一种花生过敏原多肽及其筛选方法和应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202410180127.X | 申请日 | 2024-02-18 | 公开(公告)号 | CN117986323A | 公开(公告)日 | 2024-05-07 |
| 申请人 | 中国农业大学; | 发明人 | 车会莲; 宋若琳; 王俊娟; 刘曼曼; 江月; 肖昊蚺; 郭晓晖; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种花生过敏原多肽及其筛选方法和应用。利用 噬菌体 展示技术筛选Ara h 5和Ara h 8蛋白的构象表位。以Ara h 5和Ara h 8蛋白为 抗原 免疫BALB/c小鼠制备抗目的蛋白的多克隆IgE和IgG 抗体 。经ELISA和斑点免疫印迹检测发现，抗Ara h 5和Ara h 8蛋白多克隆IgG、IgE的效价分别为1：64000、1：320，并且抗体具有特异性。以抗体为靶点，噬菌体展示技术筛选得到Ara h 5蛋白的构象表位序列为WETIYSR和FHWWYLK。Ara h 8蛋白的构象表位为FPYMKFV、FPYMKFR、SMFARID和SFHWWLF。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种花生过敏原多肽，其特征在于，多肽来源于Ara h 5蛋白，其序列为WETIYSR和/或FHWWYLK。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种花生过敏原多肽及其筛选方法和应用技术领域背景技术[0002] 过敏反应是指已产生免疫的机体在再次接受相同抗原刺激时所发生的组织损伤或功能紊乱的反应。近年来，过敏性疾病的发病率呈持续上升趋势，有报道指出过敏在全球的患病率高达22％，但目前大众对疾病的认知程度仍相对滞后。过敏性疾病可引起呼吸道阻塞、中枢神经系统紊乱、皮肤红肿瘙痒等症状，严重影响了患者工作和生活。 [0003] 花生作为九大类过敏原之一，花生过敏是一种由IgE介导的对特定花生蛋白的超敏反应，因为其结果可能是致命的，而且其患病率正在增加，花生过敏成为日益严重的社会问题。花生具有热稳定性高、耐酸和耐酶解的特性，一般的加工方式无法去除花生食品的致敏；而且与牛奶、鸡蛋等引起的过敏反应不同的是，花生过敏的发生往往具有终身性，仅有10％的患者随着年龄增长对花生产生免疫耐受。虽然花生的过敏原仅属于少数几类蛋白家族，但这些过敏原蛋白的结构和含量千差万别，目前仍不能解释花生引发严重过敏的原因。 [0004] 近年来关于过敏原表位的研究主要聚焦于过敏原的线性表位上，大量研究鉴定出不同过敏原的线性表位，而关于构象表位的鉴定及作用研究仍较少。而且构象型表位只见于B细胞表位，为抗原的核心部分。构象表位通常占与抗原结合的总抗体的90％。大多数食物过敏原具有热稳定性和耐蛋白酶水解的特性，在进入人体内之后仍然可以保持其原有结构，或者在进入机体经吸收运输到全身各处后仍具有致敏活性。因此，构象表位在致敏性中起着关键作用。前期研究结果发现花生蛋白Ara h 5和Ara h 8过敏原的构象表位在致敏性中也起着关键作用，并且构象表位可能是引起过敏性哮喘的原因。因此，表征花生蛋白Ara h 5和Ara h 8过敏原构象表位是非常有意义的。 [0005] 目前表征构象表位的方法包括大规模突变、噬菌体展示技术、氢/氘交换、X射线晶体学和核磁共振(NMR)。理论上确定构象表位的最佳方法是抗原‑抗体复合物的X射线共晶结构。目前由于技术限制，无法获得纯度极高的单克隆抗体以及蛋白，进而进行结晶。氢/氘交换以及核磁共振光谱的应用的难点在于实验难度大。氢/氘交换测量要求纯度极高的蛋白‑配体和蛋白样品。而核磁共振光谱需要确定抗原中每个氨基酸残基的核磁共振信号，这对于大分子抗原来说是一个很大的挑战。比较广泛使用的研究方法是通过定点突变来确定蛋白质相互作用中的关键位点。定点突变可以改变或减少蛋白质之间的相互作用，以暴露出其中的关键位点。但是这种方法昂贵且耗时的。当亲和力的丧失是由于表位外的结构发生变化时，有时会观察到假阳性结果。在抗原表位的研究中，噬菌体展示肽库作为重要技术已经被成功应用。 [0006] 为解决上述技术问题，本发明通过噬菌体展示肽库筛选靶向Ara h 5蛋白和Ara h 8蛋白的多克隆抗体，利用噬菌体展示技术筛选与多克隆抗体结合的序列，定位Ara h 5蛋白和Ara h 8蛋白作为过敏原的空间表位。 发明内容[0007] 本发明的目的在于针对上述花生蛋白致敏性研究不足以及过敏原空间表位的研究缺失的缺点，提供噬菌体展示技术在花生产品过敏机制研究中的应用。基于噬菌体展示技术，筛选花生食物过敏原的构想表位。 [0008] 花生过敏表现出较强的呼吸道过敏反应性。花生中与呼吸道过敏原有交叉反应的重要蛋白Ara h 5和Ara h 8也可以引起呼吸道过敏反应性，并且构象表位在致敏性中起着关键作用。 [0009] 本发明通过噬菌体展示技术得到Ara h 5和Ara h 8蛋白的构象表位，并筛选出有利于抗体结合的优势表位，完善了花生的致敏机制，为食物过敏的免疫治疗提供了重要理论基础，可拓展花生过敏的新治疗途径，为过敏患者提供新的应对方案。 [0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0011] 本发明提供一种花生过敏原多肽，多肽来源于Ara h 5蛋白，其序列为WETIYSR(SEQ ID NO:1)、FHWWYLK(SEQ ID NO:2)。还提供一种花生过敏原多肽，其特征在于，多肽来源于Ara h 8蛋白，其序列为FPYMKFR(SEQ ID NO:3)、SFHWWLF(SEQ ID NO:4)、FPYMKFV(SEQ ID NO:5)或SMFARID(SEQ ID NO:6)。 [0012] 本发明提供一种编码上述过敏原多肽的核酸。 [0013] 本发明提供一种表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌，其可以表达上述花生过敏原多肽。同时，本发明还提供一种表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌，其具有上述编码过敏原多肽的核酸。 [0014] 本发明还提供一种上述过敏原多肽作为有效成分的预防或治疗剂。 [0015] 本发明还提供一种上述过敏原多肽作为有效成分的预防或治疗剂的应用。进一步的，过敏原蛋白可作为具有免疫调控性的T‑细胞反应性多肽片段、B‑细胞反应性多肽片段、多肽片段与载体蛋白融合构建的蛋白或多核苷酸的至少一种作为有效成分的预防或治疗剂； [0016] 本发明提供一种上述过敏原多肽作为抗原、半抗原、免疫原或免疫调节剂的应用。 [0017] 本发明还提供一种抗体，该抗体可结合Ara h 5蛋白和/或Ara h 8蛋白。优选的，该抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体或人源化改性抗体中的一种。 [0018] 本发明还提供一种用于预防或治疗过敏性疾病的药物，所述药物为单方或复方制剂，其包括上述过敏原多肽或上述编码过敏原多肽的核酸或基因。 [0019] 优选的，药物为过敏原疫苗。 [0021] 本发明还提供过敏原多肽、核酸或基因、表达盒、重组载体、重组蛋白、重组细胞或重组菌在用于制备诊断花生蛋白过敏的试剂盒或预防或治疗花生过敏的药物或其药物组合物的生产过程中、成品中进行含量标定、质量控制的用途。 [0022] 另一方面，本发明还提供上述花生过敏原多肽作为抗原制备的抗体的应用。 [0023] 本发明还提供上述花生过敏原多肽制备的抗花生过敏产品。优选的，抗花生过敏产品为疫苗和/或药物。优选的，抗花生过敏产品为皮肤微针。优选的，上述产品中包含脂质体形式的佐剂。 [0024] 另一方面，本发明还提供上述花生过敏原多肽作为抗花生过敏产品的应用，包括提高机体对特定过敏原的耐受程度。优选的，特定过敏原为花生或花生类制品，优选的花生类制品为食品。 [0025] 本发明还提供包含上述花生过敏原多肽的抗花生过敏产品在制备降低机体对过敏原的敏感性药物的应用，过敏原为花生蛋白。 [0026] 本方法制得的抗体可以发挥降低花生蛋白致敏性的功能，可以应用于低致敏花生蛋白产品的开发、基于表位进行的预防和/或治疗过敏的药品制备，且效价高，可以降低生产成本，适用于工业化生产。 [0027] 进一步地，本方法制得的抗Ara h 5和抗Ara h 8蛋白的抗体可用于抗过敏药品，所述抗过敏食品包括但不限于氯雷他定、西替利嗪、阿司咪唑。 [0028] 进一步地，本方法制得的抗Ara h 5和抗Ara h 8蛋白的抗体可用于抗过敏食品，所述抗过敏食品包括但不限于花生油、花生饮品、花生休闲食品。 [0029] 本发明通过动物免疫获得克隆抗体，采用HiTrapTMProtein G HP柱子纯化血清抗体并用ELISA和斑点免疫印迹方法测定抗体效价。结果显示，特异性洗脱处出现明显的特征峰，且效价较高，证明了本方法制备并纯化的克隆抗体具备所需的功能性和特异性。 [0030] 进一步地，本发明通过噬菌体随机肽库的生物陶选，筛选得到能与抗Arah 5和抗Ara h 8蛋白的IgE抗体和IgG抗体特异性结合的阳性单克隆噬菌体，结果显示，经过三轮筛选，阳性单克隆噬菌体能够大量富集，且ELISA检测结果可见，经过筛选的阳性单克隆噬菌体与抗Ara h 5和抗Ara h 8蛋白的IgE抗体和IgG抗体特异性结合的能力显著增强，说明该方法有效筛选出了所需的特异性抗体。Pepitope三维结构比对的结果也可见筛选得到的序列与Ara h 5或Ara h 8存在较高匹配。 [0031] 本发明最后通过空间结构中定位筛选的序列，最终确认本方法制得的抗Ara h 5和Ara h 8蛋白的序列。结果表明，WETIYSR和FHWWYLK序列为Ara h 5蛋白的构象表位，FPYMKFR、SFHWWLF和FPYMKFV为Ara h 8蛋白的构象表位。该结果能够用于表位关键氨基酸的确定以及后续免疫疗法的开展，另外，模拟表位的修饰可能有助于开发针对花生过敏的阻断抗体或表位特异性免疫疗法。 [0032] 本申请通过噬菌体展示技术将花生过敏原蛋白Ara h 5和Ara h 8进行噬菌体展示，筛选对应的噬菌体抗体并优化。通过多轮筛选，获得高效结合抗体的过敏原多肽，ELISA验证筛选序列与抗体的结合活性，Pepitope比对筛选序列与抗体的三维结构，表明筛选所得的过敏原多肽序列是Ara h 5和Arah 8蛋白易结合抗体表位，可用于制备或筛选抗过敏产品，及建立机体对特定过敏原的耐受产品和应用。 [0033] 本发明相对于现有技术具有以下优点： [0034] 1、将噬菌体展示技术应用到抗过敏物质研究上，为噬菌体展示技术的应用开拓了道路，推动了该方法的进一步发展。 [0035] 2、成功筛选出了滴度好且与IgE和IgG抗体结合能力强的序列。 [0036] 3、明确了Ara h 5蛋白上可作为过敏原的构象表位为WETIYSR和FHWWYLK，Ara h 8蛋白上可作为过敏原的构象表位为FPYMKFR、SFHWWLF、FPYMKFV和SMFARID。 [0038] 图1是血清抗体的纯化图谱及SDS‑PAGE验证。图1A为Arah5抗体，图1B为Arah8抗体，图1C为SDS‑PAGE验证。 [0039] 图2是三轮筛选后多克隆IgE抗体和IgG抗体的结合噬菌体的滴度对比。图2A为IgE抗体，图2B为IgG抗体。 [0040] 图3是筛选的目标序列与IgE抗体的结合能力。图3A为Ara h5肽段，图3B为Ara h8肽段。 [0041] 图4是筛选的目标序列与IgG抗体的结合能力。图4A为Ara h5肽段，图4B为Ara h8肽段。 [0042] 图5是筛选的多肽序列在Ara h 5蛋白结构中的定位(IgE)。 [0043] 图6是筛选的多肽序列在Ara h 8蛋白结构中的定位(IgE)。 [0044] 图7是筛选的多肽序列在Ara h 5蛋白结构中的定位(IgG)。 [0045] 图8是筛选的多肽序列在Ara h 8蛋白结构中的定位(IgG)。 具体实施方式[0046] 以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。 [0047] 实施例1克隆抗体的制备 [0048] 1、动物免疫 [0049] (1)从NCBI数据库中获取花生Ara h 5和Ara h 8蛋白的氨基酸全序列，将其密码子优化成大肠杆菌优势密码子，基因序列合成并转入大肠杆菌中表达。以纯化的重组蛋白作为重组过敏原Ara h 5以及Ara h 8蛋白作为免疫原。用溶解在PBS中的重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂预混合后对6至8周龄的BALB/c小鼠进行免疫(蛋白终浓度是100μg/mL)。50μL的免疫原多点注射于雌性BALB/c小鼠的颈背部皮下。 [0050] (2)第一次注射后，每隔一周用等量的免疫原与不完全弗氏佐剂混合进行3次加强免疫。首次免疫和加强免疫都采用皮下注射的方式，注意均匀分散注射于小鼠颈背部皮下，避免集中免疫引起皮肤溃烂。 [0051] (3)第四次免疫3天后眼眶采血进行ELISA测定。若抗体效价合格后，处死小鼠，收集血清，纯化抗体。 [0052] 注：实验经中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理审查委员会批准。 [0053] 2、抗体纯化实验 [0054] (1)采用HiTrapTMProtein G HP柱子纯化血清抗体。蛋白上柱子之前，以1mL/min的速度，用10个柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.0)清洗柱子。 [0055] (2)将收集的血清按照1：5稀释(稀释液20mM磷酸钠，pH 7.0)后进行上柱。将血清蛋白以1mL/min的速度上柱子，用5个柱体积的结合缓冲液洗涤，直至基线平稳。 [0056] (3)用5倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸‑HCl，pH 2.7)进行洗脱，直至基线平稳。洗脱的收集管中加入1M Tris‑HCl，pH 9.0中和液(按照10：1加入中和液)。 [0057] (4)将特异性洗脱液用透析袋更换缓冲液为0.01mol/L PBS，并采取SDS‑PAGE鉴定纯化的抗体(图1)。 [0058] 3、ELISA测定抗体效价 [0060] (2)封闭洗涤后，用0.1％BSA抗体稀释液按照1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000稀释IgG抗体，IgE抗体按照1：10、1：20、1：40、1：80、1： 160、1：320、1：640、1：1280来稀释，对照组正常血清稀释同样的比例，加入到96孔板中，37℃孵育2h。 [0061] (3)洗涤后，加入对应的二抗孵育1h，IgG抗体加入100μL HRP标记的兔抗鼠IgG(1：10000)，IgE抗体加入100μL HRP标记的大鼠抗小鼠IgE(1：2000)。 [0062] (4)洗涤后加入TMB显色，使用多功能酶标仪测定各孔在450nm下的吸光值。 [0063] 4、斑点免疫印迹法测定效价 [0064] (1)将2μg/mL的Ara h 5以及Ara h 8蛋白取1.5μl在NC膜上，封闭1h。 [0065] (2)将1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000稀释的IgG抗体孵育2h。 [0066] (3)将1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280稀释的IgE抗体4℃过夜孵育。 [0067] (4)洗涤后，室温孵育对应的二抗兔抗鼠IgG(1：10000)或者大鼠抗小鼠IgE(1：2000)1h。 [0068] (5)洗涤后，加入ECL化学发光剂显影曝光后分析。 [0069] 实施例2以抗体为靶点噬菌体展示技术筛选过敏原表位 [0070] 1、噬菌体宿主菌ER2738的复苏与培养 [0071] (1)用灭菌接种环从E.coli ER2738甘油冻存物中沾取少许，划线接种于LBTet+平皿上，37℃倒置培养过夜。Tet为四环素。 [0072] (2)挑取单菌落于LBTet+培养基中，37℃震荡过夜培养保菌。LBTet+平皿及菌液置于4℃保存备用，保存时间不超过3周。 [0073] 2、噬菌体肽库的生物陶选 [0074] (1)包被：用包被液(0.1M NaHCO3(pH 8.6))稀释纯化实施例1中获得的IgG和IgE多克隆抗体(100μg/mL)，包被酶标板，100μL/孔，编号A阳选，4℃过夜；另外，正常小鼠血清用包被液稀释5倍后包被酶标板，100μL/孔，编号B阴选，4℃过夜。 [0075] (2)封闭：倒掉每个板上的涂层溶液，然后将其正面朝下用力拍打在干净的纸巾上，以去除残留溶液。用封闭缓冲液完全填充每个板或孔。在4℃下孵育2小时。 [0076] (3)结合：吸出B阴选中封闭液，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween‑20)充分洗涤6次，拍尽洗涤液。B阴选的各孔中加入100μL已用TBST稀释的随机7肽库液体(1011个噬菌体，原始肽库1013个噬菌体/mL，Ph.D.‑7噬菌体展示肽库试剂盒，New England Biolabs，货号#E8100S)室温下缓慢摇动1小时。吸出A阳选中的封闭液体，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween‑20)充分洗涤6次，拍尽洗涤液。分别吸入B阴选的噬菌体溶液加入到A阳选中，室温下缓慢摇动1小时。 [0077] (4)洗脱：吸出A阳选中的噬菌体液，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween‑20)充分洗涤6次，拍尽洗涤液，每次使用干净的纸巾部分，以防止交叉污染。以除去非特异性结合的噬菌体。 [0078] (5)抽提：各孔加入100μL抽提液(0.2mol/L甘氨酸‑盐酸(pH 2.2)、1mg/mL BSA过滤除菌后使用)，室温下缓慢摇动15分钟。 [0079] (6)中和：液体收集到预先加有15μL终止液(1mol/L pH 9.1Tris‑HCl)的小管里混匀中和。 [0080] (7)测滴度：用灭菌的TBST溶液梯度稀释噬菌体，各取10μL加入到已经培养到对数期(OD600值为0.5)的新鲜ER2738菌液200μL当中，混匀，然后在室温下孵育5分钟。加入3mL预热的LB‑TOP顶层琼脂中(提前在45℃水浴锅中预热)，混匀后倾倒于含有X‑Gal/IPTG的LB固体平板。37℃温箱培养过夜，次日计数噬斑。 [0081] 滴度计算公式：pfu(plague forming unit)/mL＝噬斑数×稀释倍数×总体积(mL)。 [0082] (8)扩增：剩余的洗脱噬菌体液在第二天扩增，将过夜在LBTet+培养基中培养的ER2738菌液以1：100的比例稀释到20mL LB培养基中，并在250mL锥形瓶中加入剩余的洗脱液。在37℃、220rpm温箱震摇培养4.5小时。将培养物转移到无菌离心管中，在4℃下以12,000g离心10分钟。将上清液转移到新管中并重新旋转(丢弃沉淀)。将上层80％的上清液转移到无菌的新试管中，加入1/6体积的20％PEG/2.5M NaCl。让噬菌体在4℃下沉淀过夜。次日12,000g 4℃离心15分钟沉淀噬菌体，弃上清，短暂重新旋转试管，并用移液器去除残留的上清液。用1mL TBS悬浮沉淀。将悬浮液转移到无菌微量离心管中并在4℃下以14,000rpm离心5分钟以沉淀残留细胞。将上清液转移到新的微量离心管中，加入1/6体积20％PEG/ 2.5M NaCl进行再沉淀。在冰上孵育60分钟。在4℃下14,000rpm离心10分钟，弃去上清液，短暂重新离心，并用微量移液器去除残留的上清液。加入200μL TBS溶液重新悬浮颗粒。即得扩增后的噬菌体库。 [0083] (9)重复筛选：重复进行第2，3轮筛选，除洗涤时用的TBST浓度递增(第2轮：0.5％TBST；第3轮：1％TBST)，洗脱次数增多(第2轮：10次；第3轮：15次)外，其余步骤同第一轮筛选。洗脱液均进行噬菌体滴度测试，最后一轮筛得的噬斑保留。 [0084] 经过三轮生物陶选后(如下表1、2所示)，分别获得了能与抗Ara h 5和Ara h 8蛋白的IgE抗体和IgG抗体结合的噬菌体，如图2所示。 [0085] 表1IgE抗体为靶标进行的噬菌体展示肽库生物陶选条件及结果 [0086] [0087] [0088] 表2 IgG抗体为靶标进行的噬菌体展示肽库生物陶选条件及结果 [0089] [0090] 实施例3单克隆噬菌体扩增和测序及结合性能验证 [0091] 1、单克隆噬菌体的扩增及DNA测序 [0093] (2)将培养物转移到微量离心管中，以14,000 rpm离心30秒。将上清液转移到新管中并重新旋转。使用移液器将上清液的上部80％转移到新管中。这是扩增的噬菌体原液。 [0094] (3)将500μL含有噬菌体的上清液转移到新的微量离心管中。加入200μL 20％PEG/2.5 M NaCl，颠倒数次混合，在室温下静置20分钟。4℃下14,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。短暂重新旋转。小心吸管并丢弃任何剩余的上清液。 [0095] (4)用力敲击试管，将沉淀完全悬浮在100μL碘化物缓冲液中。加入250μL乙醇并在室温下孵育15分钟。在离心机中以14,000 rpm在4℃离心10分钟，弃去上清液。 [0096] (5)用0.5mL 70％乙醇(储存在–20℃)清洗沉淀，重新离心，弃去上清液，并在真空下短暂干燥沉淀。将沉淀悬浮在30μL无菌水中。送至苏州金唯智生物科技有限公司，测序引物为‑96gIII通用引物。 [0097] 通过噬菌体随机肽库的生物陶选，筛选得到能与抗Ara h 5和抗Ara h 8蛋白的IgE抗体和IgG抗体特异性结合的阳性单克隆噬菌体，并分别挑取20个阳性单克隆噬菌体进行DNA测序。结果分别获得16个与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体结合的多肽序列，15个与抗Ara h 8蛋白的IgE抗体结合的多肽序列，20个与抗Ara h 5蛋白和抗Ara h8蛋白的IgG抗体结合的多肽序列。 [0098] 对于抗Ara h 5蛋白的IgE结合的阳性单克隆噬菌体所展示的多肽序列来说，一共筛选出3个结合肽段。出现频数最高的为FHWWYLK，出现频率为11/16。对于抗Ara h 8蛋白的IgE结合的阳性单克隆噬菌体所展示的多肽序列来说，一共筛选出5个结合肽段。出现频数最高的为FPYMKFR和FPYMKFV，出现频率分别为6/15和5/15。 [0099] 另外，对于抗Ara h 5蛋白的IgG结合的阳性单克隆噬菌体所展示的多肽序列来说，一共筛选出5个结合肽段。出现频数最高的为FLHRDND和WETIYSR，出现频率为6/20和5/20。并且WETIYSR与IgE筛选出来的序列相同。对于抗Ara h 8蛋白的IgG结合的阳性单克隆噬菌体所展示的多肽序列来说，一共筛选出6个结合肽段。出现频数最高的为FPYMKFV和FPYMKFR，出现频率分别为7/20和6/20。与抗Ara h 8蛋白的IgE结合的阳性单克隆噬菌体所展示的多肽序列一样。 [0100] 2、ELISA验证筛选序列与抗体的结合活性 [0101] (1)将5μL扩增的噬菌体原液添加到20mL培养物中，并在37℃下剧烈振荡孵育4.5小时。将培养物转移到离心管中并在4℃下以12,000g离心10分钟。将上清液转移到新管中并重新旋转，弃沉淀。将上层80％的上清液移至新管中，加入1/6体积的20％PEG/2.5M NaCl，在4℃下沉淀过夜。在4下以12,000g离心沉淀15分钟。丢弃上清液，短暂地重新旋转，然后用移液器去除残留的上清液。将沉淀物悬浮在1mL TBS中。将悬浮液转移到微量离心管中，并在4℃下以14,000rpm的转速旋转5分钟以沉淀残留的细胞。将上清液转移到新的微量离心管中，用1/6体积的20％PEG/2.5M NaCl重新沉淀。在冰上孵育6分钟。在4℃下以14,000rpm微量离心10分钟。弃去上清液，短暂地重新离心，然后用微量移液器去除残留的上清液。将沉淀物悬浮在50μL TBS中，测定滴度。 [0102] (2)然后将100μL 100μg/mL的抗体置于0.1M NaHCO3，pH 8.6中以及包被缓冲液，在4℃下孵育过夜。弃掉多余的目标溶液，将板面朝下拍打到纸巾上。用150μL封闭缓冲液完全填充每个孔。4℃下孵育2小时。弃掉封闭缓冲液并用TBST(0.5％Tween‑20)清洗6次，每次5 将板面朝下拍打在干净的纸巾上。每孔加入100μL TBST稀释的10噬菌体。在室温下孵育2小时。用未进行生物陶选的噬菌体作为对照组。 [0103] (3)用TBST(0.5％Tween‑20)洗6次，每次将板面朝下拍打在干净的纸巾上。每孔加入100μL用封阻缓冲液稀释的HRP标记的抗‑M13抗体(1：2500)，室温振荡孵育2小时。弃掉未结合的抗体并用TBST(0.5％Tween‑20)清洗6次，每孔加入100μL的TMB，37℃下避光孵育15分钟，每孔加入50μL 1M盐酸终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值。 [0104] 结果如图3、4所示，显示筛选得到的序列与IgE抗体结合的能力显著高于对照组。序列FHWWYLK与抗Ara h 5蛋白的IgE抗体结合的序列中的结合能力最强，序列FPYMKFR，SMFARID在与抗Ara h 8蛋白的IgE抗体结合的序列中的结合能力最强，显著高于其他的结合序列。与抗Ara h 5蛋白的IgG抗体结合的序列YSFTLHA的OD值与未筛选噬菌体肽库的OD值无显著性差异，推测说明序列YSFTLHA为假阳性克隆。而序列FHWWYLK和FLHRDND的OD值显著高于与抗Ara h 5蛋白的IgG抗体结合的其他序列的OD值。与抗Ara h 8蛋白的IgG抗体结合的序列FPYMKFV和FPYMKFR也显著高于与其他序列的结合能力。 [0105] 实施例4构象表位定位与分析 [0106] 用Pepitope方法分别将用噬菌体随机肽库筛选到的与抗Ara h 5蛋白和抗Ara h 8蛋白的IgE抗体和IgG抗体结合的氨基酸序列与Ara h 5蛋白和Ara h 8蛋白的三维结构进行比对。 [0107] 结果如图5‑8所示，对于筛选潜在Ara h 5的IgE构象表位序列，序列WETIYSR和序列FHWWYLK在空间结构中的匹配程度最高，并且在空间结构中处于聚合的一簇中。对于筛选潜在Ara h 8的IgE构象表位序列，匹配程度最高的序列为FPYMKFV和FPYMKFR，而序列HTYSSTT未在蛋白空间结构中对应，并且只有一个阳性克隆，可能是假阳性序列。对于筛选潜在Ara h 5的IgG构象表位序列，序列FLHRDND、WETIYSR、YSFTLHA和FHWWYLK在空间结构中的匹配程度最高。对于筛选潜在Ara h 8的IgG构象表位序列，匹配程度最高的序列为FPYMKFV和FPYMKFR。 [0108] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈