一种基于辐照的免疫活性峨参多糖及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202410106879.1 | 申请日 | 2024-01-24 | 公开(公告)号 | CN117986393A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 四川省原子能研究院; | 发明人 | 张晓彬; 倪茂君; 王静霞; 彭朝荣; 陈浩; 黄敏; 潘平川; 江力; 夏丽君; 高鹏; 邓文敏; 蒋合众; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种基于辐照的免疫活性峨参多糖及其制备方法和应用，本发明涉及中药提取技术领域。该峨参多糖采用辐照技术制得，呈现单分散态，粒径为50‑500nm，重均分子量为40‑100kDa。本发明创造性的利用带皮峨参内部结构特征，将峨参带皮加工与辐照破壁结合，对带皮峨参根进行辐照处理，可以直接制备获得多分散、尺寸均一、高免疫活性峨参纳米多糖。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其特征在于，该多糖采用辐照技术制得，呈现单分散态，粒径为50‑500nm，重均分子量为40‑100kDa。 |
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| 说明书全文 | 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种基于辐照的免疫活性峨参多糖及其制备方法和应用。 背景技术[0002] 峨参为伞形科峨参属植物峨参Anthriscus sylvestris(L.)Hoffm的根，是四川峨眉山特产，著名的川产特色药材，并于欧洲、北美等地区也有分布，峨参作为四川道地滋补类中药，使用历史悠久，其民间食用、药用历史悠久，作为药用植物，可预防和治疗包括支气管炎、咳嗽、发烧等多种疾病，也可被用作营养品、补品、蔬菜和保健食品食用，据《四川中药志》记载：“峨参入脾、胃、肺三经。性微温，味甘辛，无毒。凡邪实而正气未虚者忌用。补中益气。能够治脾虚食胀，四肢乏力，肺虚咳喘，老人夜尿，并消水肿”。 [0003] 多糖作为生物体主要活性成分之一，同时具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多种药理活性，是天然的免疫调节剂，来源广泛，并且具有无毒副作用、无抗药性的独特优势，在免疫调节方面体现了巨大的应用开发前景。多糖的活性受其单糖组成、官能团和空间构象等结构属性的影响，具有三股螺旋结构的多糖是最具活性的，峨参多糖是峨参的主要成分之一，峨参水煎液对脾虚有一定的改善作用，但峨参质地硬脆，有效成分提取困难，目前的研究多集中于小分子成分的发掘与药理研究，主要包括木脂素类、苯丙素类、香豆素类等化合物的挖掘，而峨参多糖的研究国内外均较少，且制备的峨参多糖多呈聚集状态，且免疫活性不高，因此，迫切需要一种多分散自组装的免疫活性峨参多糖。 发明内容[0004] 为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于辐照的免疫活性峨参多糖及其制备方法和应用，以解决现有峨参多糖难以分散且免疫效果不佳的问题。 [0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，该多糖采用辐照技术制得，呈现单分散态，粒径为50‑500nm，重均分子量为40‑100kDa。 [0006] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进： [0007] 进一步，平均粒径为300‑350nm。 [0008] 进一步，平均粒径为314nm。 [0009] 本发明还提供上述基于辐照的免疫活性峨参多糖的制备方法，包括以下步骤： [0011] (2)将步骤(1)制得的峨参残渣粉以60Coγ射线或电子束为辐照源，进行辐照处理，制得辐照峨参残渣粉； [0012] (3)将步骤(2)制得的辐照峨参残渣粉在NaOH溶液中进行超声，然后离心，得上清液一，调节pH值为4‑5，离心，得上清液二，浓缩，加入乙醇溶液进行沉淀，离心，收集沉淀，再依次洗涤和干燥，制得峨参粗多糖； [0013] (4)将步骤(3)制得的峨参粗多糖加入水溶解，然后依次冷藏、离心和冷冻干燥，制得基于辐照的免疫活性峨参多糖。 [0014] 进一步，步骤(1)中，峨参粉和乙醇溶液的质量体积比为1g：4‑40mL。 [0015] 进一步，步骤(1)中，原含水量为50‑60wt％。 [0016] 进一步，步骤(1)中，第一次粉碎的粒径为2‑3mm。 [0017] 进一步，步骤(1)中，第二次粉碎的粒径为0.3‑0.5mm。 [0018] 进一步，步骤(1)中，过5‑50目筛。 [0019] 进一步，步骤(1)中，于60‑90℃条件下回流提取2‑3h。 [0020] 进一步，步骤(1)中，乙醇溶液的体积分数为90‑98％。 [0021] 进一步，步骤(1)中，乙醇溶液的体积分数为95％。 [0022] 进一步，步骤(1)中，回流提取重复2‑3次。 [0023] 进一步，步骤(2)中，辐照处理时辐照吸收剂量为50‑200kGy。 [0024] 进一步，步骤(2)中，以60Coγ射线为辐照源时，剂量率为10‑100Gy/min。 [0025] 进一步，步骤(2)中，以电子束为辐照源时，电子束能量为2‑10MeV，单面辐照时峨参残渣粉厚度为2‑5cm，双面辐照时峨参残渣粉厚度为8‑10cm。 [0026] 进一步，步骤(2)中，于10‑50℃条件下进行辐照。 [0027] 进一步，步骤(2)中，将步骤(1)制得的峨参残渣粉置于包装袋中密封，然后进行辐照处理。 [0029] 进一步，步骤(3)中，辐照峨参残渣粉和NaOH溶液的质量比为1：8‑12。 [0030] 进一步，步骤(3)中，NaOH溶液的浓度为0.01‑0.03mol/L。 [0031] 进一步，步骤(3)中，于35‑45kHz、700‑800W和室温条件下超声1.5‑2.5h。 [0033] 进一步，步骤(3)中，pH值为4.5。 [0034] 进一步，步骤(3)中，浓缩为原体积的1/4‑1/3。 [0035] 进一步，步骤(3)中，浓缩得到的浓缩液和乙醇溶液的体积比为1：3‑5。 [0036] 进一步，步骤(3)中，于3‑6℃条件下沉淀20‑25h。 [0037] 进一步，步骤(3)中，乙醇溶液的体积分数为90‑98％。 [0038] 进一步，步骤(3)中，乙醇溶液的体积分数为95％。 [0039] 进一步，步骤(3)中，采用无水乙醇洗涤。 [0040] 进一步，步骤(3)中，依次真空干燥和冷冻干燥完成干燥过程。 [0041] 进一步，步骤(3)中，于0.09‑0.1MPa和室温条件下真空干燥20‑30min。 [0042] 进一步，步骤(4)中，峨参粗多糖和水的质量体积比为1g：5‑10mL。 [0043] 进一步，步骤(4)中，于3‑6℃条件下冷藏20‑30h。 [0044] 进一步，步骤(4)中，于‑70～‑90℃条件下冷冻干燥12‑24h。 [0045] 本发明还提供上述基于辐照的免疫活性峨参多糖在免疫调节药品或功能食品制备方面的应用。 [0046] 本发明具有以下有益效果： [0047] 1、本发明采用的原料为带皮峨参根，峨参在民间药用食用历史悠久，因此原料来源丰富，使用安全，且本发明中峨参不去皮，药材得到充分利用，解决了峨参根传统前处理过程中去皮导致的活性成分浪费；另外，针对峨参根完全干燥后质地过硬，难粉碎，成分难溶出等问题，本发明采用峨参鲜品趁鲜加工，通过控制粉碎时的含水量，在半干时粉碎，既可以提高可操作性并改善粉碎效果从而促进后续多糖成分溶出，提高峨参多糖提取率和提取效率，也避免了湿法粉碎时药液流失，还有利于进一步干燥；同时，粉碎带皮峨参根使得质地较软的皮和质地较硬的根混合粉碎，这也有利于解决粉碎难度大、效果差、粉尘飞扬、后续提取困难等问题。 [0048] 2、本发明利用乙醇溶液回流提取除，去脂溶性小分子成分，冰醋酸调节pH值，除去蛋白，有利于获得较纯的，结构明确的多糖，提高提取产物中活性成分的含量从而提高活性，也有利于结构鉴定和活性实验结果的重现性。 [0049] 3、本发明还结合辐照处理，辐照具有破坏植物细胞结构，促进活性多糖溶出的能力，更能够将大分子难溶多糖转变为低分子量、高溶解度的多糖，提高多糖免疫活性；同时，带皮峨参由于具有丰富的苯丙素类结构，辐照过程中产生的自由基被苯丙素类优先消耗，从而降低自由基对多糖结构的影响，于此同时也并未破坏峨参多糖三螺旋结构。在这种情况下，40‑100kDa分子量段的多糖快速溶出，从而获得单分散，高活性，粒径均一的高免疫活性峨参多糖，辐照制备的分散性峨参纳米多糖具有更强的免疫活性，是一种理想的免疫佐剂和纳米载体。 [0050] 4、峨参多糖在稀碱液中的溶解性更佳，因此，采用稀NaOH溶液进行碱提，能够提高提取率，同时稀碱能减少DNA、蛋白质等物质的溶出；另外，超声辅助提取，利用超声波的空化作用、机械作用、热效应等增大物质分子运动频率和速度，破坏细胞壁和加强细胞内传质作用，促进单分散峨参多糖的浸出。 [0051] 5、峨参根传统的前处理过程中会去皮，这在一定程度上导致了活性成分的损失，且提取获得的峨参多糖通常是团聚态的，难以获得分散性结构。辐照通常被认为是一种破坏大分子结构的通用技术，本发明创造性的利用带皮峨参内部结构特征，将峨参带皮加工与辐照破壁结合，对带皮峨参根进行辐照处理，可以直接制备获得具有高度分散性的免疫活性峨参纳米多糖，这种峨参纳米多糖尺寸均一，更具有高免疫活性。附图说明 [0052] 图1为实施例1‑4和对比例1制得峨参多糖的三螺旋检测； [0053] 图2为实施例1‑4和对比例1制得的峨参多糖的红外光谱； [0054] 图3为实施例1和对比例1制得的峨参多糖的扫描电镜分析； [0055] 图4为实施例1和对比例2制得的峨参多糖的扫描电镜分析； [0056] 图5为实施例1‑4和对比例1制得的峨参多糖的分子量分析； [0057] 图6为实施例1和对比例1制得的峨参多糖的免疫检测。 具体实施方式[0058] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。 [0059] 实施例1： [0060] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0061] (1)将带皮峨参根鲜药材烘干至原含水量一半，烘干至含水量为28wt％，切片，第一次粉碎粒径为2.5mm，然后完全烘干，第二次粉碎粒径为0.4mm，过40目筛，制得峨参粉，然后按照质量体积比为1g：30mL，利用乙醇溶液(95vt％)进行回流提取，于80℃条件下回流提取2.5h，回流提取重复3次，过滤残渣并干燥，制得峨参残渣粉； [0062] (2)将步骤(1)制得的峨参残渣粉置于包装袋(聚烯烃)中密封，以60Coγ射线为辐照源(辐照吸收剂量为100kGy，剂量率为50Gy/min)，于30℃条件下进行辐照处理，制得辐照峨参残渣粉； [0063] (3)按照质量比为1：10，将步骤(2)制得的辐照峨参残渣粉在NaOH溶液(浓度为0.02mol/L)中进行超声，于40kHz、750W和室温条件下超声2h，然后离心，得上清液一，采用冰醋酸调节pH值为4.5，离心，得上清液二，浓缩为原体积的5/12，按照体积比为1：4，加入乙醇溶液(95vt％)，于5℃条件下沉淀24h，离心，收集沉淀，然后依次采用无水乙醇洗涤，于 0.095MPa和室温条件下真空干燥25min，冷冻干燥，制得峨参粗多糖； [0064] (4)按照质量体积比为1g：10mL，将步骤(3)制得的峨参粗多糖加入水溶解，然后于5℃条件下冷藏25h，离心，于‑80℃条件下冷冻干燥20h，制得基于辐照的免疫活性峨参多糖。 [0065] 实施例2： [0066] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0067] 步骤(2)中，辐照吸收剂量为50kGy，其余同实施例1。 [0068] 实施例3： [0069] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0070] 步骤(2)中，辐照吸收剂量为150kGy，其余同实施例1。 [0071] 实施例4： [0072] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0073] 步骤(2)中，辐照吸收剂量为200kGy，其余同实施例1。 [0074] 实施例5： [0075] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0076] (1)将带皮峨参根鲜药材烘干至原含水量一半，烘干至含水量为25wt％，切片，第一次粉碎粒径为2mm，然后完全烘干，第二次粉碎粒径为0.3mm，过5目筛，制得峨参粉，然后按照质量体积比为1g：4mL，利用乙醇溶液(90vt％)进行回流提取，于60℃条件下回流提取3h，回流提取重复2次，过滤残渣并干燥，制得峨参残渣粉； [0077] (2)将步骤(1)制得的峨参残渣粉置于包装袋(聚酰胺)中密封，以60Coγ射线为辐照源(辐照吸收剂量为50kGy，剂量率为100Gy/min)，于10℃条件下进行辐照处理，制得辐照峨参残渣粉； [0078] (3)按照质量比为1：8，将步骤(2)制得的辐照峨参残渣粉在NaOH溶液(浓度为0.01mol/L)中进行超声，于35kHz、700W和室温条件下超声1.5h，然后离心，得上清液一，采用冰醋酸调节pH值为4，离心，得上清液二，浓缩为原体积的1/4，按照体积比为1：3，加入乙醇溶液(90vt％)，于3℃条件下沉淀25h，离心，收集沉淀，然后依次采用无水乙醇洗涤，于 0.09MPa和室温条件下真空干燥30min，冷冻干燥，制得峨参粗多糖； [0079] (4)按照质量体积比为1g：5mL，将步骤(3)制得的峨参粗多糖加入水溶解，然后于3℃条件下冷藏30h，离心，于‑70℃条件下冷冻干燥12h，制得基于辐照的免疫活性峨参多糖。 [0080] 实施例6： [0081] 一种基于辐照的免疫活性峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0082] (1)将带皮峨参根鲜药材烘干至原含水量一半，烘干至含水量为30wt％，切片，第一次粉碎粒径为3mm，然后完全烘干，第二次粉碎粒径为0.5mm，过50目筛，制得峨参粉，然后按照质量体积比为1g：40mL，利用乙醇溶液(98vt％)进行回流提取，于90℃条件下回流提取2h，回流提取重复3次，过滤残渣并干燥，制得峨参残渣粉； [0083] (2)将步骤(1)制得的峨参残渣粉置于包装袋(聚对苯二甲酸乙二醇酯)中密封，以电子束为辐照源(辐照吸收剂量为200kGy，剂量率为10Gy/min)，电子束能量为6MeV，单面辐照时峨参残渣粉厚度为3cm，双面辐照时峨参残渣粉厚度为9cm，于50℃条件下进行辐照处理，制得辐照峨参残渣粉； [0084] (3)按照质量比为1：12，将步骤(2)制得的辐照峨参残渣粉在NaOH溶液(浓度为0.03mol/L)中进行超声，于45kHz、800W和室温条件下超声1.5h，然后离心，得上清液一，采用冰醋酸调节pH值为5，离心，得上清液二，浓缩为原体积的1/3，按照体积比为1：5，加入乙醇溶液(98vt％)，于6℃条件下沉淀20h，离心，收集沉淀，然后依次采用无水乙醇洗涤，于 0.1MPa和室温条件下真空干燥20min，冷冻干燥，制得峨参粗多糖； [0085] (4)按照质量体积比为1g：10mL，将步骤(3)制得的峨参粗多糖加入水溶解，然后于6℃条件下冷藏20h，离心，于‑90℃条件下冷冻干燥24h，制得基于辐照的免疫活性峨参多糖。 [0086] 对比例1： [0087] 一种峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0088] 不包含步骤(2)，其余同实施例1。 [0089] 对比例2： [0090] 一种峨参多糖，其制备方法包括以下步骤： [0091] 步骤(1)中采用不带皮峨参根鲜药材，其余同实施例1。 [0092] 试验例 [0093] 一、分别将实施例1‑4和对比例1制得的多糖以及刚果红进行刚果红试验检测，检测方法具体为：将1.5mL的0.2mmol/L刚果红溶液和1mL的2mg/mL峨参多糖溶液混合，并将NaOH终浓度分别调整为0、0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L，进而测定不同NaOH浓度下，刚果红对照溶液和峨参多糖混合溶液的最大吸收波长λmax，并作图，结果见图1。 [0094] 由图1可知，刚果红能与三螺旋结构的多糖形成络合物从而在一定NaOH浓度范围内使最大吸收波长增大(红移)，说明本发明制备的峨参多糖能够保持三螺旋结构。 [0095] 二、分别将实施例1‑4和对比例1制得的多糖进红外光谱检测，检测方法具体为：将‑1样品在真空干燥箱中低温干燥，分别取8mg样品粉末，采用KBr压片，在4000‑600cm 进行傅里叶红外光谱扫描，结果见图2。 [0096] 由图2可知，本发明制备的基于辐照的免疫活性峨参多糖官能团未发生明显变化。 [0097] 三、将实施例1和对比例1‑2制得的多糖进行扫描电镜分析检测，检测方法具体为：将样品在真空干燥箱中低温干燥至恒重，表面喷金处理，观察表面及微观形貌，结果见图3‑ 4。 [0098] 由图3‑4可知，本发明制备的基于辐照的免疫活性峨参多糖呈现单分散态，平均粒‑1径为314nm ，而对比例1制得的多糖呈团聚状态，对比例2中制得的多糖形态不一，无法获得均一的形貌。 [0099] 四、将实施例1‑4和对比例1制得的多糖采用凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography，GPC)测定分子量，具体方法为：将窄分布的葡聚糖标准品(2.5‑5348kDa)和待测样品配成5mg/mL流动相溶液，经0.45μm滤膜后进样检测，根据保留时间和标准分子量校正曲线，由GPC软件计算样品分子量，检测条件：Waters 515液相色谱仪，检测器为Waters 2410示差检测器，色谱柱为Waters Ultrahyrdogel Linear凝胶色谱柱(300×7.8mm)，流动相为0.2mol/L硫酸钠(NaNO3)，流速0.6mL/min，色谱柱柱温为40℃，进样体积 20μL，结果见图5。 [0100] 由图5可知，本发明制备的基于辐照的免疫活性峨参多糖重均分子量为40‑100kDa，而对比例1制得的多糖的重均分子量为34.2kD。辐照制备的峨参多糖最大的特点是，由于对带皮峨参骨架结构的破坏，可以大幅度增加40‑100kDa分子量段的峨参多糖(图5中12～14min)的比例，辐照对于带皮峨参分子量分布产生的影响，导致40‑100kDa段结构富集，从图3和图4扫描电镜图可以明显看到本技术中制备峨参纳米多糖的特殊性。 [0101] 五、免疫活性检测 [0102] 将实施例1和对比例1制得的多糖进行免疫活性检测，具体方法为：环磷酰胺有免疫抑制作用是由于能抑制细胞的增殖，非特异性地杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞，将C57雄鼠腹腔注射80mg/kg环磷酰胺，连续注射三天后，得到免疫模型，然后喂食本发明制得的基于辐照的免疫活性峨参多糖，剂量每日100mg/kg，第11天腹腔注射200mg/kg环磷酰胺，第14天对免疫器官进行分析，结果见图5和表1(表1中，没有病变，记录为(—)，采用4级法，分别为轻微(+)、轻度(++)、中度(+++)、重度(++++))。 [0103] 表1免疫性能检测 [0104] [0105] [0106] 由图5和表1可知，通过对喂食不同多糖组的胸腺组织进行病理学分析，在短短两周之内，对于胸腺，对比例1的未辐照的峨参多糖0kGy组仅能改善淋巴细胞减少，而本发明辐照法制备的峨参多糖100kGy则具有更显著的改善胸腺萎缩的效果；对于脾脏组织，峨参多糖0kGy组仅能改善淋巴细胞减少和髓外造血，本发明的峨参多糖100kGy组完全恢复正常。 |
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