林蛙骨胶原多肽螯合钙及其制备方法 |
|||||||
| 申请号 | CN202410340197.7 | 申请日 | 2024-03-25 | 公开(公告)号 | CN117986354A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 通化康元生物科技有限公司; | 发明人 | 林万君; 郑玲玲; 林东明; | ||||
| 摘要 | 本 申请 提供了一种林蛙骨胶原多肽螯合 钙 ，其由林蛙骨胶原多肽和林蛙骨酸解液螯合制备获得；通过选择适合的酶、酸以及螯合体系，本申请的林蛙骨胶原多肽螯合钙实现了良好的螯合率、钙含量和 稳定性 ，辅以林蛙骨胶原多肽的活性，适用于制备各种补钙、增强免疫 力 的药品或保健品。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种林蛙骨胶原多肽螯合钙，其特征在于，所述林蛙骨胶原多肽螯合钙由林蛙骨胶原多肽和林蛙骨酸解液螯合制备获得。 |
||||||
| 说明书全文 | 林蛙骨胶原多肽螯合钙及其制备方法技术领域[0001] 本申请属于保健品领域和钙补充领域。具体地，本申请提供了一种林蛙骨胶原多肽螯合钙及其制备方法。 背景技术[0002] 中国林蛙(Rana temporaria chensinensis,David)的林蛙油、林蛙皮、林蛙肉被广泛用于制备食品、药品、保健品。同时，林蛙骨的利用尚不充分，目前的研究局限于使用其制备一般可溶性钙盐制剂。 [0003] 由于无机钙盐或有机酸钙在肠道中的吸收率很低，在补钙技术研究中，多肽或氨基酸螯合钙的制备日益受到关注，目前有使用鱼骨胶原多肽、牛骨胶原多肽制备螯合钙的研究，但林蛙骨胶原多肽螯合钙尚属空白。发明内容 [0004] 针对上述问题，申请人充分利用林蛙骨资源，开发了使用林蛙骨制备林蛙骨胶原多肽和林蛙骨可溶性钙，并将两者螯合制备成螯合钙的方法。 [0005] 一方面，本申请提供了一种林蛙骨胶原多肽螯合钙，所述林蛙骨胶原多肽螯合钙由林蛙骨胶原多肽和林蛙骨酸解液螯合制备获得。 [0006] 进一步地，所述林蛙骨胶原多肽通过使用蛋白酶酶解林蛙骨粉获得。 [0007] 进一步地，所述林蛙骨胶原多肽的制备方法为： [0008] (1)将林蛙骨粉加入4倍质量的水，匀质；加入胰蛋白酶500U/mL和木瓜蛋白酶500U/mL；调pH至7.5‑8.0，50摄氏度下搅拌酶解2小时；85摄氏度灭酶8分钟；冷却后在4摄氏度下，10000r/min离心5分钟获得上清和沉淀； [0009] (2)取步骤(1)得到的上清为林蛙骨胶原多肽液。 [0010] 进一步地，所述林蛙骨酸解液的制备方法为： [0011] (3)将步骤(1)得到的沉淀干燥；将干燥后的沉淀加入10倍质量的水中得到悬液；向悬液中加入干燥后的沉淀质量50％的苹果酸；90摄氏度下搅拌反应1小时；过滤，得到林蛙骨酸解液。 [0012] 进一步地，所述螯合过程为： [0013] (4)将步骤(2)得到的林蛙骨胶原多肽液和步骤(3)得到的林蛙骨酸解液以2:1的体积比例混合，调pH至8‑8.5，加入乳化剂，45摄氏度下反应1小时，得到林蛙骨胶原多肽螯合钙。 [0014] 进一步地，所述乳化剂为0.2w/v％的司盘‑20或山梨糖醇。 [0015] 进一步地，所述所述林蛙骨胶原多肽螯合钙通过以下方法制备： [0016] (1)将林蛙骨粉加入4倍质量的水，匀质；加入胰蛋白酶500U/mL和木瓜蛋白酶500U/mL；调pH至7.5‑8.0，50摄氏度下搅拌酶解2小时；85摄氏度灭酶8分钟；冷却后在4摄氏度下，10000r/min离心5分钟获得上清和沉淀； [0017] (2)取步骤(1)得到的上清为林蛙骨胶原多肽液； [0018] (3)将步骤(1)得到的沉淀干燥；将干燥后的沉淀加入10倍质量的水中得到悬液；向悬液中加入干燥后的沉淀质量50％的苹果酸；90摄氏度下搅拌反应1小时；过滤，得到林蛙骨酸解液； [0019] (4)将步骤(2)得到的林蛙骨胶原多肽液和步骤(3)得到的林蛙骨酸解液以2:1的体积比例混合，调pH至8‑8.5，加入0.2w/v％的司盘‑20或山梨糖醇，45摄氏度下反应1小时，得到林蛙骨胶原多肽螯合钙。 [0020] 另一方面，本申请提供了上述林蛙骨胶原多肽螯合钙在制备增加骨密度的药物组合物或者保健品中的应用。 [0021] 另一方面，本申请提供了增加骨密度的药物组合物或者保健品，所述药物组合物或者保健品包含上述林蛙骨胶原多肽螯合钙。 [0022] 进一步地，所述药物或保健品为片剂。 [0023] 进一步地，所述药物或保健品还包含药学上或保健品上可接受的辅料。 [0024] 进一步地，所述林蛙骨粉的制备方法包括：将林蛙去除内脏、肉、筋膜获得林蛙骨；将林蛙骨干燥、粉碎、过筛获得林蛙骨粉。 [0026] 本申请的技术从骨胶原多肽和可溶性钙两个方面充分利用了林蛙骨这一资源及其天然生物活性(如抗氧化性)，并通过选择适合的酶、酸以及螯合体系，本申请的林蛙骨胶原多肽螯合钙实现了良好的螯合率、钙含量和稳定性。本申请的林蛙骨胶原多肽螯合钙可用于制备多种保健品和药物。附图说明 具体实施方式[0028] 基本材料和方法 [0029] 中国林蛙(Rana temporaria chensinensis,David)林蛙油获自吉林某养殖基地：取林蛙油后的残体再经人工去除肉、筋膜等杂质；鼓风干燥箱中70摄氏度下干燥6小时；粉碎，过200目筛得林蛙骨粉。 [0031] 使用甲醛电位滴定法检测，将水解后的样品定容后，加入0.1M的NaOH调pH至8.2；加入中和好的甲醛溶液；0.1M的NaOH滴定至pH 9.2；记录消耗的NaOH体积，计算氨基氮含量，将酶解液中的氨基氮含量比上总氮含量获得水解度。 [0032] DPPH自由基清除率测定： [0033] 取待测液体样品2.5mL，与2.5mL 0.1mM的DPPH无水乙醇溶液(样品)或者2.5mL无水乙醇混合(对照)，25℃下避光反应30min；以分光光度计测定样品反应液、对照反应液以及参比反应液(2.5mL无水乙醇加2.5mL 0.1mM的DPPH无水乙醇溶液)517nm处的吸光度。 [0034] DPPH自由基清除率％＝(1‑(A样品‑A对照)/A参比)。 [0035] 螯合率的测定： [0036] 向样品中加入10倍体积的无水乙醇，静置2小时后离心去除沉淀，重复一次，参考GB/T5009.92‑2003中食品中钙的测定章节中的EDTA滴定法检测上清中可溶性钙含量，按照公式：螯合率％＝总钙含量‑上清中可溶性钙含量/总钙含量×100％。 [0037] 消化道中稳定性测定： [0038] 人工胃液(百奥莱博，GL0072，参考美国药典，成分包括胃蛋白酶、盐酸、氯化钠、醋酸钠等，pH 2)。将样品配制为1％w/v的溶液，将5mL人工胃液和5mL样品溶液混合，置于37摄氏度水浴中，于0、10、20、40、60分钟各取1mL混合液检测螯合率。 [0039] 各种酶和乳化剂均为国产正规厂家的食品级产品。 [0040] 实施例1林蛙骨胶原多肽的制备 [0041] 在申请人酶解制备各种林蛙多肽的技术基础上，设计以下基本方案：将林蛙骨粉加入4倍质量的水，匀质；加入酶；调pH至7.5‑8.0，50摄氏度下低速搅拌酶解2小时；85摄氏度灭酶8分钟；冷却后在4摄氏度下，10000r/min离心5分钟；上清为林蛙骨胶原多肽液(表面有少量脂肪可吸去)，直接使用上清测试DPPH自由基清除率(三组平行实验)。 [0042] 表1不同蛋白酶和酶组合制备林蛙骨胶原多肽的效果 [0043] [0044] 胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶均可用于制备林蛙骨胶原多肽，选用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合效果最佳且成本可控。 [0045] 实施例2林蛙骨酸解液的制备 [0046] 将实施例1中使用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的组合制备林蛙骨胶原多肽液得到的沉淀干燥；将干燥后的沉淀加入10倍质量的水中；向悬液中加入干燥后的沉淀质量50％的苹果酸、柠檬酸、乳酸，或者干燥后的沉淀质量30％的冰醋酸；90摄氏度下低速搅拌反应1小时；过滤得到林蛙骨酸解液；测定上清中的可溶性钙浓度(三组平行)。 [0047] 表2不同有机酸制备林蛙骨酸解液的效果 [0048] 酸 上清可溶性钙浓度mg/mL苹果酸 9.65±1.15 柠檬酸 8.87±0.97 乳酸 5.55±2.08 冰醋酸 3.23±1.33 [0049] 与先前研究过的鱼骨不同，乳酸和冰醋酸对林蛙骨的效果并不理想，苹果酸效果最佳。 [0050] 实施例3林蛙骨胶原多肽螯合钙的制备和稳定性研究 [0051] 经过体积比例、pH、温度等参数的优化，将林蛙骨胶原多肽液和酸解液以2:1的体积比例混合，调pH至8‑8.5，45摄氏度下反应1小时，得林蛙骨胶原多肽螯合钙，螯合率在91％以上。但消化道中的稳定性不佳，在人工胃液中会快速下降至不足10％的水平。 [0052] 由于低pH下H离子倾向于与Ca离子竞争多肽上的螯合位点，在胃液中螯合率的下降不可避免，进而可能影响后续吸收(在肠道中如不能大比例及时恢复成螯合钙，吸收效果会明显下降)。申请人尝试在螯合体系中加入表面活性剂改变肽和蛋白的氨基酸基团暴露情况。将林蛙骨胶原多肽液和酸解液以2:1的体积比例混合并调节pH后加入0.2w/v％的吐温‑20、司盘‑20、乳酸脂肪酸甘油酯、磷脂、山梨糖醇。 [0053] 结果如图1所示，虽然在60分钟后，各种技术方案的螯合率都降低至5％左右，但在胃中常规停留时间内，使用司盘‑20和山梨糖醇均能有效缓解螯合率的降低，司盘‑20的效果可以持续至40分钟左右，山梨糖醇持续时间略短。 [0054] 实施例4林蛙骨胶原多肽螯合钙的优选制备方法以及实际产品的制备[0055] 经过优化后的林蛙骨胶原多肽螯合钙制备方法如下： [0056] (1)将林蛙骨粉加入4倍质量的水，匀质；加入胰蛋白酶500U/mL和木瓜蛋白酶500U/mL；调pH至7.5‑8.0，50摄氏度下搅拌酶解2小时；85摄氏度灭酶8分钟；冷却后在4摄氏度下，10000r/min离心5分钟获得上清和沉淀； [0057] (2)取步骤(1)得到的上清为林蛙骨胶原多肽液； [0058] (3)将步骤(1)得到的沉淀干燥；将干燥后的沉淀加入10倍质量的水中得到悬液；向悬液中加入干燥后的沉淀质量50％的苹果酸；90摄氏度下搅拌反应1小时；过滤，得到林蛙骨酸解液； [0059] (4)将步骤(2)得到的林蛙骨胶原多肽液和步骤(3)得到的林蛙骨酸解液以2:1的体积比例混合，调pH至8‑8.5，加入0.2w/v％的司盘‑20或山梨糖醇，45摄氏度下反应1小时，得到林蛙骨胶原多肽螯合钙；所得的林蛙骨胶原多肽螯合钙经乙醇沉淀、洗涤、冻干等步骤制成成品。 [0060] 钙片产品的制备： |
||||||
