用于诊断脑损伤或神经退行性变的方法和组合物
阅读：1003发布：2020-07-12
专利汇可以提供用于诊断脑损伤或神经退行性变的方法和组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供用于诊断对象的脑损伤、 神经退行性变 ；或其倾向的方法和组合物。特别地，本 发明 涉及可用于诊断对象的脑损伤、神经退行性变；或其倾向的特异性 抗原 抗体 反应性 。，下面是用于诊断脑损伤或神经退行性变的方法和组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于诊断对象的脑损伤的方法，所述方法包含下列步骤：
(i)从对象获取样本；
(ii)确定所述样本中的抗体对选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或其组合所组成群组中的至少一种抗原的反应性；以及(iii)将所述样本中的所述抗体的反应性与健康对照的反应性比较；
其中，与所述健康对照的所述反应性相比，所述样本中所述抗体的显着差异的反应性是所述对象患有脑损伤的指征。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体的所述反应性包含IgG反应性和IgM反应性。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述样本中的所述抗体的所述显着差异的反应性包含差异性的IgG反应性和IgM反应性。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述脑损伤是选自由下列所组成的群组：脑震荡、慢性创伤性脑病、轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤、头部创伤、震荡性损伤及脑神经退行性病症。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述脑神经退行性病症进一步包括记忆或运动功能的衰退。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述神经退行性病症选自下列所组成的群组：阿兹海默症、亨廷顿症、帕金森症、脱髓鞘病、HTLV-1相关的脊髓病(HAM)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、损伤或创伤后的病理学神经学症状、脑病和病毒性脑病。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述样本是选自下列所组成的群组：血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿液和唾液样本。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述样本是血清样本。
9.如权利要求1所述的方法，其中，健康对照的反应性是选自下列所组成的群组：至少一位健康个体的反应性、来自相同个体的基线样本、来自健康个体集合的一组对照样本、及来自健康对照个体的一组存储数据。
10.如权利要求1所述的方法，包含确定所述样本中抗体对复数种抗原的反应性。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述复数种抗原是以抗原探针集合、抗原阵列、或抗原芯片的形式使用。
12.如权利要求1所述的方法，进一步包含测量所述样本中的一种或多种生物标记物的水平；以及将所述一种或多种生物标记物的所述水平与相同生物标记物的与患有脑损伤的对象关联的预先定义的水平比较及与相同生物标记物的与健康对照关联的预先定义的水平比较，其中与所述预先定义的水平中的一者的关联提供了所述诊断。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述一种或多种生物标记物是选自由下列所组成的群组：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
14.一种抗原探针集合，包含复数种选自由下列所组成的抗原探针：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或其组合。
15.一种制品，包含如权利要求14所述的抗原集合。
16.如权利要求15所述的制品，进一步包含选自由下列所组成组的一种或多种生物标记物：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
17.如权利要求15所述的制品，是抗原探针阵列形式或抗原芯片形式或浸染棒形式或侧流测试形式。
18.如权利要求17所述的制品，是试剂盒形式，所述试剂盒进一步包含用于实施如权利要求1所述方法的手段，或使用该试剂盒诊断脑损伤的使用说明书。
19.一种描述对象脑损伤状态的方法，所述方法包含下述步骤：
(i)从所述对象获取样本；
(ii)测定所述样本中的抗体对选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或其组合所组成群组中的至少一种抗原的反应性；以及将所述样本中的所述抗体的所述反应性与选自有脑损伤、无脑损伤、脑损伤倾向、亚急性脑损伤、急性脑损伤、创伤后脑损伤、进行性脑损伤、退化性脑损伤、亚临床脑损伤、轻度脑损伤、中度脑损伤、重度脑损伤和慢性脑损伤所组成群组中的一种或多种脑损伤状态相关的预先定义的反应性比较，其中，与所述预先定义的反应性中的一者的关联确定了所述对象的所述脑损伤状态。
20.如权利要求19所述的方法，进一步包含测量所述样本中的一种或多种生物标记物的水平；以及，将所述一种或多种生物标记物的水平与相同生物标记物的与一种或多种脑损伤状态关联的预先定义的水平比较，其中，与所述预先定义的水平中的一者的关联确定了所述对象的所述脑损伤状态。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述一种或多种生物标记物是选自由下列所组成的群组：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
22.一种检测对象从脑损伤恢复的方法，所述方法包含下述步骤：
(i)从所述对象获取样本；
(ii)测定所述样本中的抗体对选自由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:104、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或其组合所组成群组中的至少一种抗原的反应性；以及
(iii)将所述样本中的所述抗体的所述反应性与预先定义的反应性阈值比较；其中，所述样本中的所述抗体的相较于所述预先定义的反应性阈值的显着差异的反应性是所述对象体内从脑损伤恢复的指征。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述抗体的反应性包含IgG反应性和IgM反应性。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述样本中的所述抗体的所述显着差异的反应性包含不同的IgG反应性和IgM反应性。
25.如权利要求22所述的方法，进一步包含测量所述样本中一种或多种生物标记物的水平；以及，将所述一种或多种生物标记物的所述水平与相同标记物的与从脑损伤恢复相关联的预先定义的水平比较，其中，与所述预先定义的水平中的一者的关联是所述受验者从脑损伤恢复的指征。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述一种或多种生物标记物是选自由下列所组成的群组：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
27.如权利要求1、19或22中任一项所述的方法，其中，所述比较是使用至少一种分类算法执行的。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述至少一种分类算法是选自由下列所组成的群组：决策树分类法、逻辑回归分类法(LR)、最近邻分类法、神经网络分类法、高斯混合模型(GMM)、支持向量机(SVM)分类法、最小中值距离分类法、线性回归分类法、线性判别分析(LDA)分类法、二次判别分析(QDA)分类法、和随机森林分类法。
用于诊断脑损伤或神经退行性变的方法和组合物
技术领域
[0001] 本发明涉及用于诊断脑损伤、神经退行性变、或其倾向的方法和组合物，更具体地，涉及用于确定脑损伤或神经退行性变的存在和类型的临床方法。
背景技术
[0002] 脑损伤是复杂的，且可能具有多种严重的临床结局。大脑和脊髓的损伤可能是来自头部创伤、卒中、出生时创伤(traumatic birth)、心脏手术、心搏停止、及需要使用心室辅助装置或体外模式氧合(ECMO)支持的患者。
[0003] 每年大约170万美国人遭受轻度至重度的创伤性脑损伤(TBI)，而且这一数字并不包括大约360,000位牵涉入战斗作业的士兵和从恐怖袭击中幸存的公共安全工作者，而这
些人发展出爆炸(震荡)冲击的继发性轻度TBI。这造成了全部损伤相关死亡中的大约30％，且每年耗费约600亿美元。至少230,000人由于TBI住院治疗且存活；超过一百万人进行TBI
的急诊(ED)治疗，且80,000至90,000美国人承受由TBI造成的长期失能。
些人发展出爆炸(震荡)冲击的继发性轻度TBI。这造成了全部损伤相关死亡中的大约30％，且每年耗费约600亿美元。至少230,000人由于TBI住院治疗且存活；超过一百万人进行TBI
的急诊(ED)治疗，且80,000至90,000美国人承受由TBI造成的长期失能。
[0004] 近年来进行了研究以确定TBI评估在美国急诊中的维度。每年对480万随访者进行TBI评估；而在82％的TBI评估(每年390万随访者)中进行了头部CT扫描。52％的评估(每年
250万随访者)中诊断出TBI。接受头部CT扫描的那些人中，9％具有创伤性异常情况的CT证
据。在已经拥有格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale)分数记录的进行TBI评估的患者
中，94.5％分类为患有轻度TBI，2.1％患有中度TBI，且3.5％患有重度TBI。在患有《国际疾病分类(第九修订临床修正版)》(Classification of Diseases,Ninth Revision,
Clinical Modification)中疾病的患者中，头部简略损伤尺度(Abbreviated Injury
Scale)分数计算为9.0％、85.0％、2.5％、3.2％、0.3％、及0％的代码分别具有1、2、3、4、5、和6的头部简略损伤尺度分数。在进行TBI评估的患者中，31％具有其它头部/面部/颈部损
伤，10％具有脊椎和背部损伤，7％具有躯干损伤，且14％具有极端损伤(Korley et al.,
Sep 10,2015,J Head Trauma Rehabil)。
250万随访者)中诊断出TBI。接受头部CT扫描的那些人中，9％具有创伤性异常情况的CT证
据。在已经拥有格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma Scale)分数记录的进行TBI评估的患者
中，94.5％分类为患有轻度TBI，2.1％患有中度TBI，且3.5％患有重度TBI。在患有《国际疾病分类(第九修订临床修正版)》(Classification of Diseases,Ninth Revision,
Clinical Modification)中疾病的患者中，头部简略损伤尺度(Abbreviated Injury
Scale)分数计算为9.0％、85.0％、2.5％、3.2％、0.3％、及0％的代码分别具有1、2、3、4、5、和6的头部简略损伤尺度分数。在进行TBI评估的患者中，31％具有其它头部/面部/颈部损
伤，10％具有脊椎和背部损伤，7％具有躯干损伤，且14％具有极端损伤(Korley et al.,
Sep 10,2015,J Head Trauma Rehabil)。
[0005] TBI是钝击、摇晃或超压冲击头部的结果，其令脑功能紊乱。轻度TBI(mTBI)的子集已经表现更难以诊断TBI的部分。头部损伤的严重度是从精神状态或意识的简要变化到无意识和失忆症的范围内。在重度或多种震荡的情况下，可能出现具有毁灭性结果的人格改
变。认知减退被公认为损伤后症状的一部分。
变。认知减退被公认为损伤后症状的一部分。
[0006] TBI损伤的妥善处理需要对被影响结构的精确诊断。TBI中的损伤机制造成周边前庭神经机制、中枢前庭结构、眼球运动神经束(ocular-motor tracts)、小脑、以及与这些结构沟通的全部脑域中的多种异常情况。前庭神经缺陷的发作通常在损伤后7至10天内出现。
尽管有报导，眩晕症状在三个月后解决，15％的人在一年后仍具有顽固症状。
尽管有报导，眩晕症状在三个月后解决，15％的人在一年后仍具有顽固症状。
[0007] 目前，当有创伤性脑损伤的怀疑时，尤其主观且并非完全有效的诊断过程之一牵涉大量检查技术。该患者接受可能由下列组成的神经学检查：1)精神状态；2)运动功能；3)感觉检查；4)深部腱反射；5)站立、步态、和平衡；以及6)脑神经功能。该神经状态检查可包括：a)意识水平；b)短期和长期记忆；c)患者和住所信息；以及d)对头痛、眩晕、眼花等症状提出问题。此外，该患者也可进行放射学研究，该研究可包括头部的CT扫描、MRI、PET扫描。
已经有报导，在(尤其是轻度)创伤性脑损伤的早期，成像技术的敏感度可能不足以检测异
常情况。此外，患者的认知能力最初可能未受损，且如果有症状，可能存在很少的症状。一般观察患者24至48小时，并每隔一段时间(如，每3至4小时)唤起患者，以确保他们能被唤醒。
不给予用于头痛或其它疼痛的麻醉剂，因此，他们的作用不会遮蔽患者清醒状态的问题。一般采用测定认知水平和反应时间的计算机测试来重复检查。
已经有报导，在(尤其是轻度)创伤性脑损伤的早期，成像技术的敏感度可能不足以检测异
常情况。此外，患者的认知能力最初可能未受损，且如果有症状，可能存在很少的症状。一般观察患者24至48小时，并每隔一段时间(如，每3至4小时)唤起患者，以确保他们能被唤醒。
不给予用于头痛或其它疼痛的麻醉剂，因此，他们的作用不会遮蔽患者清醒状态的问题。一般采用测定认知水平和反应时间的计算机测试来重复检查。
[0008] 使用这一途径诊断潜在的创伤性脑损伤的问题之一是，该途径并不总是提供精确、及时的客观信息。该途径也存在源自人与人之间的个体差异。此外，如果一个人在当时无症状，则结论可能是并不存在问题，且该个体可能被鼓励回归正常活动。这一引导可能对该人的健康有潜在损伤，且甚至可能导致致命性后果。
[0010] 尽管存在前述已知规程，对于早期且有效地确定个体是否罹患脑损伤、其可能的严重程度的方法以及一旦发现该损伤存在时有效治疗该患者的方法仍存在非常实际且本
质的需求。
质的需求。
发明内容
[0012] 本发明的抗原探针集合可用以概括，在罹患脑损伤或神经退行性变疾病的患者体内，由于破坏解剖结构的任何或全部组分以及检测跨越血脑屏障的要素的能力而得的抗体
对于所述抗原的应答。这一抗体应答概况(profile)可用于诊断、监控及管理脑损伤。根据一些具体实施例，该抗体模式反映了在损伤当时的患者状态。该抗体应答的模式可在任何
平台上测量，该平台包括但不限于微阵列或任何阵列芯片。
对于所述抗原的应答。这一抗体应答概况(profile)可用于诊断、监控及管理脑损伤。根据一些具体实施例，该抗体模式反映了在损伤当时的患者状态。该抗体应答的模式可在任何
平台上测量，该平台包括但不限于微阵列或任何阵列芯片。
[0013] 本发明部分地基于将罹患脑损伤的患者的抗体反应性与健康对照的对比测试而获取的意外结果。令人惊奇的是，在所测试的脑损伤患者中，发现了与健康对照不同的对于特定抗原的免疫球蛋白G(IgG)反应性和IgM反应性。本发明还基于下述发现：将对于个体对特定脑相关分子的抗体应答模式的分析与免疫应答标记物组合，提供了新颖、可靠的探知
脑损伤和其它神经退行性变病症的特性和程度的方法。因此，本发明提供指征脑损伤的独
特抗原。本发明进一步提供与脑损伤相关的抗原-自身抗体反应性模式。特定的具体实施例中，本发明提供用于诊断或健康脑损伤的高度特异性、可靠、准确及有辨识力的化验，该化验基于该指征性抗原或其反应性模式而进行。根据一些具体实施例，监控在损伤当时的患
者状态的“预先存在”。
脑损伤和其它神经退行性变病症的特性和程度的方法。因此，本发明提供指征脑损伤的独
特抗原。本发明进一步提供与脑损伤相关的抗原-自身抗体反应性模式。特定的具体实施例中，本发明提供用于诊断或健康脑损伤的高度特异性、可靠、准确及有辨识力的化验，该化验基于该指征性抗原或其反应性模式而进行。根据一些具体实施例，监控在损伤当时的患
者状态的“预先存在”。
[0014] 因此，根据本发明的一些具体实施例，提供了用于诊断和监控脑损伤进展的新颖方法。根据本发明的一些具体实施例，该方法包含测定从对象获取或派生的抗体对于本文
中揭示的至少一种抗原的反应性。本发明的方法进一步包含将样本中抗体对至少一种抗原
的反应性与对照物对于所述至少一种抗原的反应性比较的步骤。根据某些具体实施例，与
健康对照的反应或来自相同患者的基线样本的反应性相比，样本中抗体的显着差异的反应
性，是该对象为脑损伤所苦的指征。
中揭示的至少一种抗原的反应性。本发明的方法进一步包含将样本中抗体对至少一种抗原
的反应性与对照物对于所述至少一种抗原的反应性比较的步骤。根据某些具体实施例，与
健康对照的反应或来自相同患者的基线样本的反应性相比，样本中抗体的显着差异的反应
性，是该对象为脑损伤所苦的指征。
[0015] 根据某些具体实施例，来自相同患者的基线样本可用于[随时间而测量]，以预测事件的进展、解决以及病程的缓解。
[0016] 根据某些具体实施例，本发明的方法可区别哪些具有脑损伤的患者需要进行头部CT扫描，以将颅内出血与仅存脑震荡区隔。如果作为初始应答(如，在急诊科(ED)环境)或后期应答(如，神经内科)而实施，本发明的方法将减少头部CT扫描的使用，从而减少医疗保健费用和辐射曝露。
[0017] 因此，根据第一方面，本发明提供诊断对象脑损伤的方法，该方法包含下述步骤：从该对象获取样本；确定样本中的抗体与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或其组合所组成群组中的至少一种抗原的反应性；以及，将该样本中抗体的反应性与健康对照的反应性比较；其中，与健康对照的反应性相比，样本中抗体的显着差异的反应性是该对象患有脑损伤的指征。
[0018] 某些具体实施例中，该至少一种抗原是选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、或其任意组合所组成的群组。
[0019] 某些具体实施例中，所述方法进一步包含测量该样本中一种或多种生物标记物的水平；以及将该一种或多种与相同生物标记物的与患有脑损伤的对象关联的预先定义的水
平与相同生物标记物的与健康对照关联的预先定义的水平比较，其中与预先定义中的一种
水平的关联提供了该诊断。
平与相同生物标记物的与健康对照关联的预先定义的水平比较，其中与预先定义中的一种
水平的关联提供了该诊断。
[0020] 某些具体实施例中，所述脑损伤是选自由下列所组成的群组：脑震荡、慢性创伤性脑病、轻度创伤性脑损伤、中度创伤性脑损伤、重度创伤性脑损伤、头部创伤、震荡性损伤及脑神经退行性病症。
[0021] 某些具体实施例中，所述脑损伤造成血脑屏障的破坏。
[0022] 某些具体实施例中，该脑神经退行性变病症进一步包含记忆或运动功能的衰退和认知减退。
[0023] 某些具体实施例中，该神经退行性病症是选自由下列所组成的群组：阿兹海默症、亨廷顿症、帕金森症、脱髓鞘病、HTLV-1相关的脊髓病(HAM)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、损伤或创伤后的病理学神经学症状、脑病和病毒性脑病。
[0024] 某些具体实施例中，样本中抗体的反应性显着高于健康对照的反应性，是对象受苦于脑损伤的可能性增加的指征。其它某些具体实施例中，若样本中抗体的反应性并未显
着高于健康对照的反应性，妥样本中抗体的反应性与健康对照的反应性相同，若样本中抗
体的反应性低于健康对照的反应性，或者，样本中抗体的反应性显着低于健康对照的反应
性，是对象受苦于脑损伤的可能性降低的指征。每一可能性均代表本发明的一种独立具体
实施例。
着高于健康对照的反应性，妥样本中抗体的反应性与健康对照的反应性相同，若样本中抗
体的反应性低于健康对照的反应性，或者，样本中抗体的反应性显着低于健康对照的反应
性，是对象受苦于脑损伤的可能性降低的指征。每一可能性均代表本发明的一种独立具体
实施例。
[0025] 本发明方法的某些具体实施例中，该方法是以包含从对象获取或得到样本的步骤为先导。某些具体实施例中，该样本是通过非侵入性手段或方法从对象获取或得到的。
[0026] 某些具体实施例中，所述获取在头部受创2小时内完成。某些具体实施例中，所述获取在头部受创4小时内完成。某些具体实施例中，所述获取在头部受创24小时内完成。某些具体实施例中，所述获取在头部受创72小时内完成。某些具体实施例中，所述获取在急症护理过程中完成。
[0027] 某些具体实施例中，该对象在所述获取的时间是清醒的。
[0028] 某些具体实施例中，测定样本中抗体对复数种抗原的反应性，产生了用于对象脑损伤的诊断的反应性模式。因此，根据本发明的例示性具体实施例，将该样本中抗体对于复数种抗原的反应性模式与健康对照对象的样本中抗体对于所述复数种抗原的反应性模式
比较，其中，该样本的反应性模式与健康对照的反应性模式间的显着差异表明，该对象受苦于脑损伤，或在其它具体实施例中，具有脑损伤的可能性增加。传统上，使用例如本文中揭示的学习和模式识别算法来计算并比较该反应性模式。
比较，其中，该样本的反应性模式与健康对照的反应性模式间的显着差异表明，该对象受苦于脑损伤，或在其它具体实施例中，具有脑损伤的可能性增加。传统上，使用例如本文中揭示的学习和模式识别算法来计算并比较该反应性模式。
[0029] 根据另一具体实施例，该反应性包含IgG反应性和IgM反应性。根据另一具体实施例，样本中抗体的显着较高的反应性包含差异性的IgG反应性及/或IgM反应性。根据另一具体实施例，该增加的IgM反应性是相对于选自下列所组成组的至少一种抗原的：SEQ ID NO:
1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。根据另一具体实施例，该增加的IgG反应性是相对于选自下列所组成组的至少一种抗原的：SEQ ID
NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。根据另一具体实施例，该增加的IgG反应性是相对于选自下列所组成组的至少一种抗原的：SEQ ID
NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
[0030] 根据本发明方法的另外的具体实施例，从对象获取的样本是生物体液。根据一些具体实施例，该样本是选自血浆、血清、血液、脑脊液、滑液、精液、尿液、唾液、泪液、淋巴样本、或该领域中已知的任何其它生物体液。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
根据某些具体实施例，从对象获取的样本选自血清、血浆和血液组成的群组。根据一种具体实施例，该样本是血清样本。某些具体实施例中，通过非侵入性手段或方法从对象获取或派生样本。
根据某些具体实施例，从对象获取的样本选自血清、血浆和血液组成的群组。根据一种具体实施例，该样本是血清样本。某些具体实施例中，通过非侵入性手段或方法从对象获取或派生样本。
[0031] 根据本发明方法的某些具体实施例，该对照选自下列所组成的群组：来自至少一个健康个体的样本、来自相同对象的基线样本、来自一群健康个体的一组对照样本、以及存储的来自健康个体的数据集。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。典型地，健康个体是不受苦于脑损伤的对象。另一具体实施例中，健康个体是不受苦于神经退行性变疾
病的对象。
病的对象。
[0032] 根据另一具体实施例，该方法包含测定该样本中抗体对于复数种抗原的反应性。
[0033] 根据另一具体实施例，该方法包含测定样本中抗体对于选自由下列所组成群组的至少一种抗原的反应性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构
体、其片段、或前述任意组合。根据另一具体实施例，该方法包含测定样本中抗体对于选自下列所组成组的至少两种抗原的反应性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。
体、其片段、或前述任意组合。根据另一具体实施例，该方法包含测定样本中抗体对于选自下列所组成组的至少两种抗原的反应性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。
[0034] 根据另一具体实施例，该复数种抗原是以抗体探针集合、抗原阵列、或抗原芯片的形式使用。
[0035] 根据另一方面，本发明提供抗原探针集合，其包含选自由下列所组成群组的复数种抗原：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合。另一具体实施例中，该抗原探针集合包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合的抗原探针。
[0036] 根据另一方面，本发明提供包含上文揭示的抗原探针集合的制品。
[0037] 某些具体实施例中，该制品进一步包含选自由下列所组成群组的一种或多种生物标记物：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
[0038] 某些具体实施例中，该制品是抗原探针阵列形式；或抗原芯片形式；或浸染棒形式；或侧流测试形式；或ELISA板形式；或Quanterix系统、Agilent读板器、介观尺度诊断平台、或该领域技术人员所知的任何其它平台形式。某些具体实施例中，该制品是试剂盒形
式。
式。
[0039] 根据某些具体实施例，该试剂盒进一步包含测定样本中抗体对于复数种抗原中至少一种抗原的反应性的手段。根据另一具体实施例，该试剂盒进一步包含测定不同样本中
抗体对于复数种抗原中至少一种抗原的反应性的手段。根据另一具体实施例，该试剂盒进
一步包含使用该试剂盒诊断脑损伤的使用说明书。
抗体对于复数种抗原中至少一种抗原的反应性的手段。根据另一具体实施例，该试剂盒进
一步包含使用该试剂盒诊断脑损伤的使用说明书。
[0040] 根据另一方面，提供选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合所组成组的至少一种抗原的用途；其用于制备用于诊断对象脑损伤的诊断试剂盒。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。一些具体实施例中，该诊断试剂盒可用于测定样本中抗体的反应性，从而测定该样本对于该至少一种抗
原的反应性模式。一些具体实施例中，样本的反应性模式与对照样本的反应性模式之间的
显着差异(如，增加)是脑损伤的指征。
原的反应性模式。一些具体实施例中，样本的反应性模式与对照样本的反应性模式之间的
显着差异(如，增加)是脑损伤的指征。
[0041] 根据另一方面，提供一种描述对象脑损伤状态的方法，该方法包含下述步骤：从该对象获取样本；确定样本中的抗体与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的异构体、其片段、或前述任意组合所组成群组中的至少一种抗原的反应性；以及，将样本中抗体的反应性与和选自由脑损伤、无脑损伤、脑损伤倾向、亚急性脑损伤、急性脑损伤、创伤后脑损伤、进行性脑损伤、退化性脑损伤、亚临床脑损伤、轻度脑损伤、中度脑损伤、重度脑损伤和慢性脑损伤所组成群组的一种或多种脑损伤状态相关的预先定义的反
应性比较，其中，与预先定义的反应性之一的关联确定了该对象的脑损伤状态。
应性比较，其中，与预先定义的反应性之一的关联确定了该对象的脑损伤状态。
[0042] 某些具体实施例中，所述方法进一步包含测量该样本中一种或多种生物标记物的水平；以及，将该一种或多种生物标记物的水平与预先定义的相同生物标记物与一种或多
种脑损伤状态关联的水平比较，其特征在于，与预先定义的水平之一的关联确定了该对象
的脑损伤状态。
种脑损伤状态关联的水平比较，其特征在于，与预先定义的水平之一的关联确定了该对象
的脑损伤状态。
[0043] 根据另一方面，一种检测对象体内从脑损伤恢复的方法，该方法包含下述步骤：从该对象获取样本；测定该样本中的抗体与选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或其组合所组成组的至少一种抗原的反应性；以及，将该样本中抗体的反应性与预先定义的反应性阈值比较；其中，该样本中抗体的较之于该预先定义的反应性阈值显着差异的
反应性是所述对象体内从脑损伤恢复的指征。
反应性是所述对象体内从脑损伤恢复的指征。
[0044] 某些具体实施例中，所述方法进一步包含测量该样本中一种或多种生物标记物的水平；以及，将该一种或多种生物标记物的水平与预先定义的相同标记物的与从脑损伤恢
复相关联的水平比较，其特征在于，与预先定义的水平之一的关联是该受验者从脑损伤恢
复的指征。
复相关联的水平比较，其特征在于，与预先定义的水平之一的关联是该受验者从脑损伤恢
复的指征。
[0045] 某些具体实施例中，该一种或多种生物标记物选自下列所组成的群组：胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触核蛋白β(Sncb)、金属硫蛋白-3(MT3)、神经颗粒素(NRGN)、细胞间粘附分子-5(ICAM5)和脑源性神经营养因子(BDNF)、或其瓜氨酸化形式。
[0046] 某些具体实施例中，使用一种或多种抗体与一种或多种生物标记物的组合。
[0047] 根据某些具体实施例，该比较是使用至少一种分离算法执行的。
[0048] 根据某些具体实施例，该至少一种算法选自下列所组成的群组：决策树分类法、逻辑回归分类法、最近邻分类法、神经网络分类法、高斯混合模型(GMM)、支持向量机(SVM)分类法、最小中值距离分类法、线性回归分类法、线性判别分析(LDA)分类法、二次判别分析(QDA)分类法、和随机森林分类法。
附图说明
[0050] 图1例示性说明，在脑损伤后第30天，抗脂肪酸结合蛋白(FABP-3，SEQ ID No:61)IgM自身抗体的水平。格拉斯哥结局量表扩展(Glasgow Outcome Scale Extended(GOSE))
分数小于8的TBI患者(十字)表示比GOSE分数为8的患者(圆点)低的IgM水平。
分数小于8的TBI患者(十字)表示比GOSE分数为8的患者(圆点)低的IgM水平。
[0051] 图2例示性说明，在脑损伤后第30天，抗髓磷脂碱性蛋白(MBPR149，SEQ ID No:10)派生的BSA缀合肽IgM自身抗体的水平。格拉斯哥结局量表扩展(GOSE)分数小于8的TBI患者(十字)表示比GOSE分数为8的患者(圆点)低的IgM水平。
[0052] 图3例示性说明，从TBI患者(圆点)与健康对照(十字)获取的血清样本中抗髓过氧化物酶(MPO，SEQ ID No:85)IgM自身抗体的水平的比较。
[0053] 图4A例示性说明，在损伤后第30天和第90天，从TBI患者(圆点)(N＝142)与健康对照(十字)(N＝21)获取的血清样本中抗CMV(SEQ ID No:86)IgG自身抗体的水平的比较。
[0054] 图4B通过抗巨细胞病毒(CMV)IgG自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)曲线而显示上述分离性能。T测试分离P值为3.746E-07，FDR校正后为5.02E-05。
[0055] Kruskal-Wallis测试分离P值为4.567E-05，FDR校正后为0.0081593。
[0056] 图5A表明，基于在损伤后第30天从TBI患者获取的血清样本中抗TNFRSF12A(SEQ ID No:104)IgM自身抗体的水平，对TBI患者在损伤后第90天的临床状态的预测。将在损伤
后第90天具有GOSE<8的TBI患者(圆点)(N＝52)与在损伤后第90天具有GOSE＝8的TBI患者
(十字)(N＝15)比较。
后第90天具有GOSE<8的TBI患者(圆点)(N＝52)与在损伤后第90天具有GOSE＝8的TBI患者
(十字)(N＝15)比较。
[0057] 图5B通过抗TNFRSF12A IgM自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)曲线而显示上述分离性能。T测试分离P值为6.808E-06，FDR校正后为0.0036493。
[0058] Kruskal-Wallis测试分离P值为0.0004082，FDR校正后为0.1541973。
[0059] 图6显示六种分类方法(SVM、LR、QDA、CART、RF和LDA)的基于100次迭代的70:30交叉验证的受试者工作特征(ROC)曲线下面积。根据特征的中值得分或模型内含的频率而将特征排名，采用何种参数取决于所使用的方法。
[0060] 将在时间0(t0,N＝85)从TBI患者获取的血清样本与从健康对照(HC,N＝21)获取的血清样本比较。基于464iChip特征(232抗原、IgM和IgG)以及四种ELISA特征进行分析。
iChip数据是基于两个阻断复本的平均，再进行校正过程而获得。ELISA特征是基于数据可
应用性而选择的；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除
ELISA数据缺失的样本。
iChip数据是基于两个阻断复本的平均，再进行校正过程而获得。ELISA特征是基于数据可
应用性而选择的；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除
ELISA数据缺失的样本。
[0061] 图7显示，六种分类方法(SVM、LR、QDA、CART、RF和LDA)的基于100次迭代的70:30交叉验证的ROC曲线。根据特征的中值得分或模型内含的频率而将特征排名，采用何种参数取决于所使用的方法。将在时间0(t0)从TBI患者获取的CT结果异常的血清样本与在时间0(t0)从TBI患者获取的CT结果正常的样本比较。基于464iChip特征(232抗原、IgM和IgG)以
及四种ELISA特征进行分析。iChip数据是基于两个阻断复本的平均，再进行校正过程而获
得。ELISA特征是基于数据可应用性而选择的；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除ELISA数据缺失的样本。
及四种ELISA特征进行分析。iChip数据是基于两个阻断复本的平均，再进行校正过程而获
得。ELISA特征是基于数据可应用性而选择的；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除ELISA数据缺失的样本。
具体实施方式
[0062] 本发明提供诊断对象脑损伤或伸进退行性病变的方法。本发明进一步提供用于实践该诊断的抗原探针集合或阵列，且检定用于生成该集合或阵列的具体抗原探针集合。
[0063] 不欲受缚于任何理论或作用机制，本发明部分地基于对在健康对象与罹患脑损伤的患者间具有高度差异的独特抗原的发现。本发明进一步基于下述发现：罹患脑损伤的患
者血清中的抗体反应性概况明显不同于健康对照个体。尽管脑损伤患者的蛋白标记物已经
被广泛研究，本文中揭示的独特抗体免疫现象在之前未被揭示。较佳地，本公开的独特抗体现象对脑损伤的诊断提供高敏感性和特异性化验。
者血清中的抗体反应性概况明显不同于健康对照个体。尽管脑损伤患者的蛋白标记物已经
被广泛研究，本文中揭示的独特抗体免疫现象在之前未被揭示。较佳地，本公开的独特抗体现象对脑损伤的诊断提供高敏感性和特异性化验。
[0064] 一些具体实施例中，本发明提供独特的抗原-抗体反应性模式，特别是与脑损伤相关的模式。在具体抗体的研究进程中，发明人使用抗原微阵列和信息学分析，检查了健康人和被诊断具有脑损伤的那些人的血清中IgM和IgG相对于多种抗原的反应性。
[0065] 定义
[0067] 本文中使用的术语“约”意为数量术语加减5％，或在另一具体实施例中为加减10％，或在另一具体实施例中为加减15％，或在另一具体实施例中为加减20％。
[0068] 本文中，术语“自身抗体”指的是能与个体自身组织或细胞的抗原性构成进行对抗反应的抗体(如，识别并结合至“自身抗原”的抗体)。
[0069] 术语“脑损伤”指的是一种情况，该情况下，大脑因为由事件造成的损伤而受损。本文中所使用，“损伤”是细胞或分子完整性、活性、水平、鲁棒性、状态、或其它可追踪至事件的改变。例如，损伤包括细胞或分子特征的物理性、机械性、化学性、生物性、功能性、传染性、或其它调整。事件可包括物理性创伤如冲击(敲击或震荡)，或生物学异常情况如血管阻塞或渗漏造成的卒中。视需要，事件是通过传染因子(infectious agent)造成的传染。该领域技术人员知道术语损伤或事件所涵盖的众多等效事件。
[0070] 根据本发明的方法的一些具体实施例，也诊断健康对象将来脑损伤发作的倾向。根据一些具体实施例，所述倾向的原因是早前的损伤或家族史。
[0071] 更具体地，术语“脑损伤”指的是导致中枢神经系统受损的病症，而不考虑其病理生理学基础如何。“脑损伤”的最常见肇因是卒中和创伤性脑损伤(TBI)。“卒中”分为出血性卒中和非出血性卒中。出血性卒中的实例包括脑出血、蛛网膜下出血、及作为脑动脉畸形继发症的颅内出血，而非出血性卒中包括脑梗死。
[0072] 术语“脑损伤”也指的是亚临床脑损伤、及缺氧缺血性脑损伤。术语“亚临床脑损伤”(SCI)指的是不具有明显脑损伤临床证据的脑损伤。当脑损伤确实存在时，脑损伤临床证据的缺失可能是损伤程度、损伤类型、意识水平、以及药物治疗特别是镇静和麻醉造成的结果。这些原因多数可导致慢性创伤性脑病(CTE)。
[0073] 本文中所使用，术语“创伤性脑损伤”应意为由一次或多次直接或间接的冲击载荷造成的脑损伤，该冲击载荷被施加至脑而造成该载荷迅速移动且非自然地进入患者颅骨内，且创伤性脑损伤应明显包括，但不限于，通过下列造成的脑损伤：(a)贯穿颅骨的物体，如子弹、箭头、及其它穿过颅骨并进入脑内的物体；(b)施加至头部或患者身体其它部位的冲击载荷；(c)外科手术诱发的创伤；(d)造成个体站立处相对较近距离内大地重大震颤的
爆炸，如可能在战争中存在的通过手榴弹、炸弹、及其它爆炸物的冲击产生的爆炸，以及类似的由非爆炸手段如运动损伤、交通事故、建筑物倒塌和地震造成的震颤。创伤性脑损伤的结果可能是各种类型的，但在每个实例中，将包括脑正常工作的能力的临时性或永久性下
降且可造成死亡。
爆炸，如可能在战争中存在的通过手榴弹、炸弹、及其它爆炸物的冲击产生的爆炸，以及类似的由非爆炸手段如运动损伤、交通事故、建筑物倒塌和地震造成的震颤。创伤性脑损伤的结果可能是各种类型的，但在每个实例中，将包括脑正常工作的能力的临时性或永久性下
降且可造成死亡。
[0074] 由于对脑的冲击造成内皮细胞的渗透性增加，从而令流体可以从血管结构进入脑内，因此创伤性脑损伤的常见后果之一是脑内炎症的产生。这些渗漏出现的常见原因是创
伤造成血管孔隙度增加，从而令血清从血管渗漏至脑域中。随着这一机制的建立，可产生脑的炎症和肿胀，而这些可能需要手术干预。
伤造成血管孔隙度增加，从而令血清从血管渗漏至脑域中。随着这一机制的建立，可产生脑的炎症和肿胀，而这些可能需要手术干预。
[0075] 临床上，基于包括意识丧失(LOC)、格拉斯哥昏迷量表(GCS)和创伤后应激性失忆症的持续时间的TBI变量，创伤性脑损伤可分为轻度、中度或重度。
[0076] 本文中所使用，“二次脑创伤”指的是，在急性脑损伤后，即TBI的二次损伤期内，对患者脑部的损害。
[0077] “慢性创伤性脑病(CTE)”是在曝露于重复的头部碰撞的个体，如拳击手和足球运动员，死后尸检中最常被鉴定的神经退行性疾病。CTE的神经病理学特征为，与其它神经退行性疾病包括阿兹海默症截然不同的模式而过度磷酸化的tau蛋白的蓄积。CTE的临床特征
往往是累进性的，导致情绪、行为和认知的巨大改变，常常造成退行性痴呆的结果。一些例子中，也可能存在运动机能特征，包括震颤麻痹。
往往是累进性的，导致情绪、行为和认知的巨大改变，常常造成退行性痴呆的结果。一些例子中，也可能存在运动机能特征，包括震颤麻痹。
[0078] “非创伤性脑损伤”指的是并不牵涉局部缺血或外部机械力的脑损伤(如，卒中、阿兹海默症、帕金森症、亨廷顿症、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脑出血、脑感染等)。
[0079] “卒中”指的是作为脑内出血或梗死的结果的脑组织损毁。卒中是发达国家中死亡的首要肇因。卒中可能是脑部一个区域内血流减少或组织死亡(梗死)所造成的。卒中的肇因包括在脑内血管中形成的血块(血栓)和从其它位置移动到脑部的血块或多个动脉粥样
硬化斑块或其它材料(栓塞)。脑内流血(出血)也可造成类似卒中的症状。
硬化斑块或其它材料(栓塞)。脑内流血(出血)也可造成类似卒中的症状。
[0080] “阿兹海默症(AD)”是非常普遍的、仍不可逆的、进展性脑部疾病，其缓慢地摧毁记忆力和思考能力，并最终摧毁完成最简单任务的能力。AD是老年人群体中痴呆的最常见肇因，其造成认知功能性思考、记住、和推理能力的丧失，丧失程度为妨碍日常生活和活动。预测人数有所不同，但专家认为多达510万美国人可能患有AD。目前，对罹患AD或其早期阶段或具有家族性AD病史的人群、或罹患遗忘性轻度认知功能障碍(MCI)的人群进行的脑部成
像，正在开始检测其脑部的改变。AD的临床性痴呆与老年斑的明显病理学配合。AD的特征为淀粉体β在脑实质和脑毛细血管中的的异常蓄积和沉积，其导致血脑屏障(BBB)受损。
像，正在开始检测其脑部的改变。AD的临床性痴呆与老年斑的明显病理学配合。AD的特征为淀粉体β在脑实质和脑毛细血管中的的异常蓄积和沉积，其导致血脑屏障(BBB)受损。
[0081] 本文中所使用，“慢性脑损伤”指的是对象从损伤后三天即遭受脑损伤之苦，到至少12个月之前，仍持续存在脑损伤的症状。
[0082] 本文中所使用，“亚急性脑损伤”指的是对象在损伤后2至5天遭受脑损伤之苦。
[0083] 本文中所使用，“有意识的”具有传统意义，如Plum,et al.,The Diagnosis of Stupor and Coma,CNS Series,Philadelphia:Davis(1982)中所详述，该文献通过引用并
入本文。有意识的患者包括那些具有能证明其自我意识或所处环境的可靠、可再生、互动行为的患者。有意识的患者包括恢复意识且具有较不严重的脑损伤的患者，但不包括引物其
认知功能被损害而无法独立生活的患者。有意识的患者不包括展现觉醒状态但缺乏互动的
那些(如，被认为处于持续性植物状态的那些人)。
入本文。有意识的患者包括那些具有能证明其自我意识或所处环境的可靠、可再生、互动行为的患者。有意识的患者包括恢复意识且具有较不严重的脑损伤的患者，但不包括引物其
认知功能被损害而无法独立生活的患者。有意识的患者不包括展现觉醒状态但缺乏互动的
那些(如，被认为处于持续性植物状态的那些人)。
[0084] 在曝露于头部创伤后仍有意识的对象可能没有任何可观察的创伤性脑损伤症状。相反，该对象也可能展现多种脑损伤症状和认知功能障碍。
[0085] 这与在获取时没有意识的对象相反，该没有意识的对象以诸如脑震荡或颅内出血状况(如，轴向内血肿、硬膜外血肿、及硬脑膜下血肿)为指征。
[0086] 短语“脑损伤状态”包括状况的任何可区别的表现形式，该状况包括不具有脑损伤。例如，脑损伤状态包括而不限于，患者体内脑损伤的存在或不存在、发展出脑损伤的风险、脑损伤的节段或严重性、脑损伤的进展(如，脑损伤随时间的进展)和脑损伤治疗的有效性或应答(如，治疗后对脑损伤的临床跟踪和监督)。基于这一状态，可指明进一步的规程，包括另外的诊断性测试或治疗性规程或方案。
[0087] “脊髓损伤”指的是一种状况，在该状况下，脊髓受到由椎骨骨折或脱臼造成的压迫/磨损而造成机能障碍。本文中所使用，术语“缺氧缺血性脑损伤”指的是对脑组织的供氧匮乏导致脑功能受损，且包括脑缺氧。例如，缺氧缺血性脑损伤包括局灶性脑缺血、全局性脑缺血、乏氧性缺氧(即，环境中有限的氧造成脑功能的下降，如潜水员、飞行员、登山者、和消防员，全部处于这种脑缺氧的风险之下)、肺功能障碍(如，噎、勒杀、气管破碎造成的缺氧)。
[0088] 术语“脑损伤生物标记物(BIB)”、“脑损伤生物标记蛋白”、“脑损伤生物标记肽”、“脑损伤生物标记多肽”等指的是一种蛋白质，包括本文中揭示的那些，其可用于本发明的方法中如诊断患者的脑损伤。脑损伤生物标记蛋白包括，但不限于，SNCB、GFAP、S100B、MT3、ICAM5、BDNF、及/或NSE。该术语也包括该领域中已知的其它脑损伤生物标记蛋白，包括神经颗粒素(NRGN)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、PAD-2、微管蛋白β-4B链、微管蛋白α-IB链、CNPase、PPIA、Septin-7、伸长因子l-α2、TPPP、TPPP3、Ermin异构体2、NDRG2异构体2、星形肌动蛋白1(ASTN1)、脑血管生成抑制剂3(BAD)、肌肽二肽酶1(CNDP 1)、ERMTN、谷氨酸受体代谢型3(GRM3)、类科尔奇蛋白32(KLH32)、黑素瘤抗原家族E,2(MAGE2)、神经调节蛋白3(NRG3)、少突细胞髓磷脂糖蛋白(OMG)、溶质载剂家族39(锌转运子)、内质网膜蛋白1(RTN1)、及肽酰精氨酸脱亚氨酶(1型至4型、6型)(PAD)。
[0089] 此外，术语“脑损伤生物标记物”还包括前述任一者的异构体及/或转译后修饰的形式。本发明关注未修饰和修饰的(如，瓜氨酸化或其它转译后修饰)蛋白质/多肽/肽以及
对于前述任一者的自身抗体的检测、测量、定量、测定等。某些具体实施例中，理解为，关于对生物标记物的检测、测量、测定等，泛指对蛋白质/多肽/肽(修饰及/或未修饰)的检测。其它具体实施例中，关于生物标记物的检测、测量、测定等，泛指对该蛋白质/多肽/肽的自身抗体的检测。
对于前述任一者的自身抗体的检测、测量、定量、测定等。某些具体实施例中，理解为，关于对生物标记物的检测、测量、测定等，泛指对蛋白质/多肽/肽(修饰及/或未修饰)的检测。其它具体实施例中，关于生物标记物的检测、测量、测定等，泛指对该蛋白质/多肽/肽的自身抗体的检测。
[0090] 本文中所使用，术语“比较”指的是，对来自患者的样本中抗体的反应性与标准样本或对照样本中相应抗体的反应性如何关联做出评估。例如，“比较”可以指，评估来自患者样本的抗体对一种或多种抗原的反应性是否等于、高于或低于、或不同于来自标准样本或对照样本的相应抗体的反应性。更具体地，该术语可以指，评估来自患者的样本的抗体对于一种或多种抗原的反应性是否等于、高于或低于、不同于、或反而对应于(或不对应于)抗体的预先定义的反应性，该抗体的预先定义的反应性与例如具有亚临床脑损伤(SCI)、不具有SCI、响应对SCI的治疗、不响应对SCI的治疗、似乎响应/不响应特定的SCI治疗、或具有/不具有另一疾病或病症的患者相对应。
[0091] 本文中所使用，关于参数如来自患者的样本中抗体的经调整的反应性的术语“表明”或“相关”(根据语境，或“指示”或“关联”或“指征”或“相互关系”)，可以意为该患者具有脑损伤。具体的具体实施例中，该参数可包含抗体对本发明的一种或多种抗原的反应性。抗体对一种或多种抗原的特定反应性可表明患者具有脑损伤(即，与患者具有脑损伤相关)。
其它具体实施例中，抗体对一种或多种抗原的特定反应性可能与患者未受影响相关(即，表明患者不具有脑损伤)。某些具体实施例中，如根据本发明而使用的“表明”或“相关”，可以是通过描述抗体反应性水平与标准、对照或比较性值之间关系的任何线性或非线性的方
法，进行对该诊断的评估、脑损伤或脑损伤进展的预测、临床治疗功效的评估、对可能相应特定的治疗方案或药剂的患者的鉴定、监控治疗进展、以及在筛选化验情境中用于抗脑损
伤治疗性的鉴定。
其它具体实施例中，抗体对一种或多种抗原的特定反应性可能与患者未受影响相关(即，表明患者不具有脑损伤)。某些具体实施例中，如根据本发明而使用的“表明”或“相关”，可以是通过描述抗体反应性水平与标准、对照或比较性值之间关系的任何线性或非线性的方
法，进行对该诊断的评估、脑损伤或脑损伤进展的预测、临床治疗功效的评估、对可能相应特定的治疗方案或药剂的患者的鉴定、监控治疗进展、以及在筛选化验情境中用于抗脑损
伤治疗性的鉴定。
[0092] 根据一些具体实施例，对脑损伤进展的监控是在损伤后第7至20天的时间点进行的，在那时神经循环重新连接开始出现。根据一些具体实施例，预测到对于神经循环系统的损害。
[0093] 术语“患者”、“个体”、或“对象”在本文中可互换使用，且指的是哺乳动物，特别是人。该患者可能具有轻度、中度或重度疾病。该患者可以是初治、正在对任何形式的治疗产生应答、或难治。基于特定症状或家族史，该患者可以是需要治疗或需要诊断的个体。一些例子中，该术语可以指治疗实验动物、兽医应用中的动物、及用于疾病的动物模型研发中的动物，包括但不限于，啮齿动物，包括小鼠、大鼠和仓鼠；以及灵长类动物。
[0094] 本文中所使用，术语“健康对照”指的是健康个体；来自相同个体的基线；复数个健康个体；与一个或多个健康个体相关或自其获取的数据集合或值。
[0095] 本文中所使用，术语“扩展格拉斯哥结局量表(GOSE)”将TBI后的功能性失能分为级别1至8，其中，1为死亡，而8为恢复高于良好。将GOSE分数<8的定义为功能性失能。
[0096] 术语“测量”、“检测”和“测定”通篇可互换使用，且指代是包括获取患者样本并检测样本中抗体反应性的方法。一些具体实施例中，该术语指的是获取患者样本并检测该样本中抗体对一种或多种抗原的反应性。可通过该领域已知的方法和本文中进一步揭示的那
些来实施测量。
些来实施测量。
[0097] 术语“样本”、“患者样本”、“生物样本”等，涵盖从患者、个体或对象获取的多种样本类型，且可用于诊断或监控化验中。患者样本可从健康对象、患病的患者或具有脑损伤相关症状的患者获取。此外，从患者获取的样本可分成几部分，并仅将一部分用于诊断。再者，该样本或其部分可在一定条件下存储以保存样本以供后续分析。该定义具体地涵盖血液和生物来源的其它液体样本(包括但不限于，外周血、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、粪便和滑液)。特定具体实施例中，样本包含血液样本。另一具体实施例中，使用血清样本。该定义也包括已经在其取得之后以任何途径操作的样本，如通过离心、过滤、沉淀、渗析、色谱、使用试剂处理、洗涤、或富集某些细胞群体操作的样本。该术语进一步涵盖临床样本，还包括培养物中的细胞、细胞上清液、组织样本、器官等。样本也可包含新鲜冷冻及/或福尔马林固定、石蜡包埋的组织块，如从临床或活体组织切片制备的块，制备用于病理学分析或通过免疫组化进行研究。
[0098] 该样本可在采集后立即测试，或在4℃、-20℃、或-80℃储存后测试。在储存24小时、1周、1个月、1年、10年、或长达30年后测试。
[0099] 本发明的多种方法包括牵涉将值、水平、特征、特点、性质等与“适当对照”比较的步骤，本文中可互换地指代为“适宜对照”或“对照样本”。“适当对照”、“适宜对照”或“对照样本”是该领域技术人员所熟知的用于比较目标的任何对照或标准。一种具体实施例中，“适当对照”或“适宜对照”是在细胞、器官、或患者如对照或正常细胞、器官或患者中测定的展现俩人正常特质的值、水平、特征、特点、性质等。例如，来自未受影响的个体(UI)或正常对照个体(NC)(本文中两个术语可互换使用)的样本中抗体的反应性。另一具体实施例中，
“适当对照”或“适宜对照”是在对患者实施治疗(如，对脑损伤的治疗)之前测定的值、水平、特征、特点、性质等。又一具体实施例中，可在对细胞、器官、或患者给予治疗之前、之中或之后，测定转录速率、mRNA水平、转译速率、蛋白质水平、生物学活性、细胞特点或性质、基因型、表型等。再一具体实施例中，“适当对照”或“适宜对照”是预先定义的值、水平、特征、特点、性质等。“适当对照”可以是抗体对至少一种与脑损伤关联的抗原的反应性概况或模式，患者样本可与该至少一种抗原比较。该患者样本也可与阴性对照比较，该阴性对照即为与
不具有脑损伤相关联的概况。
“适当对照”或“适宜对照”是在对患者实施治疗(如，对脑损伤的治疗)之前测定的值、水平、特征、特点、性质等。又一具体实施例中，可在对细胞、器官、或患者给予治疗之前、之中或之后，测定转录速率、mRNA水平、转译速率、蛋白质水平、生物学活性、细胞特点或性质、基因型、表型等。再一具体实施例中，“适当对照”或“适宜对照”是预先定义的值、水平、特征、特点、性质等。“适当对照”可以是抗体对至少一种与脑损伤关联的抗原的反应性概况或模式，患者样本可与该至少一种抗原比较。该患者样本也可与阴性对照比较，该阴性对照即为与
不具有脑损伤相关联的概况。
[0100] 可使用该领域中广为人知的方法来纯化或合成待用于本发明化验中的抗原探针。例如，可使用已知的重组或合成方法生产抗原性蛋白或肽，该方法包括但不限于，固相(如，Boc或f-Moc化学)和溶液相合成方法(Stewart and Young,1963；Meienhofer,1973；
Schroder and Lupke,1965；Sambrook et al.,2001)。该领域技术人员将掌握所需要的专
门知识以获取或合成本发明的抗原探针。一些抗原探针也可商购，如从Sigma(St.Louis,
Mo.,USA)、Prospec(Ness-Ziona,Israel)、Abnova(Taipei City,Taiwan)、Matreya LLC
(Pleasant Gap,Pa.,USA)、Avanti Polar Lipids(Alabaster,Ala.,USA)、Calbiochem(San Diego,Calif.,USA)、Chemicon(Temecula,Calif.,USA)、GeneTex(San Antonio,Tex.,
USA)、Novus Biologicals(Littleton,Colo.,USA)、Assay Designs(Ann Arbor,Mich.,
USA)、ProSci Inc.(Poway,Calif.,USA)、EMD Biosciences(San Diego,Calif.,USA)、
Cayman Chemical(Ann Arbor,Mich.,USA)、HyTest(Turku,Finland)、Meridian Life
Science(Memphis,Tenn.USA)和Biodesign International(Saco,Me.,USA)获取，如下文详
述。
Schroder and Lupke,1965；Sambrook et al.,2001)。该领域技术人员将掌握所需要的专
门知识以获取或合成本发明的抗原探针。一些抗原探针也可商购，如从Sigma(St.Louis,
Mo.,USA)、Prospec(Ness-Ziona,Israel)、Abnova(Taipei City,Taiwan)、Matreya LLC
(Pleasant Gap,Pa.,USA)、Avanti Polar Lipids(Alabaster,Ala.,USA)、Calbiochem(San Diego,Calif.,USA)、Chemicon(Temecula,Calif.,USA)、GeneTex(San Antonio,Tex.,
USA)、Novus Biologicals(Littleton,Colo.,USA)、Assay Designs(Ann Arbor,Mich.,
USA)、ProSci Inc.(Poway,Calif.,USA)、EMD Biosciences(San Diego,Calif.,USA)、
Cayman Chemical(Ann Arbor,Mich.,USA)、HyTest(Turku,Finland)、Meridian Life
Science(Memphis,Tenn.USA)和Biodesign International(Saco,Me.,USA)获取，如下文详
述。
[0101] 应注意，本发明使用抗原探针及其同源物、片段、部分序列、突变形式、修饰形式和衍生物，只要这些同源物、片段、部分序列、突变形式、修饰形式和衍生物与这些抗原探针可免疫地交叉反应。本文中使用的术语“免疫地交叉反应”指的是，通过相同抗体特异性键结的两种或多种抗原。本文中使用的术语“同源物”指的是，具有与抗原氨基酸序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％一致性的肽。可通过大量免疫化验技术的任一者如竞争化验(测量所测试抗原竞争性抑制抗体与其已知抗原的结合的能力)测定交
叉反应性。
叉反应性。
[0102] 术语“肽”典型指的是长度最多为约50个氨基酸残基的多肽。根据特定的具体实施例，本发明的抗原性肽的长度可以是10至50个氨基酸，典型地，长度为约10至30个或约15至25个氨基酸。
[0103] 该术语涵盖原生肽(降解产物、合成性合成肽、或重组肽)、模拟肽(典型为合成性合成肽)、及肽类似物类肽和半类肽，且可具有例如令该肽在身体内更稳定或更能渗透入细胞内的修饰。此类修饰包括，但不限于：N端修饰；C端修饰；肽键修饰；骨架修饰；以及残基修饰。
[0104] 本发明中的肽抗原可具有末端羧基；可作为羧基酰胺使用；可作为还原的末端羟基使用；或可作为药学可接受的盐，如金属盐，包括钠盐、钾盐、锂盐或钙盐，或作为与有机酸的盐，或作为与矿物酸包括硫酸、盐酸或磷酸的盐，或作为与有机酸如醋酸或马来酸的
盐。根据一些具体实施例，本发明的肽抗原是BSA缀合肽。
盐。根据一些具体实施例，本发明的肽抗原是BSA缀合肽。
[0105] 功能性衍生物由对氨基酸侧链及/或羧基及/或所述肽的氨基部分的化学修饰组成。此类衍生化的分子包括，例如，其中游离氨基已经被衍生为形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。将游离的羧基可衍生以形成盐、甲酯、乙酯、或其它类型的酯或酰肼。将游离的羟基可衍生以形成O-酰基或O-烷基衍生物。
组氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-苄基组氨酸。还包括的化学衍生物为含有天然存在的
20种标准氨基酸残基或其修饰的氨基酸衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可以替代脯氨酸；羟基赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸；以及，鸟氨酸可以替代赖氨酸。
组氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-苄基组氨酸。还包括的化学衍生物为含有天然存在的
20种标准氨基酸残基或其修饰的氨基酸衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可以替代脯氨酸；羟基赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸；以及，鸟氨酸可以替代赖氨酸。
[0106] 除非明确排除，本文中揭示的氨基酸残基是“L”同分异构型式。然而，“D”同分异构型式的残基可替代任何L-氨基酸残基，只要该肽基本保留所希望的抗体特异性即可。
[0107] 通过当下标准肽合成方法和设备或重组方法可轻易合成适当的类似物。关于其氨基酸序列，全部这些类似物将主要基于本发明的抗原，但将具有一个或多个被删除、替代、或加入的氨基酸残基。当氨基酸残基被替代时，所设想的此类保守置换为那些并不显着改
变该多肽的结构或抗原性的置换。例如，碱性氨基酸将被替换为其它碱性氨基酸，酸性氨基酸被替换为其它酸性氨基酸，而中性氨基酸被替换为其它中性氨基酸。处理包含上述保守
替代的类似物之外，进一步设想了包含非保守氨基酸替代的类似物，只要这些类似物可与
本发明的肽抗原进行免疫交叉反应即可。
变该多肽的结构或抗原性的置换。例如，碱性氨基酸将被替换为其它碱性氨基酸，酸性氨基酸被替换为其它酸性氨基酸，而中性氨基酸被替换为其它中性氨基酸。处理包含上述保守
替代的类似物之外，进一步设想了包含非保守氨基酸替代的类似物，只要这些类似物可与
本发明的肽抗原进行免疫交叉反应即可。
[0108] 另一方面，提供编码这些肽的核酸、包含这些核酸的载体、以及含有该载体的宿主细胞。这些核酸、载体和宿主细胞可通过该领域中已知的重组技术轻易生产(间，如，Sambrook et al.,2001)。例如，编码本发明抗原的分离的核酸序列可从其天然来源作为完整(即，完全)基因或其一部分而获取。核酸分子也可使用重组DNA技术(如，聚合酶链反应
(PCR)扩增、克隆)或化学合成生产。核酸序列包括天然核酸序列及其同源物，包括但不限
于，天然等位基因突变体和修饰核酸序列，其中，核苷酸已经被插入、删除、替代、及/或反转，以此方式，这些修饰并不显着干扰该核酸分子编码本发明的功能性肽的能力。
(PCR)扩增、克隆)或化学合成生产。核酸序列包括天然核酸序列及其同源物，包括但不限
于，天然等位基因突变体和修饰核酸序列，其中，核苷酸已经被插入、删除、替代、及/或反转，以此方式，这些修饰并不显着干扰该核酸分子编码本发明的功能性肽的能力。
[0109] 本文中所使用，本发明的多肽或肽抗原的“功能等效突变体”是具有部分序列同源性的多肽或肽、具有一个或多个特异性保守及/或非保守氨基酸变化的多肽或肽、以及并不改变该多肽或肽的生物学性质或结构性质的多肽或肽缀合产物。
[0110] 对于术语“功能性类似物”，该领域技术人员很好地理解，生物学功能性多肽或肽类似物的定义中所固有的是下述概念，对于可在分子所定义部位内作成的且仍导致分子具有可接受的等效生物学活性水平的改变的数目存在限制。根据本发明，可容易做出和使用
复数种具有不同替代的有区别的多肽或肽。还应理解，某些残基对于多肽的生物学性质或
结构性质尤其重要，且这些残基通常不可交换。
复数种具有不同替代的有区别的多肽或肽。还应理解，某些残基对于多肽的生物学性质或
结构性质尤其重要，且这些残基通常不可交换。
[0111] 可通过保守或非保守氨基酸替代生成功能性类似物。氨基酸替代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、体积等。因此，在本发明的范畴内，保守氨基酸变化意为，特定位置的氨基酸变化为与最初存在者相同类型的氨基酸；
即，疏水性氨基酸交换为疏水性氨基酸，碱性氨基酸交换为碱性氨基酸等。保守替代的实例包括，非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替代为另一非极性(疏水性)残基；一个极性(亲水性)残基替代为另一个极性(亲水性)残基，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬氨酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间；一个碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替代为另一个碱性残基；一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸替代为另一个酸性残
基；支链氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸替代为另一个支链氨基酸；或者，一个芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸替代为另一个芳香族氨基酸。氨基酸的这些变化得到
了功能性类似物，其中，它们并不显着改变该多肽的整体电荷及/或构型。此类保守变化的实例是该领域技术人员所熟知的，且处于本发明的范畴内。保守替代也包括使用化学衍生
残基代替非衍生残基，但须满足，所得多肽与该多肽抗原是生物学功能等效的。
即，疏水性氨基酸交换为疏水性氨基酸，碱性氨基酸交换为碱性氨基酸等。保守替代的实例包括，非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替代为另一非极性(疏水性)残基；一个极性(亲水性)残基替代为另一个极性(亲水性)残基，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬氨酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间；一个碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替代为另一个碱性残基；一个酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸替代为另一个酸性残
基；支链氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸替代为另一个支链氨基酸；或者，一个芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸替代为另一个芳香族氨基酸。氨基酸的这些变化得到
了功能性类似物，其中，它们并不显着改变该多肽的整体电荷及/或构型。此类保守变化的实例是该领域技术人员所熟知的，且处于本发明的范畴内。保守替代也包括使用化学衍生
残基代替非衍生残基，但须满足，所得多肽与该多肽抗原是生物学功能等效的。
[0112] 因此，“瓜氨酸化多肽”涵盖一种多肽，该多肽所具有的氨基酸序列与本文中提供的序列的差别在于一个或多个保守氨基酸替代。瓜氨酸化多肽也涵盖一种具有与本文中提供的序列相差一个突变的氨基酸序列的多肽，其中，该一个突变表示一个氨基酸删除、插入或替代。
[0113] 可通过该领域技术人员已知的方法作成瓜氨酸化的肽，最特别且优选的是使用蛋白质化学领域广为人知的技术通过化学合成如固相合成(Merrifield et al,
65J.AM.CHEM.ASSOC.2149(1964)；Merrifield et al,85J.AMER.CHEM.SOC.2149(1963)；及Merrifield et al,35INT.J.PEPTIDE PROTEIN RES.161-214(1990))或在均相溶液合成
(METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY,E.Wansch(Ed.)Vol.15,pts.I and II,Thieme,
Stuttgart(1987))来生成合成肽。瓜氨酸是转译后修饰的精氨酸，它是通过由肽酰基精氨
酸脱亚氨酶4(PAD-4)催化的脱亚氨过程创建的，该过程从精氨酸移除一个正电荷并令所得
瓜氨酸事实上是极性的。
65J.AM.CHEM.ASSOC.2149(1964)；Merrifield et al,85J.AMER.CHEM.SOC.2149(1963)；及Merrifield et al,35INT.J.PEPTIDE PROTEIN RES.161-214(1990))或在均相溶液合成
(METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY,E.Wansch(Ed.)Vol.15,pts.I and II,Thieme,
Stuttgart(1987))来生成合成肽。瓜氨酸是转译后修饰的精氨酸，它是通过由肽酰基精氨
酸脱亚氨酶4(PAD-4)催化的脱亚氨过程创建的，该过程从精氨酸移除一个正电荷并令所得
瓜氨酸事实上是极性的。
[0114] 一种具体实施例中，可从已知的可商购来源制作瓜氨酸化的肽。在这方面，将冻干2+
蛋白质在适宜的加入有该肽酰基精氨酸脱亚氨酶4的缓冲液中重建。或者，将Ca 加入PAD-4溶液中。令该溶液在适宜温度静置一段时间，该时间足以造成精氨酸残基修饰为瓜氨酸并
因此创建瓜氨酸化的蛋白质。随后，使用高分子量膜移除该酶以分隔该酶或其它色谱方法
来分离瓜氨酸化的蛋白质。该领域技术人员将理解，可依据被脱亚氨化的蛋白质，改动培养温度、缓冲条件和培养时间(Masson-Bessiere et al,166J.IMMUNOL.4177-4184(2001))。
蛋白质在适宜的加入有该肽酰基精氨酸脱亚氨酶4的缓冲液中重建。或者，将Ca 加入PAD-4溶液中。令该溶液在适宜温度静置一段时间，该时间足以造成精氨酸残基修饰为瓜氨酸并
因此创建瓜氨酸化的蛋白质。随后，使用高分子量膜移除该酶以分隔该酶或其它色谱方法
来分离瓜氨酸化的蛋白质。该领域技术人员将理解，可依据被脱亚氨化的蛋白质，改动培养温度、缓冲条件和培养时间(Masson-Bessiere et al,166J.IMMUNOL.4177-4184(2001))。
[0115] 可通过基于其由序列决定的性质而选择的方法，进一步分离和纯化瓜氨酸化的蛋白质。可通过蛋白质纯化过程如色谱方法(凝胶过滤、离子交换、和免疫亲和性)、高效液相色谱(HPLC、RP-HPLC、离子交换HPLC、体积排阻HPLC、高效层析聚焦和疏水作用色谱)或通过沉淀(免疫沉淀)实现纯化。
[0116] 聚酰胺凝胶电泳也可用来基于蛋白质的分子量、电荷性质和疏水性而分离瓜氨酸化的蛋白质。经纯化的瓜氨酸化的蛋白质可用于进一步的生物化学分析中，以确立二级结
构和三级结构，而该结构可能有助于药物与该蛋白质相互作用、改变蛋白质电荷构型或与
其它蛋白质的电荷相互作用、或改变其功能。
构和三级结构，而该结构可能有助于药物与该蛋白质相互作用、改变蛋白质电荷构型或与
其它蛋白质的电荷相互作用、或改变其功能。
[0117] 本文中所使用，术语“寡核苷酸抗原”指的是，某一长度的邻接核苷酸的伸展。除非明确排除，本文中使用的术语“寡核苷酸抗原”涉及长度为15至40个核苷酸之间、或者长度为17至28个核苷酸之间、或长度为18至25个核苷酸之间的核苷酸序列。某些具体实施例中，寡核苷酸抗原由至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少16个、或更多个邻接核苷酸组成。每一种可能性表示本发明的一种独立具体实施例。某些具体实施例中，抗原由不超过50个、不超过45个、不超过40个、不超过35个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过16个、或更少个邻接核苷酸组成。每一种可能性表示本发明的一种独立具体实施例。某些具体实施例中，抗原由10至30个、15至25个、或17至20个邻接核苷酸组成。某些具体实施例中，抗原由17、18、19、或20个邻接核苷酸组成。
[0118] 本文中所使用，相对于“抗原”或“复数种抗原”的“样本中多种抗体的反应性”或“样本中抗体的反应性”指的是，样本中至少一种抗体性对于选自复数种抗原的至少一种特异性抗原的免疫反应性。该抗体相对于抗原的免疫反应性，即该抗体特异性结合至抗原的能力，可用来测定样本中该抗体的量。样本中每一种所测试抗体的计算水平，统统指代为该样本相对于这些抗原的反应性模式。该样本的反应性模式反映该样本中每一种所测试抗体
的水平，从而提供定量检验。优选的具体实施例中，该抗体被定量测定。
的水平，从而提供定量检验。优选的具体实施例中，该抗体被定量测定。
[0119] 在不同的具体实施例中，反应性模式间的“显着差异”指的是统计学显着差异，或在其它具体实施例中，指的是为该领域技术人员所公认的显着差异。其它具体实施例中，从对象获取的样本的反应性模式与对照反应性模式间的显着差异是该对象受苦于脑损伤的指征。特定具体实施例中，样本中抗体相对于抗原的反应性上调或更高的反应性指的是，比对照中抗原相对于抗原的反应性水平高(即，大)约至少2倍、约至少3倍、约至少4倍、或约至少5倍的增长(即，提升)。另一具体实施例中，样本中抗体相对于抗原的反应性下调或更低的反应性指的是，比对照中抗原相对于抗原的反应性水平低约至少2倍、约至少3倍、约至少
4倍、或约至少5倍的下降(即，减少)。
4倍、或约至少5倍的下降(即，减少)。
[0120] 根据一些具体实施例，该至少一种寡核苷酸抗原是包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接腺嘌呤核苷酸的寡核苷酸序列。根据另一具体实施例，该寡核苷酸序列包含至多20个邻接腺嘌呤核苷酸。根据另外的具体实施例，该至少一种寡核苷酸抗原是包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接胸腺嘧啶核苷酸的寡核苷酸序列。根据另一具体实施例，该寡核苷酸序列包含至多20个邻接胸腺
嘧啶核苷酸。
嘧啶核苷酸。
[0121] 根据另外的具体实施例，该至少一种寡核苷酸抗原是包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个邻接胞嘧啶核苷酸的寡核苷酸序列。根据另一具体实施例，该寡核苷酸序列包含至多20个邻接胞嘧啶核苷酸。根据另外的具体实施例，该至少一种寡核苷酸抗原是包含5至17、6至17、7至17、8至17、9至17、10至17、11至17、12至17、13至17、
14至17、15至17、16至17、或至多17个邻接鸟嘌呤核苷酸的寡核苷酸序列。
14至17、15至17、16至17、或至多17个邻接鸟嘌呤核苷酸的寡核苷酸序列。
[0122] 根据一些具体实施例，该至少一种抗原选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成的群组。
[0123] 根据一些具体实施例，该抗原选自蛋白质、寡核苷酸抗原、或其任意组合。
[0124] 应理解，根据本发明的每一抗原可与从所测试对象获取或排除的样本中发现或分离的IgM抗体及/或IgG抗体结合。由于针对某一表位或抗原的IgM抗体和IgG抗体的相对量
随时间进程而变，根据本发明的每一抗原可与IgM抗体、IgG抗体或两者结合。某些具体实施例中，抗体的反应性意为IgG抗体的反应性。某些具体实施例中，抗体的反应性意为IgM抗体的反应性。根据另一具体实施例，样本中抗体的显着较高的反应性意为增加的IgG反应性。
根据另一具体实施例，样本中抗体的显着较高的反应性意为增加的IgM反应性。
随时间进程而变，根据本发明的每一抗原可与IgM抗体、IgG抗体或两者结合。某些具体实施例中，抗体的反应性意为IgG抗体的反应性。某些具体实施例中，抗体的反应性意为IgM抗体的反应性。根据另一具体实施例，样本中抗体的显着较高的反应性意为增加的IgG反应性。
根据另一具体实施例，样本中抗体的显着较高的反应性意为增加的IgM反应性。
[0125] 根据另一具体实施例，该增加的IgM反应性是相对于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原的反应性。
[0126] 根据另一具体实施例，该增加的IgG反应性是相对于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原的反应性。
[0127] 某些具体实施例中，该增加的IgM和IgG反应性是相对于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原的反应性。某些具体实施例中，该增加的IgM反应性是相对于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原的反应性。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
[0128] 应理解，为了实施本发明的方法，从对象获取或派生的样本必须包含由该对象自身产生的抗体。因此，样本可从天然地包含该对象抗体至少一个子集的任何组织、器官或液体中获取或派生。某些具体实施例中，该取自对象的样本是生物体液。根据一些具体实施
例，该样本选自血浆、血清、血液、脑脊液、滑液、痰液、尿液、唾液、泪液、淋巴标本、或该领域中已知的任何其它生物体液所组成的群组。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施
例。根据某些具体实施例，该取自对象的样本选自血清、血浆和血液所组成的群组。根据一种具体实施例，该样本是血清样本。获取和分离适宜样本的方法完全处于该领域技术人员
的能力之内。
例，该样本选自血浆、血清、血液、脑脊液、滑液、痰液、尿液、唾液、泪液、淋巴标本、或该领域中已知的任何其它生物体液所组成的群组。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施
例。根据某些具体实施例，该取自对象的样本选自血清、血浆和血液所组成的群组。根据一种具体实施例，该样本是血清样本。获取和分离适宜样本的方法完全处于该领域技术人员
的能力之内。
[0129] 根据本发明方法的某些具体实施例，该对照选自下列所组成的群组：来自至少一个健康个体的样本、相同对象的基线、来自一群健康个体的一组对照样本、以及存储的来自健康个体的数据集。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。典型地，健康个体是未受苦于脑损伤的对象。
[0130] 特定的具体实施例中，使用至少85％、优选至少90％的阳性预测值(PPV)截留来测定该显着差异。测定对于所选标记物(如，抗原)的PPV是该领域技术人员所熟知的，且在下文揭示的方法中举例说明。典型地，若在具体研究子群中超过10％的对象中检出所选截留
值如PPV≥90％，则确定为抗原阳性。例如，当与不同测试组B比较时，如果在A组中检出至少
10％的对象的PPV≥90％，则确定A组为抗原i特异性表征组。A组中对于抗原i的PPV≥90％
截留的对象被认为是相对于抗原i为阳性。
值如PPV≥90％，则确定为抗原阳性。例如，当与不同测试组B比较时，如果在A组中检出至少
10％的对象的PPV≥90％，则确定A组为抗原i特异性表征组。A组中对于抗原i的PPV≥90％
截留的对象被认为是相对于抗原i为阳性。
[0131] 本文中所使用，“被指向”抗原的抗体是能特异性结合至该抗原的抗体。对抗体被指向复数种抗原的水平的测定，包括测量样本中每一抗体的水平，其中，每一抗体被指向本发明的具体抗原。典型使用免疫化验实施这一步骤，如本文中所详述。
[0132] 其它具体实施例中，通过包含下述的过程实施对样本中抗体相对于至少一种抗原的反应性(和样本中每一种所测试抗体的水平)的测定：在可形成特异性抗原-抗体复合物
的条件下，令该样本与至少一种抗原(或当使用复数种抗原时，与包含该复数种抗原的抗原探针集合)接触；以及，将关于每一抗原探针形成的抗原-抗体复合物的量进行定量。抗原-抗体复合物的量是样本中所测试抗体水平(或该样本与该抗原的反应性)的指征。
的条件下，令该样本与至少一种抗原(或当使用复数种抗原时，与包含该复数种抗原的抗原探针集合)接触；以及，将关于每一抗原探针形成的抗原-抗体复合物的量进行定量。抗原-抗体复合物的量是样本中所测试抗体水平(或该样本与该抗原的反应性)的指征。
[0133] 另一具体实施例中，该方法包含测定样本中至少一种IgG抗体和至少一种IgM抗体对于复数种抗原的反应性。另一具体实施例中，该方法包含测定样本中复数种IgG抗体和至少一种IgM抗原对于复数种抗原的反应性。另一具体实施例中，该方法包含测定样本中至少一种IgG抗体和复数种IgM抗体相对于复数种抗原的反应性。根据另一具体实施例，该方法
包含测定样本中抗体相对于复数种抗原的反应性。
包含测定样本中抗体相对于复数种抗原的反应性。
[0134] 典型地，使用免疫化验实施对样本中抗体对于至少一种抗原的反应性的测定。较佳地，当使用复数种抗原时，该复数种抗原可以抗原阵列的形式使用。
[0135] 抗原探针和抗原探针集合
[0136] 根据其它具体实施例，本发明提供可用于如本文所详述而用于诊断脑损伤的抗原探针和抗原探针集合。
[0137] 本发明进一步提供复数种抗原，本文中也指代为抗原探针集合。这些抗原探针集合包含复数种抗原，该抗原可与患有脑损伤的对象的血清进行特异性反应。根据本发明的
原则，该复数种抗原较佳可以抗原阵列形式使用。根据一些具体实施例，该抗原阵列以抗原芯片的形式便利地排列。
原则，该复数种抗原较佳可以抗原阵列形式使用。根据一些具体实施例，该抗原阵列以抗原芯片的形式便利地排列。
[0138] 本文中所使用，“探针”意为能特异性结合至一种组分的任何化合物。根据一方面，本发明提供包含选自下列所组成组的复数种抗原的抗原探针集合：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合。根据某些具体实施例，该抗原探针集合包含本发明抗原的子集。特定的具体实施例中，该抗原的子集由下列组成：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合。
[0139] 一些具体实施例中，抗原探针集合由多达300种抗原组成。一些具体实施例中，该抗原探针集合由2至5种抗原组成。
[0140] 根据另一具体实施例，本发明的方法包含测定样本中抗体对于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原的反应性。
[0141] 可根据该领域中已知的技术，测定本发明的抗体对于复数种抗原的反应性。
[0142] 优选地，本发明方法和试剂盒的复数种抗原包含一组本文中揭露的抗原。其它具体实施例中，该复数种抗原(或抗原探针集合)包含其子集或由其子集组成，如3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25,26、27、28、29、30、31、32、33,
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64、65、66或115中不同的抗原，各自选自本发明的抗原，其中，每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。可选择此类子集，以获得诊断化验的最佳灵敏度及/或特异性。
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25,26、27、28、29、30、31、32、33,
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、61、62、63、64、65、66或115中不同的抗原，各自选自本发明的抗原，其中，每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。可选择此类子集，以获得诊断化验的最佳灵敏度及/或特异性。
[0143] 待用于本发明化验中的抗原探针可使用该领域中众所周知的方法合成或纯化。
[0144] 应注意，本发明使用抗原探针及其同源物、片段和衍生物，只要这些同源物、片段和衍生物可与这些抗原探针进行免疫交叉反应即可。本文中所使用，术语“f”指的是，由相同抗体特异性结合的两种或更多种抗原。本文中所使用，术语“同源物”指的是，具有至少80％、至少85％或至少90％的与抗原序列或结构的一致性的抗原探针。通过大量免疫化验
技术如竞争化验(测量测试抗原竞争性抑制抗体与其已知抗原集合的能力)来测定交叉反
应性。
技术如竞争化验(测量测试抗原竞争性抑制抗体与其已知抗原集合的能力)来测定交叉反
应性。
[0145] 本文中所使用，术语“片段”指的是抗原的一部分或抗原类似物，其保留与抗原探针的免疫学交叉反应性，如免疫特异性识别靶标抗原。该片段可具有对应抗原长度的约80％、约85％、约90％、或约95％。
[0146] 根据另一方面，本发明提供抗原探针集合，其包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成组的复数种抗原探针。
[0147] 根据另一相关方面，本发明提供抗原探针集合，其包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合所组成组的至少一种抗原探针。
[0148] 根据另一方面，本发明提供一种制品，其包含上文揭示的至少一种抗原探针集合。
[0149] 某些具体实施例中，该制品是抗原探针阵列形式、或抗原芯片形式、或浸染棒形式、或侧流测试形式、或该领域技术人员所知的任何其它平台形式。“抗原探针阵列”通常指的是复数种抗体探针，其或在单一容器内混合或布置在一个或多个容器内。“抗原芯片”通常指的是其上附加或粘附有复数种抗原的大体上二维的表面。“浸染棒”通常指的是一种其上附加或粘附有复数种抗原的物体，将其浸没于液体中以实施化学测试或提供对该液体中
发现的数量的测量。“侧流测试”通常指的是装置，其打算用来检测样本(基质)中靶标分析质的存在(或不存在)而无需专业且昂贵的配置。某些具体实施例中，该制品是试剂盒形式。
发现的数量的测量。“侧流测试”通常指的是装置，其打算用来检测样本(基质)中靶标分析质的存在(或不存在)而无需专业且昂贵的配置。某些具体实施例中，该制品是试剂盒形式。
[0150] 根据某些具体实施例，该试剂盒进一步包含用于检测样本中抗体对于复数种抗原的至少一种抗原的反应性的手段。根据另一具体实施例，该试剂盒进一步包含用于将不同
样本中抗体对于复数种抗原的至少一种抗原的反应性进行比较的手段。根据另一具体实施
例，该试剂盒进一步包含使用说明书。例如，前述手段可包括试剂、可检测的标签及/或容器，其可用于测量抗体与本发明抗原探针的特异性结合。本文中所使用，“手段”也可指代用来实施生物学或化学化验的装置、试剂和化学品，如小瓶、缓冲液和书面协议或使用说明
书。
样本中抗体对于复数种抗原的至少一种抗原的反应性进行比较的手段。根据另一具体实施
例，该试剂盒进一步包含使用说明书。例如，前述手段可包括试剂、可检测的标签及/或容器，其可用于测量抗体与本发明抗原探针的特异性结合。本文中所使用，“手段”也可指代用来实施生物学或化学化验的装置、试剂和化学品，如小瓶、缓冲液和书面协议或使用说明
书。
[0151] 根据另一方面，提供选自下列所组成组的至少一种抗原的用途：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:115、其异构体、其转译后修饰的形式、其片段、或前述的任意组合；用于制备用于诊断对象脑损伤的诊断试剂盒。一些具体实施例中，该诊断试剂盒可用于测定样本中抗
体的反应性，从而测定样本对至少一种抗原的反应性模式。一些具体实施例中，样本的反应性模式较之于对照样本的反应性模式的显着差异(如，增加)是脑损伤的指征。
体的反应性，从而测定样本对至少一种抗原的反应性模式。一些具体实施例中，样本的反应性模式较之于对照样本的反应性模式的显着差异(如，增加)是脑损伤的指征。
[0152] 其它具体实施例中，该抗体探针集合中包含的复数种抗原包含多达50、55、60、70、80、90或100种不同抗原或由这些不同抗原组成。其它具体实施例中，该抗体探针集合中包含的复数种抗原包含至少50、100、150、200或500中不同抗原或由这些不同抗原组成。
[0153] 其它方面，提供包含本发明的寡核苷酸的核酸载体及含有该载体的宿主细胞。这些核酸、载体和宿主细胞是通过该领域中已知的重组方法生产的。聚核酸分子也可使用重
组DNA技术(如，聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成生产。核酸序列包括天然核酸序列及其同源物，包括但不限于，天然等位基因突变体和修饰核酸序列，其中，核酸已经被插入、删除、替代、及/或反转，且修饰方式为这些修饰大体上并不干扰核酸分子实施本发明方法的能力。
组DNA技术(如，聚合酶链反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成生产。核酸序列包括天然核酸序列及其同源物，包括但不限于，天然等位基因突变体和修饰核酸序列，其中，核酸已经被插入、删除、替代、及/或反转，且修饰方式为这些修饰大体上并不干扰核酸分子实施本发明方法的能力。
[0154] 根据本发明，该试剂盒包含复数种抗原，本文中也指代为抗原探针集合。这些包含复数种抗原的抗原探针集合可与患有脑损伤的对象的血清进行特异性反应。一些具体实施例中，该抗原探针集合可区分患有脑损伤的对象的血清与正常对象的血清。根据本发明的
原则，该复数种抗原较佳可以抗原阵列形式使用。根据一些具体实施例，该抗原阵列以抗原芯片的方式便利地排列。
原则，该复数种抗原较佳可以抗原阵列形式使用。根据一些具体实施例，该抗原阵列以抗原芯片的方式便利地排列。
[0155] 其它具体实施例中，该试剂盒进一步包含用于检测样本中抗体对于复数种抗原的反应性的手段。例如，该试剂盒可含有试剂、可检测的标签及/或容器，其可用于测量抗体对于本发明抗原探针的特异性结合。特定的具体实施例中，该试剂盒是抗原阵列形式。
[0156] 一些具体实施例中，该试剂盒包含用于将不同样本中抗体对于复数种抗原的反应性模式进行比较的手段。其它具体实施例中，该试剂盒可进一步包含阴性及/或阳性对照样本。例如，阴性对照样本可含有来自至少一个健康个体(如，未受苦于脑损伤的个体)的样
本。阳性对照可含有来自至少一个受苦于正在被诊断的脑损伤或脑损伤子类型的个体的样
本。其它非限制性实例是一组来自一群健康个体或患病个体的对照样本，或来自对照个体
的存储数据集。
本。阳性对照可含有来自至少一个受苦于正在被诊断的脑损伤或脑损伤子类型的个体的样
本。其它非限制性实例是一组来自一群健康个体或患病个体的对照样本，或来自对照个体
的存储数据集。
[0157] 抗体、样本和免疫化验
[0158] 抗体，或免疫球蛋白，包含两个通过二硫键链接在一起的重链和两个轻链，每一轻链通过二硫键以“Y”形的构型链接至一条重链。每一重链在一端具有一可变域(VH)，接着是多个恒定域(CH)。每一轻链在一端具有一可变域(VL)而在其另一端具有一恒定域(CL)，该轻链可变域与该重链可变域对准，且该轻链恒定域与该重链的第一恒定域(CH1)对准。每一对轻链和重链的可变域形成抗原结合位点。
[0159] 该重链的同种型(γ、α、δ、ε或μ)决定了免疫球蛋白类别(分别为IgG、IgA、IgD、IgE或IgM)。该轻链是全部抗体类别中发现的两种同种型(κ或λ)的一种。
[0160] 应理解，当使用“抗体”或“多种抗体”时，其倾向于包括完整抗体，如多克隆抗体或单克隆抗体(mAbs)，及其蛋白水解性片段如Fab片段或F(ab')2片段。本发明的范畴进一步包括(例如，作为免疫化验试剂，如本文中所详述)，嵌合抗体、重组和工程抗体、及其片段。
[0161] 包含轻重两条链的完整或基本完整的可变域的例示性功能性抗体片段定义如下：(i)Fv，定义为由该轻链可变域和该重链可变域组成的表达为两条链的基因工程片段；(ii)单链Fv(“scFv”)，包括通过适当的多肽链结基链接的该轻链可变域和该重链可变域的基因工程单链分子；(iii)Fab，含有抗体分子的单价抗体结合部位的抗体分子片段，通过使用木瓜蛋白酶处理完整抗体以获得完整轻链和重链Fd片段而得，由该可变域及其CH1域组成；
(iv)Fab’，含有抗体分子的单价抗原结合部位的抗体分子片段，通过使用胃蛋白酶处理完整抗体之后再还原(每一抗体分子得到两个Fab’片段)而得；以及(v)F(ab’)2，含有抗体分子的单价抗原结合部位的抗体分子片段，通过使用胃蛋白酶处理完整抗体而得(即，通过两个二硫键保持在一起的Fab’片段的二聚体)。
(iv)Fab’，含有抗体分子的单价抗原结合部位的抗体分子片段，通过使用胃蛋白酶处理完整抗体之后再还原(每一抗体分子得到两个Fab’片段)而得；以及(v)F(ab’)2，含有抗体分子的单价抗原结合部位的抗体分子片段，通过使用胃蛋白酶处理完整抗体而得(即，通过两个二硫键保持在一起的Fab’片段的二聚体)。
[0162] 本文中所使用，术语“抗原”是能结合抗体的分子或分子的一部分。抗原典型能诱导动物生产能结合至该抗原表位的抗体。上文中指代的特异性反应意为，指出该抗原将以高选择性的模式与其相关抗体反应而不与可能被其它抗原诱发的多数其它抗体反应。“抗
原肽”是能特异性结合抗体的肽。
原肽”是能特异性结合抗体的肽。
[0163] 另一具体实施例中，可通过将特异性抗原-抗体复合物的形成定量而实施对抗体特异性结合抗原探针的能力的检测。本文中所使用，术语“特异性结合”意为抗体与特异性抗原探针的该结合不受不相关分子存在的影响。
[0164] 某些具体实施例中，通过测定本发明抗原特异性结合至从对象分离的IgG表位的抗体的能力，或在其它具体实施例中结合至IgM抗体的能力，实施本发明的方法。
[0165] 从对象获取含抗体的适当生物样本的方法完全处于该领域技术人员的能力之内。典型地，适当的样本包含全血及自其排除的产品如血浆和血清。其它具体实施例中，可使用其它含抗体的样本，如CSF、尿液和唾液样本。
[0166] 大量众所周知的流体采集方法可用来从对象采集生物样本，以实施本发明的方法。
[0167] 根据本发明，任何适当的免疫化验可与该对象抗原合用。此类技术是该领域技术人员众所周知的，且已经揭示于很多标准免疫学手册和教科书中。某些优选具体实施例中，使用基于抗原探针阵列的方法来实施对抗体特异性结合该抗原探针的能力的测定。优选
地，将该阵列以经适当稀释的对象血清培养，以允许该血清中含有的抗体与固定化的抗原
探针之间进行特异性结合，从该阵列洗除未结合的血清，使用所希望表位抗体的接合有可
检测标签的配体培养经洗涤的阵列，从该阵列洗除未结合的标签，以及测量结合至每一抗
原探针的标签的水平。
地，将该阵列以经适当稀释的对象血清培养，以允许该血清中含有的抗体与固定化的抗原
探针之间进行特异性结合，从该阵列洗除未结合的血清，使用所希望表位抗体的接合有可
检测标签的配体培养经洗涤的阵列，从该阵列洗除未结合的标签，以及测量结合至每一抗
原探针的标签的水平。
[0168] 多种具体实施例中，本发明的方法进一步包含在实施该测定步骤前稀释样本。一种具体实施例中，例如，将样本使用PBS以1:2稀释。另一具体实施例中，将样本以1:4、1:6、
1:8、1:15、1:20、1:50、或优选1:10进行稀释。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。另一具体实施例中，样本在2倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在4倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在6倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在8倍至10倍范围内稀释。
1:8、1:15、1:20、1:50、或优选1:10进行稀释。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。另一具体实施例中，样本在2倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在4倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在6倍至10倍范围内稀释。另一具体实施例中，样本在8倍至10倍范围内稀释。
[0169] 抗原芯片
[0170] 抗原微阵列用于免疫应答的高通量表征(Robinson et al.,2002,Nat Med 8,295-301)，且已经被用来分析接种疫苗和自体免疫疾病中的免疫应答(Robinson et al.,
2002；Robinson et al.,2003,Nat Biotechnol.21,1033-9；Quintana et al.,2004；
Kanter et al.,2006,Nat Med 12,138-43)。已经假定，多重反应性的模式可能比单一抗
原-抗体关系更具启迪作用(Quintana et al.,2006,Lupus 15,428-30)，如早先对于健康
和患病小鼠(Quintana et al.,2004；Quintana et al.,2001,J Autoimmun 17,191-7)和
人(Merbl et al.,2007,J Clin Invest 117,712-8；Quintana et al.,2003,J Autoimmun
21,65-75)自体免疫库的分析中所示。因此，自身抗体库具有提供重新深入理解该疾病发病机理的潜力，以及用作该疾病进程的免疫生物标记物(Cohen,2007,Nat Rev Immunol.7,
569-74)的潜力。
2002；Robinson et al.,2003,Nat Biotechnol.21,1033-9；Quintana et al.,2004；
Kanter et al.,2006,Nat Med 12,138-43)。已经假定，多重反应性的模式可能比单一抗
原-抗体关系更具启迪作用(Quintana et al.,2006,Lupus 15,428-30)，如早先对于健康
和患病小鼠(Quintana et al.,2004；Quintana et al.,2001,J Autoimmun 17,191-7)和
人(Merbl et al.,2007,J Clin Invest 117,712-8；Quintana et al.,2003,J Autoimmun
21,65-75)自体免疫库的分析中所示。因此，自身抗体库具有提供重新深入理解该疾病发病机理的潜力，以及用作该疾病进程的免疫生物标记物(Cohen,2007,Nat Rev Immunol.7,
569-74)的潜力。
[0171] 根据一些方面，可使用WO 02/08755和U.S.2005/0260770中揭露的抗原阵列实践本发明的一些方法，这两篇专利的内容通过引用并入本文。WO 02/08755针对用于聚类的系统和制品，从而鉴别可与源自需要进行疾病诊断或治疗监控的患者的血清的待定免疫球蛋
白反应的预先定义抗原。进一步揭露诊断方法，以及可用于这些方法中的系统，采用将复数种抗原的抗原子集聚类的步骤，该抗原子集可与源自复数个患者的复数种抗体反应，以及
将对象的抗体与所得集群关联或取消关联。
白反应的预先定义抗原。进一步揭露诊断方法，以及可用于这些方法中的系统，采用将复数种抗原的抗原子集聚类的步骤，该抗原子集可与源自复数个患者的复数种抗体反应，以及
将对象的抗体与所得集群关联或取消关联。
[0172] U.S.2005/0260770揭露一种抗原阵列系统及其诊断用途。该申请提供了诊断对象体内免疫疾病特别是1型糖尿病或其倾向的方法，包含测定该对象的免疫球蛋白特异性结
合抗原探针集合的每一抗原探针的能力。该公开的教导乳糖本中详述者而以其整体并入本
文。
合抗原探针集合的每一抗原探针的能力。该公开的教导乳糖本中详述者而以其整体并入本
文。
[0173] 其它具体实施例中，可使用各种其它免疫化验，包括而不限于，酶联免疫吸附化验(ELISA)；使用多重微珠的流式细胞计(如Luminex制作的系统)；表面等离子体共振(SPR)；椭圆测量术；以及各种其它免疫化验，其采用例如激光扫描、光检测、经由光电倍增管的光子检测、使用基于数码相机的系统或视频系统进行的摄影、辐射计数、荧光检测、电磁检测、和允许对抗原-抗体结合进行定量测量的任何其它系统。
[0174] 已经研发了多种方法用于制备适用于本发明方法的阵列。最先进的方法牵涉使用机械设备以将含有抗原探针的不同溶液施加或“点”在平面支撑物表面上密集的可访问位
置，该平面支撑物典型为玻璃支撑物如显微镜载玻片，之后通过适当的热处理及/或化学处理进行加工以将抗原探针附加至该支撑物表面。首先，通过化学处理将该保留表面活化，将一层反应性基团如环氧基留在该表面上，而该反应性基团共价结合含有游离胺基或巯基的
任何分子。适当的支撑物也可包括硅、硝基纤维素、纸张、纤维质支撑物等。
置，该平面支撑物典型为玻璃支撑物如显微镜载玻片，之后通过适当的热处理及/或化学处理进行加工以将抗原探针附加至该支撑物表面。首先，通过化学处理将该保留表面活化，将一层反应性基团如环氧基留在该表面上，而该反应性基团共价结合含有游离胺基或巯基的
任何分子。适当的支撑物也可包括硅、硝基纤维素、纸张、纤维质支撑物等。
[0175] 优选地，为了令统计学上具有说服力的数据的产生称为可能，将附加至该阵列的具体可访问位置上的每一抗原探针或本发明抗原探针的不同子集独立附加在该阵列的至
少两个、更优选至少三个分隔的具体可访问位置。
少两个、更优选至少三个分隔的具体可访问位置。
[0176] 根据另外的具体实施例，该抗原探针集合包含至少5、至少25、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300种或更多种抗原，包括一种或复数种本发明提供的抗原。
[0177] 该阵列除了包括本发明的抗原探针外，可较佳地包括对照抗原探针或其它标准化学品。此类对照抗原探针可包括标准化对照探针。从该标准化对照探针获取的信号，提供用于结合条件、标签强度、“读取”效率和其它可造成给定结合的抗体-探针配体相互反应信号改变的因素中变化的对照。例如，从该抗原探针阵列全部其它抗原探针读取的信号如荧光
强度除以来自该标准化对照探针的信号(如，荧光强度)，从而将测量值标准化。标准化对照探针可结合至该抗原探针阵列上的各种可访问位置，以控制抗体-配体探针效率的空间变
化。优选地，标准化对照探针被置于该阵列的角落或边缘以控制边缘效应，以及该阵列的中部。
强度除以来自该标准化对照探针的信号(如，荧光强度)，从而将测量值标准化。标准化对照探针可结合至该抗原探针阵列上的各种可访问位置，以控制抗体-配体探针效率的空间变
化。优选地，标准化对照探针被置于该阵列的角落或边缘以控制边缘效应，以及该阵列的中部。
[0178] 标记的抗体配体可以是各种适当类型的抗体配体的任一种。优选地，该抗体配体是能特异性结合所使用的对象抗体的Fc部位的抗体。例如，若该对象的抗体是IgM表型，则该抗体配体优选为能特异性结合至该对象IgM抗体Fc区域的抗体。
[0179] 该对象抗体的配体可与各种类型可检测标签的任一种接合。该标签优选为荧光团，最优选Cy3。或者，该荧光团可以是各种荧光团的任一种，包括Cy5、Dy5、异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、若丹明、Texas红等。适用于特异性同种型抗体的接合有荧光团的适当抗体可从供应商处广泛购买，且它们的生产方法已经被完善地构建。
[0180] 依据用途和目的，可分离对象的抗体，用于分析其以各种途径结合抗原探针的能力。虽然对象的抗体可以适当且便利地作为血清或血浆或其稀释物(如，1:10稀释)形式存
在，仍可在测试该抗体特异性结合抗原探针的能力之前，对抗抗体进行任何所希望程度的
纯化。可使用对象的全抗体或该对象的包含抗体可变区的抗体片段实践本发明的方法。
在，仍可在测试该抗体特异性结合抗原探针的能力之前，对抗抗体进行任何所希望程度的
纯化。可使用对象的全抗体或该对象的包含抗体可变区的抗体片段实践本发明的方法。
[0181] 对从对象获取的样本中一种或多种抗体水平与一种或多种生物标记物水平的联合测量
[0182] 本发明至少部分地基于下述发现：对从对象获取的样本中一种或多种抗体水平与一种或多种生物标记物水平的联合测量可测量该对象的实时背景生理学和急性事件状态。
[0183] 在具有脑损伤的患者体内，对损伤和从该损伤恢复的过程的应答取决于该损伤特性和该个体在损伤前的状态的组合。在停留在“健康”背景上损伤的患者将很可能具有比在“病态”或“先前受损”背景上损伤的患者更高(更快、更完全)的恢复情况。
[0184] 对患者自身抗体概况的测定可用作该患者在脑损伤之前的替代指标(surrogate measurement)，而对在损伤后短期内循环抗原水平的测定可用作损伤特点/程度的替代指
标。将关于患者在损伤前状态的信息与该损伤特点/程度组合的算法可用来预测结局。
标。将关于患者在损伤前状态的信息与该损伤特点/程度组合的算法可用来预测结局。
[0185] 可使用其中抗原结合至表面的任何平台实施对自身抗体概况的测定，循环抗体结合至该抗原并使用示踪二次抗体进行检测。可以任何包括捕捉抗体和检测抗体的ELISA型
夹心化验格式进行对循环抗原概况的测定。
夹心化验格式进行对循环抗原概况的测定。
[0186] 用于抗体和抗原检测的平台可以是独立的(如，用于自身抗体的iCHIP、用于抗原的MSD ELISA或任何基于ELISA的相关平台)，或者可以组合为单一平台以同步测量循环自
身抗体和抗原。这可通过下述进行：打印具有相关抗原和捕捉抗体两者的iCHIP，令血清与打印的表面接触，因此，循环抗体将结合至该表面结合的抗原，且循环抗原将结合至该表面结合的捕捉抗体。可使用二次抗体和检测抗体的混合物进行检测。
身抗体和抗原。这可通过下述进行：打印具有相关抗原和捕捉抗体两者的iCHIP，令血清与打印的表面接触，因此，循环抗体将结合至该表面结合的抗原，且循环抗原将结合至该表面结合的捕捉抗体。可使用二次抗体和检测抗体的混合物进行检测。
[0187] 在需要测量自身抗体对显示疾病状态信息的相同抗原的反应性的例子中，这些测量可在两个分隔的腔中进行。来自多次测试的数据联合用于用以最终预测该患者的状态的
算法分析目的。
算法分析目的。
[0188] 用于检测生物标记物的试剂盒
[0189] 另一方面，本发明提供用于描述脑损伤状态的试剂盒，该试剂盒用来检测本文中揭示的生物标记物。特定具体实施例中，该试剂盒提供为包含本发明生物标记物的抗体的
ELISA试剂盒，该生物标记物包括但不限于，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和突触核蛋白β
(Sncb)。
ELISA试剂盒，该生物标记物包括但不限于，胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和突触核蛋白β
(Sncb)。
[0190] 一种候选具体实施例中，该组生物标记物包含BDNF、GFAP、MT3和SNCB。另一具体实施例中，该组生物标记物包含BDNF、GFAP、NRGN和SNCB。又一具体实施例中，该组生物标记物包含BDNF、ICAM5、MT3和SNCB。
[0191] ELISA试剂盒可包含其上附加有生物标记物捕捉试剂的固体支撑物，如芯片、微量滴定板(如，96孔板)、微珠、或树脂。
[0193] 该试剂盒可提供为包含其上固定有抗体的膜的免疫层析条带，以及用于检测的手段如金颗粒结合的抗体，其中，该膜包括NC膜和PVDF膜。该试剂盒可包含其上固定有样本施加垫的塑料板、暂时固定在玻璃纤维过滤器上的金颗粒结合的抗体、其上顾客有抗体带和
二次抗体带的硝基纤维素膜，以及，吸收剂垫以连续方式放置以保持血清的连续毛细流动。
二次抗体带的硝基纤维素膜，以及，吸收剂垫以连续方式放置以保持血清的连续毛细流动。
[0194] 数据分析
[0195] 较佳地，为了区别健康对照对象与那些具有脑损伤的患者的反应性模式，本发明的方法可采用学习和模式识别分析、聚类算法等。如此，该术语具体包括通过例如测定测试样本中抗体对复数种抗原的反应性，并使用测量算法及/或分析将所得反应性模式与阴性
和阳性对照样本(如，分别从未受苦于脑损伤的对照对象或受苦于脑损伤的患者获取的样
本)的反应性模式比较，从而测量的差异。该差异也可通过将测试样本的反应性模式与以此方式获取的预先定义分类相比较而测量。
和阳性对照样本(如，分别从未受苦于脑损伤的对照对象或受苦于脑损伤的患者获取的样
本)的反应性模式比较，从而测量的差异。该差异也可通过将测试样本的反应性模式与以此方式获取的预先定义分类相比较而测量。
[0196] 一些具体实施例中，为了区别具有子类型的脑损伤的对象与对照对象的反应性模式，本发明的方法可采用学习和模式识别分析、聚类算法等。例如，该方法可包括测定测试样本中抗体对复数种抗原的反应性，并使用此类算法及/或分析将所得模式与阴性和阳性
对照样本的反应性模式比较。
对照样本的反应性模式比较。
[0197] 因此，另一具体实施例中，测试样本反应性模式与对照样本反应性活性相比的显着差异，其中该差异是使用学习和模式识别算法计算的，表明该对象受苦于脑损伤。例如，该算法可包括而不限于，监督或非监督分类，包括统计算法包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、多元线性回归(MLR)、主成分回归(PCR)、判别函数分析(DFA)，包括线性判别分析(LDA)、和聚类分析包括最近邻算法、人工神经网络、耦合双向聚类算法、多层感知
(MLP)、广义回归神经网络(GRNN)、模糊推理系统(FIS)、自组织映射(SOM)、遗传算法(GAS)、神经模糊系统(NFS)、自适应共振理论(ART)。
(MLP)、广义回归神经网络(GRNN)、模糊推理系统(FIS)、自组织映射(SOM)、遗传算法(GAS)、神经模糊系统(NFS)、自适应共振理论(ART)。
[0198] 某些具体实施例中，一种或多种算法或计算机程序可用来将测试样本中定量的每一抗体的量与预先定义的截留(或与一定数目的预先定义的截留)比较。或者，可提供一种
或多种用于人手动实施必需步骤的使用说明书。
或多种用于人手动实施必需步骤的使用说明书。
[0199] 用于测定和比较模式分析的算法包括，但不限于，主成分分析、费舍尔线性分析、神经网络算法、遗传算法、模糊逻辑模式识别等。分析完成后，所得信息可例如在显示器上显示、传输至主机、或存储在存储装置中用于后续取回。
[0200] 该算法大多为基于神经网络的算法。神经网络具有输入层、处理层和输出层。神经网络中的信息分散在整个处理层中。该处理层由通过互连至其节点而模拟神经元的节点所组成。与展现一批数据中基本模式的统计分析相似，神经网络基于预先约定的准则锁定一
批数据中的一贯模式。
批数据中的一贯模式。
[0201] 适当的模式识别算法包括，但不限于，主成分分析(PCA)、费舍尔线性判别分析(FLDA)、簇类独立软模式法(SIMCA)、K最近邻算法(KNN)、神经网络、遗传算法、模糊逻辑、及其它模式识别算法。一些具体实施例中，使用费舍尔线性判别分析(FLDA)和典型判别分析
(CDA)以及其组合来比较输出信号与来自数据库的可用数据。
(CDA)以及其组合来比较输出信号与来自数据库的可用数据。
[0202] 其它具体实施例中，使用主成分分析。主成分分析(PCA)牵涉将若干相关联的变量转换为较少数目的不相关联的变量的数学技术。该较少数目的不相关联的变量称为主成
分。第一主成分或特征向量尽可能多地占据该数据中的可变性，且每一接续成分
(succeeding component)尽可能多地占据剩余的可变性。PCA的主要目标是减少数据集的
维度和鉴定新的基础变量。
分。第一主成分或特征向量尽可能多地占据该数据中的可变性，且每一接续成分
(succeeding component)尽可能多地占据剩余的可变性。PCA的主要目标是减少数据集的
维度和鉴定新的基础变量。
[0203] 主成分分析以分层方式比较两个或多个协方差矩阵的结构。例如，一个矩阵可能会与另一矩阵相同，但在后者中，前者的每一矩阵元均乘以一个常数。两个矩阵因此彼此成正比。更特别地，两个矩阵共享相同的特征向量(或主成分)，但其特征值相差一个常数。两个矩阵间的另一关系是，它们共享共有的主成分，但它们的特征值不同。主成分分析中使用的数学技术称为特征分析。与最大特征值相关联的特征向量具有与第一主成分相同的方
向。与第二大特征值相关联的特征向量决定第二主成分相同的方向。特征值之和等于方阵
的迹(trace)，而特征向量的最大数目等于这一矩阵的行数。
向。与第二大特征值相关联的特征向量决定第二主成分相同的方向。特征值之和等于方阵
的迹(trace)，而特征向量的最大数目等于这一矩阵的行数。
[0204] 另一具体实施例中，该算法是分类器。一种类型的分类器是通过使用来自训练集合且其效能被使用测试集合数据评估的数据“训练”该算法而创建。与本发明合用的分类器的实例是判别分析、决策树分析、受试者工作曲线或其拆分曲线、及成绩分析。
[0205] 术语“决策树”指的是采取用于分类法的类似流程图的树结构的分类器。决策树由数据集重复分段的子集所组成。每一分段由应用至一个变量的简单规则组成，如，“如果“变量1”的值大于“阈值1”，则向左，否则向右”。据此，给定特征空间被分割为一组矩形，且每一矩形被分配给一类。
[0206] 术语“测试集合”或“未知”或“确认集合”指的是全体可用数据集的子集，该数据集由未包括于训练集合中的全体。测试数据用来评估分类器效能。
[0207] 术语“训练集合”或“已知集合”或“参考集合”指的是各自全体可用数据集的子集。这一子集典型是随机选择的，且独自用于分类器构建的目的。
[0208] 诊断方法
[0209] 本文中所使用，术语“诊断”(diagnosing或diagnosis)指的是，通过其征兆、症状且特别是来自多种诊断过程的结果鉴定身体状况或疾病(如，脑损伤)的进程，包括，例如，检测从个体获取的生物样本(如，血清)中抗体对一种或多种抗原的反应性。此外，本文中所使用，术语“诊断”涵盖疾病的筛选、检测疾病的存在或严重性、区分一种疾病与包括那些可能具有一种或多种相似或相同症状的疾病的其它疾病、提供疾病的预后、监控疾病进展或复发，以及评估疗效及/或疾病、病变或病症的复发，以及选择对疾病的治疗及/或处置、对给定疾病疗法(剂量/计划)的优化、监控对疾病的治疗、及/或预测疗法对于特定患者或亚
种群的适用性、或测定治疗性产品在患者或亚种群中的适宜给药剂量。
种群的适用性、或测定治疗性产品在患者或亚种群中的适宜给药剂量。
[0210] 一种具体实施例中，诊断脑损伤进一步容许评估所述脑损伤进化为脑损害并导致长期机能障碍的风险。另一具体实施例中，对所述脑损伤进化为长期机能障碍的风险的评
估容许在早期进行的治疗性干预。
估容许在早期进行的治疗性干预。
[0211] 面对已经遭受TBI的患者的最直接的问题是，测定再震荡性损伤后何时可以恢复至高风险活动而没有在细胞层面出现的永久性脑损害的风险。根据一些具体实施例，本发
明提供广泛的免疫系统测试以监控、评估慢性结局及核实重新工作或比赛的安全性。
明提供广泛的免疫系统测试以监控、评估慢性结局及核实重新工作或比赛的安全性。
[0212] 对于确定适宜的临床关联以及预测长期结局，对TBI后的病理学和神经功能缺损的评估是关键。在头部损伤中最常用的结局测量措施是格拉斯哥昏迷量表(GCS)、格拉斯哥结局量表(GOS)、计算机断层扫描、和磁共振成像(MRI)以检测颅内病理学。但是，尽管有基于这些结局测量措施的显着改良的急诊分类系统，大多数TBI遭受长期缺损，且尽管基于
GOS预测为“恢复良好”，大量TBI幸存者仍严重受损。此外，CT和MRI昂贵且不能在急诊室环境中快速采用。另外，在于战斗相关联的简陋医疗环境中，TBI的确诊将会是对伤员进行适宜分类的必要先决条件。
GOS预测为“恢复良好”，大量TBI幸存者仍严重受损。此外，CT和MRI昂贵且不能在急诊室环境中快速采用。另外，在于战斗相关联的简陋医疗环境中，TBI的确诊将会是对伤员进行适宜分类的必要先决条件。
[0213] 一种具体实施例中，与脑损伤相关的脑损害类型是白质结构异常。另一具体实施例中，该白质结构异常或损害处于胼胝体区域内。另一具体实施例中，该异常或损害处于钩束内。另一具体实施例中，该异常或损害处于右脑额叶内。另一具体实施例中，该异常或损害处于左脑额叶内。另一具体实施例中，该异常或损害是弥漫性轴索损伤(DAI)。另一具体实施例中，该异常或损害是弥漫性血管损伤。
[0214] 一些具体实施例中，该脑损伤是轻度TBI，一种具体实施例中，脑震荡是轻度TBI。另一具体实施例中，轻度TBI是由头部损伤造成的，其中，该头部损伤是，另一具体实施例中，钝挫伤、加速力或减速力。能够了解，此类头部损伤可以具有一个或多个下述条件为特征：(1)观察到的或自报的挫伤、定向障碍、或损伤当下的意识缺失、记忆丧失、意识丧失持续时间短于30分钟；以及，(2)在损伤不久后的症状如头痛、眩晕、疲惫、易怒、和注意力难以集中。基于使用格拉斯哥昏迷量表的临床检查，该头部损伤也可被归类为轻度。一种具体实施例中，在急诊中心检查时，该头部损伤的格拉色哥昏迷量表(GCS)分数为13至15，头部CT未见异常，意识丧失的持续时间不超过30分钟，创伤后记忆缺失短于24小时，且简明损伤量表(AIS)S3和ISS<12修改以排除该头部区域。
[0215] 诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断系统的“灵敏度”是测试呈阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。该化验未检出的患病个体为“假阴性”。未患病且在该化验中测试呈阴性的对象称为“真阴性”。诊断化验的“特异性”是1减去假阳性率，其中，该“假阳性”率定义为那些未患病但测试呈阳性的比例。尽管特定的诊断方法可能不提供对病症的最终诊断，但若该方法提供有助于诊断的阳性指示即足够。诊断化验的“准确性”是测量结果与真实值的接近度。诊断化验的“p值”是获取所观察的样本结果为零假设是事实真实时(或更极端的结果)的可能性。
[0216] 某些具体实施例中，使用本发明提供的抗原探针集合或本发明提供的抗原探针阵列，导致脑损伤指示性的(p值≤1.00E-08)、灵敏的(≥0.600)、特异性的(≥0.700)且准确的(≥0.600)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致更加脑损伤指示性的(p值≤
1.00E-10)、灵敏的(≥0.700)、特异性的(≥0.800)且准确的(≥0.700)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致甚至更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-12)、灵敏的(≥
0.800)、特异性的(≥0.900)且准确的(≥0.700)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致再更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-14)、灵敏的(≥0.900)、特异性的(≥0.950)且准确的(≥0.900)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致再更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-16)、灵敏的(≥0.950)、特异性的(≥0.990)且准确的(≥0.950)抗体反应性
概况。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
1.00E-10)、灵敏的(≥0.700)、特异性的(≥0.800)且准确的(≥0.700)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致甚至更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-12)、灵敏的(≥
0.800)、特异性的(≥0.900)且准确的(≥0.700)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致再更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-14)、灵敏的(≥0.900)、特异性的(≥0.950)且准确的(≥0.900)抗体反应性概况。某些具体实施例中，该使用导致再更加脑损伤指示性的(p值≤1.00E-16)、灵敏的(≥0.950)、特异性的(≥0.990)且准确的(≥0.950)抗体反应性
概况。每一可能性表示本发明的一种独立具体实施例。
[0217] 某些具体实施例中，本发明提供的抗原或本发明提供的抗原模式是脑损伤指示性的(p值≤1.87E-08)、灵敏的(≥0.609)、特异性的(≥0.769)且准确的(≥0.687)。某些具体实施例中，本发明提供的抗原或本发明提供的抗原模式是脑损伤指示性的(p值≤2.81E-
12)、灵敏的(≥0.657)、特异性的(≥0.798)且准确的(≥0.725)。某些具体实施例中，本发明提供的抗原或本发明提供的抗原模式是脑损伤指示性的(p值≤8.00E-14)、灵敏的(≥
0.663)、特异性的(≥0.814)且准确的(≥0.738)。
12)、灵敏的(≥0.657)、特异性的(≥0.798)且准确的(≥0.725)。某些具体实施例中，本发明提供的抗原或本发明提供的抗原模式是脑损伤指示性的(p值≤8.00E-14)、灵敏的(≥
0.663)、特异性的(≥0.814)且准确的(≥0.738)。
[0218] 另一具体实施例中，该方法可导致对脑损伤进展水平的测定。又一具体实施例中，该方法可导致提供用于监控脑损伤进展的实体的比较。这些具体实施例中，该方法可用来例如区分具有进行性脑损伤的对象与具有退化性脑损伤的对象。
[0219] 一种具体实施例中，正在根据本发明方法进行诊断的对象是有症状的。其它具体实施例中，该对象是无症状的。某些具体实施例中，该对象显示直接症状。某些具体实施例中，该对象显示迟发症状。某些具体实施例中，该对象现在或过去未接受治疗。
[0220] 本文中所使用，术语“治疗”可涵盖治愈、预防、减少疾病的发病率；减轻疾病的症状；诱发疾病的缓解；或迟缓疾病的进展。术语“减少”、“压制”和“抑制”指的是裁减或缩减。
[0221] 诊断过程可在体内或体外实施，优选在体外实施。本发明方法的某些具体实施例中，通过非侵入性手段或方法实施该诊断过程。
[0222] 本发明的诊断过程和平台可能适用于作为护理装置方向或在诊所、医师办公室、医院实验室、或商业诊断实验室中服务方向使用。
[0223] 下述实施例仅为了更完全地例示性说明本发明的一些具体实施例而存在。然而，它们决不应解释为限制本发明范畴的广度。
[0224] [实施例]
[0225] 材料和方法
[0226] 人类对象
[0227] 该研究由参与临床单位的机构审查委员会批准；获取了来自全部参与者的知情同意书。在初始研究中，使用包括228种抗原(见表1)的抗原微阵列测试血清，该血清源自从健康对象获取的血液样本和从遭受脑损伤的对象在损伤后不同时间获取的血液样本，且具有
不同的GOSE分数。
不同的GOSE分数。
[0228] 在HeadSMART试验中从到达约翰霍普金斯医院(Johns Hopkins Hospital)急诊科(ED)的患者(JHH,Baltimore；n＝61)或在COBRIT临床试验的一个参与中心(n＝31；如
JAMA.2012；308(19):1993-2000中所揭示)采集血液样本和临床数据。
JAMA.2012；308(19):1993-2000中所揭示)采集血液样本和临床数据。
[0229] 将确定的人血清样本用于本研究。回顾分析来自成年TBI患者的样本。从贝勒医学院(Baylor College of Medicine)(Houston,TX；n＝21)获取评估为未主诉TBI的健康对照
组患者。
组患者。
[0230] 待认定为进行HeadSMART试验的TBI患者，必须符合下述准则：18岁或更年长、损伤后24小时内存在TBI、符合美国急诊医师血液(American College of Emergency Physicians(ACEP))对于获取TBI的头部CT扫描的准则。排除患有脑瘤、进行过脑部外科手
术、怀孕的、不以英语为母语的患者。在从登记至长达6个月的期间内，从61位TBI患者采集连续的血清样本。对于每一患者，在脑损伤后不同的8个时间点分别采集3个样本，挑选样本用于该分析。对于COBRIT试验样本，使用下述准则，接受准则为：该患者曾患有非穿透性创伤性脑损伤、年龄18岁(阿拉巴马州为19岁)至70岁、如协议中说明的启用/不启用GCS准则
的中风患者、损伤后6个月在网络中心完成结局测量的合理预期、24小时时间窗口内登记的合理预期、且以英语为母语。排除准则包括：GCS运动评分为6且不符合CT准则的插管患者、双侧固定且瞳孔扩张的、妊娠测试阳性的、已知怀孕的、或正在哺乳的、证明患有干扰结局评估的疾病的、正在使用乙酰胆碱酯酶抑制剂的、濒死或当下患有威胁生命的疾病的、当下登记在另一研究中的、或囚犯。对于健康对照，在贝勒医学院，招募了21位至少18岁的非TBI个体，并签署知情同意书。从每一对照个体采集一份血液样本，并加工以获取血清和血浆的复制瓶装小样，小样在-80℃储存直至使用。全部患者身份信息保密。
术、怀孕的、不以英语为母语的患者。在从登记至长达6个月的期间内，从61位TBI患者采集连续的血清样本。对于每一患者，在脑损伤后不同的8个时间点分别采集3个样本，挑选样本用于该分析。对于COBRIT试验样本，使用下述准则，接受准则为：该患者曾患有非穿透性创伤性脑损伤、年龄18岁(阿拉巴马州为19岁)至70岁、如协议中说明的启用/不启用GCS准则
的中风患者、损伤后6个月在网络中心完成结局测量的合理预期、24小时时间窗口内登记的合理预期、且以英语为母语。排除准则包括：GCS运动评分为6且不符合CT准则的插管患者、双侧固定且瞳孔扩张的、妊娠测试阳性的、已知怀孕的、或正在哺乳的、证明患有干扰结局评估的疾病的、正在使用乙酰胆碱酯酶抑制剂的、濒死或当下患有威胁生命的疾病的、当下登记在另一研究中的、或囚犯。对于健康对照，在贝勒医学院，招募了21位至少18岁的非TBI个体，并签署知情同意书。从每一对照个体采集一份血液样本，并加工以获取血清和血浆的复制瓶装小样，小样在-80℃储存直至使用。全部患者身份信息保密。
[0231] 抗原和血清测试
[0232] 使用Scienion S-11非接触式微阵列打印机(Scienion AG,Germany)将228种不同的抗原点在室内生产的环氧己基三乙氧基硅烷(EHTES)活化的环氧树脂载片上。随后，使用
1％酪蛋白将该微阵列在室温封闭1小时。在37℃，将1％酪蛋白封闭缓冲液中的测试血清样本(1:20稀释)在盖玻片下培养1小时。随后，洗涤该阵列，并在37℃使用混合在一起的两种抗体的1:500稀释物培养1小时，该两种抗体是羊抗人IgG Cy3缀合抗体和羊抗人IgM AF647
缀合抗体(两者均购自杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories
Inc.,West Grove,PA))。通过激光器(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)在530nm和
630nm两个波长实施图像采集，使用Genepix pro 7软件(Molecular devices,Sunnyvale,
CA)分析结果。结合至每一抗原点的信号强度的定量范围是0至65,000；这一检测范围令使
用以1:20稀释的测试血清样本获得可靠数据成为可能。
1％酪蛋白将该微阵列在室温封闭1小时。在37℃，将1％酪蛋白封闭缓冲液中的测试血清样本(1:20稀释)在盖玻片下培养1小时。随后，洗涤该阵列，并在37℃使用混合在一起的两种抗体的1:500稀释物培养1小时，该两种抗体是羊抗人IgG Cy3缀合抗体和羊抗人IgM AF647
缀合抗体(两者均购自杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories
Inc.,West Grove,PA))。通过激光器(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)在530nm和
630nm两个波长实施图像采集，使用Genepix pro 7软件(Molecular devices,Sunnyvale,
CA)分析结果。结合至每一抗原点的信号强度的定量范围是0至65,000；这一检测范围令使
用以1:20稀释的测试血清样本获得可靠数据成为可能。
[0234] 将每一点的强度表示为，减除其局部背景中位数之后进行Log2变换的像素均值。输入具有类背景强度的阴性点(背景减除后)。对于各点，减去背景强度以获得纯信号。对于每一载片中的每一抗原，移除异常值点。异常值点定义为具有Z分>2或<-2。在移除异常值的点后，通过中位数将多个点的强度组合起来。将每一抗原的多个点的前景强度和背景强度
平均，并计算前景与背景之间的差异。将所得值作为抗体结合至该点抗原的抗原反应性。在大量载片中，全部抗原均显示有意义的反应性；因此没有抗原被排除。
平均，并计算前景与背景之间的差异。将所得值作为抗体结合至该点抗原的抗原反应性。在大量载片中，全部抗原均显示有意义的反应性；因此没有抗原被排除。
[0235] 抗体结果的统计分析
[0236] 鉴别与其它子群相比具有更高或更低反应性的特异性研究子群中的抗原。在T测试中使用单变量分析来分离抗原。实现并测定了允许设定分类阈值如阳性预测值(PPV)≥
90％且灵敏度≥20％的抗原，以显着表征具体的子群。对于额外的限制，仅选择其双侧t测试的p值(在多重假设的Benjamini-Hochberg校正后)小于0.05的抗原。
90％且灵敏度≥20％的抗原，以显着表征具体的子群。对于额外的限制，仅选择其双侧t测试的p值(在多重假设的Benjamini-Hochberg校正后)小于0.05的抗原。
[0237] ELISA板化验方法
[0238] 通过比色检测法、荧光检测法、化学发光检测费、或电化学发光检测法测试生物标记物。对于比色检测方法，使用Maxisorb 96孔板。对于荧光化验，使用黑色不透明壁的板。对于基于发光的化验，使用适用于发光的微量滴定板。如下述者制备板。使用对于每一板类型为特异性的涂覆缓冲液冲洗该板一次。将捕获抗体以最优浓度在最优时间段内加热各孔
中。通常，在40℃涂覆缓冲液中实施超过12小时的涂覆。涂覆时期之后，移除过量抗体，以经优化的封闭缓冲液封闭该板，该封闭缓冲液由缓冲盐水与下列之一组成：酪蛋白、牛血清白蛋白、物种特异性全血清、或经过滤的脱脂奶粉、或其它封闭剂、及/或非离子型洗涤剂。使用最理想长度的一系列相继培养以令：1)屏蔽非特异性结合位点(即，封闭)；2)捕获抗体-抗原结合；3)抗原的结合，之后洗涤以移除过量和未结合的抗原；4)抗-抗原检测抗体溶液和检测标签的培养；5)洗涤，以移除过量的未结合检测抗体和标签；以及，6)加入检测底物(ELISA)或优化的检测溶液(荧光或发光)。通过测量有色底物对适宜波长的光的吸光度，在微量滴定板阅读器上实施比色检测。使用基于荧光的读板器实施荧光化验。在基于发光的
阅读器上检测发光。收集数据，并使用已知浓度的重组蛋白质的标准曲线测定生物标记物
浓度。
中。通常，在40℃涂覆缓冲液中实施超过12小时的涂覆。涂覆时期之后，移除过量抗体，以经优化的封闭缓冲液封闭该板，该封闭缓冲液由缓冲盐水与下列之一组成：酪蛋白、牛血清白蛋白、物种特异性全血清、或经过滤的脱脂奶粉、或其它封闭剂、及/或非离子型洗涤剂。使用最理想长度的一系列相继培养以令：1)屏蔽非特异性结合位点(即，封闭)；2)捕获抗体-抗原结合；3)抗原的结合，之后洗涤以移除过量和未结合的抗原；4)抗-抗原检测抗体溶液和检测标签的培养；5)洗涤，以移除过量的未结合检测抗体和标签；以及，6)加入检测底物(ELISA)或优化的检测溶液(荧光或发光)。通过测量有色底物对适宜波长的光的吸光度，在微量滴定板阅读器上实施比色检测。使用基于荧光的读板器实施荧光化验。在基于发光的
阅读器上检测发光。收集数据，并使用已知浓度的重组蛋白质的标准曲线测定生物标记物
浓度。
[0239] 实施例1：FABP(SEQ ID No:61)与具有TBI结局的MBPR149(SEQ ID No:10)之间的关联
[0240] 为了勾勒每一患者自身抗体在损伤后随时间改变的情况，对每一患者在其自测时间点进行概况性描述。在特定时间点(损伤后3个月/1个月)，将来自扩展格拉斯哥结局量表(GOSE)等于8的TBI患者的样本与来自GOSE小于8的TBI患者的样本比较。
[0241] 抗体的结合
[0242] 测试来自健康对象和具有不同GOSE分数的脑损伤患者在受损后不同时间的血清样本中，血清IgG抗体及/或IgM抗体对表1中揭露的不同抗原的结合。
[0243] 表1：脑损伤相关抗原的清单
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256] 如图1中所示，与具有GOSE分数＝8的患者(圆点)相比，在损伤后第30天从格拉斯哥结局量表扩展(GOSE)分数<8的TBI患者(十字)的血清样本中抗脂肪酸结合蛋白质(FABP，
SEQ ID No:61)IgM自身抗体的水平较低。
SEQ ID No:61)IgM自身抗体的水平较低。
[0257] 如图2中所示，与具有GOSE分数＝8的患者(圆点)相比，在损伤后第30天从格拉斯哥结局量表扩展(GOSE)分数<8的TBI患者(十字)的血清样本中抗髓磷脂碱性蛋白
(MBPR149，SEQ ID No:10，MBP衍生的BSA缀合肽)IgM自身抗体的水平较高。这些结果第一次表明，从TBI患者获取的血清样本中抗FABP IgM自身抗体水平的增加，是所述TBI患者从脑
损伤恢复的指征。此外，从TBI患者获取的血清样本中抗MBPR149IgM自身抗体水平的下降，是所述TBI患者从脑损伤恢复的指征。因此，本发明揭露了可用于监控脑损伤及/或脑损伤
预后的特异性抗原抗体反应性。
(MBPR149，SEQ ID No:10，MBP衍生的BSA缀合肽)IgM自身抗体的水平较高。这些结果第一次表明，从TBI患者获取的血清样本中抗FABP IgM自身抗体水平的增加，是所述TBI患者从脑
损伤恢复的指征。此外，从TBI患者获取的血清样本中抗MBPR149IgM自身抗体水平的下降，是所述TBI患者从脑损伤恢复的指征。因此，本发明揭露了可用于监控脑损伤及/或脑损伤
预后的特异性抗原抗体反应性。
[0258] 实施例2：与健康对照相比，从TBI患者获取的血清样本中抗髓过氧化物酶(MPO，SEQ ID No:85)IgM自身抗体的水平提高
[0259] 如图3中所示，与健康对照(十字)相比，从TBI患者(圆点)获取的血清样本中抗MPO IgM自身抗体的水平较高。这些结果第一次表明，抗MPO自身抗体的水平增加是脑损伤的指征。
[0260] 实施例3：与健康对照相比，从TBI患者获取的血清样本中抗CMV(SEQ ID No:86)IgG自身抗体的水平下降
[0261] 如图4A中所示，与健康对照(十字)(N＝21)相比，在损伤后第30天和第90天从TBI患者(圆点)(N＝142)获取的血清样本中抗CMV(SEQ ID No:86)IgG自身抗体的水平较低。图
4B通过抗CMV IgG自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)曲线显示分离效能。
4B通过抗CMV IgG自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)曲线显示分离效能。
[0262] 实施例4：基于在损伤后第30天从TBI患者获取的血清样本中的抗TNFRSF12A(SEQ ID No:104)IgM自身抗体的水平，对TBI患者在损伤后第90天的临床状态的预测
[0263] 如图5A中所示，可使用在损伤后第30天从TBI患者获取的血清样本中的抗TNFRSF12A(SEQ ID No:104)IgM自身抗体的水平，来预测TBI患者在损伤后第90天的临床状
态(GOSE<8或GOSE＝8)。图5B通过抗TNFRSF12A IgM自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)
曲线显示分离效能。
态(GOSE<8或GOSE＝8)。图5B通过抗TNFRSF12A IgM自身抗体水平的受试者工作特征(ROC)
曲线显示分离效能。
[0264] 实施例5：与健康对照相比，从TBI患者获取的血清样本中自身抗体与生物标记物的水平的组合测量
[0265] 为了确定能否区分TBI患者与健康对照血清样本中抗体和生物标记物水平的组合测量，进行组合分析。将在时间0(t0,N＝85)从TBI患者获取的血清样本与从健康对照(HC，N＝21)获取的血清样本比较。该分析基于464种iChip特征(232种抗原，IgM和IgG)和四种
ELISA特征。iChip数据基于两种封闭复本的平均，之后进行校正过程。基于数据可用性而选择ELISA特征；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除具有缺失ELISA数据的样本。
ELISA特征。iChip数据基于两种封闭复本的平均，之后进行校正过程。基于数据可用性而选择ELISA特征；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除具有缺失ELISA数据的样本。
[0266] 图6显示基于100次迭代的70:30交叉验证的六种分类方法(SVM、LR、QDA、CART、RF及LDA)的受试者工作特征(ROC)曲线下的面积。根据其中位数得分或模型内含物的频率，依据所使用的方法，将特征排名。
[0267] 使用LDA分类方法透露，随机背景水平之上最高的六种特征是生物标记物：GFAP及SNCB与下述自身抗体组合：体外瓜氨酸化的抗MBP(SEQ ID No:2)IgM、抗GFAP(SEQ ID No:
14)IgM、抗ICAM5(SEQ ID No:28)IgM、及抗BDNF(SEQ ID No:42)IgM。
14)IgM、抗ICAM5(SEQ ID No:28)IgM、及抗BDNF(SEQ ID No:42)IgM。
[0268] 使用QDA分类方法透露，随机背景水平之上最高的三种特征是生物标记物：GFAP及SNCB与自身抗体：体外瓜氨酸化的抗MBP(SEQ ID No:2)组合。
[0269] 实施例6：与具有正常CT的TBI患者相比，从头部CT具有颅内出血的TBI患者获取的血清样本中抗体与生物标记物水平的组合测量
[0270] 为了确定能否区分头部CT具有颅内出血的TBI患者与具有正常CT的TBI患者的血清样本中抗体和生物标记物水平的组合测量，进行组合分析。将在时间0(t0)从具有异常CT的TBI患者获取的血清样本与在时间0(t0)从具有正常CT的TBI患者获取的血清样本比较。
该分析基于464种iChip特征(232种抗原，IgM和IgG)和四种ELISA特征。iChip数据基于两种封闭复本的平均，之后进行校正过程。基于数据可用性而选择ELISA特征；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除具有缺失ELISA数据的样本。
该分析基于464种iChip特征(232种抗原，IgM和IgG)和四种ELISA特征。iChip数据基于两种封闭复本的平均，之后进行校正过程。基于数据可用性而选择ELISA特征；仅使用具有可用于>80％的iChip样本的数据的特征。从该分析中移除具有缺失ELISA数据的样本。
[0271] 图7显示基于100次迭代的70:30交叉验证的六种分类方法(SVM、LR、QDA、CART、RF及LDA)的ROC曲线下的面积。根据其中位数得分或模型内含物的频率，依据所使用的方法，将特征排名。
[0272] 使用LDA分类方法透露，随机背景水平之上最高的五种特征是生物标记物：SNCB与下述自身抗体组合：抗胶原IV(SEQ ID No:66)IgG、抗Oligo24(SEQ ID No:44)IgM、抗EBV IgM和抗胶原II(SEQ ID No:102)IgG。
[0273] 前述对特定具体实施例的说明将因此完全透露本发明的通常特性，通过应用当下的知识，其他人可轻易地修改此类特定具体实施例及/或令其适用于多种应用而不悖离通
用概念，以及，因此，此类改动或修改应该且倾向于被理解为处于所揭露具体实施例等效的意义和范围内。应理解，本文中采用的措辞或术语用于说明而非限制。用于实施所揭露的功能的手段、材料和步骤可采取各种备选形式，而不悖离本发明。
用概念，以及，因此，此类改动或修改应该且倾向于被理解为处于所揭露具体实施例等效的意义和范围内。应理解，本文中采用的措辞或术语用于说明而非限制。用于实施所揭露的功能的手段、材料和步骤可采取各种备选形式，而不悖离本发明。
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