[0001] 本公开的技术涉及细菌来源的发酵提取物，其增加脂连蛋白水平。所述发酵提取物由短芽孢杆菌(Bacillus pumilus)物种的菌株分泌。本发明还涉及含有所述发酵提取物的美容组合物或皮肤药物组合物。

[0002] 皮肤、粘膜、毛发和/或指甲构成生物体和其环境之间的物理屏障。皮肤是由两个组织组成：表皮和真皮。脂肪细胞存在于真皮下的更深层——皮下组织，其组织成小叶，由包含血管、神经和淋巴结的结缔组织间隔隔开。脂肪细胞的主要功能是在液泡中以甘油三酯形式储存脂肪。

[0003] 脂肪组织在全身脂肪酸内稳态的调节中起关键作用。在热量丰足期间，脂肪组织通过将游离脂肪酸(FFA)酯化成甘油而以甘油三酯的形式储存游离脂肪酸，并在能量短缺时将其释放回循环中。脂肪组织也可以作为能够分泌细胞因子的内分泌器官发挥作用，所述细胞因子命名为脂肪因子(adipokines)或脂肪组织来源的蛋白质。

[0004] 脂肪组织在身体不同部位的沉积和肌肉质量的减少随着年龄和缺乏足够的身体活动发生。经常运动带来脂肪堆积减少和肌肉耐力增加，这反过来又可以导致一些身体部位更结实以及更好的体态。据认为，运动的有益作用部分地由脂肪因子谱的变化(也就是，通过增加抗炎细胞因子(如脂连蛋白)水平)来介导[Golbidi S.和Laher I“.运动诱导的脂肪因子改变和代谢症状(Exercise Induced Adipokine Changes and the Metabolic Syndrome)”,J.Diabetes Res.,2014；DOI 2014:726861；Petersen A.M.和Pedersen B.K.,“运动的抗炎效应(The anti-inflammatory effect of exercise)”,J.Appl.Physiol.,2005,98(4),1154–1162；LaMonte M.J.等人“,体育活动和糖尿病预防(Physical activity and diabetes prevention)”,J.Appl.Physiol.,2005,99,1205–1213；Bruunsgaard H.,“体育活动和全身低水平炎症的调节(Physical activity and modulation of systemic low-level inflammation)”,J.Leukoc.Biol.,2005,78(4),819-835]。已经在基因表达、蛋白质配体和受体结合水平描述了运动的效果[Moldoveanu A.I.等人,“对体育活动和训练的细胞因子反应(The cytokine response to physical activity and training)”,Sports Med.,2001,31(2),115–144]。

[0005] 脂连蛋白(也称为AdipoQ,ACDC,Acrp30,apM-1,APM1,GBP28,ADPN和ADIPQTL1)是脂肪细胞分化过程中由脂肪组织分泌的细胞因子。人脂连蛋白由244个氨基酸组成，并具有特征性结构域结构和胶原蛋白样结构域和球状C1q样结构域，其在血液中以至少三种同聚复合体(即，三聚体、六聚体及更高级的多聚体)循环。血浆脂连蛋白水平与身体质量指数(BMI)和腹内脂肪呈反比，而且，通过有氧运动训练的方式可以升高血浆脂连蛋白水平[Golbidi S.and Laher I.“运动诱导的脂肪因子和代谢综合征(Exercise Induced Adipokine Changes and the Metabolic Syn-drome)”,J.Diabetes Res.,2014；DOI 2014:726861]。

[0006] 脂连蛋白通过两种受体，脂连蛋白受体1(AdipoR1)和脂连蛋白受体2(AdipoR2)，的激活，发挥其功能。在骨骼肌细胞中脂连蛋白结合AdipoR1，其通过磷酸化而激活5'AMP激活的蛋白激酶(AMPK)通路，启动一系列分子反应，最终刺激葡萄糖摄取、脂肪酸氧化、ATP产生和线粒体生物合成(biogenesis)[Kadowaki T.和Yamauchi T.“Adiponectin and adiponectin receptors”,Endocr.Rev.2005,26:439-451；Golbidi S.and Laher I.“Exercise Induced Adipokine Changes and the Metabolic Syndrome”,J.Diabetes Res.,2014,2014:726861]。此外，已经公开，用脂连蛋白处理人肌管可以诱导线粒体生物合成、棕榈酸氧化和柠檬酸合酶活性[Civitarese A.E.等人,”Role of adiponectin in human skeletal muscle bioenergetics.”Cell Metab.,2006,4(1):75-87]，由此诱导类似于通过体育运动可取得的肌纤维强度和张力增加。

[0007] 骨骼肌由形成肌肉纤维(肌纤维)的肌细胞组成。在被称为肌肉发生的过程中，肌纤维由发育的成肌细胞(一种胚胎祖先细胞)融合形成。有两种主要类型的肌纤维，区别在于其肌球蛋白重链(MyHC)同种型和其酶学能力。肌肉由不同类型的肌纤维混合组成。I型纤维(慢缩)由于高的线粒体(表达氧化脂肪酸的酶)含量而具有有氧活性，高氧化能力，富含肌红蛋白，红色外观，表达蛋白质标记物肌球蛋白重链7(MyH7)——其是I型纤维特异性的[Couturier A.等人“Carnitine supplementation to obese Zucker rats prevents obesity-induced type II to type I muscle fiber transition and favors an oxidative phenotype of skeletal muscle”Nutrition&Metabolism,2013,10:48]。II型纤维(快缩)由于低线粒体含量而具有无氧活性、低氧化能力、依赖糖酵解代谢生成ATP(三磷酸腺苷)。I型和II型纤维的比例取决于肌肉的活动：I型纤维主要参与有氧运动，相比之下，Ⅱ型纤维主要参与无氧运动，即I型纤维的数量越多，肌肉耐力越高。具有高骨骼肌毛细血管密度的个体和具有高比例I型纤维的个体表现出高浓度的循环脂连蛋白[Ingelsson E.等人,“Associations of Serum Adiponectin with Skeletal Muscle Morphology and Insulin Sensitivity”,J Clin Endocrinol Metab,2009,94(3):953–957]。因此，预期循环脂连蛋白的水平增加可以增加I型纤维的比例和肌肉耐力。

[0008] 此外，已经报道，脂连蛋白通过促进角质形成细胞的增殖和迁移，诱导或加速皮肤创伤的愈合过程[EP1651161 B1][Shibata S.等人“Adiponectin regulates cutaneous wound healing by promoting keratinocyte proliferation and migration via the ERK signaling pathway”,J.Immunol.,2012,189(6):3231-41]。还报道了，脂连蛋白增加胶原蛋白的合成和上调透明质酸合酶2基因的表达，从而增加透明质酸的合成[Ezure T.等人“. Adiponectin and leptin up-regulate extracellular matrix production by dermal fibroblasts”,Biofactors.2007,31(3-4):229-36；Yamane T.等人“.Adiponectin promotes hyaluronan synthesis along with increases in hyaluronan synthase 2 transcripts through an AMP-activated protein kinase/peroxisome proliferator-activated receptor-α-dependent pathway in human dermal fibroblasts”,Biochem.and Biophys.Res.Comm.2011,415,235-238]。

[0009] 令人惊奇地，本发明的发明人发现，来自短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物可以增加脂连蛋白的水平、肌肉中的线粒体活性、肌肉中的ATP水平和肌肉耐力。

[0010] 发明概述

[0011] 本公开提供，通过短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物增加脂肪细胞中的脂连蛋白水平和肌肉中的线粒体活性的技术方案。

[0012] 本发明涉及短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物、发酵提取物用于增加脂连蛋白水平的用途、和包含发酵提取物的美容组合物或皮肤药物组合物。令人惊奇的是，本发明的发明人还发现，上述发酵提取物增加肌肉中线粒体的活性，增加肌肉耐力。

[0013] 定义

[0014] 为了便于本发明的理解，给出在本发明上下文中使用的一些术语和表述的含义。

[0015] 如本文所使用的，术语“包含”，其与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含性的或开放式的，不排除另外的、未描述的要素或方法步骤。然而，在文中，每次述及“包括”，都意在涵盖“基本上由......组成”和“由......组成”的备选实施方案，其中“由......组成”排除没有指明的任何要素或步骤，“基本上由......组成”允许包括未描述的、不实质上影响所论及的组合物或方法的必要或基本特征和新颖性特征的其它要素或步骤。

[0016] 在本发明的上下文中，“皮肤”应理解为从最上层或角质层到最下层或皮下组织的皮肤层，且含最上层和最下层。这些层由不同类型的细胞，如角质形成细胞、成纤维细胞、黑素细胞和/或脂肪细胞及其它组成。在本发明的上下文中，术语“皮肤”包括头皮。

[0017] 如在本说明书上下文中使用的，术语“治疗/处理(treatment)”，当其不伴随限定词“非治疗性美容”时，是指施用根据本发明的化合物以减轻或消除疾病或病患、或减少或消除与这种疾病或病患相关的一种或多种症状。术语“治疗/处理(treatment)”还涵盖减轻或消除疾病或病患的生理后果的能力。

[0018] 当术语“治疗/处理(treatment)”伴随限定词“非治疗性美容”时，其是指将化合物应用到皮肤，目的是改善皮肤的美容质量，例如但不限于，其水合度、弹性、紧致度、光泽、色调或质地，等等。在本发明中，术语“护理”指维持皮肤的质量，它包括身体和/或毛发卫生。这些皮肤质量可以通过皮肤的美容处理和/或护理，在健康受试者以及存在皮肤疾病和/或病患的受试者中，得到改善和维持，所述皮肤疾病和/或病患例如但不限于，皮肤上的溃疡和损伤、银屑病、皮炎、痤疮或红斑痤疮，等等。

[0019] 如在本发明中使用的，术语“防止”，是指本发明的化合物在疾病或病症出现之前防止、延迟或阻碍其出现或发展的能力。

[0020] 在本发明的上下文中，术语“老化”是指，随年龄(时间老化(chronoaging))或通过暴露于阳光(光老化)或环境因素如烟草烟雾，冷、热或风的极端气候条件，化学污染物质或污染物，皮肤经历的变化，包括所有外部可见和/或通过触摸可感知的变化，如但不限于，皮肤上出现的纹路，如皱纹、细纹、沟纹、不平整或粗糙、毛孔增大、失去弹性、失去紧致度、失去光滑度、失去从变形恢复的能力、皮肤松弛，如脸颊下垂，等等。

[0021] 因此，本发明的第一方面涉及短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物，其用于增加脂连蛋白的水平、增加肌肉中的线粒体活性、增加肌肉耐力、刺激伤口愈合和/或皮肤的上皮再形成。在一个实施方案中，肌肉中线粒体活性的增加是肌肉中的ATP水平和/或柠檬酸合酶活性的增加。在其它实施方案中，脂连蛋白的水平是循环脂连蛋白的水平。在其它实施方案中，肌肉耐力的增加是有氧耐力的增加。在另一个实施方案中，有氧耐力的增加是肌肉中I型纤维比例的增加。

[0022] 在另一方面，本发明涉及短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物的用途，用于非治疗性美容增加脂肪细胞中的脂连蛋白水平，非治疗性美容刺激皮肤中胶原蛋白合成和/或透明质酸合成，非治疗性美容处理和/或防止皮肤老化，非治疗性美容处理和/或防止皮肤皱纹，非治疗性美容处理使皮肤紧致，和/或非治疗性美容防止皮肤紧致度的丧失。

[0023] 在一个实施方案中，皮肤治疗/处理通过局部或经皮应用进行。

[0024] 在其它实施方案中，肌肉中线粒体活性的增加、肌肉耐力的增加、伤口愈合的刺激和/或皮肤的上皮再形成，是脂连蛋白水平增加的结果。

[0025] 在另一实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株是保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株。该菌株已在2014年3月11日保藏在比利时微生物协调保藏中心(BCCM)/微生物细菌实验室(Laboratorium voor  )(LMG)(BCCM/LMG)(根特大学,K.L.莱德汉克大街(Ledeganckstraat)35,9000根特，比利时)，该保藏中心是根据1977年4月28日关于国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约被法定认可的用于该目的的保藏机构。

[0026] 在其它实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物含有分子量小于7000Da、或小于5000Da的肽类和糖类物质。在另一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物不包含仲胺。在另一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物不包含酚类化合物。

[0027] 在另一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物在色谱分析——高效液相色谱(HPLC)中具有9到20分钟之间、10到15分钟之间的停留时间，其中使用色谱柱TSKGel G2000SWXL，5m， 7.8mm x 30mm(TOSOH Bioscience)和具有0.1M pH＝6.70+0.1M磷酸缓冲液+0.1M硫酸钠的水作为洗脱剂。

[0028] 在另一个实施方案中，通过短芽孢杆菌物种菌株的发酵获得提取物，其中在合适的培养基中在常规搅拌和通气下进行发酵以合成和向培养基中分泌所述产物，并之后纯化。生产本发明提取物的发酵可以在搅拌和通气的培养基中、在温度10℃-40℃之间或20℃-35℃之间进行，培养基的pH值在6.5-9之间，或约7.0，如有必要，在发酵过程调整pH。发酵的持续时间为12至120小时，或24至72小时。

[0029] 在短芽孢杆菌物种菌株的发酵中，培养基包含氮和/或碳源，如酵母提取物、麦芽提取物和/或蛋白胨，这些组分之每一种的浓度为0.1至20g/L或0.5至10g/L。在短芽孢杆菌物种菌株的发酵中培养基还可以含有海盐，浓度为5至40g/L之间，或25至35g/L之间。

[0030] 在另一个实施方案中，在短芽孢杆菌物种菌株的发酵中培养基包含外源性糖，如但不限于，半乳糖、葡萄糖、甘露糖、苦杏仁苷、纤维二糖、麦芽糖、淀粉、糖原、乳糖、其混合物，和/或含有这些糖的混合物的提取物可用作发酵培养基中额外的碳源。在一个实施方案中，外源供给0.5至40g/L或5至25g/L葡萄糖到发酵培养基中。在其它实施方案中，所述发酵培养基不含额外的氮或碳源。

[0031] 在另一个实施方案中，除了海盐外，还向短芽孢杆菌物种菌株的发酵培养基中提供其它的无机盐。这些盐可选自提供离子Na+,K+,NH4+,Ca2+,Mg2+,PO43-,SO42-,Cl-,F-,I-,CO32-,NO3-，柠檬酸根，或微量元素如Cu,Mn,Mo,Fe,Sr,B,Br,Si,Al,Li,和Zn的盐。

[0032] 在其它实施方案中，发酵提取物的分离和纯化方法通过本领域技术人员已知的方法进行，如离心和过滤。在一个实施方案中，离心和过滤步骤涉及，分离短芽孢杆菌物种菌株与存在发酵提取物的上清液。在一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株是保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株。

[0033] 本发明的另一方面涉及美容或皮肤药物组合物，特征在于其包括美容上或皮肤药物上有效量的短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物和至少一种美容上和/或皮肤药物上可接受的赋形剂和/或成分。在一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株是保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株。所述组合物可以通过本领域技术人员已知的常规方法制备[“Harry’s Cosmeticology”,Seventh edition,(1982),Wilkinson J.B.,Moore R.J.,ed.Longman House,Essex,GB]。

[0034] 在待施用的本发明组合物中，短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物的美容上或皮肤药物上的有效量，以及其剂量，将取决于多种因素，包括年龄、患者的状况、待治疗/处理和/或护理的状况或病症的性质或严重程度、施用的途径和频率、以及待使用的发酵提取物的性质。

[0035] “美容上或皮肤药物上有效量”应理解为，成分的无毒但足以提供期望效果的量。例如，短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物可以以美容或皮肤药物浓度使用以达到期望的效果；即，相对于组合物的总重量，0.0000000001％(以重量计)和20％(以重量计)之间；
0.00000001％(以重量计)和10％(以重量计)之间，0.000001％(以重量计)和5％(以重量计)之间，或0.0001％(以重量计)和5％(以重量计)之间。

[0036] 在一个实施方案中，本发明的发酵提取物也可掺入到美容或皮肤药物递送系统和/或持续释放系统中。

[0037] 术语“递送系统”涉及与本发明的发酵提取物一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂、媒介物或添加剂。这些美容或皮肤药物载体可以是液体，例如水、油或表面活性剂，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如但不限于，花生油，大豆油，矿物油，芝麻油，蓖麻油，聚山梨醇酸酯(polysorbate)，脱水山梨醇酯，醚硫酸盐，硫酸盐，甜菜碱，糖苷，麦芽糖苷，脂肪醇，壬基酚聚氧乙烯醚，泊洛沙姆，聚氧乙烯，聚乙二醇，葡萄糖，甘油，毛地黄皂苷和类似物。本领域技术人员知道在施用本发明化合物的不同递送系统中可以使用的稀释剂、助剂或赋形剂。

[0038] 术语“持续释放”在常规意义上使用，涉及化合物的递送系统，其在一段时间内提供这种化合物的逐步释放。在一个实施方案中，逐步释放导致在一段时间内相对恒定的化合物释放水平。

[0039] 递送或持续释放系统的实例包括，但不限于，脂质体，混合脂质体，油质体(oleosome)，类脂质体(niosome)，醇质体(ethosome)，毫米颗粒(milliparticle)，微粒，纳米颗粒和固体脂质纳米颗粒，纳米结构的脂质支持物，海绵，环糊精，囊泡，胶束，表面活性剂的混合胶束，表面活性剂-磷脂混合胶束，毫米球(millisphere)，微球和纳米球，脂质球(liposphere)，毫米囊，微囊和纳米囊，以及微乳剂和纳米乳剂，其可加入以实现本发明发酵提取物的更大渗透。在一个实施方案中，递送或持续释放系统是脂质体，表面活性剂-磷脂混合胶束，微乳剂，具有内部反胶束结构的油包水微乳剂、和含有纳米囊的微乳剂。在一个实施方案中，递送或持续释放系统是脂质体，微乳剂、或含有脂质体的微乳剂。

[0040] 持续释放系统可通过现有技术中已知的方法制备，并且可施用含有该系统的组合物，例如，通过局部或经皮施用，包括粘附贴剂、非粘附贴剂、遮蔽式贴剂(occlusive patch)和微电贴剂(microelectric patch)，或通过全身性施用，例如但不限于，口服或肠胃外途径，包括鼻、直肠或皮下植入或注射，或直接植入或注射到特定身体部分。在一个实施方案中，所述释放可以在一段时间内提供相对恒定的化合物释放水平。持续释放系统中包含的发酵提取物的量将取决于，例如，组合物的施用位置、本发明发酵提取物的释放动力学和持续时间，以及待治疗/处理和/或护理的状况和/或病症的性质。

[0041] 在一个实施方案中，含有本发明发酵提取物的组合物被吸附在固体有机聚合物或固体无机支持物上，如但不限于，滑石、膨润土、二氧化硅、淀粉或麦芽糖糊精等等。

[0042] 在一个实施方案中，将含有短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物的组合物掺入到与皮肤直接接触的织物、无纺织物或医疗装置中，从而释放本发明的发酵提取物(通过织物、无纺织物或医学装置的结合系统的生物降解，或通过其与身体之间的摩擦、或通过身体水分、皮肤pH或体温，而释放)。在其它实施方案中，本发明的发酵提取物掺入到用于制造直接接触身体的衣物的织物和无纺织物中。在一个实施方案中，含有本发明发酵提取物的织物、无纺织物和医学装置被用于治疗/处理和/或护理状况和/或病症，其中通过增加脂连蛋白水平、增加线粒体活性、刺激伤口愈合和/或皮肤的上皮再形成、或通过刺激胶原蛋白合成，改善或防止状况和/或病症。

[0043] 织物、无纺织物、衣物、医学装置以及将化合物固定到其上的手段(包括上述的递送系统和/或持续释放系统)的实例，可以在文献中找到且是现有技术已知的[Schaab C.K.(1986)HAPPI May 1986；Nelson G.,“Application of microencapsulation in textiles”(微囊化在纺织品中的应用),(2002),Int.J.Pharm.,242(1-2),55-62；“Biofunctional Textiles and the Skin”(生物功能性纺织品和皮肤)(2006)
Curr.Probl.Dermatol.v.33,Hipler U.C.and Elsner P.,eds.S.Karger AG,Basel,Switzerland；Malcolm R.K.等人,“Controlled release of a model antibacterial drug from a novel self-lubricating silicone biomaterial”(来自新颖的自润滑硅氧烷生物材料的抗菌药物模型的控制释放),(2004),J.Cont.Release,97(2),313-320]。在一个实施方案中，织物、无纺织物、衣物和医学装置是绷带，纱布，T恤衫，短袜，裤袜，内衣，腰带，手套，尿布，卫生巾，敷料，床单，擦拭巾，粘附贴剂，非粘附贴剂，遮蔽式贴剂，微电子贴剂和/或面罩。

[0044] 含有本发明发酵提取物的美容或皮肤药物组合物可以用于不同类型的局部或经皮应用的组合物中，可选地包括配制期望的施用形式所必需的美容上和/或皮肤药物上可接受的赋形剂。

[0045] 在一个实施方案中，用于局部或经皮应用的组合物可以以任何固体、液体或半固体制剂的形式生产，例如且不限于霜剂，复合乳剂，诸如且不限于水包油和/或水包硅氧烷的乳液、油包水和/或硅氧烷包水的乳液、水/油/水型或水/硅氧烷/水型乳液和油/水/油型或硅氧烷/水/硅氧烷型乳液，液晶，无水组合物，含水分散体，油，乳，香膏，泡沫，洗剂，凝胶，乳霜凝胶，水醇溶液，水甘醇溶液(hydroglycolic solution)，水凝胶，搽剂，精华液(sera)，皂，洗发精，调理剂，浆液(serum)，多糖薄膜，软膏，摩丝，润发油，粉末，杆剂，笔剂，喷雾剂或气溶胶(喷雾剂)，包括“留存型”制剂和“冲洗型”制剂。在其它实施方案中，使用本领域技术人员已知的技术，可以将这些局部或经皮应用制剂掺入到不同类型的固态辅助物中，诸如例如且不限于，绷带，纱布，T恤衫，短袜，裤袜，内衣，腰带，手套，尿布，卫生巾，敷料，床单，擦拭巾，粘附贴剂，非粘附贴剂，遮蔽式贴剂，微电子贴剂或面罩，或者可以掺入到不同的化妆产品中，例如粉底(例如液态粉底和粉饼)、卸妆液、卸妆乳、遮瑕膏、眼影、唇棒、护唇膏、唇彩与唇粉等。

[0046] 在其它实施方案中，本发明的美容组合物或皮肤药物组合物可以包括增加本发明发酵提取物的经皮吸收的物质，例如且不限于二甲亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、表面活性剂、氮酮(1-十二烷基氮杂环庚-2-酮)、醇、脲、乙氧基二甘醇、丙酮、丙二醇或聚乙二醇等。此外，本发明的美容组合物或皮肤药物组合物可以通过离子电渗、超声促渗、电穿孔、微电贴剂、机械压迫、渗透压梯度、遮蔽式治疗(occlusive cure)、显微注射或借助于压力的无针注射(诸如通过氧压的注射)、或其任何的组合，应用至待处理的局部区域，以获得本发明发酵提取物的更大渗透。应用的区域将取决于待治疗/处理和/或护理的状况和/或病症的性质。

[0047] 可以包含在本发明所述的美容组合物或皮肤药物组合物中的美容上或皮肤药物上可接受的赋形剂和/或成分包括，通常用于美容或皮肤药物组合物中的其它成分，例如但不限于，增加脂肪细胞中脂连蛋白水平的其它物质，增加线粒体活性的其它物质，增加肌肉中ATP水平的其它物质，刺激愈合的其它物质，其它辅助愈合物质，刺激上皮再形成的其它物质，其它辅助上皮再形成物质，减少脂肪细胞中甘油三酯含量的物质，延缓脂肪细胞分化的物质，降低夜蛋白量的物质，抑制夜蛋白表达的物质，脂肪分解物质或刺激脂肪分解的物质，静脉张力剂(venotonic agents)，调节PGC-1α表达的物质，抑制PPARγ活性的物质，抗脂肪团物质，减少皮脂生成的物质，刺激真皮或表皮大分子合成和/或能够抑制或防止其降解的物质，胶原蛋白合成刺激剂、弹性蛋白合成刺激剂、饰胶蛋白聚糖合成刺激剂、层粘连蛋白合成刺激剂、防卫素合成刺激剂、伴侣蛋白合成刺激剂、cAMP合成刺激剂、调节AQP-3的物质、调节水通道蛋白合成的物质、来自水通道蛋白家族的蛋白质、透明质酸合成刺激剂、糖胺聚糖合成刺激剂、纤连蛋白合成刺激剂、沉默调节蛋白(sirtuin)合成刺激剂、热休克蛋白、热休克蛋白合成刺激剂、抑制神经元胞吐作用的物质、抗胆碱能物质、抑制肌肉收缩的物质、抗衰老物质、抗皱物质、止汗剂、抗炎药和/或镇痛药、止痒药、镇静药、麻醉药、乙酰胆碱受体聚集抑制剂、抑制乙酰胆碱酯酶的物质、皮肤舒缓剂、黑色素合成刺激剂或抑制剂、白化剂或去色素沉着剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰-和/或脯氨酰羟化酶抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的物质、反应性羰基类物质的清除剂、抗糖化剂、抗组胺药、抗病毒药、抗寄生虫药、乳化剂、柔润剂、有机溶剂、液态抛射剂、皮肤调理剂、湿润剂、保留水分的物质、α羟酸、β羟酸、保湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素或色料、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、能够减少或处理眼袋的物质、皮肤角质层剥离剂(exfoliating agent)、角质溶解剂、脱屑剂、抗微生物药、抗真菌药、抑真菌药、杀细菌药、抑细菌药、刺激角质层组分合成的物质、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原蛋白降解的物质、抑制基质金属蛋白酶的物质、抑制弹性蛋白降解的物质、抑制丝氨酸蛋白酶如激肽释放酶、白细胞弹性蛋白酶或组织蛋白酶G的物质、刺激成纤维细胞增殖的物质、刺激角质形成细胞增殖的物质、刺激黑素细胞增殖的物质、刺激角质形成细胞分化的物质、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病药、DNA修复剂、DNA保护剂、干细胞保护剂、稳定剂、处理和/或护理敏感皮肤的物质、紧致剂(firming agent)、抗妊娠纹剂、收敛剂、抑制PAR-2活性的物质、细胞因子、生长因子、作用于毛细血管循环和/或微循环的物质、刺激血管生成的物质、抑制血管通透性的物质、作用于细胞代谢的物质、改善真皮-表皮结合部的物质、诱导毛发生长的物质、毛发生长抑制剂或阻滞剂、落发阻滞剂、防腐剂、香料、美容性和/或吸收性和/或体味掩蔽性除臭剂、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、从生物技术方法获得的物质、无机盐、细胞提取物、有效对抗紫外A和/或B射线和/或红外A射线的防晒剂和有机或无机的光防护剂，或它们的混合物，条件是其与组合物中的其余组分和短芽孢杆菌物种菌株产生的发酵提取物在物理和化学上相容。同样地，这些额外成分的性质不应该不可接受地改变本发明发酵提取物的益处。这些额外成分的性质可以是合成的或天然的，如植物提取物，或来自生物技术步骤，或来自合成步骤和生物技术步骤的组合。其它实例可见CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary&Handbook,12th Edition(2008)。在本发明的上下文中，生物技术步骤应被理解为在生物体或其部分中生产活性成分或其部分的任何步骤。

[0048] 在一个实施方案中，减少脂肪细胞的甘油三酯含量的物质、延迟脂肪细胞分化的物质、抗脂肪团物质、脂肪分解物质、静脉张力物质、抑制PGC-1α表达的物质或抑制PPARγ活性的物质选自例如以下并且不限于，以下植物的提取物或经水解的提取物：羽衣草(Alchemilla vulgaris)，当归(Angelica sinensis)，Armeniacea sp.、山金车(Arnica montana L)、Atractylodis platicodon、竹、白桦(Betula alba)、柴胡(Bupleurum chinensis)、金盏花(Calendula officinalis)、苍术、钝叶号角树(Cecropia obtusifolia)、鸡冠花(Celosia cristata)、积雪草(Centella asiatica)、藜麦(Chenopodium quinoa)、金黄洋甘菊(Chrysanthellum indicum)、总状升麻(Cimifuga racemosa)、苦橙(Citrus aurantium amara)、藏掖花(Cnicus benedictus)、小果咖啡(Coffea arabica)、白可拉(Cola nipida)、髯毛鞘蕊花(Coleus barbatus)、五彩苏(Coleus blumei)、毛萼鞘蕊花(Coleus esquirolii)、毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii)、小五彩苏(Coleus scutellaroides)、鞘蕊花属物种(Coleus sp.)、Coleus xanthantus、没药(Commiphora myrrha)、海茴香(Crithmum maritimum)、枯茗(Cuminum cyminum)、叉蕊薯蓣(Dioscorea  colettii)、长柔毛薯蓣(Dioscorea  villosa)、丁香(Eugenia 
caryophyllus)、旋果蚊子草(Filipendula ulmaria L)、茴香(Foeniculum vulgare)、墨角藻(Fucus vesiculosus)、胶石花菜(Gelidium Cartilagineum)、银杏(Ginkgo biloba)、银杏、大豆(Glycine max)、洋甘草(Glycyrrhiza glabra)、洋常春藤(Hedera helix)(常春藤提取物)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、大麦(Hordeum vulgare)、啤酒花(Humulus lupulus)、贯叶连翘(Hypericum perforatum)、巴拉圭茶(Ilex paraguariensis)、非洲吊灯树(Kigelia africana)、掌状海带(Laminaria digitata)、宿根羽扇豆(Lupinus perennis)、莲(Nelumbium speciosum)、Orthosiphon stamincus benth、人参(Panax ginseng)、巴西香可可(Paullinia  cupana)、波尔多树(Peumus boldus)、褐藻
(Phyllacantha fibrosa)、卡瓦胡椒(Piper methysticum)、胡椒(Piper nigrum)、夏枯草(Prunella vulgaris)、扁桃(Prunus amygdalus dulcis)、迷迭香(Rosmarinus 
officinalis)、覆盆子(Rubus idaeus)、假叶树(Ruscus aculeatus)(假叶树提取物)、鼠尾草(Salvia officinalis L)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、锯叶棕(Serenoa repens)、灰菝葜(Smilax aristolochiaefolia)、勃那特螺旋藻(Spirulina platensis)(藻类)、红果蒲公英(Taraxacum erythrospermum)、欧蒲公英(Taraxacum officinale)、绿茶、红榆(Ulmus rubra)、绒毛钩藤(Uncaria tomentosa)、马鞭草(Verbena officinalis)、穗花牡荆(Vitex agnus-castus)、Dysmorphococcus globosus，等等；阿尔维林、枸橼酸阿尔维林、二氢杨梅黄酮、辅酶A、脂肪酶、变蓝菌素、芦丁、海罂粟碱、七叶苷、维斯那定、咖啡因、茶碱、可可碱、氨茶碱、黄嘌呤、肉碱、毛喉素、七叶树皂苷、鲁斯可皂苷元、常春藤皂苷、碘化三乙醇胺、AMPc合成诱导物、Atrium/Unipex销售的 [INCI：金黄洋甘菊
(Chrysanthellum Indicum)提取物]、BASF销售的Slim-ExcessTM[INCI：水、丁二醇、氯化钠、TM
经水解的角叉菜胶、黄原胶]、Sveltine [INCI：水、丁二醇、肉碱、卵磷脂、咖啡因、卡波姆、水杨酸、缺端胶原、积雪草提取物、七叶苷、软骨素硫酸钠]、秘鲁Liana[INCI：绒毛钩藤提取物]或FlavengerTM[INCI：辛酸/癸酸甘油三酯、二甲基甲硅烷基化硅石、甘油油酸酯、五羟黄酮辛酸酯]、Codif销售的Scopariane[INCI：细枝黑顶藻(Sphacelaria Scoparia)]、Phyco R75[INCI：掌状海带]、Pheoslim[INCI：褐藻提取物]、荞麦蜡[INCI：荞麦(Polygonum fagopyrum)]或Areaumat Samphira[INCI：海茴香提取物]、Actiporine8.G[甘油、水、叉珊藻(Jania rubens)提取物]、Cosmetochem销售的瘦身因子KarkadeTM[INCI：玫瑰茄]、Infinitec Activos销售的Liposuctionine[提议的INCI：乙酰基六肽]、Exsymol销售的Xantalgosil [INCI：茶碱甲基硅烷醇甘露糖醛酸酯]、Theophyllisilane [INCI：甲基硅烷醇羧甲基茶碱藻酸盐]、 [INCI：焦谷氨酰基吲哚]或Cafeisilane 
C[INCI：硅氧烷三醇藻酸酯、咖啡因、丁二醇]、Greentech销售的 [INCI：聚葡糖醛酸]、Indena销售的Visnadine[INCI：维斯那定]或银杏(Ginkgo biloba)二聚体类黄酮磷脂复合物(Phytosome)[INCI：磷脂、银杏叶提取物]、Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF销售的 LS9509[INCI：钝叶号角树(Cecropia Obtusifolia)树皮提
取物]、Lipotec/Lubrizol销售的SilusyneTM[INCI：野大豆(Glycine Soja)油、失水山梨糖醇倍半油酸酯、异十六烷、透明质酸钠、月桂基二甲基铵羟丙基水解大豆蛋白、乙酰基六肽-
39]或 [INCI：水、丙三醇、卵磷脂、咖啡因、假叶树根提取物、麦芽糊精、二
氧化硅、氢碘酸TEA盐、丙二醇、洋常春藤提取物、肉碱、七叶树皂苷、三肽-1、黄原胶、角叉菜胶(皱波角叉菜(Chondrus Crispus))、EDTA二钠]、Mibelle Biochemistry销售的Iso-Slim Complex[INCI：大豆异黄酮、咖啡因、肉碱、勃那特螺旋藻提取物、聚山梨醇酯-80、醇、苯氧乙醇、Aqua]、Happybelle-PE[INCI：卵磷脂、穗花牡荆提取物、丙三醇、抗坏血酸四异棕榈酸酯、生育酚、辛酸/癸酸甘油三酯、环糊精、醇、水]或AmaraShape[INCI：卵磷脂、咖啡因、苦橙提取物、戊二醇、醇、水]、Pentapharm/DSM销售的 [INCI：麦芽糊精、咖啡因、巴西香可可籽提取物、肉碱、微晶纤维素、氧化半胱氨酸、Pantheine磺酸酯]或
[INCI：异构化亚油酸、卵磷脂、丙三醇、聚山梨醇酯-80]、Provital销售的
ProvislimTM[INCI：丙二醇、水(Aqua)、漆黄素、覆盆子酮]、Myriceline[INCI：二氢杨梅黄酮]或Drenalip[INCI：假叶树根提取物、香橼(Citrus Medica Limonum)皮提取物、毛果一枝黄花(Solidago Virgaurea)提取物、膜荚黄芪(Astragalus Membranaceus)根提取物]、Givaudan销售的Actisculpt[INCI：Commiphora Myrrha提取物、毛喉鞘蕊花根提取物]、Rahn销售的 [INCI：水、肉碱、咖啡因、假叶树提取物]或 Shape
[INCI:小球藻(Chlorella Vulgaris)/白羽扇豆(Lupinus Albus)蛋白发酵产物、毛喉鞘蕊花、咖啡因]、Rovi Cosmetics销售的ProContourTM[INCI：水、醇、卵磷脂、咖啡因、肉碱、积雪草叶提取物、磷酸钾、毛喉鞘蕊花根提取物]、Sederma/Croda销售的UnislimTM[INCI：巴拉圭茶(叶)提取物、水、丁二醇、小果咖啡(Coffea Arabica)(咖啡)籽提取物(豆类)、PEG-60杏仁甘油酯类、丙三醇、鲸蜡基羟乙基纤维素]、ReduliteTM[INCI：丙三醇、水、乙氧基二甘醇、西洋接骨木、聚丙烯酸钠]、PleurimincylTM[INCI：咖啡因、柴胡提取物]、PhytotalTMSL[INCI：丙三醇、马鞭草提取物、丁二醇、西洋接骨木花提取物、丁香(Clove)花提取物、卵磷脂]、PhytosonicTM[INCI：Aqua、细小裸藻(Euglena Gracilis)提取物、咖啡因、黄花海罂粟TM
叶提取物]、Ovaliss [INCI：丙三醇、Aqua、椰油基葡糖苷、辛二醇、醇、海罂粟碱]、LipocareTM[INCI：咖啡因、辅酶A、柴胡提取物]、Cyclolipase TM[INCI：甘油聚甲基丙烯酸酯、水、咖啡因、脂肪酶、磷酸腺苷]、Coaxel TM[INCI：咖啡因、辅酶A、肉碱、水、丙三醇]、BodyfitTM[INCI：丙三醇、Aqua(水)、椰油基葡糖苷、辛二醇、醇、海罂粟碱]或Vexel[INCI：
Aqua、丙二醇、卵磷脂、咖啡因、棕榈酰肉碱]、Seppic销售的Voluform[INCI：棕榈酰异亮氨酸]、Adipoless[INCI：丁二醇、昆诺阿藜(CChenopodium Quinoa)籽提取物]、Silab销售的[INCI：波尔多树叶提取物]、 [INCI：苦橙花提取物]、Pro-
Sveltyl[INCI：莲(提取物]、 [INCI：水解鸡冠花/籽提取物、水解夏枯草提
取物]、 [INCI：水解芫荽(Coriandrum Sativum)果提取物、甜橙(Citrus 
Aurantium Dulcis)(橙)果提取物]或Stemsvelt[INCI：水、丁二醇、水飞蓟提取物]、Solabia销售的Delipidol[INCI：Tyrosyl Punicate]、 [INCI：丁二醇、水、咖
啡因、巴西香可可籽提取物、巴西榥榥木(Ptychopetalum Olacoides)树皮提取物]或[INCI：可可树果壳提取物]、Soliance销售的Abdoliance[INCI：蔗糖棕榈
酸酯、聚山梨醇酯-20、甘油亚麻酸酯、巴西香可可籽提取物、麦芽糊精、甜扁桃(Prunus Amygdalus Dulcis)油、卵磷脂、水、苦橙果皮提取物、苯氧乙醇、生育酚]、Betaphroline[INCI：灰毛豆(Tephrosia Purpurea)籽提取物]或PRO-DG[INCI：水、浮游生物提取物]、Vincience/ISP销售的UCPeptide TM V[INCI：水、丁二醇、五肽]或ATPeptideTM IS[INCI：三肽-3]，等等；或它们的混合物。

[0049] 在一个实施方案中，紧致和/或再密实和/或重建物质选自例如以下并且不限于：红叶金虎(Malpighia punicitolia)、洋蓟(Cynara scolymus)、草棉(Gossypium herbaceum)、库拉索芦荟(Aloe Barbadensis)、稷(Panicum miliaceum)、黑桑(Morus nigra)、芝麻(Sesamum indicum)、野大豆(Glycine soja)、小麦(Triticum vulgare)的提取物、Provital销售的 Refirming HSC[INCI：小麦(Triticum Vulgare)、水飞
蓟(Silybum Marianum)、Glycine Soy、问荆(Equisetum Arvense)、羽衣草(Alchemilla Vulgaris)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、萝卜(Raphanus sativus)]或
Refirming[INCI：Coneflower、Asiatic Centella、墨角藻(Fucus)、Fenugreek]、Atrium Biotechnologies/Unipex Innovations销售的 [INCI：山梨醇、藻提取物]、
Pentapharm/DSM销售的 Nutrix[INCI：天然营养因子]、含有异黄酮的植物提取
物、Sederma/Croda销售的Biopeptide ELTM[INCI：棕榈酰寡肽]、Biopeptide CLTM[INCI：
棕榈酰寡肽]、 [INCI：水(Aqua)、丙二醇、卵磷脂、咖啡因、棕榈酰肉碱]、
3000[INCI：棕榈酰五肽-3]、 [INCI：棕榈酰四肽-3、棕榈酰寡肽]
或Bio BustylTM[INCI：甘油聚甲基丙烯酸酯、拉恩氏菌(Rahnella)/大豆蛋白发酵物、水(Aqua)、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇-8、棕榈酰寡肽]、Laboratoires Serobiologiques/Cognis/BASF销售的 HC[INCI：丙三醇、水(Aqua)、葡糖氨基葡聚
糖、糖原]、 [INCI：甘露醇、环糊精、糖原、熊果(Aratostaphylos Uva Ursi)叶提取物]、 LS[INCI：水解酪蛋白、水解酵母蛋白、赖氨酸HCl]或
LS9120[INCI：榄仁树(Terminalia Catappa)叶提取物、西洋接骨木花提取物、聚乙烯吡咯烷酮、鞣酸]、Silab销售的 [INCI：水解小麦蛋白]、 [INCI：水解
大豆粉]或Ridulisse [水解大豆蛋白]、Lipotec/Lubrizol销售的 [INCI：
六肽10]、DecorinylTM[INCI：三肽10瓜氨酸]、 [INCI：假交替单胞菌发酵产物
提取物、水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽10瓜氨酸、三肽1]、SilusyneTM[INCI：大豆(野大豆(Glycine soja))油、失水山梨糖醇倍半油酸酯、异十六烷、透明质酸钠、月桂基二甲基铵羟丙基水解大豆蛋白、乙酰基六肽-39]、UplevityTM[INCI:乙酰基四肽-2]或Adifyline TM[INCI：乙酰基六肽-38]、Coletica/Engelhard/BASF销售的 [INCI：卵磷脂、
熊果酸、缺端胶原、黄原胶、软骨素硫酸钠]或 [INCI：水解麦芽提取物]、
Pentapharm/DSM销售的 Coll[INCI：棕榈酰三肽5]、Atrium Biotechnologies/
Unipex Innovations销售的 [INCI：水(Aqua)、葡糖氨基葡聚糖、硬化胶]或
Institut Europeen de Biologie Cellulaire/Unipex Innovations销售的IP2000[INCI：
葡聚糖、三氟乙酰三肽-2]，等等。

[0050] 在一个实施方案中，刺激真皮或表皮大分子合成的物质选自例如以下并且不限于：胶原蛋白合成刺激剂、弹性蛋白合成刺激剂、饰胶蛋白聚糖合成刺激剂、层粘连蛋白合成刺激剂、伴侣蛋白合成刺激剂、沉默调节蛋白(sirtuin)合成刺激剂、沉默调节蛋白(sirtuin)活化剂、水通道蛋白合成调节物质、纤连蛋白合成刺激剂、抑制胶原蛋白降解的物质、抑制抑制弹性蛋白降解的物质、抑制丝氨酸蛋白酶如激肽释放酶、白细胞弹性蛋白酶或组织蛋白酶G的物质、刺激成纤维细胞增殖的物质和DNA修复剂和/或DNA保护剂，如且不限制于积雪草、酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae)、马铃薯(Solanum tuberosum)、迷迭香、狭叶越桔(Vaccinium angustifolium)、巨藻(Macrocystis pyrifera)、粉团扇藻(Padina pavonica)的提取物、大豆、麦芽、亚麻、鼠尾草、红色车轴草、kakkon、白色羽扇豆植株的提取物、榛提取物、玉米提取物、酵母提取物、榉树苗提取物、豆科植物籽实提取物、植物激素提取物如赤霉素、植物生长激素或细胞分裂素，等等；或浮游动物Salina的提取物、牛奶的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)发酵产物、积雪草苷及它们的衍生物、维生素C及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、Sederma/Croda销售的 [INCI：棕榈酰五肽-3]、 3000[INCI：棕榈酰四肽-3、棕榈酰寡肽]或Biopeptide CLTM
[INCI：甘油聚甲基丙烯酸酯、丙二醇、棕榈酰寡肽]、Lipotec/Lubrizol销售的
[INCI：假交替单胞菌发酵产物提取物]、 [INCI：三肽-10瓜
氨酸]、 [INCI：六肽-10]、Lipeptide[INCI：水解植物蛋白]、
[INCI：水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽-1]、RelistaseTM[INCI：乙酰基精氨酰三色氨酰联苯基甘氨酸]、ThermostressineTM[INCI：乙酰基四肽-22]、肽AC29[INCI：乙酰基三肽-30瓜氨酸]、DiffuporineTM[INCI：乙酰基六肽-37]、SilusyneTM[INCI：大豆(野大豆)油、失水山梨糖醇倍半油酸酯、异十六烷、透明质酸钠、月桂基二甲基铵羟丙基水解大豆蛋白、乙酰基六肽-39]、UplevityTM[INCI:乙酰基四肽-2]或AdifylineTM[INCI：乙酰基六肽-38]、Alban Muller销售的 PF[INCI：酵母β-葡聚糖]、comercializado por Solabia
销售的Phytovityl [INCI：Aqua、玉蜀黍(Zea mays)提取物]、Coletica/Engelhard/BASF销售的 [INCI：水解麦芽提取物]、Vincience/ISP/Ashland销售的
Phytocohesine PSPTM[INCI：β-谷甾醇硫酸钠]、矿物质如钙等，类视黄醇及其衍生物、异黄酮类化合物、类胡萝卜素类、尤其番茄红素、伪二肽类、类视黄醇和它们的衍生物如视黄醇或视黄醇棕榈酸酯等或类肝素等。

[0051] 在一个实施方案中，抗皱和/或抗衰老物质选自例如以下并且不限于：葡萄(Vitis vinifera)、犬蔷薇(Rosa canina)、姜黄(Curcuma longa)、可可(Theobroma cacao)、银杏(Ginkgo biloba)、高山火绒草(Leontopodium alpinum)或盐生杜氏藻(Dunaliella salina)提取物或水解提取物等、Sederma/Croda销售的 [INCI：棕榈酰五肽-4]、 [INCI：棕榈酰四肽-7、棕榈酰寡肽]、 Synthe’6TM
[INCI：丙三醇、水、羟丙基环糊精、棕榈酰三肽-38]、EssenskinTM[INCI：羟蛋氨酸钙]、Renovage[INCI：替普瑞酮]、ResistemTM[INCI：心叶球花(Globularia Cordifolia)发酵产物]或 [INCI：棕榈酰寡肽]、Pentapharm/DSM销售的 [INCI：五肽-
3]、 [INCI：二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐]、 [INCI：棕榈酰
三肽-5]、Phytaluronate[INCI：角豆(长角豆(Ceratonia siliqua)胶]或
[INCI：野大豆(Glycine soja)(大豆)蛋白、氧化还原酶]、Laboratoires  Sé
robiologiques/Cognis/BASF销售的MyoxinolTM[INCI：水解的咖啡黄葵(HIBISCUS ESCULENTUS)提取物]、SyniorageTM[INCI：乙酰基四肽-11]、DermicanTM[INCI：乙酰基四肽-
9]或DN AGETM LS[INCI：翅荚决明(CASSIA ALATA)叶提取物]、Exsymol销售的Algisum[INCI：甲基硅烷醇甘露糖醛酸酯]或Hydroxyprolisilane [INCI：甲基硅烷醇羟脯氨酸酯天冬氨酸酯]、Lipotec/Lubrizol销售的 [INCI：乙酰基六肽-8]、SNAP-7
[INCI：乙酰基七肽-4]、SNAP-8[INCI：乙酰基八肽-3]、 [INCI：五肽-18]、
InylineTM[INCI：乙酰基六肽-30]、 [INCI：水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三
肽-1]、PreventheliaTM[INCI：二氨基丙酰三肽-33]、 [INCI：三肽-10瓜氨
酸]、 [INCI：三肽-9瓜氨酸]、 [INCI：假交替单胞菌发酵产物提
取物、水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽-10瓜氨酸、三肽-1]、 [INCI：乙酰基四肽-5]、肽AC29[INCI：乙酰基三肽-30瓜氨酸]、RelistaseTM[INCI：乙酰基精氨酰三色氨酰联苯基甘氨酸]、 [INCI：乙酰基四肽-22]、LipochromanTM[INCI：二甲
基甲氧基苯并二氢吡喃醇]、ChromabrightTM[INCI：棕榈酸二甲基甲氧基色烷酯]、[INCI：假交替单胞菌发酵产物提取物]、dGlyageTM[INCI：赖氨酸HCl、卵
TM
磷脂、三肽-9瓜氨酸]、Vilastene [INCI：赖氨酸HCl、卵磷脂、三肽-10瓜氨酸]、HyadisineTM[INCI：假交替单胞菌发酵产物提取物]、HyanifyTM[INCI：糖类同分异构体]、DiffuporineTM[INCI：乙酰基六肽-37]、SilusyneTM[INCI：大豆(野大豆)油、失水山梨糖醇倍半油酸酯、异十六烷、透明质酸钠、月桂基二甲基铵羟丙基水解大豆蛋白、乙酰基六肽-
39]、AdifylineTM[INCI：乙酰基六肽-38]UplevityTM[INCI：乙酰基四肽-2]或JuvefoxoTM[INCI：乙酰基六肽-51酰胺]、Institut Europeen de Biologie Cellulaire销售的[INCI：三肽-1、葡聚糖]、Vincience/ISP/Ashland销售的 IS
TM TM
[INCI：六肽-9]、Laminixyl IS  [INCI：七肽]、Orsirtine GL[INCI：稻(Oryza sativa)(稻)提取物]、D’OrientineTMIS[INCI：枣椰子(Phoenix dactylifera)(椰枣)籽提取物]、PhytoquintescineTM[INCI：单粒小麦(一粒小麦(Triticum monococcum)提取物]或QuintescineTMIS[INCI：二肽-4]、Infinitec Activos销售的BONT-L-肽[INCI：棕榈酰六肽-
19]、Seppic销售的DeepalineTMPVB[INCI：棕榈酰水解小麦蛋白]或 DPHP[INCI：
二棕榈酰羟脯氨酸]、Gattefossé销售的 表达[INCI：千日菊(Acmella 
oleracea)提取物]、 In-Tense[INCI：金钮扣(Spilanthes acmella)花提取物]
或 Age Defense 2[INCI：胡桃(Juglans regia)(胡桃)籽提取物]、
TM
Biotechmarine销售的Thalassine [INCI：藻提取物]、Atrium/Unipex Innovations销售的ChroNOlineTM[INCI：己酰基(Caprooyl)四肽-3]或Thymulen-4[INCI：乙酰基四肽-2]、Coletica/Engelhard/BASF销售的EquiStat[INCI：苹果(Pyrus malus)果提取物、野大豆籽提取物]或Juvenesce[INCI：乙氧基二甘醇和辛酸甘油三酯、视黄醇、熊果酸、维生素K1、伊洛马司他]、Mibelle Biochemistry销售的Ameliox[INCI：肌肽、生育酚、水飞蓟果提取物]或PhytoCellTec栽培苹果(Malus domestica)[INCI：栽培苹果果实细胞培养物]、Silab销售的Bioxilift[INCI：茴芹(Pimpinella  anisum)提取物]或SMS
[INCI：番荔枝(Annona squamosa)籽提取物]、Ca2+通道拮
抗剂如且不限制于阿尔维林、锰盐或镁盐、某些仲胺或叔胺、视黄醇及其衍生物、艾地苯醌及其衍生物、辅酶Q10及其衍生物、乳香酸及其衍生物、GHK及其衍生物和/或盐、肌肽及其衍生物、DNA修复酶如且不限制于光裂合酶或T4核酸内切酶V、或氯离子通道激动剂等和/或其混合物。

[0052] 在一个实施方案中，刺激愈合的物质、辅助愈合物质、刺激上皮再形成的物质、辅助上皮再形成物质选自，例如但不限于，以下植物的提取物或水解提取物：Aristoloquia clematis，积雪草(Centella asiatica)，麝香蔷薇(Rosa moschata)，狭叶松果菊(Echinacea angustifolia)，聚合草(Symphytum officinal)，问荆(Equisetum arvense)，贯叶连翘(Hypericum perforatum)，细花含羞草(Mimosa tenuiflora)，鳄梨(Persea gratísima)，非洲刺李(Prunus africanum)，Tormentilla erecta，芦荟(Aloe vera)，由Provital销售的 Epithelizing[INCI：金盏花(Calendula officinalis)，贯叶连翘(Hypericum perforatum)，母菊(Chamomilla recutita)，迷迭香(Rosmarinus officinalis)]，由Laboratories Sérobiologiques/Cognis销售的 LS 9028
[INCI：水解酪蛋白，水解酵母蛋白，赖氨酸盐酸盐]，由Coletica/Engelhard销售的[INCI：玉米(Zea mays)仁提取物]，尿囊素，钙粘素(cadherins)，整合素，选择素，透明质酸受体，免疫球蛋白，成纤维细胞生长因子，结缔组织生长因子，血小板衍生的生长因子，血管内皮生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，角质形成细胞生长因子，集落刺激因子，转化生长因子β，肿瘤坏死因子-α，干扰素，白细胞介素，基质金属蛋白酶，蛋白酪氨酸磷酸酶受体， [INCI：假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)发酵提取
物]， [INCI：乙酰二肽-3氨基己酸酯]或DecorinylTM[INCI：三肽-10瓜氨
酸]， [INCI：假交替单胞菌发酵提取物，水解小麦蛋白，水解大豆蛋白，三肽10瓜氨酸，三肽-1]，XpertmoistTM[INCI：甘油，假交替单胞菌发酵提取物，黄原胶，脯氨酸，丙氨酸，丝氨酸，乙基己基甘油，辛甘醇]， [INCI：六肽-10]，DelisensTM[INCI：
乙酰六肽-49]或由Lipotec/Lubrizol销售的ThermostressineTM[INCI：乙酰四肽-22]，等等，和/或其混合物。

[0053] 应用

[0054] 本发明的其它方面涉及短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物在制备美容或皮肤药物组合物中的用途，所述美容或皮肤药物组合物用于提高脂连蛋白水平、增加肌肉中线粒体活性、增加肌肉耐力、刺激伤口愈合和/或皮肤的上皮再形成、刺激胶原蛋白合成和/或透明质酸合成、处理和/或防止皮肤老化、处理和/或防止皮肤皱纹、处理以使皮肤紧致和/或防止皮肤紧致度丧失。在一个实施方案中，脂连蛋白水平是循环中的脂连蛋白水平。在另一个实施方案中，脂连蛋白水平是在脂肪细胞中的脂连蛋白水平。在一个实施方案中，增加肌肉中的线粒体活性是增加肌肉中的ATP水平和/或柠檬酸合酶活性。在其它实施方案中，肌肉耐力的增加是有氧耐力的增加。在另一个实施方案中，有氧耐力的增加是增加肌肉中I型纤维的比例。在一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株是保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株。

[0055] 本发明的另一个方面涉及，用于增加脂连蛋白水平、增加肌肉中线粒体活性、增加肌肉耐力、刺激伤口愈合和/或皮肤的上皮再形成、刺激胶原蛋白合成和/或透明质酸合成、处理和/或防止皮肤老化、处理和/或防止皮肤皱纹、处理以使皮肤紧致和/或防止皮肤紧致度丧失的方法，所述方法包括施用美容上或皮肤药物学上有效量的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物。在一个实施方案中，脂连蛋白水平是循环中的脂连蛋白水平。在另一个实施方案中，脂连蛋白水平是在脂肪细胞中的脂连蛋白水平。在一个实施方案中，增加肌肉中的线粒体活性是增加肌肉中的ATP水平和/或柠檬酸合酶活性。在其它实施方案中，肌肉耐力的增加是有氧耐力的增加。在另一个实施方案中，有氧耐力的增加是增加肌肉中I型纤维的比例。在一个实施方案中，短芽孢杆菌物种菌株是保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株。在另一个实施方案中，肌肉中线粒体活性的增加、肌肉耐力的增加、伤口愈合和/或上皮再形成的刺激，是脂连蛋白水平增加的结果。在另一个实施方案中，皮肤老化的处理和/或防止，皮肤皱纹的处理和/或防止、使皮肤紧致的处理和/或皮肤紧致度丧失的防止，是胶原蛋白合成刺激的结果。

[0056] 在一个实施方案中，脂连蛋白水平的增加可以引起肌肉中线粒体活性的增加、肌肉耐力的增加、刺激皮肤伤口愈合和/或上皮再形成、刺激胶原蛋白合成和/或透明质酸合成、处理和/或防止皮肤老化、处理和/或防止皮肤皱纹、处理皮肤紧致度和/或防止皮肤紧致度的丧失。

[0057] 在另一个方面，短芽孢杆菌物种菌株产生的发酵提取物，通过引起其与人体中作用部位接触的任何手段来施用，并且常常，以包含其的组合物的形式施用。短芽孢杆菌物种菌株产生的发酵提取物可以进行局部或经皮施用。在一个实施方案中，局部或经皮应用通过离子电渗、超声促渗、电穿孔、机械压迫、渗透压梯度、遮蔽式治疗(occlusive cure)、显微注射、或借助于压力的无针注射、微电贴剂、面膜或其任意组合进行。

[0058] 应用或施用的频率可以有很大变化，这取决于每个受试者的需要，建议应用或施用的范围从每月一次到每天10次，从每周一次到每天4次，从每周三次到每天三次，或每天一次。

[0059] 生物材料的保藏

[0060] 根据布达佩斯条约，短芽孢杆菌物种的菌株保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)/微生物细菌实验室(LMG)(根特大学,K.L.莱德汉克大街35,9000根特，比利时)。保藏在2014年3月11日完成并且保藏号是LMG P-28202。实施例

[0061] 上文提到的每份文献，无论上文是否具体列出，均通过引用方式并入本文，包括优先权被要求的任何在先申请。提到任何文献不是承认，在任何司法管辖区，该文献均被视作现有技术或构成技术人员的常识。除却在实施例中或另有明确指示的情况下，本说明书中指明材料数量、反应条件、分子量、碳原子数目等的全部数值量均应理解为近似量，即，接受所示数值的±5％、±3％、±1％，±0.1％，或±0.01％的变异。应该理解的是，本文给出的量、范围和比例的上下限可以独立地组合。类似地，本文描述的技术的各要素的范围和量可以与任何其它要素的范围或量一起使用。

[0062] 实施例1：获得保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物。

[0063] A)保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌菌株的培养方法。

[0064] 保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌菌株在生物反应器中、在25℃和pH 8.0、在培养基中培养，所述培养基含有水、1g/L酵母提取物和4g/L蛋白胨作为碳和氮源、20g/L葡萄糖作为额外的碳源、和浓度31g/L的海盐。从600nm波长下光密度0.2AU的指数生长的预培养物接种。发酵延长至72小时培养。溶解氧浓度控制在30％饱和空气，并且将搅拌维持在约200rpm的值。

[0065] B)纯化从保藏号为LMG P-28202的短芽孢杆菌菌株获得的发酵提取物。

[0066] 通过在10,000rpm工作的Westfalia CSA-1离心机中连续离心，从实施例1a)中所述的含有发酵提取物的所得发酵液，分离细菌。通过以最终孔径0.2μm过滤，完成细菌移除。随后冷冻干燥含有发酵提取物的所得上清液。

[0067] 实施例2：保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌菌株的发酵提取物的物理化学表征。

[0068] 为了物理化学表征根据实施例1得到的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物，进行了高效液相色谱法(HPLC)、伯胺(茚三酮试验)、仲胺(Chloranyl试验)碳水化合物(Fehling)、和酚(Folin-Ciocalteau)测定法。

[0069] 色谱分析SE-HPLC-UV

[0070] 制备在水:甘油(9:95)中的根据实施例1得到的发酵提取物的7mg/mL溶液，通过HPLC-UV分析。预先用水1：5稀释，通过0.22μm醋酸纤维素滤器过滤。将100μL注入高效液相色谱(HPLC)LC20A SHIMADZU中。使用的色谱柱是TSKGel G2000SWXL,5m, 7.8mm x 30mm(TOSOH Bioscience)，水0.1M pH＝6.70+0.1M磷酸缓冲液+0.1M硫酸钠作为洗脱液。

[0071] 在这些条件下，产物的色谱图显示10至15分钟之间的峰，平均峰在11分钟，在标准品氨基苯甲酸(MW＝137Da)和来自牛胰腺的核糖核酸酶A(MW＝13700Da)的保留时间之间。

[0072] 伯胺(茚三酮法)

[0073] 试剂：茚三酮试剂A：40g苯酚溶于10mL无水乙醇中。平行地，65mg KCN溶解在100mL水中。2mL该溶液溶解在100mL通过茚三酮蒸馏的吡啶中。这两种溶液都在45分钟内与4g Amberlite MB-3混合。最后，将溶液通过纸过滤，然后混合。茚三酮试剂B：2.5mg茚三酮溶于50mL无水乙醇中。

[0074] 方法：0.5mL 1mg/mL根据实施例1获得的发酵提取物的水性溶液倒入2mL试管中。然后3滴茚三酮试剂A和1滴茚三酮试剂B加入到该管中并混合。然后，在2分钟内保持在110℃。所分析的产物显示出黄颜色，因此，指示没有检测到伯胺。用4M TFA溶液酸水解4小时后，重复茚三酮测试，获得阳性结果，这表明发酵提取物含有肽形式的氨基酸。

[0075] 仲胺(Chloranyl测定法)

[0076] 试剂：丙酮和氯醌反应试剂：0.75g chloranyl(2,3,5,6-四氯-1,4-苯醌)溶解在25mL甲苯中以获得饱和溶液。

[0077] 方法：4滴丙酮加入到根据实施例1获得的20mg冻干发酵提取物。然后，加入1滴Chloranyl反应试剂。搅拌此混合物并在室温下保持5分钟。该分析产物未显示蓝绿颜色，因此表明在发酵提取物中未检测到仲胺。

[0078] 碳水化合物分析(Fehling测定法)

[0079] 试剂：Fehling A：48.3g硫酸铜(II)在1L水与1mL 96％硫酸中。Fehling B：90g氢氧化钠与300g酒石酸钠钾在1L水中。

[0080] 方法：1mL试剂Fehling A和1mL试剂Fehling B加入到10mg根据实施例1得到的发酵提取物，将样品在60℃加热45-60分钟。红色固体沉淀表明在发酵提取物中存在还原性碳水化合物。

[0081] 酚测定法(Folin-Ciocalteau测定法)

[0082] 试剂：Folin-Ciocalteau试剂(来自Sigma-Aldrich；Ref.47641)；Na2CO3(来自Panreac)和甲醇(来自Scharlab)。

[0083] 方法：在10ml试管中加入以下试剂：0.5ml的1mg/mL根据实施例1得到的发酵提取物的水溶液，0.5ml Folin-Ciocalteau试剂，1.5ml Na2CO320％和7mL甲醇:水(1:1)。该溶液保持在黑暗中1小时。制备相同的而无发酵提取物(用水代替)的溶液作为空白。阴性结果、无色溶液表明在发酵提取物未检测到酚。

[0084] 实施例3：制备含有保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物的美容霜组合物

[0085] 在一个适当的容器中，混合水[INCI：水(AQUA)]、山梨酸钾[INCI：山梨酸钾]和EDTA二钠[INCI：EDTA二钠〕，并搅拌直至实现溶解。接着，加入Carbopol Ultrez 20[INCI:卡波姆]并搅拌至全分散。之后，加入黄原胶[INCI：黄原胶]，也搅拌至全分散。该成分的混合物构成相A。

[0086] 在搅拌下，向相A的混合物中逐一加入B相的成分，Hydrolite-52/016020[INCI:戊二醇],Zemea[INCI:丙二醇]和苯氧乙醇[INCI:苯氧乙醇]成分。

[0087] 向相A和相B的混合物中加入包含环己硅氧烷BRB CM60[INCI:环己硅氧烷]的相C，搅拌至均质。

[0088] 在搅拌下向先前的混合物中加入相D成分Schercemol 1818[INCI：异硬脂醇异硬脂酸酯]，直到其完全并入混合物。

[0089] 相E包含根据实施例1从保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌菌株得到的发酵提取物，甘油[INCI：甘油]，水[INCI：水(AQUA)]。在搅拌下向相A，B，C和D成分的混合物中加入该相，直到溶解。

[0090] 同样地，将相F的成分Diffuporine[INCI:乙酰六肽-37,丁二醇，水(AQUA)]加入到先前的混合物中，直到溶解。

[0091] 相G的成分乙醇[INCI：ALCOHOL DENAT]在搅拌下加入。

[0092] 随后，在搅拌下加入香料维生素混合物[INCI：FRAGANCE(PARFUM)](相H)。

[0093] 通过在搅拌下加入氢氧化钠[INCI：氢氧化钠](q.s足够的量以调整到该pH)(相I)，将pH调节至6.0-6.5，获得具有表1所示比例的美容组合物。

[0094] 表格1

[0095]

[0096]

[0097] 实施例4：制备包含保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物的美容霜组合物

[0098] 在一个适当的容器中，混合水[INCI：水(AQUA)〕、Hydrolite-5[INCI：戊二醇]、甘油[INCI：甘油]、甜菜碱BP[INCI：甜菜碱]，和Microcare BNA[INCI：苯甲醇]，并搅拌直至实现溶解。接着，加入Carbopol Ultrez 10[INCI:卡波姆]并搅拌至分散。之后，加入Arlatone MAP160K[INCI：鲸蜡醇磷酸酯钾]，并也搅拌直到全分散。该成分的混合物构成相A。

[0099] 接着，将相B成分鲸蜡醇[INCI：鲸蜡醇]，Finsolv TN[INCI：C 12-C15烷基苯甲酸酯]，Massocare HD[INCI：异十六烷]，Polisorbate 20[INCI：聚山梨醇酸酯20]，硬脂酸[INCI：硬脂酸]和苯氧乙醇[INCI：苯氧乙醇]混合，并加热至70℃。

[0100] 将相A和B在70℃下搅拌混合。

[0101] 然后，将A和B的混合物冷却至40℃，在此温度下加入相C成分Silicone DC 345 fluid[INCI：环聚二甲基硅氧烷]，并搅拌直至混合物均质。

[0102] 在搅拌下加入D相成分至均质，D相成分包含根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物、甘油[INCI：甘油]和水[INCI：水(AQUA)]。

[0103] 随后，香料[INCI：FRAGANCE(PARFUM)](相E)在搅拌下加入。通过在搅拌下加入氢氧化钠[INCI：氢氧化钠](q.s足够的量以调整到该pH)(相F)，将pH调节至6.0-6.5，获得具有表2所示的比例的美容组合物。

[0104] 表2

[0105]

[0106] 实施例5：制备包含保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物的微乳液

[0107] 在一个适当的容器中，Docusate Sodium USP[INCI：磺基琥珀酸二乙基己酯钠]和异硬脂酸[INCI：异硬脂酸]混合(相A)。

[0108] 在另一个容器中，将包含根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物、甘油[INCI：甘油]和水[INCI：水(AQUA)]的混合物，溶于乙醇[INCI：醇]中(相B)。慢慢地，在搅拌下将相B加入到相A。见表3。

[0109] 表3

[0110]

[0111] 实施例6：制备含有实施例5的微乳液的脂质纳米颗粒组合物

[0112] 水[INCI：水(AQUA)， [INCI：小核菌胶(SCLEROTIUM GUM)]，ZemeaTM[INCI：丙二醇]，ZEMEA[INCI：丙二醇]和苯氧乙醇[INCI：苯氧乙醇](相A成分)以该顺序加入适当的容器并搅拌直到实现均质。

[0113] 包含实施例5微乳液的混合物、精制大豆油IP欧洲药典[INCI：GLYCINE SOJA(大豆)油〕、Arlacel 83[INCI：山梨坦倍半油酸酯]和Arlamol HD[INCI：异十六烷](相B成分)加入到另一容器中。

[0114] 然后，将相B成分的混合物在涡轮搅拌下加入到相A成分的混合物中，直至形成乳液。随后，用钛探针将混合物均化一分钟。

[0115] 然后，在搅拌下滴加SENSOMER CT-400[INCI：决明胶羟丙基三甲基氯化铵的水[INCI：水(AQUA)]悬液(相C成分)。见表4。

[0116] 表4

[0117]

[0118] 实施例7：制备包含保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物的脂质体

[0119] 在一个适当的容器中，水[INCI：水(AQUA)]，ZemeaTM[INCI：丙二醇]和苯氧乙醇[INCI：苯氧乙醇](相B至D)加入到相A混合物，所述的相A混合物含有根据实施例1得到的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物、甘油[INCI：甘油]和水[INCI：水(AQUA)]。

[0120] 当所有前述成分溶解后，Leciflor100 IP[INCI：卵磷脂(相E)在剧烈搅拌下下一点点地加入，直到完全溶解。然后，加入Labrasol[INCI：PEG-8辛酸/癸酸甘油酯](相F)并搅拌10-15分钟，以形成乳液。最终得到的组合物示于表5。

[0121] 表5

[0122]

[0123]

[0124] 将样品用钛探针均质化30秒。

[0125] 实施例8：制备结合至阳离子聚合物的实施例7的脂质体

[0126] 实施例7中获得的脂质体在缓慢搅拌下加入到 CT-50[INCI：水(AQUA)、淀粉羟丙基三甲基氯化铵、脲、乳酸钠、氯化钠、苯甲酸钠]中，脂质体:阳离子聚合物比例为95:5。

[0127] 实施例9：使用人原代皮下前脂肪细胞系，用ELISA(酶联免疫吸附测定法)比色试验研究脂连蛋白的蛋白水平的相对增加

[0128] 在脂肪细胞分化培养基中用根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株发酵提取物处理后，测定原代人脂肪细胞中脂连蛋白的蛋白水平的相对增加。仅用脂肪细胞分化培养基处理的细胞被用作基础对照。

[0129] 在96孔透明平板中在前脂肪细胞生长培养基中接种人前脂肪细胞(10,000细胞/孔，每个条件3孔)，细胞在37℃和95％空气和5％CO2的水饱和气氛中孵育24小时。孵育后，除去培养基，并将细胞与5μg/ml根据实施例1得到的发酵提取物在脂肪细胞分化培养基中孵育，以便诱导前脂肪细胞分化成脂肪细胞(在37℃和5％CO2中8天)。然后，收获培养物上清液，通过ELISA测定释放的脂连蛋白的量，并通过结晶紫染色测定法定量每孔的总细胞数目。ELISA结果相对于用于处理条件的总细胞数进行归一化，计算相对于基础对照的脂连蛋白的蛋白水平的相对增加。

[0130] 用ELISA定量脂连蛋白水平

[0131] 根据制造商的说明(R&D Systems)使用脂连蛋白ELISA检测试剂盒。简言之，将培养物上清液孵育在预包被了脂连蛋白捕获抗体的微量滴定板中。之后，用另一脂连蛋白检测性生物素缀合的特异抗体孵育孔。然后，向板中加入链霉亲和素-HRP(缀合链霉亲和素的辣根过氧化物酶)。最后，加入底物TMB(四甲基联苯胺)，发生颜色变化，与测试剂量中存在的脂连蛋白的量直接成正比。用硫酸溶液终止反应，在微板吸光度读取器(Multiskan-Thermo Electro Corporation)上在450nm处读取吸光度，其中在570nm处波长校正。

[0132] 通过结晶紫染色测定法测定总细胞数

[0133] 将含有细胞的平板(收获上清液用于ELISA测定后)与结晶紫溶液孵育。通过结晶紫染料溶液染色细胞的DNA。之后，去除结晶紫溶液，用Milli-Q水洗涤孔。被细胞吸收的结晶紫染料的量直接与每孔的细胞数目成正比。最后，当细胞干燥时，加入HCl溶液并在微平板吸光度读取器(Multiskan-Thermo Electro Corporation)上在630nm处读取吸光度。ELISA结果相对于测试剂量的总细胞数进行归一化，计算相对于基础对照的脂连蛋白的蛋白水平的相对增加，表6。

[0134] 表6

[0135]

[0136] 结果表明，根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202的短芽孢杆菌物种菌株的发酵提取物，在测试剂量下，增加人脂肪细胞培养物中的相对脂连蛋白水平。

[0137] 实施例10：通过免疫荧光研究人骨骼肌细胞中肌球蛋白表达的相对增加

[0138] 在脂肪细胞分化培养基中用根据实施例1获得的发酵提取物处理后，在用脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞中研究了慢骨骼肌肌球蛋白重链7(MYH7)的表达。只用未以发酵提取物处理的脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞，用作基础对照。

[0139] 在预先包被了涂层基质的带盖玻片的12孔透明平板中，将人骨骼肌细胞接种(10,000细胞/孔，每测试剂量2孔)在Muscle Cellutions生长培养基中，并孵育细胞48小时。24小时后，通过加入Muscle Cellutions分化培养基，启动分化程序。

[0140] 在分化10天后，除去培养基，细胞在37℃、5％CO2气氛中用脂肪细胞培养物上清液处理48小时，其中所述脂肪细胞培养物之前已用根据实施例1获得的发酵提取物处理了8天(脂肪细胞分化培养基中5μg/ml)。通过ELISA测试，使用特异性抗体，测定脂肪细胞培养物上清液中脂连蛋白的量。

[0141] 测定肌球蛋白的表达

[0142] 处理后，将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，并用4％多聚甲醛(PFA)固定。此步骤后，细胞与一抗小鼠单克隆抗体(抗慢骨骼肌肌球蛋白重链7(MYH7)抗体)在4℃过夜孵育。在第二天，细胞用PBS洗涤，二抗 594山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(红色荧光发
射染料)与一抗抗体在黑暗下孵育1小时。然后，用DAPI(4',6-二氨基-2-苯基吲哚)染色细胞，并在暗处封片。

[0143] 使用Zeiss荧光显微镜观察细胞，使用Zen软件捕获图像。为了验证在所有测试剂量中的细胞数量是可重叠的，用DAPI染色来揭示细胞核，并从每个测试剂量收集10个代表图像。从每个肌球蛋白荧光图像，定量ID(积分密度)值。使用ImageJ软件。一式两份地进行两个独立实验。相对基础对照，标化肌球蛋白水平的相对增加，表7。

[0144] 表7

[0145]

[0146] 得到的结果表明，相对于基础对照，用5μg/ml根据实施例1中得到的发酵提取物处理后含有高水平脂连蛋白的脂肪细胞培养物上清液，能够增加蛋白质肌球蛋白的表达水平高达69.78％。

[0147] 实施例11：研究用含有脂连蛋白的脂肪细胞培养物上清液处理的原代人骨骼肌细胞中柠檬酸合酶活性的相对增加

[0148] 在脂肪细胞分化培养基中用根据实施例1获得的发酵提取物处理后，在脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞中测定柠檬酸合酶活性的相对增加。用未以发酵提取物处理的脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞，用作基础对照。

[0149] 在6孔透明平板中人骨骼肌细胞接种(200,000细胞/孔，每个测试剂量2孔)在Muscle Cellutions生长培养基中，细胞在95％空气和5％CO2的水饱和气氛中在37℃培养48小时。然后，通过加入Muscle Cellutions分化培养基启动分化过程。分化72小时后，除去培养基，细胞与含有高水平脂连蛋白(由ELISA之前测定)的脂肪细胞培养物上清液孵育，其中所述脂肪细胞培养物之前已经用根据实施例1中得到的发酵提取物处理过8天(脂肪细胞分化培养基中5μg/ml)。在CO2培养箱中在37℃处理48小时后，裂解人骨骼肌细胞，通过BCA测定法(二辛可宁酸)测定其总蛋白质含量。所有裂解物稀释到相同的最终总蛋白浓度(用BCA测定法测定)，并定量相对于基础对照的柠檬酸合酶活性的相对增加。

[0150] 通过BCA测定法测定总蛋白

[0151] 根据制造商的说明(Thermo Scientific)使用BCA检测试剂盒。通过使用牛血清白蛋白(BSA)的标准品，通过比色反应，测定人骨骼肌细胞裂解物的总蛋白浓度。简言之，将标准品和样品分配到96-孔透明平板中。与工作试剂孵育后，在微板吸光度读取器(Multiskan-Thermo Electro Corporation)上在570nm处测量吸光度。

[0152] 柠檬酸合酶活性的测定

[0153] 根据制造商的说明(Sigma)使用柠檬酸合酶试剂盒。简言之，将细胞裂解物在96孔透明平板与含有乙酰辅酶A和DTNB(5,5'-二硫基二-(2-硝基苯甲酸))的反应混合物孵育。然后，加入柠檬酸合酶底物——草酰乙酸，发生颜色变化，与测试剂量中的柠檬酸合酶活性直接成正比。在微板吸光度读取器(Multiskan-Thermo Electro Corporation)上在405nm处读取吸光度。相对于基础对照，标化柠檬酸合酶活性的相对增加，表8。

[0154] 表8

[0155]

[0156] 结果表明，从根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202芽孢杆菌属菌株的细菌细胞外物质，在测试剂量，能够增加人骨骼肌细胞中的相对柠檬酸合酶活性。

[0157] 实施例12：研究用含有脂连蛋白的脂肪细胞培养物上清液处理的原代人骨骼肌细胞中ATP生成的相对增加

[0158] 在脂肪细胞分化培养基中用根据实施例1获得的发酵提取物处理后，在用脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞中测定了ATP生成的相对增加。用未以发酵提取物处理的脂肪细胞培养物上清液处理的人骨骼肌细胞，用作基础对照。

[0159] 在6孔透明平板中人骨骼肌细胞接种(200,000细胞/孔，每个测试剂量2孔)在Muscle Cellutions生长培养基中，细胞在37℃在95％空气和5％CO2的水饱和气氛中37℃孵育48小时。然后，通过加入Muscle Cellutions分化培养基，启动分化过程。分化72小时后，除去培养基，细胞与含有高水平脂连蛋白(先前由ELISA测定)的脂肪细胞培养物上清液孵育，其中所述脂肪细胞培养物之前已经用根据实施例1得到的发酵提取物处理过8天(脂肪细胞分化培养基中5μg/ml)。在CO2培养箱中在37℃处理48小时后，裂解人骨骼肌细胞，并通过特定的测定试剂盒定量产生的ATP，通过BCA测定总蛋白质含量。ATP结果相对于测试剂量的总蛋白质浓度进行归一化，并相对于基础对照，定量产生的ATP的相对增加。

[0160] 测量产生的ATP

[0161] 根据制造商的说明(Abcam)使用ATP检测试剂盒。简言之，将细胞裂解物与含有ATP探针、ATP转换物、Developer混合物和ATP测定缓冲液的反应混合物在96孔透明板中孵育，以产生产物，用自动平板荧光读取器(Clariostar-BMG)通过荧光定量该产物，其中设定530nm激发和590nm检测。

[0162] 通过BCA测定法测定总蛋白

[0163] 根据制造商的说明(Thermo Scientific)使用BCA检测试剂盒。通过使用牛血清白蛋白(BSA)的标准品，通过比色反应，测定人骨骼肌细胞裂解物的总蛋白浓度。简言之，将标准品和样品分配到96-孔透明平板中。与工作试剂孵育后，在微板吸光度读取器(Clariostar-BMG)上在570nm处测量吸光度。ATP结果用测试剂量的总蛋白质浓度进行归一化，并相对于基础对照，定量产生的ATP的相对增加，表9。

[0164] 表9

[0165]

[0166] 结果表明，从根据实施例1获得的保藏号LMG P-28202芽孢杆菌属菌株的细菌细胞外物质，在测试剂量，能够增加人骨骼肌细胞中ATP的相对生成。

[0167] 实施例13：研究原代人皮下前脂肪细胞的基因表达谱

[0168] 人皮下前脂肪细胞以130,000细胞/孔的密度接种在12孔平板的PGM-2(基础培养基PBM-2，补充有10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和100单位/mL庆大霉素/anfotericine)中，细胞在37℃、在95％空气和5％CO2的水饱和气氛中孵育24小时。

[0169] 24小时后除去培养基，细胞与14μg/ml根据实施例1获得的发酵提取物在分化培养基PDM-2(PGM-2，补充有胰岛素、地塞米松、吲哚美辛(Indomethacin)和IBMX)中或仅在PDM-2(基础对照)中、在CO2培养箱中在37℃孵育8天。根据实施例1获得的发酵提取物和基础对照在4个生物样本重复(孔)中进行测试。

[0170] 然后，将细胞裂解，并通过Qiagen的RNeasyPlus Mini试剂盒从每个重复和每个测试剂量提取RNA并纯化。细胞裂解物匀浆化并失活RNA酶。使用RNeasyPlus Mini试剂盒的gDNA消除离心柱从样品中除去基因组DNA。然后，使样品通过RNeasyPlus Mini试剂盒的特异性RNA结合柱，几次微离心洗涤后，用50μl超纯水洗脱纯化的RNA。

[0171] 通过分光光度计(NanoDrop)以及使用生物分析仪(Agilent Bioanalyzer)评估获得的RNA的纯度、完整性和浓度。而后，标记样品和在人基因表达微阵列(ASurePrint G3，Agilent)中杂交。

[0172] 以测试剂量获得的归一化值与以基础对照获得的归一化值进行比较，以确定差异表达的基因。接着，Bioconductor软件进行数据的参数分析。

[0173] 然后，通过GSEA(基因集富集分析，Gene Set Analysis Enrichment)评估获得的值，以在基因本体和生物路线(Gene Ontology and Biological Routes)方面分组差异表达的基因。所得到的结果示于表10。

[0174] 表10

[0175]

[0176]

[0177]

[0178] 虽然为了举例说明本发明的目的，示出了某些有代表性的实施方案和细节，但显然对本领域技术人员而言可以在其中进行各种变化和修改，而不脱离本发明主题的范围。关于这方面，本发明的范围仅由下面的权利要求书限定。