一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用 |
|||||||
| 申请号 | CN202210860300.1 | 申请日 | 2022-07-20 | 公开(公告)号 | CN117801974A | 公开(公告)日 | 2024-04-02 |
| 申请人 | 珠海益何生物技术有限公司; | 发明人 | 刘志刚; 王千诩; 钟涵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种罗伊氏乳杆菌C501及其应用，所述罗伊氏乳杆菌C501已于2022年5月17日保藏于广东省 微 生物 菌种保藏中心，其保藏号为GDMCCNo.62470。本发明的罗伊氏乳杆菌C501可用于制备改善 自闭症 社交障碍能 力 和重复性行为的合生元食品。本发明筛选所得罗伊氏乳杆菌C501安全性较好，改善脑部社交基因和 炎症 因子表达 水 平，发挥其有益作用，产生确切的健康功效；动物试验表明其制成的合生元具有较强改善自闭症社交障碍的功能。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种罗伊氏乳杆菌C501菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌C501已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No.62470。 |
||||||
| 说明书全文 | 一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用技术领域背景技术[0002] 合生元是“益生菌和益生元的混合制剂”。合生元的功能特点就是同时发挥益生菌与益生元的双重作用。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。益生元是指一类能促进有益菌生长的食物成分或物质，是一种不易被人体消化但可选择性刺激肠道内有益菌的生长或增强有益菌活性的益菌制品。相对于益生菌和益生元，合生元是一种更有效定植并发挥其功效的饮食策略。 [0003] 自闭症(Autism)又称孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorders，ASD)逐渐成为威胁儿童健康的重大公共卫生问题。近年，我囯ASD的患病人数呈明显上升趋势。ASD主要特征：社交沟通障碍、狭隘兴趣和刻板行为。据《中国自闭症教育康复行业发展状况报告》显示，我国目前超过1000万ASD患者，0‑14岁的ASD儿童可能已超300万，患病人数逐年增加。ASD儿童患者的肠道微生物构成与正常儿童存在显著的差异，如ASD儿童肠道中有益菌丰度相较与正常儿童来说有显著降低。ASD可采取几种饮食干预措施包括包括无麸质和无酪蛋白、生酮和特定碳水化合物饮食，以及益生菌等。 [0004] 目前，对于益生菌改善自闭症社交障碍的研究已经有不少报道，研究比较深入通过益生菌罗伊氏乳杆菌干预能改善自闭症的社交缺陷行为，但是目前关于合生元改善自闭症的报道较少，且已知益生菌或益生元在应用层面仍存在较大短板，研究表明大多数益生菌经口服后无法有效持续定植于肠道中，合理施用“益生元”被认为可以解决益生菌在肠道粘膜定植抗性的问题。因此研发一种新的具有改善ASD疗效的合生元组合物及其制剂是非常必要的。 发明内容[0007] 解决的技术问题 [0008] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。 [0009] (二)技术方案 [0010] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用，所述罗伊氏乳杆菌C501已于2022年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为GDMCC No.62470。 [0011] 优选的，所述罗伊氏乳杆菌C501应用在制备合生元组合物食品改善中。 [0012] 优选的，所述食品为改善自闭症的食品；优选的，所述食品作用于改善自闭症的社交障碍。 [0014] 优选的，所述合生元组合物具有改善自闭症功效，所述合生元组合物包括益生菌4 12 与益生元，所述益生菌的剂量为1×10‑1×10 CFU/day；益生元的剂量为0.015‑0.15g/day。 [0015] 优选的，所述具有改善自闭症的合生元组合物包括益生菌与益生元，所述益生菌6 10 的剂量为1×10‑1×10 CFU/day；益生元的剂量为0.03‑0.09g/day。 [0016] 优选的，所述具有改善自闭症的合生元组合物包括益生菌与益生元，所述益生菌8 的剂量为1×10CFU/day；益生元的剂量为0.06g/day。 [0017] (三)有益效果 [0018] 与现有技术相比，本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用，具备以下有益效果： [0019] 该罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用， [0020] 1、本发明筛选所得罗伊氏乳杆菌C501安全性较好，可以调解改善宿主的肠道微生态平衡，发挥其有益作用，产生确切的健康功效；动物试验表明其具有较强改善自闭症社交障碍的功能。 [0022] 图1显示根据本发明的具体实施例2益生菌罗伊氏乳杆菌C501添加不同碳源的生长曲线，横坐标代表生长时间，纵坐标代表OD值； [0023] 图2显示根据本发明的具体实施例2益生元菊粉添加不同梯度益生菌罗伊氏乳杆菌C501生长曲线，横坐标代表生长时间，纵坐标代表OD值； [0024] 图3显示根据本发明的具体实施例3益生菌罗伊氏乳杆菌C501、益生元菊粉、合生元对ASD小鼠社交偏好性的改善作用，横坐标代表组别，纵坐标代表社交时间； [0025] 图4显示根据本发明的具体实施例3益生菌罗伊氏乳杆菌C501、益生元菊粉、合生元对ASD小鼠社交新颖性的改善作用，横坐标代表组别，纵坐标代表社交时间； [0026] 图5为根据本发明的具体实施例3益生菌罗伊氏乳杆菌C501、益生元菊粉、合生元对ASD小鼠重复性行为的改善作用，横坐标代表组别，纵坐标代表自我梳理时间； [0027] 图6为根据本发明的具体实施例3益生菌罗伊氏乳杆菌C501、益生元菊粉、合生元提高了ASD小鼠皮层社交基因表达水平，横坐标代表组别，纵坐标代表基因表达水平； [0028] 图7为根据本发明的具体实施例3益生菌罗伊氏乳杆菌C501、益生元菊粉、合生元降低了ASD小鼠皮层炎症因子表达水平，横坐标代表组别，纵坐标代表基因表达水平。 具体实施方式[0029] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0030] 参考附图1‑7，本发明提供一种技术方案，一种罗伊氏乳杆菌C501菌株及其应用，其和益生元菊粉组成的合生元能够有效的改善ASD小鼠的社交障碍能力和重复性行为，以及改善脑部社交基因和炎症因子表达水平。 [0031] 在一些较为具体的实施方案中，罗伊氏乳杆菌C501在制备食品或药物中的应用，食品或药物为改善ASD的食品或改善ASD的药物。 [0032] 进一步的，药物包含的罗伊氏乳杆菌C501；以及医药用无毒载体。 [0033] 优选的，药物为复合益生菌片。 [0034] 食品包含的罗伊氏乳杆菌C501，以及食品学上可接受的添加剂。 [0035] 优选地，食品为合生元软糖。 [0036] 更进一步的，合生元软糖由低聚木糖、菊粉、低聚果糖、明胶、柠檬汁、果汁和罗伊氏乳杆菌C501制成；罗伊氏乳杆菌C501为冻干粉；冻干粉采用冻干机将罗伊氏乳杆菌C501的菌悬液在无菌环境下冷冻真空干燥而成。 [0037] 实施例1罗伊氏乳杆菌C501的分离鉴定 [0038] 1.培养基配方优化 [0039] 分组进行优化培养基实验，最后得到乳酸菌培养基最佳配方： [0040] MRS固体培养基1L配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温801.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂17.5g；pH6.5，121℃灭菌20min。 [0041] MRS肉汤培养基配方：酪蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏10.0g/L，酵母浸膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，吐温801.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锰0.05g/L，pH6.5，121℃灭菌20min。 [0042] GAM培养基配方： 胨10.0g，大豆胨3.0g，酵母浸粉5.0g，牛肉粉2.2g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，葡萄糖3.0g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3.0g，可溶性淀粉5.0g，L‑半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.3g，用蒸馏水定容至1L，调节PH值至7.3±0.1，121℃条件下灭菌 15min。 [0043] 2.菌株筛选 [0044] 罗伊氏乳杆菌C501菌种来源于健康人肠道，从健康的成年人粪便中分离得到。取‑3健康的成年人粪便，用无菌生理盐水，10倍梯度稀释样品后至10 倍，将其涂布于MRS固体培养基，置于37℃培养箱中培养24‑48h，观察菌落形态特征，并挑取MRS固体培养基上乳酸菌的疑似菌落，分别转接到MRS液体培养基中进行纯培养，并对株菌进行编号。 [0045] 对分离纯化得到的株菌进行改善ASD社交障碍能力的测定，详细实验步骤见实施例2和实施例3。 [0046] 3.菌种鉴定 [0047] 对筛选到的罗伊氏乳杆菌C501抽提细菌总DNA，进行16s rDNA扩增，引物为： [0048] sgF:5'‑TGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAG‑3' [0049] sgR:5'‑CGGATAACGCTTGCCACCTACG‑3' [0050] 利用上述引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收、测序。 [0051] 实施例2罗伊氏乳杆菌C501的体外生长曲线测定试验 [0052] (1)按照以下步骤检测菌株体外生长曲线测定筛选最佳碳源，具体如下： [0053] 通过全基因组测序技术测定获取罗伊氏乳杆菌C501的全基因组信息，通过COGNITOR对所有基因序列进行功能预测，筛选出所有碳水化合物利用相关基因；利用CAZy数据库获得所有碳水化合物利用相关基因组编码CAZy酶信息，通过NCBI及EC数据库对底物进行预测；完成对菌株特定益生元的预测。 [0054] 将菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h以上，将培养液以12,000×g、4℃离心10分钟。取上清液待用；以预测到的益生元为唯一碳源，以无碳源的半合成培养基为对照，以蔗糖和葡萄糖为碳源作为阳性对照，先在孔板中加入50μL的菌液，再加入300μL的碳源，利用生产曲线测定仪测定菌株在以相应益生元为底物的培养基中的生长曲线，进而确定益生元的效果，筛选出优势益生元，确定合生元的组成。 [0055] 表1培养基添加碳源的配方 [0056] [0057] 实验结果见图1，对罗伊氏乳杆菌C501进行不同碳源的生长曲线测定，表明其中益生元菊粉为作为罗伊氏乳杆菌C501的优势益生元，本发明的特异性合生元为益生菌罗伊氏乳杆菌C501和益生元菊粉。 [0058] (2)按照以下步骤检测菌株体外生长曲线测定筛选最佳益生菌和益生元干预剂量，具体如下： [0059] 将菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h以上，将培养液以12,000×g、4℃离心10分钟。取上清液待用；进行不同倍数稀释，涂板测定该上清浓度。以不同浓度的上述所得的最佳碳源为唯一碳源，先在孔板中加入50μL的菌液，再加入300μL的碳源，利用生产曲线测定仪测定不同梯度菌株在以最佳益生元为底物的培养基中的生长曲线，进而确定益生菌和益生元的最佳剂量。 [0060] 表2培养基添加碳源的配方 [0061] [0062] [0063] 实验结果见图2，益生元菊粉添加不同梯度益生菌罗伊氏乳杆菌C501生长曲线测8 定，体外试验表明益生菌最佳梯度为2×10 CFU/mL，益生元最佳浓度为20g/L。由于在孔板中加入50μL的菌液，以及加入300μL的碳源，换算到实际浓度比例为益生菌：益生元＝ 8 10CFU：0.06g。动物试验设计为通过灌胃补充益生菌，通过饮水补充益生元。灌胃灌100μL 9 即需灌胃菌液浓度约为1.0×10 CFU/mL；若饮水小鼠约为6mL需补充0.06g菊粉，则菊粉浓度为1％w/v。 [0064] 实施例3罗伊氏乳杆菌C501的体内有效性研究(动物实验) [0065] (1)实验菌株的制备： [0066] 将罗伊氏乳杆菌C501接种于MRS中，在37℃条件下培养24h以上。取培养液4,000×g,4℃离心10min，用无菌的1*PBS洗涤2次，用1*PBS缓冲液重悬，取1mL菌液备用剩余放于4℃。1mL菌液通过梯度稀释进行涂板计数，放37℃培养48h，进行计数，根据计数结果进行相9 应稀释，稀释到菌落数约为1.0×10CFU/mL。然后将活菌按每日使用量分装于5mL离心管，灌胃剂量为每天100uL/只，每组10只，共4组，需灌胃30天。 [0067] (2)实验动物分组及饲养方式： [0068] 利用实例2中得到的特异性合生元进行干预实验，选用7周龄的清洁级C57BL/6J雌性小鼠40只，随机分为2组，每组20只雌鼠，适应性喂养一周，自由饮水。适应性喂养后雌鼠与雄鼠进行合笼交配，雌：雄＝2:1，每日两次观察阴道栓，观察到阴道栓当天雌鼠单笼饲养，并记为妊娠期第0天。ASD模型构建：在雌鼠妊娠期12.5天以500mg/kg的剂量腹腔注射丙戊酸，对照腹腔注射等量的生理盐水。子代小鼠21天断奶后，进行分笼，只保留雄鼠进行后续干预试验，并保证子代来自于3只以上不同的母鼠。对ASD小鼠进行4周的罗伊氏乳杆菌C501灌胃干预或者等体积PBS灌胃，同时喂含特异性益生元(可溶性益生元)的饮水，合生元干预为益生菌和益生元同时干预。自闭症小鼠7周龄进行行为学实验评价合生元对自闭症小鼠社交障碍和重复性行为的改善作用。具体试验流程如下： [0069] 具体分组与处理如下：①对照组(CON)；②模型组(ASD)；③益生菌干预组(ASD+Pro)；④益生元干预组(ASD+Pre)；⑤合生元干预组(ASD+Syn)。断奶后进行干预，干预期间记录子代小鼠体重和饮食饮水量，干预一个月后收集小鼠粪便，进行行为学。 [0070] (3)样品采集与分析测试： [0071] 小鼠使用三溴乙烷麻醉，眼球取血后脱颈牺牲。血液经4000r/m离心10min后分离血清，收取小鼠血液、脑、结肠和结肠内容物用于后续研究。 [0072] (4)实验结果 [0073] 实验结果见图2、图3和图4，*表示显著性p<0.05，**表示显著性p<0.01。用含罗伊氏乳杆菌C501菌悬液和菌粉放在饮水中喂养ASD小鼠1个月后进行行为学三室社交和自我梳理试验，发现补充合生元可显著改善ASD小鼠的社交障碍能力及重复性行为。 [0074] 1个月后牺牲收集脑部组织，发现合生元改善模型小鼠的皮层社交基因表达水平(见图6)，降低了皮层的炎症因子表达水平(见图7)，表明罗伊氏乳杆菌C501在小鼠体内确有改善ASD小鼠的功效。 [0075] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。 [0081] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈