一种改善肺部健康的益生菌发酵百合组合物及其制备方法和应用 |
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| 申请号 | CN202311544417.X | 申请日 | 2023-11-20 | 公开(公告)号 | CN117625450A | 公开(公告)日 | 2024-03-01 |
| 申请人 | 兰州大学; | 发明人 | 李祥锴; 季晶; 阿曼·汗; 令桢民; 刘璞; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种改善 肺 部健康的 益生菌 发酵 百合组合物及其制备方法和应用，属于 生物 技术领域。该发酵粘液乳杆菌保藏编号：CCTCC NO:M 20231858。所述发酵组合物为从浆 水 中分离的发酵粘液乳杆菌GR‑3与百合球茎共发酵组合物。发酵粘液乳杆菌GR‑3通过发酵增加百合球茎中天然活性化合物的游离，并提高生物利用度。游离出的天然产物具有较强的体外自由基清除能 力 。该发酵组合物可以有效限制吸入的 炭黑 纳米颗粒沉积、减轻肺部组织损伤和降低促炎细胞因子，恢复肺部有益 微生物 群和缓解 炎症 。本发明中发酵组合物用于改善肺部健康，在食品、保健品、药品等领域具有广泛的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)GR‑3，其特征在于，于2023年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO:M 20231858。 |
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| 说明书全文 | 一种改善肺部健康的益生菌发酵百合组合物及其制备方法和应用 技术领域背景技术[0002] 长期暴露于不利环境对肺部健康构成重大威胁。肺损伤的病因、发生和进展引起了人们对环境因素的关注。橡胶、塑料和染料工业释放的炭黑纳米颗粒(CBNP)、芳香烃、重金属和硝酸盐化合物污染了空气。污染的空气与呼吸道持续接触，可能通过引发炎症损伤 和氧化损伤，促进包括肺癌在内的肺部问题的发展。除环境因素，病原菌、病毒、寄生虫等都与呼吸系统密切接触、易引起肺部感染。临床治疗肺部感染常见药物包括来氟米特，双氢青蒿素、细胞因子靶向药物和糖皮质激素，用于缓解肺纤维化和肺损伤，但频繁和长期使用这些药物也会对健康造成副作用。 [0003] 传统药用资源，特别是植物在治疗多种疾病方面发挥着重要作用，例如与合成药物相比，在发展中国家，约33％的传统疗法用于治疗伤口和促进愈合。植物来源的生物活性化合物，如甾醇维生素、多酚、硫酸多糖和omega‑3，由于其抗氧化、抗炎和免疫调节特性，可以改善环境和生物因素引起的呼吸系统损伤。然而，植物提取物中天然化合物的生物利用 度有限，阻碍了其对抗肺损伤等疾病的作用。因此，通过提高活性化合物的生物利用度，可以潜在地使活性化合物带来更大的健康益处。例如，利用纳米颗粒可以增强山奈酚的抗氧 化活性和溶解度。同样，与游离姜黄素相比，聚乳酸‑乙醇酸纳米粒子将姜黄素的生物利用度提高了5.6倍。然而这种方法既昂贵又不安全。因此，需要安全且廉价的技术来提高植物中天然化合物的生物利用度以产生长期影响。 [0004] 用益生菌发酵植物会改变化合物的化学结构和多糖组成。益生菌可调节蔬菜和植物中的葡萄糖和脂质代谢，与未发酵蔬菜和植物的相比，经发酵后的组合物具有促进免疫 功能和抗糖尿病的作用。例如兰花百合的球茎提取物与酿酒酵母一起培养，增加了多糖产 量和蛋白质去除率。而用植物乳杆菌发酵的兰州百合由于更有效地调节糖脂代谢而具有抗 氧化潜力。然而，尽管目前益生菌发酵会影响生物活性化合物，但缺乏能够通过发酵提升百合球茎的肺部炎症治疗价值的益生菌。 发明内容[0006] 本发明提供的第一个技术方案是一株发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)GR‑3，于2023年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址： 中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:M 20231858。 [0007] 所述发酵粘液乳杆菌GR‑3具有如下特性： [0008] (1)菌体特征：细胞呈长杆形，无芽胞和鞭毛。 [0009] (2)菌落特征：发酵粘液乳杆菌GR‑3在MRS固体培养基中生长良好，菌落呈乳白色、圆形、凸起，边缘光滑。 [0010] (3)16S rRNA基因序列特征：如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，通过Blastn比对，发酵粘液乳杆菌GR‑3中的16S rRNA基因序列与已发表的发酵粘液乳杆菌中的16S rRNA基因 的最高相似度在99.52％～99.86％之间。 [0011] (4)发酵粘液乳杆菌GR‑3发酵可以显著提高百合球茎有益营养成分和化学成分组成。 [0012] 本发明提供的第二个技术方案为含有第一个技术方案所述发酵粘液乳杆菌GR‑3的微生物制剂。 [0013] 在某些实施方式中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3在所述微生物制剂中的添加量不少6 6 于1×10CFU/mL或1×10CFU/g。 [0014] 进一步，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3在所述微生物制剂中的添加量不少于1×9 9 10CFU/mL或1×10CFU/g。 [0015] 本发明提供的第三个技术方案是含有第一个技术方案所述发酵粘液乳杆菌GR‑3或第二个技术方案所述的微生物制剂的组合物。 [0016] 在某些实施方式中，所述组合物含有第一个技术方案所述的发酵粘液乳杆菌GR‑3或第二个技术方案所述的微生物制剂作为发酵微生物制备的百合发酵产品。 [0017] 在某些实施方式中，所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3的数量≥1×6 6 10CFU/mL或≥1×10CFU/g。 [0018] 在某些实施方式中，所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3的数量≥1×9 9 10CFU/mL或≥1×10CFU/g。 [0019] 在某些实施方式中，所述组合物中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3为活菌株、干菌株、或灭活的菌株。 [0020] 在某些实施方式中，所述组合物中，有效成分为所述发酵粘液乳杆菌GR‑3的代谢物。 [0021] 本发明提供的第四个技术方案是一种发酵产品，所述发酵产品是利用百合将第一个技术方案所述的发酵粘液乳杆菌GR‑3或第二个技术方案所述的微生物制剂作为发酵微 生物，进行发酵。 [0023] 进一步，所述百合球茎浓度为54g/L，所述发酵温度为35℃，所述发酵pH为7。 [0024] 在某些实施方式中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3在所述发酵产品中的添加量不少于9 9 1×10CFU/mL或1×10CFU/g。 [0026] 在某些实施方式中，所述发酵产品包括固态产品、液态产品或半固态产品。 [0027] 本发明提供的第五个技术方案是第四个技术方案所述的发酵产品在制备预防、治疗和/或改善肺部炎症的产品中的应用。 [0028] 在某些实施方式中，所述应用至少包括如下一种作用： [0029] (1)降低个体肺组织促炎细胞因子的水平； [0030] (2)缓解个体肺组织损伤； [0031] (3)恢复个体肺部有益微生物群。 [0032] 进一步，所述肺部有益微生物群包括乳杆菌属(Lactobacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳球菌属(Lactococcus)和鼠杆菌属(Muribacter)。 [0033] 在某些实施方式中，所述应用对象包括但不限于人类。 [0034] 在某些实施方式中，所述肺部炎症为环境污染物、致病菌引起的肺部炎症。 [0035] 进一步，所述环境污染物包括但不限于硫氧化物、颗粒物质、汞、铅或挥发性有机物。 [0036] 进一步，所述致病菌包括但不限于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感病毒和肺炎支原体等。 [0037] 在某些实施方式中，所述肺部炎症是指由免疫损伤、理化因素、病原微生物引起肺部炎症。 [0038] 在某些实施方式中，所述产品为药物、功能性食品或保健品。 [0039] 进一步，所述药物同时还含有药物载体和/或药用辅料。 [0041] 进一步，所述药物的剂型是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。 [0042] 本发明提供的第六个技术方案第一个技术方案所述的发酵粘液乳杆菌GR‑3或第二个技术方案所述的微生物制剂作在制备发酵食品中的应用。 [0043] 在某些实施方式中，所述应用包括但不限于将所述发酵粘液乳杆菌GR‑3作为发酵微生物，利用食品原料进行发酵。 [0044] 在某些实施方式中，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3在所述发酵食品中的添加量不少于6 6 1×10CFU/mL或1×10CFU/g。 [0045] 进一步，所述发酵粘液乳杆菌GR‑3在所述发酵食品中的添加量不少于1×109CFU/9 mL或1×10CFU/g。 [0046] 在某些实施方式中，所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品或其他含有发酵粘液乳杆菌GR‑3的发酵食品。 [0047] 在某些实施方式中，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪。 [0048] 在某些实施方式中，所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜以及其他可食用的果蔬中的一种或两种以上的制品。 [0049] 在某些实施方式中，所述发酵食品还含有添加剂，所述添加剂选自香料、果蔬汁、花茶汁、着色剂、酸度调节剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂、甜味剂中的一种或两种以上的组合。 [0050] 在某些实施方式中，所述发酵食品的加工形态包括固态食品、液态食品或半固态食品。 [0051] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果： [0052] 本发明从甘肃省浆水中分离筛选获得一株发酵粘液乳杆菌GR‑3可以将纤维素物质降解为不同的代谢产物，从而改善百合球茎的理化性质、化学结构和天然化合物含量。发酵粘液乳杆菌GR‑3可通过发酵使百合中长链碳降解，增加蛋白质的去除，同时提高了百合中十六烷酸甲酯，22‑四羟基‑5α‑胆甾坦‑6‑酮‑3‑O‑β‑D‑别吡喃苷，22‑O‑(6‑脱氧‑α‑L‑吡喃甘露糖基)‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑孕‑5‑en‑20‑酮，1‑O‑反式阿魏酰甘油和3,4二羟基苯甲酸等活性成分的含量，进而使发酵百合组合物的还原能力和1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼自由基、超氧阴离子和羟基自由基清除率和抗坏血酸相当。发酵组合物阻断了炭黑纳米 颗粒吸入暴露小鼠模型中肺组织损伤，降低肺部炎症。肺组织中免疫调节因子IFN‑γ、TNF‑α、IL‑10和IL‑6降低了4.3‑7倍，降低了小鼠肺组织中内源性抗氧化标记物，可以治疗肺部炎症并恢复肺部微生物群。同时，发酵组合物中还含有发酵粘液乳杆菌GR‑3，经过实验验证，发酵粘液乳杆菌GR‑3在抗氧化和改善肺部炎症反应上具有突出效果。因此，发酵粘液乳杆菌GR‑3发酵百合组合物改善了肺部健康，用于开发改善肺部健康的功能性菌剂、食品或药物，作为用于改善肺部健康的新手段，具有广阔的应用前景。 [0053] 生物材料保藏 [0054] 发酵粘液乳杆菌GR‑3，分类命名为Limosilactobacillus fermentum GR‑3，已于2023年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:M 20231858。 附图说明 [0055] 图1为发酵粘液乳杆菌GR‑3在MRS平板上生长的菌落形态。 [0056] 图2为发酵粘液乳杆菌GR‑3的16S rRNA系统发育树图(A)和发酵粘液乳杆菌GR‑3在扫描电镜下的形态特征(B)。 [0057] 图3为使用GR‑3和其他益生菌分别发酵百合36h后蛋白质去除率(A)；GR‑3发酵过程中pH和百合球茎浓度(B)、温度和浓度(C)、pH和温度对蛋白质去除率的影响(D)。 [0058] 图4为GR‑3发酵百合球茎后的微生物群落门(A)、科(B)、属(C)和物种(D)水平分析；百合生球茎(LRB，对照)、百合发酵球茎(LFB)和GR‑3发酵百合球茎(LFB‑GR‑3)的傅里叶红外光谱(E)和热重分析(F)。 [0059] 图5是百合生球茎(LRB)和GR‑3发酵百合球茎的提取物(LFB+GR‑3)薄层色谱分析(A)，LFB(B)和LFB+GR‑3(C)提取物的GC‑MS光谱，LFB和LFB+GR‑3提取物中鉴定出的部分化合物的结构(D)。 [0060] 图6是GR‑3发酵百合球茎后提取物(LFB+GR‑3Fraction)和抗坏血酸(Ascorbic acid)标准品的抗氧化潜力，1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH，A)、超氧阴离子(B)、羟基自由基清除能力(C)和还原能力(D)。 [0061] 图7为动物实验设计方案(A)，实验分组为对照(Control)、炭黑纳米颗粒暴露组(CBNP)、CBNP暴露+GR‑3发酵百合球茎提取物治疗组(CBNP‑LFB+GR‑3Fraction)和GR‑3发酵百合球茎提取物处理组(LFB+GR‑3Fraction)；肺组织的苏木精和伊红染色分析(B)，以及 24h、14d和28d时支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞巨噬细胞(C)、淋巴细胞(D)和中性粒细胞(E)的定量。肺组织评分评估(F)和气道巨噬细胞碳含量(G)的定量分析。ns表示不显 着，**P<0.006，***P<0.005，****P<0.0001。 [0062] 图8为GR‑3发酵百合提取物组分对CBNP暴露24h、14d和28d小鼠BALF中血清炎症因子IFN‑γ(A)、TNF‑α(B)、IL‑10(C)和IL‑6(D)的影响；**P<0.006，****P<0.0001。 [0063] 图9为GR‑3发酵百合提取物对暴露于CBNP的小鼠肺微生物群多样性的影响。肺微生物群门(A)、属(B)和种(C)水平的相对丰度；Shannon指数(D)和Chao1指数(E)分析。计算并比较对照组、CBNP‑LFB+GR‑3Fraction、CBNP和LFB+GR‑3Fraction组小鼠中各个属的相对丰度(F)。 具体实施方式[0064] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。应理解具体实施例仅用于解释本发明，并不以任何方式构成对本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用材料、试剂和仪器，均可从商业途径得到。 [0065] 下述实施例中涉及的培养基如下： [0066] MRS肉汤培养基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，醋酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05。固体培养基加入20g琼脂。 [0067] 下述实施例涉及的检测方法如下： [0068] 1、傅里叶红外光谱(FTIR)检测：使用Vector 33光谱仪(布鲁克公司，德国)记录‑1 FTIR光谱。光谱以透射率模式记录，范围为4000至400cm 。使用Pyris Diamond热重分析仪(Perkin Elmer，美国)进行热重分析。将3mg样品在氮气气氛下以10℃/min的速率从25℃加热至800℃。 [0069] 2、气质联用(GC‑MS)检测GR‑3发酵百合球茎活性成分：目标化合物的分子结构通过配备有Saturn 2200Mass检测器(检测温度220℃)的GC‑MS(Shimadzu)进行鉴定，毛细管柱：CP‑sil 5CB(30m 0.25mm,0.25μm)，柱温度：150‑260℃，速率8℃/min，载气：He(0.8mL/min)，进样温度：250℃，进样量：0.5μL，分流比：1/10。百合生球茎(LRB)用作原始对照。此外，将LRB和LFB‑GR‑3样品的25mg CHCl3级分溶解在0.5mL D2O中并冷冻干燥。将样品溶解在 0.5mL D2O中，在室温(25℃)下将其置于核磁管中，并使用JNM‑ECP600核磁共振(NMR)谱仪测定其H NMR和C NMR。 [0070] 3、1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH)自由基去除能力测定：将GR‑3发酵百合球茎的提取物组分按浓度为0.1、0.5、2.5、5和10mg/mL溶解在去离子水中以进行生物活性。在517nm处测量了GR‑3发酵百合球茎提取物对1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除效果。 [0071] 4、超氧阴离子清除能力测定：将1mL的5mmol/L FeSO4溶液、0.7mL的6mmol/L H2O2溶液和0.3mL的20mmol/L水杨酸混合均匀，静置10min，然后加入2mL样品溶液混匀，37℃放置1h，测定510nm吸光度。 [0072] 5、羟基自由基清除能力测定：加入0.2mL样品溶液、3mL Tris‑HCl缓冲液(pH＝8.2，0.05mol/L)和12μL浓度为30mmol/L的联苯三酚溶液，反应伴随着摇动5min。在320nm处测量混合物的吸光度。 [0073] 6、还原能力测定：取样品溶液1mL于带塞试管中，依次加入0.2mL的0.2mol/L磷酸缓冲液和0.5mL 1％(w/v)铁氰化钾溶液。将它们混合并在50℃的水浴中反应20min并冷却 至室温。添加1mL 10％(w/v)三氯乙酸溶液。然后加入0.2mL 0.1％(w/v)氯化铁和3mL蒸馏 水，混匀，静置10min，用蒸馏水调零，在700nm处测定吸光度。 [0074] 实施例1 [0075] 菌株筛选 [0076] 将购买的浆水分别混匀后稀释涂布到MRS琼脂培养基上。37℃培养24h后，挑取单菌落在MRS肉汤培养基中孵育24h后,离心提取DNA，通过16S rRNA基因测序来鉴定分离菌株 的系统发育特征，使用扫描电子显微镜(SEM；FEI Apreo S,USA)观察菌株形态特征。 [0077] 16S rDNA序列测定结果如SEQ ID No.1所示。 [0078] 结果如图1、图2所示，GR‑3在MRS固体培养基中生长良好，菌落呈乳白色、圆形、有光泽、凸起，边缘光滑，不透明(图1)。益生菌GR‑3的16S rRNA基因序列与已发表的发酵粘液乳杆菌中的16S rRNA基因的最高相似度在99.52％～99.86％之间(图2A),我们将其命名为发酵粘液乳杆菌GR‑3(Limosilactobacillus fermentum GR‑3)，以下简称GR‑3。GR‑3细胞呈长杆形，无芽胞，无鞭毛(图2B)。 [0079] 实施例2 [0080] GR‑3发酵百合球茎参数 [0081] 使用响应面优化法优化重要变量(百合球茎浓度、温度和pH值)。采用由20个实验运行组成的三因素和水平响应面优化法，包括中心点的重复。将刚洗好的百合球茎放入破 壁机中；然后以1:1(w/v)的比例添加蒸馏水并将样品粉碎一段时间。此后，在250mL锥形瓶中使用不同浓度的百合球茎将样品分成样品后进行均质化。将所有样本在121℃下灭菌 9 20min后，将活菌数为1×10 cfu/mL的1％活化GR‑3菌株接种到每个烧瓶中，然后相应调整 pH值。发酵结束后，采用苯酚‑硫酸法测定多糖含量，采用Bradford测定法测定蛋白质含量，采用硫酸‑咔唑比色法计算糖醛酸含量。 [0082] 结果如图3所示，与课题组保存的植物乳杆菌GR‑2，植物乳杆菌GR‑4和乳酸片球菌GR‑5菌株相比，发酵粘液乳杆菌GR‑3发酵的蛋白质去除率提高了10％‑50％(图3A)。因此，选择菌株GR‑3进行后续实验。pH、球茎浓度和温度之间的相互作用表明，在固定pH 7(图3B)、百合球茎浓度54g\L(图3C)，温度35℃(图3D)下，蛋白质去除率为90.10±2.2％，而改变温度和pH值后蛋白质去除率降低。因此，pH 7和35℃是百合球茎发酵的最佳条件。这一结果表明所建立的模型对于GR‑3百合球茎发酵是可靠的。 [0083] 理化分析如表1所示，GR‑3发酵百合球茎(LFB+GR‑3)中的多糖和葡萄糖醛酸含量分别比百合生球茎(LRB)低80.35％和1.12％，而蛋白质值增加LFB+GR‑3组从0.95％到 1.81％。该结果表明菌株GR‑3使兰州百合球茎的营养成分显着提高。 [0084] 表1发酵百合球茎的理化分析 [0085] [0086] 实施例3 [0087] GR‑3发酵百合球茎体系微生物群落分析 [0088] 按照试剂盒说明书(天根生物技术有限公司)，在发酵过程结束时提取体系微生物群落DNA，测定百合球茎发酵物的微生物多样性。发酵后的球茎在室温下干燥并使用研磨机磨成粉末。对粉末进行FTIR检测和热重分析。 [0089] 结果如图4所示，微生物分析显示GR‑3成功地定殖在LFB+GR‑3中，并且在常规发酵百合球茎(LFB)和LFB+GR‑3组中没有观察到厚壁菌门和变形菌门的显着差异(图4A)。在科水平上，LFB+GR‑3组中乳杆菌科占主导地位，其次是明串珠菌科(图4B)。梭菌属、明串珠菌属和肠杆菌属是LFB组中的优势属，而乳杆菌属是LFB+GR‑3组中的优势属(图4C和D)。这表明百合球茎与菌株GR‑3的发酵可以增加有益微生物群的丰度。傅里叶红外光谱表明， ‑1 3399.3cm 处的峰通常与羟基(‑OH)官能团(酚、羧酸和一些碳水化合物)相关，在LRB中很突‑1 ‑1 出，而在LFB+GR‑3中则减少。同样，与LRB相比，LFB+GR‑3组中2925cm (C‑H基团)、1415cm‑1 甲基(‑CH3)和1251.2cm (C‑O‑C醚键)处的峰也有所减少(图4E)。这些结果表明，GR‑3在发酵过程中分解了不同的官能团并增加了百合球茎的营养价值。热重分析还证实，与LRB相 比，LFB‑GR‑3的重量损失达到71.8％(图4F)，这表明百合球茎中长链碳发生剧烈降解和分解。 [0090] 实施例4 [0091] GR‑3发酵百合球茎活性成分分析 [0092] 将发酵后的百合球茎(10kg)在100℃下灭活10min以杀死GR‑3，然后在室温下用甲醇(3×10L)提取3次。使用旋转蒸发器在减压下蒸发溶剂。收集甲醇胶状提取物残余物 (373g)，然后在定期搅拌下悬浮于蒸馏水中，并分别用正己烷和氯仿(CHCl3)提取。用正己烷(3.5g)和氯仿(10g)制备提取后，蒸发溶剂。将CHCl3组分残余物进一步溶解在1L蒸馏水 中。设置硅胶柱色谱(300mm，4mm内径玻璃管)，然后分别用石油醚和乙酸乙酯(10:1)萃取。 将各级分用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。将生物活性CHCl3馏分进行柱层析，使用硅胶 (100‑200目，600g)作为吸附剂，并用石油醚进行洗脱。薄层色谱(TLC)分析在正相硅胶板(青岛海洋化工厂，中国青岛)上进行。目标化合物的分子结构通过GC‑MS鉴定。 [0093] 结果如图5所示，在TLC分析中，LFB‑GR‑3提取物(氯仿组分)中观察到了5种化合物，而LRB中仅检测到了一种化合物(图5A)。根据GC‑MS分析，在LFB‑GR‑3提取物中观察到5个不同的峰(图5B,C)，分别是十六烷酸甲酯，22‑四羟基‑5α‑胆甾坦‑6‑酮‑3‑O‑β‑D‑别吡喃苷，22‑O‑(6‑脱氧‑α‑L‑吡喃甘露糖基)‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑孕‑5‑en‑20‑酮，1‑O‑反式阿魏酰甘油和3,4二羟基苯甲酸(图5D)。表明GR‑3发酵增加了百合球茎中的化合物数量。 [0094] 实施例5 [0095] GR‑3发酵百合球茎提取物生物活性分析 [0096] 将GR‑3发酵百合球茎的提取物组分按浓度为0.1、0.5、2.5、5和10mg/mL溶解在去离子水中以进行1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除效果、超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力和还原能力测定。 [0097] 结果如6所示，LFB+GR‑3提取物(LFB+GR‑3Fraction)对DPPH自由基的清除率呈浓度依赖性，随着浓度的增加，清除效果明显增强(图6A)。与标准品抗坏血酸(Ascorbic acid)相比，10mg/mL的LFB+GR‑3提取物的超氧阴离子清除活性为60.4％(图6B)。LFB+GR‑3提取物中观察到的羟基自由基清除能力为49.6％(图6C)。提取物的还原能力如图6D所示， 吸光度为0.6。因此，用GR‑3发酵百合可提高生物活性化合物的水平。 [0098] 实施例6 [0099] GR‑3发酵百合球茎在改善小鼠肺部健康中的应用 [0100] (1)C57BL/6J小鼠(5‑6周龄，体重约17‑22g)购自兰州大学实验动物中心。将小鼠饲养在温度和湿度受控的清洁环境中，光/暗周期为12h。小鼠适应环境7天。根据动物利用协议，兰州大学伦理委员会遵循相关伦理行为和护理批准了该实验。根据动物实验设计方案如图7A所示，将小鼠分为四组：对照组(Control)、炭黑纳米颗粒暴露组(CBNP)，CBNP暴露+GR‑3发酵百合球茎提取物治疗组(CBNP‑LFB+GR‑3Fraction)和GR‑3发酵百合球茎提取物治疗组(LFB+GR‑3Fraction)(n＝9/组)。小鼠在暴露于0.5mg/L的炭黑纳米颗粒(CBNP)的第 24h、第14d和第28d，收集生物样本。28d后安乐死时收集血清。每组小鼠在CBNP暴露后和处死前立即称重，并且在CBNP单次暴露后每2天称重一次。另外，收获肺组织并称重并计算器官系数，然后液氮冷冻后保存在‑80℃。将血液在700g下离心，然后收集上清液并储存于‑80℃直至分析。 [0101] (2)通过向腹腔注射1％(wt/wt)戊巴比妥钠(8mL/kg)进行终末麻醉处死小鼠。暴露小鼠的胸腔，使用23号针将气管插管并结扎。用1mL冰冷的无菌D‑PBS将肺灌洗3次并合 并。支气管肺泡灌洗液(BALF)在2100g下离心10min，收集上清液，置于‑80℃冻存。将细胞沉淀重悬于PBS中，并制备细胞涂片。根据制造商的说明，用Diff‑Quik染色剂对细胞涂片进行染色，并用于测量总细胞计数。对细胞进行分类和计数，包括巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。另外，第一批灌洗液上清液单独保留进行分析。 [0102] (3)手术切除后，立即将肺在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。然后将组织脱水、石蜡包埋并切成4μm厚的切片。切片用H&E染色以检测形态变化。以盲法方式进行肺部病理学评分(每只小鼠4个连续H&E染色切片)。使用配备100×油浸物镜并安装Olympus DP72相机 的光学显微镜(Olympus，BX60，日本)随机选择50个染色良好、细胞质完整的巨噬细胞。相机的操作由cell Sens Standard系统控制，显微镜的焦平面与细胞核水平对齐，以提高样品 之间的一致性。50个巨噬细胞的平均碳面积用于量化数据分析中的CCAM。 [0103] (4)在暴露28天时从肺组织和气管样本中提取DNA。简而言之，将约30mg组织样品在含有蛋白酶K(0.2mg/ml)和溶菌酶(20mg)的1ml裂解缓冲液(10mM Tris‑HCl(pH 8.0)、 0.1M EDTA(pH 8.0)和0.5％ SDS中均质化，并在56℃摇动孵育2h。然后根据制造商的建议，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)将裂解物应用于DNA提取。扩增细菌16S rRNA基因 的V3‑V4片段并进行测序分析。基于标准化操作分类单元(OTU)数据进行α多样性和β多样性分析。Alpha多样性通过3个指数来表示，包括分析物种指数、Shannon指数和Chao1指数。 [0104] 肺组织学分析显示，与CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组相比，CBNP小鼠组的CBNP是均匀的，并在肺实质和支气管中积累，导致肺组织损伤(图7B)。这表明GR‑3发酵百合提取物可以清除肺组织中积累的有毒物质。此外，对肺BALF液中的炎症细胞浸润进行了定量，结果显示，CBNP组显著高于CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组，巨噬细胞(图7C)、淋巴细胞(图7D)和中性粒细胞(图7E)分别增加了15、18和10倍。结果表明，CBNP暴露可能通过产生肺组织促炎微环境而引起肺组织纤维化。肺组织的病理学评估显示，与CBNP暴露组相比，CBNP‑LFB+GR‑ 3Fraction组的病理评分降低(图7F)，肺部炎症缓解。此外，CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组中气道巨噬细胞(CCAM)中的碳含量也比CBNP组有所降低，而在对照组和LFB+GR‑3Fraction组中未检测到(图7G)。这些数据表明，GR‑3发酵百合球茎提取物可最大限度地减少肺部炎症和损伤。 [0105] GR‑3发酵百合提取物对BALF和肺组织调节因子的影响如图8所示，CBNP组的IFN‑γ比CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组高7倍(p<0.0001)(图8A)。此外，CBNP单独暴露28天后BALF中炎症因子TNF‑α、IL‑10和IL‑6的浓度分别是6.9、4.3和7倍，而CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组没有观察到显着升高(图8B，C和D)。 [0106] 在门、属和种分类水平上计算了CBNP暴露和CBNP‑LFB+GR‑3Fraction处理之间的肺微生物群落(图9)。与CBNP组相比，CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组分中变形菌门和厚壁菌门的相对丰度较高。CBNP组中的拟杆菌门、脱硫杆菌门比其他组显着增加(图9A)。值得注意的是与CBNP组相比，CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组小鼠的肺中有益属的相对丰度比更高(图9B)。 这可能是由于百合发酵提取物增加了有益菌的生长。使用Shannon和Chao1指数计算α多样 性以评估物种总数(图9D、E)。结果显示，与CBNP组相比，CBNP‑LFB+GR‑3Fraction组的Chao1指数和Shannon指数显着较高(p<0.065，p<0.0001)，CBNP‑LFB+GR‑3Fraction中乳杆菌属、埃希氏菌属、乳球菌属和鼠杆菌属的相对丰度在属分类水平上具有较高的相对丰度(图 9F)。该数据表明GR‑3发酵百合提取物治疗塑造了小鼠肺部微生物群，增加有益微生物的丰度。 |
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