[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA及其制备方法和应用。

[0002] 飞蝗是一种危害较大的农业害虫，分布范围极广并且迁移能力很强，破坏力大，因此对农业造成严重危害。目前常用于防控飞蝗的办法还是依靠化学防治，即化学杀虫剂。然而长期使用化学农药不止会使害虫产生抗药性降低防治效率，同时还会破坏生态环境，对其他非靶标生物造成危害。因此，迫切需要开发新型的害虫防治方法。

[0003] 2006年获诺贝尔奖的RNA干扰(RNAi)技术，是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默技术。该技术为基因功能、人类疾病治疗和作物害虫防治等方面的研究都开辟了新途径。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下特点：1、杀虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2、RNA在自然界极易降解，无残留；3、对环境无毒无害，相对安全。研究表明，RNA干扰技术可有效控制特定的农作物害虫，在害虫防治领域具有非常重要的应用前景。而实现基于该技术进行害虫防控的关键是筛选出对害虫高效致死的特异dsRNA。

[0004] 昆虫表皮主要化学成分是几丁质、蛋白质、酚类和脂类物质。昆虫表皮是作为一个双向的屏障行使作用，既可以防止昆虫体内水分的蒸发，还能够反向的防止外界病原微生物的入侵。而表皮脂类物质在这一过程中发挥着重要功能。此外，表皮脂类物质还可以作为信息素发挥作用，在昆虫发育生殖以及通讯等行为中起着重要作用。昆虫表皮脂类物质的合成涉及多种酶类的参与，如脂肪酸合成酶，其是昆虫表皮脂类合成通路中的关键酶之一，参与催化由乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成软脂酸的整个过程。目前已知的有关功能研究主要集中在其时空表达、滞育以及生殖方面的影响。此外，在模式生物线虫中发现沉默脂肪酸合成酶基因会影响表皮形成及其结构。因此，脂肪酸合成酶对于昆虫生存具有十分重要的意义。

[0005] 本发明针对上述问题提供了一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA及其制备方法和应用。

[0006] 为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：

[0007] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA，该dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

[0008] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA的制备方法，包括以下步骤：

[0009] a，基于果蝇和飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗脂肪酸合成酶基因进行搜索，经过序列分析，拼接及比对后，获得飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3序列，设计上游引物序列和下游引物序列，并合成；

[0010] b，选取生长健康，大小一致雌雄各半的五龄飞蝗若虫，将其表皮快速解剖下来，并提取RNA，将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此做为模板，结合设计飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的上下游引物，通过PCR扩增获得脂肪酸合成酶基因全长片段，将得到的产物进行纯化，克隆转化至大肠杆菌中，并测序，测序结果与转录组搜索结果比对，验证并获得该基因的核苷酸序列全长，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

[0011] c，基于飞蝗脂肪酸合成酶基因序列SEQ ID NO：1，设计dsRNA上下游引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，上下游引物均携带T7启动子序列；

[0012] d，以上述脂肪酸合成酶基因克隆载体大肠杆菌为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为上下游引物，进行PCR扩增，将扩增的PCR产物，纯化后转录合成dsRNA。

[0013] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA的应用，用于防治害虫。

[0014] 与现有技术相比本发明具有以下优点：

[0015] 1、本发明提供的飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA，可以显著抑制飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的表达，从而导致飞蝗蜕皮困难死亡或蜕皮后脱水死亡；

[0016] 2、本发明提供的飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA用于飞蝗害虫防治具有专一性和高效性，不存在害虫产生抗药性导致防治效率降低的情况，也不会破坏生态环境，不会对其它非靶标生物造成危害。附图说明

[0017] 图1为本发明实施例试验中五龄第1天的飞蝗若虫分别注射核苷酸序列为SEQ ID NO：2的dsLmFAS3和dsGFP，168h后对飞蝗脂肪酸延伸酶基因的转录影响的结果对照图；

[0018] 图2为本发明实施例试验中飞蝗若虫注射核苷酸序列为SEQ ID NO：2的dsRNA后对飞蝗发育影响的结果对照图；

[0019] 图3为本发明实施例试验中飞蝗若虫注射核苷酸序列为SEQ ID NO：2的dsRNA后对飞蝗表皮渗透性影响的结果对照图。

[0020] 为了进一步阐述本发明的技术方案，下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。

[0021] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA，该dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

[0022] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA的制备方法，包括以下步骤：

[0023] a，基于果蝇和飞蝗的转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗脂肪酸合成酶基因进行搜索，经过序列分析，拼接及比对后，获得飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3序列，采用primer premier5.0软件设计上游引物序列和下游引物序列，并送往生工生物工程(上海)有限公司合成；

[0024] b，选取生长健康，大小一致雌雄各半的五龄飞蝗若虫，在体式显微镜下将其表皮快速解剖下来，并冷冻于液氮中，3头一个生物学重复，设置四个生物学重复，依照TaKaRa公司Trizol试剂盒提取RNA，采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，以此做为模板，结合设计飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的上下游引物，通过PCR扩增获得脂肪酸合成酶基因全长片段，将得到的产物进行纯化，克隆转化至大肠杆菌中，并送往华大生物科技有限公司测序，测序结果与转录组搜索结果比对，验证并获得该基因的核苷酸序列全长，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

[0025] c，基于飞蝗脂肪酸合成酶基因序列SEQ ID NO：1，采用primerpremier5.0软件设计dsRNA上下游引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，上下游引物均携带T7启动子序列，所有引物均由上海生物工程有限公司合成；

[0026] d，以上述脂肪酸合成酶基因克隆载体大肠杆菌为模板，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为上下游引物，进行PCR扩增，将扩增的PCR产物，经Gel Extraction Kit(Sigma)试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)试剂盒说明体外转录合成dsRNA，以绿色荧光蛋白基因GFP为对照，合成dsGFP，使用NaNoDrop  2000(Thermo scientific)进行定量，使其终浓度达到2.5μg/μl，保存于-80℃超级低温冰箱备用。

[0027] 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS3的dsRNA的应用，用于防治害虫。

[0028] 飞蝗脂肪酸合成酶基因dsRNA致死飞蝗试验：

[0029] 1、飞蝗脂肪酸合成酶基因dsRNA注射

[0030] 选取生长健康、大小一致、雌雄各半30头五龄第1天若虫进行试验。将合成的dsLmFAS3使用25μl规格微量注射器顺着血流方法轻轻注射4μl进入若虫侧腹部的二、三腹节之间。同时选取30头若虫设立为对照组。注射相同体积和浓度的dsGFP至对照组体内。分别将注射后飞蝗置于30℃恒温生化培养箱中饲养(光照：黑暗时间＝14h:10h，温度30±2℃，湿度60％)，每天饲喂新鲜小麦幼苗和麦麸。

[0031] 2、飞蝗脂肪酸合成酶基因沉默检测

[0032] 各收集9头注射dsGFP和dsLmFAS3，168h后若虫虫体进行总RNA提取，并反转录成第一链cDNA，每组设置3个生物学重复，每个生物学重复3头若虫。采用Real-time PCR方法分别检测目的基因LmFAS3和管家基因Rpl-32的相对表达量，对其沉默效率进行计算。如图1所示，结果表明，与对照组比较，注射dsLmFAS3后，处理组脂肪酸延伸酶基因表达显著降低，其沉默效率达到94.2％。

[0033] 3、注射dsRNA后的表型观察

[0034] 如图2所示，五龄若虫注射dsRNA后，对照组在八天后全部成功蜕皮至成虫，且蜕皮后生长发育状况良好。而实验组注射dsLmFAS3后，有15头无法成功蜕皮直至死亡，同时有9头若虫可以成功蜕皮至成虫，但在蜕皮至成虫后会因为失水而死亡，两种表型死亡率达到80％。

[0035] 4、注射dsRNA后的伊红染色试验

[0036] 五龄若虫注射dsRNA后，选取刚蜕皮至成虫1h内的实验组以及相同数量同等时期的对照组，置于0.5％伊红溶液，于45℃水浴锅中加热30min，然后进行多次清洗，观察新表皮的着色情况。如图3所示，结果显示，与对照相比，实验组飞蝗体壁着色更为明显，表明其渗透性增强。

[0037] 以上显示和描述了本发明的主要特征和优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

[0038] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

[0039] 序列表

[0040] SEQ ID NO：1

[0041] gccgactctgcgtggtgccacaagacactcagctcgtggaaagtgctccaggccgctgactgctgcagaggacgactctacaacctgtcgacaccgtgttccaagacttgccacaatgaccaaaacttcaggcagctcagcggccctaccagacgtctatgcagaatttattcctgctggaaagaaactggcatcaccaccacctggtgaggagttggtcattagtggtatatcaggacgatttccaaagagtgttggaatgtatgagcttcaggacaatcttctgaacttacatgatctcataagtgatgttgacagtggctttcaaggttcatctaacataccacatcggttgggtaaaattccatgtgcacagaagtttgatgcttcattttttggagtggatgcaaacacagcttaccatgcagatccattaatgcgtttgcagatggaaactacctacgaggccattgtagatgcaggattccatccacattccttacgaaataaacgtgtagcagttattacaagtggcatatttagtgagtcagaggtggcagtttttaactatgagaacataggtaaaggactgatgtactgcaatcgtgcattacaagccggagtgattgcctactggcttggagtgactgggcctgtgtatgtagctgatacagcttgctcttcaagcatgtttgccctggatgctgcgtatcagtttatacgcactggcaagtgtgatgctgccattgtggcaggagctaatttgtgcctccacgagttcagcacagcacaatttgcaaatctcggtgttcttagtgtagatggtatttgtcgaagttttgatgatgcaggtaatggttatgtacgttctgaagtcactggaacaatctttgtccaaaaagcaaaagatgctcgtagaatgtatgccaagctaattcacatgcaaaccaactgtgatggatacaaaaaagaaggtatcacttatccttcaggtcttatgcaggaattactgttacgccgattctatgaagagtctggagttgatttacaaagtgtaaaatatattgaagctcatggaactggaacaaaggtaggtgatccggaagaactacgagcactagacagagtattttgttctggacgaaaagatgactgcccaatacttataggatctgtgaagtcaaatttaggtcattcagaaccagtttctggaattgcatctcttgccaaggttatccttagtatggaatcaggattaataccagcaaatgccaattacaaaaaaccacgcagtggagcaaaatcactggaagaagggagattaaaggttgtagcagaacacacaccatttcctggaggtcctgttccagtaaattcttttggttttgggggctgcaactctcatacagttattgctccaaatcccaaggaaaaaataaataattgtattcgcaaagatggattgccaagattagttgcagtatcagggagaacatctgaggcagtgaattcaattcttagtcatgttgaagatatgagaaaagtggatgcagagtttgtgagcctactgcatgacgtgtatgccacaaacatacctggccatttgtaccgtggctatacagttgtaccagcagttttaggaagctgttgtaggacagtagagttgagtcctatggagaagaaatgttcagtacatatgatcttgacattgggagaaaacaagtgcaattcagctacagttggctctttaatgcagtttgatatatttgctgccacaatgaatgaatgctttcaggcattaatacttgaaggtgttgacttgttatatgctgcattttcaactgatggagatgagtgggctctccggaacagcgtcactactgctgtacagatttccctgctcagtcttctgacagcaattggtgtgaagatagatgttttcattggttcatgcccagcaaggacgtatgctgaaggaggctacacaattgaagaagctgttcgtgctgcctatgaactggatgttgaagagcgccatgactgcttgaaaggagcttcatatttttcaactatggacatgcagactggttactggcaaatccaggttgacgaagctgacaaagagaagacggcttttattacttctgacggcctctatgaatttaaagtaatgccatctggattatgtaatgctccagccacattcgaacgcatgatggacaatttgcttcgacaccttaagtggacgacgtgtctctgctatttagatgacattgtcgttttgtcgaaaacatttgaagaacatctgagtcgcctgtcaactgtgttgaagtgtgttcagactgcagaactgattactcatcttcagttcagtcttgcagcagtaggaatgcatacaccacacaactacattaaaagaaactatgaaggtttcagaactcaagtgaaagaaataattgtcctcgaaatatcaccagtcagcaagcttcctaattctcttaatatcctgagtaacagccgaaccttattgcagattcttggcagattgtacctctcacacgtggacttacatctcactgaactgtaccccaaagttcagtatcctgtaagtcgaggaacaaccatgctttcaccattcatcagatgggaacattcagaagactggtttttgacaacaggaaatagtagtgaggtaatggcaggagatcaagcttttactgtggatgtgaagatgttgcaaaagaaaaatcaatttttatttggacattccattgatgggagattcttgtatccagccacaggatacataataatggttcttcagggattctgtatgcgtaaaaatttggatatgtcaaagcacaaagttctttttgaaaatgtacgatttttgagagccactaacgtacccaaaactgcgtcagttgtttttgaagtgataagtagtgctggatctcatgaatttgaaattatggagggaggcagtttgattgttacgggcaagtttcagttgtgtgatgctcctatgttaagtgatggcttggagcttccaaaaccagctcctggtgttcccatggataaaaaagacatatacaaggagatgaaactgaggggctacaattataatggaattttccggagtttggttagtttggatccttcagcttcagtgggtcatatcgcatggcaggagaactggattgcctacatggacaatatgttgcaaataggcatcttccaacaggacactcgcaatctgtatgtcccagttcgaataaagagaatcgtggctgacttcagcaaacacacagaatgtattgccaagagtgatgaaacaggagctatacctatttacagctggaaagaaataaggctagtaagatcaggtggcatagaaatttatggcctgtatgcaagtccaatcccaaaacgccgtgtaatggcagaacctgtacttgagaactatggatttgttccttaccaagggcaaatcaatctgtctctcaaagaacttctgcgggtcagcgtccatgtggctttggagaacaatcctatggtaaagaaggtgaaaactgttgaagtgcctggagataattgcactgaatttttgtctactgaaattgcaagtatttttgcagatcttcctgtcatacaggcaaacctgacagttcttggggaaactccttcatcaaacccaccagaaggtatacagtttgagaaacatgacctgaataaagaacaaggctgtttgctggtactgggcactggcttggtatttggaaagaactctcaatatctgaaaaacgctgttgctgcactttctgacaatggcttcattatttccaaagaaacattaaatggtgatattagagaccttgaacagtctctaattgttgtaatgaactatgcaatatctgatggaaacgatcatctaatcgtaatgaaaaagggcaatccaaaaccagatatacaatttgtcaatgtgagtggaaatgactgtacttggctgccacggttaaaatccttggtccagaaaggccaaaacgaagttgtgctggtggcacaaggaaataataacagtggaatactaggtctgaccaattgcatacgcatggaaccaggaggaacatgcatcaggtgcttatttatcaaagatcataaagctccagcatttgatccaaaccttgaattttatcgaagtcagcttgctttggacctagcaatgaatgtgtatgagaaaggctgttggggaagttaccgacatcttcccctgaaaccccccaaaactgtgaagacagctcatgcattcaatgtagttaagaatattggagatttatcctcttctgtatggcaacaaggatatttagatccaacaagggatattaatgatgatggttttgcttttgtttattattctgctctcaacttccgtgatattatgacagcaactggtagactatcatatgatgtcgtgaacccagacagatgtacacaggattgtattcaaggtattgagttttctgggagagacaaaaatggcagacgtgttatgggtttggcatcaagagggtctatgtcaacaatgattgtaacaaacccaatcactgtatttccggtaccagacaattggacactggaagaagctgctacagtacccgcagtttattgtacagttatgttggccttaattagaggcggaggactacgtaaaggtcaatctgtattgatccatgctggcactggtggcattggacaagctgccatcaattactgttcgttccatggctgcgatattttcactactgttggaacaccacaaaagaaggaatttattctaaagaatttcccacaggtgcctgaatctcatattggtaactctcgagacacatcttttgaggaaatggtcatgagggaaactaagggccgtggagttgacgtggttttgaactctcttgcagaagaaaaacttcaggcatcagttcgatgcttggcaagaggag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[0042] SEQ ID NO：2

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[0044] SEQ ID NO：3

[0045] taatacgactcactatagggtcagcttgctttggacctag

[0046] SEQ ID NO：4

[0047] taatacgactcactatagggactgtacaataaactgcgggt。