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一种鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN、酸奶发酵剂、酸奶及其应用
申请号	CN202311683559.4	申请日	2023-12-10	公开(公告)号	CN117660253A	公开(公告)日	2024-03-08
申请人	石河子大学;			发明人	倪永清; 孙海龙; 罗宝龙; 剡文莉; 张慧敏; 陈宁宁;
摘要	本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004CNN及其应用，所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004CNN于2023年06月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231099；不仅对肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、肠道出血性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种等均具有良好的抑菌效果，还具有耐酸、胆盐活性，在胃液和肠液中具有较高的存活率，且具有良好的自凝集性和疏水性以及利用碳水化合物的能力；可以用于制备抑制致病菌的药物或食品添加剂，具有广阔的应用前景。
权利要求	1.一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)FMBL L23004 CNN，于2023年06月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231099。 2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN。 3.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或菌剂具有下述性质： (1)具有抑制病原微生物的潜力； (2)具有耐胆盐能力； (3)具有耐酸能力； (4)具有利用碳水化合物的能力。 4.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或权利要求2所述的菌剂在制备抑制致病菌的药物中的应用。 5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的致病菌为肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、肠道出血性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种的一种或几种。 6.一种用于预防和/或治疗消化系统疾病的药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004CNN的培养物或权利要求2所述的菌剂。 7.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的培养物或权利要求2所述的菌剂在制备食品、食品添加剂或保健品中的应用。 8.如权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或如权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的培养物或权利要求2所述的菌剂在制备酸奶或酸奶发酵剂中的应用。 9.一种酸奶发酵剂，其特征在于，所述的酸奶发酵剂包括权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN。 10.一种酸奶，其特征在于，通过权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN发酵得到。
说明书全文	一种鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN、酸奶发酵剂、酸奶及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN、酸奶发酵剂、酸奶及其应用。背景技术 [0002] 鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，原为乳杆菌属，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，现从属于乳酪杆菌属，是国家卫生部认证可添加到食品中的菌种之一。鼠李糖乳酪杆菌具有无毒，无副作用，肠道黏着率高及定植能力强等优良特性。此外，部分菌株具有抑制食品中腐败菌、病原菌及调节宿主肠道菌群，提高机体免疫力及抗癌等重要的临床应用潜力，符合当代人们健康养生、保健的需求。但是，鼠李糖乳杆菌由于其特殊的代谢途径，区别于一般乳酸菌，在普通的牛奶中无法正常生长，无法增殖。 [0003] 生产中，鼠李糖乳酪杆菌的特定菌株通常被添加到酸奶、保健品等发酵食品或益生菌补充剂产品。鼠李糖乳酪杆菌作为一种发酵剂，常用于酸奶发酵剂及食品或保健食品的添加剂的制备。例如，发明专利CN114271328A公开了一种富含鼠李糖乳杆菌酸奶及其制备方法，制备的富含鼠李糖乳杆菌酸奶。但是现有已知的鼠李糖乳杆菌的活性存在较大差异，其中，发明专利CN109536415B公开了一种鼠李糖乳杆菌及其应用，该菌株作为耐消化道逆环境能力强、抑菌特性好的添加剂鼠李糖乳杆菌冻干粉在制备食品、保健食品或药物组合物中的应用；但是所述鼠李糖乳杆菌的抑菌活性较弱，鼠李糖乳杆菌原上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、李斯特菌等多种菌株均没有抑制活性，仅在经过5倍浓缩后才具有一定的抑菌活性。 [0004] 因此，获得一株耐消化道逆环境能力强、具有较好的抑菌特性、还可以发酵制备发酵乳的鼠李糖乳酪杆菌，成为目前益生菌产品生产者亟需解决的问题。发明内容 [0005] 针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)FMBL L23004 CNN，于2023年06月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231099。 [0006] 本发明的第二目的是提供一种菌剂，含有所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN。 [0007] 优选的，所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或所述的菌剂，所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或菌剂具有下述性质： [0008] (1)具有抑制病原微生物的潜力； [0009] (2)具有耐胆盐能力； [0010] (3)具有耐酸能力； [0011] (4)具有利用碳水化合物的能力。 [0012] 本发明的第三目的是提供所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN在制备抑制致病菌的药物中的应用。 [0013] 优选的，所述的致病菌为肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、肠道出血性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种的一种或几种。 [0014] 本发明的第四目的是提供一种用于预防和/或治疗消化系统疾病的药物，其所述药物包括所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的培养物或所述的菌剂。 [0015] 本发明的第五目的是提供所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的培养物或所述的菌剂在制备食品、食品添加剂或保健品中的应用。 [0016] 本发明的第六目的是提供所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN或所述鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的培养物或所述的菌剂在制备酸奶或酸奶发酵剂中的应用。 [0017] 本发明的第七目的是提供一种酸奶发酵剂，所述的酸奶发酵剂包括所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN。 [0018] 本发明的第八目的是提供一种酸奶，通过所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN发酵得到。 [0019] 本发明的有益效果是： [0020] (1)本发明提供了一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)FMBL L23004CNN，于2023年06月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231099。 [0021] (2)所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN具有抑菌效果，能够抑制肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、肠道出血性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种6种病原微生物；可以用于制备抑制致病菌的药物、食品或食品添加剂； [0022] (3)所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN还具有耐胆盐能力、耐酸能力和代谢碳水化合物的能力； [0023] (4)所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对葡萄糖、乳糖、低聚果糖和低聚半乳糖均具有较好的利用能力，可以用于抑制腹泻，具有广阔的应用前景。附图说明 [0024] 图1鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的菌落图 [0025] 注：A.菌落形态；B.细胞革兰氏染色镜检形态 [0026] 图2系统发育树具体实施方式 [0027] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，以下实施例仅为说明性的，本发明并不受这些实例的限制。 [0028] 应当说明的是，以下实施例中，所用到的培养基配方如下： [0029] MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，K2HPO42.0 g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，琼脂粉18.0g，去离子水1000mL； [0030] PYG培养基(用于培养菌株CGMCC 1.9136)：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖1.0g，琼脂粉18.0g，去离子水1000mL； [0031] TSA培养基(用于培养菌株CGMCC 1.10754)：胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉18.0g，去离子水1000mL； [0032] 营养琼脂培养基(用于培养菌株CICC10411、CICC10420、CICC10421、CICC21530)：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉18.0g，去离子水1000mL。 [0033] 表1致病菌与培养基 [0034] [0035] 实施例一、菌株分离、鉴定 [0036] 采集自新疆维吾尔自治区伊宁市健康儿童的新鲜粪便样品，通过梯度稀释涂平板的方法，在厌氧条件下培养、分离菌株，根据菌落特征、细胞形态筛选出1株菌，将其命名为FMBL L23004 CNN。 [0037] 利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株DNA，采用groEL基因引物(GroEL‑Lac‑F：5＇‑GCY GGT GCWAAC CCN GTT GG‑3＇，GroEL‑Lac‑R：5＇‑AAN GTN CCV CGVATC TTG TT‑3＇)进行PCR扩增，产物送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。 [0038] 菌落呈圆形，乳白色，中间凸起，表面光滑不透明，边缘整齐，质地黏稠(图1A)；革兰氏阳性的杆状(图1B)纯培养物，将获得的序列提交到GenBank数据库中进行BLAST在线比对并下载相似序列，构建系统发育树。结果表明，菌株FMBL L23004 CNN为鼠李糖乳酪杆菌，拉丁名：Lacticaseibacillus rhamnosus FMBL L23004 CNN，于2023年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231099，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，电话(027)‑68754052，E‑mail：cctcc@whu.edu.cn。 [0039] 以下实施例中，将鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)FMBL L23004 CNN简写为鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN。 [0040] 实施例二、鼠李糖乳酪杆菌FMBLL23004 CNN抗腹泻效应 [0041] 1.实验方法 [0042] 病原指示菌：肠道致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coil EPEC O127:K63 CICC 10411)、产肠毒素大肠埃希氏菌(Escherichia coil ETEC O78:K80 CICC 10421)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium CICC 10420)、肠道出血性大肠埃希氏菌(Escherichia coil EHEC O157:H7 CICC 21530)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136)、肠沙门氏菌肠亚种(Salmonella enterica subsp.Enterica CGMCC 1.10754)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。 [0043] (1)指示菌菌悬液制备：将6种指示菌分别接种至相应的液体培养基中，37℃培养18h，离心、洗涤后用无菌生理盐水调整菌悬液浓度至7log CFU/mL。 [0044] (2)发酵上清液的制备：实验菌株以2％接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，离心后，用0.22μm的无菌滤膜过滤上清液，得到无细胞发酵上清液。 [0045] (3)牛津杯法测定抑菌特性：取100μL指示菌菌悬液，均匀涂布在相应的固体培养基上，等距放置3个无菌牛津杯，并加入200μL发酵上清液后置于4℃冰箱扩散4小时，在37℃恒温培养24h后，观察、测定抑菌圈直径，结果取平均值， [0046] 2.实验结果 [0047] 鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对不同菌株的抑菌活性如表3所示，鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN能够抑制指示菌的生长。 [0048] 表3鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对不同菌株的抑菌活性分析 [0049] [0050] 注：同一列内不同字母代表差异显著性(P<0.05) [0051] 实施例三、鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的益生特性 [0052] 1.实验方法 [0053] (1)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN耐酸性评估 [0054] 用1mol/L的HCl调整MRS液体培养基pH分别为2.5、3.5和4.5，并灭菌。菌株FMBL L23004 CNN活化两次后按照2％接种至不同pH值的MRS液体培养基中，37℃分别培养2h和4h，进行梯度稀释，稀释液均匀涂布到MRS固体平板，37℃厌氧培养24h，进行活菌计数，实验设置3个重复。 [0055] (2)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN胆盐耐受性评估 [0056] 补充猪胆盐，制备终浓度分别为0.1％、0.3％和0.5％无菌MRS液体培养基，将菌株活化两代后，按照2％接种，37℃厌氧培养，2h、4h分别取样，梯度稀释涂布于MRS固体平板上，37℃厌氧培养24h，进行活菌计数，实验设置三个重复。 [0057] (3)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN自聚集能力与疏水性 [0058] 自聚集能力：将活化好的菌株离心后用等体积的PBS缓冲液洗涤两次并重悬，调整菌悬液OD600为0.6±0.05(A0)。取6mL菌悬液至20mL试管，涡旋振荡2min，室温静置2h，取1mL上清液测定OD600值(A1)，实验重复三次，按照以下公式计算自凝集能力。 [0059] 自聚集能力(A％)＝(1‑A1/A0)×100％ [0060] 疏水性：取3mL上述OD600为0.6±0.05(A0)的菌悬液与1mL二甲苯涡旋振荡30s，静止10s，再次振荡30s，室温静置2h后测定水相的OD600(At)。实验重复三次，按照以下公式计算菌株细胞表面疏水性。 [0061] 表面疏水性(CSH％)＝[1‑(A0‑At)/A0]×100％ [0062] (4)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN在模拟胃肠液消化过程中的存活能力评估[0063] 鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN活化后以2％接种量接种到MRS液体培养基中37℃厌氧培养18h。6000r/min离心10min并用PBS将菌株细胞洗2次后重悬于等量的人工模拟胃液中(pH2.5，0.3％胃蛋白酶)，37℃厌氧箱中静置3h。模拟胃液处理后再次离心并用PBS清洗三次，重悬于等量的人工肠液中(pH7.4，0.3％胆盐，0.1％胰蛋白酶)，厌氧箱中37℃分别静置3h、6h、9h，进行梯度稀释。实验设置三个重复，通过菌落平板计数法，计算活菌数量。 [0064] (5)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN利用碳水化合物的特性 [0065] 实验组将不同糖的母液用0.22μm无菌滤膜过滤除菌后替代液体MRS培养基中的葡萄糖，MRS培养基作为阳性对照组，不加糖的MRS培养基为空白对照。活化后的菌液用无菌PBS清洗并重悬，按2％的比例接种到实验组和对照组培养基中，37℃厌氧培养24h，测量OD600，实验设置三个平行。 [0066] 2.结果 [0067] (1)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN利用碳水化合物的特性 [0068] 鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对菊糖、抗性淀粉、低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、D‑棉子糖、水苏糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、乳糖以及葡萄糖的利用效果较好，对D‑海藻糖和麦芽糊精的代谢能力较差，如表4所示。 [0069] 表4鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN利用碳水化合物的能力 [0070] [0071] 注：不同字母代表差异显著性(P<0.05) [0072] (2)鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN耐酸、耐胆盐特性 [0073] 酸和胆盐耐受性是菌株能够在肠道中存活、生长并发挥益生作用的前提，这些特性也作为评估乳酸菌菌株作为益生菌开发候选菌株的选择标准之一。一般来说，人体胆汁的胆盐浓度从0.3％到0.5％不等，因此对胆汁的耐受性是使乳酸菌能够在小肠中存活、生长和保持活性的重要特征。由表5可知耐受胆盐4h后，鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的活菌数可达到4.86log CFU/mL。表6可知菌株在酸的耐受性较好，4h后pH2.5处理下仍有10％以上的存活率。 [0074] 表5鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对胆盐的耐受性 [0075] [0076] 注：同一行内不同字母代表差异显著(P<0.05) [0077] 表6鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对酸的耐受性 [0078] [0079] 注：同一行内不同字母代表差异显著(P<0.05) [0080] (3)抑菌鼠李糖乳酪杆菌自凝集性和疏水性分析 [0081] 由表7可知，鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN自凝集性和疏水性较好。 [0082] 表7抑菌鼠李糖乳酪杆菌的自凝集性与疏水性分析 [0083] [0084] (4)抑菌鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN在胃、肠液中存活能力评估 [0085] 由表8可知，经胃液处理3h后，鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN的存活率可达7.66log CFU/mL，再经肠液处理6h后，菌株存活率明显下降，存活率为3.35log CFU/mL。 [0086] 表8鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN在模拟消化过程中的存活能力评估[0087] [0088] 注：字母代表差异显著(P<0.05) [0089] 实施例四、抗生素敏感性 [0090] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN是从健康成人的鲜粪便中分离得到的益生菌，从细菌来源上保证其安全性和有效性。另外，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN在人类肠道环境中定殖和繁殖后，仅仅是依附于宿主的肠上皮细胞，能够成为肠道粘膜的一层生物屏障，提升宿主肠道粘膜屏障能力，并且可以活菌形式直接作用于人体，保证了安全性。 [0091] 1.实验方法 [0092] 将鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN以2％接种量于37℃厌氧培养24h后，100μL7 (约1×10cfu/mL)菌液涂布在MRS固体培养基表面，将药敏纸片(英国Oxoid公司)分别轻压紧贴于培养基中间，37℃厌氧培养24h，观察药敏片抑菌情况，测量药敏片抑菌圈直径。药敏片信息如表9所示。 [0093] 表9药敏纸片信息 [0094] [0095] [0096] 2.实验结果 [0097] 如表10所示，可知鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对庆大霉素、阿卡米星、万古霉素、替卡拉宁、诺氟沙星、多粘霉素、卡那霉素和环丙沙星具有耐药性，对青霉素、氨苄西林、头胞嘧啶、克林霉素、四环素、米诺环素、氯霉素、利福平、羟氨苄青霉素和红霉素较为敏感。 [0098] 表10两株菌的抗生素敏感性 [0099] [0100] 注：R：耐药；I：中度敏感；S：敏感 [0101] 综上所述，本发明提供了一种鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)FMBL L23004 CNN，于2023年06月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231099。所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN具有抑菌效果，能够抑制肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型、肠道出血性大肠埃希氏菌、单核增生李斯特氏菌、肠沙门氏菌肠亚种6种病原微生物；可以用于制备抑制致病菌的药物、食品或食品添加剂；所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN还具有耐胆盐能力、耐酸能力和代谢碳水化合物的能力；所述的鼠李糖乳酪杆菌FMBL L23004 CNN对葡萄糖、乳糖、低聚果糖和低聚半乳糖均具有较好的利用能力，可以用于抑制腹泻，具有广阔的应用前景。

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