用于控制真菌腐败的细菌组合物和其用途
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202080073495.4 | 申请日 | 2020-10-21 |
| 公开(公告)号 | CN114585258A | 公开(公告)日 | 2022-06-03 |
| 申请人 | 科·汉森有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | A·戈尔; C·L·M·尼尔森; 赫勒·斯科沃·古尔达格; S·K·迪默; K·L·V·安德森; | 第一发明人 | A·戈尔 |
| 权利人 | 科·汉森有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 科·汉森有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份： | 城市 | 当前专利权人所在城市： |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：丹麦赫斯霍尔姆 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | A23C19/032 | 所有IPC国际分类 | A23C19/032 ; A23C3/00 ; A23C3/08 ; A23C9/12 ; A23C9/123 ; A23C9/127 ; A23C9/13 ; A23C9/152 ; A23C19/097 ; A23C19/10 ; A23L3/3571 ; A23L3/358 |
| 专利引用数量 | 4 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 15 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京世峰知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 王思琪; 王建秀; |
| 摘要 | 本 发明 涉及一种包含含锰转运蛋白的乳酸菌的直投式起子培养物组合物，其用于 发酵 食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的 真菌 生长，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰。 | ||
| 权利要求 | 1.一种包含含锰转运蛋白的乳酸菌的直投式起子培养物组合物，其用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长， |
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| 说明书全文 | 用于控制真菌腐败的细菌组合物和其用途技术领域[0001] 本发明涉及高度浓缩的起子培养物组合物和其制剂，其用于控制真菌腐败而不借助于防腐剂，诸如化学防腐剂。因此，本发明有助于满足对较少加工且不含防腐剂的食品的需求，而同时有助于提供一种有效的解决方案，以管理酵母和霉菌生长。本发明还涉及包含所述组合物的食物产品。 背景技术[0002] 食品工业中的一个主要问题是有害微生物引起的腐败。根据粮食和农业组织(Food and Agriculture Organization,FAO)，预定供人消耗的每4卡路里中就有1卡路里最终不被人消耗。在超过8亿人遭受饥饿的食物短缺时代，食物浪费话题已成为全球政策制定者和食品制造商的优先考虑问题。除了对社会造成负面的社会和经济影响之外，浪费的食物还造成一系列相关的环境影响，包括不必要的温室气体排放以及对诸如水和土地的稀缺资源的低效利用。 [0003] 酵母和霉菌在引起食物腐败方面高度有效，并且是大多数食品制造商所面临的问题。由于酵母和霉菌引起的腐败在食物产品表面上清晰可见为霉菌块或变色，允许其在食用前被处理掉。酵母倾向于以浮游形式在食物和饮料基质内生长，并且它们倾向于使糖发酵，在厌氧条件下生长良好。相比之下，霉菌倾向于以由细胞组成的可见菌丝体的形状在产品表面上生长。 [0004] 抗真菌微生物剂用于食物生物保存的用途是已知的，例如描述于Salas等“用于食物生物保存的抗真菌微生物剂——综述(Antifungal microbial agents for food biopreservation—a review).”Microorganisms 5.3(2017):37中。 [0005] 特别是在乳品行业，欧洲每年有2900万吨乳制品被浪费。保持乳制品新鲜的主要挑战之一是管理酵母和霉菌的污染，酵母和霉菌天然存在于任何地方，尤其是在从生产到消费者餐桌的冷链出现中断的情况下。 [0006] 出于经济和环境原因，一直需要有效控制酵母和霉菌污染的新颖或改善的方式。 发明内容[0007] 锰已被认为对人体健康至关重要，因此是一种必需的痕量元素。锰对人和动物两者的正常功能都是必不可少的，因为它是许多细胞酶(例如锰超氧化物歧化酶、丙酮酸羧化酶)的功能所必需的，并且它可用于活化许多其他酶，如激酶、脱羧酶、转移酶和水解酶。 [0008] 锰可天然存在于许多食物来源中，包括叶菜、坚果、谷物和动物产品。常见食品中锰浓度的典型范围是例如谷物产品中0.4‑40ppm，肉类、家禽、鱼和蛋中0.1‑4ppm，蔬菜产品中0.4‑7ppm，均质化乳中0.03ppm。 [0009] 除了作为膳食补充剂之外，有时还在发酵产品中添加锰作为活性成分以促进双歧杆菌在乳中的生长(参见例如WO2017/021754,Compagnie Gervais Danone,France)。 [0010] 最近发现，锰是食物产品中真菌生长的重要生长限制因素。因此，有可能在食物产品中施加锰清除剂，诸如锰清除细菌，以与真菌竞争游离锰。这导致这种营养素的耗尽，从而抑制或延迟真菌生长。此类细菌可用作用于发酵食物产品的起子培养物。本发明涉及此类用于工业应用的抗真菌细菌的制备。 [0011] 本发明部分地基于令人惊讶的发现，即当在按比例放大工艺期间在制备起子培养物中使用高水平的锰(这是本领域中的常见实践)时，当稍后应用于食物产品中时，细菌在抑制或延迟真菌生长方面变得不太有效。因此，按比例放大工艺期间的细菌不应暴露于高水平的锰，因为此类水平会对其抗真菌活性产生负面影响。换句话说，本发明人已发现细菌组合物中所含的锰水平与其抗真菌活性密切相关。 [0013] 商业起子培养物通常可以冷冻或冷冻干燥(FD)培养物的形式分配。高度浓缩的培养物在商业上非常引人关注，因为此类培养物可直接接种到乳中而无需中间转移。高度浓缩的培养物可被称为直投式(direct vat set,DVS)‑培养物。 [0014] 商业上高度浓缩的DVS起子培养物可作为呈粉末形式的冷冻干燥或冻干的培养物。在这种形式中，起子可在没有冷藏的情况下运输。 [0015] 乳酸菌通常以用于批量起子繁殖的冷冻或冷冻干燥培养物的形式供应给食品工业，诸如乳品业，或以预定用于直接接种到发酵容器或桶中的所谓的“直投式”(DVS)培养物的形式供应用于生产乳制品，诸如发酵乳产品或奶酪，而无需制备批量起子。 [0016] 直投式起子培养物是直接添加到桶中的高度浓缩的生物质(通常为1010到1012个cfu/g)。优点包括减少了噬菌体攻击的风险、使用的灵活性、可获得混合菌株和物种培养物以及不需要繁殖设施。冷冻干燥培养物通常储存‑18℃，但冷冻培养物在运输期间需要用干冰冷却并储存在‑45℃。 [0017] 用于起子培养物的典型生产工艺包括以下步骤：(a)处置接种材料，(b)制备培养基，(c)在pH控制下在发酵器中繁殖培养物，(d)浓缩，(e)冷冻，(f)干燥以及(g)包装和储存。生产起子培养物的步骤对于获得培养物产品的期望特性、纯度和质量是重要的。在无菌条件下制备用作直接接种材料的培养物，并将转移保持在最低限度。 [0018] 用于生产培养物的生长培养基可含有所选乳组分并补充各种营养素，诸如酵母提取物、维生素和矿物质。将培养物生长培养基加热到超高温，并且对于嗜中温培养物或嗜热培养物，分别冷却到30或40℃。在接种培养物后，通过添加碱(诸如NaOH或NH4OH)将pH值维持在6.0‑6.3(对于嗜中温培养物)和5.5‑6.0(对于嗜热培养物)来优化生长。 [0019] 对处理参数(诸如发酵器中的温度、搅动速率和顶空气体)进行调整，以产生比批量起子浓缩得多的细胞悬浮液。在发酵(通常是容量为10,000到40,000L的容器中的分批发酵)后，将内容物冷却并收获生物质，使细胞进一步浓缩10‑20倍。通常采用分离装置来分离水性液体以收集细菌。 [0020] 由于成本效益和效率，因此不断需要更高的生物质产率。对于DVS用途，期望使细菌培养物尽可能浓缩，同时具有尽可能高的细胞回收率。 [0021] 为了包含足够的细菌，商业相关的高度浓缩培养物通常具有高水平的锰。本领域已知锰促进细菌、特别是乳酸菌的生长。对于生物质产率是首要关注的起子培养物制造商来说，这是重要的经济考虑因素(Raccach，M“. 锰和乳酸菌(Manganese and lactic acid bacteria).”Journal of food protection 48.10(1985):895‑898)。 [0022] EP2119766公开了锰可增加乳酸菌的生长产率。 [0023] EP0130228公开了锰盐可用于乳酸菌的快速发酵。已常规地以例如食品级锰盐的形式，以适当的量添加锰以促进细胞生长。 [0025] 本发明大体上涉及包含乳酸菌的组合物，所述组合物用于添加到诸如食物产品的产品中。所述细菌组合物可用作用于食物产品的起子培养物组合物。其可被添加到食物产品中，或者被添加以发酵食物产品并同时管理真菌生长。所述组合物的特征在于其含有低水平或降低水平的锰。如本上下文中使用的术语“起子培养物”是指一种或多种能够酸化食物产品的细菌的培养物。 [0026] 在第一方面，本申请提供包含乳酸菌和低水平的锰(诸如至多600ppm的锰)的起子培养物组合物。所述组合物可用于摄取产品中反之可供酵母或霉菌利用的游离锰。本发明人已经证明，常见的酵母和霉菌被所公开的组合物抑制。 [0027] Archibald等(1984)探索了植物乳杆菌(L.plantarum)14917对锰的摄取(Archibald等，“植物乳杆菌对锰的获取(Manganese acquisition by Lactobacillus plantarum).”Journal of bacteriology 158.1(1984):1‑8)。如所公开的，植物乳杆菌 14917的高锰含量是由特定的高亲和力、高速摄取系统生成的。然而，这项工作不涉及食物产品中污染酵母和/或霉菌的生长抑制。它也没有公开高度浓缩的直投式起子培养物(诸如冷冻直投式(F‑DVS)或冷冻干燥直投式(FD‑DVS))的任何制备。 [0028] 在一个方面，本发明提供包含一种或多种抗真菌乳酸菌的直投式起子培养物组合物，其用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且乳酸菌的浓度为至少1E+10个菌落形成单位/g。 [0029] 在一些实施方案中，本文提供包含具有锰转运蛋白的乳酸菌的冷冻直投式(F‑DVS)或冷冻干燥直投式(FD‑DVS)起子培养物组合物，其用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且其中乳酸菌的浓度为至少1E+10个菌落形成单位/g。 [0030] 优选地，起子培养物组合物中的细菌浓度为至少1E+10个菌落形成单位(CFU)/g。 [0031] 为了应对微生物腐败问题，本发明在其他方面提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的具有至少1E+10个CFU/g的细菌起子组合物，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰。优选地，细菌组合物是冷冻干燥直投式(FD‑DVS)或冷冻直投式(F‑DVS)。所述组合物优选包含一种或多种乳酸菌菌株。 [0032] 本文还提供用于抑制或延迟基于乳的产品中的真菌生长的起子培养物组合物或用于发酵基于乳的食物产品和抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长的起子培养物组合物，所述组合物包含乳酸菌，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且其中乳酸菌菌落形成单位/g的浓度为至少1E+10，优选其中乳酸菌使乳、酒、茶、植物和/或肉基质发酵。 [0033] 所述组合物、优选冷冻干燥的DVS(FD‑DVS)或冷冻的DVS(F‑DVS)可包含至多550ppm的锰、至多500ppm的锰、至多450ppm的锰、至多400ppm的锰、至多350ppm的锰、至多 300ppm的锰、至多250ppm的锰、至多200ppm的锰、至多150ppm的锰、至多100ppm的锰、至多 70ppm的锰、至多50ppm的锰、至多40ppm的锰。 [0034] 所述组合物可包含10‑600ppm的锰、30‑600ppm的锰、35‑600ppm的锰、40‑600ppm的锰、45‑600ppm的锰、50‑600ppm的锰、60‑550ppm的锰、100‑500ppm的锰、150‑450ppm的锰、190‑400ppm的锰、200‑350ppm的锰、250‑300ppm的锰。优选地，所述组合物可包含40‑250ppm的锰，更优选地，所述组合物可包含45‑200ppm的锰。 [0035] 所述组合物可包含具有1E+10‑5E+12、优选2.0E+10‑6.5E+11、更优选6.0E+10‑6.4E+11、甚至更优选1.3E+11‑5.6E+11的菌落形成单位/g的细胞的乳酸菌。 [0036] 在优选的实施方案中，现在所公开的组合物可以是冷冻干燥直投式(FD‑DVS)或冷冻直投式(F‑DVS)，特别地，所述组合物可以是含有无锰或基本上无锰的添加剂或冷冻保护剂的冷冻干燥直投式(FD‑DVS)，或者所述组合物可以是含有无锰或基本上无锰的添加剂或冷冻保护剂的冷冻直投式(F‑DVS)。优选地，所述组合物是冷冻干燥直投式(FD‑DVS)，并且其可进一步包含选自以下的添加剂(或冷冻保护剂)：酪蛋白酸钠、肌醇、谷氨酸单钠、抗坏血酸钠、蔗糖、麦芽糖糊精、肌苷一磷酸(IMP)、肌苷、聚山梨糖醇酯80、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、麦芽提取物、乳清粉、酵母提取物、麸质、胶原蛋白、明胶、弹性蛋白、角蛋白、白蛋白、碳水化合物或其混合物。优选地，添加剂(或冷冻保护剂)不含锰或基本上不含锰。 [0037] 所述组合物另外可含有冷冻保护剂和/或常规添加剂作为其他组分，包括营养素，诸如酵母提取物、糖和维生素，例如维生素A、C、D、K或B族维生素。可添加到本发明组合物中的合适冷冻保护剂是改善微生物的耐寒性的组分，诸如甘露醇、山梨糖醇、三聚磷酸钠、木糖醇、甘油、棉子糖、麦芽糖糊精、赤藓醇、苏糖醇、海藻糖、葡萄糖和果糖。其他添加剂可包括例如碳水化合物、调味剂、矿物质、酶(例如粗制凝乳酶(rennet)、乳糖酶和/或磷脂酶)。 [0038] 在实施方案中，所述组合物可以是含有无锰或基本上无锰的添加剂或冷冻保护剂的冷冻直投式(F‑DVS)，所述冷冻保护剂的浓度为每重量F‑DVS形式10‑40重量％的冷冻保护剂，或每重量F‑DVS形式20‑35重量％的冷冻保护剂，诸如每重量F‑DVS形式31重量％的冷冻保护剂。 [0039] 在优选的实施方案中，所述组合物是包含碳水化合物作为添加剂的冷冻干燥直投式(FD‑DVS)，优选其中添加剂(或冷冻保护剂)不含锰。合适的示例包括选自由以下组成的组的碳水化合物：戊糖(例如核糖、木糖)、己糖(例如果糖、甘露糖、山梨糖)、二糖(例如ducrose、drehalose、蜜二糖、乳果糖)、低聚糖(例如棉子糖)、低聚果糖(例如actilight、fribrolose)、多糖(例如麦芽糖糊精、黄原胶、果胶、海藻酸盐、微晶纤维素、右旋糖酐、聚乙二醇和糖醇(山梨糖醇、甘露醇)。优选的碳水化合物是二糖，优选海藻糖、蔗糖和/或麦芽糖糊精。 [0040] 在优选的实施方案中，当处于冷冻状态时，所述组合物可包含以每重量DVS形式的添加剂重量测量的2％到70％的添加剂(或冷冻保护剂)，更优选以每重量DVS形式的添加剂重量测量的3％到50％的添加剂(或冷冻保护剂)，甚至更优选以每重量DVS形式的添加剂重量测量的4％到40％的添加剂(或冷冻保护剂)，且最优选以每重量DVS形式的添加剂重量测量的10％到35％的添加剂(或冷冻保护剂)。优选地，添加剂不含锰或基本上不含锰。 [0041] 在本发明的上下文中，当所述添加剂或冷冻保护剂中存在小于10ppm的浓度的锰时，所述添加剂或冷冻保护剂不含锰或基本上不含锰。此外，在本发明的上下文中，“添加剂”、“冷冻保护剂(cryoprotectant)”或“冷冻保护试剂(cryoprotectant agent)”可互换使用。 [0042] 可通过在合适的温度将固体冷冻保护剂与生物质混合例如30分钟来将添加剂(或冷冻保护剂)添加到发酵后的分离的活细菌(生物质)中。如果冷冻保护剂是例如蔗糖，则合适的温度可以是室温。或者，可将添加剂(或冷冻保护剂)的无菌溶液与生物质混合。对于蔗糖，合适的无菌溶液可由50％(w/w)蔗糖溶液制成。对于海藻糖，合适的无菌溶液可由40％(w/w)溶液制成。 [0043] 在优选的实施方案中，所述组合物是冷冻干燥的DVS，其包含10‑600ppm的锰、30‑600ppm的锰、35‑600ppm的锰、40‑600ppm的锰、45‑600ppm的锰、50‑600ppm的锰、60‑550ppm的锰、100‑500ppm的锰、150‑450ppm的锰、190‑400ppm的锰、200‑350ppm的锰、250‑300ppm的锰。优选地，所述组合物是包含40‑250ppm的锰的冷冻干燥的DVS，更优选地，所述组合物是包含45‑200ppm的锰的冷冻干燥的DVS。此外，所述优选的冷冻干燥DVS组合物可包含选自由以下组成的组的乳酸菌：植物乳杆菌、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)、短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)，优选选自副干酪乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌，其中所述乳酸菌具有至少1E+10的CFU/g，包括2E+10、3E+10、 4E+10、5E+10、6E+10、7E+10、8E+10、9E+10 CFU/g，诸如2.0E+10‑6.5E+11，优选6.0E+10‑ 6.4E+11，更优选1.3E+11‑5.6E+11，和/或其中冷冻干燥DVS具有不含锰或基本上不含锰且浓度为每重量FD‑DVS形式10‑30％干重的冷冻保护剂或每重量FD‑DVS形式20‑30％干重的冷冻保护剂(诸如每重量FD‑DVS形式27％干重的冷冻保护剂)的添加剂或冷冻保护剂。 [0044] 在优选的实施方案中，本发明可提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的组合物、或用于抑制或延迟基于乳的产品中真菌生长的组合物、或用于发酵基于乳的食物产品以及抑制或延迟所述食物产品中真菌生长的组合物，其中所述乳酸菌包含锰转运蛋白，所述锰转运蛋白与SEQ ID NO:1‑3中任一个的序列具有至少55％，诸如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。 [0045] 在优选的实施方案中，本发明可提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的组合物、或用于抑制或延迟基于乳的产品中真菌生长的组合物、或用于发酵基于乳的食物产品以及抑制或延迟所述食物产品中真菌生长的组合物，其中乳酸菌不含超氧化物歧化酶，优选不含锰超氧化物歧化酶。 [0046] 超氧化物歧化酶(诸如锰超氧化物歧化酶)已得到研究，并且例如尤其描述于以下文献中：Kehres等，“细菌中锰转运、生物化学和发病机制的新兴主题(Emerging themes in manganese transport,biochemistry and pathogenesis in bacteria).”FEMS microbiology reviews 27.2‑3(2003):263‑290；Culotta V.C“超氧化物歧化酶、氧化应激和细胞代谢(Superoxide dismutase,oxidative stress,and cell metabolism)”Curr.Top.Cell Regul.36,117‑132(2000)或Whittaker J.W“锰超氧化物歧化酶 (Manganese superoxide dismutase)”Met.Ions Biol.Syst.37,587‑611(2000)。 [0047] 在本发明的上下文中，术语“不含”意指一种或多种细菌菌株的基因组不呈现编码超氧化物歧化酶的基因，或者即使一种或多种细菌菌株的基因组呈现编码超氧化物歧化酶的基因，该基因也不被一种或多种细菌菌株表达。 [0048] 在优选的实施方案中，本发明可提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的组合物、或用于抑制或延迟基于乳的产品中真菌生长的组合物、或用于发酵基于乳的食物产品以及抑制或延迟所述食物产品中真菌生长的组合物，其中乳酸菌选自由以下组成的组：植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、沙克乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、消化乳杆菌、乳酸片球菌、鼠李糖乳杆菌和开菲尔乳杆菌。 [0049] 在优选的实施方案中，本发明可提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的组合物、或用于抑制或延迟基于乳的产品中真菌生长的组合物、或用于发酵基于乳的食物产品以及抑制或延迟所述食物产品中真菌生长的组合物，其中真菌是酵母和/或霉菌，优选其中真菌是选自由以下组成的组的酵母：有孢圆酵母属(Torulaspora)的种、隐球菌属(Cryptococcus)的种、酵母属(Saccharomyces)的种、耶氏酵母属(Yarrowia)的种、德巴利酵母属(Debaryomyces)的种、假丝酵母属(Candida)的种和红酵母属(Rhodoturola)，优选其中德巴利酵母属的种是汉逊德巴利酵母(Debaromyces hansenii)和/或其中真菌是选自由以下组成的组的霉菌：曲霉属(Aspergillus)的种、枝孢菌属(Cladosporium)的种、亚隔孢壳属(Didymella)的种或青霉属(Penicillium)的种，优选其中青霉属的种是皮壳青霉(Penicillium crustosum)、潘氏青霉(Penicillium paneum)、卡尼青霉(Penicillium carneum)或娄地青霉(Penicillium roqueforti)。 [0050] 在又一方面，本发明还提供包含本文所公开的组合物的食物产品。在实施方案中，食物产品可以是发酵食物产品，优选嗜热发酵食物产品或嗜中温发酵食物产品，更优选所述食物产品可以是酸奶或奶酪。 [0052] 图1：用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株1(1E+7个CFU/g)的F‑DVS形式(其中所述F‑DVS形式具有约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约625ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物以及副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株3的FD‑DVS形式(其中FD‑DVS形式的所述形式具有约275ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)。酸奶被掺入皮壳青霉(X)、卡尼青霉(Y)和娄地青霉(Z)(500个孢子/每种)并在22℃储存7天。 [0053] 图2：当使用50个CFU/g的德氏有孢圆酵母接种用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株1(1E+7个CFU/g)的F‑DVS形式(其中所述F‑DVS形式具有约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约625ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)时，德氏有孢圆酵母的生长。将酸奶在7℃储存23天。 [0054] 图3：当使用50个CFU/g的汉逊德巴利酵母接种用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株1(1E+7个CFU/g)的F‑DVS形式(其中所述F‑DVS形式具有约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约625ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)时，汉逊德巴利酵母的生长。将酸奶在7℃储存23天。 [0055] 图4：当使用50个CFU/g的汉逊德巴利酵母接种用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株2的F‑DVS形式(其中所述F‑DVS形式具有约45ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物以及鼠李糖乳杆菌菌株1和2的F‑DVS形式(其中F‑DVS形式具有约65ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和具有约845ppm的锰的基准组合物A的FD‑DVS形式生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和具有约630ppm的锰的基准组合物B的FD‑DVS形式生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和具有870ppm的锰的基准组合物C的FD‑DVS形式生产的酸奶(1.5％脂肪)时，汉逊德巴利酵母的生长。将酸奶在7℃储存32天。 [0056] 图5：用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株2(1E+7个CFU/g)的F‑DVS形式(其中F‑DVS形式具有约45ppm的锰)、或和鼠李糖乳杆菌菌株1和2(1E+7个CFU/g)的F‑DVS形式(其中F‑DVS形式具有约65ppm的锰)、或和具有约845ppm的锰的基准组合物A(1E+7个CFU/g)的FD‑DVS形式、或和具有约630ppm的锰的基准组合物B(1E+7个CFU/g)的FD‑DVS形式、或和具有约870ppm的锰的基准组合物C(1E+7个CFU/g)的FD‑DVS形式生产的酸奶(1.5％脂肪)。所述酸奶已掺入卡尼青霉、潘氏青霉和娄地青霉(500个孢子/每种)并在7℃储存24天(上行)或在25℃储存6天(下行)。平板上青霉属种的布置与图1相同，只是卡尼青霉被潘氏青霉替代。 [0057] 图6：当使用50个CFU/g的汉逊德巴利酵母接种用起子培养物(参考)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物以及副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株3的FD‑DVS形式(其中FD‑DVS形式的所述形式具有约275ppm的锰)生产的酸奶(1.5％脂肪)、或用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株2(1E+7个CFU/g)的FD‑DVS形式生产的酸奶(1.5％脂肪)(其中所述FD‑DVS形式具有约200ppm的锰并且向其中将脱脂乳粉(SMP)添加或不添加到用于获得FD‑DVS形式的冷冻保护剂(标准cryo)中)时，汉逊德巴利酵母的生长。将酸奶在7℃储存27天。 [0058] 图7：用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株2(1E+7 CFU/g)的FD‑DVS形式(其中所述FD‑DVS形式具有约200ppm的锰并且向其中将不同浓度的锰(1、5、10、20和40ppm)添加到用于获得FD‑DVS形式的冷冻保护剂中)生产的酸奶(1.5％脂肪)。酸奶被掺入皮壳青霉、卡尼青霉和娄地青霉(500个孢子/每种)并在22℃储存12天。平板上青霉属种的布置与图1相同。 [0059] 图8：当使用50个CFU/g的汉逊德巴利酵母接种用起子培养物和鼠李糖乳杆菌菌株2(1E+7 CFU/g)的FD‑DVS形式(其中所述FD‑DVS形式具有约200ppm的锰并且向其中将不同浓度的锰(1和40ppm)添加到用于获得FD‑DVS形式的冷冻保护剂中)生产的酸奶(1.5％脂肪)时，汉逊德巴利酵母的生长。将酸奶在7℃储存27天。 具体实施方式[0060] 食物损失是全球关注的主要问题——为人消耗而生产的所有食物中大约有三分之一损失或浪费。这种全球食物大量损失的原因多种多样，但影响感官产品质量(外观、质地、味道和香气)的微生物腐败起着主要作用。由于真菌可在不同、甚至恶劣的环境中生长，因此它们是在食品加工链所有阶段发现的主要腐败微生物。因此，通过控制真菌污染来减少粮食损失至关重要。 [0061] 响应于这一要求，本发明提供用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的新型组合物。锰在自然界和我们的许多消费品中以痕量存在。最近发现低水平的游离锰浓度可用作用于酵母和/或霉菌生长的限制因素。因此，通过操控给定产品中游离锰的浓度，可有效地管理微生物腐败。此类腐败预防策略甚至适用于食物产品以外的产品，并延伸到通常易于受到微生物污染的其他产品，诸如饲料产品、生物产品、健康护理产品、药物产品等。 [0062] 许多细菌已经发展出复杂的采集系统来从环境中清除必需金属。因此可应用锰清除细菌来摄取产品中的游离锰。此外，本发明人最近已发现，当在按比例放大工艺中制备细菌时，优选较低水平的锰。 [0063] 在第一方面，本发明提供用于抑制或延迟基于乳的产品中的真菌生长的起子培养物组合物或用于发酵基于乳的食物产品和抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长的起子培养物组合物，所述组合物包含乳酸菌，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且其中乳酸菌菌落形成单位/g的浓度为至少1E+10，优选其中乳酸菌使乳、酒、茶、植物和/或肉基质发酵。 [0064] 一般来说，抑制意指细胞或微生物的功能和活性的降低(无论是部分还是全部)。如本文所用，与酵母和霉菌有关的术语“抑制(to inhibit)”和“抑制(inhibiting)”意指酵母和霉菌的生长、数量或浓度相同或降低。这可以通过微生物学领域中已知的任何方法来测量。可通过将产品中或产品上的真菌生长、数量或浓度与对照进行比较来观察抑制。对照可以是相同的产品，但不含所述组合物。 [0065] 一般来说，术语“延迟”是指停止、推迟、阻碍或引起某事比正常情况更慢地发生的作用。如本文所用，“延迟真菌生长”是指推迟真菌生长的作用。这可通过比较两种产品中真菌生长到给定水平所需的时间来观察，所述产品中的一种具有所公开的组合物而另一种没有。 [0066] 在一些实施方案中，“抑制或延迟真菌生长”是指延迟7天，诸如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60天。 [0067] 术语“抗真菌”在本申请中应理解为抑制延迟食物产品(诸如基于乳的产品)中真菌生长的能力。 [0068] 如本文所用，术语“食物基质”是指食物的组成和结构。它基于营养素包含在连续介质中的概念。 [0069] 如本文所用，术语“肉基质”是指肉的组成和结构。它基于营养素包含在连续介质中的概念。 [0070] 锰 [0071] 锰参与许多至关重要的生物过程，并且普遍见于所有生物体中。锰还有助于防止氧化应激，并且还有助于活性氧物质的催化解毒。许多细菌已经发展出复杂的采集系统来使用用于螯合或游离金属的低亲和力和高亲和力转运系统从环境中清除必需金属。被细菌摄取的锰在蛋白质中形成大的不可透析的聚磷酸盐‑蛋白质聚集体复合物，其可能达到非常高的细胞内浓度。 [0072] 根据本申请的“锰”是指存在于组合物中用于抑制或延迟食物产品中真菌生长的锰。在本发明的上下文中，“锰”包括见于细胞内和细胞外的锰。 [0073] 如本文所用，术语“细菌菌株”具有在微生物学领域的普通含义并且是指细菌的遗传变体。 [0074] 如本文所用，锰浓度或锰水平以基于重量/重量计算的百万分率(“ppm”)表示。产品或组合物中锰的浓度低于某一值意味着产品或其部分中锰的浓度使得按重量计整个产品或整个组合物中锰的浓度低于给定值。确定痕量元素(诸如锰)的方法是本领域已知的并且描述于例如Nielsen,S.Suzanne编辑，Food analysis.第86卷，Gaithersburg,MD:Aspen Publishers,1998中。 [0075] 测量低浓度锰的方法为本领域技术人员所熟知。此类方法包括原子吸收光谱、原子发射光谱、质谱、中子活化分析和x射线荧光测定(参见例如Williams等“锰的毒理学特征(Toxicological profile for manganese).”(2012))。 [0076] 优选地，根据由欧洲标准化委员会(European Committee for Standardization)出版的欧洲标准EN13805:2014中的“食品‑痕量元素的确定‑加压溶出(Foodstuffs‑Determination of trace elements‑Pressure digestion)”中所述的标准程序、或如由国际标准化组织(International Organization for Standardization)出版的ISO 11885:2007中的“水质‑通过电感耦合等离子体光发射光谱确定所选元素(Water quality‑Determination of selected elements by inductively coupled plasma optical emission spectrometry)(ICP‑OES)”中所述的标准程序测量锰浓度。 [0077] 存在于最终组合物(F‑DVS产品或FD‑DVS产品)中的锰水平被确定为影响菌株抗真菌活性的主要参数之一，其中高水平的Mn产生较小的抗真菌活性且低水平的Mn产生高的抗真菌活性。 [0078] 先前已经研究了来自植物乳杆菌的镉和锰摄取基因。在该研究中，Hao等公开了植2+ 物乳杆菌ATCC14917中的两种镉摄取系统。一种与Mn 不足无关，但具有低亲和力，而另一种 2+ 2+ 2+ 2+ 具有高亲和力且由Mn 不足诱导，但在Mn 存在下受到抑制。对于后者，Mn 和Cd 是彼此的 2+ 2+ 竞争性抑制剂，且其对Cd 的亲和力高于对Mn 的亲和力(Hao等“来自植物乳杆菌的镉和锰摄取基因的克隆、表达及表征(Cloning,expression,and characterization of cadmium and manganese uptake genes from Lactobacillus plantarum).”Applied and Environmental Microbiology 65.11(1999):4746‑4752和Hao等“植物乳杆菌中镉摄取的表征以及镉和锰摄取突变体的分离(Characterization of cadmium uptake in Lactobacillus plantarum and isolation of cadmium and manganese uptake mutants).”Applied and environmental microbiology 65.11(1999):4741‑4745.)。这些论文不涉及用于直接接种的高生物量细胞培养物。它们既没有教导也没有提示本申请的发现。 [0079] 本领域技术人员能够调整培养基中的锰水平以获得含有期望锰水平的最终产品。例如，如果生长培养基中的锰水平低，则最终的组合物将因此具有低水平的锰，因为锰预计会保留在浓缩过程中。另一方面，如果生长培养基中的锰水平高，则最终的组合物将相应地具有高水平的锰。 [0080] 真菌 [0081] 真菌是属于真菌界的成员。可用本领域技术人员已知的各种方法测量真菌生长。例如，真菌生长可通过菌落的密度或大小、细胞数量、菌丝团变化、孢子产生、菌丝生长、菌落形成单位(CFU)等来测量，这取决于真菌类型和应用所述方法的产品。还可通过测量营养素或代谢物浓度的变化(诸如二氧化碳释放和氧气摄取)来观察真菌生长。 [0082] 术语“真菌生长的抑制”或“抑制真菌生长”是指真菌细胞增殖的抑制。 [0083] 术语“真菌生长的延迟”或“延迟真菌生长”是指真菌细胞增殖的减缓。这可例如通过测量真菌生长并将其与对照进行比较来观察。此类对照可以是例如在没有现在所公开的组合物的情况下制备的产品。确定真菌生长抑制或延迟的方法是本领域技术人员已知的。 [0084] 在一个实施方案中，现在所公开的组合物抑制诸如以下的酵母的生长：假丝酵母属的种、迈耶氏酵母属(Meyerozyma)的种、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的种、毕赤酵母属(Pichia)的种、半乳糖酵母属(Galactomyces)的种、毛孢子菌属(Trichosporon)的种、锁掷酵母属(Sporidiobolus)的种、有孢圆酵母属的种、隐球菌属(Cryptococcus)的种、酵母属的种、耶氏酵母属的种、德巴利酵母属的种和红酵母属的种。优选地，真菌是选自由以下组成的组的酵母：有孢圆酵母属的种、隐球菌属的种、酵母属的种、耶氏酵母属的种、德巴利酵母属的种、假丝酵母属的种和红酵母属的种。更优选地，真菌是选自由以下组成的组的酵母：德氏有孢圆酵母、长莓隐球酵母(Cryptococcus fragicola)、酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、汉逊德巴利酵母和胶红酵母(Rhodoturola mucilaginosa)。 [0085] 在一个实施方案中，现在所公开的组合物抑制霉菌的生长。优选地，真菌是选自由以下组成的组的霉菌：曲霉属的种、枝孢菌属的种、亚隔孢壳属的种或青霉属的种。更优选地，真菌是选自由以下组成的组的霉菌：短密青霉(Penicillium brevicompactum)、皮壳青霉、离生青霉(Penicillium solitum)、卡尼青霉、潘氏青霉和娄地青霉。 [0086] 乳酸菌(LAB) [0087] “乳酸菌”指使糖发酵同时产生酸(包括作为主要产生酸的乳酸)的革兰氏阳性微需氧或厌氧细菌。食物产品通常具有约3.5到约6.5(诸如约4到约6，诸如约4.5到约5.5，诸如约5)的pH值。 [0088] 在优选的实施方案中，现在所公开的组合物可包含具有用于锰的转运系统的乳酸菌。这些用于锰的转运系统已得到研究，并且例如描述于Kehres等，“细菌中锰转运、生物化学和发病机制的新兴主题.”FEMS microbiology reviews 27.2‑3(2003):263‑290中。 [0089] 可用于本申请的乳酸菌菌株具有锰摄取活性。通过常规实验，本领域技术人员能2+ 2+ 够选择具有锰摄取活性的细菌。此类细菌可例如包含细菌Mn 转运蛋白。Mn 转运蛋白可以是ABC转运蛋白(例如SitABCD和YfeABCD)或质子依赖性Nramp相关转运系统，该转运系统属于在由转运分类数据库(Transport Classification Database)给出的转运蛋白分类系统中指定为TC#3.A.1.15和TC#2.A.55的家族(M.Saier；U of CA,San Diego,Saier MH,Reddy VS,Tamang DG,Vastermark A.(2014))。TC系统是用于转运蛋白的分类系统，其类似于用于酶分类的酶委员会(Enzyme Commission,EC)系统。转运蛋白分类(TC)系统是由国际生物化学和分子生物学联盟(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)批准的转运蛋白分类命名系统。TCDB可在http://www.tcdb.org免费访问，该网站提供了几种不同的用于访问数据的方法，包括逐步访问分级分类、按序列或TC编号直接检索和全文检索。 [0090] 在优选的实施方案中，乳酸菌菌株可包含属于指定为TC#3.A.1.15(锰螯合物摄取转运蛋白(MZT)家族)或TC#3.A.1.15.6、TC#3.A.1.15.8、TC#3.A.1.15.14的家族的蛋白质或其功能变体。 [0091] ABC转运蛋白主要在较高的pH值下具有活性，而质子驱动的转运蛋白在酸性条件下可能更具活性。因此，在一个实施方案中，现在所公开的组合物可包含细菌菌株，所述细2+ 菌菌株包含属于指定为TC#2.A.55家族(金属离子(Mn ‑铁)转运蛋白(Nramp)家族)的蛋白质或其功能变体。更优选地，转运蛋白属于指定为TC#2.A.55.2的亚族或指定为TC# 2.A.55.3的亚族。 [0092] 例如，本文所公开的组合物可包含乳酸菌，所述乳酸菌具有指定为TC#2.A.55.3.1、TC#2.A.55.3.2、TC#2.A.55.3.2、TC#2.A.55.3.3、TC#2.A.55.3.4、TC# 2.A.55.3.5、TC#2.A.55.3.6、TC#2.A.55.3.7、TC#2.A.55.3.8或TC#2.A.55.3.9金属离子 2+ (Mn ‑铁)转运蛋白或其功能变体，优选具有TC#2.A.55.2.6或其功能变体。 [0093] 术语“功能变体”是具有基本上相似的生物活性(即锰摄取活性)的蛋白质变体。 [0094] 如本文所用，“变体”是指蛋白质的变体形式，其与该蛋白质的特定核酸或氨基酸序列共有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。 [0095] 本公开另外提供可存在于乳酸中的锰转运蛋白的多肽序列以实施本发明。 [0096] 在优选的实施方案中，乳酸菌菌株包含具有SEQ ID NO:1(MASEDKKSKREHIIHFEDTPSKSLDEVNGSVEVPHNAGFWKTLAAYTGPGILVAVGYMDPGNWITSIAGGASFKYSLLSVILISSLIAMLLQAMAARLGIVTGRDLAQMTRDHTSKAMGGFLWVITELAIMATDIAEIIGSAIALKLLFNMPLIVGIIITTADVLILLLLMRLGFRKIEAVVATLVLVILLVFAYEVILAQPNVPELLKGYLPHADIVTNKSMLYLSLGIVGATVMPHDLFLGSSISQTRKIDRTKHEEVKKAIKFSTIDSNLQLTMAFIVNSLLLILGAALFFGTSSSVGRFVDLFNALSNSQIVGAIASPMLSMLFAVALLASGQSSTITGTLAGQIIMEGFIHLKMPLWAQRLLTRLMSVTPVLIFAIYYHGNEAKIENLLTFSQVFLSIALPFAVIPLVLYTSDKKIMGEFANRAWVKWTAWFISGVLIILNLYLIAQTLGFVK)的序列的多肽或其功能变体。 [0097] 在其他优选的实施方案中，乳酸菌菌株包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少55％(诸如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽。 [0098] 表1显示编码SEQ ID NO:1的功能变体的示例性序列和它们与SEQ ID NO:1的序列同一性. [0099] 表1 [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 在优选的实施方案中，乳酸菌菌株包含具有SEQ ID NO:2(MARPDERLTVQREKRSLDDINRSVQVPSVYESSFFQKFLAYSGPGALVAVGYMDPGNWLTALEGGSRYHYALLSVLLMSILVAMFMQTLAIKLGVVARLDLAQAIAAFIPNWSRICLWLINEAAMMATDMTGVVGTAIALKLLFGLPLMWGMLLTIADVLVVLLFLRFGIRRIELIVLVSILTVGIIFGIEVARADPSIGGIAGGFVPHTDILTNHGMLLLSLGIMGATIMPHNIYLHSSLAQSRKYDEHIPAQVTEALRFGKWDSNVHLVAAFLINALLLILGAALFYGVGGHVTAFQGAYNGLKNPMIVGGLASPLMSTLFAFALLITGLISSIASTLAGQIVMEGYLNIRMPLWERRLLTRLVTLIPIMVIGFMIGFSEHNFEQVIVYAQVSLSIALPFTLFPLVALTNRRDLMGIHVNSQLVRWVGYFLTGVITVLNIQLAISVFV)的序列的多肽或其功能变体。 [0105] 在其他优选的实施方案中，乳酸菌菌株包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少55％(诸如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的多肽。 [0106] 表2显示编码SEQ ID NO:2的功能变体的示例性序列和它们与SEQ ID NO:2的序列同一性. [0107] 表2 [0108] [0109] [0110] [0111] 在优选的实施方案中，乳酸菌菌株包含具有SEQ ID NO:3(MSDDHKKRHPIKLIQYANGPSLEEINGTVEVPHGKGFWRTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSITGGQNFQYLLISVILMSSLIAMLLQYMAAKLGIVSQMDLAQAIRARTSKKLGIVLWILTELAIMATDIAEVIGAAIALYLLFHIPLVIAVLVTVLDVLVLLLLTKIGFRKIEAIVVALILVILLVFVYQVALSDPNMGALLKGFIPTGETFASSPSINGMSPIQGALGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKIDYKNPDDVAQAVKFSAWDSNIQLSFAFVVNCLLLVMGVAVFKSGAVKDPSFFGLFQALSDSSTLSNGVLIAVAKSGILSILFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIMEGFVHMKMPLWARRLVTRIISVIPVIVCVMLTARDTPIQQHEALNTLMNNSQVFLAFALPFSMLPLLMFTNSKVEMGDRFKNTGWVKVLGWISVLGLTGLNLKGLPDSIAGFFGDHPTATQTNMANIIAIVLIVAILALLAWTIWDLYKGNQRYEAHLAAVADEKEAKADVDEQ)的序列的多肽或其功能变体。 [0112] 在其他优选的实施方案中，乳酸菌菌株是包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少55％(诸如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％)序列同一性的多肽的细菌菌株。 [0113] 表3显示编码SEQ ID NO:3的功能变体的示例性序列和它们与SEQ ID NO:3的序列同一性. [0114] 表3 [0115] [0116] [0117] [0118] 出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的“序列同一性”程度是使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends Genet.16:276‑277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman‑Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443‑453)来确定的。所用的任选参数是10的缺口开放罚分(gap open penalty)、0.5的缺口延伸罚分(gap extension penalty)和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵(substitution matrix)。使用标记为“最长同一性(longest identity)”(使用nobrief选项获得)的Needle输出作为同一性百分比，并计算如下： [0119] (相同的残基×100)/(比对长度‑比对中缺口的总数) [0120] 出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度是使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000，见上文)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman‑Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来确定的。所用的任选参数是10的缺口开放罚分、0.5的缺口延伸罚分和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”(使用nobrief选项获得)的Needle输出作为同一性百分比，并计算如下： [0121] (相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度‑比对中缺口的总数) [0122] 在实施方案中，乳酸菌菌株包含与SEQ ID NO:1‑3中任一个的序列具有至少55％(诸如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的锰转运蛋白。该确定可基于对细菌菌株进行测序或在已知序列数据库中进行blast搜索。 [0123] 用于本公开的实施例部分中的乳酸菌具有作为编码的SEQ ID NO:1‑3或其功能变体的锰转运蛋白。 [0124] 在优选的实施方案中，乳酸菌可选自由以下组成的组：植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、沙克乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、消化乳杆菌、乳酸片球菌、鼠李糖乳杆菌和开菲尔乳杆菌。 [0125] 直投式(DVS) [0126] 在一个实施方案中，本发明提供包含乳酸菌的冷冻直投式(F‑DVS)起子培养物组合物，其用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且乳酸菌的浓度为至少1E+10个菌落形成单位/g。 [0127] 在另一实施方案中，本发明提供包含乳酸菌的冷冻干燥直投式(FD‑DVS)起子培养物组合物，其用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中的真菌生长，其特征在于，所述组合物包含至多600ppm的锰并且乳酸菌的浓度为至少1E+10个菌落形成单位/g。 [0128] 在一些实施方案中，乳酸菌是植物乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、沙克乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌、消化乳杆菌、乳酸片球菌、鼠李糖乳杆菌和开菲尔乳杆菌。优选地，乳酸菌为副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。 [0129] 冷冻干燥或冷冻的细菌培养物的制备是本领域已知的，例如如US9848615中所公开的。 [0130] 商业相关的高浓缩的冷冻培养物通常具有至少1E+9个CFU/g的细菌浓度。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物中的细菌具有至少1E+10 CFU/g(包括2E+10、3E+10、4E+10、5E+10、6E+10、7E+10、8E+10、9E+10 CFU/g)的浓度。在其他实施方案中，组合物中的细菌具有至少1E+11 CFU/g(包括2E+10、3E+10、4E+10、5E+10、6E+10、7E+10、8E+10、9E+10个CFU/g)的浓度。为了达到这一目的，可能需要更长的发酵时间。 [0131] 产品 [0132] 在一些实施方案中，产品是食物产品、化妆品、健康护理产品或药物产品。“食品”和“食物产品”具有这些术语的共同含义。“食物产品”是指任何适人或动物消耗的食品或饲料产品。食物产品可以是新鲜或易腐烂的食物产品以及储存或加工的食物产品。食物产品包括但不限于水果和蔬菜(包括衍生产品)、谷物和谷物衍生产品、乳制品、肉类、家禽和海产食品。更优选地，食物产品是肉类产品或乳制品，诸如酸奶、特沃劳格(tvarog)、酸奶油、奶酪等。食物产品还可以是基于植物的产品或即食产品，诸如沙拉。 [0133] 在一个实施方案中，可将本文所述的组合物添加到非发酵食物产品或发酵食物产品中。非发酵产品通常具有高于发酵食物产品的pH值。发酵食物产品是通过微生物的作用产生或保存的食品。发酵意指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。发酵通常是指使用酵母将糖发酵成酒精。然而，它还可能涉及将乳糖转化为乳酸。例如，发酵可用于制作诸如酸奶、奶酪、萨拉米香肠(salami)、德国泡菜(sauerkraut)、朝鲜泡菜(kimchi)、腌菜(pickle)等食品。 [0134] 本发明特别可用于抑制或延迟乳制品中的真菌生长。在此类产品中，酵母和霉菌的污染很常见，并限制了此类产品的保存期。除了乳之外，“乳制品”还包括来源于乳的产品，诸如奶油、冰淇淋、黄油、奶酪和酸奶，以及次级产品，诸如抗乳血清和酪蛋白，以及含有乳或乳组分作为主要成分的任何预制食品，诸如配方乳。在一个优选的实施方案中，乳制品是发酵乳制品。术语“乳”被理解为通过给任何哺乳动物(诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶而获得的乳分泌物。在优选的实施方案中，乳是牛乳。术语乳还包括由植物材料制得的蛋白质/脂肪溶液，例如豆乳。 [0135] 在一个实施方案中，食物产品是通过用嗜热生物发酵制备的产品，即嗜热发酵食物产品。术语“嗜热生物”是指在高于43℃的温度下繁衍最好的微生物。工业上最有用的嗜热菌包括链球菌属的种(Streptococcus spp.)和乳杆菌属的种(Lactobacillus spp.)。术语“嗜热发酵”在本文中是指在高于约35℃(诸如约35℃到约45℃)的温度下的发酵。“嗜热性发酵食物产品”是指通过嗜热性起子培养物的嗜热发酵制备的发酵食物产品。此类产品包括例如酸奶、冰岛酸奶(skyr)、黎巴嫩浓缩酸奶(labneh)、印度酸奶(lassi)、爱兰(ayran)和杜格酸奶(doogh)。 [0136] 在一个实施方案中，食物产品是通过用嗜中温生物(mesophile)发酵制备的产品，即嗜中温发酵食物产品。术语“嗜中温生物”是指在中等温度(15℃‑40℃)下繁衍最好的微生物。工业上最有用的嗜中温菌包括乳球菌属的种(Lactococcus spp.)和明串珠菌属的种(Leuconostoc spp)。术语“嗜中温发酵”在本文中是指在约22℃到约35℃的温度下的发酵。“嗜中温发酵食物产品”是指通过嗜中温起子培养物的嗜中温发酵制备的发酵食物产品。此类产品中包例如酪乳、酸乳、培养乳(cultured milk)、斯美塔那(smetana)、酸奶油和新鲜奶酪，诸如夸克(quark)、特沃劳格和奶油奶酪。 [0137] 发酵产品的制备 [0138] 本文的组合物特别可用于抑制或延迟发酵乳产品(诸如嗜热和嗜中温发酵乳产品，例如酸奶产品)中的酵母和/或霉菌生长。术语“发酵乳产品”是一般根据本领域众所周知的相关官方法规和标准定义的术语。例如，将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的共生培养物用作酸奶的起子培养物，而将嗜酸乳杆菌用于制作嗜酸乳。将其他嗜中温乳酸菌用于生产夸克或清爽奶酪(fromage frais)。 [0139] 表述“发酵乳产品”是指食品或饲料产品，其中食品或饲料产品的制备涉及用乳酸菌使乳基质发酵。如本文所用的“发酵乳产品”包括但不限于诸如嗜热发酵乳产品(例如酸奶)和嗜中温发酵乳产品(诸如酸奶油和酪乳，以及发酵乳清、夸克和清爽奶酪)的产品。发酵乳产品还包括奶酪，诸如欧式奶酪(continental type cheese)、新鲜奶酪、软奶酪、切达奶酪(cheddar)、马斯卡彭奶酪(mascarpone)、帕斯塔费拉塔奶酪(pasta filata)、马苏里拉酪(mozzarella)、波萝伏洛奶酪(provolone)、白卤奶酪(white brine cheese)、比萨奶酪(pizza cheese)、羊乳酪、布里奶酪(brie)、卡门伯特奶酪(camembert)、农家奶酪(cottage cheese)、埃丹奶酪(Edam)、高德奶酪(Gouda)、提尔西特奶酪(Tilsiter)、哈瓦蒂奶酪(Havarti)或大孔奶酪(Emmental)、瑞士奶酪(Swiss cheese)和马斯达姆奶酪(Maasdamer)。 [0140] 术语“酸奶”具有其通常的含义，并且一般根据本领域众所周知的相关官方法规和标准来定义。用于制作酸奶的起子培养物包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。有趣的是，锰转运蛋白不存在于德氏乳杆菌保加利亚亚种中并且在嗜热链球菌中仅展示出低表达，这两种菌株见于酸奶的起子培养物中，使得它们对于真菌腐败特别敏感。因此，优选包括一种或多种其他细菌菌株来清除存在于酸奶中的游离锰。 [0141] 在食品加工期间，化学防腐剂传统上被用来避免真菌腐败。然而，鉴于社会对较少加工且不含防腐剂的食物产品的强烈需求，本发明有助于提供一种有效的解决方案，以通过使用用于发酵食物产品和用于抑制或延迟所述食物产品中真菌生长的组合物来管理酵母和霉菌生长，所述组合物包含至多600ppm的锰和菌落形成单位/g细胞为至少2E+10的乳酸菌。 [0142] 当现在公开组合物时，考虑到本公开中提供的实施例以及食物产品的性质，诸如水分活性、营养素、天然存在的锰的水平、保存期、储存条件、包装等，技术人员能够调整各种参数，诸如pH、温度和所述组合物的量以实现期望的结果。 [0143] 现在所公开的组合物可在给定产品的发酵之前、开始或发酵期间添加，并且所述产品可经过进一步包装以进一步限制与酵母和霉菌的接触，和/或它还可在低温(低于15℃)储存以帮助延长保存期。 [0144] 现在所公开的组合物可在给定发酵乳制品的发酵之前、开始或发酵期间添加。为了制成发酵乳制品，食品基质是乳基质。“乳基质”在本申请中被广泛地用于指基于可用作用于起子培养物的生长和发酵的培养基的乳或乳组分的组合物。“乳”通常是指通过给任何哺乳动物(诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶而获得的乳分泌物。乳基质可从任何生乳材料和/或加工乳材料以及复原乳粉获得。乳基质还可以基于植物，即由植物材料制备，例如豆乳。优选由来自奶牛的乳或乳组分制备的乳基质。 [0145] 乳基质包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，所述乳或乳状产品是诸如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳(condensed milk)、乳粉(dried milk)。 [0147] 为了使乳基质发酵，添加食品级微生物。 [0148] 在添加起子培养物(现在所公开的组合物)并使乳基质经受合适的条件后，发酵工艺开始并持续一段时间。本领域普通技术人员知道如何选择合适的工艺条件，诸如温度、氧、碳水化合物的添加、一种或多种微生物的量和特征以及所需的工艺时间。这一过程可能需要三、四、五、六个小时或更长时间。 [0149] 这些条件包括适合特定起子培养物菌株的温度的设定。例如，当起子培养物包含嗜中温乳酸菌时，可将温度设定为约30℃，并且如果培养物包含嗜热乳酸菌株，则将温度保持在约35℃到50℃(诸如40℃到45℃)范围内。发酵温度的设定还取决于一种或多种添加到发酵中的酶，这可由本领域普通技术人员容易地确定。在本发明的特定实施方案中，发酵温度为35℃到45℃，优选37℃到43℃，且更优选40℃到43℃。在另一实施方案中，发酵温度为15℃到35℃，优选20℃到35℃，且更优选30℃到35℃。 [0150] 可使用本领域已知的任何方法终止发酵。一般来说，取决于工艺的各种参数，可通过使乳基质不适合起子培养物的一种或多种菌株生长来终止发酵。例如，当达到目标pH值时，可通过快速冷却发酵乳产品来进行终止。已知在发酵期间会发生酸化，导致形成由酪蛋白簇和链组成的三维网络。术语“目标pH值”意指发酵步骤结束时的pH值。目标pH值取决于待获得的发酵乳产品并且可由本领域普通技术人员容易地确定。 [0151] 在本发明的特定实施方案中，进行发酵直到至少达到5.2的pH值，诸如直到达到5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8或3.7的pH值。优选地，进行发酵直到达到4.0到5.0、更优选4.0到4.6的目标pH值。在优选的实施方案中，进行发酵直到达到低于4.6的目标pH值。 [0152] 在优选的实施方案中，发酵食物产品选自由以下组成的组：夸克、奶油奶酪、清爽奶酪、希腊酸乳、冰岛酸奶、黎巴嫩浓缩酸奶、酪乳、酸奶油、酸乳、培养乳、开菲尔(kefir)、印度酸奶、爱兰、特瓦罗格(twarog)、杜格酸奶、斯美塔那、养乐多(yakult)和达希(dahi)。 [0153] 在另一优选的实施方案中，发酵食物产品是奶酪，包括欧式奶酪、新鲜奶酪、软奶酪、切达奶酪、马斯卡彭奶酪、帕斯塔费拉塔奶酪、马苏里拉奶酪、波萝伏洛奶酪、白卤奶酪、比萨奶酪、羊乳酪、布里奶酪、卡门伯特奶酪、农家奶酪、埃丹奶酪、高德奶酪、提尔西特奶酪、哈瓦蒂奶酪或大孔奶酪、瑞士奶酪和马斯达姆奶酪。 [0154] 本发明的其他特征和优点将由结合附图阅读以下描述而变得显而易见。除非另有定义，否则本文所用的所有术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。除非本文另外指明或者上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在下文权利要求书的上下文中)所用术语“一(a和an)”和“所述”以及类似指示物应当理解为涵盖单数与复数二者。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放性术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文叙述的值的范围仅仅意在作为个别地表示此范围内的每一单独值的简化方法，并且每一单独值都被并入本说明书中，就如同其在本文中被个别地叙述一样。除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文所提供的所有确切值均代表对应的近似值(例如，关于特定因素或测量所提供的所有确切示例性值可视为也提供对应的近似测量，在适当情况下用“约”修饰)。除非另外要求，否则，使用本文所提供的任何和所有实例或示例性用语(例如，“诸如”)仅仅意在用于更好地阐明本发明，而并不对本发明范围构成限制。本说明书中的任何用语都不应当理解为表明任何非要求保护的元素对于实施本发明是必不可少的。 [0155] 实施例 [0156] 本文所描述和要求保护的本发明的范围不受本文所公开的特定方面限制，因为这些方面旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等同的方面均意在属于本发明的范围内。实际上，除了本文所示和所述的那些之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员来说，根据前面的描述和以下的实施例将变得显而易见。此类修改也意在落入所附权利要求的范围内。在出现分歧的情况下，以本公开(包括定义)为准。 [0157] 锰的定量 [0158] 对于本文所公开的每种组合物，特别是在进行微波辅助消化之后，使用电感耦合等离子体质谱(ICP‑MS)确定锰浓度。生长后收集细胞培养物并呈送给标准程序以获得F‑DVS形式或FD‑DVS形式。此外，还确定了CFU/g。本领域技术人员知道如何进行电感耦合等离子体质谱以及如何确定CFU/g。 [0159] 所获得的结果示于表4中。 [0160] 表4. [0161] [0162] [0163] 发酵乳样品的制备 [0164] 用于本公开中的发酵乳样品如下制备。将均质化乳、特别是降脂(1.5％w/v)的均质化乳在90±1℃热处理20min并立即冷却。先前确定已存在于均质化乳中的锰浓度为约0.03ppm。将商业起子培养物(嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)以0.02％(v/w)接种在3L桶或200ml瓶中。用包含总浓度为1E+7 CFU/g的鼠李糖乳杆菌菌株(菌株1)和约30ppm的锰的组合物接种第一桶；用包含总浓度为1E+7 CFU/g的鼠李糖乳杆菌菌株(菌株1)和约 195ppm的锰的组合物接种第二桶；用包含总浓度为1E+7 CFU/g的鼠李糖乳杆菌菌株(菌株 1)和约625ppm的锰的组合物接种第三桶；用包含总浓度为1E+7 CFU/g的鼠李糖乳杆菌菌株(菌株3)和副干酪乳杆菌菌株以及约275ppm的锰的组合物接种第四桶；并且将第四桶用作参考且仅接种起子培养物。将所有桶在水浴中于43±1℃孵育，并且在这些条件下发酵直到达到4.60±0.1的pH。将发酵乳产品分配到200mL瓶中并冷却。 [0165] 将发酵乳样品的所有部分升温到40℃的温度，并添加40ml已融化并冷却到60℃的5％无菌琼脂溶液。然后将发酵乳和琼脂的该溶液倾倒到无菌培养皿中，并将平板在LAF台中干燥30min。将这些平板用于使用霉菌的挑战(challenge)测试和使用酵母的挑战测试，其中通过评分来评价生长。 [0166] 使用霉菌的挑战测试 [0167] 在本公开中，使用霉菌的挑战测试如下进行。以各500个孢子/点的浓度添加不同的目标污染物(皮壳青霉、娄地青霉和潘氏青霉或卡尼青霉)。将平板在所选温度和时间孵育，并定期检查霉菌的生长。 [0168] 使用酵母的挑战测试 [0169] 在本公开中，使用酵母的挑战测试如下进行。通过在发酵乳样品(诸如酸奶)中接种约50CFU/g的每种目标污染物来测试不同目标污染物(德氏有孢圆酵母、汉逊德巴利酵母、长莓隐球酵母、解脂耶氏酵母)的生长或生长评分。 [0170] 实施例1用包含乳酸菌和不同锰浓度的组合物抑制发酵乳产品中的霉菌 [0171] 本实施例证实锰对针对不同霉菌的抑制作用的影响。使用类似于发酵乳产品的制造工艺和生产的琼脂测定法。使用鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌菌株。 [0172] 图1显示3种不同霉菌(皮壳青霉、卡尼青霉和娄地青霉)在由用起子培养物(参考)或另外用包含乳酸菌和不同锰浓度的组合物(即包含乳酸菌和约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约275ppm的锰、或约625ppm的锰的组合物)发酵的乳制备的平板上的生长。以500个孢子/斑点的浓度添加三种目标污染物。将平板在22±1℃孵育7天。 [0173] 图1证实当使用包含乳酸菌和低浓度锰的组合物时，即当使用约30ppm、约195ppm或约275ppm的锰时，对受试霉菌的抑制更显著。包含乳酸菌和约625ppm的锰的组合物仍能抑制皮壳青霉(X)和卡尼青霉(Y)的生长，但不能抑制娄地青霉(Z)的生长。此外，当不使用此类组合物时，受试霉菌会增殖，导致发酵乳产品的腐败。 [0174] 图7显示3种不同霉菌在由用起子培养物(参考)或另外用包含乳酸菌的冷冻干燥(FD‑DVS)DVS组合物发酵的乳制备的平板上的生长，其中FD‑DVS形式具有约200ppm的锰并且所用的冷冻保护剂进一步补充有不同浓度的锰(1、5、10、20和40ppm)。向酸奶掺入皮壳青霉、卡尼青霉和娄地青霉(500个孢子/每种)并在22℃储存12天。 [0175] 图7证实与锰丰富时的条件相比，在呈送给锰贫乏的条件时，受试霉菌的生长受损。因此，当将锰添加到冷冻保护剂中时，它会促进受试霉菌的生长，导致食物的腐败。因此，图7令人惊讶地显示需要具有缺失锰、尤其是缺失在其组合物中具有锰的冷冻保护剂(诸如脱脂乳粉)的现在所公开的组合物的FD‑DVS形式。 [0176] 总之，所有受试霉菌都在由仅用起子培养物(参考)发酵的乳制成的琼脂平板上生长得很好。因此，当不使用包含乳酸菌和锰的组合物时，受试霉菌可增殖，导致发酵乳产品的腐败。此外，图1证实，当将发酵乳产品呈送给包含乳酸菌和不同浓度的锰的组合物时，对不同受试霉菌的抑制是可能的，当使用较低浓度的锰时，效应更显著。因此，使用包含乳酸菌和低水平锰(诸如低于600ppm的锰，更优选低于275ppm，甚至更优选低于200ppm，诸如约30到约200ppm或约45ppm到约200ppm)的组合物避免发酵乳产品的腐败。 [0177] 实施例2与现有技术相比，用包含乳酸菌和不同锰浓度的组合物抑制发酵乳产品中的霉菌 [0178] 还进行了本发明的组合物与现有技术之间的比较。 [0179] 图5显示3种不同霉菌(皮壳青霉、潘氏青霉和娄地青霉)在由用单独的起子培养物(参考)或另外用包含与低水平的锰(诸如45或65ppm的锰)组合的乳酸菌(菌株2或1+2)的组合物或另外用基准组合物(A、B或C)发酵的乳制备的平板上的生长。基准组合物A是具有845ppm的锰的 XPM；基准组合物B是具有630ppm的锰的 YM‑B Plus；基 准组合物C是具有870ppm的锰的 YM‑C。 [0180] 图5证实包含乳酸菌和低浓度锰(诸如浓度低于约600ppm的锰，优选浓度为约40‑600ppm的锰或浓度为约45‑600ppm的锰，更优选浓度为40‑70ppm的锰)的组合物是避免食物的腐败的原因，而与用于储存发酵乳样品的条件(诸如7±1℃保持24天相对于25±1℃保持 11天)无关。 [0181] 实施例3用包含乳酸菌和不同锰浓度的组合物抑制发酵乳产品中的酵母 [0182] 本实施例证实不同酵母(诸如有孢圆酵母属或德巴利酵母属)在接种于用单独的起子培养物(参考)或另外用包含乳酸菌(诸如鼠李糖乳杆菌菌株1、鼠李糖乳杆菌菌株2、鼠李糖乳杆菌菌株3、副干酪乳杆菌)和约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约275ppm的锰、或约625ppm的锰的组合物发酵的发酵乳产品中时所面临的生长挑战。将生长挑战在7±1℃保持 23天(图2‑3)或27天(图6)。 [0183] 图2和图3显示不同酵母(有孢圆酵母属和德巴利酵母属)在接种于用起子培养物、另外用包含乳酸菌和约30ppm的锰、或约195ppm的锰、或约625ppm的锰的组合物发酵的发酵乳产品中时的生长受损。对于包含约30ppm的锰的组合物，这种损害更为剧烈且持久(图2‑3)。然而，含有约195ppm的锰或约625ppm的锰的组合物仍然导致受试酵母的生长受损，但程度较轻，表明包含乳酸菌和较低浓度锰的组合物确实影响真菌的生长并因此影响食物的腐败。 [0184] 图6另外显示，包含乳酸菌和约275ppm的锰的组合物导致诸如德巴利酵母属的酵母的生长显著减少。所用冷冻保护剂的组成为：酪蛋白酸钠、肌醇、谷氨酸单钠、抗坏血酸钠和水，优选条件是不包括锰。所有值均以％w(成分)/w(冷冻保护剂溶液)给出。例如：酪蛋白酸钠5.55、肌醇3.75、谷氨酸单钠3.75、抗坏血酸钠5.65和水81.3，优选其中不包括锰。所有值均以％w(成分)/w(冷冻保护剂溶液)给出。 [0185] 图8进一步显示德巴利酵母属在仅用起子培养物(参考)或另外用包含乳酸菌(诸如鼠李糖乳杆菌菌株2)的冷冻干燥DVS组合物接种的乳发酵产品上的生长，其中FD‑DVS形式具有约200ppm的锰并且进一步补充有不同浓度的锰(1和40ppm)。因此，图8令人惊讶地显示需要具有缺失锰、尤其是缺失在其组合物中具有锰的冷冻保护剂(诸如脱脂乳粉)的组合物的FD‑DVS形式。 [0186] 实施例4与现有技术相比，用包含乳酸菌和不同锰浓度的组合物抑制发酵乳产品中的酵母 [0187] 还进行了本文所公开的组合物与现有技术之间的比较。 [0188] 图4显示德巴利酵母属在发酵乳产品中的生长，此时所述产品仅具有单独的起子培养物(参考)，或另外具有包含与低水平的锰(诸如约45或约65ppm的锰)组合的乳酸菌(鼠李糖乳杆菌菌株2或鼠李糖乳杆菌菌株1+2)的组合物，或另外具有基准组合物(A、B或C)。基准组合物A是具有843ppm的锰的 XPM；基准组合物B是具有630ppm的锰的YM‑B Plus；基准组合物C是具有870ppm的锰的 YM‑C。 [0189] 图4证实，与包含超过600ppm的锰的基准组合物相比，当呈送给包含乳酸菌和低浓度锰(诸如45ppm或65ppm)的组合物时，德巴利酵母属在发酵乳产品上的生长显著受损。 |
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