩枝10kg，用热水(可以用甲醇（10-70%）水溶液、乙醇（10-70%）溶液、丙酮（10-70%）溶液)回流提取，减压浓缩除去溶剂得1.2kg半流体状浸膏。

[0043] 半流体状浸膏加水（1L）分散后，依次用石油醚（3×1L）、二氯甲烷（3×1L）、乙酸乙酯（3×1L）进行萃取，浓缩萃取液，得石油醚浸膏（150g）二氯甲烷浸膏（420g）、乙酸乙酯浸膏（210g）。

[0044] 对乙酸乙酯浸膏（100g）经硅胶柱色谱,采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得A（35g）、B（45g）、C（8g）三部分浸膏。对C浸膏再次经硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯（3：1，体积比）洗脱，得化合物（1）粗品（3.2g）。化合物（1）粗品经反复Sephadex LH-20凝胶柱色谱（洗脱用甲醇（10%-70%）水溶液梯度洗脱），得纯品化合物（1）（350mg），其收率20
为0.0035%。化合物（1），淡黄色粉末，可溶于甲醇、乙醇及水，[α]D -7.2(c0.50，MeOH)，分子量为506，可以用分子式C24H26O12表示，并且根据IUPAC命名法命名为1，6-O-二咖啡酰山梨醇酯（1，6-O-dicaffeoyl sorbitol）。化合物（1）采用1D NMR、2D NMR、ESI-MS以及
1 13
HR-ESI-MS等波谱技术（见附图1-7）确定分子结构，其 H NMR和 C NMR数据见表1。

[0045] 表1化合物（1）的1H NMR、13C NMR数据（CD3ODδppm，J Hz）

[0046]

[0047] 实施例2化合物（1）的合成

[0048] 化合物（1）的合成采用如下反应路线来进行：

[0049]

[0050] 其具体反应步骤如下：

[0051] （1）在上述反应路线中，以山梨醇为起始物，将山梨醇（1.82g）与TBSCl（6.2当量，9.3g）和咪唑，在DMF中室温反应8个小时，得到产物1-1。将咖啡酸与TBSCl和咪唑，在DMF中室温反应3个小时，得到化合物B。

[0052] （2）将步骤（1）中产物1-1在1%I2-MeOH溶液中室温反应，得到产物1-2（4.7g）。将化合物B与上述产物1-2进行EDC缩合，获得产物1-3。将产物1-3重复进行该操作，获得产物1-5。

[0053] （3）将步骤（2）中产物1-5在室温条件下，用TBAF的四氢呋喃溶液（加入几滴冰醋酸）可以脱去产物1-5中TBS基团，获得化合物（1）（1.52g），总产率约30%。化合物（1），淡+ 1黄色粉末，ESI-MS：m/z507.2[M+H] ；H NMRδ6.93(2H,d,J=2.0Hz)，6.65(2H,d,J=8.1Hz)，
6.82(2H,dd,J=8.2,2.0Hz)，7.46(2H,d,J=16.0Hz)，6.21(1H,d,J=15.8Hz),6.18(1H,d,J=15.8Hz),4.24(1H,dd,J=11.5,4.3Hz)，4.18(1H,d,J=11.5Hz)，3.96(1H,m)，
3.86(1H,dd,J=5.0,1.8Hz)，3.63(1H,dd,J=8.4,1.7Hz)，3.89(1H,m)，4.37(1H,dd,J=11.6,
13
2.6Hz),4.15(1H,d,J=11.6Hz)。C NMRδ169.1,169.0,149.1,149.0,147.1,147.0,146.3,1
26.1,126.0,121.2,121.1,114.3,114.2,113.3,114.1,71.4,69.1,68.5,68.1,64.8,64.7.[0054] 实施例3化合物1，6-二咖啡酰山梨醇酰胺的合成

[0055] 化合物1，6-二咖啡酰山梨醇酰胺的合成采用如下反应路线来进行：

[0056]

[0057] 其具体反应步骤如下：

[0058] （1）以1，6-二去氧-1，6-二氨基山梨醇为起始物，将1，6-二去氧-1，6-二氨基山梨醇(1.82g)与TBSCl(9.3g,6.2当量)和咪唑，在DMF中室温反应8个小时，得到产物2-1。将咖啡酸与TBSCl和咪唑，在DMF中室温反应3个小时，得到化合物B。

[0059] （2）将步骤（1）中产物2-1及化合物B进行EDC缩合，获得产物2-2。

[0060] （3）将步骤（2）中产物2-2在室温条件下，用TBAF的四氢呋喃溶液（加入几滴冰醋酸）可以顺利脱去双咖啡酰基山梨醇酰胺衍生物中的TBS基团，得化合物1，6-二咖啡酰山梨醇酰胺（3.08g），总产率约66%。

[0061] 化 合 物 1，6-二 咖 啡 酰 山 梨 醇 酰 胺：ESI-MS：m/z505.1[M+H]+；1H NMR：1H NMRδ6.88(2H,d,J=2.0Hz)，6.59(2H,d,J=8.1Hz)，6.84(2H,dd,J=8.2,2.0Hz)，
7.43(2H,d,J=16.0Hz)，6.22(1H,d,J=15.8Hz)，6.16(1H,d,J=15.8Hz)，
4.12(1H,dd,J=11.5,4.3Hz)，4.05(1H,d,J=11.5Hz)，3.92(1H,m)，3.81(1H,m)，
13
3.63(1H,m)，3.89(1H,m)，4.28(1H,dd,J=11.6,2.6Hz)，4.08(1H,d,J=11.6Hz). C NMRδ16
7.1,167.0,148.1,145.0,146.1,146.0,145.3,126.1,126.0,121.8,121.7,114.2,113.3,1
13.3,113.2,71.3,71.0,69.0,68.1,65.4,65.0.

[0062] 实施例4对前脂肪细胞3T3-L1的生长抑制

[0063] 前脂肪细胞3T3-L1按5×104个／mL的密度接种到6孔培养板，在含有10％小牛血清的高糖DMEM培养基37℃、5％CO2孵箱中培养。24h后弃去培养液，其中3孔孔加入100μL含有不同质量浓度的化合物（1）的培养液（150～1500μg/mL），以不含有样品的高糖DMEM为空白对照，温箱孵育72h。除去培养液后，加入含有0.5mg/mL MTT的DMEM10培养基孵4h，再加入100μL的0.1g/mLSDS(含0.1mol/L HCl)溶液过夜，以完全溶解出MTT紫色结晶产物。用酶标仪在570nm处（以630nm为参考波长）测定光密度值。实验重复3次。
以药物浓度的对数与细胞存活率进行直线回归并求出IC5（0 半数抑制浓度，即细胞存活率为
50%时所需药物浓度）。

[0064] 从图8可知，化合物（1）对3T3-L1前脂肪细胞有明显生长抑制作用。随着化合物（1）浓度的升高(150～900μg/mL)，其抑制细胞生长的能力增强，剂量效应关系显著，细胞存活率从约100%降至10%。当提取物质量浓度介于900～1500μg/mL时，细胞存活率基本不变。经计算，化合物（1）对3T3-L1前脂肪细胞生长抑制的IC50为(214.2±20.2)μg/mL。试验结果表明化合物（1）对Swiss小鼠前脂肪细胞3T3-L1有明显的生长抑制作用，呈现显著剂量效应。

[0065] 实施例5乳酸脱氢酶(LDH，lactate dehydrogenase)释放量检测

[0066] 取6孔培养板，每孔加入1mL3T3-L1前脂肪细胞浓度为5×104个/mL。于37℃、5%CO2培养箱中培养。24小时后弃去DMEM培养液，3孔内分别加入1mL化合物（1）的培养液，3孔内分别加入不含样品的DMEM培养液为空白对照，分别于24、48、72h收集上清液，
500×g离心10min。取50μL离心后的上清液与2mL的Tris-EDTA-NADH溶液(含有50mmol/L Tris缓冲液，pH7.4，37℃；5mmol/L EDTA；150μmol/L NADH)混合，温箱孵育12min，再加入200μL预热(37℃)过的13.5mmol/L丙酮酸钠溶液，混合均匀，于37℃、340nm波长用酶标仪测定ΔOD值。平行测定3次。结果以LDH释放率(样品LDH释放量与对照LDH释放量之比)表示。

[0067] 实验结果（图9）显示，经化合物（1）处理后，3T3-L1细胞的LDH释放率没有增加(24～48h)，反而在72小时后有减少。试验结果表明化合物（1）对3T3-L1前脂肪细胞的生长抑制作用不是通过改变细胞膜通透性实现的。

[0068] 实施例6化合物（1）前脂肪细胞3T3-L1的分化抑制

[0069] 将3T3-L1细胞接种到24孔培养板，设对照组和化合物（1）组。不含样品的DMEM培养液为空白对照，化合物（1）的浓度为12.5、25.0、50μmol／L。在含有lO％小牛血清的高糖DMEM培养基37℃、5％CO2孵箱中培养，待细胞达到70％融合时开始加分化培养基，其中含有胰岛素O．25μmol／L、甲状腺素0．2nmol／L、地塞米松O．25μmol／L、IBMX O．5nmol／L。每48小时换液1次，至诱导分化的第12天，将细胞用油红O染色，提取油红O染液，在分光光度计490nm波长处测及吸光度(A)值。

[0070] 红O染色试验结果（图10）显示，分化的第12天，与对照组比较，经化合物（1）处理的各组脂肪细胞3T3-L1中产生的甘油三酯（TG）均低于对照组。说明化合物（1）能明显抑制前脂肪细胞的分化，且其抑制作用呈现显著剂量效应。

[0071] 实施例7化合物（1）对DPPH自由基清除作用

[0072] 将化合物(1)精确称量,依次配置成浓度为10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0μM的50%乙醇溶液，分别取1mL各浓度的化合物(1)的50%乙醇溶液，加入2mL0.1mM DPPH50%乙醇溶液，充分混匀，室温下避光反应30min，测其在525nm处吸光值。以1mL50%乙醇代替样品做空白。以Vc作为阳性对照药。用下式计算化合物对DPPH自由基清除能力：(%)=(A0-A1)/A0×100，其中A0为空白吸光值，A1为样品吸光值。计算得Vc对DPPH自由基半数清除率IC50为28μM，化合物（1）对DPPH自由基半数清除率IC50为15μM。DPPH自由基清除试验结果表示，与阳性对照相比，化合物（1）具有更强的清除自由基的作用。可用于抗衰老、提高机体免疫力以及预防癌症、食品天然抗氧化剂等的医药、保健、食品工业等用途。

[0073] 本发明所述的化合物（I），可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有降脂减肥作用或延缓衰老、提高免疫力、预防癌症、抗氧化的药物及药物组合物或保健品，上述各类药物组合物或者保健品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。