[0001] 本发明属于微生物工程领域，涉及一种动物双歧杆菌乳亚种的新应用，具体地说是动物双歧杆菌乳亚种i797在制备护眼产品中的应用。

[0002] 视疲劳，或称眼疲劳，是一种眼科常见病，它所引起的眼干、眼涩、眼酸胀，视物模糊甚至视力下降直接影响着人的工作与生活。眼疲劳主要是由于人们平时全神贯注看电视、电脑或手机等电子产品屏幕时，眼睛眨眼次数减少，造成眼泪分泌相应减少，同时闪烁荧屏强烈刺激眼睛而引起的。眼疲劳还会引发和加重各种眼病。

[0003] 现代人的工作生活休闲方式带来了过度用眼的问题，视疲劳常常困扰着学生、上班族。缓解眼睛疲劳的最佳方式是让眼睛休息。但是紧张的学习和工作通常不能让眼睛得到足够的休息。一系列护眼、缓解视疲劳的产品应运而生。

[0004] 然而缓解视疲劳的产品多为滴眼液、眼贴，对于视疲劳只带来短时间的缓解，益生菌则能够在肠道定植，具有持续的作用。但是益生菌具有菌株特异性，并不是所有益生菌菌株都具有缓解视疲劳和防止眼部细胞凋亡的作用。

[0005] 动物双歧杆菌乳亚种是一类专性厌氧、不产生芽胞的革兰氏阳性细菌，其在系統分类学上属于放线菌门、双歧杆菌属、乳亚种。其中代表菌株BB‑12是目前应用最广、发表相关论文最多的益生菌菌株，在体外和人群实验中均证明了其在提高免疫、调节肠道及口腔健康、缓解上呼吸道感染方面的作用。但目前还没有关于动物双歧杆菌乳亚种应用于缓解视疲劳方面的研究。

[0006] 本发明的目的，旨在要提供动物双歧杆菌乳亚种i797在制备护眼产品中的应用，其能够缓解视疲劳，拓宽动物双歧杆菌乳亚种的应用范围。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0008] 一种动物双歧杆菌乳亚种i797在制备护眼产品中的应用。

[0009] 作为一种限定，所述护眼产品为具有缓解视疲劳功效的食品或药品。

[0010] 作为另一种限定，所述护眼产品包括具有缓解视疲劳功效的奶粉、酸奶及益生菌剂。

[0011] 作为第三种限定，所述护眼产品中含动物双歧杆菌乳亚种i797活菌数为2×106‑510
×10 CFU/g或CFU/mL。

[0012] 本发明中：

[0013] 动物双歧杆菌乳亚种i797，该菌菌株已于2019年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp.lactis。

[0014] 由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

[0015] 本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种i797在护眼产品中的应用，该动物双歧杆菌乳亚种i797具有缓解视疲劳的功效，体外模拟实验中证明其具有良好的肠上皮细胞黏附作用，可长期定植体内发挥功效；斑马鱼模型实验中证明其能够显著防止眼部细胞凋亡，可用于制备具有缓解视疲劳功效的奶粉、酸奶及各类益生菌剂。

[0016] 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

[0017] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

[0018] 下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0019] 下述实施例中：

[0020] 动物双歧杆菌乳亚种i797，该菌菌株已于2019年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.18403，拉丁文名称是Bifidobacterium animalis subsp.lactis；

[0021] 长双歧杆菌长亚种i772，该菌菌株已于2020年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.19856，拉丁文名称是Bifidobacterium longum subsp.longum；

[0022] 短双歧杆菌i1088，该菌菌株已于2023年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.27281，拉丁文名称是Bifidobacterium breve；

[0023] 两歧双歧杆菌i771，该菌菌株已于2020年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.19855，拉丁文名称是Bifidobacterium bifidum；

[0024] 商业菌株1，由君乐宝微生物保藏中心(JMCC)提供，分离自市售酸奶,经鉴定为动物双歧杆菌；

[0025] 商业菌株2，由君乐宝微生物保藏中心(JMCC)提供，分离自市售即食型益生菌粉，经鉴定为鼠李糖乳杆菌。

[0026] 下述实施例中：

[0027] 改良固体MRS培养基：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1mL/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.25g/L、L‑半胱氨酸0.5g/L、琼脂15.0g/L及蒸馏水1L，pH值为6.2‑6.5；

[0028] 改良液体MRS培养基：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1mL/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.25g/L、L‑半胱氨酸0.5g/L及蒸馏水1L、pH值为6.2‑6.5；

[0029] 人工胃液：NaCl 0.2g/100mL、胃蛋白酶0.35g/100mL，用浓度为1mol/L的HCl调整pH值为3.0后，过滤除菌备用；

[0030] 人工肠液：将胰腺液(重碳酸钠1.1g/100mL、NaCl 0.2g/100mL及胰蛋白酶0.1g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用)和胆汁液(胆盐0.9g/100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用)以体积比2∶1混合；

[0031] 高密度培养基：大豆蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、无水乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温80 1g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.054g/L、碳酸钙5g/L、无水葡萄糖30g/L及L‑半胱氨酸盐酸盐5g/L，pH值为7.2；

[0032] 冻干保护剂：按质量百分比计，脱脂奶粉12％、海藻糖1％、甘油3％、谷氨酸钠1％与水83％，pH值为5.6；

[0033] 霉酚酸吗啉乙酯(批号：H14J6335)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

[0034] 吖啶橙(批号：C12894919)，购自上海麦克林生化科技有限公司。

[0035] 实施例动物双歧杆菌乳亚种i797在护眼产品中的应用

[0036] 本实施例公开了动物双歧杆菌乳亚种i797用于制备益生菌剂，缓解视疲劳的应用，具体验证实验如下：

[0037] 一、肠胃液耐受能力

[0038] 取动物双歧杆菌乳亚种i797菌株、商业菌株1和商业菌株2，接种于改良液体MRS培养基中，分别活化3代后取1mL，分别接种于9mL经过过滤除菌处理的pH值为3.0的人工胃液中，震荡均匀并在37℃条件下培养，在培养0h和2h时分别取样，接种于改良固体MRS培养基上，倒平板法测定活菌数(倒平板前每100mL改良液体MRS培养基加入1支莫匹罗星锂盐)，然后分别取在pH值为3.0的人工胃液中培养2h后的培养液1mL，分别接种于9mL经过过滤除菌处理的pH值为8.0的人工肠液中，震荡均匀并继续置于37℃条件下培养，在培养0h和4h时分别取样，接种于改良固体MRS培养基上，倒平板法测定活菌数，并计算菌株存活率，计算公式如下：

[0039] 胃液存活率(％)＝(cfu N1/cfu N0)×100％

[0040] 其中，N1为经胃液培养2h的活菌数，N0为经胃液培养0h的活菌数

[0041] 肠液存活率(％)＝(cfu N2/cfu N1)×100％

[0042] 其中，N2为经肠液培养4h的活菌数(即经胃液培养2h再经过肠液培养4h的活菌数)，N1为经肠液培养0h的活菌数(即经胃液培养2h的活菌数)

[0043] 消化液存活率(％)＝(cfu N2/cfu N0)×100％

[0044] 其中，消化液为胃液和肠液，N2为胃液培养2h再经过肠液培养4h的活菌数，N0为经胃液培养0h的活菌数

[0045] 菌株存活率结果如表1所示：

[0046] 表1菌株肠胃液耐受能力测试结果

[0047]菌株 胃液存活率 肠液存活率 消化液存活率
动物双歧杆菌乳亚种i797 6.4％ 116％ 7.4％
商业菌株1 6.8％ 66.7％ 4.5％
商业菌株2 96％ 0.13％ 0.13％

[0048] 具有良好的胃酸及肠液耐受能力能够保证益生菌活着到达肠道发挥作用，能否耐受酸胁迫和碱胁迫，是益生菌能否以活菌形式到达人体肠道并发挥作用的关键指标，由表1可以看出动物双歧杆菌乳亚种i797在胃液中2h存活率为6.4％，在肠液中活菌数不仅没有下降还略有增长，经过2h胃液和4h肠液处理后存活率达到7.4％，较两株商业菌株具有更好的消化液存活率，能够保证足够的活菌数量到达肠道发挥其益生作用。

[0049] 二、肠上皮细胞粘附能力

[0050] 取动物双歧杆菌乳亚种i797菌株、商业菌株1和商业菌株2，接种于改良液体MRS培9
养基中，分别活化3代后取1mL，以4000rmp的转速离心5min，此时的菌悬液浓度在10CFU/ml左右，用PBS缓冲液洗菌2次，后在5ml离心管内用1mlDMEM重悬；

[0051] 将培养好的Caco‑2细胞用胰酶消化，用DMEM完全培养基调整细胞悬液浓度为5×5
10个/mL，将调整好浓度的细胞铺于24孔板中，放入37℃(5％CO2)的培养箱中，观察直至细胞铺板为止，模拟肠上皮组织；

[0052] 将24孔板内的细胞培养液吸出后，用PBS缓冲液冲洗一遍，每孔加1ml菌悬液，每个菌悬液浓度做2个重复，计初始菌悬液的菌落总数，放至37℃二氧化碳培养箱中孵育3h；

[0053] 孵育完成后，用PBS缓冲液洗菌4次，用1ml灭菌的1％(v/v)Triton×100裂解，裂解完成进行梯度稀释，检测粘附于细胞的菌株数量(稀释方法：取300μL至2.7ml盐水中)，置于37℃条件下培养3天，计菌落总数，结果如表2所示：

[0054] 表2菌株肠上皮细胞粘附能力实验结果

[0055]

[0056] 由表2可知，动物双歧杆菌乳亚种i797具有良好的肠上皮细胞粘附能力，较好的胃肠通过率和良好的肠上皮细胞粘附能力保证了动物双歧杆菌乳亚种i797能够长期存在于受试者肠道中，发挥其益生作用。

[0057] 三、缓解视疲劳能力

[0058] 1.实验材料

[0059] 益生菌母液：

[0060] 将活化的动物双歧杆菌乳亚种i797菌株以2％的接种量接种至高密度培养基中，发酵培养18h后终止发酵，离心获得菌泥，将菌泥与冻干保护剂以1:2的重量比混合30min，随即以4℃/min的降温速度，将温度降至‑35℃～‑40℃，保持24min，进行冻干，冻干完成后，将冻干菌体放入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的产品过40目筛，于‑80℃的环境中贮藏，即得6 10
活菌数在2×10‑5×10 CFU/g范围的动物双歧杆菌乳亚种i797益生菌剂；

[0061] 长双歧杆菌长亚种i772、短双歧杆菌i1088及两歧双歧杆菌i771用相同的方法制备益生菌剂；

[0062] 选取如表3所示活菌量的长双歧杆菌长亚种i772、短双歧杆菌i1088、两歧双歧杆菌i771及动物双歧杆菌乳亚种i797益生菌剂分别用标准稀释水配制成2.00mg/mL的益生菌母液，现配现用；

[0063] 实验动物：

[0064] 斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450‑550μS/cm；pH为6.5‑8.5；硬度为50‑100mg/LCaCO3)，由本公司养鱼繁殖中心提供，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2022‑0004，饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求，IACUC伦理审查号：IACUC‑2023‑6993‑01；

[0065] 野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。

[0066] 2.实验方法

[0067] 随机选取120尾年龄为1dpf的野生型AB品系斑马鱼置于6孔板中，每孔均处理30尾斑马鱼，设置为实验组，分别水溶给予3mL的益生菌液(分别将益生菌母液按不同稀释倍数稀释，得到益生菌液，使得益生菌液中的益生菌活菌量相同，益生菌液活菌量见表3)；同时随机选取30尾年龄为1dpf的野生型AB品系斑马鱼置于6孔板中，设置为对照组，给予3mL水。各组均水溶给予霉酚酸吗啉乙酯建立斑马鱼视疲劳模型，28℃处理24h后，用吖啶橙(AO)进行染色，染色结束后每组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS‑Elements D 
3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析眼部凋亡细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价菌液缓解视疲劳的功效，统计学处理结果采用mean±SE表示，用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义，同时可参考公开号为“CN 
113496071A”的发明专利所公开的方法，将用于功效评价的斑马鱼用剂量转换为人服用量，实验结果如表3所示：

[0068] 表3菌液用量及缓解斑马鱼视疲劳功效实验结果

[0069]

[0070] 注：**表示与模型对照组比较，p<0.01

[0071] 研究表明视疲劳产生的主要生理学机制有:氧化应激损伤、炎性损伤、细胞衰老以及视细胞损耗过度，当眼球处于长时间工作、高聚光、高氧压等状态下时，会使得眼外肌和睫状肌代谢速率增大，促使大量过氧化物及ROS等代谢产物堆积，从而造成眼部产生氧化应激损伤；此外ROS易氧化视网膜中的多不饱和脂肪酸，产生大量脂质过氧化，并进一步产生大量活性醛，活性醛与细胞内蛋白质及DNA结合后可引起细胞炎症和细胞调亡，进而诱发视疲劳。因此可以通过检测眼凋亡细胞情况评估样品改善视疲劳功效。

[0072] 斑马鱼眼部结构发育与人体相同，均由三种不同的胚胎组织发育而来的，斑马鱼在72hpf有视觉反应，此时视网膜类似于成人视网膜形态，在解剖学(不同视网膜层的结构特征、细胞排列的相似性)和功能上与人类相似，同时斑马鱼的眼部血管结构和视网膜结构与人高度相似，用霉酚酸吗啉乙酯可诱发斑马鱼眼细胞凋亡，可模拟人的眼部疾病，因此可以用斑马鱼眼部细胞凋亡程度表征样品改善视疲劳的功效。

[0073] 由表3可知，在此实验条件下，动物双歧杆菌乳亚种i797益生菌粉具有显著缓解视疲劳的功效，而长双歧杆菌长亚种i772、短双歧杆菌i1088和两歧双歧杆菌i771益生菌粉缓解视疲劳功效不明显。

[0074] 动物双歧杆菌乳亚种i797也可以用于制备具有缓解视疲劳功效的酸奶或奶粉，或者其他食品或药品。