一种海洋蛋白源解酒护肝产品的开发及应用 |
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| 申请号 | CN202410011789.4 | 申请日 | 2024-01-04 | 公开(公告)号 | CN117958442A | 公开(公告)日 | 2024-05-03 |
| 申请人 | 江南大学; 江南大学(绍兴)产业技术研究院; | 发明人 | 毛健; 任青兮; 周志磊; 姬中伟; 冯杨梦晓; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种海洋蛋白源解酒护肝产品的开发及应用，属于 生物 技术领域。产品制备包括以下步骤：(1)向海洋生物匀 浆液 中添加第一种蛋白酶进行酶解，酶解完成后灭活，得到一次酶解液；向一次酶解液中加入第二种蛋白酶进行酶解，酶解完成后灭活，得到二次酶解液。(2)将二次酶解液离心取上清液。(3)将上清液进行浓缩， 冷冻干燥 得到目标粉末。本发明以8种海洋生物为原料，采用7种蛋白酶，双酶分步酶解得到336个样品；基于胃肠道消化 稳定性 、 氨 基酸组成和分子量分布，筛选确定原料为海参，采用 碱 性蛋白酶和 风 味蛋白酶分步 水 解 得到高稳定性、高疏水性氨基酸组成和低分子量的解酒护肝产品。本发明适用于食品保健领域。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种海洋蛋白源的解酒护肝产品，其特征在于，所述产品包含海参小分子肽；所述海参小分子肽中，疏水性氨基酸占总氨基酸含量≥40％，分子量1000Da以下的占比≥45％。 |
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| 说明书全文 | 一种海洋蛋白源解酒护肝产品的开发及应用技术领域背景技术[0002] 我国是世界酒精饮料的生产和消费大国。据中国酒业协会统计，2021年我国酿酒行业规模以上企业累计完成产品销售收入8686.7亿元，加上规模以下酒企的产品销售收入，中国酒水消费市场规模至少为万亿元。酗酒是肝病和肝脏相关死亡的主要风险因素，过量饮酒会导致酒精性肝病(Alcoholic liver diseases，ALD)。ALD包括脂肪肝、肝炎、肝硬化以及肝癌等一系列肝病。过度饮酒不仅与健康有关，还与社会危害有关，特别是交通事故等。因此，开发安全有效的抗醉、解酒和保肝产品应对日常小酌、工作应酬以及长期酗酒所带来的身体和社会问题是大健康时代背景下的全民需求。 [0003] 酒精在体内的代谢分为氧化途径和非氧化途径。氧化途径是酒精代谢的主要方式，占酒精代谢的90％以上，依赖于以下三种酶系：①细胞质中乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)；②内质网中微粒体乙醇氧化系统；③过氧化物酶体中过氧化氢酶。大约80％的酒精进入人体后在ADH的催化作用下氧化为乙醛，然后在乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)作用下进一步氧化为乙酸，活化成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环氧化分解为二氧化碳和水排出体外。市面上加快酒精体内代谢的产品多数依靠添加姜黄、枳椇子、葛根等中草药，甚至内含纳洛酮、利尿剂等成分，产品质量参差不次，解酒功效不明确，可能还会增加肝脏负担。另外这些中草药的植物活性成分通常提取工艺繁琐、见效慢；动物源小分子肽类产品具有易提取、易吸收、见效快、活性高的优点，能够克服现有植物源产品的不足，但这些动物源产品在消化道中容易水解失活。因此，基于有效增强肝脏中ADH活性加速酒精代谢筛选潜在功能性动物源小分子肽，综合考虑消化道稳定性、氨基酸组成和分子量分布，并结合抗醉解酒效果和保肝护肝作用评估，是开发切实有效解酒护肝类产品的重要思路之一。 [0004] 海洋环境复杂，生物种类丰富，造就了海洋生物资源丰富，种类繁多，数量庞大的特点，海洋生物中具有非常丰富的海洋生物活性物质。此外，由于海洋低温高盐等极端的条件，海洋蛋白源的氨基酸组成和序列与陆地动植物具有明显区别，因此海洋蛋白源类产品具备着独特的生物学优势，然而，目前海洋资源的高附加值深加工发展不足，市面上缺乏动物蛋白源成分的具有较高解酒护肝活性和体内消化稳定性的解酒护肝类产品。 发明内容[0005] 本发明针对海洋生物资源源解酒护肝产品开发多样性、稳定性以及活性评价不足等问题，提供一种水溶性好、稳定性高和功效显著的海洋蛋白源解酒护肝产品制备方法，并对产品的抗醉、解酒和保肝活性进行了综合评价。具体技术方案如下： [0006] 本发明以8种具有潜在解酒护肝作用的海洋生物为原料，采用7种常见蛋白酶，通过双酶分步酶解结合高速离心和冷冻干燥等技术手段，制备高活性、高稳定性的小分子解酒护肝肽产品。 [0007] 本发明提供了一种海洋蛋白源的解酒护肝产品，所述产品包含海参小分子肽；所述海参小分子肽中，疏水性氨基酸占总氨基酸含量≥40％，分子量1000Da以下的占比≥45％。 [0008] 本发明还提供了制备所述产品的方法，包括如下步骤： [0009] (1)原料预处理：对海洋生物进行清洗取肉，沸水浴灭内源酶，按照一定比例加入蒸馏水，使用匀浆机对其进行匀浆，得到匀浆液； [0010] (2)向步骤(1)得到的匀浆液中添加第一种蛋白酶，进行酶解，酶解完成后进行灭活，得到一次酶解液；向一次酶解液中加入第二种蛋白酶，进行酶解，酶解完成后进行灭活，得到二次酶解液。二次酶解产物ADH激活率＞75％。 [0012] 在一种实施方式中，步骤(1)中，所述海洋生物为海参、牡蛎、麻虾、鱿鱼、扇贝、三角帆蚌、海蜇和沙丁鱼中的任意一种；制作匀浆液的方法为：对海洋生物进行清洗取肉，沸水浴20min灭内源酶，按照1:3(g:mL)的料液比加入蒸馏水，使用匀浆机对其进行匀浆。 [0013] 在一种实施方式中，步骤(2)中，所述第一种蛋白酶和第二种蛋白酶分别选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶中的一种，第一种蛋白酶和第二种蛋白酶不能相同。 [0014] 在一种实施方式中，步骤(2)中，所述制备方法中，蛋白酶的添加量为1000U/g，这种添加量可以充分酶解海洋生物。 [0016] 在一种实施方式中，步骤(2)中，所述制备方法中，一次酶解和二次酶解的条件均为：pH 3.0～10.0，温度37～50℃，时间为3h，选择蛋白酶进行酶解时在适合的pH和温度下水浴震荡酶解3h。碱性蛋白酶适合的pH为10.0，温度为40℃；中性蛋白酶适合的pH为7.0，温度为50℃；胃蛋白酶适合的pH为3.0，温度为37℃；胰蛋白酶适合的pH为8.5，温度为37℃；木瓜蛋白酶适合的pH为7.0，温度为50℃；风味蛋白酶适合的pH为7.5，温度为50℃；菠萝蛋白酶适合的pH为7.0，温度为50℃。 [0017] 在一种实施方式中，步骤(2)中，所述制备方法中，灭活的方法为沸水浴10～20min。 [0018] 在一种实施方式中，步骤(2)中，所述制备方法中，离心条件为4500～5000rpm离心15～20min。 [0019] 在一种实施方式中，所得产品状态为粉末状，颜色为褐色、黄色或白色(根据原料不同而呈现不同颜色)；分子量在3000Da以下；ADH激活率＞75％，经胃肠道消化后ADH激活率稳定；具有一定的抗醉、解酒效果，显著延长小鼠醉酒潜伏期并缩短睡眠期；具有一定的缓解酒精性肝损伤作用，能够显著降低血清肝功能酶系谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)的活力，激活酒精代谢酶系ADH和ALDH的活力，显著减少肝脏内丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的堆积，增加超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的含量，显著减少甘油三酯(Triglyceride，TG)和总胆固醇(Serum total cholesterol，TC)的含量，减少脂肪堆积，并在肝脏组织病理形态上有所体现。 [0020] 本发明还提供了所述方法在制备解酒护肝产品中的应用。 [0021] 有益效果： [0022] 1、本发明采用双酶分步酶解的方法，对8种海洋生物进行充分酶解，从336种酶解样品中，筛选出具有解酒护肝功效的海洋源产品。所述产品为海参小分子肽，ADH激活率达118.86％，是阳性对照海王金樽的1.23倍。 [0023] 2、本发明制备的海参小分子肽SJPs经过冷冻干燥得到粉末，成品更细腻，易溶于水。所述海参小分子肽中，疏水性氨基酸占总氨基酸含量≥40％，分子量1000Da以下的占比≥45％，具有胃肠消化稳定性。 [0024] 3、本发明制备的海参小分子肽解酒护肝产品在动物实验中起到有效的解酒、护肝效果。 [0025] (1)在急性小鼠酒精中毒模型中，相较于酒精模型组，高剂量SJPs将潜伏期从9.14min延长至15.11min，延长1.65倍；将睡眠期从162.96min显著缩短至65.24min，缩短 2.50倍，具有明显的抗醉解酒效果。 [0026] (2)在小鼠早期ALD模型中，本发明制备的海参小分子肽解酒护肝产品起到显著的护肝功效，具体如下： [0027] SJPs高剂量组的ALT和AST较酒精模型组分别减少了45.47％和45.73％，相较于阳性对照组分别减少了8.32％和16.95％。 [0028] SJPs高剂量组小鼠肝脏TG和TC含量较酒精模型组显著降低了37.74％和29.41％(P<0.05)，较阳性对照组分别减少了23.26％和14.29％。 [0029] SJPs高剂量组显著提高了小鼠肝脏ADH活力27.62％和ALDH活力80.53％(P<0.05)，较阳性对照组分别提高了4.28％和21.07％。 [0030] SJPs高剂量组较酒精模型组其SOD活力显著提高了13.52％、GSH含量显著增加了60.31％、MDA含量显著降低了36.52％(P<0.05)。较阳性对照组其SOD活力提高了4.49％、GSH含量增加了7.86％、MDA含量降低了4.58％。 [0032] 图1为本发明实施例2‑6体外模拟胃肠道消化的ADH激活率稳定性分析。 [0033] 图2为本发明实施例2的ADH体外动力学分析。 [0034] 图3为NIAAA法建立小鼠早期ALD模型的造模流程。 [0035] 图4为本发明实施例2对小鼠肝脏组织病理学的影响。 具体实施方式[0036] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 [0037] 下述实施例所用的商业蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为：碱性蛋白酶(S10154)、中性蛋白酶(S10013)、胃蛋白酶(S10028)、胰蛋白酶(S10032)、木瓜蛋白酶4 5 (S10011)、风味蛋白酶(S10153)、菠萝蛋白酶(S10009)，活性范围为1.5×10～3×10。 [0038] 实施例1高ADH激活率的海洋生物酶解样品的筛选 [0039] 本发明所选海洋生物多样，配合多种蛋白酶，样本充足，8种海洋生物(海参、牡蛎、麻虾、鱿鱼、扇贝、三角帆蚌、海蜇和沙丁鱼)先由7种酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶)其中的一种进行酶解，得到56种单酶酶解样品，56种样品再由其余6种酶其中的一种进行酶解，得到了336种分步双酶酶解样品。例如海参先由碱性蛋白酶酶解得到的样品再由中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶分别酶解，得到6种样品，以此类推，可以得到336种样品。 [0040] 以ADH激活率的高低为标准，对上述酶解样品进行筛选。参照公开报道的检测方法检测336种样品的ADH激活率，具体方法为：用ADH催化氧化型辅酶Ⅰ反应的原理，ADH催化乙+醇脱氢产生乙醛，而NAD被还原为NADH。NADH在340nm下有最大吸收峰，而其他成分无显色。 因此，通过检测NADH的生成量可以间接表征ADH活力。按照ADH试剂盒说明书的操作步骤进行，使用去离子水将样品和阳性对照的蛋白浓度调节到1mg/mL。将50μL样品与150μL的工作液(试剂一：试剂二：试剂三＝0.65：0.05：0.70)混合，在37℃平衡5min后，通过添加50μL的ADH(1U/mL)引发反应，立即计时，使用多功能酶标仪于波长340nm处测定吸光度，温度设置为37℃，每10秒记录340nm处的吸光度值(OD340nm)，持续10分钟。使用蒸馏水作阴性对照，对反应曲线进行拟合，计算拟合曲线在0min处的一阶导数，表示NADH的增加速率，即初始反应速率。所有测定均为三份。ADH活化率计算公式如下: [0041] [0042] 式中：VS，样品的初始反应速率；V0，阴性对照的初始反应速率。 [0043] 初筛样品：将336种样品的ADH激活率按照从高到低排列，选出其中最高的36种。精筛样品：将36种样品按照相同方法进行重新制样，检测其ADH激活率，结果如表1所示。其中21种样品的ADH激活率高于海王金樽，选出其中ADH激活率最高的5种(制备方法如实施例2‑ 6所示)，进行后续筛选工作。表1表明，1‑5号样品(对应本发明实施例2‑6)都有较好的提高体外ADH激活率的效果，显著大于阳性对照组海王金樽(96.42％，P<0.05)，分别为 122.40％、118.86％、117.79％、116.88％和117.86％，比海王金樽分别高出26.94％、 23.27％、22.16％、21.22％和22.24％。说明这5个例子具有促进醒酒和促进酒精代谢的潜力。 [0044] 表136种样品的ADH激活率(样品组按从大到小排序) [0045] [0046] [0047] 注：表中碱代表碱性蛋白酶；风代表风味蛋白酶；胃代表胃蛋白酶；胰代表胰蛋白酶；木代表木瓜蛋白酶；中代表中性蛋白酶；菠代表菠萝蛋白酶。以/号分隔出两种酶的先后酶解顺序。同一列肩标不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。 [0048] 实施例2海参碱/风样品的制备 [0049] 表1中2号样品海参碱/风的制备方法如下： [0050] (1)原料预处理：将新鲜海参去内脏，去嘴，清洗，切块，沸水浴20min灭内源酶，加入3倍体积蒸馏水进行匀浆。 [0051] (2)酶解：将海参匀浆液预热至40℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.0，加入碱性蛋白酶，添加量为1000U/g海参(以终浓度计)，在40℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶，再调整酶解液温度至50℃，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.5，加入风味蛋白酶，添加量为1000U/g海参(以终浓度计)，在50℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶。 [0052] (3)将酶解液在4500rpm下离心15min，取上清液，将上清液进行旋转蒸发浓缩约3倍体积，所得的浓缩液在‑80℃冰箱冷冻8h以上，再将其转移至冷冻干燥机，干燥48h左右，得到海参小分子肽粉末。 [0053] 实施例3麻虾风/碱样品的制备 [0054] 表1中1号样品麻虾风/碱的制备方法如下： [0055] (1)原料预处理：将解冻麻虾去壳，去内脏，只取肉，清洗，切块，沸水浴20min灭内源酶，加入3倍体积蒸馏水进行匀浆。 [0056] (2)酶解：将麻虾匀浆液预热至50℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5，加入风味蛋白酶，添加量为1000U/g麻虾(以终浓度计)，在50℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶，再调整酶解液温度至40℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.0，加入碱性蛋白酶，添加量为1000U/g麻虾(以终浓度计)，在40℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶。 [0057] (3)将酶解液在4500rpm下离心15min，取上清液，将上清液进行旋转蒸发浓缩约3倍体积，所得的浓缩液在‑80℃冰箱冷冻8h以上，再将其转移至冷冻干燥机，干燥48h左右，得到麻虾小分子肽粉末。 [0058] 实施例4鱿鱼碱/中样品的制备 [0059] 表1中3号样品鱿鱼碱/中的制备方法如下： [0060] (1)原料预处理：将解冻鱿鱼去皮，只取肉，清洗，切块，沸水浴20min灭内源酶，加入3倍体积蒸馏水进行匀浆。 [0061] (2)酶解：将鱿鱼匀浆液预热至40℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至10.0，加入碱性蛋白酶，添加量为1000U/g鱿鱼(以终浓度计)，在40℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶，再将调整酶解液温度至50℃，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至7.0，加入中性蛋白酶，添加量为1000U/g鱿鱼(以终浓度计)，在50℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶。 [0062] (3)将酶解液在4500rpm下离心15min，取上清液，将上清液进行旋转蒸发浓缩约3倍体积，所得的浓缩液在‑80℃冰箱冷冻8h以上，再将其转移至冷冻干燥机，干燥48h左右，得到鱿鱼小分子肽粉末。 [0063] 实施例5鱿鱼中/胰样品的制备 [0064] 表1中4号样品鱿鱼中/胰的制备方法如下： [0065] (1)原料预处理：将解冻鱿鱼去皮，只取肉，清洗，切块，沸水浴20min灭内源酶，加入3倍体积蒸馏水进行匀浆。 [0066] (2)酶解：将鱿鱼匀浆液预热至50℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入中性蛋白酶，添加量为1000U/g鱿鱼(以终浓度计)，在50℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶，再将调整酶解液温度至37℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，加入胰蛋白酶，添加量为1000U/g鱿鱼(以终浓度计)，在37℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶。 [0067] (3)将酶解液在4500rpm下离心15min，取上清液，将上清液进行旋转蒸发浓缩约3倍体积，所得的浓缩液在‑80℃冰箱冷冻8h以上，再将其转移至冷冻干燥机，干燥48h左右，得到鱿鱼小分子肽粉末。 [0068] 实施例6海参胰/风样品的制备 [0069] 表1中5号样品海参胰/风的制备方法如下： [0070] (1)原料预处理：将新鲜海参去内脏，去嘴，清洗，切块，沸水浴20min灭内源酶，加入3倍体积蒸馏水进行匀浆。 [0071] (2)酶解：将海参匀浆液预热至37℃，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，加入胰蛋白酶，添加量为1000U/g海参(以终浓度计)，在37℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶，再将调整酶解液温度至50℃，调节pH至7.5，加入风味蛋白酶，添加量为1000U/g海参(以终浓度计)，在50℃下水浴震荡酶解3h，酶解结束后沸水浴10min进行灭酶。 [0072] (3)将酶解液在4500rpm下离心15min，取上清液，将上清液进行旋转蒸发浓缩约3倍体积，所得的浓缩液在‑80℃冰箱冷冻8h以上，再将其转移至冷冻干燥机，干燥48h左右，得到海参小分子肽粉末。 [0073] 实施例7胃肠道消化稳定性、氨基酸组成和分子量比较分析 [0074] 对实施例2‑6制备获得的小分子肽产品的胃肠道消化稳定性、氨基酸组成和分子量进行比较分析。 [0075] 1、胃肠道消化稳定性 [0076] 配制模拟消化液(胃液和肠液)，其成分如表2所示。首先模拟胃液消化，将1mg/mL的样品与相同体积的模拟消化胃液混合，按照2000U/mL的终浓度加入胃蛋白酶，调节pH至3.0，在37℃下水浴震荡消化2h，消化完成后沸水浴10min灭酶；再进行模拟肠液消化，将溶液与相同体积的模拟消化肠液混合，按照100U/mL的终浓度加入胰蛋白酶，调节pH至7.0，在 37℃下水浴震荡消化2h，消化完成后沸水浴10min灭酶，冷却至室温后在4500rpm下离心 15min，取上清液经蒸发浓缩、冷冻干燥后保存在‑20℃冰箱待用。 [0077] 表2模拟消化液的成分 [0078] [0079] 对经胃肠道消化后的实施例2‑6样品的ADH激活率进行检测。实验结果如图1所示。由图1可知，经过模拟体外胃肠道消化之后，综合来看，实施例2具有相对稳定的效果，ADH激活率几乎没有变化，说明其经过胃肠道消化后依旧能保持较高的解酒效果，而实施例3‑6的样品经胃肠道消化后，ADH激活率都有不同程度的降低，无法保持稳定的解酒效果。 [0080] 2、氨基酸组成 [0081] 参照公开报道的检测方法，使用高效液相色谱法对实施例2‑6进行氨基酸组成分析，检测结果如表3所示。 [0082] 表3不同实施例的氨基酸组成(g/100g) [0083] [0084] 注：*必需氨基酸；#疏水性氨基酸。 [0085] 有研究报道，含有较多疏水性氨基酸可能帮助产生稳定的NAD+，有利于促进乙醛的分解，对乙醇在肝脏中的代谢有着重要促进作用。上述实验结果表明经双酶分步酶解后的5个实例皆含有较多的疏水性氨基酸，其中实施例6和实施例2的疏水性氨基酸含量超过40％。 [0086] 3、分子量分布 [0087] 参照公开报道的检测方法，使用高效液相色谱法对实施例2‑6进行分子量分布分析，检测结果如表4所示。 [0088] 表4不同实施例的分子量分布 [0089] [0090] 由表4可知，采用双酶分步酶解后，水解产物的分子量分布以＜3000Da为主。其中，实施例2(海参作为原料)小分子活性肽(分子量＜1000Da)占比超过45％，更易吸收、稳定性更高、活性更强。 [0091] 通过对实施例2‑6在胃肠道消化稳定性、氨基酸组成、分子量分布三个方面的综合考虑，实施例2疏水性氨基酸含量较多、小分子肽占比较多并且在经胃肠道消化后仍然保持高ADH激活率。因此，将实施例2确定为后续解酒护肝产品开发的最佳备选方案。 [0092] 实施例8ADH体外动力学分析 [0093] 参照实施例1检测ADH激活率的方法，分析在不同浓度实施例2作用下ADH激活率的变化。依据实施例2的方法进行解酒护肝海参碱/风产品(蛋白质含量16.84％)的制备，并配制成0、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5、2和海参碱/风的水2.5mg/mL溶液干预ADH催化酒精氧化过程，其反应动力学如图2(A)所示。可以看到，随着实施例2浓度的增加，340nm处OD值增加速率更快，在所监测的10min内，其反应曲线可由如下方程进行拟合： [0094] [0095] 不同浓度实施例2干预下反应曲线拟合方程的参数如图2(A)中表格所示，根据拟合方程求得在0min处的一阶导数值即为初始反应速率，可表征ADH的相对酶活力。无实施例2干预时的初始反应速率记录为V0，而实施例2干预时的初始反应速率记录为Vs，参照实施例1的方法计算得到ADH激活率。对不同浓度实施例2干预下相应的ADH激活率进行曲线拟合，结果如图2(B)所示，ADH激活率随实施例2浓度升高而上升，呈现良好的量效关系，表明实施例2确实有效干预ADH催化酒精氧化的过程。实施例2的量效关系可由如下方程拟合： [0096] [0097] 基于上述ADH催化酒精氧化反应曲线拟合及量效关系方程建立，可以看出：无实施‑4例2(海参碱/风的水溶液)干预时的初始反应速率为6.16×10 ；以2.5mg/mL实施例2干预时‑4 的初始反应速率达到13.04×10 ，ADH激活率提高了111.67％，可以有效加快酒精代谢速率。 [0098] 实施例9解酒功效验证 [0099] 以实施例2获得的海参小分子肽(Stichopusjaponicuspeptides，SJPs)作为实验原料，C57BL/6J雄性小鼠60只，适应性喂养一周后，随机分为6组，即空白对照组、酒精模型组、阳性对照组、SJPs低剂量组、SJPs中剂量组和SJPs高剂量组，每组10只。实验前禁食不禁水12h，阳性对照组灌胃400mg/Kg BW海王金樽(根据海王金樽推荐剂量换算)，SJPs低、中和高剂量组分别灌胃200、400和600mg/Kg BW SJPs，空白对照组和酒精模型组分别给予等体积的生理盐水。30min后，除空白组外各组小鼠依次灌胃9.8mL/Kg BW 56°红星二锅头，空白对照组灌胃等体积生理盐水。 [0100] 小鼠灌酒后立刻开始计时，以“翻正反射试验(LORR)”观察小鼠的酒后状况，当小鼠行走摇摆或迟缓时，将其背向下呈仰位，若小鼠背向下的姿势保持30s以上，则认为翻正反射消失，记录翻正反射消失时间(醉酒潜伏期)。当小鼠能够在60s内连续2次翻转身体，即视为翻正反射恢复，记录小鼠翻正反射恢复时间(醒酒时间)和小鼠的醉酒只数。结果如表5所示。 [0101] 表5SJPs摄入对小鼠LORR的影响 [0102] [0103] 注：同一列肩标不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。 [0104] 由表5可知，急性酒精摄入导致模型组小鼠80％发生LORR，平均潜伏时间9.14min，持续时间162.96min。这表明酒精摄入成功引起小鼠急性酒精中毒。灌胃白酒前30min摄入SJPs和海王金樽不同程度降低LORR发生率、延长LORR潜伏时间并缩短持续时间。其中高剂量SJPs将潜伏期从9.14min延长至15.11min，将睡眠期从162.96min显著缩短至65.24min，缩短了一半以上的时间(P<0.05)。这些结果表明摄入SJPs可达到增加睡眠潜伏期，减少睡眠时间，加速醒酒的效果。 [0105] 实施例10护肝功效验证 [0106] 以实施例2获得的海参小分子肽(Stichopusjaponicuspeptides，SJPs)作为实验原料，采用慢性喂养+急性灌胃模型(NIAAA)建立小鼠早期ALD模型。C57BL/6J雄性小鼠54只，适应性喂养一周后，随机分为6组，即空白对照组、酒精模型组、阳性对照组、SJPs低剂量组、SJPs中剂量组和SJPs高剂量组，每组9只，每笼3只。前5天为小鼠适应期，喂食普通的固体饲料与水，第6‑12天进行酒精液体饮食适应期，初始给予每只鼠25mL液体饲料(包括对照饲料和酒精饲料)供自由摄食，之后每天根据前一天的摄食量进行修改，确保组别之间摄入相等热量的饲料。液体饲料的乙醇浓度从0％过渡到5％(v/v)，第13‑21天给予乙醇含量为5％(v/v)的酒精饲料(除空白组外)建立小鼠早期ALD模型。建模流程如图3所示。酒精液体饲料是商品化饲料，购于南通特洛菲饲料科技有限公司，空白对照饲料货号为TP4030C，酒精饲料货号为TP4030D。其中，TP4030C热量分布为：脂肪35％,蛋白质18％,碳水化合物 47％。TP4030D热量分布为：酒精28％(酒精含量：5％，V/V，mL/100mL)、脂肪35％、蛋白质 18％、碳水化合物19％。根据商品说明书的指导配制成不同酒精含量的酒精饲料。 [0107] 在此期间每天记录摄食量，通过计算平均实验组小鼠的最少摄入卡路里量来调整给予各组小鼠的液体饲料，以使各组小鼠摄取等量的热量。每天在固定时间(下午4点到5点)按照400mg/Kg BW海王金樽200、400和600mg/Kg BW SJPs依次灌胃给各组小鼠，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水，固定时间(下午5点到6点)更换液体饲料。 [0108] 在第22天早上(7点到9点)按照400mg/Kg BW海王金樽、200、400和600mg/Kg BW SJPs依次灌胃给各组小鼠。30分钟后，除空白组外各组小鼠依次灌胃12mL/Kg BW 45％乙醇溶液，空白对照组灌胃等热量的麦芽糖糊精，禁食9h后对小鼠眼球采血，随后异氟烷麻醉，处死小鼠。取肝脏，液氮冻存，用于后续测定生化指标。 [0109] 肝脏指数是指小鼠肝脏重量与体重之比，结果如表6所示。 [0110] 表6SJPs摄入对小鼠肝脏重量和肝脏指数的影响 [0111] [0112] 注：同一列肩标不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。 [0113] 肝脏重量和肝脏指数的变化可从宏观上反映脂肪酸在小鼠肝脏的堆积情况，可推测小鼠肝损伤程度。如表6所示，与对照组相比，模型组小鼠平均肝脏重量与肝脏指数显著增加，而摄入SJPs和海王金樽均可不同程度抑制肝脏重量和肝脏指数增加，且海王金樽和不同剂量SJPs组之间并无显著性差异。 [0114] 小鼠血清相关生化指标的测定：全血静置在4℃下静置8h后，2000rpm、4℃离心20min取上清液，按试剂盒的说明书测定小鼠血清的肝功能酶学相关指标ALT和AST)。 [0115] 小鼠肝脏相关生化指标的测定：称取100mg左右肝脏组织，按照1:9(mg:μL)的比例加入9倍体积的预冷生理盐水，在冰浴条件下制成10％的肝组织匀浆，3000rpm、4℃条件下离心10min，取上清，按照试剂盒的说明书测定小鼠肝脏ADH、ALDH、MDA、SOD、GSH、TG和TC的蛋白浓度，结果统一以蛋白浓度表示。 [0117] 实验平行重复3次，结果以X±SD表示，采用SPSS25.0软件进行数据统计分析，使用GraphPad Prism 5.0软件和Origin 2017软件进行绘图，多组样本比较采用单因素方差分析(One‑wayANOVA)，然后进一步用Fisher最小显著性差值法(LSD)进行多重比较和检验，P<0.05则具有显著性差异，采用字母标记法标记显著性，用小写字母按照平均值从大到小标记，若有显著差异(P<0.05)则标记不同的字母；若组间没有显著性差异则不标记。 [0118] 表7SJPs摄入对小鼠各项生化指标的影响 [0119] [0120] 注：同一列肩标不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。 [0121] ALT和AST是临床上检验肝损伤的重要指标。如表7所示，与空白对照组相比，酒精模型组中小鼠血清ALT和AST活力均显著升高(P<0.05)，说明小鼠肝细胞受损严重，肝细胞膜通透性增加，这两种酶活力的升高提示造模成功。与酒精模型组相比，阳性对照组和SJPs中、高剂量组小鼠血清ALT和AST活力均显著降低(P<0.05)。其中，SJPs高剂量组ALT和AST较酒精模型组分别减少了45.47％和45.73％，相较于阳性对照组分别减少了8.32％和16.95％，与空白对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。结果表明，SJPs中、高剂量组的干预均对小鼠肝脏细胞膜的通透性和完整性均具有较好的修复作用，尤以SJPs高剂量组的效果最为显著。 [0122] 为了进一步了解脂肪酸在早期ALD小鼠肝脏的堆积情况，测定了肝脏组织TG和TC含量。如表7所示，与对照组相比，酒精模型组小鼠肝脏TG含量从0.21显著提高0.53mmol/mg prot(P<0.05)，TC含量也从0.10mmol/mg prot显著提高至0.17mmol/mg prot(P<0.05)，显示脂肪酸在小鼠肝脏堆积，早期ALD造模成功。而SJPs高剂量组小鼠肝脏TG和TC含量较酒精模型组显著降低了37.74％和29.41％(P<0.05)，较阳性对照组分别减少了23.26％和14.29％。 [0123] 酒精在体内主要由肝脏的ADH途径代谢，该代谢途径所需ADH和ALDH活力对酒精代谢以及血液酒精清除速率至关重要。测定早期ALD小鼠肝脏ADH和ALDH活力，结果如表7所示，与空白对照组相比，酒精模型组小鼠肝脏ADH和ALDH活力略有上升，这是机体摄入酒精后被动机制。与酒精模型组相比，SJPs剂量组和阳性对照组均可不同程度增强ADH和ALDH活力。其中，SJPs高剂量组显著提高了小鼠肝脏ADH活力27.62％和ALDH活力80.53％(P<0.05)，较阳性对照组分别提高了4.28％和21.07％。结果表明，SJPs高剂量的干预均能够提高小鼠肝脏ADH和ALDH活力，加速乙醇代谢分解，催化乙醛进一步氧化成乙酸，减缓乙醇及其代谢产物直接毒害小鼠肝脏，从而保护酒精诱导所致小鼠肝损伤情况。 [0124] 由乙醇介导的氧化应激损伤，造成机体内SOD和GSH等抗氧化物质的耗竭，导致肝细胞线粒体中的脂肪酸‑β氧化发生障碍，肝脏内大量的游离脂肪酸沉积，导致肝脏TG含量升高；肝细胞膜进一步发生脂质过氧化反应，此过程中会伴随产生大量的MDA。由表7可知，与空白对照组相比，酒精模型组中小鼠肝脏GSH活力减少20.71％，SOD活力显著减少了19.69％(P<0.05)，MDA含量显著增加71.64％(P<0.05)，此时小鼠肝脏已受损严重，其抗氧化能力下降，脂质过氧化产物增加，提示造模成功。与酒精模型组相比，阳性对照组和SJPs各干预组小鼠肝脏受损的情况均有不同程度的改善效果。其中，SJPs高剂量组较酒精模型组其SOD活力显著提高了13.52％、GSH含量显著增加了60.31％、MDA含量显著降低了 36.52％(P<0.05)。较阳性对照组其SOD活力提高了4.49％、GSH含量增加了7.86％、MDA含量降低了4.58％。结果表明，SJPs的干预均可在一定程度上通过提高肝脏SOD活力、促进肝内GSH合成，增强小鼠肝脏的抗氧化能力，同时调节肝脏的脂质代谢，减轻肝脏内由急性酒精介导的氧化应激反应，减少脂质过氧化物MDA的产生和脂肪大量的堆积。 [0125] 早期酒精肝的表现为酒精性脂肪肝，也就是脂肪在肝脏内堆积，具体表现为脂肪变性，即肝细胞体积增大，胞浆内可见大小不一、境界清晰的圆形空泡。即肝细胞内积蓄的甘油三酯，大空泡将细胞核挤向一侧。对小鼠的肝脏切片进行观察，结果如图4所示。可见空白对照组肝脏被膜清晰，无明显增生，肝小叶中央为中央静脉，周围是大致呈放射状排列的肝细胞和肝血窦，肝小叶分界不明显；肝小叶内偶见肝细胞脂肪变性(箭头)，可能是由于液体饲料中脂质含量较多。酒精模型组肝脏实质内可见大量肝细胞脂肪变性(箭头)，胞质中出现大小不一的圆形空泡，说明出现了早期酒精肝的症状，造模成功。而同时摄入不同剂量的SJPs和海王金樽，小鼠酒精肝的症状可以得到不同程度的缓解。其中SJPs高剂量组肉眼观察到的圆形空泡明显减少，说明摄入高剂量SJPs可以明显减少脂质在肝脏中的堆积。 |
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