谷胱甘肽冻干粉的制备方法
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 未缴年费; |
| 专利有效性 | 失效专利 | 当前状态 | 权利终止 |
| 申请号 | CN200810069962.7 | 申请日 | 2008-07-11 |
| 公开(公告)号 | CN101319244B | 公开(公告)日 | 2011-05-04 |
| 申请人 | 重庆大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 周小华; 王东; 郑申声; | 第一发明人 | 周小华 |
| 权利人 | 重庆大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 重庆大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：重庆市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：重庆市沙坪坝区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：重庆市沙坪坝区沙正街174号 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C12P21/02 | 所有IPC国际分类 | C12P21/02 ; C07K1/14 ; A61K38/06 ; A23L3/3535 ; A23L1/226 ; A23K1/16 ; C12R1/85 |
| 专利引用数量 | 3 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 3 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 专利代理人 | ||
| 摘要 | 一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法，涉及用反胶束萃取法制备还 原型 谷胱甘肽(GSH)冻干粉的方法。本 发明 方法以面包干 酵母 为原料，先制备含GSH的提取液及P204反胶束溶液，后通过反胶束溶液对GSH提取液进行萃取，再用 氯化钠 溶液对萃取后的反胶束溶液进行反萃取，然后经过 超滤 、 冷冻干燥 制备出成品。本发明方法简单，制备条件温和，反萃取后的反胶束溶液可以再生利用，生产成本低；制备出的冻干粉中，GSH含量高达95.2％、回收率高达86.3％，并能制备出复合 氨 基酸浓缩液副产物。采用本发明制备出的GSH冻干粉，可广泛用作药物原材料、食品工业中的抗 氧 化保鲜剂和 风 味添加剂，还可用作 饲料 添加剂和 面包酵母 培养基等。 | ||
| 权利要求 | 1.一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法，其特征在于具体的方法步骤如下： |
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| 说明书全文 | 谷胱甘肽冻干粉的制备方法技术领域[0002] 技术背景 [0003] 谷胱甘肽是一种非常重要的活性三肽，有还原型和氧化型两种形态，广泛存在于动物，植物和微生物中。主要生理功能是抗自由基损伤、解毒、促进细胞蛋白质合成、参与转甲基或丙氨基反应、维持肝细胞正常功能等。因此，谷胱甘肽广泛应用于医学领域，如治疗肝病、急慢性肾功能衰竭、心血管疾病、老年性眼病、糖尿病神经损害，肿瘤放射治疗后的肝保护以及肠道保护等；谷胱甘肽还广泛应用于食品工业，如面制品、奶制品、肉类、水果蔬菜及饮料保健品中用作抗氧化保鲜剂和风味添加剂。目前，国内谷胱甘肽的年需求量在60吨以上，几乎全部从国外进口。因此，实现谷胱甘肽的国产化，具有重要战略意义和经济价值。 [0004] 现有制备还原型谷胱甘肽(GSH)的方法主要有：铜盐沉淀法、离子交换法、金属盐-离子耦合层析法、电渗析法、双水相结合温度诱导分离法。其中用到最多的是离子交换法，该方法以离子键将GSH交换到树脂上，再用洗脱剂洗脱。如公开号为CN1807447A的“谷胱甘肽纯化分离方法”专利，公开的是选择含-S-R基团或-S-S-R’基团的分离介质装填成层析柱，调节pH值为1.0～10.0的缓冲溶液平衡层析柱，调节pH值为1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，再用碱或酸洗脱，可得到只含谷胱甘肽的洗脱液，结晶后制得GSH晶体。该方法的主要缺点是：①产生大量酸碱性较强的洗脱废液，必须净化后才能排放，这不但增加了生产成本，还增加了治理废液的工艺设备及场地，从而进一步增加了生产成本。②该方法的结晶过程往往损失较多产品而导致收率降低。③制备的产品为晶体，在使用时，需将GSH晶体配制成GSH溶液，因GSH晶体的不完全溶解而导致GSH晶体利用率降低。又如公开号为CN1850854A的“一种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱甘肽的方法”专利，公开的是采用谷胱甘肽发酵液离心得到酵母细胞，经调节pH值、沸水破壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽，同时使蛋白质沉淀，再用阳离子交换技术去除小分子和有色物质，最终从发酵液中浓缩纯化谷胱甘肽，制得分子量为307.33、蛋白质含量为23％、提取收率为80.5的白色粉末状谷胱甘肽成品。该方法的主要缺点是产物中含有较多的蛋白质，产品质量不高；谷胱甘肽纯度不高；有较多的洗脱废液产生，增加了治理废液的成本。 [0005] 其次是金属盐-离子耦合层析法，其原理是利用Cu2+、Co2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸配位结合，由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同，因而与金属螯合物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。如《化学与生物工程》2007年11月第24卷第11期的“锌离子螯合亲和层析分离纯化谷胱甘肽的研究”一文，公开的是利用锌离子与GSH的巯基螯合从而达到分离目2+ 的，以谷胱甘肽的酵母抽提液为原料，用自制的以壳聚糖小球为栽体、Zn 为配基的金属螯合亲和层析柱分离纯化谷胱甘肽(GSH)。上柱谷胱甘肽抽提液浓度为132.30mg/(100mL)，上柱pH值为7.0，用含0.5mol/L NH4Cl的pH值为4.2的0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗脱，然后经浓缩、冷冻干燥处理，即得到分离纯化的GSH，谷胱甘肽回收率为68.61％。此法易于操作，但获得的提取物中GSH纯度不高，冻干粉中GSH的含量仅为9.0％。 发明内容[0006] 本发明的目的是针对现有制备还原型谷胱甘肽(GSH)方法的不足之处，提供一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法。具有工艺简单，操作简便，制备条件温和等优点，在室温条件下即可进行萃取分离；并且该萃取剂无毒且可以回收再次利用，降低了生产成本。 [0007] 本发明的原理：反胶束萃取技术是上世纪80年代初发展起来的生物物质分离、纯化技术。具有成本低、溶剂可反复利用、萃取效率高、条件温和不会引起生物活性物质变性，选择性高，操作简单可以连续生产等优点。目前，反胶束萃取技术在分离氨基酸、蛋白质等领域逐渐应用。GSH分子上有正电荷氨基，可与负电荷磷酸二辛酯(P204)形成静电相互作用，因此，能被萃取分离。由于P204的烃链短，直链仅有6个碳原子，以其制备的反胶束直径明显小于蛋白质等荷电大分子，因此，蛋白质等大分子不能进入P204反胶束，而与GSH分离；GSH的分子量虽仅为307Da左右，但是，由于其特殊的肽键结构，分子面积约为0.941平方纳 2 米(nm)显著大于分子量与GSH相近的氨基酸分子，因此，选择适当的超滤膜可将两者进行超滤分离。通过萃取、反萃取及超滤分离，可获得高纯度GSH。 [0008] 本发明的目的是这样实现的：一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法，以面包干酵母为原料，先制备含GSH的提取液及P204反胶束溶液，后通过反胶束溶液对GSH提取液进行萃取，再用氯化钠溶液对萃取后的反胶束溶液进行反萃取，然后经过超滤、冷冻干燥制备出谷胱甘肽冻干粉成品。具体的方法步骤如下： [0009] (1)GSH提取液的制备 [0010] 以面包干酵母为原料，按照面包干酵母的重量∶蒸馏水的体积∶二甲苯的体积比为1∶2～3∶0.03～0.05的比例，先在面包干酵母中加入蒸馏水，搅拌混合均匀。再加入二甲苯，并搅拌混合均匀后，置于摇床上振荡5～8小时。然后再加入与混合液等体积的蒸馏水，再进行抽滤，弃滤渣，收集滤液。对滤液用稀盐酸调节pH值为1.0～3.0，然后，加入氯化钠固体，搅拌混合均匀，制备出氯化钠的摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的还原型谷胱甘肽(GSH)提取液。 [0011] (2)反胶束溶液的制备 [0012] 以磷酸二辛酯(P204)为萃取剂，以正辛醇为稀释剂，将P204加入正辛醇中，搅拌均匀后，配制出P204的摩尔浓度为0.1～0.2mol/L的P204溶液。然后按P204溶液的P204∶蒸馏水的摩尔比为1∶5～20的比例，在P204溶液中加入蒸馏水，搅拌0.5～1.5小时，就制备出P204反胶束溶液。 [0013] (3)萃取 [0014] 在第(1)步和第(2)步完成后，按第(1)步制备出的GSH提取液∶第(2)步制备的P204反胶束溶液的体积比为1∶2～4的比例，先将GSH提取液和P204反胶束溶液置于萃取器中，然后进行搅拌萃取10～45min。再用离心机以7000～9000r/min的速度，对其进行离心分离5～15min后，静置分层，分别收集上层反胶束相和下层水相。然后再次在收集的水相中，加入2～4倍体积的第(2)步制备出的P204反胶束溶液，再次进行萃取和离心分离，再次分别收集下层水相和上层反胶束相，如此重复萃取2～4次，最后合并各次收集的上层萃取有GSH的反胶束溶液。 [0015] (4)反萃取 [0016] 第(3)步完成后，按第(3)步最后收集的萃取有GSH的反胶束溶液∶氯化钠的摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的氯化钠溶液的体积比为1∶2～4的比例，先将萃取有GSH的反胶束溶液置于萃取器中，再加入氯化钠溶液，搅拌混合均匀。最后用氢氧化钠溶液调节其pH值为10.0～12.0，进行搅拌反萃取35～65min。再用离心机以7000～9000r/min的速度，对其进行离心分离5～15min，静置分层后，分别收集下层水相和上层反胶束相。然后，再次在收集的反胶束相中，再次加入2～4倍体积的氯化钠溶液，再次调节pH值，再次进行反萃取和离心分离，再次分别收集下层水相和上层反胶束相，如此重复反萃取2～4次。最后，分别合并各次收集的反萃取有GSH的下层水相和反萃取后的上层反胶束相。 [0017] (5)制备GSH浓缩液 [0018] 第(4)步完成后，将第(4)步最后收集的反萃取有GSH的下层水相，置于截留分子量为1000的超滤器中，在压力为0.1～0.25Mpa下，进行超滤。当超滤截留液体积降低至原体积0.1～0.2时，补充蒸馏水至原体积，再进行超滤，如此重复，直至超滤滤过液中无氨基酸反应为止。再分别收集超滤截留液和超滤滤过液。然后将收集的超滤截留液，置于真空浓缩器中，在温度为60～70℃、真空度为0.06～0.08Mpa的条件下，进行真空浓缩，就制备出GSH浓缩液。对收集的超滤滤过液，通过真空浓缩器，进行真空浓缩为复合氨基酸浓缩液，可用作食品、饲料等行业的调味添加剂。 [0019] (6)制备GSH冻干粉 [0020] 在第(5)步完成后，将第(5)步制备出的GSH浓缩液，在-20～-15℃温度下，预冻1～2小时后，再置于冷冻干燥机中，在压力为30～50Pa、温度为-60～-50℃条件下，冷冻干燥20～30小时，就制备出白色的GSH冻干粉。 [0021] (7)再生萃取剂 [0022] 在第(6)步完成后，在第(4)步最后收集的反胶束溶液中，加入无水硫酸钠干燥剂，加入的无水硫酸钠的质量为收集的反胶束溶液体积的2～5％。混合均匀后，静置吸水20～30小时，再用离心机以4000～6000r/min的速度，离心分离10～20min，分别收集上层萃取剂清液和下层沉淀。对收集的上层萃取剂清液，可再次用于制备反胶束溶液。对收集的下层沉淀，在100～110℃下进行烘干，可再次用作吸附水分的干燥剂。 [0023] 本发明采用以上技术方案后，主要有以下特点： [0024] 1.方法简单，条件温和。本发明方法对面包干酵母提取液进行反胶束萃取，再反萃取、浓缩、冷冻干燥即得到成品，制备方法简便，所需的劳动量少，且制备条件温和、时间短。因此，生产成本低且安全性好，便于工业化规模生产。 [0026] 3.产品中GSH含量较高，GSH有较高的回收率。采用本发明方法后，获得的冻干粉中GSH含量达到92.3～95.2％，GSH回收率达到86.3％。所得的产品为冻干粉，便于配制成使用所需的溶液，损失小且使用方便。 [0027] 4.生产过程中制备的复合氨基酸浓缩液副产物，可用于食品、饲料等行业调味添加剂。 [0028] 采用本发明方法制备出的GSH冻干粉可用作药物原材料、食品工业中的抗氧化保鲜剂和风味添加剂，还可用作饲料添加剂和面包酵母培养基等。 具体实施方式[0029] 下面结合具体的实施方式，进一步说明本发明。 [0030] 实施例1 [0031] 一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法的具体方法步骤如下： [0032] (1)GSH提取液的制备 [0033] 以面包干酵母为原料，按照面包干酵母的重量∶蒸馏水的体积∶二甲苯的体积比为1∶2∶0.03的比例，先在面包干酵母中加入蒸馏水，搅拌混合均匀。再加入二甲苯，并搅拌混合均匀后，置于摇床上振荡5小时。然后再加入与混合液等体积的蒸馏水，再进行抽滤，弃滤渣，收集滤液。对滤液用稀盐酸调节pH值为1.0，加入氯化钠固体，搅拌混合均匀，制备出氯化钠的摩尔浓度为0.05mol/L的还原型谷胱甘肽(GSH)提取液。 [0034] (2)反胶束溶液的制备 [0035] 以磷酸二辛酯(P204)为萃取剂，以正辛醇为稀释剂，将P204加入正辛醇中，搅拌均匀后，配制出P204的摩尔浓度为0.1mol/L的P204溶液。然后按P204溶液的P204∶蒸馏水的摩尔比为1∶5的比例，在P204溶液中加入蒸馏水，搅拌0.5小时，就制备出P204反胶束溶液。 [0036] (3)萃取 [0037] 在第(1)步和第(2)步完成后，按第(1)步制备出的GSH提取液∶第(2)步制备的P204反胶束溶液的体积比为1∶2的比例，先将GSH提取液和P204反胶束溶液置于萃取器中，进行搅拌萃取10min。再用离心机以7000r/min的速度，对其进行离心分离5min后，静置分层，分别收集上层反胶束相和下层水相。然后再次在收集的水相中，加入2倍体积的第(2)步制备出的P204反胶束溶液，再次进行萃取和离心分离，再次分别收集下层水相和上层反胶束相，如此重复萃取2次，最后合并各次收集的上层萃取有GSH的反胶束溶液。 [0038] (4)反萃取 [0039] 第(3)步完成后，按第(3)步最后收集的萃取有GSH的反胶束溶液∶氯化钠的摩尔浓度为0.05mol/L的氯化钠溶液的体积比为1∶2的比例，先将萃取有GSH的反胶束溶液置于萃取器中，再加入氯化钠溶液，搅拌混合均匀。后用氢氧化钠溶液调节其pH值为10.0，进行搅拌反萃取35min。再用离心机以7000r/min的速度，对其进行离心分离5min，静置分层后，分别收集下层水相和上层反胶束相。然后，再次在收集的反胶束相中，再次加入2倍体积的氯化钠溶液，再次调节pH值，再次进行反萃取和离心分离，再次分别收集下层水相和上层反胶束相，如此重复反萃取2次。最后，分别合并各次收集的反萃取有GSH的下层水相和反萃取后的上层反胶束相。 [0040] (5)制备GSH浓缩液 [0041] 第(4)步完成后，将第(4)步最后收集的反萃取有GSH的下层水相，置于截留分子量为1000的超滤器中，在压力为0.1Mpa下，进行超滤。当超滤截留液体积降低至原体积0.1时，补充蒸馏水至原体积，再进行超滤，如此重复，直至超滤滤过液中无氨基酸反应为止。再分别收集超滤截留液和超滤滤过液。然后将收集的超滤截留液，置于真空浓缩器中，在温度为60℃、真空度为0.06Mpa的条件下，进行真空浓缩，就制备出GSH浓缩液。对收集的超滤滤过液，通过真空浓缩器，进行真空浓缩为复合氨基酸浓缩液，可用作食品、饲料等行业的调味添加剂。 [0042] (6)制备GSH冻干粉 [0043] 在第(5)步完成后，将第(5)步制备出的GSH浓缩液，在-20℃温度下，预冻1小时后，再置于冷冻干燥机中，在压力为30Pa、温度为-60℃条件下，冷冻干燥20小时，就制备出GSH的含量为92.3％、回收率为55.7％的白色冻干粉。 [0044] (7)再生萃取剂 [0045] 在第(6)步完成后，在第(4)步收集的反胶束溶液中，加入无水硫酸钠干燥剂，加入的无水硫酸钠的质量为收集的反胶束溶液体积的2％。混合均匀后，静置吸水20小时，再用离心机以4000r/min的速度，离心分离10min，分别收集上层萃取剂清液和下层沉淀。对收集的上层萃取剂清液，可再次用于制备反胶束。对收集的下层沉淀，在100℃下进行烘干，可再次用作吸附水分的干燥剂。 [0046] 实施例2 [0047] 一种谷胱甘肽冻干粉的制备方法的具体方法步骤如下： [0048] (1)GSH提取液的制备 [0049] 同实施例1，其特征为：面包干酵母的重量∶蒸馏水的体积∶二甲苯的体积比为1∶3∶0.05，振荡8小时，pH值为3.0，制备出氯化钠的摩尔浓度为0.2mol/L的还原型谷胱甘肽提取液。 [0050] (2)反胶束溶液的制备 [0051] 同实施例1，其特征为：配制出P204的摩尔浓度为0.2mol/L的P204溶液，P204溶液的P204∶蒸馏水的摩尔比为1∶20，搅拌1.5小时。 [0052] (3)萃取 [0053] 同实施例1，其特征为：第(1)步制备出的GSH提取液∶第(2)步制备的P204反胶束溶液的体积比为1∶4，搅拌萃取45min，用9000r/min的速度离心分离15min，再次在收集的水相中加入4倍体积的第(2)步制备的P204反胶束溶液，如此重复萃取4次。 [0054] (4)反萃取 [0055] 同实施例1，其特征为：第(3)步最后收集的萃取有GSH的反胶束溶液∶氯化钠的摩尔浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液的体积比为1∶4，pH值为12.0，搅拌反萃取65min，用9000r/min的速度离心分离15min，再次在收集的反胶束相中加入4倍体积的氯化钠溶液，如此重复萃取4次。 [0056] (5)制备GSH浓缩液 [0057] 同实施例1，其特征为：超滤的压力为0.25Mpa，当超滤截留液体积降低至原体积0.2时，补充蒸馏水至原体积，真空浓缩的温度为70℃、真空度为0.08Mpa。 [0058] (6)制备GSH冻干粉 [0059] 同实施例1，其特征为；预冻的温度为-15℃、时间为2小时，冷冻干燥的压力为50Pa、温度为-50℃、时间为30小时，制备出GSH的含量为93.6％、回收率为63.2％的白色冻干粉。 [0060] (7)再生萃取剂 |
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