[0001] 关于序列表的声明

[0002] 与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质复印件，并通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是PCT‑提交的序列表。该文本文件224KB，创建于2018年3月12日，并以电子方式提交。

[0003] 本公开涉及表达细胞相连的酶并在食品和/或饲料(包括用于生产烘焙产品的那些)的生产中用作酶活性源的重组酵母宿主细胞。

[0004] 商业化酵母和商业化酶通常用于生产食品和饲料，例如，如面包和其它酵母发酵的烘焙产品等。商业化酶也可以在无酵母的情况下用于制造食品和饲料，例如在化学发酵和未发酵的烘焙产品(如蛋糕和扁面包)中。烘焙师的酵母是通过分批补料增殖从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生的，并以新鲜或干燥的形式提供。食品酶和饲料酶(例如烘焙酶、啤酒厂酶和饲料酶)由各种植物、细菌和真菌产生，通常通过遗传修饰进行强化。细菌和真菌酶通常在无菌分批发酵过程中从生产生物体中表达和分泌，经分离、纯化、浓缩、干燥并以颗粒状粉末提供。

[0005] 可以将烘焙酶添加到用于制备烘焙产品的面粉、面团或面糊中。它们在混合、醒发和烘焙过程中作用于碳水化合物、蛋白质和脂质，以便于加工以及改善成品的外观、质地和保存性。例如，在面包、蛋糕和其它烘焙产品的生产过程中将产麦芽糖α‑淀粉酶(MAA)加入到面团或面糊中。它作用于烘箱中小麦淀粉的支链淀粉部分，以抑制成品中的淀粉回生以及减缓固化速度。

[0006] 通常，食品酶和饲料酶(特别是烘焙酶)是生产烘焙产品的花费的重要部分。因此，在制造过程中存在降低外源纯化食品酶和饲料酶(如烘焙酶)的利用率，或淘汰外源纯化食品和饲料酶(如烘焙酶)的动机。发明内容

[0007] 本公开提供了已经过基因工程改造以表达一种或多种细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的重组酵母宿主细胞以及使用它们或由其衍生的产品制备食品和/或饲料产品的方法。

[0008] 根据第一方面，本公开提供了重组酵母宿主细胞，其具有编码细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的异源核酸分子。异源核酸分子与异源启动子可操作地相连，异源启动子允许异源核酸分子在增殖期间的表达。在一个实施方案中，异源核酸分子允许在细胞内表达异源食品酶和/或饲料酶。在另一个实施方案中，异源核酸分子允许表达膜相关的异源食品酶和/或饲料酶。例如，异源核酸分子可以允许表达栓系异源食品酶和/或饲料酶。在一个实施方案中，栓系异源食品酶和/或饲料酶是式(I)的嵌合蛋白：

[0009] (NH2)FFE‑L‑TT(COOH) (I)

[0010] 其中，FFE是食品酶和/或饲料酶；L存在或不存在，并且是氨基酸接头；TT是氨基酸栓系部分，用于使食品酶和/或饲料酶与重组酵母宿主细胞的细胞壁相连；并且“‑”是酰胺键。在式(I)的嵌合蛋白中，(NH2)表示嵌合蛋白的氨基末端的位置，以及(COOH)表示嵌合蛋白的羧基末端的位置。

[0011] 在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是式(II)的嵌合蛋白：

[0012] (NH2)TT‑L‑FFE(COOH) (II)

[0013] 其中，FFE是食品酶和/或饲料酶；L存在或不存在，并且是氨基酸接头；TT是氨基酸栓系部分，用于使食品酶和/或饲料酶与重组酵母宿主细胞的细胞壁相连；并且“‑”是酰胺键。在式(II)的嵌合蛋白中，(NH2)表示嵌合蛋白的氨基末端的位置，以及(COOH)表示嵌合蛋白的羧基末端的位置。在一个实施方案中，异源核酸分子对异源食品酶进行编码，异源食品酶例如α‑乙酰乳酸脱羧酶、氨肽酶、淀粉酶、麦芽糖α‑淀粉酶、天冬酰胺酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、凝乳酶、天冬氨酸肽酶、无花果蛋白酶、葡萄糖淀粉酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、菊粉酶、转化酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧化酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、乳凝固酶、胰酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、戊聚糖酶、胃蛋白酶、磷脂酶、过氧化物酶、蛋白酶、支链淀粉酶、凝乳酶(rennet)、转谷氨酰胺酶、胰蛋白酶、尿素酶和/或木聚糖酶。在另一个实施方案中，异源食品酶是异源烘焙酶，例如，如淀粉分解酶、纤维素酶、半纤维素酶、氧化酶、天冬酰胺酶或脂肪酶。在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是淀粉分解酶，例如，如麦芽糖α‑淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α‑淀粉酶或真菌淀粉酶。在另一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是氧化酶，例如，如葡萄糖氧化酶。在另一个实施方案中，异源核酸分子对异源饲料酶进行编码，异源饲料酶例如，如植酸酶、β‑葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。在又一个实施方案中，异源饲料酶是植酸酶。在嵌合蛋白的另一个实施方案中，L存在并且可以包含，例如，一个或多个G4S(SEQ ID NO：41)基序和/或一个或多个EA2K(SEQ ID NO：100)或EA3K(SEQ ID NO：101)基序。在进一步的实施方案中，TT包含跨膜结构域、其变体或片段。例如，TT可以来自FLO1蛋白。例如，TT可以具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，是SEQ ID NO：14的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：14的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT可以通过后转录机制进行修饰以具有糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。例如，TT可以来自SED1蛋白、TIR1蛋白、CWP2蛋白、CCW12蛋白、SPI1蛋白、PST1蛋白或者AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合。在具体实施方案中，TT来自SPI1蛋白并且可以具有例如SEQ ID NO：74的氨基酸序列，可以是SEQ ID NO：74的氨基酸序列的变体，或者可以是SEQ ID NO：74的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT可以是SPI蛋白的片段，并且可以具有SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列；可以是SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列的变体；或者可以是SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82的氨基酸序列的片段。在另一个具体的实施方案中，TT来自CCW12蛋白，并且可以具有例如SEQ ID NO：84的氨基酸序列，可以是SEQ ID NO：84的氨基酸序列的变体，或者可以是SEQ ID NO：84的氨基酸序列的片段。在又一个实施方案中，TT可以是CCW12蛋白的片段，并且可以具有SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列；可以是SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的变体；或者可以是SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，TT来自AGA1蛋白和AGA2蛋白的组合，并且可以具有例如SEQ ID NO：24的氨基酸序列，是SEQ ID NO：24的氨基酸序列的变体，是SEQ ID NO：24的氨基酸序列的片段；具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列，是SEQ ID NO：26的氨基酸序列的变体，或者是SEQ ID NO：26的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，启动子是天然启动子或异源启动子。例如，异源启动子可包括启动子tdh1基因、hor7基因、hsp150基因、hxt7基因、gpm1基因、pgk1基因和/或stl1基因。异源启动子可包括，例如，来自tdh1基因和/或来自hor7基因的启动子。在一些实施方案中，异源核酸分子与终止子可操作地连接，所述终止子可以是例如天然终止子或异源终止子。在一些实施方案中，异源终止子包括来自dit1基因、adh3基因、idp1基因、gpm1基因、pma1基因、tdh3基因、hxt2基因和/或ira2基因的终止子。异源终止子可包括，例如，来自dit1基因、来自adh3基因和/或来自idp1基因的终止子。在一个实施方案中，膜相连的异源多肽具有异源信号肽，例如，如异源信号肽来自转化酶蛋白、AGA2蛋白或真菌淀粉酶。在一个实施方案中，异源信号肽来自转化酶蛋白，并且可以具有SEQ ID NO：68的氨基酸序列，是SEQ ID NO：68的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：68的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，异源信号肽来自AGA2蛋白，并且可以具有SEQ ID NO：69的氨基酸序列，是SEQ ID NO：69的氨基酸序列的变体或者是SEQ ID NO：69的氨基酸序列的片段。在另一个实施方案中，异源信号肽来自真菌淀粉酶，并且可以具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列，是SEQ ID NO：107的氨基酸序列的变体，或者是SEQ ID NO：107的氨基酸序列的片段。在一些实施方案中，重组酵母宿主细胞可以来自酵母(Saccharomyces sp.)属。在一些进一步的实施方案中，重组酵母宿主细胞可以来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)种属。

[0014] 根据第二方面，本公开提供了包含本文所述的食品酶和/或饲料酶的添加剂。所述添加剂可包含具有如本文所述的重组酵母宿主细胞的酵母组合物或基本上由具有如本文所述的重组酵母宿主细胞的酵母组合物组成。在一个实施方案中，酵母组合物可以以活性形式或灭活形式提供。添加剂可包含由从本文所述的重组酵母宿主细胞获得的酵母产物或基本上由从本文所述的重组酵母宿主细胞获得的酵母产物组成。在一个实施方案中，酵母产物可以是基本上纯化的食品酶和/或饲料酶、酵母提取物或酵母部分。添加剂可用作食品添加剂和/或饲料添加剂。在一个实施方案中，食品添加剂可以是面团改良剂。

[0015] 根据第四方面，本公开提供了用于制备食品或饲料产品的方法。该方法包括在食品或饲料产品中包含本文所述的重组酵母宿主细胞或本文所述的添加剂。在一个实施方案中，该方法还包括在重组酵母宿主细胞和/或添加剂存在下使食品或饲料产品发酵。在另一个实施方案中，该方法还包括对食品或饲料产品进行烘焙以提供烘焙产品。在这样的实施方案中，该方法可用于延长烘焙产品的保质期和/或用于改善烘焙产品的感官特性。在另一个实施方案中，烘焙产品是面包。在一个实施方案中，该方法可用于制备食品。在另一个实施方案中，该方法可用于制备饲料产品。附图说明

[0016] 由此概括地对本公开的本质进行了描述，现在将参考附图，通过图示的方式示出其优选实施方案，并且其中：

[0017] 图1A和图1B提供了在酵母细胞沉淀中(图1A)或野生型(M10474)或重组酵母宿主细胞的膏状酵母样品中(图1B)测量的麦芽糖淀粉酶(MAA)酶活性。在图1A中，结果作为测试酵母菌种类(从左到右，M10474、T2986、T2987、T2988、T2989、T2990、T2991、T2944；菌株描述于表1中)的函数所测得的麦芽糖淀粉酶活性(以MANU/mL提供)示出。在图1B中，结果作为测试酵母菌的种类和批次(从左到右，M10474、M13819、M13822；菌株描述于表1中)的函数的麦芽糖淀粉酶活性(以MANU/mL提供)示出。

[0018] 图2A至图2C提供了作为用以下制作的面包的函数的面包屑硬度(以g为单位测量，3
左轴，在条形图中显示)和面包体积(以cm为单位测量，右轴，以‑X‑标记线表示)：(从左到右)用野生型菌株(M10474)无补给酶制作的面包，用补给了45ppm 的野生型菌株制作
的面包，用补给了90ppm 的野生型菌株制作的面包，用补给了180ppm
的野生型菌株制作的面包，用M13822菌株(批次A)制作的面包，用M13822菌株(批次B)制作的面包，用M13819(批次A)制作的面包和用M13819(批次B)制作的面包(菌株描述于表1中)。
在烘焙后第5天(图2A)、第8天(图2B)和第11天(图2C)显示结果。

[0019] 图3A至图3C提供了作为用以下制作的面包的函数的回弹性百分比：(从左到右)用野生型菌株(M10474)无补给酶制作的面包，用补给了45ppm 的野生型菌株制作的面包，用补给了90ppm 的野生型菌株制作的面包，用补给了180ppm
的野生型菌株制作的面包，用M13822菌株(批次A)制作的面包，用M13822菌株(批次B)制作的面包，用M13819(批次A)制作的面包和用M13819(批次B)制作的面包。在烘焙后5天(图
3A)、第8天(图3B)和第11天(图3C)显示结果。

[0020] 图4提供了在不存在Sed1栓系(菌株M8498)和存在Sed1栓系(菌株M14244)下，在培养的表达异源葡萄糖淀粉酶的重组酵母宿主细胞的沉淀(“结合”，浅灰色)和上清液(“游离”，深灰色)中测量的葡萄糖淀粉酶活性。结果作为使用的菌株的函数的葡萄糖淀粉酶活性百分比显示。

[0021] 图5提供了在Sed1栓系和接头(菌株M14253)存在下，在Sed1栓系存在但无接头(菌株M14254)条件下，以及不存在Sed1栓系(菌株M10074)条件下，在培养的表达异源α‑淀粉酶的重组酵母宿主细胞的沉淀(“结合”，浅灰色)和上清液(“游离”，深灰色)中测量的α‑淀粉酶活性。结果作为使用的菌株的函数的α‑淀粉酶活性百分比显示。

[0022] 图6提供了表达麦芽糖淀粉酶的各种菌株的小麦淀粉活性。结果显示为M10474、M13822、M13819、M13879和T3892菌株(菌株描述于表1中)的全培养物(左侧条)、上清液(中间条)和洗涤的沉淀(右侧条)的小麦淀粉MANU/mL(在OD 600nm处测量)。“M”菌株的数据是两份培养物的平均值。T3892的数据包括8种转化分离物跨培养物平均活性和表现最佳的分离物的活性(□＝最佳分离物，全培养物；△＝最佳分离物，上清液；○＝最佳分离物，洗涤的细胞沉淀)。下图显示每种工程策略的预测酶定位表型。

[0023] 图7A和图7B提供了用于表达游离或栓系柠檬酸杆菌植酸酶(Citrobacter braakii phytase.)的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连的(图7A中的对角线阴影条或图7B中的□)的植酸酶活性。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。(图7A)将700nm处的吸光度与已知磷酸盐浓度的标准曲线进行比较，以FTU表示活性。在不同菌株(M12548、T2633、T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)的上清液(灰色条)和细胞(对角线条)中对吸光度进行测量。(图7B)比较不同菌株之间的FTU。左垂直轴示出了上清液活性，并且每个菌株的FTU以灰色条提供。右轴示出了细胞相关的FTU活性，并且对于每种菌株(M12548、T2633、T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)提供为□。亲本菌株和Pst1栓系细胞相关活性的值在标准曲线的范围之外，因此低于检测限。

[0024] 图8提供了表达与N‑末端或C‑末端栓系融合的大肠杆菌植酸酶的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连(对角线阴影条)的植酸酶活性。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。结果显示为每种菌株(M11312、T2705和T2706)在700nm处的光密度。

[0025] 图9提供了表达大肠杆菌植酸酶的菌株的培养物上清液(灰色条)或与细胞相连(对角线阴影条)的植酸酶活性，相较于与C端Sed1栓系融合的大肠杆菌植酸酶，该大肠杆菌植酸酶与具有或不具有AGA1过表达的N末端栓系融合。将上清液用pH 5.5的5mM植酸钠溶液温育30分钟，并将细胞在相同溶液中温育2小时。结果显示为每种菌株(M12550、M12795、M12983和T2816)在700nm处的光密度。

[0026] 图10提供了表达麦芽糖淀粉酶的菌株的小麦淀粉活性。对于不同菌株(M10474、M13819、M13822、M14851、T4328、T4329、T4330、M12962、T4336、T4337和T4338)的全培养物(左侧条)、上清液(中间条)和洗涤的细胞(右侧条)，结果以在450nm处的吸光度/600nm处的光密度的比提供。“M”菌株的数据是两份培养物的平均值。“T”菌株的数据包括7种转化分离物的跨培养物平均活性。表达形态1是指存在转化酶信号肽和产生栓系酶的Spi1栓系。表达形态2是指存在转化酶信号肽，但不存在产生分泌酶的栓系。表达形态3是指不存在信号肽并且不存在产生细胞内酶的栓系。

[0027] 图11A至图11C提供了烘焙后第3天(图11A)、第7天(图11B)和第11天(图11C)用不同的面团改良剂制成的面包的面包屑硬度(以g为单位测量，左轴，结果以条显示)。用额外添加的 麦芽糖淀粉酶产物(标记为“Novamyl”)或不用额外添加的麦芽糖淀粉酶产物(标记为“对照”)制成对照，如直方图下方所示。将对照面包与用M13979喷雾干燥的匀浆(在图中显示为“匀浆+喷雾”)或如直方图下方所示的特定Phadebas酶活性的膏制成的面包进行比较。所有面包均使用野生型酵母用于产气力。

[0028] 图12A至图12F提供了在烘焙后第4天(图12A和图12D)、第7天(图12B和图12E)和第10天(图12C和图12F)用不同的面团改良剂制成的面包的面包屑硬度(图12A‑C，以g为单位进行测量)和回弹性(图12D‑F，以百分比为单位进行测量)。用额外添加的 麦芽
糖淀粉酶产物(标记为“Novamyl”)或不用额外添加的 麦芽糖淀粉酶产物(标记
为“对照”)制成对照，如直方图下方所示。将对照面包与用M15532酵母膏制成的面包进行比较，后者经均质化以释放细胞内，并如直方图下方所示给予特定的Phadebas酶测定活性。所有面包均使用野生型酵母用于产气力。

[0029] 图13示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α‑淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自SPI1蛋白的不同栓系部分或相关平截(M15774、M15771、M15777、M15772和M15222)组合的衍生自强烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的热耐受性α‑淀粉酶(SEQ ID NO：71)。结果显示为使用的酵母菌株在540nm处的吸光度。

[0030] 图14示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α‑淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自CCW12蛋白的不同栓系部分或相关平截(M15773、M15776、M16251和M15215)组合的衍生自热水管热球菌(Thermococcus hydrothermalis)的α‑淀粉酶(SEQ ID NO：72)。结果显示为使用的酵母菌株在540nm处的吸光度。

[0031] 图15示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α‑淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含与衍生自CCW12蛋白的栓系部分和不同接头(M15785、M15786、M15782、M16252、M16221和M16222)组合的衍生自热水管热球菌的α‑淀粉酶(SEQ ID NO：72)。结果显示为酵母菌株在540nm处的吸光度。

[0032] 图16示出了相较于对照菌株(M2390)，与表达各种嵌合蛋白的酵母菌株细胞相连的α‑淀粉酶活性，所述嵌合蛋白包含衍生自强烈热球菌的α‑淀粉酶(SEQ ID NO：71)、衍生自SPI1蛋白的栓系部分和不同接头(M15784、M15778、M15779、M15787、M15780、M15788和M15783)。结果显示为酵母菌株在540nm处的吸光度。

[0033] 图17示出了相较于阴性对照菌株(M10474)和阳性对照量的市售纯化葡萄糖氧化酶(阳性对照，Gluzyme )，与表达葡萄糖氧化酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤的细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的葡萄糖氧化酶(GO)活性，酵母菌株衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)，以分泌形式(M16780)或细胞内(M16273)表达。结果显示为所用酵母菌株/对照在510nm处的吸光度。

[0034] 图18显示了与表达葡萄糖氧化酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤的细胞(对角线条)相关的葡萄糖氧化酶(GO)活性，酵母菌株衍生自黑曲霉，以分泌形式(M16780)或细胞内(M16273)表达。结果显示为所用酵母菌株在510nm处的吸光度(校正以除去与对照菌株M10474相关的吸光度)。

[0035] 图19示出了相较于阴性对照菌株(M10474)和阳性对照量的市售纯化的真菌α‑淀粉酶(阳性对照， )，与表达真菌淀粉酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的真菌淀粉酶(FA)活性，酵母菌株衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)，以具有不同信号肽(用于M16772的酿酒酵母转化酶，用于M16540的米曲霉天然α‑淀粉酶信号肽)的分泌形式表达。结果显示为所使用酵母菌株/对照在540nm处的吸光度。

[0036] 图20示出了与表达真菌淀粉酶的酵母菌株的全培养物(灰色条)、洗涤细胞(对角线条)或破碎的洗涤细胞上清液(白色条)相关的真菌淀粉酶(FA)活性，酵母菌株衍生自米曲霉，以具有不同信号肽(对于M16772为酿酒酵母转化酶，对于M16540为米曲霉天然α‑淀粉酶信号肽)的分泌形式表达。结果显示为所使用酵母菌株在540nm处的吸光度(校正以除去与对照菌株M10474相关的吸光度)。

[0037] 图21示出了使用烘焙测试对来自菌株M16780的细胞沉淀的细胞相关葡萄糖氧化酶活性的评估。结果显示为对照面包(在不存在添加剂的情况下制备)，用10ppm或20ppm葡萄糖氧化酶 制备的面包，或用给予菌株M16780的细胞沉淀制备的面包。

[0038] 本公开提供了在其增殖阶段过程中表达细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶的重组酵母宿主细胞。如在本公开的上下文中所使用的，表述“增殖阶段”是指商业化过程的扩增阶段，其中，酵母在需氧条件下增殖以使底物向生物质的转化最大化。在一些情况下，增殖的生物质可以用于随后的发酵步骤(通常在厌氧条件下)，以使一种或多种所需代谢物的产生和/或制备发酵食品或付费产品最大化。本公开的重组酵母宿主细胞是有利的，因为它们提供比传统使用的纯化产品更低成本的酶活性来源。即使在醒发时间和条件不能提供使酵母原位产生酶的机会的情况下，这种重组酵母宿主细胞可有利地用于各种食品和/或饲料产品，例如烘焙产品。这种重组酵母宿主细胞还可用于其它烘焙产品、发酵食品、非发酵食品和动物饲料。有利地，重组酵母宿主细胞可以容易地进行测量、剂量和配制。

[0039] 重组酵母宿主细胞

[0040] 本公开的重组酵母宿主细胞旨在用于制备用于人(食品)和/或动物(饲料)消费的产品。如在本公开的上下文中使用的，表述“食品酶和/或饲料酶”是指具有酶活性并且能够用于制备食品或饲料产品的方法中的蛋白质。在一些实施方案中，“食品酶和/或饲料酶”是指具有转化淀粉应用的酶(例如，含淀粉的生物质)。食品酶和饲料酶包括但不限于烘焙酶、酿造酶、蒸馏酶、酿酒酶、果汁酶、淀粉加工酶和饲料酶。本公开的重组酵母宿主细胞可任选地用于发酵过程。在一个实施方案中，发酵过程可以是相对长的，并且重组酵母宿主细胞可以用于例如制备蒸馏产品、葡萄酒和啤酒。在另一个实施方案中，发酵过程可以是相对短的，并且重组酵母宿主细胞可以用于例如制备酵母发酵的烘焙产品。本公开的重组酵母宿主细胞也可以用于不包含发酵步骤的方法中。例如，重组酵母宿主细胞可用于制备食品和饮品(例如，非酵母发酵(化学发酵)烘焙产品、乳制品、酵母提取物、果汁、脂肪和油以及淀粉)或饲料。

[0041] 在一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞在引入本公开的异源核酸分子之前确实表达至少一种食品酶和/或饲料酶，并且经遗传修饰以表达另外的(不同的或相同的)细胞相连酶。在另一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞不能用于制备例如生物燃料如生物乙醇的整合生物加工中。

[0042] 本公开的重组酵母宿主细胞可以以活性形式(例如，液体(例如，如酵母膏等)、压缩的或流化床干燥的酵母)、半活性形式(例如，液体、压缩的或流化床干燥的)、无活性形式(例如，鼓式或喷雾干燥的)以及由此获得的混合物提供。例如，重组酵母宿主细胞可以是活性形式和半活性形式或非活性形式的组合，以提供制备食品或饲料产品所需的酶的比例和剂量。

[0043] 本公开涉及经基因工程改造的重组酵母宿主细胞。遗传修饰旨在增加特定靶基因(其被认为是酵母宿主细胞的异源)的表达，并且可以在一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多)基因位置形成。在本公开的上下文中，当重组酵母细胞被鉴定为“基因工程改造”时，应理解为其已经被操作以添加至少一种或多种异源或外源核酸残基。在一些实施方案中，所添加的一种或多种核酸残基可以衍生自异源细胞或重组宿主细胞本身。在后一种情况下，核酸残基在一个或多个不同于天然基因组位置的基因组位置被添加。基因操作不是在自然界中发生的，而是酵母体外操作的结果。

[0044] 当在重组酵母宿主细胞中表达时，在一种或多种异源核酸分子上编码本文所述的异源酶。当用于提及核酸分子(例如启动子、终止子或编码序列)或蛋白质(例如酶)时，术语“异源的”是指在重组宿主细胞中未天然发现的核酸分子或蛋白质。“异源”还包括天然编码区/启动子/终止子或其部分，其从源生物体中移出并随后以不同于相应天然基因的形式(例如，不在其生物体基因组中的天然位置处)重新引入源生物体。将异源核酸分子有目的地引入重组宿主细胞中。例如，异源因子可以来自宿主细胞的不同菌株，或来自不同分类群的生物(例如，不同的界、门、类、目、科属或种，或这些分类中一个的任何亚群)。

[0045] 存在于重组宿主细胞中的异源核酸分子可以被整合到宿主细胞的基因组中。如本文所用的术语“整合”是指通过分子生物学技术置于宿主细胞基因组中的遗传因子。例如，遗传因子可以置于宿主细胞的染色体中，而非载体(如宿主细胞携带的质粒)。将遗传因子整合到宿主细胞基因组中的方法是本领域熟知的并且包括同源重组。异源核酸分子可以在酵母宿主细胞的基因组中以一个或多个副本(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或甚至更多副本)存在。或者，异源核酸分子可以独立地从酵母的基因组中复制。在这样的实施方案中，核酸分子可以是稳定的和自我复制的。

[0046] 在本公开的上下文中，重组宿主细胞是酵母，并且在一些实施方案中，酵母可以用于食品和/或饲料的生产。合适的酵母宿主细胞可以是来自例如，酵母属(Saccharomyces)、克鲁维菌属(Kluyveromyces)、阿克苏拉菌属(Arxula)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、法菲亚菌属(Phaffia)、裂糖酵母菌属(Schizosaccharomyces)、汉森拉菌属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、雪旺尼菌属(Schwanniomyces)、托鲁拉菌属(Torula)或亚罗维亚菌属(Yarrowia)。合适的酵母种可包括，例如酿酒酵母、博伊丁酵母(S.bulderi)、巴尼特酵母(S.barnetti)、少抱酵母(S.exiguus i)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、糖化酵母(S.diastaticus)、产朊假丝酵母(C.utilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)或脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)。在一些实施方案中，酵母选自于由以下组成的组：酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、巴斯提亚毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶式酵母(Yarrowia lipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、红酵母(Phaffia rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母
(Debaryomyces polymorphus)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方雪旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)。在一个具体实施方案中，酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方案中，宿主细胞可以是产油酵母细胞。例如，产油酵母宿主细胞可以来自布拉霉属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、产油油脂酵母(Lipomyces)、被孢霉(Mortierella)、毛霉菌属(Mucor)、须酶菌属(Phycomyces)、腐霉菌属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidum)、红酵母菌书(Rhodotorula)、毛孢子菌属(Trichosporon)或亚罗酵母属(Yarrowia)。在一些备选实施方案中，宿主细胞可以是产油微藻宿主细胞(例如，如来自破囊壶菌属(Thraustochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium))。在一个实施方案中，重组酵母宿主细胞来自酵母属(Saccharomyces)，并且在一些实施方案中，来自酿酒酵母属(Saccharomyces cerevisiae)。

[0047] 本公开的重组酵母宿主细胞包含异源核酸分子，其旨在允许表达(例如，编码)一种或多种异源食品酶和/或饲料酶。在一个实施方案中，异源酶是食品酶，其可以是但不限于α‑乙酰乳酸脱羧酶、氨肽酶、淀粉酶、麦芽糖α‑淀粉酶、天冬酰胺酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、凝乳酶(包括凝乳酶A和凝乳酶B)、天冬氨酸肽酶(cyprosin)、无花果蛋白酶、葡萄糖淀粉酶(又称淀粉葡萄糖苷酶或麦芽糖酶)、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖异构酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、菊粉酶、转化酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧化酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、凝乳酶(milk coagulating enzyme)、胰酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、戊聚糖酶、胃蛋白酶、磷脂酶、过氧化物酶、蛋白酶、支链淀粉酶、凝乳酶(rennet)(包括牛凝乳酶)、转谷氨酰胺酶、胰蛋白酶、脲酶和/或木聚糖酶。在一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶是烘焙酶。如在本公开的上下文中使用的，表述“烘焙酶”是指具有酶活性并且能够用于制备烘焙产品的方法中的蛋白质。在一个实施方案中，本公开的酵母宿主细胞的异源核酸分子编码至少一种异源烘焙酶。烘焙酶包括但不限于淀粉分解酶(包括例如麦芽糖α‑淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α‑淀粉酶和真菌淀粉酶)、纤维素酶/半纤维素酶、氧化酶(包括例如葡萄糖氧化酶)、天冬酰胺酶和脂肪酶。在另一个实施方案中，异源酶是饲料酶，其可以是但不限于植酸酶、β‑葡聚糖酶、木聚糖酶、α‑半乳糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。

[0048] 如本文所用的表述“淀粉分解酶”是指一类能够将淀粉或水解淀粉水解的酶。在烘焙应用中，淀粉分解酶可参与可发酵糖的释放、增加面包体积、缩短发酵时间、减少老化和/或改善风味。淀粉分解酶包括但不限于α‑淀粉酶(EC 3.2.1.1，有时称为真菌α‑淀粉酶以及细菌α‑淀粉酶，见下文)、麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4‑α‑麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)和淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25)。真菌α‑淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)、果汁和发酵饮品(如啤酒)。细菌α‑淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如，酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)、发酵饮品(包括啤酒、蒸馏饮品等)以及淀粉加工。麦芽糖α‑淀粉酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵、化学发酵或未发酵产品)。在一个实施方案中，一种或多种淀粉分解酶可以是来自米曲霉的α‑淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：105的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的麦芽糖α‑淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：108的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)的葡萄糖淀粉酶(并且具有例如，SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的葡聚糖1,4‑α‑麦芽四糖水解酶(并且具有例如SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自长野芽胞杆菌(Bacillus naganoensis)的支链淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：5的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的支链淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自假单胞菌(Pseudomonas amyloderamosa)的异淀粉酶(并且具有例如SEQ ID NO：7的氨基酸序列，其变体或其片段)和/或来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的淀粉麦芽糖酶(并且具有例如SEQ ID NO：8的氨基酸序列，其变体或其片段)。

[0049] 如本文所用，表述“纤维素酶/半纤维素酶”是指一类能够水解纤维素、半纤维素或戊聚糖的酶。在烘焙应用中，纤维素酶和半纤维素酶可参与建立面筋网络，提供可溶性膳食纤维，调节面团粘度和/或调节面团流变学。纤维素酶/半纤维素酶包括但不限于纤维素酶(E.C.3.2.1.4)和内切B(1,4)D‑木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)。在一个实施方案中，一种或多种纤维素酶/半纤维素酶可以是来自绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)的纤维素酶(并且具有例如SEQ ID NO：42的氨基酸序列，其变体或其片段)和/或来自艾默森罗萨氏菌(Rasamsonia emersonii)的内切B(1,4)D‑木聚糖酶(并且具有例如SEQ ID NO：43的氨基酸序列，其变体或其片段)。

[0050] 如本文所用，表述“氧化酶”是指一类能够催化氧化还原反应的酶。氧化酶可以是氧化还原酶，例如己糖氧化酶(包括葡萄糖氧化酶)。氧化酶可用于生产烘焙产品(例如，如包括面包的酵母发酵产品等)。在一些实施方案中，氧化酶(例如葡萄糖氧化酶)可以改善面团的可加工性。在烘焙应用中，氧化酶可参与控制美拉德反应和/或建立面包屑结构。在一个实施方案中，一种或多种氧化酶可以是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶(并且具有例如SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：103的氨基酸序列，其变体或其片段)。

[0051] 如本文所用，表述“天冬酰胺酶”是指一类能够催化天冬酰胺转化为天冬氨酸和铵的酶。天冬酰胺酶可用于生产零食、谷物(包括早餐谷物)以及烘焙产品(例如酵母发酵(包括面包)、化学发酵或未发酵产品)。

[0052] 如本文所用，表述“脂肪酶”是指一类能够水解脂质的酶。在烘焙应用中，脂肪酶可参与增加面包体积，增加面团稳定性，提供抗老化和/或促进乳化剂形成。脂肪酶可用于例如生产烘焙产品(例如酵母发酵(包括面包)和化学发酵产品)。在一个实施方案中，一种或多种脂肪酶可以是来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosis)属的三酰基甘油脂肪酶(并且具有例如SEQ ID NO：45的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自野猪(Sus scrofa)的磷脂酶A2(并且具有例如SEQ ID NO：46的氨基酸序列，其变体或其片段)，来自Streptomyces vialaceoruber的磷脂酶A2(并且具有例如SEQ ID NO：47的氨基酸序列，其变体或其片段)，和/或来自米曲霉(Aspergillus oryzea)的磷脂酶A2(并且具有例如SEQ ID NO：48的氨基酸序列，其变体或其片段)。

[0053] 在一个实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞包含(并且在一个实施方案中表达)编码麦芽糖淀粉酶的核酸分子。如在本公开中使用的，术语“麦芽糖淀粉酶”是指能够将淀粉或水解淀粉水解成麦芽糖的多肽。麦芽糖淀粉酶包括但不限于真菌α‑淀粉酶(例如衍生自曲霉属(Aspergillus sp.)(例如，黑曲霉(A.Niger)、白曲霉(A.kawachi)和米曲霉(A.oryzae))；木霉属(Trichoderma sp.)(例如，里氏木霉(T.reesie))、根霉属(Rhisopus sp.)、毛根霉属(Mucor sp.)和青霉属(Penicillium sp.)，酸稳定的真菌淀粉酶(例如衍生自黑曲霉(Aspergillus niger))，β‑淀粉酶(例如衍生自植物(小麦、大麦、黑麦、高粱、大豆、甘薯、大米)和微生物(蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多形芽孢杆菌(Bacillus polymixa)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、拟南芥(Arabidopsis thaliana))，麦芽糖淀粉酶(EC3.2.1.133)(例如衍生自微生物，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、热芽孢杆菌(Bacillus thermoalkalophilus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、栖热菌属(Thermus sp.)。在具体实施方案中，本公开的重组酵母宿主细胞包含编码衍生自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的异源麦芽糖淀粉酶的异源核酸分子，并且具有例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：108的氨基酸序列，其变体或其片段。

[0054] 如本文所使用，表述“磷酸酶”是指在水存在下能够催化磷酸单酯裂解成磷酸根离子和醇的食品酶/饲料酶。磷酸酶的实施方案是植酸酶，一种具有酶活性并且能够催化植酸(肌醇六磷酸肌苷)水解成无机磷的蛋白质。有四种不同类型的植酸酶：组氨酸酸性磷酸酶(HAPS)、β‑螺旋桨植酸酶、紫色酸性磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶样植酸酶(PTP样植酸酶)。植酸具有六个磷酸基团，其可以通过植酸酶以不同的速率和不同的顺序释放。植酸酶以逐步的方式从植酸中水解磷酸盐，产生再次成为进一步水解的底物的产物。植酸酶基于水解的植酸的第一磷酸位置进行如下分组：3‑植酸酶(EC 3.1.3.8)、4‑植酸酶(EC 3.1.3.26)和5‑植酸酶(EC 3.1.3.72)。在一个实施方案中，植酸酶衍生自细菌物种，例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)或埃希氏菌属(Escherichia sp.)。在具体实施方案中，异源植酸酶衍生自柠檬酸杆菌属，例如布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)，并且可以具有例如SEQ ID NO：66的氨基酸序列，其变体或其片段。在另一个实施方案中，异源植酸酶衍生自埃希氏菌属，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，并且可以具有例如SEQ ID NO：67的氨基酸序列，其变体或其片段。

[0055] 异源食品酶和/或饲料酶可以是已知/天然食品酶和/或饲料酶的变体。例如，在异源食品酶和/或饲料酶是异源烘焙酶的实施方案中，异源烘焙酶可以是已知/天然烘焙酶的变体，例如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：108的氨基酸序列的异源烘焙酶的变体。当与天然食品酶和/或饲料酶的氨基酸序列比较时，变体包含至少一个氨基酸差异。如本文所使用，变体是指氨基酸序列中不会不利地影响食品酶和/或饲料酶的生物学功能的改变。当改变的序列阻止或破坏与食品酶和/或饲料酶相关的生物学功能时，认为取代、插入或缺失会对蛋白质产生不利影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水‑亲水性质而不会不利地影响生物活性。因此，可以改变氨基酸序列，例如使肽更疏水或亲水，而不会不利地影响食品酶和/或饲料酶的生物活性。食品酶和/或饲料酶变体与本文所述的食品酶和/或饲料酶具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。如本领域已知的，术语“百分比同一性”是如通过对序列进行比较所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。
可以使用已知的计算机程序常规地确定同一性水平。可通过已知方法容易地对同一性进行计算，所述方法包括但不限于以下所述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,NY(1991)。对确定同一性的优选方法进行设计，以给出测试序列之间的最佳匹配。确定统一性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中编纂。可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151‑153)以默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PEN ALT Y＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLB 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。

[0056] 本文所述的变体异源食品酶和/或饲料酶(包括本文所述的食品酶和/或饲料酶)可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的酶，并且这种取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的酶，或(iii)其中成熟多肽与另一种化合物(例如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇))融合的酶，或(iv)其中额外的氨基酸与用于纯化多肽的成熟多肽融合的酶。食品酶和/或饲料酶的“变体”可以是保守变体或等位变体。

[0057] 异源食品酶和/或饲料酶可以是已知/天然食品酶和/或饲料酶的片段。在异源食品酶和/或饲料酶是异源烘焙酶的实施方案中，异源烘焙酶可以是已知/天然烘焙酶的片段或已知/天然烘焙酶的变体的片段(例如，如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：108的氨基酸序列或其变体的烘焙酶片段)。在一个实施方案中，片段对应于已除去信号肽序列的已知/天然食品酶和/或饲料酶。食品酶和/或饲料酶“片段”(包括烘焙酶“片段”)具有至少100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个或更多食品酶和/或饲料酶的连续氨基酸。当与已知/天然食品酶和/或饲料酶的氨基酸序列比较时，片段包含至少一个较少的氨基酸残基，并且仍然具有全长食品酶和/或饲料酶的酶活性。在一个实施方案中，片段对应于缺乏信号肽的酶的氨基酸序列。在一些实施方案中，食品酶和/或饲料酶的片段可用于通过肽合成产生相应的全长食品酶和/或饲料酶。因此，该片段可用作产生全长蛋白质的中间体。

[0058] 在本公开的重组酵母宿主细胞中，异源食品酶和/或饲料酶(包括烘焙酶)与重组酵母宿主细胞“细胞相连”，因为它被设计成被表达并与重组酵母宿主细胞保持物理相连。在一个实施方案中，食品酶和/或饲料酶可以在重组酵母宿主细胞内(细胞内)表达。在这样的实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶不需要与重组酵母宿主细胞壁相连。当要在细胞内表达食品酶和/或饲料酶时，如果存在于天然序列中，可以删除其信号肽序列以允许细胞内表达。

[0059] 在另一个实施方案中，可以分泌异源食品酶和/或饲料酶，但如果这样的话，则它必须与重组酵母宿主细胞保持物理相连。在一个实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶的至少一部分(通常至少一个末端)例如与细胞壁共价相连、非共价相连和/或静电相连(并且在一些实施方案中，与细胞质膜相连)。例如，可以对异源食品酶和/或饲料酶进行修饰，以携带一个或多个跨膜结构域，以具有一个或多个脂质修饰(豆蔻酰化、棕榈酰化、法尼基化和/或异戊烯化)，以与一个或多个膜相连的蛋白质相互作用和/或与细胞脂筏相互作用。虽然异源食品酶和/或饲料酶可能不直接与细胞膜或细胞壁相连(例如，当通过栓系部分发生相连时)，但蛋白质仍然被认为是根据本公开的“细胞相连的”异源食品酶和/或饲料酶。

[0060] 在一些实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶可以表达为位于重组酵母宿主细胞的细胞壁上并与之相连。在一些实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶被表达为位于宿主细胞的细胞壁的外表面并与之相连。重组酵母宿主细胞均具有细胞壁(其包括细胞质膜)，其限定细胞内(例如，面向细胞核的内部)和细胞外(例如，面向外部)环境。异源食品和/或酶可以位于重组酵母宿主细胞壁的外表面(并且在一些实施方案中，物理上与之相连)，并且在其它实施方案中，与重组酵母宿主细胞质膜的外表面相连。在本公开的上下文中，表述“与重组酵母宿主细胞的细胞壁/细胞质膜的外表面相连”是指异源食品酶和/或饲料酶至少部分地在重组酵母宿主细胞的细胞壁中(和在一些实施方案中，在细胞质膜中)物理整合的能力(以共价方式或非共价方式)。物理整合可归因于例如异源食品酶和/或饲料酶上存在跨膜结构域，存在能够与异源食品酶和/或饲料酶上的细胞质膜蛋白质相互作用的结构域，存在对异源酶食品酶和/或饲料酶的翻译后修饰(例如，脂质化)等。

[0061] 一些异源食品酶和/或饲料酶(包括烘焙酶)具有位于重组酵母宿主细胞的细胞壁并与其相连的固有能力(例如，与细胞相关)。具有细胞相连的固有能力的食品酶和/或饲料酶的一个实例示于图1A部分(例如，图1A中的菌株T2994栏)。在该图中，示出了在无栓系部分的情况下，在酿酒酵母中表达的嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α‑淀粉酶的结果，并清楚地显示该酶本质上是“细胞相连的”并且表现出酶活性(例如，麦芽糖α‑淀粉酶活性)。

[0062] 然而，在某些情况下，可能需要增加或提供与某些食品酶和/或饲料酶的细胞相连，因为它们表现出内在细胞相连不足或只是缺乏固有的细胞相连。在这样的实施方案中，可以通过将异源食品酶和/或饲料酶与栓系氨基酸部分组合作为嵌合构建体来提供，这将提供或增加与重组酵母宿主细胞细胞壁的附着。在这样的实施方案中，嵌合食品酶和/或饲料酶将被认为是“栓系的”。优选嵌合蛋白的氨基酸栓系部分相对于异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性而言是中性的，例如，不干扰异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性。在一些实施方案中，氨基酸栓系部分与异源食品酶和/或饲料酶的结合可以增加异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性(当与非栓系、非嵌合形式相比较时)。

[0063] 在一个实施方案中，栓系部分可用于与异源食品酶和/或饲料酶一起表达，以将酶位于重组酵母宿主细胞的壁。各种栓系氨基酸部分是已知技术，并且可以用于本公开的嵌合蛋白中。

[0064] 栓系部分可以是在另一种蛋白质上发现的跨膜结构域，并允许嵌合蛋白质具有跨膜结构域。在这样的实施方案中，栓系部分可衍生自FLO1蛋白(具有例如SEQ ID NO：10的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：9的核酸序列编码)。

[0065] 在又一实例中，氨基酸栓系部分可以被翻译后修饰以包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚并且允许嵌合蛋白具有GPI锚。GPI锚是附着于蛋白质末端(并且在一些实施方案中，附着于蛋白质的羧基末端)的糖脂，其允许蛋白质锚定至细胞膜的细胞质膜。能够提供GPI锚的栓系氨基酸部分包括但不限于与SED1蛋白结合/从SED1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：12的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：11的核酸序列编码)，与TIR1蛋白结合/从TIR1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：14的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：13的核酸序列编码)，与CWP2蛋白结合/从CWP2蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：16的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：15的核酸序列编码)，与CCW12蛋白结合/从CCW12蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：84的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：17的核酸序列编码)，与SPI1蛋白结合/从SPI1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：74的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：19的核酸序列编码)，与PST1蛋白结合/从PST1蛋白衍生的那些(具有例如SEQ ID NO：22的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：21的核酸序列编码)，或与AGA1和AGA2蛋白的组合结合/衍生自其的那些(具有例如SEQ ID NO：24的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：23的核酸序列编码，例如，SEQ ID NO：26的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：25的核酸序列编码)。在一个实施方案中，栓系部分提供GPI锚，并且在又一个实施方案中，栓系部分衍生自SPI1蛋白(具有例如SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：74的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：19的核酸序列编码)，或衍生自CCW12蛋白(具有例如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：84的氨基酸序列，其变体或其片段，或由SEQ ID NO：17的核酸序列编码)。

[0066] 在一个实施方案中，栓系部分是SPI1蛋白的片段，其保留其定位于细胞膜的能力。SPI1蛋白的片段包含少于129个SEQ ID NO：74的氨基酸序列的氨基酸连续残基。例如，来自SPI1蛋白的栓系部分片段可包含至少10个、20个、21个、30个、40个、50个、51个、60个、70个、
80个、81个、90个、100个、110个、111个或120个来自SEQ ID NO：74的氨基酸序列的连续氨基酸残基。在另一个实施方案中，来自SPI1蛋白的栓系部分片段可包含SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82中任一个所示的氨基酸序列，或基本上由SEQ ID NO：
76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82中任一个所示的氨基酸序列组成。

[0067] 在另一个实施方案中，栓系部分是CCW12蛋白的片段，其保留其定位于细胞膜的能力。CCW12蛋白的片段包含少于112个SEQ ID NO：84的氨基酸序列的氨基酸连续残基。例如，来自CCW12蛋白的栓系部分片段可包含至少10个、20个、24个、30个、40个、49个、50个、60个、70个、74个、80个、90个、99个、100个或110个来自SEQ ID NO：84的氨基酸序列的连续氨基酸残基。在另一个实施方案中，来自CCW12蛋白的栓系部分片段可以包含SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92中任一个所示的氨基酸序列，或基本上由SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92中任一个所示的氨基酸序列组成。

[0068] 栓系氨基酸部分可以是已知/天然栓系氨基酸部分的变体，例如具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的栓系氨基酸部分的变体。当与天然栓系氨基酸部分的氨基酸序列比较时，变体包含至少一个氨基酸差异。如本文所使用，变体是指氨基酸序列中不会不利地影响栓系氨基酸部分的生物学功能(例如，外表面上的位置和异源食品酶和/或饲料酶在细胞质膜中的锚定)的改变。当改变的序列阻止或破坏与栓系氨基酸部分相关的生物学功能时(例如，外表面上的位置和异源食品酶和/或饲料酶在细胞质膜中的锚定)，认为取代、插入或缺失会对蛋白质产生不利影响。例如，可以改变蛋白质的总电荷、结构或疏水‑亲水性质而不会不利地影响生物活性。因此，可以改变氨基酸序列，例如使肽更疏水或亲水，而不会不利地影响栓系氨基酸部分的生物活性。栓系氨基酸部分变体具有与本文所述的栓系氨基酸部分至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％或99％的同一性。如本领域已知的，术语“百分比同一性”是通过对序列进行比较所确定的两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。可以使用已知的计算机程序常规地确定同一性水平。可通过已知方法容易地对同一性进行计算，所述方法包括但不限于以下所述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,ed.)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,ed.)Academic Press,NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.)Humana Press,NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.)Stockton Press,NY(1991)。对确定同一性的优选方法进行设计，以给出测试序列之间的最佳匹配。确定统一性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中编纂。可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151‑153)以默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PEN ALT Y＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLB 1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。

[0069] 本文所述的变体栓系氨基酸部分可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的氨基酸部分，并且这种取代氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的氨基酸部分，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物(例如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇))融合的氨基酸部分，或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合以纯化多肽的氨基酸部分。栓系氨基酸部分的“变体”可以是保守变体或等位基因变体。

[0070] 栓系氨基酸部分可以是已知/天然栓系氨基酸部分的片段或已知/天然栓系氨基酸部分的变体的片段(例如，如具有SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：92的氨基酸序列的栓系氨基酸部分的片段，或其变体)。栓系氨基酸部分“片段”具有至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多栓系氨基酸部分的连续氨基酸。当与已知/天然栓系氨基酸部分的氨基酸序列比较时，片段包含至少少一个的氨基酸残基，并且仍具有全长栓系氨基酸部分的生物活性(例如，细胞壁的位置)。

[0071] 在需要氨基酸栓系部分的实施方案中，异源食品酶和/或饲料酶可以作为由重组酵母宿主细胞表达并具有下式之一的嵌合蛋白提供(由氨基(NH2)至羧基(COOH)方向提供)：

[0072] FFE‑L‑TT(I)或

[0073] TT‑L‑FFE(II)

[0074] 在这两个式中，残基“FFE”是指异源食品酶和/或饲料酶部分，残基“L”是指存在任选的接头，而残基“TT”是指氨基酸栓系部分。在式(I)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系的氨基末端(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基(COOH或C)末端。在式(II)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系的羧基末端(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基(NH2或N)末端。

[0075] 在另一个实施方案中，在式(I)和式(II)的嵌合蛋白中，食品酶和/或饲料酶可以是烘焙酶。在此类实施方案中，嵌合蛋白可具有下式之一(由氨基(NH2)至羧基(COOH)的方向提供)：

[0076] BE‑L‑TT(Ia)或

[0077] TT‑L‑BE(IIa)

[0078] 在这两个式中，残基“BE”是指异源烘焙酶部分，残基“L”是指存在任选的接头，而残基“TT”是指氨基酸栓系部分。在式(Ia)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系(直接或间接)位于异源烘焙酶部分的羧基(COOH或C)末端。在式(IIa)的嵌合蛋白中，氨基酸栓系(直接或间接)位于异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基(NH2或N)末端。

[0079] 当氨基酸接头(L)不存在时，栓系氨基酸部分与异源食品酶和/或饲料酶(或与异源烘焙酶)直接相连。在式(I)和式(Ia)的嵌合体中，这意味着异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基末端(或异源烘焙酶部分的羧基末端)与栓系氨基酸部分的氨基末端直接相连(利用酰胺键)。在式(II)和(IIa)的嵌合体中，这意味着栓系氨基酸部分的羧基末端与异源食品酶和/或饲料酶(或异源烘焙酶)的氨基末端直接相连(利用酰胺键)。

[0080] 在一些实施方案中，氨基酸接头(L)的存在对于提供例如异源食品酶和/或饲料酶部分与栓系氨基酸部分之间的一些灵活性，或促进异源核酸分子的构建是合乎需要的。如在本公开中使用的，“氨基酸接头”或“L”是指将异源酶部分FFE或BE与氨基酸栓系部分TT分开的一段或多段氨基酸(例如，间接将异源食品酶和/或饲料酶连接至氨基酸栓系部分TT)。优选氨基酸接头是中性的，例如，不干扰异源食品酶和/或饲料酶的生物(酶)活性，也不干扰氨基酸栓系部分的生物学(细胞相关)活性。在一些实施方案中，氨基酸接头L可以增加异源食品酶和/或饲料酶部分和/或氨基酸栓系部分的生物活性。

[0081] 在其中接头(L)存在于式(I)和式(Ia)的嵌合体中的情况下，其氨基末端与异源食品酶和/或饲料酶部分的羧基末端相连(利用酰胺键)，并且其羧基末端与氨基酸栓系部分的氨基末端相连(利用酰胺键)。在接头(L)存在于式(II)和式(IIa)的嵌合体中的情况下，其氨基末端与氨基酸栓系部分的羧基末端相连(利用酰胺键)，并且其羧基末端与异源食品酶和/或饲料酶部分的氨基末端相连(具有酰胺键)。

[0082] 存在各种氨基酸接头，包括但不限于(G)n、(GS)n；(GGS)n；(GGGS)n；(GGGGS)n；(GGSG)n；(GSAT)n，其中，n＝1至8(或更大)的整数。在一个实施方案中，氨基酸接头L是(GGGGS)n(也称为G4S)，并且在更进一步的实施方案中，氨基酸接头L包含多于一个G4S(SEQ ID NO：41)基序。例如，氨基酸接头L可以是(G4S)3并且具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列。在另一个实例中，氨基酸接头L可以是(G)8并且具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列。在另一个实例中，氨基酸接头L可以是(G4S)8，并且具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列。

[0083] 在一些实施方案中，氨基酸接头也可以是GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：96)。

[0084] 存在另外的氨基酸接头，包括但不限于(EAAK)n和(EAAAK)n，其中，n＝1至8(或更大)的整数。在一些实施方案中，一个或多个(EAAK)n/(EAAAK)n基序可以被一个或多个另外的氨基酸残基分开。在一个实施方案中，氨基酸接头包含一个或多个EA2K(SEQ ID NO：100)或EA3K(SEQ ID NO：101)基序。在一个实施方案中，氨基酸接头可以是(EAAK)3并且具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列。在另一个实施方案中，氨基酸接头可以是(A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A)并且具有SEQ ID NO：99的氨基酸序列。

[0085] 其它氨基酸接头包括具有一个或多个(AP)n基序的那些接头，其中，n＝1至10(或更大)的整数。在一个实施方案中，接头是(AP)10并且具有SEQ ID NO：98的氨基酸序列。

[0086] 在一些实施方案中，接头还包含一个或多个HA标签(SEQ ID NO：53)。

[0087] 用于制备重组酵母宿主细胞的工具

[0088] 为了制备重组酵母宿主细胞，在体外制备异源核酸分子(也称为表达盒)并将其引入酵母宿主细胞中以允许异源食品酶和/或饲料酶的重组表达。

[0089] 本公开的异源核酸分子包含异源多肽(例如异源食品酶和/或饲料酶或包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的编码区。DNA或RNA“编码区”是DNA或RNA分子(优选DNA分子)，其中，当置于合适的调控序列的控制下时，其在体外或体内在细胞中转录和/或翻译成异源食品酶和/或饲料酶。“合适的调控区”是指位于编码区的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核酸区域，并且其影响转录、RNA加工或稳定性、或结合编码区的翻译。调控区可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎‑环结构。编码区的边界取决于5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子。编码区可包括但不限于原核区、来自mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成的DNA分子或RNA分子。如果编码区用于在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码区的3'。在一个实施方案中，编码区域可以称为开放阅读框架。“开放阅读框”的缩写是ORF，并且是指核酸DNA、cDNA或RNA的长度，其包含翻译起始信号或起始密码子(例如ATG或AUG)和终止密码子，并且可以潜在地翻译成多肽序列。

[0090] 本文描述的异源核酸分子可包含转录和/或翻译控制区。“转录和翻译控制区”是DNA调控区，例如启动子、增强子、终止子等，其提供在宿主细胞中编码区的表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制区域。

[0091] 在一些实施方案中，本公开的异源核酸分子包括启动子以及异源食品酶和/或饲料酶(包括包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的编码序列。异源核酸序列还可包括终止子。在本公开的异源核酸分子中，启动子和终止子(当存在时)与异源食品酶和/或饲料酶(包括包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸编码序列可操作地连接，例如，它们控制异源食品酶和/或饲料酶(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸序列的表达和异源食品酶和/或饲料酶(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的核酸序列的表达的终止。本公开的异源核酸分子还可以包含编码信号肽的核酸，例如用于将异源食品酶和/或饲料酶输出宿主细胞外的短肽序列。当存在时，编码信号肽的核酸序列直接位于上游，并与编码异源食品酶和/或饲料酶的核酸序列(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)一致。

[0092] 在本文所述的异源核酸分子中，启动子和编码异源食品酶和/或饲料酶的核酸分子(包括含有异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)彼此可操作地连接。在本公开的上下文中，表述“可操作地连接”或“可操作地相连”是指启动子与编码异源多肽的核苷酸酸分子以以下方式物理结合的事实：在某些条件下允许表达来自核酸分子的异源蛋白质。在一个实施方案中，启动子可位于编码异源蛋白质的核酸序列的上游(5')。在另一个实施方案中，启动子可位于编码异源蛋白质的核酸序列的下游(3')。在本公开的上下文中，异源核酸分子中可包含一个或多于一个启动子。当异源核酸分子中包含多于一个启动子时，每个启动子与编码异源蛋白质的核酸序列可操作地连接。鉴于编码异源蛋白质的核酸分子，启动子可位于上游、下游以及位于上游和下游两者。

[0093] “启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA片段。如本文所使用的术语“表达”是指来自本文所述的异源核酸分子的有义(mRNA)的转录和稳定积累。表达还可以指将mRNA翻译成多肽。启动子可以整体衍生自天然基因，或者由衍生自天然存在的不同启动子的不同元素组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段指导表达，或响应于不同的环境或生理条件。使基因在大多数细胞中以基本相似的水平表达的启动子通常称为“组成型启动子”。在酵母细胞增殖过程中引起基因表达的启动子在本文中称为“增殖启动子”。增殖启动子包括组成型启动子和诱导型启动子，例如葡萄糖调节的启动子、糖蜜调节的启动子、应激反应启动子(包括渗透胁迫应答启动子)和需氧调节的启动子。在本公开的上下文中，重要的是所选择的启动子允许在重组酵母宿主细胞的增殖阶段期间表达异源核酸分子，以允许足够量的细胞相连异源食品酶和/或饲料酶表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。启动子通常以转录起始位点的3'末端为界，并向上游(5'方向)延伸，以包含启动转录所必需的最少数量的碱基或元素，这些碱基或元素的数量要高于背景可检测的水平。在启动子内将发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图方便地定义)，以及负责聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。

[0094] 启动子可以源自编码异源多肽的核酸分子或与其是异源的。启动子可以是异源的或衍生自与重组宿主细胞相同的属或种的菌株。在一个实施方案中，启动子衍生自酵母宿主胞细的相同属或种，并且异源多肽衍生自与宿主细胞不同的属。启动子可以是单个启动子或不同启动子的组合。

[0095] 在本公开中，在重组酵母宿主细胞的增殖期期间允许异源蛋白质表达或有利于异源蛋白质表达的启动子是优选的。作为兼性厌氧菌的酵母能够在有氧条件下进行呼吸增殖，并在厌氧条件下进行发酵增殖。在许多商业应用中，酵母在需氧条件下增殖以使底物向生物质的转化最大化。任选地，生物质可以在厌氧条件下用于随后的发酵以产生所需的代谢物。在本公开的上下文中，重要的是异源核酸中存在的启动子或启动子组合能够允许异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在重组酵母宿主细胞的增殖期过程中表达。这将允许在发酵前(如果有的话)积累与重组酵母宿主细胞相连的异源食品酶和/或饲料酶。在一些实施方案中，启动子允许在增殖过程中表达异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体，但不允许在重组酵母宿主细胞的发酵(如果有的话)过程中表达。

[0096] 启动子可以源自编码异源蛋白质的异源基因或与其异源。可以包含在异源核酸分子中的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子(例如Perez‑Torrado等，2005中描述的那些)。诱导型启动子包括但不限于葡萄糖调节启动子(例如，hxt7基因的启动子(称为hxt7p)并具有SEQ ID NO：30的核酸序列，其功能变体或功能片段；ctt1基因的启动子(称为ctt1p)并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；glo1基因的启动子(称为glo1p)并具有核酸SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)，并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段；gsy2基因的启动子(称为gsy2p)并具有SEQ ID NO：53的核酸序列，其功能变体或功能片段)，糖蜜调节启动子(例如，在Praekelt等，1992中描述的mol1基因的启动子(称为mol1p)，或具有SEQ ID NO：64的核酸序列，其功能变体或功能片段)，热休克调节启动子(例如，glo1基因的启动子(称为glo1p)并且具有SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；sti1基因的启动子(称为sti1p)，并且具有SEQ ID NO：56的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)，并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段；gsy2基因的启动子(称为gsy2p)并具有SEQ ID NO：53的核酸序列，其功能变体或功能片段)，氧化应激反应启动子(例如，cup1基因的启动子(称为cup1p)并具有SEQ ID NO：58的核酸序列，其功能变体或功能片段；ctt1基因的启动子(称为ctt1p)并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；trx2基因的启动子(称为trx2p)，并具有SEQ ID NO：55的核酸序列，其功能变体或功能片段；gpd1基因的启动子(称为gpd1p)并具有SEQ ID NO：57的核酸序列，其功能变体或功能片段；hsp12基因的启动子(称为hsp12p)并具有SEQ ID NO：63的核酸序列，其功能变体或功能片段)，渗透应激反应启动子(例如，ctt1基因的启动子(称为ctt1p)，并具有SEQ ID NO：60的核酸序列，其功能变体或功能片段；glo1基因的启动子(称为glo1p)并具有SEQ ID NO：59的核酸序列，其功能变体或功能片段；gpd1基因的启动子(称为gpd1p)，并具有SEQ ID NO：57的核酸序列，其功能变体或功能片段；ygp1基因的启动子(称为ygp1p)并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段)以及氮调节启动子(例如，ygp1基因的启动子(称为ygp1p)并具有SEQ ID NO：61的核酸序列，其功能变体或功能片段)。

[0097] 可以包含在本公开的异源核酸分子中的启动子包括但不限于：tdh1基因的启动子(称为tdh1p，并且具有例如SEQ ID NO：27的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hor7基因的启动子(称为hor7p，并且具有例如SEQ ID NO：28的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hsp150基因的启动子(称为hsp150p，并且具有例如SEQ ID NO：29的核酸序列，其功能变体或功能片段)，hxt7基因的启动子(称为hxt7p，并且具有例如SEQ ID NO：30的核酸序列，其功能变体或功能片段)，gpm1基因的启动子(称为gpm1p，并且具有例如SEQ ID NO：31的核酸序列，其功能变体或功能片段)，pgk1基因的启动子(称为pgk1p，并且具有例如SEQ ID NO：32的核酸序列，其功能变体或功能片段)和/或stl1基因的启动子(称为stl1p，并且具有例如SEQ ID NO：33的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在一个实施方案中，启动子是tdh1p和/或hor7p或包含tdh1p和/或hor7p。在另一个实施方案中，启动子包含tdh1p和hor7p，或基本上由tdh1p和hor7p组成。在进一步的实施方案中，启动子是thd1p。

[0098] 可以使用一种或多种启动子以允许每种异源多肽在重组酵母宿主细胞中表达。在本公开的上下文中，当与启动子组合使用时，表达“启动子的功能片段”是指比天然启动子更短的核酸序列，其保留在重组酵母宿主细胞的增殖阶段期间，控制编码异源食品酶和/或饲料酶或其嵌合体的核酸序列的表达的能力。通常，功能片段是来自天然启动子核酸序列的一个或多个核酸残基的5'和/或3'平截。

[0099] 在一些实施方案中，核酸分子包含一种终止子序列或终止子序列的组合，以终止异源食品酶和/或饲料酶(或包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白)的翻译。终止子对于编码异源食品酶和/或饲料酶或其相应嵌合体的核酸序列可以是天然的或异源的。在一些实施方案中，可以使用一种或多种终止子。在一些实施方案中，终止子包含来自dit1基因的终止子(称为dit1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：34的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自idp1基因的终止子(称为idp1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：35的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自gpm1基因的终止子(称为gpm1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：36的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自pma1基因的终止子(称为pma1t，并且可以具有例如SEQ ID NO：37的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自tdh3基因的终止子(称为tdh3t，并且可以具有例如SEQ ID NO：38的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自hxt2基因的终止子(称为hxt2t，并且可以具有例如SEQ ID NO：39的核酸序列，其功能变体或功能片段)，来自adh3基因的终止子(称为adh3t，并且可以具有例如SEQ ID NO：70的核酸序列，其功能变体或功能片段)，和/或来自ira2基因的终止子(称为ira2t，并且可以具有例如SEQ ID NO：40的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在一个实施方案中，终止子衍生自dit1基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：34的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在另一个实施方案中，终止子包含adh3基因或衍生自adh3基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：70的核酸序列，其功能变体或功能片段)。在本公开的上下文中，表述“终止子的功能变体”是指与天然终止子相比在至少一个核酸位置被取代的核酸序列，其保留结束表达编码异源蛋白质或其相应嵌合体的核酸序列的能力。在本公开的上下文中，表述“终止子的功能片段”是指比天然终止子更短的核酸序列，其保留结束编码异源蛋白质或其相应嵌合体的核酸序列表达的能力。

[0100] 在一些实施方案中，异源核酸分子包含一种信号肽序列或信号肽序列的组合的编码序列，其允许异源蛋白质(或包含异源蛋白质的嵌合蛋白质)输出至酵母宿主细胞壁外。可以简单地将信号肽序列添加到核酸分子中(通常与编码异源食品酶和/或饲料酶的序列一致)或替换已经存在于异源食品酶和/或饲料酶中的信号肽序列。信号肽序列对于编码异源食品酶和/或饲料酶或其相应嵌合体的核酸序列可以是天然或异源的。在一些实施方案中，可以使用一种或多种信号序列。在一些实施方案中，信号序列来自编码转化酶蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：68的氨基酸序列，其变体或其片段)，编码AGA2蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：69的氨基酸序列，其变体或其片段)或编码真菌淀粉酶蛋白的基因(并且可以具有例如SEQ ID NO：107的氨基酸序列，其变体或其片段)。在本公开的上下文中，表述“信号序列的功能变体”是指当与天然信号序列相比较，在至少一个核酸位置上被取代的核酸序列，其保留指导异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在细胞外表达的能力。在本公开的上下文中，表述“信号序列的功能片段”是指比天然信号序列更短的核酸序列，其保留指导异源食品酶和/或饲料酶或其相应的嵌合体在细胞外表达的能力。

[0101] 在其中需要在重组酵母宿主细胞内(细胞内)表达异源食品酶和/或饲料酶的一些实施方案中，异源核酸分子可以排除用于编码在编码食品酶和/或饲料酶的天然基因中发现的信号肽序列的部分。

[0102] 可以将编码异源食品酶和/或饲料酶、嵌合体的异源核酸分子，其变体或片段整合到酵母宿主细胞的基因组中。如本文所使用的术语“整合”是指通过分子生物学技术置于宿主细胞基因组中的遗传因子。例如，可以将遗传因子置于宿主细胞的染色体中，而不是载体(如宿主细胞携带的质粒)。将遗传因子整合到宿主细胞基因组中的方法是本领域熟知的，并且包括同源重组。异源核酸分子可以在酵母宿主细胞基因组中以一个或多个副本存在。或者，异源核酸分子可以独立地从酵母的基因组中复制。在这样的实施方案中，核酸分子可以是稳定的和自我复制的。

[0103] 本公开还提供了用于修饰酵母宿主细胞的核酸分子，以允许表达异源食品和/或酶、其嵌合体、变体或片段。核酸分子可以是DNA(例如互补DNA、合成DNA或基因组DNA)或RNA(其包括合成RNA)，并且可以以单链(有义链或反义链)或双链形式提供。预期的核酸分子可包括编码区的改变、非编码区的改变或两者的改变。实例是含有产生沉默取代、添加或缺失的改变的核酸分子变体，但不改变编码的食品酶和/或饲料酶、嵌合体、变体或片段的性质或活性。

[0104] 在一些实施方案中，可以引入重组宿主细胞的异源核酸分子相对于预期的受体重组酵母宿主细胞进行密码子优化。如本文所使用，术语“密码子优化的编码区”是指通过用一个或多个更常在该生物体的基因中使用的密码子替换至少一个或多于一个密码子而适于在给定生物体的细胞中表达的核酸编码区。通常，生物体中高度表达的基因偏向于被该生物体中最丰富的tRNA种类识别的密码子。这种偏向的一个衡量标准是“密码子适应指数”或“CAI”，它测量用于编码特定基因中每个氨基酸的密码子在多大程度上出现在生物体高度表达基因的参考集中的程度。本文所述的密码子优化的异源核酸分子的CAI相当于约0.8至1.0，约0.8至0.9，或约1.0。

[0105] 可以使用载体将异源核酸分子引入酵母宿主细胞中。“载体”，例如“质粒”、“粘粒”或“人工染色体”(例如，如酵母人工染色体等)是指额外的染色体元素，并且通常呈圆形双链DNA分子形式。此类载体可以是从任何来源衍生的线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中，许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的构建体，其能够将选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3'非翻译序列一起引入细胞中。

[0106] 本公开还提供了与编码异源多肽以及变体或片段的互补核酸分子可杂交的核酸分子。当核酸分子的单链形式在适当的温度和溶液离子强度条件下与另一核酸分子退火时，核酸分子可与另一核酸分子(例如cDNA、基因组DNA或RNA)“杂交”。杂交和洗涤条件是众所周知的，其在以下示例：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)，特别是其中第11章和表11.1。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可以对严格条件进行调节，以筛选中等相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)以及高度相似的片段(例如复制来自密切相关生物的功能性酶的基因)。杂交后洗涤决定了严格条件。一组条件使用一系列洗涤，从6X SSC，0.5％SDS开始，室温下
15分钟，然后用2X SSC，0.5％SDS在45℃下重复30分钟，然后用0.2X SSC，0.5％SDS在50℃下30分钟重复两次。对于更严格的条件，在较高温度下进行洗涤，其中洗涤与上述过程相同，除了在0.2X SSC，0.5％SDS中洗涤两个30min的温度升高至60℃。另一组高度严格的条件采用在0.1X SSC，0.1％SDS中在65℃下进行两次最终洗涤。另一组高度严格条件被定义为：在0.1X SSC，0.1％SDS，65℃下杂交，并用2X SSC，0.1％SDS洗涤，然后用0.1X SSC，
0.1％SDS洗涤。

[0107] 杂交需要两个核酸分子含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，但碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同一性程度越大，则具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序降低：RNA：RNA，DNA：RNA，DNA：DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经推导出用于计算Tm的等式。对于具有较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，并且寡核苷酸的长度决定了其特异性。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可以根据因素诸如探针长度的需要对温度和洗涤溶液盐浓度进行调节。

[0108] 用于增殖和配制重组酵母宿主细胞的方法

[0109] 本公开允许制备包含本公开的重组酵母宿主细胞的酵母组合物。在一些实施方案中，酵母组合物可用于减少或免除用外源(以及纯化/分离的)酶对食品或饲料制备过程进行补给的需求。

[0110] 用于制备酵母组合物的方法一般包括两个步骤：第一步，使重组酵母宿主细胞增殖；以及第二步，配制酵母组合物。如在本公开的上下文中使用的，“酵母组合物”是包含已经增殖的本公开的重组酵母宿主细胞的组合物。酵母组合物可以用于例如后续发酵(在发酵过程中原位提供异源酶)或制备食品/饲料产品。在一个实施方案中，重组酵母宿主细胞以活性或半活性形式在酵母组合物中提供。例如，酵母组合物的一个实施方案是由本公开的重组酵母宿主细胞制备的膏状酵母。

[0111] 增殖步骤可以是连续培养、分批培养或分批补料培养。在增殖步骤中，将重组酵母宿主细胞置于培养基中，在一些实施方案中，所述培养基可以允许快速生长。例如，培养基可包含碳源(例如，如糖蜜、蔗糖、葡萄糖、右旋糖糖浆、乙醇和/或玉米浆等)、氮源(例如，如氨等)和磷源(例如，如磷酸等)。增殖步骤可以细分为两个步骤，初始接种步骤和进一步的大规模增殖步骤。在增殖步骤中，可以对温度(当重组酵母宿主细胞来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属时，通常在约32℃)、pH和通气条件进行监测和调节，以有利于或优化重组酵母宿主细胞的分裂。例如，当采用分批补料增殖条件时，使用高通气和增量碳水化合物添加可以优化酵母组合物的生物量的产率。

[0112] 在配制步骤中，可以对增殖后获得的混合物(包含增殖的重组酵母宿主细胞)进行改进。本公开的重组酵母宿主细胞的优点之一是异源食品酶/饲料酶活性与重组酵母宿主细胞相关，因此在增殖后浓缩生物质也将增加异源食品酶/饲料酶的量/活性。在提供酵母组合物的实施方案中，从培养基中除去增殖后获得的混合物的至少一种组分以提供酵母组合物。该组分可以是但不限于水、氨基酸、肽和蛋白质、核酸残基和核酸分子、细胞碎片、发酵产物等。在一个实施方案中，配制步骤包括从培养基的组分中基本上分离增殖的酵母重组宿主细胞(例如，生物质)。如在本公开的上下文中所使用的，表述“基本上分离”是指从增殖的重组酵母宿主细胞中除去培养基的大部分组分。为了提供酵母组合物，可以将增殖的重组酵母宿主细胞离心(并且可以任选地洗涤包含增殖的重组酵母宿主细胞的所得细胞沉淀)、过滤和/或干燥(任选地使用真空干燥技术)。然后可以将分离的重组酵母宿主细胞配制在酵母组合物中。在一些实施方案中，配制步骤可以(至少部分地)保留重组酵母宿主细胞的活力。因此，酵母组合物可以以活性或半活性形式提供。酵母组合物可以液体、半固体或干燥形式提供。在一个实施方案中，酵母组合物可以以酵母膏的形式提供。

[0113] 酵母组合物可进一步修饰为酵母产品。如在本公开的上下文中所使用的，酵母产品是由增殖的重组酵母宿主细胞获得的产品，其包含异源食品酶和/或饲料酶。酵母产品可以是例如酵母溶解物(例如，自溶物)、酵母提取物、酵母部分(例如，酵母细胞壁)和/或基本上分离形式的异源食品酶和/或饲料酶。如在本公开的上下文中所使用的，表述“从溶解的重组酵母宿主细胞中基本上分离/纯化的异源食品酶和/或饲料酶”是指从异源食品酶和/或饲料酶中除去大部分溶解的重组酵母宿主细胞组分，并以分离/纯化形式提供它们。

[0114] 酵母组合物以及酵母产品可以作为食品添加剂提供。如在本公开中使用的，表述“食品添加剂”是指用于人类营养的产品，用于改善食品质量或改善生产过程。在此类实施方案中，酵母组合物还可包括但不限于载体(例如盐或小麦砂)、稳定剂和/或油。在具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游食品制备的活酵母组合物(例如，如酵母膏等)提供，作为灭活酵母组合物提供，作为酵母部分和/或作为纯化食品酶提供。在另一个具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游食品制备的干燥制剂(例如喷雾干燥的制剂)提供。

[0115] 酵母组合物可以作为饲料添加剂提供。如在本公开中所使用的，表述“饲料添加剂”是指用于动物营养的产品，用于改善饲料质量、动物源食品质量和/或改善动物的性能和健康(例如，提供增强的饲料原料消化率)。在此类实施方案中，酵母组合物还可包括但不限于载体(例如盐或小麦砂)、稳定剂和/或油。在具体实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游饲料制备的活酵母组合物(例如，如酵母膏等)提供，作为灭活酵母组合物提供，作为酵母部分和/或作为纯化饲料酶提供。在另一个具体的实施方案中，酵母组合物可以作为适于下游饲料制备的干燥制剂(例如喷雾干燥的制剂)提供。在一个实施方案中，将饲料添加剂添加到动物的饮食中以补给它。

[0116] 用于制作食品和饲料产品的过程

[0117] 本公开的重组酵母宿主细胞已被设计用于制备用于人(食品)或动物(饲料)消费的产品。因此，本公开提供了一种方法，包括将本公开的重组酵母宿主细胞包含在食品或饲料产品中。在一些实施方案中，可能有利的是提供本公开的重组酵母宿主细胞作为食品添加剂或作为饲料添加剂。在一些实施方案中，该方法还可包括对产品进行发酵和/或对食品或饲料产品进行烘焙。在该方法包括发酵步骤的情况下，可以在本文所述的重组酵母宿主细胞存在下或通过本文所述的重组酵母宿主细胞进行发酵(全部或部分)。本公开的方法可用于延长食品或饲料产品的保质期。可以在使用前对重组酵母细胞的酶活性(与异源食品酶和/或饲料酶以及包含异源食品酶和/或饲料酶的嵌合蛋白有关)进行计量并根据所需的活性类型进行调整。

[0118] 在一个实施方案中，食品和饲料产品是烘焙产品。在这样的实施方案中，优选使用表达细胞相连的烘焙酶的重组酵母宿主细胞。烘焙产品(如酵母发酵的烘焙产品)可以通过本文所述的重组酵母宿主细胞发酵。酵母发酵的烘焙产品包括但不限于面包、糕点(包括羊角面包)、卷、皮塔饼、玉米饼、百吉饼和馅饼或比萨饼皮等。当在制备酵母发酵产品的过程中使用时，重组酵母宿主细胞可以是添加到可发酵底物中的唯一发酵生物。在其它情况下，可以将重组酵母宿主细胞与非重组(例如野生型)酵母混合，以提供足够剂量的异源烘焙酶活性。例如，重组酵母宿主细胞(其可以是重组酿酒酵母酵母宿主细胞)可以任何比例与野生型酵母宿主细胞(其可以是野生型非重组酿酒酵母)组合。在一个实施方案中，重组体：野生型之间的比例为1:100至100:1。

[0119] 淀粉分解酶在酵母发酵烘焙产品的生产中特别受关注，因为它们有利于淀粉(原始形式或水解形式)的水解，因此为发酵酵母提供能量源来加速发酵过程，增加CO2产量，增加乙醇产量和/或改善发酵产品的感官特性。特别地，麦芽糖淀粉酶在制作面包的过程中非常有用，因为已知它们通过保持烘焙面包的柔软性和回弹性来延长保质期。

[0120] 在另一个实施方案中，烘焙产品不通过本文所述的重组酵母宿主细胞发酵，而是化学发酵或未发酵。化学发酵和未发酵的烘焙产品包括但不限于蛋糕和扁面包。

[0121] 在本文所述的方法中，本公开的重组酵母宿主细胞可以以活性形式(例如，液体、压缩或流化床干酵母)、以半活性形式(例如，液体、压缩或流化床干燥的)、无活性形式(例如，鼓式或喷雾干燥的)以及它们的混合物提供。例如，重组酵母宿主细胞可以是活性和半活性或非活性形式的组合，以提供制备烘焙产品所需的烘焙酶的比例和剂量。

[0122] 通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，这些实施例用于说明本发明而非限制其范围。

[0123]

[0124]

[0125]

[0126]

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[0128]

[0129]

[0130]

[0131]

[0132]

[0133] 细胞生长。细胞在5mL YPD(10g/L酵母提取物、20g/L细菌蛋白胨、40g/L葡萄糖)中生长过夜。收获(1)mL全培养物，通过离心使细胞沉淀。除去无细胞上清液并保存用于后续分析。将细胞沉淀洗涤一次并重悬于去离子水中。

[0134] 种子分批补料发酵。制备糖蜜混合物(85％甜菜糖蜜、15％甘蔗糖蜜)，稀释并用硫酸将其pH调节至pH 5.2。将纯培养物接种物在无菌水中稀释，并与硫酸锌、硫酸镁、生物素、硫胺素、泛酸钙和磷酸一起加入糖蜜混合物中。将酵母在32℃，pH 4.5下增殖24小时。将得到的增殖酵母离心，并使用实验室Alfa分离器洗涤增殖液体培养基以达到约20％的酵母固体。用硫酸对酵母固体进行处理，然后用氢氧化钠调节pH，得到酵母膏。

[0135] 商业化分批补料发酵。制备糖蜜混合物(85％甜菜糖蜜、15％甘蔗糖蜜)，稀释并用硫酸将其pH调节至pH 5.2。将来自种子分批补料的酵母膏在无菌水中稀释，并与硫酸锌、硫酸镁、生物素、硫胺素、泛酸钙一起加入糖蜜混合物中。将得到的增殖酵母离心，并使用实验室Alfa分离器洗涤增殖液体培养基以达到约20％的酵母固体。

[0136] 膏状酵母和灭活膏状酵母。在发酵之后，将收获的发酵液体培养基离心并使用实验室规模的GEA分离器洗涤以制备最终干重接近20％的酵母膏。为了制备灭活膏状酵母，在温控搅拌/加热板上加热约600g酵母膏直至达到75℃。将膏在75℃下保持15分钟，然后从热源中取出。

[0137] 喷雾干燥。喷雾干燥的样品通过用迷你喷雾干燥器(Buchi B‑290)在150℃下干燥制备。保持进料速率以将出口温度维持在80℃‑85℃左右。

[0138] 珠磨/制备珠磨匀浆。通过在以下珠磨条件下进行珠磨，将酵母膏破坏(典型破碎率>95％的细胞)。将酵母膏(～20％固体)用0.6L室容积Dyno KDL在4℃下进行珠磨，使用0.5mm‑0.75mm玻璃珠填充室至80％，填充容量1.6g/mL，采用直径64mm的搅拌器，圆周速度为10m/s。酵母膏流速为6kg/L/h。

[0139] 速干酵母(IDY)的制备。经目的为生产IDY样品的商业化发酵之后，将收获的液体培养基离心并使用实验室规模的GEA分离器洗涤以制备最终干重接近20％的酵母膏。然后将膏在真空过滤系统中过滤以制备块状酵母。为了除去额外的水，在挤出之前进一步压制块状酵母以达到约35％的干重。然后在与司盘充分混合5分钟后，挤压压制的饼。基于酵母干物质，司盘添加率为1％。挤出后，将酵母在实验室规模的流化床干燥器(Aeromatic AG)中干燥。将干燥温度设定并控制在35℃‑40℃。干燥持续约20‑25分钟以达到大于94％的固体含量。就发酵配方而言，IDY发酵配方的显著差异在于其在发酵结束时具有2小时的成熟期，其中，氨(N)停止并且发酵温度升高至35℃。

[0140] 发酵罐自溶。将至少3L(最小工作体积)的20％固体的膏转移到20L发酵罐(BiOENGiNEERNNG)中。自溶在55℃和pH 5.5(用2N硫酸自动控制pH)下进行，并在70rpm下温和搅拌。在温育24小时后收获自溶物(～20％干重)并如下所述进行分离。

[0141] 实验室规模自溶。该自溶与上述发酵罐自溶相似，但是以较小的规模进行并且具有稍微不同的参数。将膏状酵母(20％固体)进行自溶，并将pH调节至pH 7。将混合物在55℃水浴中的50mL锥形管中温育48小时。

[0142] 无需洗涤即可分离自溶物。在发酵罐自溶后，在Sorvall Lynx 6000离心机中在1L瓶中以11,000RCF将总自溶物分离10分钟，以获得可溶性级分(11％‑13％干重，酵母提取物)和不溶性级分(酵母细胞壁)。测量总自溶物的干重和酶活性，酵母提取物和细胞壁部分的干重和MANU余量。

[0143] 用洗涤分离自溶物。通过将发酵罐自溶物在50mL锥形管中以3,000RCF离心10分钟来进行分离。通过加入等于从离心步骤获得的上清液重量的水进行另外两次洗涤。YE(酵母提取物)分离产率计算为相对于自溶物中的起始固体，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(分别为WF＝1或2)的固体回收率。YE MANU回收率计算为相对于自溶物中的起始总Phadebas MANU，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(WF＝1或2)的活性(在Phadebas MANU中)。

[0144] 超滤。通过在11,000RCF下在1L瓶中离心分离发酵罐自溶物，并通过用10kDa分子量截止PES膜(Millipore，Biomax‑10)超滤，进一步浓缩酵母提取物级分。截留物部分被膜截留，以及渗透物部分通过膜。

[0145] 麦芽糖淀粉酶测定。一种麦芽糖淀粉酶Novo单位，MANU，是在标准条件下每分钟裂解一微摩尔麦芽三糖的酶的量。在测定酶活性之前，通过在MANU测定缓冲液(0.1M柠檬酸，pH 5.0)中于60℃温育10分钟使酵母膏样品失活。然后将样品与20mg/ml麦芽三糖底物混合，并在37℃下温育30分钟。加入等体积的1N氢氧化钠终止试剂来终止反应。在用葡萄糖(HK)测定试剂(Sigma G3293)在室温下温育15分钟后，测量被麦芽糖淀粉酶活性水解的葡萄糖。在分光光度计中读取340nm处吸光度。将未知样品与具有已知酶活性的的剂量曲线进行比较。该方法仅用于生成图1的结果。

[0146] Phadebas MANU酶活性测定。Phadebas片含有水不溶性淀粉底物和蓝色染料，用交联键与染料结合。底物被麦芽糖淀粉酶水解，释放出可溶的蓝色染料。终止反应并离心后，用分光光度法测量溶液的吸光度，并认为是酶活性的代表。对于每个样品，将一片Phadebas片剂加入到4.9mL柠檬酸盐‑磷酸盐缓冲液(70mM磷酸氢二钠、30mM柠檬酸，pH 5.5)中，在60℃水浴中温育5分钟。然后，将0.1mL在柠檬酸盐‑磷酸盐缓冲液中稀释的标准品或样品加入到片剂和缓冲溶液中，并在60℃水浴中温育15分钟。加入1mL 0.5M氢氧化钠溶液终止反应并混合。将管离心以除去固体，并用分光光度计在620nm处测量底物的吸光度。将样品(干燥或液体)与具有已知活性的 的剂量曲线进行比较。该方法用于生成除了图1之外的所有MANU结果。

[0147] 葡萄糖氧化酶测定。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加2％葡萄糖中在30℃下批量生长24小时。为了获得破碎的洗涤细胞上清液，将细胞在测定缓冲液中用玻璃珠打浆两TM次，每次1分钟，其间休息1分钟。通过离心将上清液与全裂解物分离。用K‑GLOX 试剂盒(Megazyme)对全培养物、上清液、破碎的洗涤细胞上清液(其反映细胞内细胞相关活性)、洗涤细胞或 的阳性对照(2.40GOD U/mL，相当于10000BG)进行测量：将测定缓冲
液(100mM磷酸钾，pH7，含有0.5mg/mL BSA和0.02％(w/v)叠氮化钠)中的样品与90mg/mL葡萄糖和POD混合物混合，并且在室温下温育20分钟。用分光光度计测量510nm处的吸光度。

[0148] α‑淀粉酶测定(图5)。通过将25μL洗涤的细胞或无细胞上清液加入到50mM乙酸钠pH 5中的25μL 5mM对硝基苯基α‑D‑己糖苷中，来测量α‑淀粉酶活性。将反应在35℃下温育2小时，并通过加入50μL 1M的碳酸氢钠终止。将细胞沉淀，将50μL测定混合物转移至微量滴定板并测量405nm处的吸光度。细胞级分的活性表示为总活性(“结合”+“游离”)的百分比。

[0149] α‑淀粉酶测定(图13至图16)。将菌株最初在600μL的YPD40中在35℃下在振荡器上的96孔板中以900rpm生长48小时。通过将25μL洗涤的细胞或无细胞上清液加入100μL含有50mM乙酸钠缓冲液(pH5.2)的1％生淀粉中，来测定α‑淀粉酶活性。使用Eppendorf梯度循环仪在85℃下测定30分钟。使用二硝基水杨酸试剂溶液(DNS)方法，使用2:1的DNS:淀粉测定比并在100℃下煮沸5分钟对还原糖进行测量。测量540nm处的吸光度。

[0150] 真菌淀粉酶活性。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加2％葡萄糖中在30℃下批量生长24小时。将全培养物、上清液和破碎的细胞上清液或洗涤的细胞重悬于测定缓冲液(70mM磷酸氢二钠，30mM柠檬酸，pH 5.5)中，与1％糊化小麦淀粉在测定缓冲液中混合，并在30℃下温育1小时。加入3,5‑二硝基水杨酸(DNS)以与还原端反应并在99℃下煮沸5分钟。用分光光度计测量540nm处的吸光度。

[0151] 小麦淀粉活性测定。细胞在酵母提取物蛋白胨培养基加4％葡萄糖中在35℃下批量生长48小时。将全培养物、上清液和洗涤的细胞重新悬浮于测定缓冲液(50mM乙酸钠，pH 5)中，与1％小麦淀粉在测定缓冲液中混合，并在60℃温育5分钟。然后，加入3,5‑二硝基水杨酸与还原端反应，并在99℃下煮沸5分钟。用分光光度计测量在540nm处的吸光度。

[0152] 植酸酶活性测定。制备2倍连续稀释的1M磷酸二氢钾作为计算FTU的标准。将190μl 5mM植酸钠溶液(pH 5.5)加入96孔PCR板的每个孔中。将具有4％葡萄糖的酵母提取物蛋白胨培养基中的酵母过夜培养物的标准品或上清液与pH 5.5的5mM植酸钠溶液合并，并在37℃下温育30分钟。温育2小时后再次测量细胞相连样品。在室温下以3500rpm沉淀3分钟之前，将等体积的反应物和变色溶液(4份试剂A至1份试剂B，其中，试剂A为12mM七钼酸铵‑HCl水溶液，以及试剂B为2.7％硫酸亚铁水溶液)合并，并在室温下温育10分钟。在分光光度计中读取每种样品或标准品在700nm处的吸光度。

[0153] 用 作为对照的烘焙测试。在存在和不存在外部添加剂量的麦芽糖淀粉酶产物的情况下(如图中所示)，用M1074菌株制备面包，并与用表达细胞相连MAA的菌株制备的面包(在缺失 的情况下)进行比较。对于用表达MAA的酵母膏
制成的面包，基于图1B中所示的酶活性将酵母膏的剂量标准化为1000MANU，并补给野生型C菌株酵母膏以获得足够的产气力。简而言之，将1 000g白面粉、600g水、35g酵母膏(以30％固体计量)、70g右旋糖、30g菜籽油、20g盐、0.06g抗坏血酸、0.625g (当存在
时)和3.75g硬脂酰乳酸钠在碗式混合器中合并成分，低速混合1分钟，并高速混合10分钟。
形成三个400g面团块并醒发7分钟。然后将面团卷起以形成面包条，放入面包盘中并在44℃下醒发直至它们达到100mm的高度。面包在225℃下烘焙17分钟。烘焙后测量面包屑硬度(老化指标)、回弹性和面包体积。

[0154] 质地分析。在面包烘焙后第5天、第8天和第13天进行面包屑质地分析。用电动刀切TM割面包，使用2.5cm规格。对面包中间的两片进行分析。使用TA‑XT Plus Texture 分析仪评估面包屑硬度和回弹性。使用TA‑3探针将面包屑压缩至10mm的距离(40％压缩)。在两个切片上每个切片进行五次测量，总共进行10次测量。宏(macro)用于计算回弹性％。

[0155] 用 作为对照的烘焙测试。白盘面包是在未添加或添加商业(Gluzyme10000BG，剂量为100GOU/kg或200GOU/kg面粉)或酵母细胞相连葡萄糖氧化酶(剂
量为127GOU/kg面粉)的情况下制备的。将1 000g白面粉、600g水、40g块状酵母(约30％固体)、70g右旋糖、30g植物油、20g盐和0.06g抗坏血酸在碗式搅拌机中进行组合，低速搅拌1分钟，以及高速混合9分钟。形成三个400g面团块并放入面包盘中，并在44℃下醒发直至它们达到100mm的高度。将面包条在225℃下烘焙17分钟。菌株M16780在酵母提取物蛋白胨培养基加4％葡萄糖中于32℃分批生长24小时。通过离心整个YPD培养物并除去上清液获得细胞沉淀。如葡萄糖氧化酶方法描述中所述对沉淀进行测量，并将相当于127GOU/kg面粉的体积加入面团中。将三个面团块各自校准至100mm高度并烘焙，然后测量烘烤高度。测量烘烤回弹性(烘烤高度减去校准高度)，并通过目视检查对面包屑结构进行评估(较高得分＝较细面包屑)。

[0156] 实施例II‑细胞相连的麦芽糖α‑淀粉酶的表达

[0157] 异源MAA的表达(特别是在栓系存在下)使重组酵母在细胞沉淀中具有麦芽糖淀粉酶活性(图1A)，并且在较大规模上，使重组酵母在酵母膏中具有麦芽糖淀粉酶活性(图1B)。相比之下，相应的野生型菌株未表现出任何麦芽糖淀粉酶活性(图1A和图1B)。通过表达来自tdh1和hor7基因的启动子的异源MAA获得图1A和图1B中所示的结果。仅用一种启动子(来自hor7基因；数据未示出)的组合获得了类似的结果。

[0158] 为了确定在面包制作中使用表达异源MAA的酵母的效果，用野生型酵母(补给或不补给 )或用表达异源MAA的重组酵母制备不同的面包。在面包制作中，质量与柔软性相关，因此寻求防止面包屑坚硬的能力。如图2A至图2C所示，与仅用未添加
的野生型菌株制成的面包相比，使用表达异源MAA的重组酵母制作面包可降低面包屑硬度。
表达异源MAA的重组酵母的使用提供了具有与用补给有 的野生型酵母制备的
面包块相似的面包屑硬度的面包块。

[0159] 还如图2A至图2C所示，与补给或未补给 的野生型酵母相比，表达异源MAA的酵母的使用维持或甚至增加了面包体积。

[0160] 面包质量也可以通过测量回弹性百分比来评估，而回弹性百分比的增加是希望的。如图3A至图3C所示，与未补给 的野生型酵母相比，表达异源MAA的酵母的使用甚至提高了回弹性百分比。

[0161] 增殖细胞内表达嗜热脂肪土芽孢杆菌MAA的菌株(M14851)(用糖蜜有氧分批补料)并测定MANU活性。如表2所示，在未处理的总液体培养基中，检测到在25.6至39.3之间的MANU活性。在洗涤并浓缩膏后，检测到在132至288之间的MANU活性。

[0162] 表2.浓缩酵母生物质浓缩物与细胞相连的麦芽糖淀粉酶。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的 标准品的剂量曲线进行比较。

[0163]

[0164] 增殖表达拴系嗜热脂肪土芽孢杆菌MAA(M13879)的另一菌株(用糖蜜有氧分批补料)，并在各种酵母制剂中测定MANU活性。结果如表3所示。商业化增殖后第1天的酵母膏活性数据是其原始形式的膏的最具代表性的量度。所有其它数据均在商业化增殖后第8天获得。

[0165] 表3.各种M13979制剂每克干重的Phadebas MANU活性。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶 标准品的剂量曲线进行比较。

[0166]

[0167] 在酵母菌株的不同制剂中测定MANU和小麦淀粉活性，所述酵母菌株在细胞内表达来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α淀粉酶(M15532)并增殖(用糖蜜有氧分批补料)。结果在表4至8中提供，示出了观察到的不同制剂对酶活性水平的影响。

[0168] 表4.测量各种M15532制剂上的麦芽糖淀粉酶活性的Phadebas和小麦淀粉酶测定法。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶
标准品的剂量曲线进行比较。

[0169]

[0170] 表5.膏、实验室规模的自溶膏(在55℃，pH 7下温育48小时)和再水合速干酵母(IDY)样品的活性结果。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶 标准品的剂量曲线比较。

[0171]

[0172] 表6.在酵母菌株M15532的不同制剂干燥之前和之后，自溶物、酵母提取物、超滤截留物和酵母细胞壁制剂中的干重和酶活性余量。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶 标准品的剂量曲线进行比较。

[0173]

[0174] 表7.在洗涤和不洗涤酵母菌株M15532的情况下来自总自溶物的酵母提取物和酶回收的分离结果。YE(酵母提取物)分离产率是相对于自溶物中的起始固体，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(分别为WF＝1或2)的固体回收率。YE MANU回收率是相对于自溶物中的起始总Phadebas MANU，仅分离(WF＝0)和分离加上一次或两次洗涤(WF＝1或2)的活性(在Phadebas MANU中)。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶 标准品的剂量曲线进行比较。

[0175]

[0176] 表8.具有10kDa截留分子量的M15532的酵母提取物的超滤结果。YE是酵母提取物，其通过将发酵罐自溶物在1升瓶中以11,000RCF离心10分钟而获得，以模拟商业化规模的分离。截留物是经超滤保留的样品，渗透物是未截留的样品。测定每种样品的Phadebas MANU/ml，并基于每个样品的干重计算MANU/g DW(干重)。在Phadebas酶测定中测定酶活性，并与具有已知麦芽糖淀粉酶单位(MANU)的酶 标准品的剂量曲线进行比较。

[0177]

[0178] 已经使用不同的制剂(例如膏和喷雾干燥的)酵母菌株M13979(表达栓系MAA)和M15531(表达细胞内MAA)来制作面包。与无面团改良剂制成的对照面包相比，酵母菌株M13979和M15531的使用降低了面包的面包屑硬度(图11和图12A)，同时保持其体积(图11)并增加其回弹性(图12B)。

[0179] 在表达来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的麦芽糖α淀粉酶的各种酵母菌株的总培养物、培养物上清液和洗涤细胞中测定归一化至细胞密度的小麦淀粉活性，所述酶以分泌形式表达、以栓系形式表达或在细胞内表达，如在图10的图例中所解释的。结果示于图8中，并且表明当MAA在细胞内表达时观察到最高活性。

[0180] 实施例III‑异源α‑淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、植酸酶、葡萄糖氧化酶和真菌淀粉酶的表达

[0181] 异源葡萄糖淀粉酶(GA)在酿酒酵母中由tef2基因的启动子表达。当GA表达为栓系酶时，与细胞沉淀有关的活性增加(图4)。

[0182] 来自tef2基因启动子的异源α‑淀粉酶(AA)。当AA表达为栓系酶时，与沉淀相关的活性增加，尤其是在接头存在下(图5)。

[0183] 制备表达来自柠檬酸杆菌(C.braakii)的植酸酶的酵母菌株的各种制剂，并测定它们的FTU活性。一些菌株以分泌形式表达植酸酶(T2633)，其它菌株以使用不同栓系的栓系形式表达植酸酶(T2634、T2635、T2636、T2637和T2638)。对于上清液和细胞本身，结果示于图7A和图7B中。

[0184] 制备表达来自大肠杆菌的植酸酶的酵母菌株的各种制剂，并测定它们的FTU活性。一些菌株以分泌形式表达植酸酶(M11312)，其它菌株以使用不同构型栓系的栓系形式表达植酸酶(T2705、T2706、M12795、M12938、T2816)。对于上清液和细胞本身，结果示于图8和图9中。

[0185] 使用栓系部分的各种平截制备异源嵌合耐热的强烈热球菌α‑淀粉酶‑SPl1构建体和热水管热球菌α‑淀粉酶‑CCW12构建体。将与表达具有平截的GPI锚定部分的嵌合多肽的菌株的洗涤细胞相关的α‑淀粉酶活性与未平截的GPI锚定部分进行比较，如图13和图14所示。

[0186] 如图13所示，具有全长栓系部分(由菌株M15222表达)的嵌合多肽显示出与具有平截的栓系部分的多肽(由菌株M15774(21aa‑长平截)、M15771(51aa‑长平截)、M1577(81aa‑长平截)或M15772(130aa‑长平截)表达)相同或更高的α‑淀粉酶活性。

[0187] 如图14所示，具有全长栓系部分的嵌合多肽(来自菌株M15215的表达)与具有平截的栓系部分的嵌合多肽(由菌株M15773(24aa‑长平截)、M15776(49aa‑长平截)、M16251(74aa‑长平截)或M15775(99aa‑长平截)表达)相比表现出相似或更高的α‑淀粉酶活性。

[0188] 使用各种接头和相同的栓系部分制备异源嵌合耐热的强烈热球菌α‑淀粉酶‑SPL1构建体和热水管热球菌α‑淀粉酶‑CCW12构建体。与表达具有不同接头的嵌合多肽的菌株的洗涤细胞相连的α‑淀粉酶活性示于图15和图16中。

[0189] 如图15所示，所有菌株的α‑淀粉酶活性均高于对照菌株(M2390)，与所用接头的类型无关。当使用接头7(SEQ ID NO：99)(菌株M16222)时，α‑淀粉酶活性最高。

[0190] 如图16所示，所有菌株的α‑淀粉酶活性均高于对照菌株(M2390)，与所用接头的类型无关。当使用接头5(SEQ ID NO：97)(菌株M15780)时，α‑淀粉酶活性最高。

[0191] 异源嵌合葡萄糖氧化酶(GO)构建体在细胞内或以分泌形式表达。将从各种细胞级分获得的GO活性与对照菌株(M10474)或阳性对照酶制剂Gluzyme (图17)进行比较。与菌株M16780和M16273相关的GO活性高于与亲本菌株M10474相关的对照GO活性(图
18)。

[0192] 菌株M16780也用于补给面包的面团，将其与阴性对照(未补给的面团)面包和阳性对照(葡萄糖氧化酶 补给面团)面包相比较。如图21所示，较高的烘焙回弹性和较细的面包屑结构(在M16780细胞沉淀面团中观察到)是补给面团中葡萄糖氧化酶功能的指示。

[0193] 异源嵌合真菌淀粉酶(FA)构建体以分泌形式表达。将从各种细胞级分获得的FA活性与对照菌株M10474或阳性对照酶制剂 进行比较(图19)。与菌株M16772和M16540相关的FA活性高于与亲本菌株M10474相关的对照活性(图20)。

[0194] 虽然已经结合本发明的具体实施方案对本发明进行了描述，但应理解，权利要求的范围不应受实施例中所述的优选实施方案的限制，而应给出与整个描述一致的最广泛的解释。

[0195] 参考文献

[0196] Pérez‑Torrado R,Bruno‑Bárcena JM,Matallana E.Monitoring stress‑related genes during the process of biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae strains used for wine making.Appl Environ Microbiol.2005Nov；71(11):6831‑7.

[0197] Praekelt UM,Meacock PA.MOL1,a Saccharomyces cerevisiae gene that is highly  expressed  in  early  stationary  phase  during  growth  on molasses.Yeast.1992Sep；8(9):699‑710.