技术领域
[0001] 本
发明涉及一种嵌段聚合物固定化酶的制备方法。
背景技术
[0002] 游离酶的催化活性易受到pH、
温度、
有机溶剂、重
金属离子等因素的影响。而酶的固定化技术能有效提高酶在极端条件下的
稳定性和催化活性,同时易于回收再利用。固定化酶的材料和方法有很多种,其中
纳米材料固定化酶因其高载酶量受到了研究者的青睐,尤其是一些具有多孔结构、大
比表面积的载体材料有利于提高固定化酶的载酶量,并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散以提高固定化酶的
生物活性和催化效率。
[0003] 传统粉状或颗粒状纳米材料存在分离和回收的难题,同时排放到环境中会造成污染,而具有空间连续性的
纳米纤维膜作为固定化酶的载体具有较大的比表面积和高孔隙率,并且可以通过纺丝条件进行调控等优点,越来越引起人们的重视。近年来,利用电纺纳米纤维固定化酶成为一个新兴研究热点。CN200610052953.8通过
静电纺丝和
碱处理的方法,可以得到一种在
水溶液中具有稳定形态结构的壳聚糖纳米纤维膜。CN200410019230.9将壳聚糖与聚乙烯醇的混合溶液静电纺丝制备超细纤维复合膜。Huang 等人利用
胶原蛋白等生物大分子对聚(丙烯腈-
丙烯酸)纳米纤维膜进行表面改性,并用于脂肪酶的固定化(Huang XJ, Yu AG, Jiang J, Pan C, Qian JW, Xu ZK, J. Mol. Catal. B:Enzym. 2009,57:250-256)。然而上述纳米纤维膜载体及其固定化酶存在制备工艺比较繁琐、机械强度不够、很难大规模生产和应用等缺点。
[0004] 所以有必要研制一种制备工艺简单、具有一定机械强度、有工业化生产潜
力的纳米纤维膜固定化酶,同时提高固定化酶的载酶量、催化稳定性和重复使用性。
发明内容
[0005] 针对一些固定化酶载体的载酶量和催化效率低、固定化酶过程繁琐和载体材料难以回收等问题,本发明的目的在于提供一种具有高比表面积、高
空隙率、具有一定机械强度和制备工艺简单的嵌段聚合物固定化酶的制备方法。
[0006] 本发明提出的嵌段聚合物固定化酶的制备方法,具体步骤如下:(1)制备聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜
将聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃组成的溶液中,配成重量百分比为5%~15%的溶液,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在
电压为15~25千伏,喷丝头溶液流量为0.5~1.5毫升/小时、接收距离为10~20厘米的条件下进行电纺丝,获得纤维直径为100~500nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜,将纳米纤维膜在
真空干燥箱中在30℃~50℃的条件下干燥5小时~10小时,即得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜;其中:N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃的
质量比为1:1~1:4;
(2)将步骤(1)所得的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入 1%~10%的聚乙二胺水溶液中,密封后于70℃的恒温条件下震荡1~3小时,震荡速度为30~120转/分钟;
取出处理后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜并用pH为7.0的
磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余的聚乙二胺;将胺化之后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入1%~5%的戊二
醛水溶液中,密封后于25℃恒温条件下震荡1~2小时,震荡速度为30~120转/分钟;
(3)将步骤(2)所得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余戊二醛;将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为0.1~2毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中,密封后于4℃的恒温条件下震荡1~5小时,震荡速度为30~120转/分钟;从溶液中取出纳米纤维膜,用去离子水反复冲洗3~5次,即可得到聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化酶;将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,于4℃下储存备用。
[0007] 本发明中,所述聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯的重均分子量为8~12万,数均分子量为2~5万。
[0008] 本发明中,步骤(3)中所述酶磷酸盐缓冲溶液中所用的酶为:漆酶、过
氧化物酶、蛋白酶、
淀粉酶或脂肪酶中的一种。
[0009] 本发明的有益效果在于:(1)聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜的制备及其酶固定化工艺简单。
[0010] (2)聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜具有高比表面积和高空隙率,有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化效率。
[0011] (3)聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜作为酶的固定化载体,易于从反应体系中回收,可以重复使用,极大地提高酶的利用率和降低生产成本。
[0012] (4)聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜具有良好的
生物相容性,可以为其表面固定化酶蛋白提供良好的微环境,有效的提高固定化酶的生物活性和稳定性。
附图说明
[0013] 图1、
实施例2所得到的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化过氧化氢酶的扫描电镜图;图2、实施例4所得到的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶的扫描电镜图。
具体实施方式
[0014] 以下实施实例对本发明做更详细的描述,但所述例不构成对本发明的限制。
[0015] 实施例11、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于质量比为1:1的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶液中配成重量百分比为5%的溶液,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压为18千伏,喷丝头溶液流量为0.5毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行电纺丝,获得纤维直径为200nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜,将纳米纤维膜在真空干燥箱中在30℃的条件下干燥5小时。
[0016] 2、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入4%的聚乙二胺水溶液中,密封后于70℃的恒温条件下震荡1小时,震荡的速度为50转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余的聚乙二胺;将胺化之后的纳米纤维膜浸入2%的戊二醛水溶液中,密封后于25℃恒温条件下震荡1小时,震荡速度为50转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余戊二醛;将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为0.5毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中,密封后于4℃的恒温条件下震荡3小时,震荡的速度为30转/分钟;从溶液中取出膜,用去离子水反复冲洗3次,即可得到过氧化氢酶固定化的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜;将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,于4℃下储存备用。
[0017] 实施例21、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于质量比为1:4的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶液中配成重量百分比为10%的溶液,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压为25千伏,喷丝头溶液流量为1.5毫升/小时、接收距离为20厘米的条件下进行电纺丝,获得纤维直径为300nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜,将纳米纤维膜在真空干燥箱中在50℃的条件下干燥10小时。
[0018] 2、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入8%的聚乙二胺水溶液中,密封后于70℃的恒温条件下震荡2小时,震荡的速度为80转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余的聚乙二胺;将胺化之后的纳米纤维膜浸入5%的戊二醛水溶液中,密封后于25℃恒温条件下震荡2小时,震荡速度为80转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余戊二醛;将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为1毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中,密封后于4℃的恒温条件下震荡5小时,震荡的速度为40转/分钟;从溶液中取出膜,用去离子水反复冲洗5次,即可得到过氧化氢酶固定化的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜;将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,于4℃下储存备用。
[0019] 从图1中扫描电镜的结果可以看出,上述得到的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化过氧化氢酶形貌和结构较好,纤维直径也比较的均匀。
[0020] 实施例31、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于质量比为1:2的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶液中配成重量百分比为8%的溶液,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压为15千伏,喷丝头溶液流量为0.8毫升/小时、接收距离为15厘米的条件下进行电纺丝,获得纤维直径为300nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜,将纳米纤维膜在真空干燥箱中在30℃的条件下干燥5小时。
[0021] 2、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入6%的聚乙二胺水溶液中,密封后于70℃的恒温条件下震荡1.5小时,震荡的速度为60转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余的聚乙二胺;将胺化之后的纳米纤维膜浸入4%的戊二醛水溶液中,密封后于25℃恒温条件下震荡1.5小时,震荡速度为60转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余戊二醛;将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为0.8毫克/毫升的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲溶液中,密封后于4℃的恒温条件下震荡2小时,震荡的速度为60转/分钟;从溶液中取出膜,用去离子水反复冲洗4次,即可得到辣根过氧化物酶固定化的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜;将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,于4℃下储存备用。
[0022] 实施例41、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于质量比为1:3的N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶液中配成重量百分比为12%的溶液,充分溶解后,注入到静电纺丝装置中,在电压为20千伏,喷丝头溶液流量为1.2毫升/小时、接收距离为20厘米的条件下进行电纺丝,获得纤维直径为500nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜,将纳米纤维膜在真空干燥箱中在50℃的条件下干燥10小时。
[0023] 2、将1克聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入10%的聚乙二胺水溶液中,密封后于70℃的恒温条件下震荡3小时,震荡的速度为120转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余的聚乙二胺;将胺化之后的纳米纤维膜浸入10%的戊二醛水溶液中,密封后于25℃恒温条件下震荡3小时,震荡速度为120转/分钟;取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗,以除去膜上残余戊二醛;将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为1.5毫克/毫升的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲溶液中,密封后于4℃的恒温条件下震荡4小时,震荡的速度为60转/分钟;从溶液中取出膜,用去离子水反复冲洗5次,即可得到辣根过氧化物酶固定化的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜;将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中,于4℃下储存备用。
[0024] 从图2中扫描电镜的结果可以看出,上述得到的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶的形貌和结构较好,纤维直径也比较的均匀。