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短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用
申请号	CN202311600747.6	申请日	2023-11-28	公开(公告)号	CN117617506A	公开(公告)日	2024-03-01
申请人	澳优乳业(中国)有限公司; 扬州大学;			发明人	顾瑞霞; 潘丽娜; 李丹丹; 康文丽; 张臣臣; 汪家琦; 李威;
摘要	本发明提供了短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用，具体地，所述短双歧杆菌菌株grx05可用于制备缓解便秘及调节肠道菌群的产品。所述短双歧杆菌菌株grx05(保藏编号为CGMCC 21589)来源于中国健康母亲的乳汁，在小鼠便秘模型中，短双歧杆菌菌株grx05能够调整肠道菌群，显著缩短首次排黑便时间，回调乙酰胆碱脂酶水平和一氧化氮水平，够减少潜在有害菌门和提高有益菌门的丰富度，改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。同时，其用于动物模型的数据优于鼠李糖乳杆菌LGG。短双歧杆菌菌株grx05可用于制备能够缓解功能性便秘的食品或药品，特别可用于缓解便秘的益生菌产品中。
权利要求	1.短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌株grx05在制备用于缓解便秘及调节肠道菌群的产品中的用途。 2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述缓解便秘及调节肠道菌群是指改善排便状态和肠运动状态，和/或松弛平滑肌，促进胃肠道运动；和/或改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。 3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述短双歧杆菌菌株grx05用于促进兴奋性神经递质AchE的分泌，降低抑制性神经递质NO的含量。 4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在门水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于降低脱硫菌门的相对丰度，提高拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度。 5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在属水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于增加乳杆菌属和/或和毛螺旋菌属的相对丰度，降低脱硫弧菌属的相对丰度。 6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品为食品。 7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品包括益生菌制品、营养保健品、动物饲料和宠物零食中的至少一种。 8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述益生菌制品包括发酵制品、乳饮料、活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。 9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品为药品。 10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药品为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、盖膜剂、口溶性颗粒剂、液体剂、栓剂或灌肠剂的形式。
说明书全文	短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用。背景技术 [0002] 肠道微生物在维持宿主健康中发挥重要作用，大量共生细菌在胃肠道内寄居、繁殖，并对维持最佳的宿主生理生化代谢过程具有至关重要的影响。微生物菌群通过直接抵御入侵微生物或协调合适的免疫应答以保护宿主免受感染。随着人们生活工作压力的增加，饮食结构的改变，以及过度服用抗生素药物等外界因素，导致人体肠道微生物的组成和代谢活动发生改变，从而影响宿主肠道微生物的结构和健康。 [0003] 便秘是一种常见的胃肠道疾病，主要表现为排便次数少，排便困难和粪便干硬等。目前认为便秘的发生于肠道神经系统功能性障碍，内脏高敏感性，胃肠动力减慢等多种因素有关。 [0004] 母乳作为新生儿最完美的天然食品，为新生儿提供最好的营养物质，对新生儿的健康和发育起到至关重要的作用。母乳中益生菌是婴儿肠道微生物菌群的重要来源，通过喂养转移到婴儿体内并在肠道内定植，从而调节婴儿肠道菌群的组成和功能。双歧杆菌是婴儿胃肠道的主要成员之一，它可以通过调整肠道菌群、代谢产生短链脂肪酸、缓解炎症反应、增强结肠蠕动、增强肠道屏障的稳定性等来保护肠道，同时释放肠道神经递质和肠道免疫反应物质来调节肠道运动。母乳源菌株是理想的婴幼儿用益生菌。发明内容 [0005] 有鉴于此，本发明提供了短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用，所述短双歧杆菌菌株grx05来源于中国健康母亲的乳汁，可用于制备能够缓解功能性便秘及调节肠道菌群的食品或药品，特别可用于缓解便秘及调节肠道菌群的益生菌产品中。 [0006] 为解决背景技术中提出的技术问题，本发明采用以下技术方案： [0007] 第一方面，本发明提供了一种短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌株grx05在制备用于缓解便秘及调节肠道菌群的产品中的用途。 [0008] 进一步地，所述缓解便秘及调节肠道菌群是指改善排便状态和肠运动状态，和/或[0009] 松弛平滑肌，促进胃肠道运动；和/或 [0010] 改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。 [0011] 进一步地，所述短双歧杆菌菌株grx05用于促进兴奋性神经递质AchE的分泌，降低抑制性神经递质NO的含量。 [0012] 进一步地，在门水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于降低脱硫菌门的相对丰度，提高拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度。 [0013] 进一步地，在属水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于增加乳杆菌属和/或和毛螺旋菌属的相对丰度，降低脱硫弧菌属的相对丰度。 [0014] 进一步地，所述产品为食品。 [0015] 进一步地，所述产品包括益生菌制品、营养保健品、动物饲料和宠物零食中的至少一种。 [0016] 进一步地，所述益生菌制品包括发酵制品、乳饮料、活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。 [0017] 进一步地，所述产品为药品。 [0018] 进一步地，所述药品为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、盖膜剂、口溶性颗粒剂、液体剂、栓剂或灌肠剂的形式。 [0019] 进一步地，所述药品还包括在药学上可接受的载体和/或辅料。 [0020] 本发明的上述技术方案的有益效果如下： [0021] 本发明提供了短双歧杆菌菌株grx05在缓解便秘及调节肠道菌群中的应用。具体地，所述短双歧杆菌菌株grx05可用于制备缓解便秘及调节肠道菌群的产品。本发明的短双歧杆菌菌株grx05(保藏编号为CGMCC 21589)来源于中国健康母亲的乳汁，在小鼠便秘模型中，短双歧杆菌菌株grx05能够调整肠道菌群，显著缩短首次排黑便时间，回调乙酰胆碱脂酶水平和一氧化氮水平，够减少潜在有害菌门和提高有益菌门的丰富度，改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。同时，其用于动物模型的数据优于鼠李糖乳杆菌LGG。短双歧杆菌菌株grx05可用于制备能够缓解功能性便秘的食品或药品，特别可用于缓解便秘的益生菌产品中。附图说明 [0022] 图1为空白组、模型组、LGG对照组和grx05实验组的便秘型小鼠血清中一氧化氮(NO)的含量； [0023] 图2为空白组、模型组、LGG对照组和grx05实验组的便秘型小鼠血清中乙酰胆碱酯酶(AchE)的含量； [0024] 图3为空白组、模型组、LGG对照组和grx05实验组的门水平上的肠道菌群组成； [0025] 图4为空白组、模型组、LGG对照组和grx05实验组的属水平上的肠道菌群组成； [0026] 图5为空白组、模型组、LGG对照组和grx05实验组的属水平上的肠道菌群热力图。具体实施方式 [0027] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0028] 第一方面，本发明提供了短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)菌株grx05在制备用于缓解便秘及调节肠道菌群的产品中的用途。 [0029] 根据本发明的一些实施例，所述用于缓解便秘及调节肠道菌群的产品中，短双歧6 杆菌(Bifidobacterium breve)菌株grx05的活菌数量不低于10CFU/mL。具体地，根据产品的种类不同，所述产品中菌株grx05的活菌数量不同。以酸奶为例，酸奶中的活菌数不低于 6 9 10CFU/mL；而菌粉、固体饮料中活菌数一般在10CFU/g以上。 [0030] 根据本发明的一些实施例，所述缓解便秘及调节肠道菌群是指改善排便状态和肠运动状态，和/或松弛平滑肌，促进胃肠道运动；和/或改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。 [0031] 根据本发明的一些实施例，所述短双歧杆菌菌株grx05用于促进兴奋性神经递质AchE的分泌，降低抑制性神经递质NO的含量。 [0032] 根据本发明的一些实施例，在门水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于降低脱硫菌门的相对丰度，提高拟杆菌门(Bacteroidota)的相对丰度。 [0033] 根据本发明的一些实施例，在属水平，所述短双歧杆菌菌株grx05用于增加乳杆菌属和/或和毛螺旋菌属的相对丰度，降低脱硫弧菌属的相对丰度。 [0034] 根据本发明的一些实施例，所述产品为食品。 [0035] 根据本发明的一些实施例，所述产品包括益生菌制品、营养保健品、动物饲料和宠物零食中的至少一种。 [0036] 根据本发明的一些实施例，所述益生菌制品包括发酵制品、乳饮料、活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。 [0037] 根据本发明的一些实施例，所述益生菌制品中包括短双歧杆菌菌株grx05，还包括益生元。 [0038] 根据本发明的一些实施例，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、胡萝含氮多糖、酪蛋白水解物、α‑乳清蛋白和乳铁蛋白中的至少一种。 [0039] 根据本发明的另一些实施例，所述产品包括药品。 [0040] 根据本发明的另一些实施例，所述药品为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、盖膜剂、口溶性颗粒剂、液体剂、栓剂或灌肠剂的形式。 [0041] 根据本发明的另一些实施例，所述药品还包括在药学上可接受的载体和/或辅料。 [0042] 根据本发明的另一些实施例，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂或矫味剂的载体。 [0043] 下面通过一些具体实施例对本发明作进一步说明。 [0044] 1.1实验动物及实验试剂： [0045] 实验动物为SPF级3‑4周龄KM小鼠，购于济南朋悦实验动物繁殖有限公司；一氧化氮(NO)、乙酰胆碱酯酶(AchE)水平用购自于上海酶联生物科技有限公司的试剂盒测定，胆盐购自于北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶和胃蛋白酶自于生工生物工程(上海)股份有限公司。 [0046] 鼠李糖乳杆菌(LGG)分离自市售益生菌产品 [0047] 本发明中使用的短双歧杆菌grx05已于2021年1月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.21589，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。进一步地，所述短双歧杆菌grx05公开于申请号为202110171608.0，申请公布号为CN112899194A(授权公告号为CN112899194B)的中国专利中。 [0048] 1.2相关试剂及培养基配方： [0049] 配制改良MRS培养基：称取牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，醋酸钠5.0g，吐温‑80 1mL，K2 HPO4 2.0g，柠檬酸三铵2.0g,MgSO4·7H2O 0.20g，MnSO4·4H2O 0.05g，蒸馏水1000mL混合，于121℃灭菌15min，冷却备用，使用前加入200μL/ 10mL半胱氨酸盐酸盐溶液和100μL/10mL莫匹罗星。 [0050] 配制生理盐水：取9.0g的NaCl溶于1000mL蒸馏水中，121℃灭菌15min，冷却备用。 [0051] 配制墨汁：取10.0g阿拉伯胶，加少量水煮沸，后加入5.0g 活性炭至上述溶液中煮沸三次，待冷却后定容到100mL，放入4℃冰箱冷藏备用，用前摇匀。 [0052] 配制人工胃液：分别取0.5g NaCl和0.3g胃蛋白酶溶解于去离子水中并定容至100mL，用1.0mol/L的盐酸调pH至2.5，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱冷藏备用。 [0053] 模拟胆盐的配制：称取一定量的胆盐于MRS液体培养基中，使其胆盐浓度(w/v)分别为0.075％、0.1％，并调节pH至6.5±0.2，121℃灭菌15min，冷却备用。 [0054] 1.3设置实验组和LGG对照组： [0055] grx05实验组菌悬液的制备：将活化好的短双歧杆菌grx05,37℃静置培养24h后，6000r/min离心10min,用无菌生理盐水洗涤离心两次后获得2代菌泥，用PBS溶液调整活菌 9 数为1.0×10CFU/mL。 [0056] LGG对照组菌悬液的制备：将活化好的鼠李糖乳杆菌(LGG),37℃静置厌氧培养24h后,6000r/min离心10min,用无菌生理盐水洗涤离心两次后获得2代菌泥，用PBS溶液调整活9 菌数为1.0×10CFU/mL。 [0057] 1.4功能性便秘小鼠通过灌胃盐酸洛哌丁胺进行造模： [0058] 动物分组和建立功能性便秘模型的方法：KM小鼠适应性喂养一周后，分为4组，每组8只。鼠李糖乳杆菌(LGG)对照组，模型组，grx05实验组连续造模7天(10μL/g，一天一次)灌胃盐酸洛哌丁胺(10mg/kgBW)。建立便秘模型后，空白组和模型对照组灌相同剂量的无菌生理盐水，鼠李糖乳杆菌(LGG)对照组和grx05实验组灌相同剂量的含该组受试菌的菌悬液，连续干预14天(10μL/g，一天一次)。 [0059] 实施例1grx05对功能性便秘小鼠排便和小肠运动功能的影响 [0060] 连续干预14天后，禁食不禁水16小时，将每组中的4只小鼠单独放入笼子里，各组灌胃洛哌丁胺10mg/kg诱导小鼠功能性便秘模型，30min后实验组和LGG对照组给予含菌的墨汁，空白组和模型对照组给予空白墨汁。以灌墨汁后开始，记录各小鼠首次排黑便时间以及6h排黑便粒数和重量。 [0061] 其余4只各组灌胃洛哌丁胺10mg/kg诱导小鼠功能性便秘模型，LGG对照组和grx05实验组给予含对应菌株的墨汁，空白组和模型对照组给予空白墨汁。给予墨汁后25min小鼠脱颈椎处死，迅速取出幽门至盲肠部分的肠道，不改变肠道长度的情况下拉直，计算墨汁推进率，墨汁推进率的计算公式如下所示： [0062] 墨汁推进率＝L1/L0×100％ [0063] 式中：L1(cm)为墨汁推进长度；L0(cm)为幽门到盲肠的长度。 [0064] 以上实验的实验结果记载于表1，如表1所示，与空白组相比，模型对照组的小鼠首次排黑便时间显著延长(p<0.01)，6h排黑便粒数减少(p<0.05)，墨汁推进率降低(p<0.01)，说明小鼠造模成功。与模型组相比，给予短双歧杆菌grx05干预后，其首次排黑便时间缩短(p<0.01)，6h排黑便粒数增加(p<0.05)，墨汁推进率升高(p<0.01)；与空白组相比，各项指标均有所接近，说明本发明所述短双歧杆菌grx05可以改善便秘小鼠的排便状态，肠运动状态。且本发明所述短双歧杆菌grx05改善便秘小鼠的排便状态的效果优于鼠李糖乳杆菌(LGG)。 [0065] 表1 [0066] [0067] 注：不同字母表示具有差异性(p<0.05) [0068] 实施例2grx05对功能性便秘小鼠血清神经递质表达水平的影响 [0069] 测试方法： [0070] 血清神经递质乙酰胆碱酯酶(AchE)含量按照酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒说明书进行检测(上海酶联生物科技有限公司，上海，中国)。该试剂盒采用双抗体一步夹心法进行检测，使用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 [0071] 一氧化氮(NO)含量按照一氧化氮试剂盒说明书进行检测，使用酶标仪在550nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 [0072] 以上实验的实验结果记载于图1、图2和表1，如图1、图2和表2所示，与空白组相比，模型对照组小鼠血清中的AchE水平显著降低(p<0.01)，NO水平显著升高(p<0.01)；与模型对照组相比，短双歧杆菌grx05干预后的小鼠血清中AchE水平显著增高(p<0.01)，NO水平显著降低(p<0.05)，且与空白组无显著差别。表明本发明所述短双歧杆菌grx05能够促进兴奋性神经递质AchE的分泌，降低抑制性神经递质NO的含量，说明本发明中的短双歧杆菌grx05能够松弛平滑肌，促进胃肠道运动。同时，相较LGG对照组，本发明grx05实验组的AchE水平和NO水平也更高。 [0073] 表2 [0074]组别 NO(μmol/L) AchE(nmol/L) c a 空白组 30.40±0.84 155.43±4.13 a c 模型组 43.33±0.56 86.42±11.43 c b LGG对照组 33.88±1.24 119.92±6.23 b b grx05实验组 39.00±1.42 121.86±3.85 [0075] 实施例3grx05对便秘小鼠肠道菌群组成的影响 [0076] 测试方法：小鼠的肠内容物样本被收集到无菌管中，经过液氮冷冻后，储存在‑80℃。肠道内容物样本在‑80℃干冰保存下送到上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因测序。使用 soil DNA kit(Omega Bio‑tek,Norcross,GA,U.S.)进行细菌总基因DNA的抽提。分别使用1％的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000(美国Thermo Scientific公司)对抽提DNA的质量，浓度和纯度进行分析。使用上游引物338F(5’‑ACTCCTACGGGAGGCAGCAG‑3’)和下游引物806R(5’‑GGACTACHVGGGTWTCTAAT‑3’)对16SrRNA基因V3‑V4可变区进行PCR扩增，分别使用2％琼脂糖凝胶和AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)对PCR产物进行回收和纯化。使用NEXTFLEX Rapid DNA‑Seq Kit对纯化后的PCR产物进行建库，最后在Illumina平台进行测序。最后在Illumina NovaSeq6000平台(Illumina,San Diego,CA,USA)进行测序。 [0077] 在门水平上，由图3可知，与空白组(BC)相比，模型对照组(NC)脱硫菌门(Desulfobacterota)的相对丰度为17.6％，显著高于空白组(8.8％)。与模型组相比，grx05实验组脱硫菌门的相对丰度为0.8％，显著降低了脱硫菌门的相对丰度，同时提高了拟杆菌门(Bacteroidota)的丰富度。说明本发明菌株短双歧杆菌grx05能够减少潜在有害菌门和提高有益菌门的丰富度。 [0078] 在属水平上，由图4可知，与空白组相比，模型组的乳杆菌属(Lactobacillus)和毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)等有益菌属的相对丰度显著降低，而脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的相对丰度显著升高。经过短双歧杆菌grx05干预后，乳杆菌属的相对丰度增加到30.5％，显著高于模型组(10.6％)，同时显著降低了脱硫弧菌属的相对丰度。在图5的热图中可以看出，grx05组和LGG对照组与空白组(BC)的肠道菌群丰富度更加接近。说明本发明菌株短双歧杆菌grx05能够改善肠道菌群的组成，维护肠生态环境稳定。 [0079] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

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