[0001] 本发明涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种用于生产脂肪酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用。

[0002] 脂肪酶又叫甘油三脂水解酶，能催化甘油三酯水解生成甘油双酯、甘油单酯或甘油。脂肪酶在面粉品质改良中具有重要作用，包括：(1)增加面包体积及强筋：松软强筋的面包口感更好，膨大的体积会使其更具有卖相。脂肪酶的作用机理为甘油三酯脂肪酶把面粉中含有的非极性的脂质(甘油三酯脂质)分解为极性的脂质(单/双甘油脂)。这种分解能使面粉形成具有表面活性剂特性的分子结构，能够与水和谷蛋白更好地结合，形成更强的面筋网络，增加了面团的强度和耐搅拌性，以及面包的入炉急胀能力，增加烘焙产品的体积，使组织细腻均匀，包芯柔软，口感更好。(2)馒头增白：馒头的白度是衡量面粉质量的重要指标。如果馒头的表面比较白且光滑，说明所使用的面粉质量较好，这种馒头同时对消费者也更具有吸引力。脂肪酶使馒头增白的作用机理为脂肪酶分解脂肪，使溶于脂肪中的色素释放出来，色素被空气中的氧气氧化褪色，达到二次增白效果。脂肪酶的这一应用特性被广泛应用于馒头的增白，特别是在面粉中禁止使用过氧化苯甲酰后，这一应用得到更多认可。除此之外，脂肪酶水解脂肪产生的甘油单/双酯能与淀粉结合，起到润滑和分离作用，从而有效阻断了淀粉颗粒之间的重结晶，延缓淀粉的老化。

[0003] 里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种嗜温腐生性的丝状真菌，在二战期间，被驻扎在所罗门群岛上的美军在腐烂的棉衣和帆布帐篷上发现的。所分离到的菌株经鉴定为里氏木霉QM6a。从原始菌株QM6a出发，又经过一系列诱变育种，筛选出了一些纤维素酶高产菌株，如RUT‑C30。里氏木霉被广泛应用是由于其具有自然分泌大量的内源蛋白到胞外的能力，而内源性纤维素酶经发酵后，产量高达100g/L。里氏木霉因多样的翻译后修饰也让其成为表达同源和异源蛋白的常用宿主。里氏木霉产出的纤维素酶被广泛应用于各行业。如两个表达量最高的纤维素酶cbh1和cbh2启动子，已被成功用于里氏木霉中表达异源蛋白。

[0004] 通常利用毕赤酵母表达获得脂肪酶，但是毕赤酵母不是食品安全菌株，而且需要甲醇诱导基因表达，不符合食品安全规范。里氏木霉是食品安全菌株，但自身表达的内源酶太多，尤其是过多的纤维素酶和木聚糖酶，不利于面团成型，不能应用于烘焙食品。

[0005] 本发明的目的是提供一种用于生产脂肪酶的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明成功构建了分泌表达脂肪酶的里氏木霉工程菌株，该工程菌株可用于食品级的脂肪酶的生产，生产的脂肪酶可以显著提高烘焙食品(如面包)的比容和白度。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种用于生产脂肪酶的里氏木霉工程菌，所述里氏木霉工程菌异源表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的脂肪酶；所述里氏木霉工程菌中，将里氏木霉中原始的纤维素酶cbh1和cbh2以及木聚糖酶xyn1和xyn2的基因依次替换为编码所述脂肪酶的基因；

[0008] 编码所述脂肪酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0009] 本发明还提供一组用于构建所述的里氏木霉工程菌的质粒，依次包括替换纤维素酶cbh1和cbh2以及木聚糖酶xyn1和xyn2的基因的质粒，所述质粒依次包含所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的启动子序列、编码所述脂肪酶的基因序列和所需替换的纤维素酶或木聚糖酶基因的终止子序列。

[0010] 本发明还提供一种所述的里氏木霉工程菌的构建方法，包括通过所述的质粒使编码所述脂肪酶的基因序列依次替换里氏木霉中原始的纤维素酶cbh1和cbh2以及木聚糖酶xyn1和xyn2的基因序列的步骤。

[0011] 进一步地，在依次替换里氏木霉中原始的纤维素酶cbh1和cbh2以及木聚糖酶xyn1和xyn2的基因序列时，每替换一个基因序列后，以获得的过程菌株中脂肪酶活力最高的菌株作为宿主，进行下一步替换，至纤维素酶cbh1和cbh2以及木聚糖酶xyn1和xyn2的基因序列全部替换完成。

[0012] 本发明还提供所述的里氏木霉工程菌在生产脂肪酶中的应用。

[0013] 本发明还提供一种生产脂肪酶的方法，包括将所述的里氏木霉工程菌进行发酵培养，获得所述脂肪酶。

[0014] 本发明还提供所述的方法获得的脂肪酶在制备烘焙食品中的应用。

[0015] 进一步地，所述烘焙食品包括面包。

[0016] 本发明还提供所述的方法获得的脂肪酶在提高烘焙食品的比容和白度中的应用。

[0017] 进一步地，所述烘焙食品包括面包。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明利用里氏木霉表达质粒构建脂肪酶表达模块，将脂肪酶的编码基因转化到里氏木霉基因组中，依次代替里氏木霉中分泌表达量最高的两个纤维素酶基因(cbh1和cbh2)，以及两个木聚糖酶基因(xyn1和xyn2)。本发明成功构建了分泌表达脂肪酶的里氏木霉工程菌株。该工程菌株可用于食品级的脂肪酶的生产，生产的脂肪酶符合食品安全规范，并且可以显著提高烘焙食品(如面包)的比容和白度，将更适合实际的食品行业需求。附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0021] 图1为本发明中里氏木霉表达质粒(A)和脂肪酶表达模块(B)构建图；

[0022] 图2为本发明中菌株构建的流程图(A)及其相应的酶活(B)；

[0023] 图3为本发明实施例4中不同脂肪酶添加量对面包比容的影响。

[0024] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0025] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0026] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0027] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0028] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0029] 在本发明方法的实施例中，培养基及试剂的配方如下：

[0030] (1)Luria Bertani(LB)培养基配方：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，自来水定容到1L，自然pH。

[0031] (2)葡萄糖或木糖PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖(或木糖)20g，琼脂20g，自来水定容到1L，自然pH。

[0032] (3)里氏木霉发酵培养基的配方(1L)：葡萄糖30g，乳糖10g，葡萄糖酸铵14g，纤维素粉末10g，麸皮5g，玉米浆5g，蛋白胨3g，酵母粉2g，KH2PO42.0g，CaCl20.34g，MgSO4·7H2O 0.3g，Mandels微量元素液1mL和吐温80 1mL。

[0033] (4)Mandels微量元素液(1000×)的配方：FeSO4·7H2O 5g，CoCl·6H2O 2g，ZnSO4·7H2O1.4g，MnSO4·H2O 1.6g，纯净水定容至1L。

[0034] (5)农杆菌接合转移里氏木霉方案：将表达模块电转至根瘤农杆菌，然后将电转成功后的农杆菌分别与里氏木霉宿主菌株在IM平板培养基(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens‑mediated transformation ofFusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259‑264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养2天后，在加入头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的葡萄糖PDA平板中进行筛选，直至长出菌丝和孢子，然后进行PCR验证，证明长出菌体为正确的转化子。

[0035] (6)里氏木霉抗性标记缺失方案：每轮构建的工程菌株依据文献方案(Zhang et al.Light‑inducible genetic engineering and control of non‑homologous end‑joining in industrial eukaryotic microorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)消除潮霉素抗性标记后，可进行下一轮的基因改造。原理如下：利用木糖PDA平板中进行培养和传代，潮霉素抗性就会缺失，缺失效率接近70～100％；缺失后的菌株无法在有潮霉素的PDA平板中生长，利用这一特性就可验证缺失菌株。

[0036] 在本发明方法实施例中所用的里氏木霉出发菌株是里氏木霉RUT‑C30(ATCC 56765)，此方案对其他里氏木霉菌株，如QM9414(ATCC 26921)，QM6a(ATCC 13631)，RL‑P37(NRRL 15709)和NG14(ATCC 56767)也适用。

[0037] 质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，胶回收试剂盒购自MAGEN公司，无缝克隆试剂盒选用全式金公司，DNA限制性内切酶与连接酶需用NEB公司，也可选用其他公司的同类产品代替。

[0038] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

[0039] 以下实施例中的脂肪酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0040] SEQ ID NO.1：

[0041] MVSFISISQGVSLCLLVSSMMLGSSAVPVAGHKGSVKATNGTDFQLPPLISSRCTPPSHPETTGDPDAEAYYINKSVQCYQAHGGNYTALIKRDTETVGGMTLDLPENPPPIPATSTAPSSDSGEVVTATAAQIKELTNYAGVAATAYCRSVVPGTKWDCKQCLKYVPDGKLIKTFTSLHTDTNGFILRSDAQKTIYVTFRGTNSFRSAITDMVFTFSDYSPVKGAKVHAGFLFSYNQVVKDYFPVVQDQLTAYPDYKVIVTGHSLGGAQALLAGMDLYQREKRLSPKNLSIYTVGCPRVGNNAFAYYVDSTGIPFHRTVHKRDIVPHVPPQAFGYLHPGVESWIKEDPADVQICTSNIETKQCSNSIVPFTSIADHLTYFGINEGSCL。

[0042] 编码脂肪酶蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该序列是按照里氏木霉密码子偏好性进行优化后的核苷酸序列。

[0043] SEQ ID NO.2：

[0044] ATGGTCAGCTTCATCTCCATCTCCCAGGGCGTCAGCCTCTGCCTCCTCGTCAGCAGCATGATGCTCGGCTCCAGCGCTGTCCCTGTCGCTGGCCACAAGGGCAGCGTCAAGGCTACTAACGGCACCGACTTCCAGCTGCCCCCTCTCATTAGCAGCCGCTGCACTCCTCCCAGCCACCCTGAGACCACTGGCGACCCTGATGCTGAGGCTTACTACATCAACAAGAGCGTCCAGTGCTACCAGGCCCACGGCGGCAACTACACTGCTCTCATCAAGCGCGACACCGAGACCGTCGGCGGCATGACCCTCGACCTCCCTGAGAACCCTCCCCCTATCCCTGCTACCAGCACCGCTCCTAGCAGCGATTCCGGCGAGGTCGTCACTGCTACCGCTGCTCAGATCAAGGAGCTGACCAACTACGCCGGCGTCGCTGCTACTGCTTACTGCCGAAGCGTCGTCCCCGGCACCAAGTGGGACTGCAAGCAGTGCCTGAAGTACGTCCCCGACGGCAAGCTGATCAAGACCTTCACCAGCCTCCACACCGACACCAACGGCTTCATCCTCCGCAGCGACGCTCAGAAGACCATCTACGTCACCTTCCGCGGCACCAACTCCTTCCGATCCGCTATCACCGACATGGTCTTCACCTTCTCCGACTACTCCCCCGTCAAGGGCGCTAAGGTCCACGCTGGCTTCCTGTTCAGCTACAACCAGGTCGTCAAGGACTACTTCCCCGTCGTCCAGGACCAGCTGACCGCTTACCCTGACTACAAGGTCATCGTCACCGGCCACTCCCTCGGCGGCGCTCAGGCTCTCCTCGCTGGCATGGACCTCTACCAGCGAGAGAAGCGCCTCAGCCCTAAGAACCTCAGCATCTACACCGTCGGCTGCCCCCGAGTCGGCAACAACGCTTTTGCCTACTACGTCGATAGCACCGGCATCCCCTTCCACCGAACCGTCCACAAGCGCGATATCGTCCCCCACGTCCCTCCTCAGGCTTTCGGCTACCTCCACCCTGGCGTCGAGTCTTGGATCAAGGAGGACCCCGCCGACGTCCAGATCTGCACCAGCAACATCGAGACCAAGCAGTGCTCCAACAGCATCGTCCCCTTCACCTCCATCGCCGACCACCTCACTTACTTCGGCATCAACGAGGGCAGCTGCCTGTAG。

[0045] xyn1基因的启动子Pxyn1核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0046] SEQ ID NO.3：

[0047] TCAGCGAACAAATCAGCGATTCATCCCTCGGACAAAGGGAGCTCACTGTGCATTTGGAGAGCGGATGCCGCGTTGAACGGCTTCCCAGTAACCGGAGCAGAGTAACTCACGCCAATGGCAAGAGAAGAATACTGCAGAGACTTGAAGAGATTTCTAAACACCGGCAAGTCTTCGTACTCTATCGAAGTCTCGCCTTACGTACTTGATCTGCTGTCTTTCGTGTCCGGTCAACATATACTCGCACACATTAGCCCCAGCAGAACATGTCGTCGGCATAAAAGGCCAATTCAGATCGCAGATAACAAAATGCTACCAGCATCTGTCTAGTTGTGGAGATATGAAGGGGTATTTCAGGCTTTCTTTGTGGGAATAAAGAGAGAAAGAGAGACTTACAGGAGCTCTAGGCTTCGTAGCCCCTGCGTTCTTAGTTCGCAATGCCGTGAAAGCAGCTACATCTACCAAGACACTCGTGCATCGTCTATTTTATTTGTTACATGCTGGGAATTTCCGGGACATTGTTTAAGGATGACTAGGTTCAGCCGTTAAAGAATGGAAGGCCATGGCTTGTCCCTCTGTGGCAAGTCATTGCACTCCAAGGCCTTCTCCTGTACTAGTCCTACAATTCTGCAGCAAATGGCCTCAAGCAACTACGTAAAACTCCATGAGATTGCAGATGCGGCCCACTGGAATACAACATCCTCCGCAAGTCCGACATGAAGCCCCTTGACTTGATTGGCAGGCTAAATGCGACATCTTAGCCGGATGCACCCCAGATCTGGGGAACGCGCCGCTTGAGGCCCGAAGCGCCGGGTTCGATGCATTACTGCCATATTTCAGCAGTTAACTAGGACCGGCTTGTGTCGATATTGCGGGTGGCGTTCAATCTATTCCGGCACTCCTATGCCGTTTGATCCGATACCTGGAGGGCGTGCTTTAGGCAAAATGCCAAGCTTCGAGGATACTGTACGAGCCGCTTTCAACCTCACTTGATGATGTCTGAGTTTCATCAAGAGAATTGAAGTCAAAGCTCAAATCATGATGTGAAGAGGTTTTGAATGTGGAAGAATTCTGCATATATAAAGCCATGGAAGAAGACGTAAAACTGAGACAGCAAGCTCAACTGCATAGTATCGACTTCAAGGAAAACACGCACAAATAATCATC。

[0048] cbh1基因的终止子Tcbh1核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0049] SEQ ID NO.4：

[0050] GTTCTGTTGATGTTGACTTGGAGTGGATGAGGGGTTTGAGCTGGTATGTAGTATTGGGGTGGTTAGTGAGTTAACTTGACAGACTGCACTTTGGCAACAGAGCCGACGATTAAGAGATTGCTGTCATGTAACTAAAGTAGCCTGCCTTTGACGCTGTATGCTCATGATACATGCGTGACATCGAAATATATCAGCCAAAGTATCCGTCCGGCGACATGCCCATCAACTATATTGAAGTCAGAAACACACTGTCCCTCTTCCCTCCTATGCTTTTACAAGCTGCTCCTCTATCCGCCCCCACAGTCCCTTGTTCATATACCCCGAAAGCCAAAAGTTTCCATCCTTGTCCTTGCCCATGATCGGGAAGCCGTTTGGTAGCACGATACCCCACTGATTATTCTGTATATAGATCGGTGAACCCGATTTCCCACCCTCCCTACTGGGCTGAAGCACAGCTGCAGAAAAGTCCAAGTCGAACAGCTTTGCCTTGCCCCAATTTGACAACGTAATCATGTGCATGTTGCCGTTGCCGAAGAAAGGCGGAATCCTCCCGCTAGATCCTCGCCACATAGCGAAAAAGGCTTCTACCTGAGACCGAGTTCCCAGTTCTTGAATCGCGGTTCGAGTAGCAGCAGCAATATAACTCAGCGGCTTC。

[0051] xyn2基因的启动子Pxyn2核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0052] SEQ ID NO.5：

[0053] TTCAACTCAACCGACCTTCCAAGCTACAAAAACGACAAGGTTGGATGTCTGCCGTTTGCTGCCTCGCCACCAGCTGACTTTAGGCAAAACAGGTCATTGAATCCAGATCGGAGTCGACACTCGCATCCGTGCTCCGGGAGTCACGATCGAGACATGCCGCCCAAGCATGCAACCTGCCCCAGGGTCCGATTATATCCAATTTAGCCGCTGGACAAGCTGCATCCATGCCGCTCATCACCCCCGCAAATCACTTTCGGGTCCCGTCTTCTCCCAGATTGCTTTCATCGGCACTAGACCAATGGAGAGCGGCTCTTGCTGAATGCCGTCGTAGGCTGTTGTCGACGGACCTCGGGGTGCATGAGGCTGGGAACAGGGGGTGGGGGACATGGCATGGTGTGTGTGTGTGTTATGGTTAATTGGAAGCATACGGGTTGACTCTACTTGGTTATAACGGCCACATTCGACATCAGGTAATGGATGTGACATGGCCGCTCCACGGCGGGCTTTGGGCGTGAATTACGACATTGCGGCAAAGATGGAATGGACTATTCGCCATTCTAGCACGCGATATTGTGATGCTGCTGCTGATGGCTAATCCCAAAGACTCGTCATACTGCCTCTTGTAGTTTACTGCATCGTCTTGACTCCACTGAGAGGACTGTGCCGATGAGACGCTGCTGAGAAACGTCGAATCGGTTGTACACTCGGAGCATTTTGGGGTAACTTGTTGATTTTCCATTTCCTTCTATACGTCCATGAGTTTCCGTTCCGATATATGAGATTGCCAAGAGGAAATTAGCCGTTATTCAGACAATGTATGTGCCGGGCTTCTTCTCACATGTATCGGAGCAGAAGGGGTCCATCTATGTGAGCTGACTCGAGACGGCTGAGACAGCAGCATCACCACGTCACGATGGTGTTGCAAGGCGCAATATCATTGATGAAAGGAGAACAACTTCTAGACTGGGTAAATTGGTCAATGGCCAGCCGCTCGGCCGTGCGGAGACGAGGCAAGCTTGATGAGGCCAAATTATCCGTCAACTGTCTTATAAAGGAGCCCATGCCAAACCCCCCCTAAAGACTCAAGAAGCCAAACCTGAACAACCCCAGCACCTGAACAGTCATACAACCCCTCCAAGCCCAAAAGACACAACAACTCCTACTAGCTGAAGCAAGAAGACATCAAC。

[0054] xyn2基因的终止子Txyn2核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

[0055] SEQ ID NO.6：

[0056] AGGGGGCTCTTCTTTTGTGATGTGTGAAAAAAAAAAAAAGGATGGTGGATAAAAGGGGGTTGAAGGGCTTGTGTTCTTTGGCTCTGTAGAGGCTCTAGGGGGTTGGATTGGGCTGACTATGGTCTCCCCTTTGTATGCTACACACTGATCAGACGATCGTAGTCAGTTGAGAGATGAGCTTCATTGGTCGATATGAGTGCTTTGAGACTGGACACTTGCGTGACTGCATGTTCCGTTTCTTGTGATAATTGCCGTGAAGATGTGTCTGCTGGTATGACGACAAAGTAGCATCAGCAGCAAAGTATGGCGAGGACTACTAGGCCCAAGATATTGTCGGCTTCGTCAAAGTGAGAAATTTTAGGGTCTCCATTGATTACATTCATCCGTTTCAGAAGCACGATATAGAGGAGTAGCACCATCAGGTCGGAAAGGTCGTCAACAGCTTGAACAAGTCATACTAAGGTATGTTAGTGTGGTCGTGGTTGTCGGTATCAGTAGGTATCATTGGAGTATGTGTTATATACAGATTAATGGGACCAATGCATCACGCATCAGGACATGCCCTGGCAATCCTCCCTCTTACAAATCGCGATGAGGCTTGGGTTTGGGGGTAATAGTAGCGGTCGTAAAGGTGGTGGTGCCAGTAGCGCACACGCAGCCCTGGCCGGAAATGCTGGTAATGGGAGGAGATTTGCAGGTGGGCTCGGTGGTAAAGGAGGCGTAGGTGCTGGTGGGCTCAACCGTGGGCTCAACCAGCTCAGCCTTGACCAGGACGGGGATGATCTGGCCTGTGGACAGGCTGAAGGAGCGGTGGTTGAGCACGGTGAGAATGGCGCCAATCTCGCCCGAGTGGCTGGTGATGCTAATCCAGGTGTTGTCGTCGTG。

[0057] 以下实施例中脂肪酶活力的测定原理与方法如下：

[0058] 脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸，可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O。

[0059] 1.酶活单位定义：1mL酶液或1g固体酶粉，于40℃，pH 7.5条件下，水解脂肪每分钟产生1微摩尔(μmol)的脂肪酸，即为1个脂肪酶国际单位，以U/mL或U/g表示。

[0060] 2.试剂和溶液：

[0061] (1)聚乙烯醇(PVA)：聚合度1750±50(国药集团上海化学试剂公司)。

[0062] (2)橄榄油(国药集团上海化学试剂公司)。

[0063] (3)95％(V/V)乙醇(GB679)。

[0064] (4)底物溶液：称取聚乙烯醇(PVA)40g，加水800mL，在沸水浴中加热、搅拌，直至全部溶解，冷却后定溶至1000mL。以干净的双层纱布过滤，取滤液，即为4％PVA溶液。量取4％PVA溶液150mL，加橄榄油50mL，用高速组织捣碎机处理6min(分2次处理，每次3min，中间休息5min)，即成乳白色PVA乳化液。该溶液要现用现配。该溶液如贮存在冰箱中，有效期为一周。

[0065] (5)pH 7.5磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)1.96g，十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)39.62g，加水溶解，用pH计校正至7.5±0.01后定容至500mL。

[0066] (6)0.05mol/L氢氧化钠标准溶液：按照GB 601配制与标定。

[0067] (7)0.5mol/L氢氧化钠滴定液：按照GB 601配制与标定。

[0068] 若为脂肪酶液体，直接量取1mL酶液。若脂肪酶为固体，则称取1g酶粉，分多次溶解：先用10mL(5)中的pH 7.5磷酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入5～10mL缓冲液，捣研并将上清液倾入容量瓶，如此重复3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度100mL，摇匀，转入组织捣碎机捣研3min后供测定用。测定酶粉时，稀释倍数参考下表1，控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差在1～2mL范围内。注意：吸取样品时，应将酶液摇匀后再取。

[0069] 表1酶粉酶活测定稀释倍数

[0070]估测酶活力(U/g) 稀释倍数
4000 600
5000 750
6000 900

[0071] 3.酶活测量：

[0072] 取两个100mL烧杯，于第一个空白对照杯A和第二个样品检测杯B中各加底物溶液4.00mL和pH 7.5磷酸缓冲液5.00mL，再于A杯中加入95％乙醇15.0mL，于40±0.2℃水浴中预热5min。然后于A、B两杯中，各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，在40±0.2℃水浴中准确反应15min，于B杯中立即补加95％乙醇15.0mL终止反应，取出；

[0073] 在烧杯中放一枚转子，置于电磁搅拌器上。在搅拌下，用0.5mol/L氢氧化钠滴定液滴定，直至pH＝10.3，为其终点，记录消耗0.5mol/L氢氧化钠滴定液的体积。

[0074] 计算样品的酶活力，计算公式如下：

[0075] X＝(B‑A)×C/0.05×50×1/15×n

[0076] ＝200/3×(B‑A)×C×n；

[0077] 式中：

[0078] X—样品的酶活力，U/g或U/mL；

[0079] B—滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

[0080] A—滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

[0081] C—氢氧化钠标滴定液的真实浓度，0.5mol/L；

[0082] 0.05—氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

[0083] 50—0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50微摩尔(μmol)；

[0084] 1/15—反应时间15min，以1min计；

[0085] n—稀释倍数，对于固体酶1g加入1000mL缓冲液，即为稀释1000倍；对于液体酶1mL加入99mL缓冲液，即为稀释100倍。

[0086] 所得结果表示至整数。

[0087] 实施例1构建XYN1T1.0和XYN2T1.0质粒

[0088] 本发明构建载体的骨架为LmL2.0a(已在文献“Zhang et al.Light‑inducible genetic engineering and control of non‑homologous end‑joining in industrial eukaryotic microorganisms:LmL 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761”中公开)，含有Cre‑loxP元件，可实现筛选标记的重复使用。

[0089] 1、表达质粒XYN1T1.0的构建

[0090] (1)利用引物Pxyn1‑F和Pxyn1‑R，以里氏木霉基因组为模板扩增xyn1基因的启动子序列Pxyn1(如SEQ ID NO.3)，不算引物上的同源臂序列共1164bp。

[0091] Pxyn1‑F(SEQ ID NO.7)：

[0092] 5’‑GATTACGAATTCTTAATTAATCAGCGAACAAATCAGCGATT‑3’；

[0093] Pxyn1‑R(SEQ ID NO.8)：

[0094] 5’‑ATTATACGAAGTTATCTAGATGATTATTTGTGCGTGTTTTCC‑3’。

[0095] 扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD‑Plus‑Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mM MgSO43μL；引物(10μM each)1.5μL；里氏木霉基因组模板(20ng)1μL；KOD‑Plus‑Neo(1U/μL)1μL。

[0096] 反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。

[0097] (2)利用引物Txyn1‑1和Txyn1‑2，以里氏木霉基因组为模板扩增cbh1基因的终止子序列Tcbh1(如SEQ ID NO.4)，不算引物上的同源臂序列共655bp。

[0098] Txyn1‑1(SEQ ID NO.9)：

[0099] 5’‑ACTAGTGAGCTCATTTGTTCTGTTGATGTTGACTTGGA‑3’；

[0100] Txyn1‑2(SEQ ID NO.10)：

[0101] 5’‑AGTGCCAAGCTTATTTGAAGCCGCTGAGTTATATTGC‑3’。

[0102] 扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD‑Plus‑Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mM MgSO43μL；引物(10μM each)1.5μL；里氏木霉基因组模板(20ng)1μL；KOD‑Plus‑Neo(1U/μL)1μL。

[0103] 反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃35sec，运行30个循环；68℃5min。

[0104] (3)以LmL2.0a为骨架构建表达载体，首先利用限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，连入xyn1的启动子序列Pxyn1；再用限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，连入xyn1的终止子序列Txyn1，即为表达质粒XYN1T1.0(图1中A)。

[0105] 2、表达质粒XYN2T1.0的构建

[0106] (1)利用引物Pxyn2‑F和Pxyn2‑R，以里氏木霉基因组为模板扩增xyn2基因的启动子序列Pxyn2(如SEQ ID NO.5)，不算引物上的同源臂序列共1187bp。

[0107] Pxyn2‑F(SEQ ID NO.11)：

[0108] 5’‑GATTACGAATTCTTAATTAATTCAACTCAACCGACCTTCCA‑3’；

[0109] Pxyn2‑R(SEQ ID NO.12)：

[0110] 5’‑TACATTATACGAAGTTATTTAAATGTTGATGTCTTCTTGCTTCAGCTA‑3’。

[0111] 扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD‑Plus‑Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mM MgSO43μL；引物(10μM each)1.5μL；里氏木霉基因组模板(20ng)1μL；KOD‑Plus‑Neo(1U/μL)1μL。

[0112] 反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。

[0113] (2)利用引物Txyn2‑1和Txyn2‑2，以里氏木霉基因组为模板扩增xyn2基因的终止子序列Txyn2(如SEQ ID NO.6)，不算引物上的同源臂序列共885bp。

[0114] Txyn2‑1(SEQ ID NO.13)：

[0115] 5’‑ACTAGTGAGCTCATTTAGGGGGCTCTTCTTTTGTGAT‑3’；

[0116] Txyn2‑2(SEQ ID NO.14)：

[0117] 5’‑AGTGCCAAGCTTATTTCACGACGACAACACCTGGAT‑3’。

[0118] 扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD‑Plus‑Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mM MgSO43μL；引物(10μM each)1.5μL；里氏木霉基因组模板(20ng)1μL；KOD‑Plus‑Neo(1U/μL)1μL。

[0119] 反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。

[0120] (3)以LmL2.0a为骨架构建表达载体，首先利用限制性内切酶SwaI进行单酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，连入xyn2的终止子序列Txyn2；再用限制性内切酶PacI/XbaI进行双酶切，利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，连入xyn2的启动子序列Pxyn2，即为表达质粒XYN2T1.0(图1中A)。

[0121] 这里所用的表达载体主要提供农杆菌接合转移位点的作用，所以，除了LmL2.0a外，可以用以下任一种农杆菌二元载体，如PZP100、pPZP201、pPZP201B、pPZP201BK、pBI121、pCAMBIA、pPK2或LmL2.1，但不仅仅是这些载体。

[0122] 实施例2构建脂肪酶基因的表达模块

[0123] (1)获得脂肪酶编码基因的方式为：提供氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，委托常规的基因公司，合成对应的核苷酸编码序列。合成规则可以依据宿主的密码子偏好性。因为宿主的差异，密码子偏好性也有所不同。根据里氏木霉密码子的偏好性，最终合成的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

[0124] (2)向基因公司提供未连入基因的空的表达质粒，并告知需要连入表达基因的酶切位点，及酶切位点上下游的DNA序列，避免发生移码突变，基因就可以被直接合成在提供的质粒上，构建出最终用于表达脂肪酶的表达质粒，省去了PCR、酶切、连接等步骤。

[0125] (3)本发明实施例1构建的两个里氏木霉质粒XYN1T1.0和XYN2T1.0，以及发明人前期构建的两个表达质粒CBH1T1.0和CBH2T1.0(公开在申请号为202211596367.5的专利申请文件中)，共四个表达质粒。委托基因合成公司，将SEQ ID NO.2重组在XYN1T1.0和CBH1T1.0质粒的启动子之后的XbaI酶切位点(TCTAGA)，将SEQ ID NO.2重组在XYN2T1.0和CBH2T1.0质粒的启动子之后的SwaI酶切位点(ATTTAAAT)。需要注意的是，XYN2T1.0和CBH2T1.0质粒重组插入脂肪酶基因后，SwaI酶切位点所有序列(8个碱基——ATTTAAAT)均被完全消除，不残留在质粒上。表达质粒成功插入脂肪酶基因后，即为四个脂肪酶表达模块，如图1的B所示。

[0126] 实施例3表达脂肪酶的里氏木霉工程菌株的构建

[0127] 将实施例2中的四个脂肪酶表达模块依次转化里氏木霉，最终得到的转化子即为里氏木霉工程菌株。本发明利用根瘤农杆菌介导法(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens‑mediated transformation ofFusarium circinatum.Mycol.Res.105(3):259‑264)将表达模块1(CBH1T1.0‑lip)转化里氏木霉菌株RUT‑C30(ATCC 56765)，脂肪酶会代替纤维素酶cbh1，获得一代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑1。采用木糖PDA培养基培养，缺失潮霉素抗性标记后，选择脂肪酶活力最高的菌株，作为宿主。接着将表达模块2(CBH2T1.0‑lip)转化一代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑1，获得二代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑2，脂肪酶会代替纤维素酶cbh2。缺失抗性标记后，选择脂肪酶活力最高的菌株，作为宿主。将表达模块3(XYN1T1.0‑lip)转化二代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑2，脂肪酶会代替木聚糖酶xyn1，获得三代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑3。缺失抗性标记后，选择脂肪酶活力最高的菌株，作为宿主。将表达模块4(XYN2T1.0‑lip)转化三代里氏木霉过程菌株Tr‑lip‑3，脂肪酶会代替木聚糖酶xyn2，获得四代转化子。缺失抗性标记后，选择脂肪酶活力最高的菌株，即为最终的里氏木霉工程菌株Tr‑lip‑4。在工程菌株中，两个纤维素酶cbh1和cbh2、两个木聚糖酶xyn1和xyn2均被脂肪酶基因代替，整个构建过程如图2的A所示。随着改造过程的进行，菌株在摇瓶发酵产生的脂肪酶的活力也逐渐提高，如图2的B所示。

[0128] 将里氏木霉工程菌株Tr‑lip‑4在里氏木霉发酵培养基发酵，诱导脂肪酶的分泌表达。发酵罐培养方法参照文献“Chen et al.Engineering ofTrichoderma reesei for enhanced degradation of lignocellulosic biomass by truncation of the cellulase activator ACE3.Biotechnol Biofuels.2020,13:62”。发酵结束后，取发酵液，
12500rpm转离心10min，取上清，即为脂肪酶粗酶液。将所述粗酶液进行喷雾干燥，加入通用的保护剂，制成固体脂肪酶粉，酶粉活力达100000U/g。

[0129] 实施例4脂肪酶的应用

[0130] 利用实施例3中制备得到的脂肪酶粉进行面包烘焙实验，以不添加脂肪酶为对照。

[0131] 本实施例中制作面包的面团配方为：小麦粉(面粉)1000g、酵母粉10g、盐16g、水580g、糖60g和植物油30g，对照组和实验组脂肪酶的添加量分别为0和15ppm，每组3个重复。

[0132] 面包制备步骤为：将上述配方的面团各成分加入到和面钵中，搅拌18min，使其形成均匀的面团。将和好的面团置于天平上，分成50g/个，放入方形模具中，至于38℃发酵60min，发酵好的面团放入180℃烤箱中焙烤10min，得到面包成品。

[0133] 将制得的面包室温下冷却2h，分别测定各实验组面包的质量和体积。计算面包比容，面包比容为面包的体积/面包的质量(mL/g)，结果如图3所示。感官测量面包的白度，结果如表2所示。

[0134] 表2不同脂肪酶添加量对烘焙食品白度的影响

[0135]

[0136] 注：+代表色深白度低，++代表色浅白度高。

[0137] 根据图3和表2数据表明，本方法提供的脂肪酶可以显著提高烘焙食品的比容和白度。

[0138] 由上述实施例的结果可知：本发明提供的分泌表达脂肪酶工程菌株生产的脂肪酶可应用于食品行业中的面团处理过程，提高烘焙食品的品质。

[0139] 综上所述，本发明公开了脂肪酶序列，并公开了对里氏木霉菌进行基因改造，成功构建了分泌表达脂肪酶的工程菌株的经过。该工程菌株生产的脂肪酶可以应用在食品行业，提高烘焙食品的品质。

[0140] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。