优化的纤维素酶
阅读：805发布：2022-12-19
专利汇可以提供优化的纤维素酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了具有优化特性的用于处理含 纤维 素和木质 纤维素 物质的纤维素酶。具体而言，公开了具有优选特性的纤维 二糖 水 解 酶。本发明提供这些酶的融合、插入、缺失和/或替换变异体。酶变异体具有增强的热 稳定性 、蛋白水解稳定性、比活性和/或在极端pH下的稳定性。公开了编码这些酶的核酸分子、包含该酶的组合物、制备方法、和在纤维素处理和/或 生物 燃料 制备中的用途。，下面是优化的纤维素酶专利的具体信息内容。
1.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5基于437位的序列长度具有至少60%序列一致性的氨基酸序列，并且其中所述多肽在于62℃或更高的温度下进行转化60分钟后保持其最大底物转化能力的50%。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5基于437个氨基酸
残基的序列长度具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中SEQ ID NO：5所定义序列中的一个或多个氨
基酸残基，
在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个优选选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、D111、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、I276、I277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、I321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个插入而被修饰；
在更优选的实施方式中，在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个的1~8个氨基酸插入而被修饰；
在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159后的一个或更多中通过插入，和/或其位置G151、K159后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。
4.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：5基于
437个氨基酸残基的序列长度具有至少85%的序列一致性的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：2基于
500个氨基酸残基的序列长度具有至少85%的序列一致性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：2基于500个氨基酸
残基的序列长度具有至少90%、优选至少95%、更优选至少99%的序列一致性的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中的一项或多项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列具有
SEQ ID NO：2所定义的序列，其中1~75个氨基酸残基、更优选1~35个氨基酸残基被替换、缺失或插入。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中SEQ ID NO：2所定义的序列中的一个或多个以下氨基酸残基，
优选在SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的位置Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、D111、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、I276、I277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、I321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422、F427、P429、I430、G431、T433、G434、N435、P436、S437、G439、N440、P441、P442、G443、N445、R446、T448、T449、T450、T451、R453、P454、A455、T456、T457、G459、S460、S461、P462、G463、P464、T465、S467、H468、G470、C472、G474、G476、Y477、S478、P480、V482、C483、S485、G486、T488、C489、Q490、V491、L492、N493、Y495、Y496、Q498、C499、L500上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个插入而被修饰；
在更优选的实施方式中，在SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422、P436、P442、N445、R446、T448、T451、R453、P462、G463、H468、P480、V482、S485的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个的1~8个氨基酸插入而被修饰；
在还更优选的实施方式中，在SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422、P442、N445、R446、H468、V482的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后的一个或更多中通过插入，和/或其位置G151、K159、G434、A455或P464后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。
9.根据权利要求8所述的多肽，其中SEQ ID NO：2所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基被修饰如下：
10.根据前述权利要求中的一项或多项所述的多肽，其中所述多肽具有选自以下SEQ ID NO：2突变列表中的氨基酸序列：
11.根据前述权利要求中的一项或多项所述的多肽，其中，将编码多肽的核酸引入到酵母后，其中所述多肽含有与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的氨基酸序列，所述多肽以高于100mg/l、更优选高于200mg/l、特别优选高于500mg/l、最优选高于1g/l的水平表达并分泌到上清液中。
12.一种核酸，所述核酸编码权利要求5~11中的一项或多项所述的多肽，优选所述核酸与SEQ ID NO：1具有至少95%的一致性。
13.一种载体，包括权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其转化有权利要求13所述的载体。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞来源于酵母菌
（Saccharomyces）、裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）、毕赤酵母菌（Pichia）、毕赤酵母菌、汉森酵母菌（Hansenula）、曲霉菌（Aspergillus）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）、金孢子菌属（Chrysosporium）、毛壳属（Chaetomium）、枝顶孢属（Acremonium）、假丝酵母（Candida）和Yarrowina。
16.根据权利要求14或15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够产生乙醇，且优选为来源于包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、树干毕赤酵母（Pichia stipitis）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）的宿主细胞中的酵母。
17.根据权利要求14至15的任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是甲基营
养型酵母，优选来源于包括甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）、巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）、安格斯毕赤酵母（Pichia angusta）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）的宿主细胞。
18.根据权利要求14至15的任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真
菌，优选选自包括木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、毛壳属（Chaetomium）、金孢子菌属（Chrysosporium）、青霉属（Penicillium）或枝顶孢属（Acremonium）的宿主细胞，更优选为选自以下菌种中的一种：木霉菌（Trichoderma sp.）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）或Chrysosporium lucknowense。
19.产生权利要求1~11中任一项所述的纤维二糖水解酶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
d.获得已转化有载体的宿主细胞，所述载体包含权利要求12中所定义的核酸；
e.在表达所述纤维二糖水解酶蛋白的条件下培养所述宿主细胞；和
f.回收所述纤维二糖水解酶蛋白。
20.一种鉴定权利要求1~11中任一项所述的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
h.通过使具有SEQ ID NO：6所定义序列（编码SEQ ID NO：5）的核酸或根据权利要求
12所述的核酸，优选具有SEQ ID NO：1所定义序列的根据权利要求12所述的核酸进行突变，产生编码突变蛋白的突变基因的库；
i.将各个突变基因插入到表达载体中；
j.将各个表达载体转化到酵母细胞，以提供酵母转化株的库；
k.在表达并分泌突变蛋白的条件下培养各个酵母转化株；
l.将所表达的突变蛋白和底物一起培育；
m.确定所述突变蛋白的催化活性；
n.根据所确定的催化活性来选择突变蛋白。
21.根据权利要求19所述的方法，其中通过使权利要求12所述的核酸突变而产生编码突变蛋白的突变基因库，其中如下进行步骤e~g：
e.将所表达的突变蛋白与纤维素材料一起培育；
f．确定释放出的糖的量；
g．根据所释放糖的量来选择突变蛋白。
22.根据权利要求20或21所述的方法，还包括以下步骤：
h.对所选择的突变基因或蛋白进行测序；
i．通过将所选择的突变蛋白的序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行比较，以鉴定氨基酸修饰。
23.一种制备具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：
a.提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：2的催化域（SEQ ID NO：5）具有至少68%序列一致性的氨基酸序列；
b.对所述多肽的氨基酸进行鉴定，其对应于如在权利要求22的步骤i中所鉴定的相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列被修饰的氨基酸；和
c.通过定点突变执行在步骤b中所鉴定出的氨基酸修饰，以制备出步骤a所提供的多
肽的突变多肽。
24.根据权利要求23所述的方法，其中步骤a中所提供的多肽是来源于里氏木霉的野
生型纤维二糖水解酶。
25.一种具有纤维二糖水解酶活性的多肽，所述多肽可通过权利要求23或24所述的方法得到。
26.根据权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO：5所定义序列中的一个或多个以下
氨基酸残基如下表所示进行修饰：
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述多肽具有选自下列SEQ ID NO：5突变列表的氨基酸序列：
28.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：12具有至少85%序
列一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：12所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失而进行修饰：Q1、S2、P12、T15、S21、G23、T26、Q28、T29、G30、V32、N37、W40、T48、C50、N54、L60、E65、K69、V84、S90、D114、E119、F120、T121、L122、L123、D132、V133、G142、S148、M149、V155、Y158、N161、T162、K166、G170、Q175、F182、I183、G191、I203、D214、I215、A224、T231、G234、I237、S248、G254、W263、G269、L282、T285、G298、Y303、N307、G308、T310、E317、L318、S322、N324、G340、S341、D345、S357、M360、V363、D369、A372、P382、S388、T389、P390、T399、S400、Q406、N413、F423、P425、I426、G427、T429、P432、G435、N436、P437、G439、N441、R442、T444、T445、T446、T447、R449、P450、A451、T452、T453、S456、S457、P458、G463、P464、S467、H459、C468、G470、G472、S474、P476、V478、C479、S481、G482、T484、V487、L488、N489、Y491、Y492、Q494、C495、L496。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，
其中一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失而进行修饰：Q1、S2、P12、T15、S21、G23、T26、Q28、T29、G30、V32、N37、W40、T48、C50、N54、L60、E65、K69、V84、S90、D114、E119、F120、T121、L122、L123、D132、V133、G142、S148、M149、V155、Y158、N161、T162、K166、G170、Q175、F182、I183、G191、I203、D214、I215、A224、T231、G234、I237、S248、G254、W263、G269、L282、T285、G298、Y303、N307、G308、T310、E317、L318、S322、N324、G340、S341、D345、S357、M360、V363、D369、A372、P382、S388、T389、P390、T399、S400、Q406、N413、F423、P425、I426、G427、T429、P432、G435、N436、P437、G439、N441、R442、T444、T445、T446、T447、R449、P450、A451、T452、T453、S456、S457、P458、G463、P464、S467、H459、C468、G470、G472、S474、P476、V478、C479、S481、G482、T484、V487、L488、N489、Y491、Y492、Q494、C495、L496。
30.一种组合物，包括权利要求1~11或24~29中的一项或多项所述的多肽，以及一种或多种内切葡聚糖酶，和/或一种或多种β-葡糖苷酶，和/或一种或多种另外的纤维二糖水解酶，和/或一种或多种木聚糖酶。
31.权利要求1~11或24~29中的一项或多项所述的多肽或权利要求30所述的组合物
用于木质纤维素生物质的酶降解、和/或纺织品处理和/或作为洗涤剂成分和/或作为食品或饲料组合物成分中的用途。
优化的纤维素酶
技术领域
[0001] 本发明公开了具有优化特性的用于处理含有纤维素和含有木质纤维素底物的纤维素酶。具体而言，公开了具有优选特性的纤维二糖水解酶。本发明提供这些酶的融合、插入、缺失和/或替换变体。酶变体具有增强的热稳定性、蛋白水解稳定性、比活性（specific activity）和/或在极端pH下的稳定性。公开了编码该酶的核酸分子、包含该酶的组合物、制备方法以及用于纤维素处理和/或用于生物燃料生产中的用途。
背景技术
[0002] 极其需要发展基于可再生资源的生产方法，例如用于由纤维素和木质纤维素材料生成乙醇。
[0003] 纯的纤维素材料、或其与半纤维素和/或木质素的组合是有价值的并且是容易获得的用于生产化学品和燃料的原材料。纤维素和木质纤维素加工的重要步骤是β-1,4-连接葡萄糖聚合物纤维素（β-1,4-linked glucose polymer cellulose）的水解以及随后的葡萄糖单体和短葡萄糖低聚物例如纤维二糖、纤维三糖等的释放。在多种能降解和水解纤维素的生物特别是丝状真菌和细菌中发现了催化该反应的酶。
[0004] 已知用于将固体木质纤维素的生物质转化为可燃烧的燃料产物的连续工序。使纤维素底物更易被酶降解的处理包括碾磨、化学处理和/或水热处理。实例是湿式氧化和/或蒸汽喷发（steam explosion）。这样的处理提高了纤维素纤维的可及性（accessibility）并使它们与半纤维素和木质素分离开。
[0005] 文献中已知很多的用于将处理过的生物质水解的酶混合物。通常需要内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的混合物来进行纤维素聚合物的降解。在这些纤维二糖水解酶（CBH）中，更具体地，纤维二糖水解酶I（CBHI）在水解步骤中起重要作用，因为它们提供最持续的（processive）酶活性。CBHI酶催化纤维二糖从纤维素聚合物还原端上持续的水解释放。（Lynd LR,Weimer PJ,van Zyl WH,Pretorius IS.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol BiolRev.2002Sep;66(3):506-77）。
[0006] 水解的纤维素材料包含若干种可以从混合物中分离出来的有价值的碳水化合物分子。含糖的纤维素材料水解产物可以用于多种精细化学品或生物聚合物的微生物生产，例如有机酸、乙醇或高级醇（即二元醇或多元醇）或聚羟基脂肪酸酯（PHA）。糖类水解产物的主要用途之一是生物燃料的制备。
[0007] Kurabi等人（2005）描述了从里氏木霉（Trichoderma reesei）和其他真菌例如青霉菌（Penicillium sp.）中制备纤维素酶。基于经蒸汽喷发和乙醇有机溶剂预处理过的黄旗松（Douglas-fir）对性能进行了分析。酶混合物的更佳性能似乎是单组分酶的性质改善以及混合物中各化合物作用的结果，特别是β-葡萄糖苷酶的存在。（Kurabi A,Berlin A,Gilkes N,Kilburn D,Bura R,Robinson J,Markov A,Skomarovsky A,Gusakov A,Okunev O,Sinitsyn A,Gregg D,Xie D,Saddler J.(2005)Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-Fir by novel and commercial fungal cellulases.Appl Biochem Biotechnol.121-124:219-30）。
[0008] 领域内从一些真菌源得知了葡糖水解酶（glucohydrolase）7型（cel7）的纤维二糖水解酶序列。已知埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）的Cel7纤维二糖水解酶，并报道过其在大肠杆菌（Escherichia coli）（Grassick A,Murray PG，Thompson R,Collins CM,Byrnes L,Birrane G，Higgins TM,Tuohy MG.Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase,CBH IB,and molecular characterization of the cel7gene from the filamentous fungus,Talaromyces emersonii.Eur J Biochem.2004Nov;271(22):4495-506）和 酿 酒 酵 母 菌（Saccharomyces cerevistae）（Voutilainen SP，Murray PG，Tuohy MG，Koivula A.Expression of Talaromyces emersonii cellobiohydrolase Cel7A in Saccharomyces cerevisiae and rational mutagenesis to improve its thermostability and activity.Protein Eng DesSel.2010Feb;23(2):69-79）中的表达，然而，蛋白或是产出为失活形式的或者是收率非常低（小于或等于5mg/l）。从肉座菌属（Hypocrea）或木霉属（Trichoderma）的野生型或工程菌中可以以高收率产生红褐肉座菌（Hypocrea jecorina）纤维二糖水解酶I。红褐肉座菌Cel7A的改进序列在US7459299B2、US7452707B2、WO2005/030926、WO01/04284A1或US2009/0162916A1中公开。
[0009] 从已报道的热稳定性酶的序列比对中推断出、并从已确定位置的结构信息和重排（shuffling）以及接下来的限制筛选中暗示出引起改进的位点。已报道，通过应用非常敏感且以非常严格的方式与原物质（native substrate）类似的荧光物质，在可转化生物例如酿酒酵母中来进行较大库的筛选。（Percival Zhang YH,Himmel ME,Mielenz JR.Outlook for cellulase improvement:screening and selection strategies.Biotechnol Adv.2006 Sep-Oct;24(5):452-81）。
[0010] 报道了由其他真菌体系例如嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、Chrysosporium lucknowense或黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）生产纤维二糖水解酶。报道了由酵母表达Cel7纤维二糖水解酶，但是酶的收率或酶特性仍然不佳。（ ME,André L,Lehtovaara P，Bailey M,Teeri TT,Knowles JK.Efficient secretion of two fungal cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae.
Gene.1988;63(1):103-12）。
Gene.1988;63(1):103-12）。
[0011] WO03/000941公开了多个CBH和它们的相应的基因序列。但是没有公开生理特性和应用。报道了纤维素结合域对纤维二糖水解酶催化亚基的融合能改善没有原结构域的蛋白的水解特性。
[0012] US 2009042266（A1）公开了嗜热子囊菌Cel7A与来自嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）和红褐肉座菌的纤维二糖水解酶I的纤维素结合域的融合。
[0013] US5686593报道了特定设计的接头域（linker domain）和结合域与纤维二糖水解酶的融合。
[0014] Hong等人（2003）描述了嗜热子囊菌CBHI在酵母菌中的产生及其表征（Hong J,Tamaki H,Yamamoto K,Kumagai H Cloning of a gene encoding thermostablecellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast.Appl Microbiol Biotechnol.2003Nov;63(1):42-50）。
[0015] Tuohy等人（2002）报道了埃默森篮状菌CBH的表达和表征（Tuohy MG，Walsh DJ,Murray PG，Claeyssens M,Cuffe MM,Savage AV，Coughlan MP.:Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii.Biochim Biophys Acta.2002Apr 29;1596(2):366-80）。
[0016] Nevoigt等人（2008）报道了可加水分解纤维素的酶在酵母中的表达（Nevoigt E.Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae.Microbiol Mol Biol Rev.2008Sep;72(3):379-412）。
[0017] Fuita等人（2004）报道了在酿酒酵母中表达内切葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶和在细胞表面上的CBHII的结合。在该构建中没有使用纤维二糖水解酶I（Cel7）（Fujita Y，Ito J,Ueda M,Fukuda H,Kondo A.Synergistic saccharification,and direct fermentation to ethanol,of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme.Appl Environ Microbiol.2004Feb;70(2):1207-12）。
[0018] Boer H等人（2000）描述了GH7类酶在不同酵母宿主中的表达，但是所表达的蛋白水平低（Boer H,Teeri TT,Koivula A.Characterization of Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A secreted from Pichia pastoris using two different promoters.Biotechnol Bioeng.2000Sep5;69(5):486-94）。
[0019] Godbole等人（1999）和Hong等人（2003）发现，与从同源宿主表达的蛋白相比，酵母中表达的该酶类的蛋白经常错误折叠、高糖基化且水解能力降低（Godbole S,Decker SR,Nieves RA,Adney WS,Vinzant TB,Baker JO,Thomas SR,Himmel ME.Cloning and expression of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in Pichia pastoris.Biotechnol Prog.1999Sep-Oct;15(5):828-33）。
[0020] Kanokratana等人（2008）、Li等人（2009）以及CN01757710描述了Cel7 CBH I酶的高效表达，但是这些蛋白缺少为有效处理底物所需的纤维素结合域。（Kanokratana P，Chantasingh D,Champreda V，Tanapongpipat S,Pootanakit K,Eurwilaichitr L Identification and expression of cellobiohydrolase(CBHI)gene from anendophytic fungus,Fusicoccum sp.(BCC4124)in Pichia pastoris.LProtein Expr Purif.2008Mar;58(1):148-53.Epub 2007Sep 19;Li YL,Li H,Li AN,Li DC.Cloning of a gene encoding thermostable cellobiohydrolase from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum and its expression in Pichia pastoris.J Appl Microbiol.2009Jun;106(6):1867-75）。
[0021] Voutilainen（2008）和Viikari（2007）公开了包括热稳定性纤维二糖水解酶的Cel7酶，但是仅从里氏木霉中得到低到中等的表达水平（Voutilainen SP，
Puranen T，Siika-Aho M,Lappalainen A,Alapuranen M,Kallio J,Hooman S,Viikari L, J,Koivula A.Cloning,expression,and characterization of
novel thermostable family 7cellobiohydrolases.Biotechnol Bioeng.2008Oct
15;101(3):515-28.PubMed PMID:18512263;Viikari L,Alapuranen M,Puranen
T, J,Siika-Aho M.Thermostable enzymes in lignocellulose
hydrolysis.Adv Biochem Eng Biotechnol.2007;108:121-45）。
Puranen T，Siika-Aho M,Lappalainen A,Alapuranen M,Kallio J,Hooman S,Viikari L, J,Koivula A.Cloning,expression,and characterization of
novel thermostable family 7cellobiohydrolases.Biotechnol Bioeng.2008Oct
15;101(3):515-28.PubMed PMID:18512263;Viikari L,Alapuranen M,Puranen
T, J,Siika-Aho M.Thermostable enzymes in lignocellulose
hydrolysis.Adv Biochem Eng Biotechnol.2007;108:121-45）。
[0022] Grassick等人（2004）公开了埃默森篮状菌的纤维二糖水解酶I在大肠杆菌而非酵母菌中的未折叠表达（Grassick A,Murray PG，Thompson R,Collins CM,Byrnes L,Birrane G，Higgins TM,Tuohy MG.Three-dimensional structure of a thermostable native cellobiohydrolase,CBH IB,and molecular characterization of the cel7gene from the filamentous fungus,Talaromyces emersonii.Eur J Biochem.2004Nov;271(22):4495-506）。
[0023] 因此，需要具有改善特性的纤维素酶用于纤维素水解的技术工序。具体而言，需要在工序条件下具有较高催化活性和/或较高稳定性的CBH酶。此外，需要在真菌和/或酵母表达和分泌系统中具有较高产率的CBH酶。
发明内容
[0024] 本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在优选的实施方式中，本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的热稳定性多肽。即，在本实施方式中，当在60℃或更高，优选62℃或更高，并且在具体实施方式中为64℃或更高，例如66℃或更高下进行60分钟转化后，多肽保持其最大底物转化能力的50%。该多肽包含与SEQ ID NO5具有至少54%，优选至少56%，更优选至少58%，特别优选至少60%例如至少62%，特别是至少64%例如至少66%，且最优选至少68%的序列一致性的氨基酸序列。本发明还提供包含与SEQ ID NO：2具有至少
85%序列一致性的氨基酸序列的多肽。
85%序列一致性的氨基酸序列的多肽。
[0025] 此外，本发明公开编码本发明多肽的核酸、包含该核酸的载体以及转化有该载体的宿主，其中优选核酸与SEQ ID NO:1具有至少95%的一致性。
[0026] 本发明还提供用于制备由本发明的载体所编码的纤维二糖水解酶蛋白的方法、用于鉴定具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法、以及制备该具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法。还提供用于鉴定在升高的温度例如60℃或更高下保持最大底物转化能力的50%或更高的此类多肽的方法。
[0027] 本发明还提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：2所定义序列中的一个或多个特定氨基酸残基通过替换或缺失以及插入突变而进行修饰。这样的突变体的实例包括SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的Q1、G4、A6、T15、Q28、W40、D64、E65、A72、S86、K92、V130、V152、Y155、K159、D181、E183、N194、D202、P224、T243、Y244、I277、K304、N310、S311、N318、D320、T335、T344、D346、Q349、A358、Y374、A375、T392、T393、D410、Y422、P442、N445、R446、T456、S460、P462、G463、H468和/或V482，但是本发明并不限制于此。以下给出进一步的具体位置。
[0028] 此外，本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其可根据本发明通过制备具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法得到，其中该多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80%序列一致性的氨基酸序列，其中由SEQ ID NO：5定义的序列中的一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失以及插入突变而进行修饰。这样的突变体的实例包括SEQ ID NO：5的氨基酸1~440中的Q1、G4、A6、T15、Q28、W40、D64、E65、A72、S86、K92、V130、V152、Y155、K159、D181、E183、N194、D202、P224、T243、Y244、I277、K304、N310、S311、N318、D320、T335、T344、D346、Q349、A358、Y374、A375、T392、T393、D410和/或Y422。但是本发明并不限制于这些。其他具体位置在以下给出。
[0029] 本发明还提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：12具有至少85%序列一致性的氨基酸序列，其中由SEQ ID NO：12定义的序列中的一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失以及插入突变而进行修饰。这样的突变体的实例包括Q1、T15、Q28、W40、C72、V133、V155、Y158、T162、Y247、N307、G308、E317、S341、D345、Y370、T389、Q406、N441、R442、T452、S456、P458、G459、H464和/或V478，但是本发明并不限制于此。其他具体位置在以下给出。
[0031] 图1：用于毕赤酵母（Pichia pastoris）中组成型表达蛋白的pV1的限制性酶切图谱；pUC19-ori：在大肠杆菌中的复制起始点；KanR：卡那霉素/G418抗性与TEF1和EMZ启动子序列一起分别用于毕赤酵母和大肠杆菌筛选；5’GAP：甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子区；3’-GAP：终止子区域；SP MF α：酿酒酵母交配因子α信号序列；MCS：多克隆位点。
[0032] 图2：含有表达质粒的毕赤酵母CBS 7435摇瓶培养物的10倍浓缩上清液的考马斯染色SDS-PAGE，其中表达质粒具有绿色木霉（Trichoderma viride）的成熟CBHI蛋白（CBH-f；第1道）的编码序列、灰腐质霉（Humicola grisea）的成熟CBHI蛋白（CBH-d；第2道）的编码序列、埃默森篮状菌的成熟CBHI蛋白（CBH-b，第3道）的编码序列、嗜热子囊菌的成熟CBHI蛋白（CBH-e；第4道）的编码序列、以及在毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控下的在N端与酿酒酵母交配因子α的信号肽融合的埃默森篮状菌CBHI-CBD融合蛋白（CBH-a；第6道）的编码序列和与酿酒酵母交配因子α的信号肽融合的灰腐质霉-CBD融合蛋白（CBH-g；第7道）的编码序列。
[0033] 图3：用于在毕赤酵母中表达蛋白的pV3表达质粒的图谱。复制子：pUC19-ori，在大肠杆菌中的复制起始点；ZeoR：与TEF1和EM7启动子序列一起分别用于毕赤酵母和大肠杆菌表达的Zeocine抗性基因；AOX I启动子：毕赤酵母醇氧化酶I基因的启动子区；AOX 1转录终止子：终止子区；SP MFα：酿酒酵母交配因子α信号序列；MCS：多克隆位点。
[0034] 图4：从毕赤酵母菌株的发酵液中取得的培养上清液样品的SDS-PAGE分析，其中该毕赤酵母菌株具有AOXI-表达盒的基因整合且在7I生物反应器中在甲醇诱导过程中表达埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合肽（CBH-a）。样品P1~P7分别取自甲醇诱导的开端，以及20、45、119.5、142.5和167小时后。
[0035] 图5：用于埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合肽（CBH-ah）在里氏木霉中表达的pV4表达质粒的图谱；复制子：用于大肠杆菌中的复制的pUC19；cbh15’：木霉属CBHI基因的5’启动子区；cbh1信号肽：里氏木霉CBHI前导肽的编码序列；CBH-a：SeqID NO.18的编码区，埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合肽；cbh1终止子：里氏木霉CBHI基因座的3’端区域；潮霉素抗性：在里氏木霉磷酸甘油酸激酶启动子调控下的潮霉素磷酸转移酶的编码区；cbh13’：用于双交换事件的里氏木霉CBHI基因座的终止区的同源序列。
[0036] 图6：里氏木霉培养上清液的SDS-Page。第1道示出取代原CBHI基因而携带有埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合蛋白（CBH-ah）的替代菌株的表达谱。作为比较，第2道示出在相同条件下未修饰菌株的图谱。M：分子量标记。
[0037] 图7：归一化之后根据底物转化能力vs.温度图确定IT50值。在归一化步骤中，选定温度下的最大和最小荧光值分别被关联到1或0。归一化值邻近0.5时在最接近的两个温度点之间进行F’(T)=0.5线性插值得到所定义的IT50温度。
[0038] 图8：基于在各温度下评估的4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷（4-Methylumbelliferyl-β-D-lactoside）水解结果的“wt”埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合蛋白（CBH-ah：SeqID NO.18=SeqID NO.2+6×His-标签）和突变体的归一化转化能力vs.温度的图。荧光值是根据图8在55℃~75℃的温度范围内被归一化的。
[0039] A...wt；
[0040] B...G4C，A72C；
[0041] C...G4C，A72C，Q349K；
[0042] D...G4C，A72C，D181N，Q349K；
[0043] E...Q1L，G4C，A72C，D181N，E183K，Q349R；
[0044] F...Q1L，G4C，A72C，S86T，D181N，E183K，D320V，Q349R；
[0045] G...G4C，A72C，E183K，D202Y，N310D，Q349R；
[0046] H...Q1L，G4C，A72C，A145T，H203R，Q349K，T403K；
[0047] I...,Q1L，G4C，Q28R，E65V，A72C，D181N，E183M，S192S，P224L，S311G，D320I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468L，V482I
[0048] J...,Q1L，G4C，Q28K，E65K，A72C，L119L，D181N，E183M，S192S，S311G，N318Y，D320I，T335I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，N445D，R446G，H468Q，V482T
[0049] K...,Q1L，G4C，Q28K，E65V，A72C，L119L，D181N，E183M，S192S，D202N，P224L，S311G，T335I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468Q，V482I[0050] L...Q1L，G4C，Q28R，E65V，A72C，G151GCGRSG，D181N，E183M，P224L，S311G，D320I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468L，V482I
[0051] M...Q1L，G4C，Q28R，E65V，A72C，K159KCGRNK，D181N，E183M，P224L，S311G，D320I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468L，V482I
[0052] 图9：在β-糖苷酶的存在下水解48小时后，通过野生型（wt）和突变型埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD（CBH-ah）融合蛋白对预处理秸秆进行水解的葡萄糖收率。变异体的特征在于存在对于SeqID NO.18的下列突变，并且在摇瓶培养中从毕赤酵母中表达出变异体并使用Ni-NTA通过亲和层析从上清液中对其进行分离。
[0053] A：wt
[0054] B：G4C，A72C
[0055] C：G4C，A72C，Q349R
[0056] D：Q1L，G4C，A72C，D181N，E183K，Q349R
[0057] E：Q1L，G4C，Q28R，E65V，A72C，D181N，E183M，P224L，S311G，D320I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468L，V482I
[0058] F：Q1L，G4C，Q28R，E65V，A72C，G151GCGRSG，D181N，E183M，P224L，S311G，D320I，D346E，Q349K，T393V，Y422F，P442S，N445D，R446G，H468L，V482I
[0059] 图10：SeqID.NO 2与里氏木霉CBHI的比对。使用空格开放罚分为10且空格扩展罚分为0.1的比对矩阵blosum62mt2来创建比对。
具体实施方式
[0060] 本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽。在一个优选的实施方式中，本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的热稳定性多肽。在一个优选的方面，本发明公开了于高温下在一段延伸的时间内显示出高活性的蛋白变异体。优选地，当在60℃或更高的温度下进行60分钟转化时，本发明的多肽保持其最大底物转化能力的50%。各个温度也被称为IT50值。换言之，IT50值优选为60℃或更高，但更优选62℃或更高。即，在该实施方式中，当在60℃或更高，优选62℃或更高，并且在一个具体实施方式中为64℃或更高例如66℃或更高下进行60分钟转化时，多肽保持其最大底物转化能力的50%。此外，本发明的多肽优选具有在62~80℃，更优选65~75℃范围内的IT50值。
[0061] 在本文中，酶的“底物转化能力”被定义为在给定条件下（底物浓度、pH值和缓冲液浓度、温度）在某一时间段内由一定量的酶所催化的底物转化程度，并可以通过该条件下酶反应的终点检定来进行确定。在本文中，酶的“最大底物转化能力”被定义为在多个如上所述进行的测量中所得到的酶的底物转化能力中的最大值，其中仅有一个参数例如温度在给定范围内变化。根据本发明，实施例8所描述的检测用于确定这些参数。
[0062] 多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少54%、优选至少56%、更优选至少58%、特别优选至少60%例如至少62%、特别是至少64%例如至少66%、且最优选至少68%的序列一致性的氨基酸序列。术语“基于y个残基的序列长度的一致性”（其中y是任意整数，例如，如示例性实例，200、255、256、300、400、437、500）是指，y是用作序列一致性比较基础的亲本序列（在此具体情况为SEQ ID NO：5，但贯穿本申请也同理，也针对其它情况，具体是指本发明序列可以与之进行比较的亲本序列）的（优选为连续的）一部分。因此，对于序列一致性比较（序列比对），优选将SEQ ID NO：5中给出的亲本序列的200或更多、更优选300或更多、甚至更优选400或更多、且最优选437个位置考虑在内。以下具体给出如何计算序列一致性百分比。还应该注意，除非本说明书另外明确指出，亲本序列（例如，在该具体情况中，为SEQ ID NO：5）的全部序列（即，从第一个到最后一个氨基酸残基）将被用作亲本序列。
[0063] 在优选的实施方式中，能够在60℃或更高、优选62℃或更高的温度下进行60分钟转化时保持其最大底物转化能力的50%的多肽，是至少有一处突变而不同于SEQ ID NO：5的多肽，其中突变可以是一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或替换。也优选相对于SEQ ID NO：5中给出的多肽有至少两个这样的突变，例如至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少10个这样的突变。
[0064] “纤维二糖水解酶”或“CBH”是指从葡萄糖链的末端切割纤维素并产出纤维二糖作为主产物的酶。另外的名称为1,4-β-D葡聚糖纤维二糖水解酶或纤维素1,4-β-纤维二糖糖苷酶。CBH从包含1,4-β-D糖苷键的聚合物的还原或非还原端水解该1,4-β-D糖苷键。“纤维二糖水解酶I”或“CBH I”从纤维素纤维的还原端进行作用。“纤维二糖水解酶II”或“CBH II”从纤维素纤维的非还原端进行作用。纤维素二糖水解酶通常具有由催化域与一个或多个“纤维素结合域”或“CBD”所构成的结构。这样的结构域可以位于催化域的N端或C端。CBD具有碳水化合物结合活性且它们介导纤维素酶对晶体纤维素的结合，且已知结合域的存在与否对酶的持续性（processivity）特别是在对于聚合的底物时有很大影响。
[0065] 在优选的实施方式中，该多肽的特征还在于包含与SEQ ID NO：5具有至少80%的序列一致性、更优选与SEQ ID NO：5具有至少85%的序列一致性例如与SEQ ID NO：5具有至少90%的序列一致性、且最优选与SEQ ID NO：5具有至少95%的序列一致性的氨基酸序列。
[0066] 在还更优选的实施方式中，如上定义的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的特征还在于以下：其为如上定义的多肽，其中由SEQ ID NO：5定义的序列中的一个或多个氨基酸残基，在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个优选选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、D111、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S 193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、I276、I277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、I321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159之后通过一个或多个插入而被修饰，
[0067] 并且在一个更优选的实施方式中，在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159之后通过一个或多个的1~8个氨基酸插入而被修饰，
[0068] 在还更优选的实施方式中，在SEQ ID NO：5的氨基酸1~437中的一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422的位置上通过替换或缺失，和/或其位置G151、K159之后的一个或多个中通过插入，和/或在其位置G151、K159之后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。
[0069] 还优选这样的实施方式，其中上面给出的各个突变被引入到SEQ ID NO：2给出的多肽中，如以下所概述。
[0070] 本领域技术人员应该理解，给出的这些突变中的一些可以相互组合，即，其中例如Q69和T232被替换成其他氨基酸残基的具有纤维二糖水解酶活性的多肽包含在该实施方式中。术语“在位置x后插入”应被理解成该插入可以是在位置x的C端侧（接近C端）的任何位置；但是，强烈优选紧接在位置x后进行插入（其中x是任意位置）。
[0071] 本发明还公开了具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的氨基酸序列。优选与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的该多肽是如下的多肽，其还与以上给出的SEQ ID NO：5具有一定一致性，例如与SEQ ID NO：5给出的多肽具有至少60%（或更高，参见上面内容）序列一致性，和/或任意一个或多个在上面详细给出的与SEQ ID NO：5的一致性百分比的更具体的一致性实施方式。因此，与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的多肽是包含在本发明中的涉及与SEQ ID NO：5给出的多肽具有至少60%序列一致性的多肽的实施方式。本领域技术人员将容易地认识到以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5的热稳定性突变体为基础的共同发明构思。
[0072] 与上面对于SEQ ID NO：5的叙述相当，对于本文所定义的SEQ ID NO：2的序列比对，优选将SEQ ID NO：5的200或更多、更优选300或更多、甚至更优选400或更多、且最优选437个位置考虑在内。以下给出怎样计算序列一致性百分比的详情。在更优选的实施方式中，各个多肽包含与SEQ ID NO：2基于500个氨基酸残基的序列长度具有至少85%序列一致性的氨基酸序列。甚至更优选地，本发明包含与SEQ ID NO：2基于500个氨基酸残基的序列长度具有至少90%、或甚至更优选至少95%或98%的序列一致性的氨基酸序列。
[0073] 亲本序列在SEQ ID NO：2中给出。序列得自于里氏木霉CBHI的接头域和纤维素结合域（SEQ ID NO：4）与埃默森篮状菌CBHI（SEQ ID NO：5）催化域的C端融合。本发明还包括含有任意纤维素结合域与埃默森篮状菌CBHI（SEQ ID NO：5）的催化域衍生物的其他融合蛋白，优选该融合蛋白具有上述的温度稳定特性。纤维素结合域可以从任何来源获得。根据本发明的多肽可以另外携带六聚组氨酸标签。因此，通过示例的方式，任何一个在SEQ ID NO：42、44、46、48或50中示出的多肽的变异体都包括在本发明中。变异体优选为使得多肽表现出温度稳定性，如上面所描述和定义的。
[0074] 优选本发明的多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90%、优选至少95%、更优选至少99%序列一致性的氨基酸序列。此外，特别优选多肽的氨基酸序列具有SEQ ID NO：2所确定的序列，或由SEQ ID NO：2确定的序列但其中1~75个、更优选1~35个氨基酸残基被替换、缺失或插入。
[0075] 特别优选SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：12的蛋白的变异体。“蛋白变异体”是其氨基酸序列在一个或多个位置不同于亲本蛋白的多肽，其中不同可以是一个氨基酸被另一个取代、一个或多个氨基酸的缺失、或另外的氨基酸或一段氨基酸插入亲本序列中。根据定义，亲本多肽的变异体可以使用ClustalW Algorithm通过序列一致性比较（比对）而跟其他多肽区分开（Larkin M.A.,Blackshields G.,Brown N.P.,Chenna R.,McGettigan P.A.,McWilliam H.,Valentin F.,Wallace I.M.,Wilm A.,LopezR.,Thompson J.D.,Gibson T.J.and Higgins D.G.(2007)ClustalW and ClustalX
version 2.Bioinformatics 200723(21):2947-2948）。产生这些蛋白变异体的方法包括随机或定点突变、点饱和突变、基于PCR的片段拼装、DNA改组、体外或体内同源重组、以及基因合成的方法。
version 2.Bioinformatics 200723(21):2947-2948）。产生这些蛋白变异体的方法包括随机或定点突变、点饱和突变、基于PCR的片段拼装、DNA改组、体外或体内同源重组、以及基因合成的方法。
[0076] 根据IUPAC的建议作出了氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名。该文件内氨基酸通常命名为对应于一个字母代码。
[0077] 通过以原始氨基酸的单个字母代码接着为其位置号以及取代氨基酸的单个字母代码命名来描述单个氨基酸的调换，即，位置一的谷氨酰胺在这个位置变成亮氨酸被描述为“Q1L”。对于序列中单个位置的缺失，取代氨基酸的符号被替换为三个字母缩写“del”，因此位置3上丙氨酸缺失则会指代为“A3del”。插入额外的氨基酸纳入在前位置的数字并相对于他们到插入点的距离按字母表顺序以小写字母延伸。因此，在位置3后面的两个色氨酸插入指代为“3aW，3bW”或简单地为A3AWW（即，形式上为位置3的“A”被替换为氨基酸残基“AWW”）。非翻译密码子TAA、TGA和TAG引入到氨基酸序列中，在氨基酸序列中以“*”表示，因此在氨基酸序列的位置4引入终止密码子指代为“G4*”。
[0078] 多个突变用加号或斜线或逗号隔开。例如，分别在位置20和21将丙氨酸和谷氨酸替换为甘氨酸和丝氨酸的两个突变被表示为“A20G+E21S”或“A20G/E21S”“A20G，E21S”。
[0079] 当给定位置的氨基酸残基被两个或更多个可选的氨基酸残基替换时，这些残基用逗号或斜线隔开。例如，位置30的丙氨酸替换为甘氨酸或谷氨酸表示为“A20G，E”或“A20G/E”、或“A20G，A20E”。
[0080] 当在本文中确定了适合进行修饰的位置而没有建议任何具体的修饰时，应理解为任意氨基酸残基可以替换存在于该位置上的氨基酸残基。因此，例如，当提到位置20丙氨酸的修饰而没有指明时，应该理解为丙氨酸可以缺失或替换成任意其他氨基酸残基（即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任一个）。
[0081] 术语“相似的突变”或“相似的替换”是指本领域技术人员认为与第一种突变相似的氨基酸突变。本文中的相似是指具有相似化学特性的氨基酸。例如，如果在特定位置的突变引起脂肪族氨基酸残基（例如，Leu）对非脂肪族氨基酸残基（例如，Ser）的替换，那么在相同位置用不同的脂肪族氨基酸（例如，Ile或Val）进行替换被认为是相似的突变。其他的氨基酸特征包括残基的大小、疏水性、极性、电荷、pK值和其他领域内已知的氨基酸特征。因此，相似的突变可以包括例如碱性对碱性、酸性对酸性、极性对极性等等的替换。这样得到的氨基酸组很可能因为结构的原因而是保守的。这些组可以以Venn图的形式来说明（Livingstone CD.and Barton GJ.(1993)"Protein sequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation"Comput.Appl Biosci.9:745-756;Taylor W.R.(1986)"The classification of amino acid conservation"J.Theor.Biol.119;205-218）。例如，可以根据以下氨基酸分组来做出相似替换：疏水性的：F W Y H K M I L V A G；芳香族：F W Y H；脂肪族：I L V；极性的：W Y H K R E D C S T N；带电荷的：H K R E D；带正电的：H K R；带负电的：E D。
[0082] 作为氨基酸编号和用于描述蛋白变异体的蛋白变异体命名的惯例，在SEQ ID NO：2给出的亲本蛋白序列内，氨基酸序列QQAGTA中的第一个谷氨酰胺（Q）被认为是第1位置或Q1或谷氨酰胺1。所有氨基酸将根据他们在SEQ ID NO：2给出的亲本序列中相对于位置1的位置而进行编号。
[0083] 本发明还公开了以上给出的本发明多肽的具体变异体，例如SEQ ID NO：2的变异体，其序列在下文给出的一个或多个位置有改变。即，本发明在一个具体实施方式中提供如上所述的多肽，其中由SEQ ID NO：2所确定序列中的以下一个或多个氨基酸残基，优选在SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的位置Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、D111、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、I276、I277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、I321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422、F427、P429、I430、G431、T433、G434、N435、P436、S437、G439、N440、P441、P442、G443、N445、R446、T448、T449、T450、T451、R453、P454、A455、T456、T457、G459、S460、S461、P462、G463、P464、T465、S467、H468、G470、C472、G474、G476、Y477、S478、P480、V482、C483、S485、G486、T488、C489、Q490、V491、L492、N493、Y495、Y496、Q498、C499、L500通过替换或缺失，和/或在其位置G151、K159、G434、A455或P464之后通过一个或多个插入而被修饰。
[0084] 在一个更优选的实施方式中，SEQ ID NO：2所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基，优选在SEQ ID NO：2的氨基酸1~500中的选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、A21、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、W40、Y47、D64、E65、A68、Q69、A72、S86、K92、K118、Y155、D181、E183、Q190、S192、N194、D202、H203、P224、T229、G231、M234、S236、T243、D247、S311、N318、D320、T335、A340、T344、D346、Q349、K355、Y374、A375、T387、D390、T392、T393、Y422、P436、P442、N445、R446、T448、T451、R453、P462、G463、H468、P480、V482、S485的位置通过替换或缺失，和/或在其位置G151、K159、G434、A455或P464之后通过一个或多个的1~8个氨基酸插入而被修饰，在一个还更优选的实施方式中，在一个或多个选自Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、Q28、E65、A72、S86、D181、E183、D202、P224、S311、N318、D320、T335、D346、Q349、T392、T393、Y422、P442、N445、R446、H468、V482的位置上通过替换或缺失，和/或在位置G151、K159、G434、A455或P464之后的一个或多个处通过插入，和/或在位置G151、K159、G434、A455或P464之后通过一个或多个的5个氨基酸插入而被修饰。
[0085] 同样包括在本发明中的是在SEQ ID NO：5中的任意一个或多个具体突变1~430上的各个突变。本领域技术人员将意识到，SEQ ID NO：5的残基1~430相当于SEQ ID NO：2的位置1~430，因此可以容易地将以上和以下给出的对于任意一个或多个位置1~430有关于SEQ ID NO：2的优选修饰的详细教导转移至SEQ ID NO：5的各个一个或多个位置（1~430）上。作为示例性的和非限制性的实施例，技术人员易于知晓，因为D390是SEQ ID NO：2中优选进行修饰的一个具体位置，D390同样也是在SEQ ID NO：5中进行修饰所优选的位置。
[0086] 在优选的实施方式中，本发明多肽的变异体是如上所述的多肽，其中具体地，SEQ ID NO：2所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基如表1所示被修饰。示出的是优选、更优选、和最优选的修饰。这些突变中的任何突变可以相互组合。然而，在具体实施方式中，优选突变仅在表1示出的更优选和最优选的实施方式中进行选择。甚至更优选地，仅选择被指明为最优选的修饰。技术人员将意识到，任意这些突变都可以相互组合。
[0087] 表1：优选的交换和相似的突变
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 本发明的发明者惊讶地发现这些修饰的引入可以得到具有IT50值升高的纤维二糖水解酶活性的多肽，技术人员可以从以下实施例特别是实施例8中得知。
[0093] 甚至更优选地，以上总体定义的本发明多肽的变异体在具体实施方式中包括选自相对于SEQ ID NO：2具有下表2所列突变的序列的氨基酸序列，其任选地与C端6×-His标签融合。
[0094] 表2：对于SEQ ID NO：2的突变
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
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[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118] 又一方面，本发明公开了编码本发明多肽的核酸。核酸是多核苷酸序列（DNA或RNA），当在合适启动子的控制下组装（set）并转移至合适的生物宿主或化学环境时，其被加工以编码多肽，其中该过程还包括所有必要的翻译后和转录后步骤。编码序列会很容易因为简并的碱基三联体的变化、信号序列的改变、或通过内含子的引入而改变，而不影响所编码蛋白的分子特性。优选本发明的核酸与SEQ ID NO：1具有至少95%，更优选至少97%，最优选100%的一致性。本发明还提供包含该核酸的载体和转化有该载体的宿主。
[0119] 本发明还公开本发明多肽和其变异体在多种宿主细胞包括酵母和真菌宿主中的生产方法。也公开了通过序列变化而得到的菌株在蛋白特性改善中的用途。此外，本发明公开了这些多肽在纤维素水解中的应用方法。
[0120] 本发明的另一方面公开了用于产生SEQ ID NO：2的蛋白变异体的载体和方法，其中在酵母中表达并通过测量所释放的单和/或寡聚糖分子来检测他们对于纤维素材料的活性。
[0121] 本发明还涉及产生纤维二糖水解酶蛋白的方法，包括以下步骤：
[0122] a.获得宿主细胞，该宿主细胞已转化有包含本发明核酸的载体；
[0123] b.在表达纤维二糖水解酶蛋白的条件下培养宿主细胞；和
[0124] c．收集纤维二糖水解酶蛋白。
[0125] 在一个具体实施方式中，产生纤维二糖水解酶蛋白的该方法限定为产生本发明所提供的，例如具有上述IT50值、和/或属于本申请提供的并在说明书其他地方详细描述的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的一种具体变异体的纤维二糖水解酶蛋白的方法。
[0126] 在更优选的实施方式中，宿主细胞来源于酵母菌（Saccharomyces）、裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces）、克鲁维酵母菌（Kluyveromyces）、毕赤酵母菌（Pichia）、汉森酵母菌（Hansenula）、曲霉菌（Aspergillus）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）、假丝酵母（Candida）和Yarrowina。优选宿主细胞能够产生乙醇，其中最优选的酵母包括酿酒酵母菌、树干毕赤酵母菌（Pichia stipitis）、嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus）、或甲基营养型酵母，优选来源于包括甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）、巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）、安格斯毕赤酵母（Pichia angusta）、多形汉森酵母（Hansenula polymorpha）的宿主细胞。
[0127] 惊讶地发现，可以高水平地从酵母中表达根据本发明的多肽和其变异体。本文中的“酵母”（yeast）是指所有在其生命周期内显示出单细胞营养态的低级真核生物。尤其包括酵母菌（Saccharomycetes）纲的生物，特别是酵母菌属、管囊酵母菌属（Pachysolen）、毕赤酵母属、假丝酵母属、Yarrowina属、德巴利酵母属（Debaromyces）、克鲁维酵母属、接合酵母属（Zygosaccharomyces）。
[0128] 因此，本发明的一个方面涉及要求保护的多肽和其变异体在酵母中的表达。可以通过在至少一种合适启动子序列的调控下，将从核苷酸位置1开始的SEQ ID NO：1核酸分子插入到表达载体，并将核苷酸分子融合到合适的信号肽中例如融入到酿酒酵母交配因子α的信号肽中，来实现融合蛋白（SEQ ID NO：2）和SEQ ID NO：2的衍生蛋白变异体在酵母中的高效表达。
[0129] 在优选实施方式中，在将编码多肽的核酸引入到酵母中后，本发明的多肽和其变异体以高于100mg/l、更优选高于200mg/l、特别优选高于500mg/l、或最优选高于1g/l的水平表达并分泌到上清液中，其中多肽有与SEQ ID NO：2具有至少85%序列一致性的氨基酸序列。为确定酵母中的表达水平，培养和上清液分离可按实施例3所述进行。
[0130] 另一方面，本发明公开在丝状真菌中，优选在曲霉属（Aspergillus）或木霉属（Trichoderma）的真菌，更优选在木霉属的真菌，最优选在里氏木霉（Trichoderma reesei）中产生根据本发明多肽的方法。本文中的“丝状真菌”或“真菌”是指所有在其生命周期至少一个状态中表现出菌丝生长的低等真核生物。特别包括子囊菌（Ascomycota）门和担子菌（Basidiomycota）门的生物，尤其是木霉属、踝节菌（Talaromyces）属、曲霉属、青霉属、金孢子菌（Chrysosporium）属、平革菌（Phanerochaete）属、嗜热子囊菌（Thermoascus）属、伞菌（Agaricus）属、Pleutrus属、耙齿菌属（Irpex）的生物。通过将相容的信号序列的编码区融合至从SEQ ID NO：3的核苷酸位置52开始的核酸分子（因为SEQ ID NO：3中进行了里氏木霉CBHI信号序列的融合），并将融合肽定位在足够强的启动子的控制下，接着将基因构建体转移到宿主细胞中来表达多肽。这样的启动子和信号序列以及用于高效转移的技术已在本领域中已有描述。
[0131] 又一方面，本发明还涉及鉴定具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：
[0132] a.通过使权利要求9的核酸或具有SEQ ID NO：6（编码SEQ ID NO：5）所定义序列的核酸，优选具有SEQ ID NO：1所定义序列的核酸进行突变，产生编码突变蛋白的突变基因的库；
[0133] b.将各个突变基因插入到表达载体中；
[0134] c.将各个表达载体转化到酵母细胞，以提供酵母转化株的库；
[0135] d.在表达并分泌突变蛋白的条件下培养各个酵母转化株；
[0136] e.将所表达的突变蛋白与底物一起培育；
[0137] f.确定突变蛋白的催化活性；
[0138] g.根据所确定的催化活性来选择突变蛋白。
[0139] 具体地，可以使用孔板设计（format）来进行步骤d。优选地该设计允许具有纤维二糖水解酶活性的多肽鉴定方法的高通量性能。
[0140] 在优选实施方式中，用于鉴定具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法限定为如下方法，其中具有纤维二糖水解酶活性的多肽是本发明提供的一种或多种多肽，例如具有上述IT50值的多肽、和/或是以下SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的具体变异体中的一种。
[0141] 优选地，用于鉴定具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法中的步骤e到g如下进行：
[0142] e.将所表达的突变蛋白与纤维素材料一起培育；
[0143] f.确定释放出的糖的量；
[0144] g.根据释放出的糖的量来选择突变蛋白。
[0145] 在另一实施方式中，用于鉴定具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法包括以下另外的步骤：
[0146] h.对所选的突变基因或蛋白进行测序；
[0147] i.通过将所选择的突变蛋白的序列与SEQ ID NO：2的氨基酸序列进行比较来确定氨基酸修饰。
[0148] 在具体的实施方式中，该方法的特征还在于，测量所得多肽的IT50值。可以按以下实施例中所述的那样来测定IT50值。任选地，之后可以是对于在例如至少60℃、至少62℃等温度下表现出期望的IT50值的多肽的选择步骤。因此，在该具体实施方式中，本方法适于确定出表现出纤维二糖水解酶活性和升高的IT50值的多肽，即，具有纤维二糖水解酶活性的热稳定性多肽。
[0149] 本发明还提供用于制备具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：
[0150] a.提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽包含与SEQ ID NO：2的催化结构域（SEQ ID NO：5）具有至少54%序列一致性的氨基酸序列（例如优选为，至少60%、至少62%、至少64%、至少66%、至少68%、或至少70%，其中至少68%或至少70%为最优选的实施方式）；
[0151] b.确定该多肽的氨基酸，其相当于如在具有纤维二糖水解酶活性的多肽鉴定方法的步骤i中所确定的相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列被修饰的氨基酸；和
[0152] c.通过定点突变进行在步骤b中所确定出的氨基酸修饰，以制备在步骤a中提供的多肽的突变多肽。
[0153] 在一个实施方式中，优选地，在具有纤维二糖水解酶活性的多肽的制备方法的步骤a中提供的多肽是来源于里氏木霉的野生型纤维二糖水解酶。
[0154] 本发明还提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其可通过根据本发明的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的制备方法而获得。
[0155] 此外，本发明提供包含本发明的多肽和/或其变异体以及一种或多种纤维素酶的组合物，其中纤维素酶为，例如一种或多种内切葡聚糖酶和/或一种或多种β-葡糖苷酶和/或一种或多种其他纤维二糖水解酶和/或一种或多种木聚糖酶。“纤维素酶”或“纤维素水解酶”被定义为能够水解纤维素物质或衍生物或包含纤维素聚合物的混合饲料的酶。这样的酶被称作具有“纤维素水解活性”，因此能够将这样的材料中的纤维素分子水解成更小的寡或单糖。纤维素水解酶包括纤维素酶和半纤维素酶，特别是包括纤维二糖水解酶（CBH）、内切葡聚糖酶（EG）和β-葡糖苷酶（BGL）。
[0156] 本发明还提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其中多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少80%、优选至少95%、更优选至少98%、甚至更优选至少99%和最优选99.6%的氨基酸序列。具体地，优选这样的多肽为如下的多肽，其中SEQ ID NO：5所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失进行修饰：Q1、Q2、G4、A6、T7、A8、N10、P12、T15、A21、G23、S24、T26、T27、Q28、N29、G30、A31、V32、N37、W40、V41、G46、Y47、T48、N49、C50、T52、N54、D57、T59、Y60、D64、E65、A68、Q69、A72、V84、S86、S89、S90、K92、S99、Q109、D110、D111、I116、F117、K118、L119、L120、D129、V130、G139、A145、M146、V152、K154、Y155、N157、N158、K159、K163、G167、Q172、F179、I180、D181、E183、E187、G188、Q190、S192、S193、N194、I200、D202、H203、D211、V212、A221、P224、D228、T229、G231、T233、M234、S236、T243、Y244、S245、N246、D247、G251、F260、G266、K275、I276、I277、T280、L290、D293、G294、T295、T297、T299、S301、K304、F306、N310、S311、V313、I314、N318、D320、I321、T325、N327、T335、A340、F341、D343、T344、D345、D346、Q349、H350、A354、K355、A358、Q361、Q362、G363、M364、V367、D373、Y374、A375、A376、P386、T387、D390、T392、T393、P394、T400、P402、T403、D404、D410、N417、S418、T421、Y422，和/或通过在位置G151、K159之后进行一个或多个插入而被修饰。
[0157] 在优选实施方式中，具有纤维二糖水解酶活性且含有与SEQ ID NO：5具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的多肽包括一个或多个修饰过的SEQ ID NO：5所定义序列中的氨基酸残基。因此，在SEQ ID NO：5中给出的多肽可以，作为示例，修饰如下：Q1L、G4、A6G/V、T15S、Q28Q/R、W40R、D64N、E65K/V、A72V、S86T、K92K/R、V130I/V、V152A/E、Y155C、K159E、D181N、E183V/K、N194C/R/Y/D/K/I/L/G/Q/S/V、D202Y/N/G、P224L、T243I/R/Y/A/F/Q/P/D/V/W/L/M、Y244F/H、I277V、K304R、N310D、S311G/N、N318Y、D320V/E/N、T335I、T344M、D346G/A/E/V、Q349R/K、A358E、Y374C/P/R/H/S/A、A375D/N/Y/R/Q/L/V/E/G/T/M、T392C/D/K、T393A、D410G、Y422F。
[0158] 更优选地，具有纤维二糖水解酶活性的多肽包含下表3所示的一个或多个经修饰的SEQ ID NO：5所定义序列中的氨基酸残基。如上所述，对于SEQ ID NO：2的具体修饰，两个或更多个这样的具体修饰可以相互组合，例如优选地，两个或更多个更优选或最优选修饰可以相互组合，且特别优选地，两个或更多个根据表3的最优选修饰可以相互组合。
[0159] 表3：对于SEQ ID NO：5的突变
[0160]
[0161]
[0162]
[0163]
[0164] 特别优选如上定义的多肽，还具有以下特征：包含对SEQ ID NO：5的修饰，其为在以下表3a中给出的具体修饰。这些多肽各自定义SEQ ID NO：5中给出的多肽的突变形式。
[0165] 表3a：关于SEQ ID NO：5的具体突变
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181] 此外，本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其包含与SEQ ID NO：12具有至少85%、优选至少95%、更优选至少98%、甚至更优选至少99%、且最优选100%序列一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：12所定义序列中的一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失而进行修饰：Q1、S2、P12、T15、S21、G23、T26、Q28、T29、G30、V32、N37、W40、T48、C50、N54、L60、E65、K69、V84、S90、D114、E119、F120、T121、L122、L123、D132、V133、G142、S148、M149、V155、Y158、N161、T162、K166、G170、Q175、F182、I183、G191、I203、D214、I215、A224、T231、G234、I237、S248、G254、W263、G269、L282、T285、G298、Y303、N307、G308、T310、E317、L318、S322、N324、G340、S341、D345、S357、M360、V363、D369、A372、P382、S388、T389、P390、T399、S400、Q406、N413、F423、P425、I426、G427、T429、P432、G435、N436、P437、G439、N441、R442、T444、T445、T446、T447、R449、P450、A451、T452、T453、S456、S457、P458、G463、P464、S467、H459、C468、G470、G472、S474、P476、V478、C479、S481、G482、T484、V487、L488、N489、Y491、Y492、Q494、C495、L496。优选地，该多肽包含与SEQ ID NO：5具有至少54%、优选至少56%、更优选至少58%、特别优选至少60%、例如至少62%、特别地至少64%、例如至少66%、最优选至少68%序列一致性的氨基酸序列。还优选该多肽在上述实施方式内，其中多肽是热稳定性的，即具有例如上述的高IT50值，例如如前面描述的62℃或更高（对于更多实施方式，参见以上，与SEQ ID NO：5突变体的限定相关）。技术人员将意识到，SEQ ID NO：12与SEQ ID NO：5具有约68%的一致性。因此，来源于SEQ ID NO：12所定义多肽的多肽，例如通过一个氨基酸交换为另一个氨基酸例如Q1A而不同于SEQ ID NO：12定义的多肽，是与SEQ ID NO：5具有显著一致性的多肽，即，如上所述的至少66%或更高。因此，技术人员可以容易地意识到本发明的共同发明构思，特别是将本发明多肽的温度稳定性考虑在内时。
[0182] 在优选实施方式中，具有纤维二糖水解酶活性的多肽包含与SEQ ID NO：12具有至少85%序列一致性的氨基酸序列，其中该多肽具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列但其中一个或多个以下氨基酸残基通过替换或缺失而进行修饰：Q1、S2、P12、T15、S21、G23、T26、Q28、T29、G30、V32、N37、W40、T48、C50、N54、L60、E65、K69、V84、S90、D114、E119、F120、T121、L122、L123、D132、V133、G142、S148、M149、V155、Y158、N161、T162、K166、G170、Q175、F182、I183、G191、I203、D214、I215、A224、T231、G234、I237、S248、G254、W263、G269、L282、T285、G298、Y303、N307、G308、T310、E317、L318、S322、N324、G340、S341、D345、S357、M360、V363、D369、A372、P382、S388、T389、P390、T399、S400、Q406、N413、F423、P425、I426、G427、T429、P432、G435、N436、P437、G439、N441、R442、T444、T445、T446、T447、R449、P450、A451、T452、T453、S456、S457、P458、G463、P464、S467、H459、C468、G470、G472、S474、P476、V478、C479、S481、G482、T484、V487、L488、N489、Y491、Y492、Q494、C495、L496。
[0183]
[0184]
[0185] 本发明的另一方面涉及本发明的分离多肽及其变异体在纤维素材料的完全或部分水解中的应用。纤维素材料可以是天然的、处理过的或人造的。本文中的“纤维素材料”被定义为所有纯的、不纯的、混合的、化合的（blended）或其他方式构成的材料，且其含有至少一部分的至少7个连续亚基的β-1-4-连接的D-葡糖基聚合物。纤维素材料的突出实例是所有含纤维素的植物材料类木材（软和硬）、秸秆、谷物、象草、hey、叶、棉、和从这些加工而来的材料或来自于这些加工过程的废物流。本文中用在酶反应中的纤维素材料也指纤维素底物。
[0186] 纤维素材料的水解可以是在酵母细胞中制备纤维二糖水解酶之后连续的工序或与制备同时的工序（合并的生物工序）。因为很多酵母有将所释放的糖（C6或C5）发酵为乙醇或其他感兴趣的代谢物的能力，纤维素水解酶在酵母中的表达尤其令人感兴趣。
[0187] 因此，本发明的其他实施方式涉及表达根据本发明的多肽或其变异体的全细胞用于处理纤维素材料中的应用。
[0188] 在具体的实施方式中，本发明公开了本发明的多肽及其变异体或组合物在纤维素材料优选木质纤维素生物质的酶降解、和/或纺织品加工和/或作为洗剂成分和/或作为食品或饲料组合物的成分中的用途。
[0189] 实施例
[0190] 实施例1：巴氏毕赤酵母表达质粒的制备
[0191] 通过组装由巴氏毕赤酵母磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子、酿酒酵母SPα（交配因子α信号肽）、多克隆位点（MCS）和3’-GAP-终止子序列构成的表达盒来制备用于在转化的巴氏毕赤酵母宿主中组成性表达蛋白的表达质粒。出于选择的目的，分别在EM7或TEF启动子的控制下使用卡那霉素抗性基因以在细菌或酵母中进行选择。得到的质粒载体被称为pV1（图1）和pV2（可选的MCS）。基本按Waterham,H.R.,Digan,M.E.,Koutz,P.J.,Lair,S.V.,Cregg,J.M.(1997).Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter.Gene,186,37-44and Cregg,J.M.:Pichia Protocols in Methods in Molecular Biology,Second Edition,Humana Press,Totowa New Jersey 2007所描述的进行转化和表达培养。
[0192] 实施例2：构建用于CBHI序列的巴氏毕赤酵母表达构建体（construct）
[0193] 使用表4给出的寡核苷酸对和模板（通过基因合成而得到的）来扩增绿色木霉（CBH-f）、灰腐质霉（CBH-d）、嗜热子囊菌（CBH-e）、埃默森篮状菌（CBH-b）的CBHI基因，以及里氏木霉CBHI的纤维素结合域与埃默森篮状菌CBHI的融合体（CBH-a）或与灰腐质霉CBHI的融合体（CBH-g）。使用从SeqID No.5和11产生的PCR片段，通过重叠延伸PCR来产生编码SeqID No.2的融合基因。Phusion DNA聚合酶（Finnzymes）被用于扩增PCR。
[0194] 表4：用于扩增CBH-a、CBH-b、CBH-d、CBH-e、CBH-f和CBH-g的引物和模板[0195]
[0196]
[0197] 在电泳之后，使用 SV PCR和凝胶纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化出期望长度的PCR片段。DNA片段的浓度在分光光度计上测量，在2.5mM dATP的存在下，于
22.5℃用9U的T4-DNA聚合酶处理0.2pmol的片段37.5min，将经T4-DNA-聚合酶/dTTP处理的SmaI-线性化pV1质粒DNA与处理后的片段一起进行退火，并在之后转化到化学感受态大肠杆菌Top10细胞中。从所述过程不同的是，通过对pV2引入SphI和SalI位点来克隆出利用表格11栏的引物对而产生的编码灰腐质霉融合蛋白片段的产物。通过对分离出的质粒DNA进行测序来控制转化株。
22.5℃用9U的T4-DNA聚合酶处理0.2pmol的片段37.5min，将经T4-DNA-聚合酶/dTTP处理的SmaI-线性化pV1质粒DNA与处理后的片段一起进行退火，并在之后转化到化学感受态大肠杆菌Top10细胞中。从所述过程不同的是，通过对pV2引入SphI和SalI位点来克隆出利用表格11栏的引物对而产生的编码灰腐质霉融合蛋白片段的产物。通过对分离出的质粒DNA进行测序来控制转化株。
[0198] 实施例3：CBHI基因在巴氏毕赤酵母中的表达
[0199] 将实施例2的质粒转化到电感受态巴氏毕赤酵母CBS 7435细胞中且转化株在YPD培养基中接种培养，含有200mg/l，于250rpm的旋转振荡器中于27℃培育5天。通过在Sorvall Avant离心机中以5000×g下离心30分钟来分离培养物上清液。在截留大小（cut-off size）为10kDa的离心柱中浓缩上清液。通过SDS-PAGE（Laemmli等人）来分析浓缩上清液的蛋白谱，并且用胶态的考马斯亮蓝染色剂对凝胶进行染色。通过在50mM乙酸钠缓冲液（pH 5）中将上清液与2mM的对硝基苯基-β-D-乳糖苷溶液或200μM的4-甲基-伞形酮基-β-D-乳糖苷（4-methyl-umbelliferyl-β-D-lactoside）溶液一起培育1小时，以确定酶活性。通过添加相等体积的1M碳酸钠溶液来停止反应，并通过测量405nm下的吸光度或在360nm/450nm激发/发射的荧光的来确定所释放的对硝基苯基或4-甲基伞形酮。
[0200] 实施例4：埃默森篮状菌CBHI-里氏木霉CBHII-CBD融合序列在巴氏毕赤酵母中的基因组整合和表达
[0201] 表5
[0202]
[0203]
[0204] 使用（实施例2中）表4所示的寡核苷酸对和合成模板，通过2步重叠延伸PCR来产生融合基因的DNA片段。通过缓慢地将温度从75℃降低到4℃，使经T4-DNA聚合酶处理过的全长片段与线性的pV3载体片段进行退火。pV3质粒包含交配因子α信号肽与多克隆位点的融合，其位于巴氏毕赤酵母AOXI启动子的下游。将退火溶液转化到化学感受态大肠杆菌中得到转化株，通过它们的Teocine抗性来进行筛选，通过限制性酶切分析和测序来检测是否包含所预期的构建质粒。用SacI将pV3-CBH-a质粒制备物线性化，并将约1μg的线性DNA片段转化到巴氏毕赤酵母的电感受态细胞中。从YPD-Zeocine平板挑出94个转化株，之后通过在500μl的96孔板上于含有1%甲醇的BMMY培养基中进行培养来检测其表达，其中每24小时补给一次0.5%甲醇，持续5天（350rpm/27℃；振幅为2.5cm的加湿的回旋式振荡器）。基于4-MUL检测上清液的活性，选择具有高表达水平的克隆，并在相同条件下进行再次评测。
[0205] 在Infors Multifors生物反应器中发酵，选择产生最高酶浓度的菌株。选择YPD-Zeocin（100g/l）预培养液以在由磷酸盐缓冲液、硫酸镁和氯化镁、微量元素/生物素和甘油组成的矿物培养基中进行接种，其中使用氨水或磷酸进行pH校准。在批量甘油（2%）的代谢后，在将补给变为甲醇以转换为AOXI启动子的诱导条件之前，保持1天的额外甘油补给。在该条件下保持发酵5天。通过在5000×g下离心30分钟，以从发酵液中分离细胞。使用Bradford试剂和BSA标准物（Biorad）来分析上清液中的全蛋白。进行SDS-PAGE/，使用考马斯亮蓝染色来分析SDS-PAGE上的蛋白谱。
[0206] 实施例5：里氏木霉表达载体构建体
[0207] 基本如 等人（1997）所述，将SbfI/SwaI消化过的pSCMB100质粒DNA转化7
到里氏木霉SCF41中。将10μg的线性DNA用于10 原生质体的转化。通过在覆盖有琼脂的Mandel's Andreotti培养基板上培养原生质体，完成对转化株的选择，其中培养基中含有潮霉素作为选择剂（100mg/l）。通过在孢子形成培养基板上的传代和在潮霉素培养基中的孢子再选择来进一步纯化转化株。从再生长的菌丝中，分离基因组DNA并通过PCR证实替换事件。对被证实是真替换的菌株的转化株进一步检测重组体蛋白的分泌。
到里氏木霉SCF41中。将10μg的线性DNA用于10 原生质体的转化。通过在覆盖有琼脂的Mandel's Andreotti培养基板上培养原生质体，完成对转化株的选择，其中培养基中含有潮霉素作为选择剂（100mg/l）。通过在孢子形成培养基板上的传代和在潮霉素培养基中的孢子再选择来进一步纯化转化株。从再生长的菌丝中，分离基因组DNA并通过PCR证实替换事件。对被证实是真替换的菌株的转化株进一步检测重组体蛋白的分泌。
[0208] 实施例6：具有6×His标签的埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合（CBH-ah）融合体在里氏木霉中的表达
[0209] 具有6×His标签的埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合体的重组子CBHI替换菌株在里氏木霉Q6A（ATCC 13631）中的表达，通过在含有40ml矿物培养基的摇瓶培养于300ml烧瓶中于30℃/250rpm培养6天而完成，其中矿物培养基包含2%的Avicel。通过离心收集上清液并通过SDS-PAGE和Bradford蛋白检测来进一步分析。
[0210] 实施例7：筛选热稳定性变异体
[0211] 在用于PCR扩增的Taq-DNA聚合酶反应混合物中应用含锰缓冲剂和不平衡的dNTP浓缩物通过易错PCR来产生埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合（具有
6×His标签）基因的随机突变库，过程基本如Craig和Joyce所述（R.Craig Cadwell and G.F.Joyce,1995.Mutagenic PCR,in PCR Primer:a laboratory manual,ed.
C.W.Dieffenbach and G.S.Dveksler,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,ME,583-589）。选择野生型融合基因（SeqID.NO.17）或其突变体作为模板。使用SphI和HindIII内切酶和T4-DNA-连接酶将突变的PCR片段克隆到pPKGMe质粒中。
6×His标签）基因的随机突变库，过程基本如Craig和Joyce所述（R.Craig Cadwell and G.F.Joyce,1995.Mutagenic PCR,in PCR Primer:a laboratory manual,ed.
C.W.Dieffenbach and G.S.Dveksler,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,ME,583-589）。选择野生型融合基因（SeqID.NO.17）或其突变体作为模板。使用SphI和HindIII内切酶和T4-DNA-连接酶将突变的PCR片段克隆到pPKGMe质粒中。
[0212] 将埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合（具有6×His标签）基因变异体的库分布在1536孔板中，其中孔占据数（well occupation number）接近于1。在体积为
4μl的YPG-G418培养基中表达酶7天。对于变异体特性的评估，将2μl的培养上清液样品转移到含有磨碎秸秆、乙酸盐缓冲液和β-葡糖苷酶的悬浮液的板上。密封反应板在设定的温度下培育48小时后，在GOX和HRP的存在下使用Amplex red，通过分析荧光水平来确定葡萄糖的浓度。将最佳表现的突变体进行再接种和再评估。收集被证实的CBH-ah突变体的质粒，使用寡核苷酸α-f（5'TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'）和oli740（5'-TCAGCTATTTCACATACAAATCG-3′）来进行测序。
4μl的YPG-G418培养基中表达酶7天。对于变异体特性的评估，将2μl的培养上清液样品转移到含有磨碎秸秆、乙酸盐缓冲液和β-葡糖苷酶的悬浮液的板上。密封反应板在设定的温度下培育48小时后，在GOX和HRP的存在下使用Amplex red，通过分析荧光水平来确定葡萄糖的浓度。将最佳表现的突变体进行再接种和再评估。收集被证实的CBH-ah突变体的质粒，使用寡核苷酸α-f（5'TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'）和oli740（5'-TCAGCTATTTCACATACAAATCG-3′）来进行测序。
[0213] 实施例8：使用4-甲基伞形酮基-β-D-乳糖苷（4-MUL）确定不同温度下的底物转化能力以示出CBH-ah-变异体的热稳定性
[0214] 为精确比较热稳定性，将含有所分泌的纤维二糖水解酶变异体的培养上清液在乙酸钠缓冲液（50mM，pH 5）中稀释十倍，并在Eppendorff梯度热循环仪的温度梯度下将90μl的200μM 4-MUL（在缓冲液中）与10μl样品一起培育。对12个反应混合物应用从
55℃到75℃的20℃温度梯度，每个样品1小时。在将100μl的1M碳酸钠溶液添加到各个反应并且在Tecan Infinite M200平板读取器中测量360nm/454nm下的荧光强度后，可记录温度曲线。为比较热稳定性，将值归一化为用于最大和最小荧光计数的1和0之间（图
7）。
55℃到75℃的20℃温度梯度，每个样品1小时。在将100μl的1M碳酸钠溶液添加到各个反应并且在Tecan Infinite M200平板读取器中测量360nm/454nm下的荧光强度后，可记录温度曲线。为比较热稳定性，将值归一化为用于最大和最小荧光计数的1和0之间（图
7）。
[0215] 表6：具有改善的IT50值的SeqID NO.18的突变体列表
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231] 实施例9：埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合体（具有6×His标签）的变异体的表征
[0232] 将80mL发酵液浓缩到约1mL的最终体积。在确定蛋白浓度后（Bradford试剂，Biorad，德国，标准物是德国Sigma-Aldrich的BSA），用Ni-NTA Spin试剂盒（Qiagen，德国）来纯化1.2mg蛋白。接下来通过在预处理（酸预处理）过的麦秆中进行水解反应来检测该纯化的CBH1部分。将12.5mg（干重）的经预处理的麦秆与0.0125mg的纯化CBH1、以及相对于每mg的CBH1为40CBU的Novo188（Novozymes，丹麦）进行混合。加入1.50mM乙酸钠（Sigma-Aldrich，德国）直至500μL。在50℃~65℃的温度范围内保持检测48小时，并通过HPLC分析来确定温度依赖的葡萄糖含量。
[0233] 实施例10：用里氏木霉中表达的Seq.ID NO：2变异蛋白来水解秸秆
[0234] 如实施例5所述，通过用相应序列与CBHI信号肽的融合来替代原始CBHI阅读框，从里氏木霉中表达所选的纤维二糖水解酶序列（表7）。将突变蛋白的样品从培养上清液中分离出来，并通过Ni-NTA亲和色谱进行纯化。通过在非限定量的β-葡糖苷酶的存在下将蛋白（E）与经酸预处理的秸秆底物（S）（在反应中，2.5%的干物质含量，E/S=0.1%w/w）于50℃~75℃的温度下培育48小时，并随后通过HPLC来确定所释放的葡萄糖浓度而完成蛋白的表征。结果显示在表7中。选取60℃下48小时后的葡萄糖释放作为性能的指征，发现与野生型蛋白相比，葡萄糖释放显著增加。在表7中，给出了仍然达到最大葡萄糖收率的50%的温度。
[0235] 表7：木霉表达的纤维二糖水解酶对于秸秆的表现
[0236]
[0237]
[0238]
[0239] 实施例11：具有改善的热稳定性的Seq.ID NO：5变异体的性能
[0240] 按照根据筛选出的具有更优表现的Seq.ID：2突变体所推断的，使用PCR技术将所选的突变转移到Seq.ID NO：5骨架中。将从巴氏毕赤酵母中表达出的蛋白从培养上清液中取出，并通过实施例8中给出的步骤来测试它们的底物转化能力。在表格中，给出了计算出的针对4-MUL底物的IT50值。在这些条件下，发现没有CBD的蛋白比融合蛋白具有略高的稳定性。结果显示在表8中。
[0241] 表8：SEQ.ID NO：5和SEQ.ID NO：2突变的IT50值比较
[0242]
[0243]
[0244] 实施例12：不同纤维素结合域对IT50值的影响
[0245] 为评价CBD的可交换性，通过OE-PCR将稳定的Seq.ID NO：5突变（Q1L、G4C、Q28R、E65V、A72C、D181N、E183M、P224L、S311G、D320I、D346E、Q349K、T393V、Y422F）与一系列不同来源的纤维二糖水解酶中的纤维素结合域以及接头域进行连接。将得到的编码序列（SEQ.ID NO:21、23、25、27和29）克隆到巴氏毕赤酵母表达载体中，以用于根据SEQ.ID NO:20、22、24、26和28的相应融合蛋白的表达。如上所述评估变异体的IT50值，并列在表9中。观察到不同的CBD模块对稳定性仅有小影响。
[0246] 表9：具有接头序列的CBD与稳定和不稳定的Seq.ID.NO:5变异体的不同融合的性能比较
[0247]
[0248] 表10：序列列表（概览）
[0249]
[0250]
[0251]
[0252] SEQID.NO.01
[0253] cagcaggccggcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccacccagaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgaaacctgcgcccagaactgtgcgctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcgacggcgaggccaacgtcgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactccgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacagcaacgtcattccgcagcccaactcggacatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgacctactcgaacattaagtttggtccgatcggtagcacaggtaatccttcaggtggtaatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacactacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactgtttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctataatgataa
[0254] CBH-a（成熟）的编码序列
[0255] SEQID.NO.02
[0256] QQAGTATAENHPPLTWQECTAPGSCTTQNGAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDETCAQNCALDGADYEGTYGVTSSGSSLKLNFVTGSNVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFDVDVSNLPCGLNGALYFVAMDADGGVSKYPNNKAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFIDGEANVEGWQPSSNNANTGIGDHGSCCAEMDVWEANSISNAVTPHPCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTLSEIKRFYIQNSNVIPQPNSDISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDDFSQHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYAAQMLWLDSDYPTDADPTTPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTYSNIKFGPIGSTGNPSGGNPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
[0257] CBH-a的成熟序列
[0258] SEQID.NO.03
[0259] atgtatcggaagttggccgtcatctcggccttcttggccacagctcgtgctcagcaggccggcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccacccagaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgaaacctgcgcccagaactgtgcgctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcgacggcgaggccaacgtcgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactccgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacagcaacgtcattccgcagcccaactcggacatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgacctactcgaacattaagtttggtccgatcggtagcacaggtaatccttcaggtggtaatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacactacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactgtttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacatcatcaccaccacCattaa
[0260] CBH-a与里氏木霉CBHI信号肽的融合的编码序列
[0261] SEQID.NO.04
[0262] GSTGNPSGGNPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
[0263] 里氏木霉CBHI纤维素结合域和接头序列
[0264] SEQID.NO.05
[0265] QQAGTATAENHPPLTWQECTAPGSCTTQNGAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDETCAQNCALDGADYEGTYGVTSSGSSLKLNFVTGSNVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFDVDVSNLPCGLNGALYFVAMDADGGVSKYPNNKAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFIDGEANVEGWQPSSNNANTGIGDHGSCCAEMDVWEANSISNAVTPHPCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTLSEIKRFYIQNSNVIPQPNSDISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDDFSQHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYAAQMLWLDSDYPTDADPTTPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTYSNIKFGPINSTFTAS
[0266] 埃默森篮状菌CBHI序列（CBH-b）
[0267] SEQID.NO.06
[0268] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcaccctctcagcaggccggcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccacccagaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgaaacctgcgcccagaactgtgcgctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagcttctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcgacggcgaggccaacgtcgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactccgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacagcaacgtcattccgcagcccaactcggacatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgacctactcgaacattaagtttggtccgatcaactcgaccttcaccgcttcgtgataa
[0269] 融合到α因子信号肽的埃默森篮状菌CBHI的编码序列
[0270] SEQID.NO.07
[0271] QQAGTITAENHPRMTWKRCSGPGNCQTVQGEVVIDANWRWLHNNGQNCYEGNKWTSQCSSATDCAQRCALDGANYQSTYGASTSGDSLTLKFVTKHEYGTNIGSRFYLMANQNKYQMFTLMNNEFAFDVDLSKVECGINSALYFVAMEEDGGMASYPSNRAGAKYGTGYCDAQCARDLKFIGGKANIEGWRPSTNDPNAGVGPMGACCAEIDVWESNAYAYAFTPHACGSKNRYHICETNNCGGTYSDDRFAGYCDANGCDYNPYRMGNKDFYGKGKTVDTNRKFTVVSRFERNRLSQFFVQDGRKIEVPPPTWPGLPNSADITPELCDAQFRVFDDRNRFAETGGFDALNEALTIPMVLVMSIWDDHHSNMLWLDSSYPPEKAGLPGGDRGPCPTTSGVPAEVEAQYPDAQVVWSNIRFGPIGSTVNV
[0272] 灰腐质霉CBHI（CBH-d）
[0273] SEQID.NO.08
[0274] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcaccctctcagcaggctggtactattactgctgagaaccacccaagaatgacctggaagagatgctctggtccaggaaactgtcagactgttcagggcgaggttgtgattgacgctaattggagatggttgcacaacaacggccagaactgttacgagggtaacaagtggacctctcagtgttcttctgctaccgactgtgctcagagatgtgctttggacggtgccaactaccagtctacctacggtgcttctacctctggtgactctctgaccctgaagttcgttaccaagcacgagtacggaaccaacatcggctctagattctacctgatggccaaccagaacaagtaccagatgttcaccctgatgaacaacgagttcgcctttgacgttgacctgtctaaggtggagtgcggtatcaactctgccctgtacttcgttgctatggaagaggacggtggaatggcttcttacccatctaacagagccggtgctaagtacggtactggttactgtgacgcccagtgtgctagagacctgaagttcatcggtggaaaggccaacattgagggttggagaccatctaccaacgacccaaacgctggtgttggtccaatgggagcttgttgtgccgagattgatgtgtgggagtctaacgcttacgcctacgcttttaccccacacgcttgcggttctaagaacagataccacatctgcgagaccaacaactgtggtggaacctactctgacgacagattcgctggatactgcgacgctaacggttgtgactacaacccatacagaatgggcaacaaggacttctacggcaagggaaagaccgttgacaccaacagaaagttcaccgtggtgtcgagattcgagagaaacagactgtcgcagttctttgtgcaggacggcagaaagattgaggtcccaccaccaacttggccaggattgccaaactctgccgacattaccccagagttgtgtgacgctcagttcagagtgttcgacgacagaaacagatttgctgagaccggtggttttgacgctttgaacgaggctctgaccattccaatggtgctggtgatgtctatttgggacgaccaccactctaacatgttgtggctggactcttcttacccaccagagaaggctggattgccaggtggtgacagaggaccatgtccaactacttcgggtgttccagctgaggttgaggctcagtacccagacgctcaggttgtgtggtcgaacatcagattcggcccaatcggttctaccgtgaacgtgtaa
[0275] 融合到α因子信号肽的灰腐质霉CBHI的编码序列
[0276] SEQID.NO.09
[0277] heagtvtaenhpsltwqqcssggscttqngkvvidanwrwvhttsgytncytgntwdtsicpddvtcaqncaldgadysgtygvttsgnalrlnfvtqssgknigsrlyllqddttyqifkllgqeftfdvdvsnlpcglngalyfvamdadgnlskypgnKagakygtgycdsqcprGlkfingqanvegwqpsandpnagvgnhgsscaemdvweansistavtphpcdtpgqtmcqgddcggtysstryagtcdtdgcdfnpyqpgnhsfygpgkivdtsskftvvtqfitddgtpsgtlteikrfyvqngkvipqsestisgvtgnsitteyctaqkaafdntgffthgglqkisqalaqgmvlvmslwddhaanmlwldstyptdadpdtpgvargtcpttsgvpadvesqnpnsyviysnikvgpinstftan
[0278] 嗜热子囊菌CBHI（CBH-e）
[0279] SEQID.NO.10
[0280] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcaccctctcacgaggccggtaccgtaaccgcagagaatcacccttccctgacctggcagcaatgctccagcggcggtagttgtaccacgcagaatggaaaagtcgttatcgatgcgaactggcgttgggtccataccacctctggatacaccaactgctacacgggcaatacgtgggacaccagtatctgtcccgacgacgtgacctgcgctcagaattgtgccttggatggagcggattacagtggcacctatggtgttacgaccagtggcaacgccctgagactgaactttgtcacccaaagctcagggaagaacattggctcgcgcctgtacctgctgcaggacgacaccacttatcagatcttcaagctgctgggtcaggagtttaccttcgatgtcgacgtctccaatctcccttgcgggctgaacggcgccctctactttgtggccatggacgccgacggcaatttgtccaaataccctggcaacaaggcaggcgctaagtatggcactggttactgcgactctcagtgccctcgggatctcaagttcatcaacggtcaggccaacgttgaaggctggcagccgtctgccaacgacccaaatgccggcgttggtaaccacggttcctcgtgcgctgagatggatgtctgggaagccaacagcatctctactgcggtgacgcctcacccatgcgacacccccggccagaccatgtgccagggagacgactgtggtggaacctactcctccactcgatatgctggtacctgcgacactgatggctgcgacttcaatccttaccagccaggcaaccactcgttctacggccccgggaagatcgtcgacactagctccaaattcaccgtcgtcacccagttcatcaccgacgacgggacaccctccggcaccctgacggagatcaaacgcttctacgtccagaacggcaaggtgatcccccagtcggagtcgacgatcagcggcgtcaccggcaactcaatcaccaccgagtattgcacggcccagaaggcagccttcgacaacaccggcttcttcacgcacggcgggcttcagaagatcagtcaggctctggctcagggcatggtcctcgtcatgagcctgtgggacgatcacgccgccaacatgctctggctggacagcacctacccgactgatgcggacccggacacccctggcgtcgcgcgcggtacctgccccacgacctccggcgtcccggccgacgtggagtcgcagaaccccaattcatatgttatctactccaacatcaaggtcggacccatcaactcgaccttcaccgccaactaa
[0281] 融合到α因子信号肽的嗜热子囊菌CBHI的编码序列
[0282] SEQID.NO.11
[0283] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttaga tttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcaccctcttcagcttgtacactgcaatccgagactcatccacctttaacgtggcaaaagtgtagttctggcggaacttgtactcaacagactggtagtgtcgtgatagatgctaactggagatggacacatgcaacgaactcctcaactaactgctacgatggtaacacctggtcttctacattgtgtcctgacaacgaaacctgcgctaagaactgttgtcttgatggagcagcttacgcaagtacatatggtgtgactacctctggtaacagcctttccattggttttgtaacccagtcggctcagaagaatgttggtgctagattgtacctgatggcttcagacaccacataccaggagtttaccttgttgggaaacgagttctctttcgacgtagatgtgtctcagctaccatgtggattgaatggagccttgtactttgtctcaatggatgcagacggaggtgtttcaaagtaccctactaacacagctggtgctaagtatggaactggatactgcgattctcaatgcccaagagacctgaagttcatcaacggacaagctaacgttgaaggttgggaaccttctagcaacaacgcaaacactggaattggtggtcatggttcttgctgttcagagatggacatttgggaagccaactccatcagtgaagctttgactccacatccatgcacaactgttgggcaagaaatttgcgaaggtgatggttgtggtggcacttactctgataacagatacggcggaacatgtgatccagatggatgtgattggaacccatacagactgggtaacacttcgttttacggaccaggttcttccttcactctagacactacgaagaagttgactgtggtcacccaatttgagacttctggtgccattaaccgatactacgtgcagaacggagttactttccaacagccaaacgctgaattgggtagttactcaggcaacgagcttaacgatgactactgcactgctgaagaagcagaatttggtggatcttccttttcggataagggtggattgacgcagttcaagaaagctacctctggtggaatggttctagtcatgagtctgtgggacgattactacgctaacatgctttggctggactctacttaccctacaaacgagacatcttctactcctggtgctgtaagaggtagctgttctacatcttctggagttccagcccaagttgagagtcaaagtccaaatgccaaggtcaccttctccaacatcaagttcggaccaattggtagcacaggtaatccttcaggtggtaatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacactacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactgtttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacaccatcatcatcatcattaatgataa
[0284] 里氏木霉CBHI（CBH-c）的编码序列，包含α因子信号肽和6×His标签
[0285] SEQID.NO.12
[0286] QSACTLQSETHPPLTWQKCSSGGTCTQQTGSVVIDANWRWTHATNSSTNCYDGNTWSSTLCPDNETCAKNCCLDGAAYASTYGVTTSGNSLSIGFVTQSAQKNVGARLYLMASDTTYQEFTLLGNEFSFDVDVSQLPCGLNGALYFVSMDADGGVSKYPTNTAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGQANVEGWEPSSNNANTGIGGHGSCCSEMDINEANSISEALTPHPCTTVGQEICEGDGCGGTYSDNRYGGTCDPDGCDWNPYRLGNTSFYGPGSSFTLDTTKKLTVVTQFETSGAINRYYVQNGVTFQQPNAELGSYSGNELNDDYCTAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKKATSGGMVLVMSLWDDYYANMLWLDSTYPTNETSSTPGAVRGSCSTSSGVPAQVESQSPNAKVTFSNIKFGPIGSTGNPSGGNPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
[0287] 里氏木霉CBHI（CBH-c）
[0288] SEQID.NO.13
[0289] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcaccctctcaatctgcttgcaccttgcagtctgaaactcacccaccattgacctggcagaagtgttcttctggcggtacttgtactcagcagaccggttctgttgttatcgacgccaactggagatggactcacgctaccaactcttctaccaactgctacgacggtaacacttggtcgtctaccttgtgtccagacaacgagacctgtgccaagaactgttgtttggacggtgctgcttacgcttctacctacggtgttaccacctctggtaactcgctgtctatcggtttcgttacccagtctgcccagaaaaatgttggtgccagactgtacttgatggcttctgacaccacctaccaagagtttaccctgctgggtaacgagttctctttcgacgtggacgtttctcaactgccatgtggactgaacggtgccctgtacttcgtttctatggacgctgacggtggtgtttctaagtacccaaccaacaccgctggtgctaaatacggaaccggttactgcgattctcagtgcccaagagacctgaagttcatcaacggacaggctaacgttgaaggatgggagccatcttctaacaacgccaacaccggtattggtggtcacggttcttgctgttctgagatggacatctgggaggccaactctatttctgaggctttgaccccacacccatgtactactgtgggtcaagagatctgtgagggtgatggttgtggtggtacttactcggacaacagatacggtggtacttgtgacccagacggttgtgattgggacccatacagactgggtaacacctctttctacggtccaggatcttcttttaccctggacaccaccaagaagttgaccgttgttacccagtttgagacctctggtgccatcaacagatactacgtgcagaacggtgttactttccagcagccaaacgctgaactgggatcttactctggtaacggactgaacgacgactactgtactgctgaggaagctgagttcggtggttcttctttctctgacaagggtggactgacccagtttaagaaggctacctctggcggaatggtgctggttatgtctttgtgggacgactactacgctaacatgctgtggcttgactctacctacccaactaacgagacctcttctaccccaggtgctgttagaggatcttgctctacctcttctggtgttccagctcaggttgagtctcagtctccaaacgccaaggtgaccttctctaacatcaagttcggtccaatcggttctactggtgacccatctggtggtaacccaccaggtggaaacccacctggtactaccactaccagaagaccagctaccaccactggttcttctccaggtccaacccaatctcactacggtcagtgtggtggtattggttactctggtccaaccgtttgtgcttctggaaccacctgtcaggttctgaacccatactactcgcagtgcctgtaa
[0290] 绿色木霉CBHI的编码序列，包含α因子信号肽
[0291] SEQID.NO.14
[0292] QSACTLQSETHPPLTWQKCSSGGTCTQQTGSVVIDANWRWTHATNSSTNCYDGNTWSSTLCPDNETCAKNCCLDGAAYASTYGVTTSGNSLSIGFVTQSAQKNVGARLYLMASDTTYQEFTLLGNEFSFDVDVSQLPCGLNGALYFVSMDADGGVSKYPTNTAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGQANVEGWEPSSNNANTGIGGHGSCCSEMDIWEANSISEALTPHPCTTVGQEICEGDGCGGTYSDNRYGGTCDPDGCDWDPYRLGNTSFYGPGSSFTLDTTKKLTVVTQFETSGAINRYYVQNGVTFQQPNAELGSYSGNGLNDDYCTAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKKATSGGMVLVMSLWDDYYANMLWLDSTYPTNETSSTPGAVRGSCSTSSGVPAQVESQSPNAKVTFSNIKFGPTGSTGDPSGGNPPGGNPPGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCL
[0293] 绿色木霉CBHI（CBH-f）
[0294] SEQID.NO.15
[0295] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcatgctcgcagcaggctggtacaattactgctgagaaccatccaagaatgacgtggaagagatgtagtggtccaggaaactgtcagactgttcagggtgaggtcgtgatagatgctaactggagatggttgcataacaacggccagaactgctacgagggtaacaagtggacctctcagtgttcttctgctaccgactgcgctcagagatgtgctcttgatggagcaaactaccagagtacatatggtgcttctacctctggtgacagccttaccctgaagtttgtaaccaagcacgagtacggaaccaatatcggttctagattctacctgatggctaaccagaacaagtaccagatgtttaccttgatgaacaacgagttcgccttcgacgtagatctgtctaaggtggagtgtggaatcaattctgccttgtactttgtcgctatggaagaggacggaggtatggcttcttacccttctaacagagctggtgctaagtatggaactggatactgcgatgcccaatgcgctagagacctgaagttcatcggtggaaaggctaacattgaaggttggagaccttctaccaacgacccaaacgctggagttggtccaatgggtgcttgctgtgccgagattgacgtgtgggaatctaacgcttacgcctacgcttttactccacatgcttgcggttctaagaacagataccacatttgcgaaaccaacaactgtggtggcacttactctgatgacagattcgctggatactgtgatgctaacggatgtgattacaacccatacagaatgggtaacaaggacttttacggaaagggtaagactgttgacactaacagaaagttcactgtggtctcgagatttgagagaaacagactgtcgcagttctttgtgcaggacggaagaaagattgaggtcccaccaccaacttggccaggattgccaaactctgccgacattaccccagagttgtgcgacgctcagttcagagtgtttgacgacagaaacagatttgctgagaccggtggatttgacgctttgaacgaggctctgaccattccaatggttctagtcatgagtatttgggacgatcaccactctaacatgctttggctggactcttcttaccctccagagaaggctggattgcctggtggtgacagaggtccatgtccaacaacttctggagttccagccgaggttgaggctcaatacccagacgcccaggtcgtgtggtccaacatcagattcggaccaattggaagcttaacaggtaatccttcaggtggtaatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacactacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactgtttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacaccatcatcatcatcattaa
[0296] 灰腐质霉CBHI-里氏木霉CBHI纤维素结合域融合蛋白的编码序列，包含α因子信号肽和6×His标签
[0297] SEQID.NO.16
[0298] qqagtitaenhprmtwkrcsgpgncqtvqgevvidanwrwlhnngqncyegnkwtsqcssatdcaqrcaldganyqstygastsgdsltlkfvtkheygtnigsrfylmanqnkyqmftlmnnefafdvdlskvecginsalyfvameedggmasypsnragakygtgycdaqcardlkfiggkaniegwrpstndpnagvgpmgaccaeidvwesnayayaftphacgsknryhicetnncggtysddrfagycdangcdynpyrmgnkdfygkgktvdtnrkftvvsrfernrlsqffvqdgrkievppptwpglpnsaditpelcdaqfrvfddrnrfaetggfdalnealtipmvlvmsiwddhhsnmlwldssyppekaglpggdrgpcpttsgvpaeveaqypdaqvvwsnirfgpigsltgnpsggnppggnrgttttrrpatttgsspgptqshygqcggigysgptvcasgttcqvlnpyysqclasahhhhhh
[0299] 灰腐质霉CBHI-里氏木霉CBHI纤维素结合域融合蛋白，包含6×His标签（CBH-g）[0300] SEQID.NO.17
[0301] atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaacgtgaggcggaagcatgctcgcagcaggccggcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccacccagaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgaaacctgcgcccagaactgtgcgctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcgacggcgaggccaacgtcgagggctggcagccgtcttcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactccgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacagcaacgtcattccgcagcccaactcggacatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgacttctctcagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacgacccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagcccccaactcctacgtgacctactcgaacattaagtttggtccgatcggtagcacaggtaatccttcaggtggtaatcctccaggtggaaacagaggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcacactacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactgtttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacatcatcaccaccaccattaatgataa
[0302] 包含α因子信号肽和6×His标签的埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合的成熟序列
[0303] SEQID.NO.18
[0304] QQAGTATAENHPPLTWQECTAPGSCTTQNGAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDETCAQNCALDGADYEGTYGVTSgGSSLKLNFVTGSNVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFDVDVSNLPCGLNGALYFVAMDADGGVSKYPNNKAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFIDGEANVEGWQPSSNNANTGIGDHGSCCAEMDVWEANSISNAVTPHPCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTLSEIKRFYIQNSNVIPQPNSDISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDDFSQHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYAAQMLWLDSDYPTDADPTTPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTYSNIKFGPIGSTGNPSGGNPPGGNRGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVCASGTTCQVLNPYYSQCLASAHHHHHH
[0305] 具有6×His标签的埃默森篮状菌CBHI/里氏木霉-CBD融合的成熟序列（CBH-ah）[0306] SEQID.NO 19
[0307] atggccagcgatctggcacagcaggctggtacaat tactgctgagaaccatccaagaatgacgtggaagagatgtagtggtccaggaaactgtcagactgttcagggtgaggtcgtgatagatgctaactggagatggttgcataacaacggccagaactgctacgagggtaacaagtggacctctcagtgtt cttctgctaccgactgcgctcagagatgtgctcttgatggagcaaactaccagagtacatatggtgcttctacctctggtgacagccttaccctgaagtttgtaaccaagcacgagtacggaaccaatatcggttctagattctacctgatggctaaccagaacaagtaccagatgtttaccttgatgaacaacgagttcgccttcgacgtagatctgtctaaggtggagtgtggaatcaattctgccttgtactttgtcgctatggaagaggacggaggtatggcttcttacccttctaacagagctggtgctaagtatggaactggatactgcgatgcccaatgcgctagagacctgaagttcatcggtggaaaggctaacattgaaggttggagaccttctaccaacgacccaaacgctggagttggtccaatgggtgcttgctgtgccgagattgacgtgtgggaatctaacgcttacgcctacgcttttactccacatgcttgcggttctaagaacagataccacatttgcgaaaccaacaactgtggtggcacttactctgatgacagattcgctggatactgtgatgctaacggatgtgattacaacccatacagaatgggtaacaaggacttttacggaaagggtaagactgttgacactaacagaaagttcactgtggtctcgagatttgagagaaacagactgtcgcagttctttgtgcaggacggaagaaagattgaggtcccaccaccaacttggccaggattgccaaactctgccgacattaccccagagttgtgcgacgctcagttcagagtgtttgacgacagaaacagatttgctgagaccggtggatttgacgctttgaacgaggctctgaccattccaatggttctagtcatgagtatttgggacgatcaccactctaacatgctttggctggactcttcttaccctccagagaaggctggattgcctggtggtgacagaggtccatgtccaacaacttctggagttccagccgaggttgaggctcaatacccagacgcccaggtcgtgtggtccaacatcagattcggaccaattggtagcacagtgaatgtggcttctgcacaccatcatcatcatcattga
[0308] 具有信号序列的灰腐质霉的可选编码序列
[0309] SEQID NO 42[P]
[0310] LQACTATAENHPPLTWQECTAPGSCTTRNGAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDVTCAQNCCLDGADYEGTYGVTSSGSSLKLNFVTGSNVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFDVDVSNLPCGLNGALYFVAMDADGGVSKYPNNKAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGMANVEGWQPSSNNANTGIGDHGSCCAEMDVWEANSISNAVTLHPCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKI IDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTLSEIKRFYIQNGNVIPQPNSIISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDEFSKHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYAAQMLWLDSDYPTDADPTVPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTFSNIKFGPINSTVPGLDGSTPSNPTATVAPPTSTTTSVRSSTTQISTPTSQPGGCTTQKWGQCGGIGYTGCTNCVAGTTCTELNPWYSQCLASAHHHHHH
[0311] 含6×His标签的具有嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I CBD的埃默森篮状菌CBHI突变
[0312] SEQID NO 43[N]
[0313] ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccaccaggaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactctgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgaattctctaagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacattaagtttggtccgatcaactcgaccgtccctggcctcgacggcagcacccccagcaacccgaccgccaccgttgctcctcccacttctaccaccaccagcgtgagaagcagcactactcagatttccaccccgactagccagcccggcggctgcaccacccagaagtggggccagtgcggtggtatcggctacaccggctgcactaactgcgttgctggcactacctgcactgagctcaacccctggtacagccagtgcctggcttctgctcatcatcaccatcaccac
[0314] 含6×His标签的具有嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I CBD的埃默森篮状菌CBHI突变的编码序列
[0315] SEQID NO 44[P]
[0316] LQACTATAENHPPLTWQECTAPGSCTTRNGAVVLDANWRWVHDVNGYTNCYTGNTWDPTYCPDDVTCAQNCCLDGADYEGTYGVTSSGSSLKLNFVTGSNVGSRLYLLQDDSTYQIFKLLNREFSFDVDVSNLPCGLNGALYFVAMDADGGVSKYPNNKAGAKYGTGYCDSQCPRDLKFINGMANVEGWQPSSNNANTGIGDHGSCCAEMDVWEANSISNAVTLHPCDTPGQTMCSGDDCGGTYSNDRYAGTCDPDGCDFNPYRMGNTSFYGPGKIIDTTKPFTVVTQFLTDDGTDTGTLSEIKRFYIQNGNVIPQPNSIISGVTGNSITTEFCTAQKQAFGDTDEFSKHGGLAKMGAAMQQGMVLVMSLWDDYAAQMLWLDSDYPTDADPTVPGIARGTCPTDSGVPSDVESQSPNSYVTFSNIKFGPINSTYTGTVSSSSVSSSHSSTSTSSSHSSSSTPPTQPTGVTVPQWGQCGGIGYTGSTTCASPYTCHVLNPYYSQCYASAHHHHHH
[0317] 含6×His标签的具有黄孢原毛平革菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变
[0318] SEQID NO 45[N]
[0319] ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccaccaggaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactctgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgaattctctaagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacattaagtttggtccgatcaactcgacctacactggaactgtttcttcatcctccgtttcatcttctcactcctccacttctacttcatcttcccattcctcatcttccactccaccaactcaaccaactggtgttactgttccacaatggggacaatgtggtggtattggttacactggttccactacttgtgcttccccatacacttgtcacgttttgaacccatactactcccaatgttacgcttctgctcatcatcaccatcaccactaa
[0320] 含6×His标签的具有黄孢原毛平革菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变的编码序列
[0321] SEQID NO 46[P]
[0322] lqactataenhppltwqectapgscttrngavvldanwrwvhdvngytncytgntwdptycpddvtcaqnccldgadyegtygvtssgsslklnfvtgsnvgsrlyllqddstyqifkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadggvskypnnkagakygtgycdsqcprdlkfingmanvegwqpssnantgigdhgsccaemdvweansisnavtlhpcdtpgqtmcsgddcggtysndryagtcdpdgcdfnpyrmgntsfygpgkiidttkpftvvtqfltddgtdtgtlseikrfyiqngnvipqpnsiisgvtgnsittefctaqkqafgdtdefskhgglakmgaamqqgmvlvmslwddyaaqmlwldsdyptdadptvpgiargtcptdsgvpsdvesqspnGyvtfsnikfgpinstftggttsssstttttskststsssskttttsvtttttssgssgtgaahwaqcggngwtgpttcvspytctkqndwysgclasahhhhhh
[0323] 含6×His标签的具有微紫青霉菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变[0324] SEQID NO 47[N]
[0325] ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccaccaggaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactctgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgaattctctaagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacattaagtttggtccgatcaactcgaccttcactggtggtactacttcatcctcctccactactactacaacttccaagtccacttccacttcatcttcatccaagactacaactacttccgttacaactactactacttcctctggttcttctggtactggtgctgctcattgggctcaatgtggtggtaatggatggactggtccaactacttgtgtttccccatacacttgtactaagcagaacgactggtactctcaatgtttggcttctgctcatcatcaccatcaccac
[0326] 含6×His标签的具有微紫青霉菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变的编码序列
[0327] SEQID NO 48[P]
[0328] lqactataenhppltwqectapgscttrngavvldanwrwvhdvngytncytgntwdptycpddvtcaqnccldgadyegtygvtssgsslklnfvtgsnvgsrlyllqddstyqifkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadggvskypnnkagakygtgycdsqcprdlkfingmanvegwqpssnnantgigdhgsccaemdvweansisnavtlhpcdtpgqtmcsgddcggtysndryagtcdpdgcdfnpyrmgntsfygpgkiidttkpftvvtqfltddgtdtgtlseikrfyiqngnvipqpnsiisgvtgnsittefctaqkqafgdtdefskhgglakmgaamqqgmvlvmslwddyaaqmlwldsdyptdadptvpgiargtcptdsgvpsdvesqspnsyvtfsnikfgpinstftgtgstspsspagpvssstsvasqptqpaqgtvaqwgqcggtgftgptvcaspftchvvnpyysqcyasahhhhhh
[0329] 含6×His标签的具有白囊耙齿菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变[0330] SEQID NO 49[N]
[0331] ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccaccaggaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactctgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgaattctctaagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacattaagtttggtccgatcaactcgaccttcactggtactggttctacttctccatcttctccagctggtccagtttcttcttccacttccgttgcttcccaaccaactcaaccagctcaaggtactgttgctcaatggggacaatgtggtggtactggtttcactggtccaactgtttgtgcttccccattcacttgtcacgttgttaacccatactactcccagtgttacgcttctgctcatcatcatcaccatcac[0332] 含6×His标签的具有白囊耙齿菌纤维二糖水解酶CBD的埃默森篮状菌CBHI突变的编码序列
[0333] SEQID NO 50[P]
[0334] lqactataenhppltwqectapgscttrngavvldanwrwvhdvngytncytgntwdptycpddvtcaqnccldgadyegtygvtssgsslklnfvtgsnvgsrlyllqddstyqifkllnrefsfdvdvsnlpcglngalyfvamdadggvskypnnkagakygtgycdsqcprdlkfingmanvegwqpssnnantgigdhgsccaemdvweansisnavtlhpcdtpgqtmcsgddcggtysndryagtcdpdgcdfnpyrmgntsfygpgkiidttkpftvvtqfltddgtdtgtlseikrfyiqngnvipqpnsiisgvtgnsittefctaqkqafgdtdefskhgglakmgaamqqgmvlvmslwddyaaqmlwldsdyptdadptvpgiargtcptdsgvpsdvesqspnsyvtfsnikfgpigstgnpsggnpsggdggttttrrpatttgsspgptqslygqcggigysgpticasgttcqvlnpyysqclasahhhhhh
[0335] 含6×His标签的具有突变里氏木霉CBD的埃默森篮状菌CBHI突变
[0336] SEQID NO 51[N]
[0337] ctgcaggcctgcacggcgacggcagagaaccacccgcccctgacatggcaggaatgcaccgcccctgggagctgcaccaccaggaacggggcggtcgttcttgatgcgaactggcgttgggtgcacgatgtgaacggatacaccaactgctacacgggcaatacctgggaccccacgtactgccctgacgacgtaacctgcgcccagaactgttgcctggacggcgcggattacgagggcacctacggcgtgacttcgtcgggcagctccttgaaactcaatttcgtcaccgggtcgaacgtcggatcccgtctctacctgctgcaggacgactcgacctatcagatcttcaagctcctgaaccgcgagttcagctttgacgtcgatgtctccaatcttccgtgcggattgaacggcgctctgtactttgtcgccatggacgccgacggcggcgtgtccaagtacccgaacaacaaggctggtgccaagtacggaaccgggtattgcgactcccaatgcccacgggacctcaagttcatcaacggcatggccaacgtcgagggctggcagccgtcatcgaacaacgccaacaccggaattggcgaccacggctcctgctgtgcggagatggatgtctgggaagcaaacagcatctccaatgcggtcactctgcacccgtgcgacacgccaggccagacgatgtgctctggagatgactgcggtggcacatactctaacgatcgctacgcgggaacctgcgatcctgacggctgtgacttcaacccttaccgcatgggcaacacttctttctacgggcctggcaagatcatcgataccaccaagcccttcactgtcgtgacgcagttcctcactgatgatggtacggatactggaactctcagcgagatcaagcgcttctacatccagaacggcaacgtcattccgcagcccaactcgatcatcagtggcgtgaccggcaactcgatcacgacggagttctgcactgctcagaagcaggcctttggcgacacggacgaattctctaagcacggtggcctggccaagatgggagcggccatgcagcagggtatggtcctggtgatgagtttgtgggacgactacgccgcgcagatgctgtggttggattccgactacccgacggatgcggaccccacggtccctggtattgcccgtggaacgtgtccgacggactcgggcgtcccatcggatgtcgagtcgcagagccccaactcctacgtgaccttctcgaacattaagtttggtccgatcggtagcacaggtaatccttcaggtggtaatccttcaggtggagacggcggaacaacgacaactagaagaccagctactacaactggttcaagtccaggtccaactcaatcactatacggtcaatgtggtggtataggttactctggtcccactatttgtgcttctggtactacttgccaagttctgaacccttactactcacagtgtctagcttctgcacatcatcaccaccaccat
[0338] 含6×His标签的具有突变里氏木霉CBD的埃默森篮状菌CBHI突变的编码序列
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