脂解酶变体 |
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| 申请号 | CN201980040964.X | 申请日 | 2019-06-18 | 公开(公告)号 | CN112292037B | 公开(公告)日 | 2024-03-22 |
| 申请人 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司; | 发明人 | 宙克·安妮琳·普赛斯; 尼尔·凯尔; 芮妮·马赛尔·德钟; 阿洛伊修斯·威廉默斯·鲁道夫斯·胡伯·泰; 尼森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽可为这样的多肽，所述多肽具有的 氨 基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述 位置 是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。本发明还涉及一种制备面团的方法，其中使用了如本文所公开的多肽，并且涉及由所述面团制备的 烘焙 产品。 | ||||||
| 权利要求 | 1. 一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO: 1的成熟氨基酸序列并且具有i）或ii）的氨基酸取代： |
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| 说明书全文 | 脂解酶变体技术领域背景技术[0002] 在烘焙行业中，例如在工业面团和面包制作中，加工助剂通常用于改善面团和/或烘焙产品的特性。可以改善的面团特性包括稳定性、气体保持能力、弹性、可延展性、可塑性等。可改善的烘焙产品的特性包括面包条(loaf)体积、面包皮松脆性、烤焙弹性、面包瓤质地(crumb texture)、面包瓤结构、面包瓤柔软度、风味、相对陈化和保质期。 [0003] 已知由全麦面粉制成的面团具有比由白面粉制成的面团更差的稳定性。因此，在醒发(proof)结束时，全麦面团损失更多的发酵气体，并且与由白面粉面团制成的烘焙产品的体积相比，全麦面团的烘焙产品的体积较小。具体地，在加工处理期间，当面团被揉捏(knocked)或捏制(jarred)时，面团体积受到攻击并且可能会部分塌陷。 [0004] 谷物面粉含有一定量的脂质和游离脂肪酸，并且在面粉储存期间，例如由于内源脂质的脂解，面粉中的游离脂肪酸的量通常会增加。这在全麦面粉的储存期间最为明显(参见例如Tait和Galliard，J Cereal Sci.1988,8:125‑137以及Clayton和Morrison，Sci.Food Agric.1972,23,721‑735)。面粉中游离脂肪酸的量影响面团特性，例如面团稳定性，以及由所述面团制成的烘焙产品的特性。 [0005] 可以将加工助剂(例如化学添加剂和酶)添加到面粉和/或面团中以改善面团或烘焙产品的特性。 [0006] 化学添加剂包括乳化剂，例如充当面团调整剂的乳化剂，例如双乙酰酒石酸单/双甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)或硬脂酰乳酸钙(CSL)。乳化剂例如DATEM也可用于增大或控制烘焙产品的体积。消费者对化学乳化剂的抵制日益增强，因此需要非化学类替代品。 [0007] 化学乳化剂的替代品为脂解酶，所述脂解酶在作用于底物时可原位产生乳化分子。例如，脂肪酶用于完全或部分替代DATEM。WO1998026057描述了可用于制作面包的方法中的磷脂酶。WO2009/106575描述了脂解酶及其在制作面包的方法中的用途。 [0009] 图1示出了曲霉属(Aspergillus)表达载体pGBFIN‑50 [0010] 图2示出了曲霉属脂解酶表达载体pGBFINPL‑00 [0012] SEQ ID NO:1：具有脂肪酶活性的多肽的氨基酸序列 [0013] SEQ ID NO:2：编码根据SEQ ID NO:1的具有脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列。 [0014] SEQ ID NO:3：根据SEQ ID NO:1的具有脂肪酶活性的多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列在304位之后具有两个氨基酸PP的插入。 [0015] SEQ ID NO:4：编码根据SEQ ID NO:3的具有脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列。 [0016] SEQ ID NO:5：经修饰的葡糖淀粉酶glaA启动子翻译起始序列SEQ ID NO:6：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)脂肪酶的氨基酸序列 [0017] SEQ ID NO:7：编码经密码子优化以在黑曲霉(Aspergillus niger)中表达的尖孢镰刀菌脂肪酶的核苷酸序列。 发明内容[0018] 本发明涉及一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽选自由以下项组成的组： [0019] i.多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的； [0020] ii.根据i)的所述多肽，其中在295位处的所述氨基酸取代是D295G、D295N或D295S，并且所述至少一个另外的氨基酸取代是：在113位处的I113H、I113N或I113T，在121位处的氨基酸取代N121D，在179位处的氨基酸取代V179M，和/或在位置284处的氨基酸取代I284M或I284T； [0021] iii.多肽，所述多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性，其中所述多肽包含氨基酸取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)，其中所述取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的； [0022] iv.根据i)至iii)的所述多肽，其中所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的氨基酸序列在304位之后包含一个或多个氨基酸的插入； [0023] v.根据iv)的所述多肽，其中所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列包含插入。 [0024] 本发明还涉及一种编码如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽的核酸，其中任选地所述核酸与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少70％同一性，其中所述核酸包含编码氨基酸取代D295G、D295N或D295S和至少一个另外的氨基酸取代I113H、I113N或I113T和/或N121D和/或V179M和/或I284M或I284T的突变，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的，其中所述取代的位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。 [0025] 还公开了一种表达载体，所述表达载体包含如本文所公开的核酸，所述核酸可操作地连接到至少一个控制序列，所述至少一个控制序列指导所述多肽在宿主细胞中的表达。 [0026] 本文还涉及一种包含如本文所公开的核酸或如本文所公开的表达载体的重组宿主细胞。 [0027] 本文还涉及一种用于制备如本文所公开的多肽的方法，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养宿主细胞，以及任选地回收所述多肽。 [0028] 本发明还涉及一种用于制备面团的方法，所述方法包括将如本文所公开的多肽或包含如本文所公开的多肽的组合物添加到所述面团中；以及一种包含如本文所公开的变异多肽的面团。 [0029] 本发明还涉及一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙如本文所公开的面团。 [0030] 还公开了如本文所公开的变异多肽用于增加面团的耐冲击性或增大烘焙产品的体积的用途。 [0031] 定义 [0032] 术语“烘焙产品”是指从面团制备的烘焙食物产品。 [0033] 烘焙产品(无论是白色、棕色还是全谷物类型(例如粗面粉型或全麦型)的)的示例包括通常呈面包条或面包卷形式的面包、法式长棍型面包、糕点、羊角面包、奶油蛋卷、意大利面包(panettone)、意大利面、面条(煮用面条或炒用面条)、皮塔饼和其他扁面包、墨西哥面饼、炸玉米饼、蛋糕、煎饼、饼干(尤其是软饼)、甜甜圈(包括酵母发酵型甜甜圈)、百吉饼、派皮、馒头、薄脆饼干、布朗尼蛋糕、大块蛋糕(sheet cake)、零食(例如，脆饼干(pretzel)、墨西哥炸玉米片、加工零食(fabricated snacks)、加工薯片(fabricated potato crisps))。烘焙产品通常通过在用于制备烘焙产品的合适温度(例如介于100℃与300℃之间的温度)下烘焙面团而制成。如本文所公开的烘焙产品可为粗面粉制面包或全麦的面包。 [0034] 术语“面团”在本文中被定义为面粉和其他成分的混合物。通常，面团硬到足以进行捏合或卷起(roll)。面团可以是新鲜的、冷冻的、预制的(prepared)或预烘焙的(parbaked)。面团往往由基本的面团成分制成，所述基本的面团成分包括(谷物)面粉(例如小麦粉或米粉)、水和任选的盐。对于发酵产品，主要使用发面酵母，并且任选地可以使用化学发酵化合物，例如酸(或酸生成化合物)和碳酸氢盐的组合。可以制成面粉的谷物包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、双粒小麦、硬质小麦和卡姆小麦。本文中的术语面团还包括面糊。面糊是一种半液体混合物，其薄到足以从勺子落下或倾倒，是一种或多种面粉与液体(例如水、牛奶)或用于制备各种食物(包括蛋糕)的蛋类的组合。 [0035] 术语“预混物”应以其常规含义来理解，即作为通常包括面粉、淀粉、麦芽糖糊精和/或盐在内的烘焙剂的混合物，其不仅可以用于工业面包烘焙厂/设施中，而且还可以用于零售面包店中。预混物包含如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽。预混物可含有如本文所提及的添加剂。 [0036] 在大多数情况下，添加剂以粉末形式添加。合适的添加剂包括氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA)、还原剂(包括L‑半胱氨酸)、乳化剂(包括但不限于单甘油酯和双甘油酯，单甘油酯为例如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、聚甘油脂肪酸酯(PGE)以及双乙酰酒石酸单/双甘油酯(DATEM)、丙二醇单硬脂酸酯(PGMS)、卵磷脂)、树胶(包括瓜尔胶和黄原胶)、香精、酸(包括柠檬酸、丙酸)、淀粉、改性淀粉、保湿剂(包括甘油)和防腐剂。 [0037] 如本文所用的术语“控制序列”是指在特定生物体内或体外参与编码序列表达的调节的组分。控制序列的示例是转录起始序列、终止序列、启动子、前导序列、信号肽、前肽、前原肽或增强子序列；夏因‑达尔加诺序列(Shine‑Delgarno sequence)、阻遏物或激活物序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定化细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强蛋白质分泌的序列。 [0038] 术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。 [0039] “表达载体”包含编码多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至适当的控制序列(例如启动子，以及转录和翻译终止信号)以用于在体外表达和/或翻译。表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，该表达载体可以方便地经历重组DNA程序并且可以引起多核苷酸的表达。载体的选择将通常取决于载体与要导入载体的细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。载体可以是自主复制载体，即这样的载体，所述载体作为染色体外实体存在，所述载体的复制独立于染色体复制，为例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是这样的载体，所述载体当被引入宿主细胞时整合到基因组中并与其所整合到的染色体一起复制。整合克隆载体可以整合在宿主细胞的染色体中的随机或预定靶基因座处。载体系统可以是单一载体或质粒或两种或更多种载体或质粒，所述载体或质粒一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。优选用于细菌的载体例如在WO‑A1‑2004/074468中公开。 [0040] 如本文所定义的“宿主细胞”是适用于遗传操纵并且可以在可用于工业生产目标产物(例如根据本发明的多肽)的细胞密度下培养的生物体。宿主细胞可以是在自然界中发现的宿主细胞，或来源于亲本宿主细胞的遗传操纵或经典诱变后的宿主细胞。有利地，宿主细胞是重组宿主细胞。宿主细胞可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、植物、动物、或昆虫宿主细胞。 [0041] 核酸或多核苷酸序列在本文中定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。术语“核酸”和“多核苷酸序列”在本文中可互换使用。核酸或多核苷酸序列在本文中定义为包含至少5个核苷酸或核酸单元的核苷酸聚合物。核苷酸或核酸是指RNA和DNA。 [0042] 术语“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸残基并含有多于五个氨基酸残基的分子。如本文所用的术语“蛋白质”与术语“多肽”同义，并且还可以指两种或更多种多肽。因此，术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用。可任选地修饰(例如，糖基化、磷酸化、酰化、法尼基化、异戊烯基化、磺化等)多肽以增加官能性。在某些条件下在特定底物存在下表现出活性的多肽可称为酶。应当理解，由于遗传密码的简并性，可以产生编码给定多肽的多种核苷酸序列。 [0043] 如本文所公开的多肽可以是融合或杂合多肽，另一种多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端处融合。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合来产生融合多肽。 [0044] 用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，以使得它们符合读框并且融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的控制下。杂合多肽可包含从至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种所述多肽可与宿主细胞异源的。融合多肽和信号序列融合体的示例例如如WO2010/121933中所述。 [0045] 如本文所用的术语“分离的多肽”是指从与所述多肽天然相关的至少一种组分(例如其他多肽材料)中取出的多肽。分离的多肽可以不含任何其他杂质。如通过SDS‑PAGE或任何其他适用于此目的并且为本领域技术人员所已知的分析方法所测定的，分离的多肽可以为至少50％纯，例如至少60％纯、至少70％纯、至少75％纯、至少80％纯、至少85％纯、至少80％纯、至少90％纯，或至少95％纯、96％纯、97％纯、98％纯、99％纯、99.5％纯、99.9％纯。 分离的多肽可以由重组宿主细胞产生。 [0046] “成熟多肽”在本文中定义为这样的多肽，所述多肽处于其最终形式下并且在将mRNA翻译成多肽并对所述多肽进行翻译后修饰后获得。翻译后修饰包括N‑末端加工、C‑末端截短、糖基化、磷酸化，以及通过切割去除前导序列(诸如信号肽、前肽和/或前原肽)。 [0047] “成熟多肽编码序列”是指编码成熟多肽的多核苷酸。 [0048] 术语“启动子”在本文中被定义为这样的DNA序列，所述DNA序列结合RNA聚合酶并将所述聚合酶引导至核酸序列的正确下游转录起始位点以启动转录。合适的细菌启动子例如在WO‑A1‑2004/074468中公开。 [0049] 当关于核酸或蛋白质使用时，术语“重组”是指该核酸或蛋白质如果与其天然形式相比则已经通过人工干预进行了序列修饰。当涉及细胞(例如宿主细胞)时，术语“重组”表示该细胞的基因组如果与其天然形式相比则已经通过人为干预进行了序列修饰。术语“重组”与“经遗传修饰的”同义。 [0050] 序列同一性或序列同源性在本文中可互换使用。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的序列同源性或序列同一性百分比，对序列进行比对以实现最佳比较目的。为了优化两个序列之间的比对，可以在进行比较的两个序列中的任一序列中引入空位。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，可以在较短的长度上进行比对，例如在约20个、约50个、约100个或更多个核苷酸/碱基或氨基酸上进行比对。序列同一性是两个序列之间在所报告的比对区域上相同匹配的百分比。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443‑453)。该氨基酸序列和核苷酸序列都可以通过算法来进行比对。已在计算机程序NEEDLE中实现了Needleman‑Wunsch算法。出于本发明的目的，使用来自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0版或更高版本，EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice, P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)，第276‑277页，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列，使用EBLOSUM62来用于取代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。所使用的任选参数是为10的空位开放罚分和为0.5的空位延伸罚分。技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但是两个序列的总体同一性百分比不会显著改变。如上所述通过程序NEEDLE进行比对后，查询序列与本发明序列之间的序列同一性百分比计算如下：比对中对应位置(其显示两个序列中的相同氨基酸或相同核苷酸)的数目除以减去比对中的空位总数后的比对总长度。 如本文所限定的同一性可以通过使用NOBRIEF选项从NEEDLE获得，并在程序的输出中标记为“最长同一性”。 [0051] 本发明的核酸序列和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403‑10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来执行此类搜索。可以用得分＝ 100、字长＝12的NBLAST程序来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用得分＝50、字长＝3的XBLAST程序来执行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用空位BLAST，如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389‑3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。 [0052] 通过体外化学或酶促合成来产生“合成分子”，诸如合成核酸或合成多肽。所述合成分子包括但不限于用所选宿主生物体的最佳密码子使用制备的变异核酸。 [0053] 可以优选根据WO2006/077258和/或WO2008000632中描述的方法，来优化合成核酸的密码子使用，该等专利以引用方式并入本文。WO2008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样的一种方法，在所述方法中，编码已经关于多肽的密码子使用(特别是所使用的密码子对)进行修饰的多肽的核苷酸序列，被优化以获得编码所述多肽的核苷酸序列的改善表达和/或所编码多肽的改进产生。密码子对被定义为编码序列中的一组两个紧接三联体(密码子)。本领域技术人员应知道，密码子使用需要根据宿主物种进行调整，可能导致相对于SEQ ID NO:2具有显著同源性偏差，但仍然编码根据本发明的多肽的变体。 [0054] 如本文所用，术语“变体”(“变异”)或“突变体”(“突变”)可互换地使用。它们可以指多肽或核酸。变体包括在相对于参考序列的一个或多个位置处的取代、插入、缺失、截短、颠换和/或倒位。可以通过例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及本领域技术人员已知的各种其他重组方法来产生变体。核酸的变异基因可以通过本领域已知的技术人工合成。 具体实施方式[0055] 本发明涉及一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽选自由以下项组成的组： [0056] i.多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的； [0057] ii.根据i)的所述多肽，其中在295位处的所述氨基酸取代是D295G、D295N或D295S，并且所述至少一个另外的氨基酸取代是：在113位处的I113H、I113N或I113T，在121位处的氨基酸取代N121D，在179位处的氨基酸取代V179M，和/或在位置284处的氨基酸取代I284M或I284T；以及 [0058] iii.多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性，其中所述多肽包含氨基酸取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)，其中所述取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的；以及 [0059] iv.根据i)至iii)的所述多肽，其中所述多肽在304位之后包含一个或多个氨基酸的插入，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的；以及 [0060] v.根据iv)的所述多肽，其中所述成熟氨基酸序列包含插入。 [0061] 因此，本发明涉及一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽选自由以下项组成的组： [0062] i.多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1定义的； [0063] ii.根据i)的所述多肽，其中在295位处的所述氨基酸取代是D295G、D295N或D295S，并且所述至少一个另外的氨基酸取代是：在113位处的I113H、I113N或I113T，在121位处的氨基酸取代N121D，在179位处的氨基酸取代V179M，和/或在位置284处的氨基酸取代I284M或I284T；以及 [0064] iii.多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性，其中所述多肽包含氨基酸取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)，其中所述取代是参照SEQ ID NO:1定义的；以及 [0065] iv.根据i)至iii)的所述多肽，其中所述多肽在304位之后包含一个或多个氨基酸的插入，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1定义的；以及 [0066] v.根据iv)的所述多肽，其中所述成熟氨基酸序列包含插入。 [0067] 因此，本发明还涉及一种具有脂肪酶活性的变异多肽，其中所述多肽选自由以下项组成的组： [0068] i.多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述位置是参照SEQ ID NO:6定义的； [0069] ii.根据i)的所述多肽，其中在295位处的所述氨基酸取代是D295G、D295N或D295S，并且所述至少一个另外的氨基酸取代是：在113位处的I113H、I113N或I113T，在121位处的氨基酸取代N121D，在179位处的氨基酸取代V179M，和/或在位置284处的氨基酸取代I284M或I284T；以及 [0070] iii.多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％同一性，其中所述多肽包含氨基酸取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)，其中所述取代是参照SEQ ID NO:6定义的；以及 [0071] iv.根据i)至iii)的所述多肽，其中所述多肽在304位之后包含一个或多个氨基酸的插入，其中所述位置是参照SEQ ID NO:6定义的；以及 [0072] v.根据v)的所述多肽，其中所述成熟氨基酸序列包含插入。 [0073] 令人惊讶地发现，当在面团中使用如本文所公开的多肽时，与由包含参考多肽的面团制成的烘焙产品的耐冲击性、面团稳定性和/或体积相比，由所述面团制成的烘焙产品的耐冲击性增大、面团稳定性提高和/或体积增大。参考多肽可以被定义为如本文所公开的变异多肽的亲本多肽。措词“参考多肽”和“亲本多肽”在本文中可互换使用。如本文所公开的参考多肽可以是这样的多肽，所述多肽与SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％同一性，但是所述多肽不包含氨基酸取代D295G、D295N或D295S，并且不含有或包含至少一个另外的氨基酸取代I113H、I113N或I113T、N121D、V179M和/或I284M或I284T。如本文所公开的参考多肽可以是这样的多肽，所述多肽与SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％或100％同一性，但是所述多肽不含有或包含氨基酸取代D295G、D295N或D295S，并且不含有或包含至少一个另外的氨基酸取代I113H、I113N或I113T、N121D、V179M和/或I284M或I284T。 [0074] 参考多肽或亲本多肽可包含或含有SEQ ID NO:1的氨基酸34至304或SEQ ID NO:6的氨基酸34至304。 [0075] 如本文所用的烘焙产品可为面包。在包含全麦面粉和/或含有0.01w/w％至0.8w/w％(例如0.05w/w％至0.6w/w％、例如0.1w/w％至0.5w/w％或0.2w/w％至4w/w％)的游离脂肪酸的面粉的面团和烘焙产品中令人惊讶地发现了提高的面团稳定性和/或增大的烘焙产品体积。谷物或谷类中的脂肪酸是已知的，并且包括棕榈酸、油酸、亚油酸和/或亚麻酸。面粉可以是经储存的面粉，例如储存了1天至10年，例如储存了1个月至5年，或储存了2个月至1年的面粉。 [0076] 面团稳定性可以通过测量由面团制成的烘焙产品的体积来确定。与从包含具有脂肪酶活性的参考多肽的面团制备的烘焙产品的体积相比，从包含如本文所公开的多肽的面团制备的烘焙产品的体积增大了1％至40％，例如2％至30％、例如3％至20％、例如4％至15％。可以在对如本文所定义的面团进行冲击处理之后确定从包含如本文所公开的多肽的面团制备的烘焙产品的增大的体积。 [0077] 如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽可以是这样的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含在295位处的氨基酸取代和在113、121、179和/或284位处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。 [0078] 如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽可以是这样的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列，其中所述多肽包含氨基酸取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)，其中所述取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。 [0079] 如本文所公开的多肽可以是分离的或合成的多肽。 [0080] 如本文所公开的具有脂肪酶活性的变异多肽可包含一个或多个另外的氨基酸取代。例如，如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽可包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或更多个另外的氨基酸取代、缺失和/或插入，由此所述多肽仍然具有本发明的多肽的活性或功能。 [0081] 氨基酸在本文中以本领域技术人员已知的其单字母代码指代，并且可见于Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001中。为了举例说明，在本文鉴定的位置处的氨基酸是D＝Asp＝天冬氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、N＝Asn＝天冬酰胺、I＝Ile＝异亮氨酸；H＝His＝组氨酸；V＝Val＝缬氨酸；M＝Met＝蛋氨酸；P＝Pro＝脯氨酸；S＝Ser＝丝氨酸；T＝Thr＝苏氨酸。 [0082] 具有脂肪酶活性的多肽也称为脂肪酶或脂解酶。如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽可具有任何合适的脂肪酶活性，例如三酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性。如本文所公开的脂肪酶可具有磷脂酶A1活性。脂肪酶活性可以根据本领域已知的方法确定。 [0084] 半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)水解半乳糖脂中的酯键。半乳糖脂由具有酯化的脂肪酸的甘油主链组成，而第二和/或第三羟基与糖残基结合，例如在半乳糖脂单半乳糖酰甘油二酯(MGDG)或双半乳糖酰甘油二酯(DGDG)的情况下。 [0085] 磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)催化对来自磷脂(二酰基甘油磷脂)的sn‑1位处的脂肪酰基的双酰化，以生成溶血磷脂和游离脂肪酸。 [0086] 如本文所公开的包含氨基酸取代、具有脂肪酶活性的变异多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列至少70％的同一性。SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列可包含或含有SEQ ID NO:1的氨基酸34至304、氨基酸34至302、氨基酸34至303、氨基酸34至 307、氨基酸31至303、氨基酸31至304和/或氨基酸31至307。SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列可包含或含有SEQ ID NO:1的氨基酸34至304。具有脂肪酶活性的多肽的长度，例如SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列的长度，可以通过如在材料和方法部分中所公开的LC‑MS分析来确定。 [0087] SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列包含或含有SEQ ID NO:6的氨基酸34至304。 [0088] 如本文所公开的多肽可在304位之后包含一个或多个氨基酸的插入，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。因此，在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的304位与305位之间插入一个或多个氨基酸，例如两个氨基酸。可以在304位与305位之间插入任何合适的氨基酸。SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的304位之后的插入可包含两个脯氨酸氨基酸(脯氨酸(P)–脯氨酸(P))。 [0089] 在一个实施方式中，如本文所定义的多肽的成熟氨基酸序列可包含插入。例如，包含如本文所公开的氨基酸取代中的任何氨基酸取代的如本文所定义的具有脂肪酶活性的多肽，可以是这样的多肽，所述多肽与SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。SEQ ID NO:3的成熟氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸34至306。 [0090] 本发明还涉及一种编码如本文所公开的具有脂肪酶活性的多肽的核酸。所述核酸可以是这样的核酸，所述核酸与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其中所述核酸包含编码氨基酸取代D295G、D295N或D295S和在I113H、I113N或I113T和/或N121D和/或V179M和/或I284M或I284T位处的至少一个另外的氨基酸取代的突变，其中所述氨基酸取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。如本文所公开的核酸可以是这样的核酸，所述核酸与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7具有至少60％、70％、75％、 80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其中所述核酸包含编码氨基酸取代D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)的突变，其中所述取代是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。 [0091] 如本文所公开的核酸可为分离的或合成的核酸。 [0092] 本文还公开了一种表达载体，所述表达载体包含如本文所公开的核酸，所述核酸可操作地连接到至少一个控制序列，所述至少一个控制序列指导所述多肽在宿主细胞中的表达。 [0093] 有几种本领域技术人员已知的用于将核酸插入核酸构建体或表达载体中的方法，参见例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001。可能需要用控制序列(例如启动子和终止子序列)来操纵编码本发明多肽的核酸。 [0094] 可以使用能够指导在本公开的宿主细胞中转录的多种启动子。启动子序列可以源自高度表达的基因。强组成型启动子是众所周知的，并且可以根据要在宿主细胞中控制的特定序列来选择合适的强组成型启动子。合适的启动子的示例列于WO 2009/106575中，包括丝状真菌中的合适启动子的示例。其中提到的所有启动子都是本领域中可容易获得的。 [0095] 可以使用本领域的技术人员已知的在如本文所公开的细胞中有功能的任何终止子。丝状真菌中合适的终止子序列的示例包括丝状真菌基因的终止子序列，例如在WO 2009/106575中列出的那些。 [0096] 本文还公开了一种包含如本文所公开的核酸或如本文所公开的表达载体的重组宿主细胞。 [0098] 真核细胞可以是真菌细胞，例如酵母细胞，例如假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)的细胞。 酵母细胞可来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)。 [0099] 优选的丝状真菌细胞属于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、青霉菌属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)、踝节菌属(Rasamsonia)、梭孢壳属(Thielavia)、镰刀菌属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)的物种，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)、亚拉巴马枝顶孢(Acremonium alabamense)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)、太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)或产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum)的物种。丝状真菌宿主细胞属于曲霉属，例如物种黑曲霉。 [0100] 丝状真菌细胞还可包含一种或多种修饰，优选地在其基因组中的一种或多种修饰，使得如果与亲本宿主细胞相比较并在相同条件下测量，则所述突变丝状真菌宿主细胞在所述细胞中缺乏选自以下的至少一种产物：葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定的α‑淀粉酶(amyA)、中性α‑淀粉酶(amyBI和amyBII‑WO2011009700)、α‑1,3‑葡聚糖合酶(优选AgsE或AgsE和AgsA，WO2014013074、WO2016066690)、α‑淀粉酶AmyC(AmyC)、毒素(优选赭曲霉毒素和/或伏马菌素(WO2011009700))、蛋白酶转录调节因子prtT(WO 00/20596、WO 01/68864、WO 2006/040312和WO 2007/062936)、PepA、由基因hdfA和/或hdfB编码的产物、非核糖体肽合酶npsE(WO2012001169)，为锌双核簇转录调节因子缺陷型菌株(WO2018166943和其中的参考文献)。 [0101] 本文还公开了用于生成变异多肽的方法，其中所述方法包括 [0102] i.选择包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的亲本多肽；以及 [0103] ii.将295位处的氨基酸取代为G、N或S并且将113位处的至少一个另外的氨基酸取代为H、N或T；和/或将121位处的氨基酸取代为D；和/或将179位处的氨基酸取代为M和/或将284位处的氨基酸取代为M或T，其中所述位置是参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6定义的。 [0104] 生成如本文所公开的变异多肽可包括在合适的重组宿主细胞中表达编码所述变异多肽的基因，以及培养所述宿主细胞以生成所述变异多肽。 [0105] 本公开还涉及一种用于制备如本文所公开的多肽的方法，所述方法包括在允许所述多肽表达的条件下在合适的发酵培养基中培养如本文所公开的宿主细胞，以及任选地回收所述多肽。本领域技术人员知道如何取决于所使用的宿主细胞来执行用于制备具有脂肪酶活性的多肽的方法。合适的发酵培养基通常包含碳和氮源。通常，发酵培养基的pH值介于3与8之间。培养宿主细胞的合适温度通常介于25℃与60℃之间。 [0107] 有利地，从发酵培养基中回收或分离本文所公开的多肽。从发酵培养基回收或分离多肽可以例如通过离心、过滤和/或超滤来执行。 [0108] 本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含根据本发明的多肽。所述组合物可为固体或流体组合物。所述组合物可包含选自由以下项组成的组的一种或多种组分：乳粉、面筋、粒状脂肪、附加的酶、氨基酸、盐、氧化剂、还原剂、乳化剂、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、聚甘油脂肪酸酯和双乙酰酒石酸单/双甘油酯、树胶、调味剂、酸、淀粉、改性淀粉、保湿剂和防腐剂。所述组合物包含预混物。 [0109] 如本文所公开的组合物可包含一种或多种另外的酶，例如淀粉酶，例如α‑淀粉酶，例如真菌α‑淀粉酶(其可用于提供可被酵母发酵的糖)、β‑淀粉酶；葡聚糖转移酶；肽酶，特别是外肽酶(其可用于风味增强)；转谷氨酰胺酶；纤维素酶；半纤维素酶，特别是戊聚糖酶，例如木聚糖酶(其可用于戊聚糖，更特别地阿拉伯糖基木聚糖的部分水解，这会增加面团的可延展性)；蛋白酶(其可用于特别当使用硬质小麦面粉时进行面筋减弱)；蛋白质二硫键异构酶，例如如在WO 95/00636中公开的蛋白质二硫键异构酶；糖基转移酶；过氧化物酶(其可用于改善面团的稠度)；漆酶；氧化酶，例如己糖氧化酶、葡糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶；脂氧合酶；L‑氨基酸氧化酶(其可用于改善面团粘稠度)和/或天冬酰胺酶。 [0110] 本发明还涉及一种用于制备面团的方法，所述方法包括将如本文所公开的多肽或如本文所公开的组合物添加到面团中。用于制备面团的方法是本领域烦人技术人员已知的，并且通常包括混合面团成分，例如面粉、水和任选的盐。如本文所公开的制备面团的方法包括例如在面团的制备期间，例如在混合其他面团成分期间，向所述面团中添加具有脂解活性的多肽。将适量的具有脂解活性的多肽添加到面团中。合适量的具有脂解活性的多肽可以例如用GalLU表示。 [0111] 具有脂肪酶活性的多肽的合适量可为10GalLU/kg面粉至3000GalLU/kg面粉，例如20GalLU/kg面粉至2000GalLU/kg面粉，例如50GalLU/kg面粉至1500GalLU/kg面粉，例如 100GalLU/kg面粉至1400GalLU/kg面粉。 [0112] 本发明还涉及一种面团，所述面团包含如本文所公开的变异多肽或如本文所公开的组合物的。令人惊讶地发现，与用参考多肽制备的面团相比，如本文所公开的面团或由如本文所公开的面团制成的烘焙产品具有改善的特性。具体地，当面团由全麦粉和/或包含的游离脂肪酸含量为0.01w/w％至0.8w/w％(例如0.05w/w％至0.6w/w％，例如0.1w/w％至0.5w/w％)的面粉制成时，发现了改进的特性。面粉中的游离脂肪酸可最初存在或在面粉储存时形成。改善的特性可为增加的耐冲击性、增加的面团稳定性和/或改善的面包体积。参考多肽是如上文所定义的多肽。 [0113] 术语“增加的面团稳定性”在本文中被定义为这样的面团特性，所述面团特性不易受由于机械滥用而导致的形成故障的影响，并且因此与参考面团相比更好地保持其形状和体积。面团稳定性可以通过正常和/或延长醒发后面包条的横截面的高度:宽度之比来评估。 [0114] 改善的面团稳定性可为改善的面团耐冲击性。改善的面团耐冲击性可以通过使面团经受如下冲击处理来证明。 [0115] 在醒发后，使相应罐中的面团经受由250g金属球进行的机械捏制，所述金属球沿着使用定制装置以约45°设置的轨道向下滚动，撞入容纳所述面团的罐中；对于所谓的‘中等冲击’，将轨道设置在约350mm(例如310mm)的高度，而对于所谓的‘高冲击’，将轨道设置在大约650mm，例如600mm的高度。 [0116] 术语“增大的烘焙产品体积”优选地被测量为使用如本领域中已知的超声或激光检测，通过自动面包体积分析仪(例如，BVM‑3，TexVol Instruments AB,Viken,Sweden)测定给定面包条的体积，并与参考烘焙产品的体积进行比较。在体积增大的情况下，特性得到改善。或者，在相同大小的罐中烘焙之后的烘焙产品高度指示烘焙产品的体积。在烘焙产品的高度增加的情况下，烘焙产品的体积增大。 [0117] 本发明还涉及一种制备烘焙产品的方法，所述方法包括烘焙如本文所公开的面团。本领域的技术人员知道如何制备烘焙产品，并且通常包括将面团在烤箱中在合适的温度下烘焙以制备烘焙产品。用于制备烘焙产品的合适温度为例如介于100℃与300℃之间。 [0118] 本发明还涉及如本文所公开的变变异多肽用于增加面团耐冲击性，或改善面团稳定性或增大由所述面团制成的面包的体积的用途。因此，本文公开了一种用于使用如本文所公开的多肽来改善面团耐冲击性或改善面团稳定性的方法。如本文所公开的变异多肽用于增加面团耐冲击性、改善面团稳定性或和/或增大如本文所公开的烘焙产品的体积的用途是相对于如上文所定义的参考多肽的用途而言的。因此，本文公开了一种使用如本文所公开的多肽来增加面团耐冲击性、改善面团稳定性和/或改善烘焙产品的体积的方法。 [0119] 本发明还涉及一种增大烘焙产品的体积的方法，所述方法包括 [0120] ‑制备包含如本文公开的多肽的面团， [0121] ‑对所述面团进行冲击处理，以及 [0122] ‑烘焙所述面团， [0123] 其中与由包含如上文所定义的参考多肽的面团制备的烘焙产品的体积相比，所述烘焙产品的体积增大了。 [0124] 本文所公开的面团或烘焙产品可包含任何合适的谷物面粉，例如全麦面粉或不同面粉的混合物。谷物面粉还可包含麸皮、谷粒和/或种子。谷物包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、双粒小麦、硬质小麦和卡姆小麦。全麦面粉，也称为全小麦面粉，是由整个小麦籽粒或谷粒(包括外部)制成的面粉。面粉可包含介于0.01w/w％至0.8w/w％之间，例如介于0.05w/w％至0.6w/w％的游离脂肪酸含量，例如介于0.1w/w％至0.5w/w％之间或介于0.14w/w％至0.4w/w％之间的游离脂肪酸含量。在储存期间，面粉中的游离脂肪酸含量通常会增加。游离脂肪酸可例如为亚油酸(C18:2)、棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚麻酸(C18:3)(参见例如MacMurray和Morrison，J.Sci.Food Agr.21:520‑528(1970))。面粉中的游离脂肪酸可以通过本领域的技术人员已知的方法来测定，例如如在Fierens等人，J.of Cereal Science 65(2015)，第81‑87页中所公开的。 [0125] 实施例 [0126] 标准遗传技术，诸如酶在宿主细胞中的过表达、对宿主细胞的遗传修饰、或杂交技术是本领域中已知的方法，诸如在Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press或F.Ausubel等人编著，"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)中描述的那些技术。用于真菌宿主细胞的转化、遗传修饰的方法是从例如EP‑A‑0 635574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP‑A‑0481008、EP‑A‑0635 574和US 6,265,186中已知的。 [0127] 材料和方法 [0128] pH5.5下的对DGDG脂解活性的GalLU测定 [0129] 制备以下溶液： [0130] 1)底物溶液：1g来自燕麦的双半乳糖酰甘油二酯(DGDG)在2％Triton X‑100中的溶液。 [0131] 2)0.2M醋酸盐缓冲液pH 5.5 [0132] 3)0.1M CaCl2 [0133] 4)终止溶液：1M HCl [0134] 将500μL的溶液1、250μL的溶液2和50μL的溶液3的混合物在37℃下平衡。通过添加100μL含有脂解活性的溶液(适当稀释以含有介于0.05‑1.0GalLU/mL之间的活性)来开始反应。在37℃孵育10分钟后，通过添加100μL的溶液4终止反应。通过在不添加含有脂解活性的样品的情况下将500μL的溶液1、250μL的溶液2和50μL的溶液3的混合物在37℃下孵育10分钟来执行空白测量。在添加100μL的溶液4(终止溶液)后，添加100μL的含有脂解活性的溶液。通过使用Wako HR系列NEFA‑HR(2)诊断试剂盒(产品目录号999‑34691/991‑34891/993‑ 35191)并遵循其包装说明书中所述的使用说明来确定反应和空白中所形成的游离脂肪酸的量。活性计算如下： [0135] GalLU/mL＝(ΔFFA×Vt×df)/(Vs×t) [0136] ΔFFA＝样品中的FFA‑空白中的FFA(μmol/mL) [0137] Vt＝停止反应后的总体积(1mL) [0138] Vs＝样品体积(0.1mL) [0139] t＝孵育时间(10分钟) [0140] df＝样品的稀释倍数 [0141] 1GalLU被定义为在测试条件下每分钟释放一微摩尔游离脂肪酸的酶量。 [0142] LC‑MS分析 [0143] 在LC‑MS分析之前，蛋白质样品通过添加三氯乙酸(TCA)至终浓度10％而进行三氯乙酸沉淀。在离心后，将沉淀用丙酮洗涤，然后溶于50mM氢氧化钠中，并且进一步用100mM碳酸氢铵稀释，然后再用肽N‑糖苷酶F(PNGase F)脱糖基化。为了通过LC‑MS表征完整蛋白质质量氨基酸主链，使用Acquity I级Synapt G2‑S(Waters)分析所有样品，该Acquity I级Synapt G2‑S以正电喷雾电离模式(ESI‑pos)操作，以分辨率模式(R＝20000FWHM)使用，并且扫描范围为500‑3500m/z。 [0144] 用Waters Acquity UPLC蛋白质BEH300 C4 1.7μm 孔径2.1×50mm柱，使用以(A)0.1％甲酸(FA)在LC‑MS级水中的溶液和B)0.1％FA在LC‑MS级乙腈中的溶液作为流动相进行的梯度洗脱，来实现色谱分离。 [0145] 15分钟的梯度以2％B开始，然后在2分钟后在0.2分钟内线性增加到15％B，然后在5.8分钟内线性增加到40％B，之后在0.2分钟内线性增加到95％B并保持在95％B处4分钟，然后用2％B重新平衡4分钟。将流速保持在0.4mL/min，使用2μL的进样量，并将柱温设置为 75℃。 [0147] 菌株 [0148] WT1：该黑曲霉菌株用作野生型菌株。该菌株以保藏号CBS513.88保藏在CBS Institute。 [0149] GBA 306：使用WT1作为起始菌株来构建GBA 306已在WO2011/009700中详细描述。该GBA 306菌株具有以下基因型：ΔglaA、ΔpepA、ΔhdfA、经适应的BamHI扩增子、ΔamyBII、ΔamyBI和ΔamyA。 [0150] 酶 [0151] Golden可从DSM Food Specialties商购获得。Golden包含来自SEQ ID NO:1的野生型成熟脂肪酶。 [0152] F获自Novozymes。 F包含来自SEQ ID NO:6的野生型成熟脂肪酶。 [0153] 实施例1：脂解酶变体的设计、克隆和表达 [0154] 设计和克隆 [0155] 具有脂解活性的参考多肽(也称为亲本(成熟)多肽)的蛋白质序列(氨基酸序列)示出为SEQ ID NO:1的氨基酸34至304。设计了用于在黑曲霉中表达脂解酶蛋白(脂解酶变体和参考多肽)的经密码子适应的DNA序列，所述DNA序列包含附加的BsaI II型限制性酶切位点，以便能够在曲霉表达载体pGBFIN‑50中亚克隆(还参见图1)。如WO2008/000632中所述执行密码子适应。用于在黑曲霉中表达编码SEQ ID NO:1的参考多肽的基因的经密码子优化的DNA序列在SEQ ID NO:2中示出。 [0156] 另外，制备具有SEQ ID NO:1的氨基酸34至304和在304位之后的两个脯氨酸插入的多肽序列，如SEQ ID NO:3的氨基酸34至306所示。用于在黑曲霉中表达编码SEQ ID NO:3的多肽的基因的经密码子优化的DNA序列在SEQ ID NO:4中示出。 [0157] 另外，以如上所述类似的方式制备具有SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列(即SEQ ID NO:6的氨基酸34至304)的具有脂解活性的参考多肽。用于在黑曲霉中表达编码SEQ ID NO:6的参考多肽的基因的经密码子优化的DNA序列在SEQ ID NO:7中示出。 [0158] SEQ ID NO:1的变异脂肪酶被表示为PAN2[...]，SEQ ID NO:3的变异脂肪酶被表示为NBL[…]，并且SEQ ID NO:6的变异脂肪酶被表示为LPV[…](参见表1和表3)。 [0159] 将葡糖淀粉酶glaA启动子翻译起始序列修饰为5'‑CACCGTCAAA ATG‑3'(SEQ ID NO:5)(已经存在于曲霉属表达载体pGBFIN‑50中)，并且在脂解酶表达构建体的生成中使用最佳翻译终止序列5'‑TAAA‑3'(如WO2006/077258和WO2011/009700中所详述)。将编码本发明的脂解酶变体和参考多肽的DNA序列完全合成(ATUM/DNA2.0，Newark,USA)，并且根据标准工序通过BsaI消化和连接(GoldenGate克隆方法(New England Biolabs))的重复步骤克隆到黑曲霉表达载体pGBFIN‑50。将含有在葡糖淀粉酶启动子控制下的脂解酶变体表达盒的所得载体命名为pGBFINPL‑00号(参见图2)，所述载体编码如在表1和表3中公开的变异多肽中的任何变异多肽。 [0160] 随后，用使用相应pGBFINPL‑00号载体作为模板生成的经PCR扩增的Pgla‑3'gla脂解表达盒片段转化黑曲霉GBA 306。PCR片段包含在葡糖淀粉酶启动子和终止子控制下的脂解酶表达盒以及潮霉素选择性标记。或者，可以使用含有脂解酶表达盒和潮霉素选择性标记的载体的经NotI消化并且经纯化的片段。用WO199846772、WO199932617、WO2011009700、WO2012001169、WO2013135729、WO2014013073和WO2014013074以及它们中的参考文献中所述的菌株和方法来执行转化实验。在转化之后，将原生质体接种到选择性再生培养基上，所述选择性再生培养基由补充有60μg/mL潮霉素B的曲霉基本培养基组成。在30℃下孵育5‑10天之后，将单个转化子在补充有60μg/mL潮霉素B的PDA(马铃薯右旋糖琼脂)上重划线成单个菌落。在30℃下5‑7天生长并形成孢子后，将单个菌落转移至PDA平板中。在30℃下生长5‑7天后，将孢子分离出，并用作摇瓶发酵的接种材料。 [0161] 表1.相对于SEQ ID NO:1(PAN[..]和NBL[..])或SEQ ID NO:6(LPV[...])具有氨基酸取代和插入的变异脂解酶 [0162] [0163] 脂解酶变体的表达 [0164] 制备含有如上所公开的载体的新鲜黑曲霉孢子，并用于通过在摇瓶中培养菌株来生产脂解酶样品材料。将黑曲霉菌株在带有挡板的100mL摇瓶中的20mL预培养培养基中进行预培养，所述预培养培养基每升含有：100g的玉米浸渍固体(Roquette)、1g的NaH2PO4.H2O、0.5g的MgSO4.7H2O、10g的Glucose.H2O、0.25g的Basildon，pH 5.8。在34℃和 170rpm下过夜生长后，将10mL的此培养物转移到带有挡板的500mL摇瓶中的100mL发酵培养基中。发酵培养基每升含有：(150g麦芽糖、60g大豆蛋白胨、15g(NH4)2SO4、1g NaH2PO4.H2O、 1g MgSO4.7H2O、1g L‑精氨酸、0.08g吐温‑80、0.02g Basildon、20g MES，pH 6.2。使培养物在34℃、170rpm下生长2‑7天。通过以5000x g离心10分钟来回收培养上清液。如上所公开的测定上清液中的脂肪酶活性(GalLU)并且在表3中示出。 [0165] 实施例2：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的变异脂肪酶对全麦烘焙产品的体积的影响 [0166] 用如表2所示的配方和工艺条件进行全麦面粉应激测试。 [0167] 表2.工艺条件全麦应激测试 [0168] [0169] 全麦面粉(Acasia)来自Meneba，压缩酵母(Koningsgist)来自AB Mauri，AmylaseP500和木聚糖酶 HSP6000来自DSM Food Specialties，活性小麦面筋(Amygluten 110)来自Syral，并且其他材料来自通用面包店供应商。材料的添加按照面包师的百分比或ppm，即基于面粉的重量。将脂肪酶与其他成分混合在一起。如表1中所公开的变异脂肪酶的量和影响是针对该应用的最佳 Golden剂量20ppm进行 评定的，其中使用用于确定针对这些的最佳使用水平的变体剂量范围。在本次烘焙试验中使用了导致最大面包体积的变异脂肪酶量(最佳剂量)。 [0170] 由分批的2kg面粉制备面团，以在成型后形成至少6×350g面团块，将所述面团块放入适当的烘焙罐(187mm×96mm×96mm)中。在醒发后，使相应罐中的至少4个面团经受由250g金属球进行的机械捏制，所述金属球沿着使用定制装置以约45°设置的轨道向下滚动，撞入容纳所述面团的罐中。对于所谓的‘中等冲击’，将轨道设置在约310mm的高度，而对于所谓的‘高冲击’，将轨道设置在约600mm的高度。罐中有至少2个面团块未经受任何冲击处理。烘焙所有具有和没有冲击处理的面团块。在烘焙后，使用来自TexVol instrument(Perten)的激光体积计确定从经受“无冲击”、“中等冲击”和“高冲击”的面团制成的面包的比体积。 [0171] 表3中的结果表明，与用 Golden(包含SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列的参考多肽)制成的面包的体积相比，用包含取代(D295S和V179M)、(D295N和V179M)、(D295S、I113H和V179M)、(D295G和I113T)、(D295N和I113N)、(D295N、I113T、V179M和N112D)、(D295S、I113H、V179M和I284M)、(D295N和I113T)、(D295S、I113T、V179M和I284M)、(D295S、I113T、V179M、N121D)、(D295S、I113T和V179M)、(D295S和I113N)或(D295N和I284T)的变异脂肪酶制备的面包在面团经受‘中等冲击’或‘高冲击’后具有增大的面包体积。与使用没有冲击处理的 Golden制成的面包的体积相比，一些变体(表3中的编号 7、8、12、13、14和15)也具有增大的体积。 [0172] [0173] 实施例3：变异脂肪酶(PAN2和NBL)对从具有添加的游离脂肪酸的面粉制成的面包的体积的影响 [0174] 使用如表4所示配方和工艺条件进行白面粉应激测试。 [0175] 表4.工艺条件白面粉应激测试。 [0176] [0177] 白面粉(Kolibri)来自Meneba，压缩酵母(Koningsgist)来自AB Mauri，淀粉酶P500和木聚糖酶 HSP6000来自DSM Food Specialties，亚油酸来自一般化学品供应商，并且其他材料来自一般面包店店供应商。材料的添加按照面包师的百分比或ppm，即基于面粉的重量。将脂肪酶与其他成分混合在一起。变异脂肪酶的量和影响是针对该应用的最佳Panamore Golden剂量20ppm进行评定的，其中使用用于确定针对这些的最佳使用水平的变体剂量范围。在该烘焙试验中使用了导致最大面包体积的变异脂肪酶量(最佳剂量)。 [0178] 由分批的2kg面粉制备面团，以在成型后形成至少6×300g面团块，将所述面团块放入适当的烘焙罐(187mm×96mm×96mm)中。在醒发后，使相应罐中的至少4个面团经受由250g金属球进行的机械捏制，所述金属球沿着使用定制装置以约45°设置的轨道向下滚动，撞入容纳所述面团的罐中；对于所谓的‘中等冲击’，将轨道设置在约310mm的高度，而对于所谓的‘高冲击’，将轨道设置在约600mm的高度。罐中有至少2个面团块未经受任何冲击处理。烘焙所有具有和没有冲击处理的面团块。在烘焙后，使用来自TexVol instrument(Perten)的激光体积计确定从经受“无冲击”、“中等冲击”和“高冲击”的面团制成的面包的比体积。 [0179] 表5中的结果表明，与以类似方式用 Golden中的参考脂肪酶在20ppm和40ppm下制备的面包的体积相比，用包含取代(D295G、I113T)的SEQ ID NO:3的NBL变异脂肪酶(即，包含在305位和306位处的脯氨酸的SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列)和添加的亚油酸在对对应的面团进行冲击处理之后制备的面包的面包体积更大。 [0180] 表6中的结果表明，与用 Golden中的参考脂肪酶在20ppm下制备的面包的体积相比，用包含氨基酸取代基(D295S、I113N)的SEQ ID NO:1的PAN2变异脂肪酶和添加的亚油酸在对对应的面团进行冲击处理之后制备的面包的体积减小至更小的程度。与用参考脂肪酶制成的面团相比，用表6中的变异脂肪酶制成的面团显示出增大的耐冲击性。 [0181] 表5.从具有0％、0.1％和0.2％亚油酸和不同(含量)脂肪酶的面团制成的面包的体积(ml/g)。面团经受无冲击处理、中度冲击处理或高度冲击处理。 [0182] [0183] 表6.从具有0％、0.1％和0.2％亚油酸和不同(含量)脂肪酶的面团制成的面包的体积(ml/g)。面团经受无冲击处理、中度冲击处理或高度冲击处理。 [0184] [0185] 实施例4：SEQ ID NO:6的变异脂肪酶对从具有添加的游离脂肪酸的面粉制成的面包的体积的影响 [0186] 为了测试如在实施例2和3中所公开的在不同的脂肪酶下在SEQ ID NO:1中进行的氨基酸取代是否对面包体积具有类似的影响，在根据SEQ ID NO:6的脂肪酶中进行了类似的氨基酸取代。SEQ ID NO:1的成熟氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟氨基酸序列具有76.8％的同一性，并且SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列具有根据如本文所定义的比对算法确定的78.3％的序列同一性。 [0187] 如实施例1中所述制备包含氨基酸取代(I113N、D295S)、(I284T、D295N)和(I113T、295G)的SEQ ID NO:6的三种变异脂肪酶，并命名为LP02、LPV05和LPV06。亲本脂肪酶(成熟氨基酸序列SEQ ID NO:6)被命名为LPV01。 [0188] 使用针对实施例3所述的材料和工序，使用表3中所示的配方和工艺条件进行了白面粉面包店应激测试，不同之处在于以0.3％w/w代替0‑0.2w/w％添加亚油酸。 [0189] 在40ppm、60ppm和80ppm，即分别为184GalL U/kg、276GalL U/kg和368GalL U/kg下，将变异脂肪酶LP02、LPV05和LPV06相对于LPV01和市售 F产品进行评估测试。变异脂肪酶的量和影响是针对该应用的最佳 F剂量进行评定的，其中使用用于 确定针对变异脂肪酶的最佳使用水平的变体剂量范围。在该烘焙试验中使用了导致最大面包体积的变异脂肪酶量(最佳剂量)。烘焙试验分为三个单独的组执行。 [0190] 表7中的结果表明，与所有剂量的 F相比，从用LPV02、LP05或LPV06制备的面团制成的面包在中等和高冲击处理之后导致更高体积的LPV01。这表明与参考多肽相比，用变异脂肪酶制成的面团导致增大的面包体积，所述变异脂肪酶包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6具有至少70％同一性的氨基酸序列并且包含至少如本文所公开的所述氨基酸取代，例如(I113N、D295S)、(I284T、D295N)或(I113T、D295G)。 [0191] 表7.从具有0.3％亚油酸和不同脂肪酶的面团制成的面包的体积(ml/g)。面团经受无冲击处理、中度冲击处理或高度冲击处理。 [0192] |
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