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条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用

阅读：279发布：2021-08-03

专利汇可以提供条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 治疗 领域。最特别地，本发明提供生成在活化配体出现时条件表达受基因表达调节系统控制的一种或多种免疫调节剂的载体的方法和用于动物中治疗目的的应用。可以提供这些载体通过直接注射或通过体外工程改造的细胞如树突细胞来治疗多种 疾病 ，例如 肿瘤 疾病。，下面是条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用专利的具体信息内容。

1.一种条件表达有一种或多种具有治疗蛋白功能的蛋白的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接到通过所述配体依赖性转录因子激活的启动子。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述治疗蛋白选自下组：促血红细胞生长素、生长素释放肽、骨保护素、RANKL、RANKL诱饵（decoy）、TNF-α拮抗剂、IL-1拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、血管他汀、内皮他汀、TNF-α、PP1DCY-LSRLOC、β-葡糖苷酸酶、IL-12、a-半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、b-葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、CLN6蛋白、青少年相关CLN3、N-磺氨基葡糖磺基水解酶（sulfoglucosamine sulfohyrolase）(SGSH)、a-N-乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-辅酶A-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶（iduronidase）、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶（iuduronate sulfatase）和血浆铜蓝蛋白。
3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述治疗蛋白是一种或多种选自下组的免疫调节剂：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNβ、IFNα1、IFNα2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体选自下组：质粒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、双生病毒（geminivirus）、花椰菜花叶病毒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物和生物聚合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述编码所述一种或多种有免疫调节剂功能蛋白的多核苷酸和编码所述有IL-12功能蛋白的所述多核苷酸受所述基因开关调节的启动子控制。
8.如权利要求1-7中任一项所述的载体，其特征在于，所述基因开关是基于蜕皮激素受体(EcR)的基因开关。
9.如权利要求1-8中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。
11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
12.如权利要求1-11中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸编码人类蛋白。
13.如权利要求5-12中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸编码人IL-12。
14.如权利要求3-13中任一项所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂是TNFα。
15.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂是人TNFα。
16.如权利要求3-15中任一项所述的载体，其特征在于，所述免疫调节剂包含与SEQ ID NO:37(人TNFα)至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。
17.如权利要求1-16中任一项所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸是密码子优化的。
18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述编码一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白的多核苷酸还包含编码信号肽的核酸序列。
19.如权利要求18所述的载体，其特征在于，所述编码信号肽的核酸序列是密码子优化的。
20.如权利要求19所述的载体，其特征在于，所述信号肽选自下组：TNFOptUV和IL-2optUV。
21.如权利要求18-20中任一项所述的载体，其特征在于，所述信号肽与野生型TNFα信号肽基因编码的肽序列相比诱导提高的TNFα蛋白分泌。
22.如权利要求1-21中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含5’非翻译区(UTR)。
23.如权利要求22所述的载体，其特征在于，所述5’UTR衍生自TNF野生型或5U2。
24.如权利要求22或23所述的载体，其特征在于，所述5’UTR诱导提高的编码TNFα的mRNA水平、TNFα蛋白病毒表达或两者。
25.如权利要求1-24中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含3’调节区。
26.如权利要求25所述的载体，其特征在于，所述3’调节区是衍生自SV40e或人生长激素(hGH)的聚腺苷酸化信号。
27.如权利要求25或26所述的载体，其特征在于，所述3’调节区诱导提高的编码TNFα的mRNA水平、TNFα蛋白病毒表达或两者。
28.如权利要求27所述的载体，其特征在于，所述载体包含衍生自5U2的5’UTR、密码子优化的IL-2信号肽(IL-2optUV)、由密码子优化的核酸序列编码的TNF-α和衍生自hGH的3’调节区。
29.如权利要求1-28中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体包含选自下组的核酸序列：载体43318、载体43319、载体43320、载体43321、载体43322、载体43322、载体
43323、载体43324、载体43325、载体43326、载体43327和载体43329。
30.如权利要求1-29中任一项所述的载体，其特征在于，所述条件表达所述治疗蛋白的载体直接注射入肿瘤或肿瘤附近。
31.如权利要求1-30中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体在体内给予前不包含于细胞中。
32.一种生成免疫细胞群或治疗支持细胞(TSC)群的方法，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白功能的蛋白，所述方法包含用权利要求1-31中任一项所述载体修饰免疫细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述树突细胞是骨髓树突细胞。
35.一种表达有一种或多种治疗蛋白功能的蛋白的免疫细胞群或TSC群，所述免疫细胞或TSC群包含如权利要求1-34中任一项所述的载体。
36.如权利要求35所述的免疫细胞或TSC群，其特征在于，所述细胞是人树突细胞。
37.一种体外工程改造的免疫细胞或TSC，所述细胞或TSC包含如权利要求1-31中任一项所述的载体。
38.如权利要求37所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，其特征在于，所述免疫细胞或TSC是人树突细胞。
39.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群，如权利要求37-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞群或TSC群，或其组合。
40.一种组合物，所述组合物包含两种或多种如权利要求1-31中任一项所述的载体，两个或多个如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群，两种或多种如权利要求37-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或其组合。
41.如权利要求39或40所述的组合物和药学上可接受运载体。
42.如权利要求39-41中任一项所述的组合物，所述组合物还包含缓冲剂。
43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述缓冲剂是TRIS。
44.如权利要求39-43中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含甘油。
45.如权利要求39-44中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物适于口服、玻璃体内、肿瘤内、腹膜内或皮下给予。
46.如权利要求39-45中任一项所述的组合物，其特征在于，所述细胞群包含至少104细胞。
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47.如权利要求39-46中任一项所述的组合物，其特征在于，所述细胞群包含至少10细胞。
48.如权利要求39-47中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物和所述活化配体同时给予或以任何顺序给予有此需要的哺乳动物时，所述组合物降低肿瘤大小或防止肿瘤形成。
49.如权利要求39-48中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物和所述活化配体同时给予或以任何顺序给予有此需要的哺乳动物时，所述组合物治疗肿瘤。
50.(1)如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的群，如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或如权利要求39-49中任一项所述的组合物，和(2)药物生产中治疗有效量的一种或多种活化配体用于制造药物的应用，所述药物用以治疗有此需要的哺乳动物的疾病或紊乱。
51.如权利要求50所述的应用，其特征在于，所述疾病或紊乱是所述哺乳动物中的肿瘤。
52.如权利要求50或51所述的应用，其特征在于，所述治疗是降低所述哺乳动物中肿瘤的大小或防止肿瘤。
53.(1)如权利要求1-31中任一项所述的载体，如权利要求35-36中任一项所述的群，如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞或TSC，或如权利要求39-49中任一项所述的药物组合物，和(2)药物生产中治疗有效量的一种或多种活化配体用于制造药物的应用，所述药物用于在有此需要的哺乳动物中降低、消除或控制TNFα的系统毒性，其中，所述配体与所述载体或组合物给予同时、或之前、或之后给予，并且其中活化配体给予的时间降低、消除或控制系统毒性。
54.如权利要求50-53中任一项所述的应用，其特征在于，当所述哺乳动物显示副作用时，停止给予所述活化配体。
55.如权利要求50-54中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体、所述群、所述体外工程改造的免疫细胞或TSC或者所述组合物前后小于1小时内给予。
56.如权利要求50-55中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体或所述组合物之后小于24小时内给予。
57.如权利要求50-55中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体或所述组合物之后小于48小时内给予。
58.如权利要求50-57中任一项所述的应用，其特征在于，所述载体不含在细胞中，并且所述载体瘤内给予所述哺乳动物中的肿瘤微环境。
59.如权利要求58所述的应用，其特征在于，免疫细胞或TSC不与所述载体一样瘤内给予。
60.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是良性肿瘤。
61.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤。
62.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是黑素瘤。
63.如权利要求50-59中任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是恶性黑素瘤皮肤癌。
64.如权利要求50-63中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是二酰肼。
65.如权利要求50-64中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。
66.如权利要求50-63中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是酰胺酮和恶二唑啉（oxadiazoline）。
67.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物前后小于1小时内给予。
68.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物之后小于24小时内给予。
69.如权利要求50-66中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体在载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物之后小于48小时内给予。
70.一种测定患者中基于如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-49中任一项所述的组合物的治疗方案功效的方法，所述方法包含：
(a)在给予所述载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞或组合物前，从有此需要的患者获得的第一生物样品中测量干扰素γ（IFN-γ）的表达水平或活性水平或两者，从而生成对照水平；
(b)给予所述患者如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-49中任一项所述的组合物；
(c)给予所述患者治疗有效量的活化配体；
(d)在给予载体、免疫细胞群或TSC群、体外工程改造的免疫细胞和活化配体后，从所述患者获得的第二生物样品中测量IFNγ的表达水平或活性水平或两者，从而生成测试水平；和
(e)比较IFNγ的所述对照水平和测试水平，其中IFNγ的表达、活性或两者的测试水平相对于对照水平增加指示所述治疗方案对所述患者有效。
71.一种试剂盒，所述试剂盒包含(a)如权利要求1-31中任一项所述的载体、如权利要求35-36中任一项所述的免疫细胞群或TSC群、如权利要求35-38中任一项所述的体外工程改造的免疫细胞、或如权利要求39-47中任一项所述的组合物，和(b)激活所述基因开关的配体。
72.如权利要求71所述的试剂盒，其特征在于，所述配体是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
73.一种增加TNF-αmRNA表达或TNF-α蛋白表达的方法，所述方法包含(1)生成如权利要求1-31中任一项所述的载体,其中所述免疫调节剂是TNF-α且其中所述编码一种或多种有免疫调节剂功能的蛋白的多核苷酸还包含一个或多个调节序列，和(2)加入活化配体，其中所述一个或多个调节序列提高所述TNF-α的表达。
74.(a)条件表达蛋白的载体，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，和(b)治疗有效量的一种或多种活化配体在生产用于治疗所需哺乳动物中疾病或紊乱的药物中的应用，
其中，编码基因开关的所述多核苷酸包含
(1)操作性连接到启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白的多核苷酸，操作性连接到由所述配体依赖性转录因子激活的启动子，
所述载体不包含在细胞内；和
其中当给予时，所述配体在所述哺乳动物中诱导所述一种或多种蛋白的表达和治疗所述疾病。
75.如权利要求74所述的应用，其特征在于，所述疾病选自：慢性肾病、骨关节炎、肿瘤学、病毒性上呼吸道感染、猫浆细胞口腔炎、猫酸细胞性肉芽肿、猫白血病病毒感染、犬瘟热感染、系统性真菌感染、心肌病、黏多糖贮积症VII和传染病。
76.如权利要求75所述的应用，其特征在于，所述传染病选自牛呼吸道疾病、猪呼吸道疾病、家禽流行性感冒、鸟类感染性支气管炎、牛脑海绵状病、犬利什曼病、慢性消耗性疾病、人体免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、古典猪瘟、包虫病、流行性肺炎、FIP、口蹄疫、肺腺瘤病、梅迪维斯纳病、动物乳腺炎、犬小孢子菌、Orf(动物疾病)、小反刍兽疫、痘病、鹦鹉喙羽病、狂犬病、地中海热(布氏杆菌病)或牛传染性流产或波状热、马尔他热、接触性流产、传染性流产、沙门菌性食物中毒、肠副伤寒样症状、细菌性痢疾、假结核病、鼠疫、瘟疫热、结核病、霍乱、利斯特菌病、钩端螺旋体性黄疸(细螺旋体病)或钩端螺旋体病、出血性黄疸病(出血性黄疸钩端螺旋体)、乳品业工人发烧(牛钩端螺旋体（L.hardjo）)、回归热、蜱媒回归热、钩端螺旋体性热、流浪热、饥馑热、莱姆关节炎、Bannworth综合症(莱姆病)、蜱传脑膜多神经炎、慢性迁移性红斑、弧菌病、大肠菌感染症（Colibacteriosis）、大肠杆菌毒血症、白泻病、猪肠道水肿、肠副伤寒样症状（paratyphosis）、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌性胃肠炎、犬冠状病毒(CCV)或犬小病毒肠炎、猫感染性腹膜炎病毒、传染性胃肠炎(TGE)病毒、豪氏红口病(ERMD)、感染性造血坏死病毒(IHN)、猪胸膜肺炎放线杆菌(嗜血杆菌属)、麻疯病、链丝菌病、绵羊霉菌性皮炎、马伪鼻疽、惠特莫尔氏病、Francis病、土拉菌病、兔热病、O'Hara病、念珠状链杆菌性热、哈佛希耳热、流性斑、鼠咬热（sodoku）、航运或运输热、出血性败血症、饲鸟病、鹦鹉热、禽衣原体病、北美皮肤芽生菌病、芝加哥病、吉耳克里斯特氏（Gilchrist）病、猫抓热、良性淋巴网状内皮细胞增生、良性非细菌性淋巴结炎、杆菌性血骨病、杆菌性紫癜、寇热、巴尔干流感、巴尔干流感、屠宰场热（abattoir fever）、蜱传热、肺炎立克体病、美国蜱斑疹伤寒、蜱传斑疹伤寒、疱疹样立克次体病、立克次氏体痘疹热、蚤传斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、都市伤寒、癣菌病、皮肤癣菌病、癣、毛癣菌病、小孢子菌病、股癣、脚癣、申克孢子丝菌、双态性真菌、隐球菌病和组织胞浆菌病、良性表皮猴痘、BEMP、猴疱疹病毒、乙型猿猴病毒病、委内瑞拉马脑炎病毒、C型昏睡性脑炎、黄热病、黑色呕吐、汉坦病毒肺综合症、朝鲜出血热、流行性肾病、流行性出血热、出血性肾病肾炎、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、加利福尼亚脑炎/大地病毒脑炎、非洲出血热、绿猴或南非小猿猴病、恐水病、狂犬病（Lyssa）、传染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、麻疹、麻疹、猪和马流感、禽疫、新堡病、梨浆虫病、弓浆虫病、非洲昏睡病、冈比亚锥虫病、非洲锥虫病、南美锥虫病、查加斯病、南美锥虫病、痢疾形虫、小袋虫痢疾、隐孢子虫病、贾第虫病、皮肤利什曼病:糖胶树胶工人（Chiclero）溃疡、鼻咽粘膜利什曼病、pianbols、粘膜皮肤利什曼病（uta）和布巴病（buba）(在美洲)；东方疖、皮肤利什曼病(在旧大陆);巴格达疖、德里疖、包鲁疖，内脏利什曼病:黑热病、微孢子虫病、异尖线虫病、旋毛虫病、血管圆线虫蚴移行症、嗜酸性粒细胞脑膜炎或脑膜脑炎(广州管圆线虫（A.cantonensis）)、腹部管圆线虫病(脊形管圆线虫（A.costaricensis）)、钩虫病、板口线虫病、钩虫病、毛细线虫病、马来丝虫病（Brugiasis）、毒蛔虫病、食道口线虫病、粪类圆线虫病、毛状腺虫病、蛔虫症、裂头绦虫病、裂头蚴病、牛羊棘球蚴病、棘球蚴病、尖绦虫（Echinococcus granulosis）、囊性包虫病、绦虫感染、血吸虫（Schistosoma）、EBV引起的伯奇氏淋巴瘤、劳氏逆转录病毒引起的劳氏肉瘤、8型疱疹病毒引起的卡波济氏肉瘤、HTLV-I逆转录病毒引起的成年T细胞白血病或HTLV-II引起的多毛细胞白血病。
77.如权利要求75所述的应用，其特征在于，所述传染病选自下组：牛呼吸疾病、猪呼吸疾病和禽流感。
78.如权利要求75所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自下组：骨肉瘤、白血病和淋巴瘤。
79.如权利要求74-78中任一项所述的应用，其特征在于，所述一种或多种蛋白
选自下组：促血红细胞生长素、生长素释放肽、骨保护素、RANKL、RANKL诱饵（decoy）、TNF-α拮抗剂、IL-1拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、管他汀、内皮他汀、TNF-α、PP1DCY-LSRLOC、β-葡糖苷酸酶和IL-12。
80.如权利要求74-79中任一项所述的应用，其特征在于，所述一种或多种蛋白选自下组：IL-1、IL-2、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNα、IFNα1、IFNα2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。
81.(a)条件表达蛋白的载体，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，和(b)治疗有效量的一种或多种活化配体在生产用于治疗有此需要的哺乳动物中溶酶体贮积症的药物中的应用，
其中，编码基因开关的所述多核苷酸包含
(1)操作性连接到启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白的多核苷酸，操作性连接到由所述配体依赖性转录因子激活的启动子，
其中所述载体在体内给予前不包含于细胞内；和
其中所述配体在给予时诱导所述哺乳动物中一种或多种蛋白的表达和治疗所述溶酶体贮积症。
82.如权利要求81所述的应用，其特征在于，所述溶酶体贮积症选自下组：庞培氏病/II型糖原贮积病、高歇病(I型、II型、III型)、法布里病、黏多糖贮积症II(亨特综合症)、黏多糖贮积症VI(马-拉二氏(Maroteaux-Lamy)综合症)、黏多糖贮积症I、异染性脑白质营养不良、神经元蜡样质脂褐质沉积病或CLN6病(非典型晚婴型、迟发型变异、若年、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二氏（Jansky-Bielschowsky）病/晚婴型CLN2/TPP1病、库夫斯病/成年发作性NCL/CLN4病、北方癫痫/变异晚婴型CLN8、神经元蜡样脂褐质沉积症(Santavuori-Haltia)/婴儿CLN1/PPT病、β-甘露糖苷病)、巴-斯-沃三氏（Batten-Spielmeyer-Vogt）/青少年NCL/CLN3病、A型沙费利波综合症、B型沙费利波综合症、C型沙费利波综合症、D型沙费利波综合症、MPSI贺勒综合症、尼曼-匹克氏（Niemann-Pick）病(A型、B型、C型、D型)、激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂累积病、α-甘露糖苷病、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯沉积病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏、胱氨酸累积症、Danon病、Farber病、岩藻苷贮积症、半乳糖唾液酸沉积症(Goldberg综合症)、GM1神经节苷脂累积病(婴儿、晚婴型/少年、成年/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积II、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(婴儿发病，迟发性)、黏多醣症(假性赫尔利多营养障碍综合征/黏脂沉积IIIA、沙伊综合症、MPS I贺勒氏-施艾氏(Hurler-Scheie)综合症、莫奎欧氏症A型/MPS IVA、莫奎欧氏症B型MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏、Sly综合症(MPS VII)、黏脂沉积I/唾液酸沉积症、黏脂沉积IIIC,、黏脂沉积IV型)、多发性硫酸酯酶缺乏症、致密性成骨不全症、山霍夫氏病/成年发病/GM2神经节苷脂累积病、山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病-婴幼儿、山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病-青少年、Schindler病、Salla病、婴儿唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs)/GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、天冬氨酰葡糖胺尿症（Asparylglucosaminuria）和鞘脂激活蛋白原（prosaposin）。
83.如权利要求81或82所述的应用，其特征在于，所述溶酶体贮积症选自下组：庞培氏病/II型糖原贮积病、高歇病(I型、II型、III型)、法布里病、黏多糖贮积症II(亨特综合症)、黏多糖贮积症VI(马-拉二氏综合症)、黏多糖贮积症I和异染性脑白质营养不良。
84.如权利要求81-83中任一项所述的应用，其特征在于，所述一种或多种蛋白选自：a-半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、b-葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、CLN6蛋白、青少年相关CLN3、N-磺氨基葡糖磺基水解酶（sulfoglucosamine sulfohyrolase）(SGSH)、a-N-乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-辅酶A-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶（iduronidase）、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase）和艾杜糖醛酸硫酸酯酶（iuduronate sulfatase）。
85.(a)条件表达蛋白的载体，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，和(b)治疗有效量的一种或多种活化配体在生产用于治疗所需哺乳动物中肝病的药物中的应用，其中，编码基因开关的所述多核苷酸包含
(1)操作性连接到启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白的多核苷酸，操作性连接到由所述配体依赖性转录因子激活的启动子，
其中所述载体在体内给予前不包含于细胞内；和
其中所述配体在给予时诱导所述哺乳动物中一种或多种蛋白的表达和治疗所述肝病。
86.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述肝病是乙型肝炎。
87.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述肝病是丙型肝炎。
88.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白是IFN-α。
89.如权利要求85-87中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白是血浆铜蓝蛋白。
90.(a)条件表达蛋白的载体，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，和(b)治疗有效量的一种或多种活化配体在生产用于治疗所需哺乳动物中眼部疾病的药物中的应用，
其中，编码基因开关的所述多核苷酸包含
(1)操作性连接到启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和
(2)编码一种或多种蛋白的多核苷酸，操作性连接到由所述配体依赖性转录因子激活的启动子，
其中所述载体在体内给予前不包含于细胞内；和
其中所述配体在给予时诱导所述哺乳动物中一种或多种蛋白的表达和治疗所述眼部疾病。
91.如权利要求90所述的应用，其特征在于，所述眼部疾病选自：青光眼、开角型青光眼、闭角型青光眼、无虹膜性(niridic)青光眼、先天性青光眼、青少年型青光眼、晶状体诱导青光眼、新生血管性青光眼、外伤后青光眼、类固醇诱导青光眼、Sturge-Weber综合症并发青光眼和色素层炎诱导青光眼、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、黄斑变性、脉络膜新生血管性疾病、血管裂隙和/或视网膜水肿、细菌性结膜炎、真菌性结膜炎、病毒性结膜炎、葡萄膜炎、角膜后沉淀物、黄斑水肿、人工晶体植入术后的炎症反应、葡萄膜炎综合症、视网膜血管炎、肉状瘤病，伊尔斯病，急性视网膜坏死，Vogt-小柳-原田（Vogt Koyanaki Harada）综合症，眼弓形体病、放射视网膜病、增殖性玻璃体视网膜病变、眼内炎、眼部青光眼、缺血性视神经病变、甲状腺相关眼病，眼眶炎性假瘤，色素播散综合症(色素性青光眼)，巩膜炎，表层巩膜炎脉络膜病、视网膜病变(例如,囊样黄斑水肿、中心性浆液性脉络膜病变和眼假组织胞浆菌病综合症、视网膜血管病、视网膜动脉闭塞、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、视网膜色素变性、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、特发性水螅状脉络膜血管病变、黄斑前膜和白内障。
92.如权利要求90或91所述的应用，其特征在于，所述载体玻璃体内给予。
93.如权利要求74-92中任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是人或非人动物。
94.如权利要求74-93任一项所述的应用，其特征在于，所述载体选自下组：质粒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、腺病毒、双生病毒（geminivirus）、花椰菜花叶病毒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白复合物和生物聚合物。
95.如权利要求74-94中任一项所述的应用，其特征在于，所述载体是腺病毒载体。
96.如权利要求74-95中任一项所述的应用，其特征在于，所述基因开关是基于EcR的基因开关。
97.如权利要求74-96中任一项所述的应用，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。
98.如权利要求74-97中任一项所述的应用，其特征在于，所述编码基因开关的多核苷酸包含在启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。
99.如权利要求98所述的应用，其特征在于，所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列通过EMCV内部核糖体进入位点(IRES)连接。
100.如权利要求74-99中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是二酰肼。
101.如权利要求74-99中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。
102.如权利要求74-99中任一项所述的应用，其特征在于，所述配体是酰胺酮和恶二唑啉(oxadiazoline)。

说明书全文

条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其

应用

技术背景

技术领域

[0001] 本发明涉及治疗疾病和紊乱的基因治疗来源，所述疾病和紊乱例如癌症、溶酶体贮积症、眼病、肝病或传染病。在一个实施方式中，本发明提供免疫细胞或治疗支持细胞
(TSC)的工程改造以表达一种或多种治疗蛋白(例如，免疫调节剂)和使用所述细胞作为治
疗。在另一个实施方式中，本发明包含用于条件表达本文所公开治疗蛋白(例如，免疫调节剂（immunodulator）)例如IL-12、TNF-α的载体，例如腺病毒，以及使用这些载体的方法。
[0002] 技术背景
[0003] 白介素12(IL-12)是参与引起很多生物过程的I型细胞因子家族成员，所述生物过程包括但不限于保护性免疫反应和肿瘤发生的抑制(Abdi等，2006;Adorin
i,1999;Adorini,2001;Adorini 等，2002;Adorini 等，1996;Akhtar 等，2004;Akiyama
等，2000;Al-Mohanna 等，2002;Aliberti 等，1996;Allavena 等，1994;Alli 和
Khar,2004;Alzona 等，1996;Amemiya 等，2006;Araujo 等，2001;Arulanandam 等，
1999;Athie 等，2000;Athie-Morales 等，2004;Bertagnolli 等，1992;Bhardwaj 等，
1996;Biedermann 等，2006;Brunda 和 Gately,1994;Buchanan 等，1995;Romani 等，
1997;Rothe 等，1996;Satoskar 等，2000;Schopf 等，1999;Thomas 等，2000;Tsung 等，
1997;Wolf等，1994;Yuminamochi等，2007)。越来越多的证据提示IL-12可以是控制人类
疾病（如癌症）的有希望的靶标。
[0004] 尽管事实上根据其对1型抗肿瘤NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的潜在支持活性，IL-12是有希望的癌症治疗试剂(Trinchieri,2003)，但报道的患者中重组人
IL-12(rhIL-12)的毒性(Atkins等，1997)与临床应用的有限GMP级rhIL-12来源共同妨
碍基于IL-12治疗方案的成功。因此，基因治疗方案可代表更安全、更加可维持的治疗选择看起来是合乎情理的。确实，发现实施瘤内或瘤周递送重组病毒(Sangro等，2004;Triozzi等，2005)或基于质粒IL-12cDNA(Heinzerling等，2005)或IL-12基因修饰的自体成纤维
细胞(Kang等，2001)的I期临床试验安全并良好耐受。
[0005] 然而，接受这些基因治疗的黑素瘤或各种癌症患者中的对象（objective）临床反应罕见、可变、短暂并且主要集中在治疗位点(Heinzerling等，2005;Kang等，2001;Sangro等，2004;Triozzi等，2005)。在疾病部分或全部解决的示例中，已经注意到癌症浸润淋巴细胞的频率增加(Heinzerling等，2005;Sangro等，2004)和循环肿瘤特异CD8+T细胞的水平增高(Heinzerling等，2005)，与这些患者中抗原特异T细胞的交叉激活提高一致。
[0006] 因为所述特异T细胞的交叉激活最好通过作为天然但调控的IL-12来源的树突细胞（DC）来完成(Berard等，2000)，关于基于DC的IL-12基因治疗的优越的临床前功效
的近期报道引起极大的兴趣(Satoh等，2002;Tatsumi等，2003;Yamanaka等，2002)。例
如，显示了肿瘤内(i.t.)注射工程改造的DC以生产IL-12p70(通过重组腺病毒感染)造
成广泛反应性肿瘤特异CD8+T细胞库的交叉激活显著提高，这与鼠模型中肿瘤排斥一致
(Tatsumi等，2003)。鉴于原先使用基于CMV启动子的编码mIL-12的重组腺病毒(rAd.
cIL12,(Tatsumi等,2003))，经工程改造DC的IL-12生成是组成型的，因此，在治疗结果方
面没有解决早期肿瘤损伤内和晚期肿瘤引流淋巴结内的所述细胞因子的所述免疫影响。因
此，需要工程改造用于条件表达IL-12的DC，以调节转基因表达水平和转基因活化时间。本发明提供用于这些细胞的有希望的治疗结果。
[0007] 核酸序列在患者宿主细胞或合适生理环境下表达前，目前临床前或临床试验中研究的很多治疗蛋白在患者中存在时没有显示有害的副作用。然而，一些蛋白例如肿瘤坏死
因子(TNF)在正常生理组织或环境下表达时(例如，暴露于非靶标组织)，造成有害的副作
用。所述蛋白的系统或甚至局部施用对很多非癌症细胞类型极其有毒，增强过敏和恶病质。
另外，对TNFα的长时间暴露可以产生与急性刺激极为不同的细胞反应。基于这些原因，针对癌症的安全和有效的THFα治疗仍然难以捉摸。
[0008] 考虑到与通过包含感兴趣核酸序列所编码蛋白的载体组合物的基因的基因表达相关问题，仍需要用于直接注射或用于基于细胞治疗的经改善转移载体组合物。
[0009] 溶酶体贮积症(LSD)是一类可遗传的遗传病，能同时只被蛋白治疗剂以酶替代疗法的方式治疗。
[0010] LSD是一类49种基因遗传病，特征为一种或多种溶酶体酶的缺乏造成溶酶体内未消化大分子的积累。这些废物的积累造成细胞内溶酶体变大，产生细胞损伤和变性。器官
和组织中积累的损伤造成物理和/或精神状态的进行性退化，并且最终死亡。诊断通常在
幼年完成。个体疾病的严重性不同，并且与缺陷基因生成的残留酶活性量相关。
[0011] LSD的发病率是5000人中约有1例（世界范围130,000例）。严重性不同，并且与缺陷基因生成的残留酶活性量相关。严重受影响的患者可能只活到十多岁，而较少受到严
重影响的患者可以活到成年。
[0012] 酶替代疗法是治疗LSD的唯一可用方法。治疗由靶向溶酶体和降解所积累废物分子的活性蛋白的系统融合组成。LSD蛋白治疗的示例包含用于法布里病（Fabry Disease）
的Fabrazyme(健赞公司(Genzyme))、用于MPSII的Elaprase(希尔公司（Shire）)、和用于
庞培氏病（Pompe Disease）的Myozome(健赞公司)及用于高歇病（Gaucher Disease）的
Cerezyme(健赞公司)。
[0013] 酶替代疗法伴随有某些缺点，例如需要翻译后蛋白修饰、所述替代酶显示体内短的半衰期、和患者发展对所述替代酶的免疫反应。因此，本领域仍需要酶替代疗法和其替代方式以治疗溶酶体贮积症。

发明内容

[0014] 本发明提供在一个或多个启动子控制下具有一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的编码蛋白的重组载体。在一个实施方式中，所述一个或多个启动子是条件型。在另一个实施方式中，所述一个或多个启动子是组成型。在另一个实施方式中，所述载体是编码启动子驱动的蛋白的腺病毒载体，所述启动子能通过提供可溶小分子配体如二酰基肼而
条件激活(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)。这个载体能控制来自免疫细胞、
TSC和来自直接注射包含治疗蛋白的载体中的蛋白(例如免疫调节剂)表达。
[0015] 在一个实施方式中，本发明提供用于条件表达蛋白的载体，所述蛋白有一种或多种包含编码基因开关的多核苷酸的治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能，其中所述编码基因
开关的多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中，所述至少一
个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种有治疗蛋白(例如免
疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸连接到通过所述配体依赖性转录因子
激活的启动子。在一个实施方式中，所述治疗蛋白(例如免疫调节剂)选自IL-1、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNγ、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB
1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、TGFα、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。
[0016] 在另一个实施方式中，本发明提供用于表达有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白和有包含编码基因开关的多核苷酸的IL-12功能的蛋白的载体，其中所
述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录
因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)
功能的所述蛋白的多核苷酸，和(3)编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)
的至少一个多核苷酸连接到由配体依赖性转录因子激活的启动子上。
[0017] 在一些实施方式中，本发明的所述载体条件表达TNFα。在某些实施方式中，条件表达一种或多种有治疗蛋白功能的蛋白（例如免疫调节剂）如TNFα的所述载体例如腺病毒载体，还包含编码信号肽的核酸序列。所述信号肽能是密码子优化。在其他实施方式中，所述载体还包含5’非翻译区(UTR)、3’调节区或两者，并且提高蛋白表达和/或总产率。
[0018] 本发明还提供生产细胞（例如免疫细胞或TSC）群的方法，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白，通过用条件表达有一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的重组载体修饰(例如转染、电穿孔等)所述细胞，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一
个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码
一种或多种有治疗蛋白(例如免疫调节剂)调节剂功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸
连接到由所述配体依赖性转录因子激活的启动子上。
[0019] 在另一个实施方式中，本发明提供生成细胞（例如免疫细胞或TSC）群的方法，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，通过含有编码基因开关的多核苷酸的重组载体修饰所述细胞，其中所述多核苷酸包含(1)
操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依
赖性转录因子，(2)编码有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的所述蛋白的多
核苷酸，和(3)编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一个多核苷酸
连接到由配体依赖性转录因子激活的启动子上。
[0020] 在一些实施方式中，本发明提供某些方法，所述方法增加治疗蛋白(例如免疫调节剂)如TNFα的表达，mRNA表达或蛋白表达，所述蛋白表达包含生成条件表达一种或多
种有治疗蛋白功能的蛋白(例如免疫调节剂)和一种或多种调节序列的所述载体，其中所
述一种或多种调节序列提高治疗蛋白(例如免疫调节剂)例如TNFα的表达。
[0021] 本发明还提供细胞（例如免疫细胞或TSC）群，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白，通过用条件表达有一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的重组载体修饰(例如转染、电穿孔等)所述细胞，其中所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子
序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种
有治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸连接到由所述配体
依赖性转录因子激活的启动子上。
[0022] 在另一个实施方式中，本发明提供细胞（例如免疫细胞或TSC）群，所述细胞表达有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，通过含有编码基因开关的多核苷酸的重组载体修饰所述细胞，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接
启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因
子，(2)编码有一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，和(3)编
码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一个多核苷酸连接到由配体依
赖性转录因子激活的启动子上。
[0023] 在另一个实施方式中，本发明提供包含两个或多个本发明细胞（例如免疫细胞或TSC）群的组合物，其中所述组合物中的每个细胞群表达一种或多种治疗蛋白(例如免疫调
节剂)，所述蛋白与所述组合物中其他细胞群表达的一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节
剂)不同。在一个实施方式中，所述组合物包含两个细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含多于两个细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含三个细胞群。在另一个
实施方式中，所述组合物包含四个细胞群。
[0024] 在另一个实施方式中，本发明提供体外工程改造的细胞，例如免疫细胞或TSC，包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码有治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸连接到通过所
述配体依赖性转录因子激活的启动子。在另一个实施方式中，本发明提供体外工程改造的
细胞，例如免疫细胞或TSC，包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编
码配体依赖性转录因子，(2)编码有治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，
和(3)编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一个多核苷酸连接到
通过所述配体依赖性转录因子激活的启动子。
[0025] 在另一个实施方式中，本发明提供包含本发明的两个或多个体外工程改造细胞（例如免疫细胞或TSC）群的组合物，其中所述组合物中每个所述体外工程改造的细胞群包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的
至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码有治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸连接到通过所
述配体依赖性转录因子激活的启动子，并且其中所述组合物中每个体外工程改造的细胞群
表达一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)，所述蛋白与所述组合物中其他体外工程改
造的细胞群表达的一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)不同。在一个实施方式中，本发
明提供含有两个或多个体外工程改造的细胞（例如免疫细胞或TSC）群的组合物，每个所述细胞群包含含有编码基因开关的多核苷酸的载体，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接
启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因
子，(2)编码有治疗蛋白(例如免疫调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，和(3)编码有IL-12
功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一个多核苷酸连接到通过所述配体依赖性
转录因子激活的启动子。在一个实施方式中，所述组合物包含两个体外工程改造的细胞群。
在另一个实施方式中，所述组合物包含多于两个体外工程改造的细胞群。在另一个实施方
式中，所述组合物包含三个体外工程改造的细胞群。在另一个实施方式中，所述组合物包含四个体外工程改造的细胞群。
[0026] 本发明也提供包含如本文所述的细胞（例如免疫细胞或TSC）群的药物组合物，或适于直接注射细胞群中没有的表达载体（即直接注入）的药物组合物。
[0027] 在一个实施方式中，所述编码一种或多种有免疫调节剂功能的蛋白的多核苷酸受所述基因开关启动子的控制，和所述编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸受组成型启动子
的控制。在另一个实施方式中，编码有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的多核苷酸和编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸都受所述基因开关的多顺反子启动子控制。在另一
个实施方式中，所述编码有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的多核苷酸受所述基因开关的启动子控制，和所述编码有IL-12功能的蛋白的多核苷酸受与所述基因开关启动子
不同的条件启动子控制。在另一个实施方式中，所述编码有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的多核苷酸的基因调节系统和有IL-12功能的的多核苷酸的基因调节系统正交
（orthogonal）。在另一个实施方式中，所述编码每个蛋白的各多核苷酸的基因调节系统正交（orthogonal）。
[0028] 在一个实施方式中，本发明也提供癌症治疗，例如但不限于黑色素瘤，胶质瘤，肾癌和前列腺癌，和本文表1中列举的癌症。IL-12基因疗法当用作重组cDNA载体时，显示动物模型研究中的抗肿瘤效果(Faure等，1998;Sangro等，2005)，但是当用于基因修饰DC环
境时，甚至更加如此(Satoh等，2002;Svane等，1999;Tatsumi等，2003;Yamanaka等，2002)。
然而，至今，实施质粒或病毒载体的IL-12基因治疗的人I期试验没能在癌症环境下实现
持续的、对象临床反应(Heinzerling等，2005;Kang等，2001;Sangro等，2004;Triozzi等，
2005)，如本文所述的基因治疗提供有希望的治疗方法。
[0029] 在一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包含如下步骤：
[0030] (a)向肿瘤微环境（在肿瘤周边的区域）瘤内给予或系统给予免疫细胞群、TSC群或本发明的载体(或其组合)，所述细胞群或载体被体外工程改造以条件表达一种或多种
有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白；和
[0031] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0032] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗所述肿瘤。
[0033] 在一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包含如下步骤：
[0034] (a)向肿瘤微环境瘤内给予免疫细胞群或TSC群，所述细胞群被体外工程改造以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白；和
[0035] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0036] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗所述肿瘤。
[0037] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包含如下步骤：
[0038] (a)向肿瘤微环境瘤内给予两个或多个免疫细胞群或TSC群，所述细胞群被体外工程改造以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白，其中每个免疫细胞群或TSC群表达不同组的一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）；和
[0039] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的一种或多种活化配体；
[0040] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗所述肿瘤。
[0041] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包含如下步骤：
[0042] (a)向肿瘤微环境瘤内给予免疫细胞群或TSC群，所述细胞群被体外工程改造以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中至少一种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）或IL-12功能的所述蛋白受由配体激活的条件启动子控制；和
[0043] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0044] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表达和治疗所述肿瘤。
[0045] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中肿瘤的方法，包含如下步骤：
[0046] (a)向肿瘤微环境瘤内给予两个或多个免疫细胞群或TSC群，所述细胞群被体外工程改造以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中每个免疫细胞群或TSC群表达不同组的一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节
剂）功能的蛋白，其中至少一种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）或IL-12功能的所述蛋白受由配体激活的条件启动子控制；和
[0047] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的一种或多种活化配体；
[0048] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表达和治疗所述肿瘤。
[0049] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中疾病或紊乱的方法，包含如下步骤：
[0050] (a)给予所述哺乳动物修饰的细胞群，所述细胞群经修饰以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白；和
[0051] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0052] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗所述疾病或紊乱。
[0053] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中疾病或紊乱的方法，包含如下步骤：
[0054] (a)给予所述哺乳动物两个或多个修饰细胞群，所述细胞群经修饰以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白，其中每个修饰细胞群表达不同组的一种或多种治疗蛋白（例如免疫调节剂）；和
[0055] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的一种或多种活化配体；
[0056] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗所述疾病或紊乱。
[0057] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中疾病或紊乱的方法，包含如下步骤：
[0058] (a)给予所述哺乳动物修饰细胞群，所述细胞群经修饰以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中至少一种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）或IL-12功能的所述蛋白受由配体激活的条件启动子控制；和
[0059] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0060] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表达和治疗所述疾病或紊乱。
[0061] 在另一个实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中疾病或紊乱的方法，包含如下步骤：
[0062] (a)给予所述哺乳动物两个或多个修饰细胞群，所述细胞群经修饰以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中每个修饰细胞群表达不同组的一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白，其中至少一种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）或IL-12功能的所述蛋白受由配体激活的条件启动子控制；
和
[0063] (b)向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的一种或多种活化配体；
[0064] 从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表达和治疗所述疾病或紊乱。
[0065] 本发明也提供测定基于工程改造细胞如免疫细胞或TSC的治疗功效的方法，所述方法通过测量患者在开始治疗前的IFNγ表达水平或活性，从而生成对照水平，然后给予
工程改造细胞以表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和可选有IL-12功能的蛋白的细胞，给予有效量的活化配体，和然后测量IFNγ表达水平以生成测试水平，并且比较所述对照水平和测试水平以测定所述治疗方案是否有效。
[0066] 还包含在有此需要的哺乳动物中治疗肿瘤、降低肿瘤大小或防止肿瘤形成的方法，包含(a)在所述哺乳动物中给予治疗有效剂量的条件表达至少一种治疗蛋白（例如免
疫调节剂）如IL-12、TNF-α的载体，(b)给予所述哺乳动物治疗有效剂量的一种或多种活
化配体，其中所述活化配体激活有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的表达，从而诱导有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白表达并且治疗所述肿瘤。
[0067] 在一个实施方式中，本发明提供测定患者中基于体外工程改造细胞如免疫细胞或TSC的治疗方案功效的方法，包含：
[0068] (a)在给予体外工程改造的细胞前，从所述有此需要的患者获得的第一生物样品中测量干扰素γ（IFNγ）的表达水平或活性水平或两者，从而生成对照水平；
[0069] (b)给予有此需要的患者体外工程改造的细胞，所述细胞工程改造以条件表达一种或多种有治疗蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白和可选有IL-12功能的蛋白；
[0070] (c)给予所述有此需要的患者治疗有效量的活化配体；
[0071] (d)在给予体外工程改造的免疫细胞和活化配体后，从所述有此需要的患者获得的第二生物样品中测量IFNγ的表达水平或活性水平或两者，从而生成测试水平；和
[0072] (e)比较IFNγ的所述对照水平和测试水平，其中IFNγ的表达、活性或两者的测试水平相对于对照水平的增加指示所述治疗方案对所述有此需要的患者有效。
[0073] 在一个实施方式中，本发明提供在有此需要的哺乳动物中治疗肿瘤、降低肿瘤大小或防止肿瘤形成的方法，包含：(a)向肿瘤微环境瘤内给予条件表达一种或多种有治疗
蛋白（例如免疫调节剂）功能的蛋白的载体，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个
转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码一种或多种有治疗蛋白(例如免疫
调节剂)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接到通过所述配体依赖性转录
因子激活的启动子，其中所述一种或多种治疗蛋白(例如免疫调节剂)选自IL-1、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFN α、IFNγ、IFNα1、IFN α2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋 巴 细 胞 趋 化 因 子 )、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、
4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB 1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、OX40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3,PSA和PSMA，其中所述载体不包含在细胞内；和(b)给予所
述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；从而诱导一种或多种有治疗蛋白（例如免
疫调节剂）功能的蛋白的表达和治疗肿瘤。
[0074] 本发明也提供在有此需要的哺乳动物中治疗疾病的方法，包含：(a)给予所述哺乳动物载体以条件表达蛋白，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸
包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编
码配体依赖性转录因子，和(2)操作性连接由所述配体依赖性转录因子所激活启动子的编
码一种或多种蛋白的多核苷酸，其中，所述载体不包含在细胞内；和(b)给予所述非人的动物治疗有效量的一种或多种活化配体，从而诱导一种或多种蛋白的表达和治疗所述疾病。
[0075] 本发明也提供在有此需要的哺乳动物中治疗溶酶体贮积症的方法，包含：(a)给予所述哺乳动物载体以条件表达一种或多种蛋白，所述载体包含编码基因开关的多核苷
酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至
少一个转录因子序列编码配体依赖性转录因子，和(2)操作性连接由所述配体依赖性转录
因子所激活启动子的编码一种或多种蛋白的多核苷酸，其中所述载体在体内给予前不包含
在细胞内；和(b)给予所述哺乳动物治疗有效量的一种或多种活化配体；从而诱导一种或
多种蛋白的表达和治疗所述溶酶体贮积症。
[0076] 本发明也提供在有此需要的哺乳动物中治疗肝病的方法，包含：(a)给予所述哺乳动物载体以条件表达蛋白，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸
包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编
码配体依赖性转录因子，和(2)操作性连接由所述配体依赖性转录因子所激活启动子的编
码一种或多种蛋白的多核苷酸，其中所述载体在体内给予前不包含在细胞内；和(b)给予
所述非人的动物治疗有效量的一种或多种活化配体，从而诱导一种或多种蛋白的表达和治
疗所述肝病。
[0077] 附图详细说明
[0078] 图1显示编码hIL-12的双顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0079] 图2显示编码hIL-21和hIL-15的双顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0080] 图3显示编码mIL-12的双顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0081] 图4显示编码mIL-21和mIL-15的双顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0082] 图5显示hIL-21的调节启动子表达系统的质粒图。
[0083] 图6显示mIL-21的调节启动子表达系统的质粒图。
[0084] 图7显示编码hIL-12和hIL-21的三顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0085] 图8显示编码mIL-12和mIL-21的三顺反子转录物的调节启动子表达系统的质粒图。
[0086] 图9显示载体rAd.RheoIL12的结构，其中删除E1和E3区且 治疗系统(RTS)-IL-12组分取代所述E1区。标记"IL12"的盒代表由IRES分开的IL-12p40和
IL-12p35编码序列。
[0087] 图10显示翻译、转录后、翻译和翻译后过程的汇总图。
[0088] 图11显示用产物支点(pivot)表示的模块元件。
[0089] 图12显示有开关的腺病毒相容 主链和诱导型模块合成基因的示意图。
[0090] 图13显示包含TNFwt 5’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwt UV开放阅读框(ORF)和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43318)。
[0091] 图14显示包含TNFwt 5’UTR、TNFoptUV信号肽、TNFopt UV ORF和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43319)。
[0092] 图15显示包含TNFwt 5’UTR、IL-2optUV信号肽、TNFoptUV ORF和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43320)。
[0093] 图16显示包含5U25’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43321)。
[0094] 图17显示包含5U25’UTR、TNFoptUV信号肽、TNFoptUV ORF和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43322)。
[0095] 图18显示包含5U25’UTR、IL-2optUV信号肽、TNFoptUV ORF和SV40e+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43323)。
[0096] 图19显示包含TNFwt 5’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43324)。
[0097] 图20显示包含TNFwt 5’UTR、TNFoptUV信号肽、TNFoptUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43325)。
[0098] 图21显示包含TNFwt 5’UTR、IL-2optUV信号肽、TNFoptUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43326)。
[0099] 图22显示包含5U25’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43327)。
[0100] 图23显示包含5U25’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43328)。
[0101] 图24显示包含5U25’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和hGH+pA的3’调节区的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43329)。
[0102] 图25显示包含TNFwt 5’UTR、TNFwtUV信号肽、TNFwtUV ORF和TNFwt3’UTR的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43533)。
[0103] 图26显示包含TNFwt 5’UTR、TNF全长ORF和TNFwt 3’UTR的调节启动子表达系统的腺病毒载体图(载体43534)。
[0104] 图27显示通过 配体有可变PT3组分（-/+）诱导的载体转染HEK293细胞后，标准化TNFα分泌蛋白水平的图示。
[0105] 图28显示通过 配体有可变PT3组分（-/+）诱导的载体转染CHO-K1细胞后，标准化TNFα分泌蛋白水平的图示。
[0106] 图29显示HEK293细胞转染后TNFα分泌倍数的差异。
[0107] 图30显示5U25'UTR和wtUV TNFα5'UTR之间的蛋白分泌差异。
[0108] 图31是显示小鼠B16F0黑素瘤模型中Ad-RTS-IL-12剂量反应研究的线形图。小鼠在第12天以1ee7;1ee8;1ee9;5ee9;1ee10;5ee10病毒颗粒(vp))剂量单一注射
Ad-RTS-IL-12来治疗，并且配体在第11天开始使用饲料递送。x轴显示肿瘤细胞接种后的
天数和y轴指示肿瘤体积。剂量水平显示抗肿瘤的实质效果。指示了与对照相比的肿瘤下
降%。
[0109] 图32是显示体重随研究时程改变的线形图。用y轴上%体重显示所述改变。
[0110] 图33A和33B的线形图显示Ad-RTS-mIL12在Lewis小鼠肺癌（LLC）模型中的抗肿瘤活性（图33A）和安全性（图33B）。Lewis肺癌在免疫活性C57b/6小鼠中皮下生长。当所述肿瘤达到期望的大小时，开始所述治疗。在肿瘤细胞接种后第6、9、13天，动物接受单个剂量的AdRTS-mIL12(1e10vp)。相对于对照动物，有活化因子的Ad-RTS-mIL12显示明显
的抗肿瘤活性。没有注意到大的毒性。
[0111] 图34A和34B的线形图显示小鼠黑素瘤(B16F0)模型中的功效（图34A）和安全性（图34B），其中动物用Ad-RTS-mIL12治疗。肿瘤在C57b/6小鼠的腋下s.c发展。在细胞接
种后第13天（箭头），瘤内给予单个剂量的Ad-RTS-mIL12(1e10vp)。在载体注射前24小时
给予所述活化因子配体(50、100、250、500、750和1000mg/kg)，直到实验结束。用百分比指示所述肿瘤生长抑制并与对照动物作比较。Ad-RTS-IL12显示有广泛活化因子剂量窗口的
治疗优点。所述治疗耐受良好。
[0112] 图35A和35B的线形图显示小鼠结肠癌（CT26Luc）模型中Ad-RTS-mIL12的功效（图35A）和安全性（图35B）。鼠结肠肿瘤在Balb/C小鼠腋下区域皮下生长。在细胞接种
后第11天和18天，动物用Ad-RTS-mIL12以1e10vp/100ul剂量水平瘤内(i.t.)治疗两
次(箭头)。在载体注射前24小时起始活化因子。在整个实验中监控肿瘤体积和体重。
Ad-RTS-mIL12治疗造成相对于对照动物的显著肿瘤生长抑制（100%）。值得注意地是，所有用Ad-RTS-mIL12加活化因子治疗的动物都没有肿瘤。
[0113] 图36A和36B的线形图显示胰腺癌（PAN02）模型中Ad-RTS-mIL12的功效（图36A）和安全性（图36B）。在细胞接种后第7天和14天，皮下PAN02荷瘤小鼠用1e10vp/100ul剂
量水平的单个剂量Ad-RTS-mIL12在瘤内(i.t.)治疗(箭头)。在载体给予前一天，向动
物提供所述活化因子饲料，直到实验结束。对照或单独载体组只接受正常的啮齿动物饲料。
结果表明相对于对照动物，所述Ad-RTS-IL12显示明显的抗肿瘤活性（97%）。Ad-RTS-IL12治疗的结果是没有发现大的体重改变。
[0114] 图37是AD-RTS-mIFNα的载体图。
[0115] 图38是AD-RTS-mTNFα的载体图。
[0116] 图39A和39B的线形图显示乳腺癌（4T1）模型中Ad-RTS-mIL12的功效（图39A）和安全性（图39B）。所述4T1肿瘤在BALB/C小鼠腋下皮下(s.c)生长。荷瘤小鼠随机分
成四组，每组5只；对照没有治疗、仅活化因子配体(L)、仅Ad-RTS-mIL12和有活化因子配
体的Ad-RTS-mIL12。在三个不同时间点，瘤内给予1e10v.p./100μl PBS剂量水平的单个
Ad-RTS-mIL12注射（箭头）。在载体注射前24小时，通过饲料给予所述活化因子配体，直到实验结束。用平均值±SE显示肿瘤大小（体积）和体重(%)。没有治疗的动物（对照）中，肿瘤快速生长。相对于对照，仅用活化因子配体或没有活化因子配体的三个Ad-RTS-mIL12剂
量治疗分别有22%和35%的轻微肿瘤生长抑制。值得注意地是，用Ad-RTS-IL12加活化因
子配体治疗与没有治疗的对照动物相比，造成82%的显著肿瘤生长抑制。在任何治疗中没
有发现大的体重减轻。
[0117] 图40是干扰素α-2a的载体图。
[0118] 详细序列说明
[0119] 治疗蛋白
[0120] 细胞因子
[0121] 就针对感染的炎症反应而言重要的细胞因子白介素1（IL-1）的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号M28983(人IL-1α);M15330(人IL-1β);AF201830(人
IL-1δ);AF201831( 人 IL-1ε);AF201832( 人 1L-1ζ);AF201833( 人
IL-1η);NM_010554( 小 鼠 IL-1α);NM_008361( 小 鼠 IL-1β);NM_019451( 小 鼠
L-1δ); □ NM_019450( 小 鼠 IL-1f6);NM_027163( 小 鼠 IL-1f8);NM_153511( 小 鼠
IL-1f9);NM_204524(鸡IL-1β);NM_017019(大鼠IL-1α);和NM_031512(大鼠IL-1β)，
这些序列通过引用纳入本文。
[0122] 白介素1（IL-1）的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号AAA59134(人IL-1α);AAA59135( 人 IL-1β);AAF25210( 人 IL-1δ);AAF25211( 人
IL-1ε);AAF25212( 人 1L-1ζ);AAF25213( 人 IL-1η);NP_034684( 小 鼠
IL-1α);NP_032387( 小 鼠 IL-1β);NP_062324( 小 鼠 L-1δ); □ □ NP_062323( 小
鼠 IL-1f6);NP_081439( 小 鼠 IL-1f8);NP_705731( 小 鼠 IL-1f9);NP_989855( 鸡
IL-1β);NP_058715(大鼠IL-1α);和NP_113700(大鼠IL-1β)，这些序列通过引用纳入
本文。Laurent等，Psychiatr.Genet.7:103(1997)鉴定人白介素1β中的多态突变。
[0123] 属于细胞因子家族的包含IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的白介素2(IL-2)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号U25676(人);NM_008366(小鼠);NM_204153(鸡);和NM_053836(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0124] 白 介 素 2(IL-2)的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAA70092(人);NP_032392(小鼠);NP_989484(鸡);和NP_446288(大鼠)，这些序列通过
引用纳入本文。
[0125] Liu 等，Appl.Biochem.Biotechnol.133:77(2006) 生 成 突 变 人 IL-2，和Lorberboum等，J.Biol.Chem.265:16311(1990)描述嵌合IL-2的生成。
[0126] 诱导天然辅助T细胞分化成Th2细胞的细胞因子白介素4(IL-4)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号M23442(人);NM_021283(小鼠);NM_001007079(鸡);和
NM_201270(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0127] 白 介 素 4(IL-4)的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAA59150(人);NP_067258(小鼠);NP_001007080(鸡);和NP_958427(大鼠)，这些序列
通过引用纳入本文。
[0128] Kawashima等，J.Med.Genet.35:502(1998)描述与特应性皮炎相关的IL-4基因的多态性。
[0129] 白介素7(IL-7)是对B和T细胞发育重要的细胞因子。IL-7的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号J04156(人);NM_008371(小鼠);NM_001037833(鸡);和
NM_013110(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0130] 白 介 素 7(IL-7)的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAA59156(人);NP_032397(小鼠);NP_001032922(鸡);和NP_037242(大鼠)，这些序列
通过引用纳入本文。
[0131] Feng等，Genetics 175:545(2007)鉴定出造成功能缺陷的IL-7的点突变。
[0132] 白介素9(IL-9)是由T细胞生成的细胞因子和造血细胞的调节剂。IL-9的多核苷酸 序列可获自公 共数据库，登录号 NM_000590(人);NM_008373(小
鼠);NM_001037825(鸡);和NM_001105747(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0133] 白 介 素 9(IL-9)的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_000581(人);NP_032399(小鼠);NP_001032914(鸡);和NP_001099217(大鼠)，这些
序列通过引用纳入本文。
[0134] IL-12是细胞因子，能作为活化T和NK细胞的生长因子，增强NK/淋巴因子激活杀伤细胞的裂解活性，并且通过使外周血单核细胞（PBMC）休止来刺激IFNγ生成。
IL-12的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_000882(人IL12A);NM_002187(人
IL12B);NM_008351( 小 鼠 IL12a);NM_008352( 小 鼠 IL12b);NM_213588( 鸡
IL12A);NM_213571(鸡IL12B);NM_053390(大鼠IL12a);和NM_022611(大鼠IL12b)，这些
序列通过引用纳入本文。
[0135] 白介素12(IL-12)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_000873(人IL12A);NP_002178( 人 IL12B);NP_032377( 小 鼠 IL12a);NP_032378( 小 鼠
IL12b);NP_998753( 鸡 IL12A);NP_998736( 鸡 IL12B);NP_445842( 大 鼠 IL12a); 和
NP_072133(大鼠IL12b)，这些序列通过引用纳入本文。
[0136] 白介素15(IL-15)是调节T和自然杀伤细胞活化和增殖的细胞因子。IL-15的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号U14407(人);NM_008357(小鼠);EU334509(鸡);
和AF015719(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0137] 白 介 素15(IL-15) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAA21551(人);NP_032383(小鼠);ABY55312(鸡);和AAB94536(大鼠)，这些序列通过引
用纳入本文。
[0138] 巨噬细胞生成的细胞因子白介素18(IL-18)与白介素12一起在微生物产物感染后，诱导细胞介导的免疫。IL-18的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
U90434(人);NM_008360(小鼠);EU747333(鸡);和AY258448(大鼠)，这些序列通过引用
纳入本文。
[0139] 白 介 素18(IL-18) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAB50010(人);NP_032386(小鼠);ACE79188(鸡);和AAP14669(大鼠)，这些序列通过引
用纳入本文。
[0140] 通过诱导细胞增殖对免疫系统细胞（包含自然杀伤细胞和细胞毒性T细胞）有潜在调节作用的细胞因子白介素21(IL-21)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
AF254069(人);NM_021782(小鼠);NM_001024835(鸡);和NM_001108943(大鼠)，这些序
列通过引用纳入本文。
[0141] 白 介 素21(IL-21) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAG29348(人);NP_068554(小鼠);NP_001020006(鸡);和NP_001102413(大鼠)，这些序
列通过引用纳入本文。
[0142] 白介素27(IL-27)是在调节B和T淋巴细胞活性中起重要作用的细胞因子。IL-27的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号AY099296(人);NM_145636(小鼠);和
XM_344962(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0143] 白 介 素27(IL-27) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号AAM34498(人);NP_663611(小鼠);和XP_344963(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0144] 结合特异细胞表面受体(IFNAR)的干扰素蛋白组成员并且刺激巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞以引发抗病毒反应的干扰素β1(IFNB1)的多核苷酸序列可获自公共数据
库，登录号NM_002176(人);NM_010510(小鼠);NM_001024836(鸡);和NM_019127(大鼠)，
这些序列通过引用纳入本文。
[0145] 干 扰 素β1(IFNB1) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_002167(人);NP_034640(小鼠);NP_001020007(鸡);和NP_062000(大鼠)，这些序列
通过引用纳入本文。
[0146] 干扰素γ(IFN-γ)是可溶的细胞因子，是唯一的II型干扰素，并且有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤活性。IFN-γ的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
NM_000619(人);NM_008337(小鼠);和NM_138880(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0147] 干 扰 素γ(IFN-γ) 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_000610(人);NP_032363(小鼠);和NP_620235(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0148] 影响脂质代谢、凝结、胰岛素抗性和内皮细胞功能，主要由单核细胞/巨噬细胞分泌的多功能促炎症细胞因子即肿瘤坏死因子(TNFα)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号X02910(人);NM_013693(小鼠);和BC107671(大鼠)，这些序列通过引用纳入本
文。
[0149] TNF α的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号CAA26669(人);NP_038721(小鼠);和AAI07672(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0150] 人TNF α(本文缩写为hTNFα，或简单的hTNF)是人细胞因子，以17kD可溶形式(sTNFα)和26kD膜结合形式(tmTNFα)存在，其生物活性形式由非共价结
合的17kD分子三聚体构成。例如，hTNFα结构描述于Pennica,D.等(1984)Nature
312:724-729;Davis,J.M. 等 (1987)Biochemistry 26:1322-1326; 和 Jones,E.Y. 等
(1989)Nature 338:225-228。TNFα可以结合1型TNF受体(TNFR-1)或2型 TNF受
体(TNFR-2)，并且参与调节免疫细胞、诱导凋亡或炎症或抑制肿瘤发生或病毒复制。
TNF/TNFR结合生成的细胞信号级联反应描述于例如Wajant,H.等(2003)Cell Death
Differ.10(1):45-65或Chen,G.等(2002)Science296:1634-5。
[0151] 全长人TNFα多肽由胞质结构域、跨膜结构域和胞外结构域组成。据报道人TNFα的多肽序列是233aa的多肽序列且在本文称为SEQ ID NO:37，其具有SEQ ID NO:37氨基
酸1-35的胞质结构域、SEQ ID NO:37氨基酸36-56的跨膜结构域、和SEQ ID NO:37氨基酸
57-233的胞外结构域。SEQ ID NO：37是编码SEQ ID NO:35或36的核苷酸序列。人TNFα变
体包括但不限于有下列一种或多种突变的多肽：L105S、R108W、L112F、A160V、S162F、V167A、E222K、F63S、PSD84-86VNR或E183R。
[0152] 趋化因子
[0153] 趋化因子(C基序)配体1(XCL1，也称为淋巴细胞趋化因子)对CD4+和CD8+T细胞而不是单核细胞有趋化性，并且诱导外周血淋巴细胞中胞内钙的提高。XCL1的多核苷酸序
列可获自公共数据库，登录号NM_002995(人);NM_008510(小鼠);和NM_134361(大鼠)，
这些序列通过引用纳入本文。
[0154] XCL1的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_002986(人);NP_032536(小鼠);和NP_599188(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。美国专利号6,022,534公开了淋
巴细胞趋化因子，并且用于吸引细胞毒性T细胞和/或NK细胞，和/或诱导增殖或驻留细
胞。也公开了抗淋巴细胞趋化因子抗体的分离和使用的方法，以及XCL1融合蛋白。
[0155] 参与多形核白细胞募集和活化中急性炎症状态的单核因子（主要由单核细胞和巨噬细胞生成的细胞因子类型）CC趋化因子配体3(CCL3)（也称为巨噬细胞炎性蛋白1
（MIP-1）的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_002983(人);NM_011337(小鼠);
和NM_013025(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0156] CCL3的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_002974(人);NP_035467(小鼠);和NP_037157(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0157] 参与炎症和哮喘的促炎细胞因子CCL5(RANTES)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号AF043341(人);NM_013653(小鼠);和NM_031116(大鼠)，这些序列通过引用纳
入本文。
[0158] CCL5的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号AAC03541(人);NP_038681(小鼠);和NP_112378(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0159] 参与在炎症和癌症侵入中募集巨噬细胞的趋化因子CC趋化因子配体7(CCL7)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_006273(人);NM_013654(小鼠);和
NM_001007612(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0160] CCL7的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_006264(人);NP_038682(小鼠);和NP_001007613(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0161] 趋化因子(CXC基序)配体9(CXCL9，也称为MIG)是由γ干扰素诱导的T细胞化学引诱物。CXCL9的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_002416(人);NM_0108599(小
鼠);和NM_145672(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0162] CXCL9的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_002407(人);NP_032625(小鼠);和NP_663705(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0163] 趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)是在免疫系统细胞化学趋向、T细胞向内皮细胞粘附、抗肿瘤活性和血管生成中起作用的小细胞因子。CXCL10的多核苷酸序列可
获自公共数据库，登录号X02530(人);NM_021274(小鼠);和BC058444(大鼠)，这些序列
通过引用纳入本文。
[0164] 趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号CAA26370(人);NP_067249(小鼠);和AAH58444(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0165] 趋化因子(C-X-C基序)配体12(CXCL12)也称为间质细胞衍生因子1(SDF-1)，是属于间分泌素（intercrine）家族的小细胞因子，其成员活化白细胞并且常由促炎
刺激如LPS、TNF或IL1诱导。CXCL12的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
NM_000609(人);NM_001012477(小鼠);NM_204510(鸡);和NM_001033883(大鼠)，这些
序列通过引用纳入本文。
[0166] CXCL12 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_000600(人);NP_001012495(小鼠);NP_989841(鸡);和NP_001029055(大鼠)，这些
序列通过引用纳入本文。
[0167] Hansson等，Microbes and Infection 8:841(2006)讨论了趋化因子(C-C基序)受体7(CCR7)和趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19，也称为MIP-3β)间的相互作用对产
生初次免疫反应关键。CCR7的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_001838(人);
和NM_007719(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0168] CCR7的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_001829(人);和NP_031745(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0169] CCL19的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_006274(人);和NM_011888(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0170] CCL19的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_006265(人);和NP_036018(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0171] CC趋化因子配体21(CCL21)是对CD4+而不是CD8+T细胞达到其稳定状态“设定点”必需的已充分确立CCR7配体，并且干扰CCL21表达可能改变对自身免疫的
易感性，其多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号AB002409(人);NM_011335(小鼠
CCL21a);NM_011124(小鼠CCL21b);和NM_023052(小鼠CCL21c)；这些序列通过引用纳入
本文。
[0172] CCL21的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号BAA21817(人);NP_035465(小鼠CCL21a);NP_035254(小鼠CCL21b);和NP_075539(小鼠CCL21c)，这些序列通过引用纳入
本文。
[0173] 白介素8(IL-8)是趋化因子，也称为嗜中性粒细胞活化肽1或SCYB8，是数种细胞响应炎性刺激而分泌的组织衍生肽。美国专利号6,133,426和6,177,980公开了人源化抗
IL-8抗体的氨基酸和多核苷酸序列。人IL-8的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
NM_000584，其序列通过引用纳入本文。
[0174] 人IL-8的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_000575，其序列通过引用纳入本文。
[0175] 生长因子
[0176] 粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是用作白细胞生长因子的细胞因子，刺激干细胞生成粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细
胞。GM-CSF的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号M11734(人);NM_009969(小
鼠);EU520303(鸡);NM_001037660(大鼠Csf2ra);和NM_133555(大鼠Csf2rb)，这些序列
通过引用纳入本文。
[0177] 粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号AAA52122(人);NP_034099(小鼠);ACB11534(鸡);NP_001032749(大鼠Csf2ra);和
NP_598239(Csf2rb)，这些序列通过引用纳入本文。
[0178] 可以用作造血干细胞或祖细胞或两者的生长因子受体的FMS相关酪氨酸激酶配体(FLT3/FLK2配体,Flt3L)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号U04806(人);和
NM_013520(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0179] FLT3/FLK2配体(Flt3L)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号AAA17999(人);和NP_038548(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0180] 转化生长因子α(TGFα)在一些人类癌症中上调，能在培养细胞中可逆赋予转化表型，其多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_001099691(人);NM_031199(小
鼠);NM_001001614(鸡);和NM_012671(大鼠),这些序列通过引用纳入本文。
[0181] TGFα 的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_001093161(人);NP_112476(小鼠);NP_001001614(鸡);和NP_036803(大鼠)，这些
序列通过引用纳入本文。
[0182] 佐剂
[0183] β防御素是参与针对很多革兰氏阴性和革兰氏阳性菌、真菌和病毒的先天免疫反应的抗微生物肽。β防御素的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号X92744(人
hBD-1);AJ000152( 人 hBD-2);AF217245( 人 β 防 御 素 -3);AJ314835( 人 β 防 御
素 -4);AB089180( 人 hBD-5);AY122466( 人 防 御 素 β106,DEFB106);AF540979( 人
β 防 御 素 107,DEFB107);AF529416( 人 β 防 御 素 ,DEFB108);DQ012014( 人 β 防
御 素 110,DEFB110);DQ012015( 人 β 防 御 素 111,DEFB111);DQ012016( 人 β 防
御 素 112,DEFB112);DQ012017( 人 β 防 御 素 113,DEFB113);DQ012018( 人 β 防
御 素 114,DEFB114);DQ012019( 人 β 防 御 素 115,DEFB115);DQ012020( 人 β 防
御 素 116,DEFB116);DQ012021( 人 β 防 御 素 117,DEFB117);NM_007843( 小
鼠 防 御 素 β1);NM_010030(小 鼠 防 御 素 β2,Defb2);NM_013756(小 鼠 防 御
素 β3,Defb3);NM_019728( 小 鼠 防 御 素 β4,Defb4);NM_030734( 小 鼠 防 御
素 β5,Defb5);NM_054074( 小 鼠 防 御 素 β6,Defb6);NM_139220( 小 鼠 防 御 素
β7);NM_153108(小鼠防御素β8,Defb8);NM_139219(小鼠防御素β9,Defb9);和
NM_139225(小鼠防御素β10,Defb10);这些序列通过引用纳入本文。
[0184] β防御素的 氨基酸序 列可获自 公共数据 库，登录号 CAA63405(人hBD-1);CAB65126( 人 hBD-2);AAF73853( 人 β 防 御 素 -3);CAC85520( 人 β 防 御
素 -4);BAC10630( 人 hBD-5);AAM93908( 人 防 御 素 β106,DEFB106);AAN33115( 人
β 防 御 素 107,DEFB107);AAQ09525( 人 β 防 御 素 ,DEFB108);AAY59750( 人 β 防
御 素 110,DEFB110);AAY59751( 人 β 防 御 素 111,DEFB111);AAY59752( 人 β 防
御 素 112,DEFB112);AAY59753( 人 β 防 御 素 113,DEFB113);AAY59754( 人 β 防
御 素 114,DEFB114);AAY59755( 人 β 防 御 素 115,DEFB115);AAY59756( 人 β 防
御 素 116,DEFB116);AAY59757( 人 β 防 御 素 117,DEFB117);NP_031869( 小 鼠
防 御 素 β1);NP_034160(小 鼠 防 御 素 β2,Defb2);NP_038784(小 鼠 防 御 素
β3,Defb3);NP_062702(小鼠防御素β4,Defb4);NP_109659(小鼠防御素β5,Defb5);NP
473415(小鼠防御素β6,Defb6);NP_631966(小鼠防御素β7,Defb7);NP_694748(小
鼠防御素β8,Defb8);NP_631965(小鼠防御素β9,Defb9);和NP_631971(小鼠防御素
β10,Defb10),这些序列通过引用纳入本文。对于其他人和大鼠防御素肽序列，还参见美国专利号5,242,902。
[0185] 高迁移率族蛋白1(HMGB1)是用作细胞因子的非组蛋白染色体蛋白，调节对坏死性细胞死亡和癌症、病原体侵入、外伤和败血症的局部和系统反应。HMGB1蛋白的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_002128(人);NM_010439(小鼠);NM_204902(鸡);和
NM_012963(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0186] 高迁移率族蛋白1(HMGB1)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_002119(人);NP_034569(小鼠);NP_990233(鸡);和NP_037095(大鼠)，这些序列通
过引用纳入本文。
[0187] 吞噬S100蛋白调节炎症反应和募集炎症细胞到组织损伤位点，其是对先天免疫重要的损伤相关分子模式(DAMP)分子的成员。参见Foell等，J.Leukocyte
Biol.81:1(2006)。S100蛋白的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号BC014392(人
S100A1);BC002829(人S100A2);BC012893(人S100A3);BC016300(人S100A4);Z18954(人
S100D);BC001431(人S100A6);BC034687(人S100A7);BC005928(人S100A8);BC047681(人
S100A9);BC015973( 人 S100A10);D38583( 人 clagizzarin);NM_011309( 小 鼠
S100a1);NM_009115( 小 鼠 S100b);NM_013650( 小 鼠 S100a8);NM_009114( 小 鼠
S100a9);NM_011310( 小 鼠 S100a3);NM_011311( 小 鼠 S100a4); 和 NM_011312( 小 鼠
S100a5),这些序列通过引用纳入本文。
[0188] S100蛋白 的氨 基酸 序列 可获 自公 共数据 库，登 录号AAH14392( 人S100A1);AAH02829( 人 S100A2);AAH12893( 人 S100A3);AAH16300( 人
S100A4);CAA79479(人S100D);AAH01431(人S100A6);AAH34687(人S100A7);AAH05928(人
S100A8);AAH47681( 人 S100A9);AAH15973( 人 S100A10);BAA07597( 人
clagizzarin);NP_035439(小 鼠 S100a1);NP_033141( 小 鼠 S100b);NP_038678(小 鼠
S100a8);NP_033140(小鼠S100a9);NP_035440(小鼠S100a3);NP_035441(小鼠S100a4);
和NP_035442(小鼠S100a5)，这些序列通过引用纳入本文。
[0189] 植物多糖甘露聚糖是甘露糖的多聚物，用于产生免疫反应。美国专利号5,807,559公开了可以用于针对肿瘤相关糖结构或针对在传染剂和/或感染宿主细胞上表达的糖结构生成T细胞免疫的甘露聚糖免疫偶联物美国专利号5,773,425公开了使用甘露聚糖减轻
症状和/或治愈病毒疾病和增强免疫反应。
[0190] 卡介苗（BCG）是活的减毒分枝杆菌（Mycobacterium）种，用作防止严重和致死结核的疫苗。美国专利号7,393,541公开了生成佐剂疫苗以在哺乳动物对象中产生针对分枝杆菌的体内T细胞介导免疫反应。也参见Hubbard和Collins,Infect.Immun.59(2):570。
美国专利号5,292,513公开了用热灭活BCG在需要增强杀菌和抗病毒活性的患者体内激
发巨噬细胞。BCG完整的基因组序列可获自公共数据库，登录号NC_008769(牛分支杆菌
（M.bovis）BCG巴斯德种1173P2的完整基因组)。
[0191] 细菌脂多糖(LPS)是诱导革兰氏阴性菌感染后强免疫反应的内毒素。美国专利号4,148,877公开了来自细菌培养的LPS分馏和使用所述组分作为药物诱导对细菌感染的抗
性。美国专利号5,292,513公开了在需要增强杀菌和抗病毒活性的患者体内用LPS激发巨
噬细胞。
[0192] 共刺激分子(阳性)
[0193] OX40配体(OX40L)属于肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(Tnfsf4)，在树突细胞上表达并且促进Th2细胞的分化。OX40配体的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
X79929(人);U12763(小鼠);和AF037067(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0194] OX40配体的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号CAA56284(人);AAA21871(小鼠);和AAC67236(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0195] 4-1BB配体(4-1BBL)属于肿瘤坏死因子(配体)超家族成员9(Tnfsf9)，是2型跨膜糖蛋白并在活化T淋巴细胞上表达。4-1BBL的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录
号NM_003811(人);NM_009404(小鼠);和AY332409(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0196] 4-1BB配 体 (4-1BBL)的 氨 基 酸 序 列 可 获 自 公 共 数 据 库，登 录 号NP_003802(人);NP_033430(小鼠);和AAQ01228(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0197] 所述CD40蛋白属于肿瘤坏死因子受体超家族成员5，在调节广泛免疫和炎症反应中重要，所述反应包含T细胞依赖的免疫球蛋白类别转换、记忆B细胞发育和和生发中心的
形成。CD40蛋白的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号X60592(人);NM_170701(小
鼠);NM_204665(鸡);和NM_134360(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0198] CD40蛋白的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号CAA43045(人);NP_733802(小鼠);和NP_989996(鸡)；和NP_599187(大鼠),这些序列通过引用纳入本文。
[0199] CD40L(CD40配体，或CD154)主要在活化T细胞上表达，并且是TNF超家族分子的成员。其结合抗原呈递细胞上的CD40。CD40L起共刺激分子的作用，并且在抗原呈递
细胞上诱导与T细胞受体刺激my MHC分子有关的抗原呈递细胞活化。CD40L有三个结合
伴侣:CD40、α5β1整联蛋白和αIIbβ3。所述CD40L序列可获自公共数据库，登录号
NM_000074和MP_000065(人)和NM_011616和NP_035746(小鼠)。
[0200] 糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族成员相关蛋白（GITR）能通过T细胞刺激来诱发有效的肿瘤免疫。给予抗GITR单克隆抗体(mAb)能引起有效的肿瘤特
异性免疫并在不引起明显的自体免疫疾病情况下消除已建立的肿瘤。见Ko等,J.Exp.
Med.7:885(2005)。美国专利号6,503,184B1公开了抗GITR抗体。
[0201] GITR配体(GITRL)的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号AY358868(人);和AY359852(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0202] GITR配体(GITRL)的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号AAQ89227(人);和AAQ55265(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0203] 疱疹病毒进入介质(HVEM)结合配体(HSVgD)(也称为p30)或LIGHT是参与T细胞共刺激的TNF家族成员。LIGHT有两个受体，疱疹病毒进入介质(HVEM)和淋巴毒素β受
体(LT-βR)。作为HVEM的配体，HSVgD通过用作T细胞的共刺激因子来活化T细胞，引起
T细胞增殖和细胞因子分泌。LIGHT的多核苷酸和氨基酸序列见美国专利号7,118,742。美
国专利5,654,174描述了羧基末端残基缺失的变体gD蛋白。
[0204] CD70是结合CD27的细胞因子。其在T细胞活化中起作用。诱导共刺激T细胞增殖和提高溶细胞性T细胞的产生。CD70的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号
NM_001252(人);NM_011617(小鼠);和NM_001106878(大鼠)，这些序列通过引用纳入本
文。
[0205] CD70的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_001243(人);NP_035747(小鼠);和NP_001100348(大鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0206] ICOS-L是T细胞特异细胞表面受体ICOS的配体，并且用作T细胞增殖和细胞因子分泌的共刺激信号。ICOS-L也诱导B细胞增殖和向浆细胞分化。ICOS-L在调节对炎性病
症的局部组织反应和通过共刺激记忆T细胞功能调节第二免疫反应中起重要作用。ICOS-L
的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_015259(人);和NM_015790(小鼠)，这些序
列通过引用纳入本文。
[0207] ICOS-L的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_056074(人);和NP_056605(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0208] PD-L1(也称为CD274)蛋白在活化的单核细胞、T和B细胞中表达。用IFNγ处理后单核细胞中PD-L1上调，和用IFNγ与其他活化因子一起处理后树突细胞和角质形成细
胞中PD-L1上调。PD-L1蛋白的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_014143(人);
和NM_021893(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0209] PD-L1蛋白的氨基酸序列可获自公共数据库，登录号NP_054862(人);和NP_068693(小鼠)，这些序列通过引用纳入本文。
[0210] 共刺激分子(阴性)
[0211] 细胞毒性T淋巴细胞相关4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族的成员，并且是活化T细胞中表达的共刺激分子。美国专利号7,034,121和6,984,720公开了针对CTLA4抗体的制
备和使用方法。美国专利号6,984,720也公开了抗CTLA4抗体的重和轻链的氨基酸序列。
[0212] PD-1分子是结合PD-1配体(PD-L1)的免疫球蛋白基因超家族的成员。通过PD-L1结合T细胞上的PD-1受体传送共刺激信号到细胞，防止所述细胞通过细胞周期过程并且增
加T细胞增殖。抑制PD-L1和有抗PD-L1抗体的T细胞受体之间的相互作用造成免疫反应
的下调，称为免疫细胞无能(immune cellenergy)。美国专利号7,029,674公开了抗PD-L1
抗体的制备和序列。
[0213] PD-L2主要称为PD-1配体(或人同源物PDCD1)。然而，报道PD-12参与共刺激信号，对采用PDCD1非依赖性方式的T淋巴细胞增殖和IFNγ生成重要。与PDCD1的相
互作用通过阻断细胞周期进展来抑制T细胞增殖，和细胞因子生成。Yamazaki等，J.of
Immunol.169:5538(2002)和Ansari等，J.Exp.Med.198:63(2003)描述了抗PD-L2单克隆
抗体的制备。
[0214] 逆向免疫抑制剂（耐受性抑制剂）
[0215] 转化生长因子-β(TGF-β)是通过与两个跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体（I型和II型）之一的相互作用，调节细胞增殖和分化的多功能蛋白。见Chen等，Science
28:1335(1993)。II型TGF受体(TGFR2)磷酸化和活化I型受体，I型受体自体磷酸
化，然后结合和活化SMAD转录调节物。Lynch MA等，CancerRes.58:4227(1998)描述
了与人卵巢癌有关的II型转化生长因子β受体基因（TGFBR2）的突变。Brand等，
J.Biol.Chem.268:11500-11503(1993)描述了预测的丝氨酸/苏氨酸激酶胞质结构
域的缺失(TGFβR2cDNA H2-3FF的核苷酸1172-2036，获自公共数据库登录号M85079
且氨基酸序列获自登录号AAA61164)损害所有三个TGF-β(1、2和3)依赖性基因表
达。TGF-β在大部分人类癌症中生成，并且抑制肿瘤抗原特异性细胞免疫。Foster等，
J.Immunother.31:500(2008)描述了在细胞毒性T淋巴细胞中显性阴性TGFβR2的表达能
产生对TGF-β抑制效果的抗性。
[0216] TGFβ在诱导转化中与TGFα协同作用。其也用作阴性自分泌生长因子。TGFβ活化和信号传递的失调可以造成凋亡。Ziyadeh等，Proc.Natl.Acad.Sci.97:8015(2000)描
述了给予抗TGFβ抗体能在db/db小鼠中防止肾功能不全和肾小球硬化症，所述小鼠是发
展出明显肾病的II型糖尿病的模型。生成和使用TGFβ单克隆抗体的方法描述于美国专
利号6,419,928。Barcellos-Hoff等，Am J.Pathol.147:5(1995)也描述了生成TGFβ抗
体的方法。TGFβ融合蛋白构建物的氨基酸和核苷酸序列描述于美国专利号6,756,215。
[0217] IL-10是由活化的Th2细胞、B细胞、角化细胞、单核细胞和巨噬细胞生成的细胞因子。IL-10抑制很多细胞因子的合成，包含由活化的巨噬细胞和辅助T细胞生
成的IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-10用于促进活化人B细胞的生长和分
化、抑制Th1反应以防止移植体排斥和T细胞介导的自体免疫疾病。O'Farrell等，
EMBO J.17:1006(1998);Kanbayashi 等，Cell Immunol.171:153(1996);Fukushima 等，
Br.J.Ophthalmol.90:1535(2006);和van Lent等，Ann.Rheum.Dis.66:334(2007)描述了
抗IL10抗体的制备。美国专利号7,326,567公开了IL-10抗体的多核苷酸序列。美国专
利号5,837,232公开了用抗IL-10抗体治疗B细胞介导的自体免疫紊乱的方法。
[0218] 细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族蛋白形成调节细胞因子信号转导的经典负反馈系统的一部分。Alexander等Cell 98:597(1999)描述了细胞因子信号转导抑制因
子1(SOCS1)是干扰素-γ信号转导的重要抑制剂，并且防止此细胞因子潜在的致死新生儿
的作用。Hilton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:114(1999)讨论了SOCS1参与通过JAK/
STAT3通路信号的细胞因子负调节。Ohya等，J.Biol.Chem.272:27178(1997)描述了SOCS
蛋白似乎是通过白介素6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)信号转导的主要调节剂。美国专
利号6,534,277讨论了抗SOCS1抗体的制备和使用的方法，其中编码SOCS1抗体的核酸序
列引入到细胞，从而所述抗体通过所述细胞或其后代表达，并且然后为了治疗效果，体内给予所述重组细胞。美国专利号6,323,317和7,049,418也公开了抗SOCS1抗体。
[0219] TGF-α是促有丝分裂多肽，能结合EGF受体并且与TGF-β协同作用以提高软琼脂中锚定不依赖性细胞增殖。Ellis等，N.Engl.J.Med.317:158(1987)描述了TGF-α
在黑素瘤的某些副肿瘤性表现中起作用。美国专利号4,742,003和Xian等，The J.of
Histochem.&Cytochem.47:949(1999)描述抗TGF-α抗体的制备方法。
[0220] 肿瘤坏死因子受体(TNFR1)和Fas都包含有死亡结构域的胞质Fas相关蛋白(FADD)，对用于程序性细胞死亡（凋亡）和受体寡聚化的Fas和TNF诱导信号转导重要。
鉴定了称为FADD的哺乳动物蛋白，其能结合Fas受体的胞质区或结构域并且抑制FAS介
导的凋亡。FADD的多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号U2423，和氨基酸序列登录号
AAA86517，这些序列通过引用纳入本文。FADD片段或其编码核酸，是功能完整天然FADD的
显性阴性抑制剂，描述于美国专利号6,562,797B1。
[0221] p53(也称为蛋白53或肿瘤蛋白53)是肿瘤抑制蛋白，在人中由TP53基因编码。p53在多细胞生物体中重要，其调节细胞周期并且因此作为预防癌症的肿瘤抑制剂。p53
的氨基酸和多核苷酸序列可获自公共数据库，登录号NM_00546和NP_000537(人)以及
NM_011640和NP_035770(小鼠)。
[0222] 生存素是凋亡家族抑制剂成员。生存素蛋白的功能是抑制半胱天冬酶活化，因此造成凋亡或程序性细胞死亡的负调节。通过破坏生存素诱导通路造成凋亡增加和肿瘤生长
下降来显示上述调节。所述生存素蛋白在大部分人肿瘤和胎儿组织中高表达，但是在最终
分化细胞中全部缺失。因此这使得生存素成为肿瘤治疗的理想靶标，因为靶定肿瘤细胞而
留下正常细胞。生存素表达也通过细胞周期严格调控，并且只在G2-M期表达。已知生存素
通过与微管相互作用，在有丝分裂中定位在有丝分裂纺锤体上，并且可以在调节有丝分裂
中起作用。生存素的调节看似与p53蛋白相连。可获得p53的氨基酸和多核苷酸序列，登
录号NM_001012270和NP_001012270(人)以及NM_001012273和NP_001012273(小鼠)。
[0223] 黑色素瘤相关抗原3(MAGE3)氨基酸序列的登录号为P43357-1(UniParc)。
[0224] 前列腺特异性抗原(PSA)是由前列腺细胞生成的蛋白。PSA在有健康前列腺的男人血清中含量小，但是经常在有前列腺癌和其他前列腺紊乱情况中含量提高。
[0225] 前列腺特异性膜抗原(PSMA)是前列腺组织和一些其他组织中发现的2型膜整合糖蛋白。其是前列腺癌的可能治疗靶标。
[0226] 序列表描述
[0227] SEQ ID NO：1是编码mIL-12和m-IL21的构建物的多核苷酸序列。
[0228] SEQ ID NO：2是编码hIL-12和hIL-21的构建物的多核苷酸序列。
[0229] SEQ ID NO：3是编码mIL-21和mIL-15的构建物的多核苷酸序列。
[0230] SEQ ID NO：4是编码mIL-12的构建物的多核苷酸序列。
[0231] SEQ ID NO：5是编码hIL-21和hIL-15的构建物的多核苷酸序列。
[0232] SEQ ID NO：6是编码hIL-21的构建物的多核苷酸序列。
[0233] SEQ ID NO：7是编码mIL-21的构建物的多核苷酸序列。
[0234] SEQ ID NO：8是编码hIL-21的构建物的多核苷酸序列。
[0235] SEQ ID NO：9是编码mIL-21的多核苷酸序列。
[0236] SEQ ID NO：10是mIL-21的氨基酸序列。
[0237] SEQ ID NO：11是编码mIL-15的多核苷酸序列。
[0238] SEQ ID NO：12是mIL-15的氨基酸序列。
[0239] SEQ ID NO：13是编码mIL-12的mp40的多核苷酸序列。
[0240] SEQ ID NO：14是mIL-12的mp40的氨基酸序列。
[0241] SEQ ID NO：15是编码mIL-12的mp35的多核苷酸序列。
[0242] SEQ ID NO：16是mIL-12的mp35的氨基酸序列。
[0243] SEQ ID NO：17是编码hIL-21的多核苷酸序列。
[0244] SEQ ID NO：18是hIL-21的氨基酸序列。
[0245] SEQ ID NO：19是编码hIL-15的多核苷酸序列。
[0246] SEQ ID NO：20是hIL-15的氨基酸序列。
[0247] SEQ ID NO：21是编码hIL-12的p40的多核苷酸序列。
[0248] SEQ ID NO：22是hIL-12的p40的氨基酸序列。
[0249] SEQ ID NO：23是编码hIL-12的p35的多核苷酸序列。
[0250] SEQ ID NO：24是hIL-12的p35的氨基酸序列。
[0251] SEQ ID NO：25是果蝇（Drosophila）中发现的蜕皮激素响应元件的核酸序列。
[0252] SEQ ID NO：26是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中发现的蜕皮激素响应元件的核酸序列。
[0253] SEQ ID NO：27是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中发现的蜕皮激素响应元件的核酸序列。
[0254] SEQ ID NO：28是寻靶（homing）内切核酸酶(HE)(I-SceI)的限制性位点。
[0255] SEQ ID NO：29是包含人IL-12编码序列:Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)的腺病毒载体DNA序列。
[0256] SEQ ID NO：30是人TNF野生型5'UTR的核酸序列。
[0257] SEQ ID NO：31是5U25'UTR的核酸序列。
[0258] SEQ ID NO：32是编码IL-2信号肽的密码子优化的核酸序列。
[0259] SEQ ID NO：33是编码人TNFα信号肽的野生型核酸序列。
[0260] SEQ ID NO：34是编码人TNFα信号肽的密码子优化的核苷酸序列。
[0261] SEQ ID NO：35是编码人TNFα的野生型核酸序列。
[0262] SEQ ID NO：36是编码人TNFα的密码子优化的核酸序列。
[0263] SEQ ID NO：37是人TNFα的氨基酸序列。
[0264] SEQ ID NO：38是包含编码SV40聚腺苷酸化信号的核苷酸序列的3'调节区的核酸序列。
[0265] SEQ ID NO：39是包含编码人生长激素聚腺苷酸化信号的核苷酸序列的3'调节区的核酸序列。
[0266] SEQ ID NO：40是包含野生型人TNFα3'UTR的核酸序列。
[0267] SEQ ID NO：41是人TNFα3'UTR A-C突变体的核酸序列。
[0268] SEQ ID NO：42是人GAST 5'UTR的核酸序列。
[0269] SEQ ID NO：43是合成3'调节区的核酸序列。
[0270] SEQ ID NO：44是人GAPDH 5'UTR的核酸序列。
[0271] SEQ ID NO：45是编码胰岛素SP的野生型核酸序列。
[0272] SEQ ID NO：46是编码人FGF-19信号肽的野生型核酸序列。
[0273] SEQ ID NO：47是载体43318的核酸序列。
[0274] SEQ ID NO：48是载体43319的核酸序列。
[0275] SEQ ID NO：49是载体43320的核酸序列。
[0276] SEQ ID NO：50是载体43321的核酸序列。
[0277] SEQ ID NO：51是载体43322的核酸序列。
[0278] SEQ ID NO：52是载体43323的核酸序列。
[0279] SEQ ID NO：53是载体43324的核酸序列。
[0280] SEQ ID NO：54是载体43325的核酸序列。
[0281] SEQ ID NO：55是载体43326的核酸序列。
[0282] SEQ ID NO：56是载体43327的核酸序列。
[0283] SEQ ID NO：57是载体43328的核酸序列。
[0284] SEQ ID NO：58是载体43329的核酸序列。
[0285] SEQ ID NO：59是载体43533的核酸序列。
[0286] SEQ ID NO：60是载体43534的核酸序列。
[0287] SEQ ID NO：61是载体VVN2823(Ad-RTS-hIL-12)的核酸序列。
[0288] SEQ ID NO：62是载体VVN2539(Ad-RTS-mIL-12)的核酸序列。
[0289] 发明详述
[0290] 定义
[0291] 除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便
于引用和理解对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示
与本领域常规理解有显著差异。分子生物学术语和/或方法和/或方案的一般理解定义
参见Rieger等，Glossary of Genetics:Classicaland Molecular（遗传学词汇：经典和
分子）,第5版,纽约施普林格出版公司(Springer-Verlag),1991;Lewin,Genes V（基因
V）,纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press),1994;Sambrook等，Molecular
Cloning,A LaboratoryManual（分子克隆，实验室手册）(第3版，2001)和Ausubel等，
CurrentProtocols in Molecular Biology（新编分子生物学实验指南）(1994)。除非另有说明，涉及使用市售可得试剂盒和/或试剂的过程通常按生产商的指南和/或方案和/或
参数适当进行。
[0292] 用于本发明目的的术语“分离”定义从其原始环境（天然存在的环境）移除的生物材料（细胞、核酸或蛋白）。例如，植物或动物的天然状态中出现的多核苷酸没有被分离，然而与其天然存在的相邻核酸分开的相同多核苷酸视作“分离”。
[0293] 术语“纯化”用于不需要材料以显示绝对纯度形式下出现的生物材料，排除其他化合物的出现。这更确切是相对的定义。
[0294] “核酸”，"核酸分子"，"寡核苷酸"，"核苷酸"和"多核苷酸"互换使用，并且指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其采用单链形式或双链螺旋的任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，。可以是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。
术语核酸分子且特别是DNA或RNA分子，仅仅指分子的一级和二级结构，不限定任何特定三
级形式。因此，该术语包含双链DNA，尤其是线状或环状DNA分子(如限制性片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中发现的双链DNA等。当讨论特定双链DNA分子的结构时，本文可以按
常规惯例描述序列，仅在沿非转录的DNA链的5'到3'方向上给出序列(即具有mRNA同源
序列的链）。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包含但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。
[0295] 用于多核苷酸序列的术语“片段”指相对于参照核酸长度减少的核苷酸序列，在所述共有部分包含与参照核酸相同的核苷酸序列。根据本发明的这种核酸片段可以是合适地包含在其作为组分的更大多核苷酸中。这种片段包含寡核苷酸或另外由寡核苷酸组成，
所述寡核苷酸长度为至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、
50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、
1000、1500、2000、3000、4000、5000或本发明所述核酸的更多连续核苷酸。
[0296] 本文使用的“分离核酸片段”指单或双链的RNA或DNA聚合物，可选包含合成、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的经分离核酸片段可包含一个或多个区段的
cDNA、基因组DNA或合成DNA。
[0297] “基因”指包含编码功能分子的核苷酸的多核苷酸，所述功能分子包含只由转录生成的功能分子(例如生物活性RNA种类)或由转录和翻译生成的功能分子(例如多肽)。术语“基因”包含cDNA和基因组DNA核酸。“基因”也指表达特定RNA、蛋白或多肽的核酸片段，包含所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然
基因”指自然存在且具有自身调控序列的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含自然中没有一起发现的调节和/或编码序列。因此，嵌合基因可以包含来自不同来源的
调节序列和编码序列，或来自相同来源但是与天然发现方式不同排列的调节序列和编码序
列。嵌合基因可以包含来自不同来源的编码序列和/或来自不同来源的调节序列。“内源
基因”指在生物体基因组中天然定位的天然基因。“外源”基因或“异源”基因指在宿主生物体内未正常发现，但是通过基因转移引入宿主生物体的基因。外源基因能包含插入到非天
然生物体的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化过程引入到基因组的基因。例如，白介素12(IL-12)基因编码IL-12蛋白。IL-12是35-kD亚基(p35)和40-kD亚基(p40)
通过二硫键连接产生全功能IL-12p70的异二聚体。所述IL-12基因编码p35和p40亚基。
[0298] “异源DNA”指不是天然定位到所述细胞或细胞染色体位点的DNA。异源DNA可以包含对细胞外源的基因。
[0299] 术语“基因组”包含染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。
[0300] 当单链形式的核酸分子在合适的温度和溶液离子强度条件下可与其它核酸分子(如cDNA、基因组DNA或RNA)退火时，该核酸分子与所述其它核酸分子是“可杂交的”。杂
交和洗涤条件熟知且示例于Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual（分子
克隆：实验室手册），第二版，冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor,1989)，特别是其中的第11章和表11.1)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严谨性”。
[0301] 可调整严谨性条件以筛选适度相似的片段，如来自亲缘关系远的生物体的同源序列，到高度相似的片段，如使来自亲缘关系近的生物体的功能酶加倍的基因。对同源核酸的初级筛选而言，能使用对应Tm 55°的低严谨性杂交条件，例如5X SSC、0.1%SDS、0.25%牛
奶且没有甲酰胺；或30%甲酰胺、5X SSC、0.5%SDS。中等严谨性杂交条件对应更高Tm，例如
40%甲酰胺，有5X或6XSSC。高严谨性杂交条件对应最高Tm，例如50%甲酰胺，有5X或6X
SSC。
[0302] 杂交需要包含互补序列的两个核酸，尽管根据所述杂交的严谨性，可以有碱基之间的错配。术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基间的关系。例如，当涉及DNA时，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包含分离的核酸片段，所述片段与本文公开或使用的全部序列以及那些基本相似的核酸序列互补。
[0303] 在本发明的一个实施方式中，多核苷酸通过使用包含在Tm 55°C杂交步骤的杂交条件和使用上述条件来检测。在其他实施方式中，Tm是60°C、63°C或65°C。
[0304] 杂交后的洗涤也决定了严谨条件。一组条件使用一系列的洗涤，始于6XSSC、0.5%SDS室温15分钟（min），然后用2X SSC、0.5%SDS于45℃重复洗涤30min，再用0.2X
SSC，0.5%SDS于50℃洗涤30min并重复两次。一组严谨条件使用更高的温度洗涤，其中洗
涤同上，除了最后两次用0.2X SSC、0.5%SDS洗涤30min的温度升高到60℃。另一组高严谨
条件在0.1X SSC，0.1%SDS中65℃进行最后两次洗涤。
[0305] 杂交核酸的合适严谨性取决于核酸的长度和互补的程度，这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间相似性或同源性的程度越高，有这些序列的核酸杂交体的Tm值越
高。核酸杂交的相对稳定性（对应更高Tm）按下列顺序降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。
对于长度多于100个核苷酸的杂交体，已经推导出计算Tm的方程(见Sambrook等，同上，
9.50-0.51)。对更短核酸（如寡核苷酸）的杂交而言，错配的位置变得更加重要，且寡核苷酸的长度决定其特异性(见Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
[0306] 在本发明的一个实施方式中，通过使用杂交条件测定多核苷酸，所述条件包含少于500mM盐和至少37°C的杂交步骤，以及在温度至少63°C的2X SSPE中的洗涤步骤。
在另一个实施方式中，杂交条件包含用于杂交步骤的小于200mM盐和至少37℃。在另一个
实施方式中，杂交条件包含用于杂交和洗涤步骤的2×SSPE和63℃。
[0307] 在另一个实施方式中，可杂交核酸的长度至少约10个核苷酸。优选可杂交核酸的最短长度是至少约15个核苷酸；例如，至少约20个核苷酸；例如，至少约30个核苷酸。
另外，技术人员会认识到，根据诸如探针长度等因素，必要时可以调整温度和洗涤溶液盐浓度。
[0308] 术语“探针”指单链核酸分子，所述分子能与互补单链靶标核酸碱基配对以形成双链分子。
[0309] 本文使用的术语“寡核苷酸”指与基因组DNA分子、cDNA分子、质粒DNA或mRNA分32
子可杂交的短核酸。寡核苷酸能用如 P核苷酸或共价连接有标记如生物素的核苷酸来标
记。标记的寡核苷酸能用作检测核酸出现的探针。寡核苷酸（二者其一可以被标记）能用作PCR引物以用于克隆全长或核酸片段，用于DNA测序，或检测核酸的出现。寡核苷酸也能用
于与DNA分子形成三螺旋。通常，寡核苷酸优选在核酸合成器上合成制备。因此，寡核苷酸能用非天然产生的磷酸酯类似物键例如硫酯键等制备。
[0310] “引物”指寡核苷酸，所述寡核苷酸与靶标核酸序列杂交以生成能用作合适条件下DNA合成起始位点的双链核酸区。这种引物可用于聚合酶链反应或DNA测序。
[0311] “聚合酶链反应”缩写为PCR，指酶学扩增特异核酸序列的体外方法。PCR涉及重复系列的温度循环，每个循环包含三个阶段：变性模板核酸以分离靶标分子的链，退火单链PCR寡核苷酸引物到模板核酸，和通过DNA聚合酶延伸退火引物。PCR提供检测靶标分子出
现的方法，并且在定量或半定量条件下，测定核酸的起始库中靶标分子的相对量。
[0312] “逆转录聚合酶链反应”缩写为RT-PCR且指一种体外方法，所述方法用于酶促生成靶标cDNA分子或来自一个或多个RNA分子的分子，然后如上述酶促扩增一个或多个靶标
cDNA分子内的一种或多种特异核酸序列。RT-PCR提供检测靶标分子出现的方法，并且在定
量或半定量条件下，测定核酸的起始库中靶标分子的相对量。
[0313] DNA“编码序列”或“编码区”指某一双链DNA序列，所述序列当置于合适调节序列控制下时在细胞中、离体、体外或体内编码多肽并且能被转录和翻译成多肽。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码序列)的核苷酸序
列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或翻译。调控序列可包含启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应器结合位点和茎环结构。编码序列的边界由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编
码序列包括但不限于，原核序列、来自mRNA的cDNA、基因组DNA序列和甚至合成DNA序列。
如果所述编码序列意在用于真核细胞中的表达，聚腺苷酸化信号和转录终止序列常位于该
编码序列的3’。
[0314] “开放阅读框”缩写为ORF，指包含翻译起始信号或起始密码子如ATG或AUG和终止密码子并且能潜在翻译成多肽序列的某一核酸序列（DNA、cDNA或RNA）长度。
[0315] 本文使用术语“头对头”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的5’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的5’末端时，两个多核苷酸以头对头
方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向远离另一多核苷酸的5’末端前进。术语“头对头”可以缩写为(5’)-(5’)，并且也可以由符号(←→)或(3’←5’5’→3’)指示。
[0316] 本文使用术语“尾对尾”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的3’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的3’末端时，两个多核苷酸以尾对尾
方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向朝向另一多核苷酸前进。术语“尾对尾”可以缩写为(3’)-(3’)，并且也可以由符号(→←)或(3’→3’5’←3’)指示。
[0317] 本文使用术语“头对尾”描述彼此相关的两个多核苷酸序列的方向。当一个多核苷酸的编码链的5’末端毗邻另一多核苷酸的编码链的3’末端时，两个多核苷酸以头对尾方向放置，其中每个多核苷酸的转录方向以与另一多核苷酸相同的方向前进。术语“头对尾”可以缩写为(5’)-(3’)，并且也可以由符号(→→)或(5’→3’5’←3’)指示。
[0318] 术语“下游”指位于参照核苷酸序列3’的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列通常指转录起始点后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始点的下游。
[0319] 术语“上游”指位于参照核苷酸序列5’的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸序列通常涉及位于编码序列或转录起始点的5’端的序列。例如，大部分启动子位于转录起始点的上游。
[0320] 术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”互换使用，指在双链DNA内结合和剪切特异核苷酸序列的酶。
[0321] "同源重组"指插入外源DNA序列到另一个DNA分子中，例如插入载体到染色体中。优选地，所述载体靶向同源组合的特定染色体位点。对特异同源重组而言，所述载体会包含足够长的与染色体序列同源区域以使载体与染色体互补结合并纳入其中。更长的同源
区域和更高的序列相似性程度可以增加同源重组的效率。
[0322] 本领域已知的数个方法可以用于根据本发明扩增多核苷酸。一旦建立合适宿主系统和生长条件，重组表达载体能大量增殖和制备。本文所述能使用的表达载体包括但不限
于下列载体或其衍生物：人或动物病毒例如疫苗病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；
酵母载体；噬菌体载体(例如λ)，和质粒和粘粒DNA载体等等。
[0323] “载体”指用于克隆和/或转移核酸到宿主细胞的任何载剂。载体可以是连接另一DNA区段的复制子，以实现所连接区段的复制。“复制子”指用作体内DNA自主复制单
位的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，即能够在其自身控制下进行复制。术语“载体”包含体外、离体或体内引入核酸到细胞的病毒和非病毒载剂。可使用
本领域已知的大量载体来操纵核酸，将响应元件和启动子纳入基因等。可能的载体包括例
如：质粒和修饰的病毒，包括例如噬菌体如λ衍生物，或质粒如pBR322或pUC质粒衍生
物，或Bluescript载体。本发明使用的载体的另一个示例是 生成系统
（Production System）(弗吉尼亚州布莱克斯堡（Blacksburg）的英创松公司（Intrexon）)，如WO 2007/038276中描述。例如，将对应响应元件和启动子的DNA片段插入到合适载体能
通过连接合适DNA片段到有互补粘性末端的选定载体来完成。或者，DNA分子的末端可以酶
学修饰或任何位点可以通过连接核苷酸序列（接头）到DNA末端来生成。这种载体可以工程改造成包含选择标记基因，能选择整合标记到细胞基因组的细胞。这种标记能鉴定和/或
选择整合和表达标记所编码蛋白的宿主细胞。
[0324] 病毒载体且特别是逆转录病毒载体，用于细胞和活体动物对象中的各种基因递送应用。能使用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、疫苗病毒、单纯疱疹病毒、爱波斯坦-巴尔病毒、腺病毒、双生病毒（geminivirus）和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂(cytofectin))、DNA-蛋
白质复合物和生物聚合物。除了核酸之外，载体还可包含一个或多个调控区，和/或用于选择、测量和监测核酸转移结果(转移到哪个组织、表达持续时间等)的选择性标记物。
[0325] 术语“质粒”指通常载有不是细胞中枢代谢（central metabolism）一部分但常采用环状双链DNA分子形式的基因的染色体外元件。这些元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，源自任何来源，其中大量核苷酸序列已连接或重组入能够将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与
合适的3’未翻译序列引入细胞的独特结构。
[0326] "克隆载体"指“复制子”，是顺序复制和包含复制起点的单位长度的核酸（优选DNA）例如质粒、噬菌体或粘粒，其可以连接另一个核酸区段，从而产生所述连接区段的复制。克隆载体能在一种细胞类型中复制并且在另一种中表达(“穿梭载体”)。克隆载体可
以包含用于细胞选择的一个或多个序列，所述细胞包含所述载体和/或一个或多个插入感
兴趣序列的多克隆位点。
[0327] 术语“表达载体”指设计成能表达所插入核酸序列的载体、质粒或载剂。克隆基因，如插入的核酸序列，通常置于对照元件（如启动子、最小启动子、增强子等）的控制下。用于驱动需要宿主细胞中核酸表达的起始控制区或启动子有多个，并且为本领域技术人员熟
悉。能驱动这些基因表达的几乎任何启动子能用于表达载体，包括但不限于病毒启动子、
细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发病或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调节启动子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于酿酒酵母（Saccharomyces）中的表达)；AOX1启动子(用于毕赤酵母（Pichia）
中的表达)；β-内酰胺酶、lac、ara、tet、trp、lPL、IPR、T7、tac和trc启动子(用于大肠杆菌（Escherichiacoli）中的表达)；光调节、种子特异性、花粉特异性、卵巢特异性、花椰菜花叶病毒35S、CMV 35S最小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮
糖-1,5-二磷酸羧化酶、苗特异性、根特异性、壳多糖酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、植物超-启动子、马铃薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸还原酶、甘露碱合酶、胆脂碱合酶、泛素、玉米醇溶蛋白和花色苷启动子(用于植物细胞中的表达)；本领域已知的动物和哺乳动物
启动子，包括但不限于，SV40早期(SV40e)启动子区、包含于劳氏（Rous）肉瘤病毒(RSV)的
3’长末端重复序列(LTR)的启动子、E1A的启动子或腺病毒(Ad)的主要晚期启动子(MLP)
基因、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒
IE1启动子、延伸因子1α(EF1)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛素(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子调节序列和转录控制区、遍在启动子(HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间纤维启动子(人结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)、治疗基因启动子(MDR、CFTR或因子VIII型等)、发病或疾病相关启动子、和显示组织特异
性并用于转基因动物的启动子例如胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；胰
腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区,淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区,
睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区；白蛋白基因、肝中有活性的Apo AI和Apo AII控制区、肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区、肝中有活性的α1抗
胰蛋白酶基因控制区、骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区、脑内少突细胞中有活性
的髓磷脂碱性蛋白基因控制区、骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区和下丘脑中
有活性的促性腺激素释放激素基因控制区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白启动子、平滑肌细胞α-肌动蛋白启动子等。另外，这些表达序列可以通过加入增强子或调节序列等调控。
[0328] 载体可以通过本领域已知的方式引入所需的宿主细胞，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE右旋糖苷、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因
枪、或DNA载体转运子(参见例如，Wu等，J.Biol.Chem.267:963(1992)；Wu等，J.Biol.
Chem.263:1462114624(1988);和Hartmut等，加拿大专利申请号2,012,311)。
[0329] 根据本发明的多核苷酸也能通过脂质转染体内引入。在过去的十年中，越来越多使用脂质体以体外包封和转染核酸。设计成限制脂质体所介导转染遭遇的困难和危险的
合成阳离子脂质，能用于制备脂质体以体内转染编码标记的基因(Felgner等，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.84:7413(1987);Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8027(1988)；和
Ulmer等，Science 259:1745(1993))。使用阳离子脂质促进带负电核酸的包封，也促进与
带负电细胞膜的融合(Feigner等，Science 337:387(1989))。用于转移核酸的尤其有用的
脂质化合物和组合物如WO95/18863、WO96/17823和US5,459,127所述。使用脂质转染体
内引入异源基因到特定器官有某些实用优点。分子靶向脂质体到特定细胞代表一个优势方
面。显然，指向特定细胞类型的转染会在有细胞异质性的组织例如胰腺、肝、肾和脑中特别优选。脂质可以化学偶联到另一个分子以用于靶向目的(Mackey等，1988，同上)。靶定的
肽（例如激素或神经递质）和蛋白（例如抗体）或非肽分子可以化学偶联到脂质体。
[0330] 其他分子也用于辅助体内核酸转染，例如阳离子寡肽(例如WO95/21931)，源自DNA结合蛋白的肽(例如WO96/25508)或阳离子聚合物(例如WO95/21931)。
[0331] 也可将载体作为裸露DNA质粒体内引入(参见美国专利号5,693,622、5,589,466和5,580,859)。也能使用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum.Gene
Ther.3:147(1992);和Wu等，J.Biol.Chem.262:4429(1987))。
[0332] 术语“转染”指细胞摄入外源或异源RNA或DNA。当这种RNA或DNA引入到细胞内时，细胞被外源或异源RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA影响表型改变时，细胞被外
源或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA能整合（共价连接）到染色体DNA中构成所
述细胞的基因组。
[0333] “转化”指将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，引起遗传上稳定的遗传。包含转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
[0334] 另外，包含根据本发明多核苷酸的重组载体可以包含细胞宿主中的一个或多个复制启点，其试图扩增或表达标记或选择标记。
[0335] 术语“选择标记”指能基于标记基因效果来选择的鉴定因子，通常是抗生素或化学抗性基因，所述效果即耐受抗生素、耐受除草剂、比色标记物、酶、荧光标记物等，其中所述效果用于追踪感兴趣核酸的遗传和/或鉴定遗传所述感兴趣核酸的细胞或生物。本领域已知并使用的可选择标记基因的例子包括：提供耐受氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的基因；和可用作表型标记物的基因，即花色素苷调节基因、异戊烯转移酶基因等。
[0336] 术语“报道基因”指编码能基于报道基因效果分辨的鉴定因子的核酸，其中所述效果用于追踪感兴趣核酸的遗传，鉴定遗传有感兴趣核酸的细胞或生物，和/或测量基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道基因的例子包含：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸酶(Gus)等。选择
标记基因也视作报道基因。
[0337] “启动子”和“启动子序列”互换使用，并且指能控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可整体来自于天然基因，或由来自不同天然启动子的不同元件所组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应了
解，不同的启动子可指导不同组织或细胞类型中的基因表达，或在不同发育阶段，或响应不同的环境或生理条件反应。在多数时候引起大部分细胞类型中基因表达的启动子通常称作
“组成型启动子”。引起基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为“细胞特异启动子”或“组织特异启动子”。引起基因在特定发育或细胞分化的阶段中表达的启动子通常称为“发育特异启动子”或“细胞分化特异启动子”。用诱导启动子的试剂、生物分子、化学、配体、光等接触或处理细胞后，诱导并引起基因表达的启动子通常称为“诱导型启动子”或“调节启动子”。还应认识到，由于多数情况下调控序列的精确界限未完全确定，不同长度的DNA片段可有相同的启动子活性。
[0338] 本发明的任何载体中，载体可选包含本文公开的启动子。在一个实施方式中，所述启动子是列于本文表1的启动子。
[0339] 本发明的任何载体中，载体可选包含组织特异启动子。在一个实施方式中，所述组织特异启动子是本文公开的组织特异启动子。在另一个实施方式中，所述组织特异启动子是列于本文表2的组织特异启动子。
[0340] 通常启动子序列的3'末端界限为转录起始位点且向上游(5’方向)延伸，以包括起始高于背景的可检测转录水平所需的最小数目碱基或元件。启动子序列内部可找到转录
起始位点(易通过例如核酸酶S1作图确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构
域(共有序列)。
[0341] "治疗开关启动子"(″TSP")指控制基因开关组分表达的启动子。基因开关和其各种组分在本文其他地方详细描述。在某些实施方式中，TSP是组成型，即持续活性。组成型TSP可以是组成型普遍存在(即通常在任何组织或细胞中有功能，而不需要额外因子或
调节物)或者组成型组织或细胞特异(即通常在特定细胞种类或细胞类型中有功能，而不
需要额外因子或调节物)。在某些实施方式中，本发明的TSP在与疾病、紊乱或病症相关的
条件下活化。在涉及两个或多个TSP的某些本发明实施方式中，所述启动子可以是组成型
和可活化启动子的组合。本文使用的"在与疾病、紊乱或病症相关的条件下活化的启动子
"包括但不限于疾病特异启动子，响应特定生理、发育、分化或病理条件的启动子、响应特定生物分子的启动子、和对所述疾病、紊乱或病症相关特定组织或细胞类型（如肿瘤组织或恶性细胞）特异的启动子。TSP能包含天然产生的启动子序列、衍生自天然产生启动子的修饰序列、或合成序列(例如将响应元件插入最小启动子序列以改变所述启动子的反应)。
[0342] 当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后反式RNA剪接（如果编码序列包含内含子）和翻译成由编码序列编码的蛋白时，编码序列是在细胞中转录和翻译控制序列“控制下”。
[0343] “转录和翻译控制序列”指提供宿主细胞中编码序列表达的DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是控制序列。
[0344] 术语“响应元件”是一种或多种顺式作用的DNA元件，它能够通过与转录因子的DNA-结合结构域相互作用介导赋予启动子反应性。这种DNA元件可以是回文序列(完美
或不完美)或者由可变数量的核苷酸分隔的序列基序或半位点(half sites)组成。半位
点可以类似或者相同，并排列成正向或反向重复序列或者形成单个半位点或相邻半位点串
联形成的多聚体。所述响应元件可以根据要整合响应元件的细胞或生物的性质，包含从不
同生物分离的最小启动子。有或没有配体时，转录因子DNA结合结构域结合响应元件的
DNA序列以启动或抑制受该响应元件调控的下游基因的转录。天然蜕皮激素受体的响应元
件的DNA序列的示例包含：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO:25)(见Cherbas等，Genes
Dev.5:120(1991));AGGTCAN(n)AGGTCA,其中N(n)是一个或多个间隔子核苷酸(SEQ ID
NO:26)(见D'Avino等，Mol.Cell.Endocrinol.113:1(1995));和GGGTTGAATGAATTT(SEQ ID
NO:27)(见Antoniewski等，Mol.Cell Biol.14:4465(1994))。
[0345] 术语“操作性连接”表示单一核酸片段上结合核酸序列，从而彼此影响功能。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子操作性连接于编码序列。编码序列以有义或反义方向操作性连接于调控序列。
[0346] 本文所用的术语“表达”指源自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达也可以指mRNA翻译形成蛋白质或多肽。
[0347] 术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”指能够在特定限制位点或者通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA区段。该DNA区段包括编码感兴趣多肽的多核苷酸，盒和限制位点设计成能够确保盒插入适当读码框进行转录和翻译。“转化盒”指包含编码感兴趣多肽的多核苷酸并具有除有利于特定宿主细胞转化的多核苷酸之外元件的特定载体。本发明的
盒、表达盒、基因表达盒和转化盒也可以包含使宿主细胞中编码感兴趣多肽的多核苷酸表
达增强的元件。这些元件包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、响应元件、终止子序列、聚腺苷酸化序列等。
[0348] 就本发明的目的而言，术语“基因开关”指启动子相关的响应元件和基于配体依赖性转录因子系统的组合，所述系统在一个或多个配体出现时，调节整合响应元件和启动子的基因表达。术语“编码基因开关的多核苷酸”指启动子相关的响应元件和编码基于配体
依赖性转录因子系统的多核苷酸的组合，所述系统在一个或多个配体出现时，调节整合响
应元件和启动子的基因表达。
[0349] 本发明的治疗开关启动子可以是任何用于治疗、改善或预防特定疾病、紊乱或病症的启动子。示例包括但不限于，只在特定疾病、紊乱或病症中显示表达增加的基因的启动子和显示特定细胞条件（例如增殖、凋亡、pH改变、氧化状态、氧含量）下表达增加的基因的启动子。在基因开关包含多于一个转录因子序列的一些实施方式中，通过联合疾病或病症
特异性启动子和组织或细胞类型特异性启动子以限定表达治疗产物的组织，来提高治疗方
法的特异性。因此，组织或细胞类型特异性启动子包含在治疗开关启动子定义中。
[0350] 作为疾病特异性启动子的示例，治疗癌症的有用启动子包含癌基因的启动子。癌基因种类的示例包括但不限于，生长因子、生长因子受体、蛋白激酶、程序性细胞死亡调节物和转录因子。癌基因的特定示例包括但不限于sis、erbB、erb B-2、ras、abl、myc和bcl-2和TERT。其他癌症相关基因的示例包含在肿瘤细胞中过量表达的肿瘤相关抗原基因和其他
基因(例如MAGE-1、癌胚抗原、酪蛋白酶、前列腺特异抗原、前列腺特异膜抗原、p53、MUC-1、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-1、gp100、GM2、Tn、sTn和Thompson-Friedenreich抗原(TF))。
[0351] 为本领域已知并且用作本发明治疗开关启动子的启动子序列和其他调节元件（例如增强子）的示例，以及每个启动子相关的疾病/紊乱(表1)或组织特异性(表2)，在表
1和2所列参考文献中公开。这些参考文献中公开的启动子序列通过引用全文纳入本文。
[0352] 编码表1所列任何蛋白的多核苷酸也可以使用本发明载体和非治疗启动子的启动子来表达。
[0353] 表1
[0354]
[0355]
[0356]
[0357] 表2
[0358]
[0359]
[0360] 在特定疾病或紊乱中显示表达水平改变并且因此可以提供用于本发明启动子的其他基因包括但不限于表3列举的基因(与所述相关疾病/紊乱一起)。
[0361] 表3
[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368]
[0369]
[0370]
[0371] 一旦鉴定了具有在疾病、紊乱或病症中调节的表达模式的基因，基因的启动子可以用于本发明的基因开关。很多基因的序列（包含启动子区）为本领域已知并且可获自公共数据库（例如GenBank）。因此，一旦鉴定了合适的基因，易于鉴定和获得启动子序列。本发明的另一方面是针对鉴定其启动子能被分离并置于基因开关的合适基因。因此，由于所述启
动子能分离并用于后续设置或环境中，所述基因性质对本发明的特定实施方式不重要。因
此本发明包含使用仍需鉴定的基因的启动子。一旦鉴定了合适基因，测定启动子功能所需
的基因序列是常规技术或实验的问题。确实，存在数个市售方案以帮助测定感兴趣基因的
启动子区。举例来说，Ding等通过累进删除人Sprouty4基因的5′侧翼序列，近期阐明了新的Sprouty4基因的启动子序列(Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.287:L52(2004)，
通过引用纳入)。简单而言，一旦确定转录起始位点，使用通用PCR引物以单向方式克隆5′侧翼区段来生成PCR片段。所生成的片段克隆到荧光素酶报道载体并且测量荧光素酶活性
以测定人Sprouty4基因的启动子区。
[0372] 获得和证实基因启动子的方案的另一个示例包含下列步骤：(1)获得相似/相同组织类型的患病和非患病细胞/组织样品；(2)从样品中分离总RNA或mRNA；(3)进行患病
和非患病RNA的差异微阵列分析；(4)鉴定候选疾病特异转录物；(5)鉴定与疾病特异性转
录物相关的基因组序列；(6)获得或合成所述疾病特异性转录物的预测转录起始位点上游
和下游的DNA序列；(7)使用步骤6的不同长度DNA设计和生成启动子报道载体；和(8)在
患病和非患病细胞/组织以及不相关的细胞/组织中检测启动子报道载体。
[0373] 插入到基因开关的启动子来源可以是天然的或合成的，并且启动子来源应该不限定本文所述发明的范围。换言之，所述启动子可以直接从细胞中克隆，或所述启动子可以从不同来源事先克隆，或所述启动子可以合成。
[0374] 基因开关系统
[0375] 所述基因开关可以是通过加入或移除特定配体来调节基因表达的任何基因开关。在一个实施方式中，所述基因开关是基因表达水平依赖于所出现配体水平的基因开
关。可以用于本发明基因开关的配体依赖性转录因子复合物的示例包括但不限于其各自
配体(例如糖皮质激素、雌激素、孕激素、类维生素A、蜕皮激素和其类似物和模拟物)活
化的核受体超家族成员和四环素活化的rTTA。本发明的一个方面中，所述基因开关是基
于EcR的基于开关。这些系统的示例包括但不限于，美国专利号6,258,603、7,045,315，
美国公开专利申请号2006/0014711、2007/0161086和国际公开申请号WO 01/70816中所
述的系统。嵌合的蜕皮激素受体的示例描述于美国专利号7,091,038，美国公开专利申请
号2002/0110861、2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和 2006/0100416和 国 际公开申请号WO 01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO02/066614、WO 02/066615、WO
02/29075和WO 2005/108617，各通过引用全文纳入本文。非甾体蜕皮激素激动剂调节系
统的示例是 哺乳动物诱导表达系统(马萨诸塞州伊普斯威奇（Ipswich MA）
的NEB（New EnglandBiolabs）公司)。本发明的另一个方面中，所述基因开关基于FK506
结合蛋白（FKBP）与FKBP雷帕霉素相关蛋白(FRAP)的异二聚化，并且通过雷帕霉素或其非
免疫抑制类似物调节。这种系统的示例包括但不限于ARGENTTM转录技术(马萨诸塞州剑
桥的ARIAD药物公司（ARIAD Pharmaceuticals）)以及美国专利号6,015,709、6,117,680、
6,479,653、6,187,757和6,649,595所述的系统。
[0376] 在一个实施方式中，所述基因开关包含编码治疗开关启动子控制下配体依赖性转录因子复合物的单个转录因子序列。所述转录因子序列可以编码天然产生的配体依赖性转
录因子复合物或人工配体依赖性转录因子复合物。人工转录因子是转录因子的天然序列已
经改变的那些，所述改变是例如通过序列突变或不同转录因子结构域的组合。在一个实施
方式中，所述转录因子包含H组核受体配体结合结构域。在一个实施方式中，所述H组核受
体配体结合结构域来自蜕皮激素受体、遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、甾体激素核受体
1(NER-1)、类视黄醇X受体相互作用蛋白15(RIP-15)、肝X受体β(LXRβ)、类固醇激素受
体样蛋白(RLD-1)、肝X受体(LXR)、肝X受体α(LXRα)、法尼酯X-受体(FXR)、受体相互
作用蛋白14(RIP-14)或法尼酯受体(HRR-1)。在另一个实施方式中，H组核受体LBD来自
蜕皮激素受体。
[0377] A.基于蜕皮激素的基因开关
[0378] EcR和其他H组核受体是核受体超家族的成员，其中所有成员的特征通常是出现氨基末端反式激活结构域(AD，也互换称为"TA"或"TD")，可选融合到异二聚体伙伴(HP)
以形成共活化蛋白(CAP)，DNA结合结构域(DBD)，和LBD通过铰链区与DBD融合以形成配体
依赖性转录因子(LTF)。本文所用的术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽
序列，最长至整个DNA结合蛋白长度，只要该DNA结合结构域能够与特定响应元件结合。核
受体超家族的成员的特征也是出现四个或五个结构域：A/B、C、D、E和在一些成员中的F(见US 4,981,784和Evans,Science 240:889(1988))。“A/B”结构域对应反式激活结构域，“C”对应DNA结合结构域，“D”对应铰链区和“E”对应配体结合结构域。家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式激活结构域，对应“F”。
[0379] 报道下列多肽序列是蜕皮激素受体的多肽序列(蜕皮甾醇激素（ecdysteroid）受体)(20-羟基蜕皮激素受体)(20E受体)(EcRH)(核受体亚家族1组H成员1)，其Genbank
登录号是P34021。
[0380] 黑腹果蝇（果蝇）的蜕皮激素受体(878aa)(SEQ ID NO:5)
[0381] 1mkrrwsnngg fmrlpeesss evtsssnglv lpsgvnmsps sldshdycdq dlwlcgnesg
[0382] 61sfggsnghgl sqqqqsvitl amhgcsstlp aqttiiping nangnggstn gqyvpgatnl
[0383] 121galangmlng gfngmqqqiq nghglinstt pstpttplhl qqnlggaggg giggmgilhh
[0384] 181angtpnglig vvgggggvgl gvggggvggl gmqhtprsds vnsissgrdd lspssslngy
[0385] 241sanescdakk skkgpaprvq eelclvcgdr asgyhynalt cegckgffrr svtksavycc
[0386] 301kfgracemdm ymrrkcqecr lkkclavgmr pecvvpenqc amkrrekkaq kekdkmttsp
[0387] 361ssqhggngsl asgggqdfvk keildlmtce ppqhatipll pdeilakcqa rnipsltynq
[0388] 421laviykliwy qdgyeqpsee dlrrimsqpd enesqtdvsf rhiteitilt vqlivefakg
[0389] 481lpaftkipqe dqitllkacs sevmmlrmar rydhssdsif fannrsytrd sykmagmadn
[0390] 541iedllhfcrq mfsmkvdnve yalltaivif sdrpglekaq lveaiqsyyi dtlriyilnr
[0391] 601hcgdsmslvf yakllsilte lrtlgnqnae mcfslklknr klpkfleeiw dvhaippsvq
[0392] 661shlqitqeen erleraermr asvggaitag idcdsastsa aaaaaqhqpq pqpqpqpssl
[0393] 721tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta
[0394] 781pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv
[0395] 841smyanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta
[0396] DBD的特征是在两个氨基酸基序（P盒和D盒）之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源受体蛋白的不同结构域
的嵌合体。EcR类似核受体家族的子集，也有用于异二聚化性质的不太明确的区域。因为核受体结构域自然模块化，所述LBD、DBD和AD可以互换。
[0397] 在另一个实施方式中，所述转录因子包含AD、识别与表达被调控的治疗蛋白或治疗多肽相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包
含取代突变。
[0398] 在另一个实施方式中，所述基因开关包含在第一治疗开关启动子(TSP-1)控制下的第一转录因子序列例如CAP，和在第二治疗开关启动子(TSP-2)控制下的第二转录因子
序列例如LTF，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作
用形成蛋白复合物（LDTFC），即基于“双开关”或"双杂交”的基因开关。所述第一和第二TSP可以相同或不同。在此实施方式中，基因开关中出现治疗分子表达所需的两个不同TSP
增强了治疗方法的特异性（见图2）。图2也显示了通过插入合适的TSP修饰治疗基因开关
以治疗任何疾病、紊乱或病症的能力。
[0399] 在另一个实施方式中，第一和第二转录因子序列例如CAP或LTF，受单个治疗开关启动子控制(例如图1中的TSP-1)。这种启动子的活化会产生有单个开放阅读框的CAP和
LTF。这能使用转录接头如IRES（内部核糖体进入位点）来实现。在这个实施方式中，配体依赖性转录因子复合物的两个部分都在TSP-1活化后合成。TSP-1能是组成型启动子或只
在与所述疾病、紊乱或病症相关的条件下活化。
[0400] 在另一个实施方式中，一个转录因子序列如LTF受只在与所述疾病、紊乱或病症相关条件下活化的治疗开关启动子控制(例如图4中的TSP-2或TSP-3)，且另一个转录因
子如CAP受组成型治疗开关启动子控制(例如图4中的TSP-1)。在这个实施方式中，配体
依赖性转录因子复合物的一部分组成型存在，而第二部分只在与所述疾病、紊乱或病症相
关的条件下合成。
[0401] 在另一个实施方式中，一个转录因子序列如CAP受第一TSP控制(例如图3中的TSP-1)控制且两个或更多不同第二转录因子序列如LTF-1和LTF-2受不同TSP控制(例如
图3中的TSP-2和TSP-3)。在此实施方式中，每个LTF可以有识别不同因子调节启动子序
列的不同DBD(例如DBD-A结合与因子调节启动子1(FRP-1)有关的响应元件且DBD-B结合
与因子调节启动子2(FRP-2)有关的响应元件。每个因子调节启动子可以操作性连接到不
同的治疗基因。在这种方式下，可以同时提供多个治疗。
[0402] 在一个实施方式中，所述第一转录因子序列编码包含AD的多肽，识别与表达受到调控的治疗产物序列相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD，第二转录因子序列编码包
含核受体LBD的转录因子，所述核受体LBD选自脊椎动物类视黄醇X受体(RXR)、无脊椎动
物RXR、超气门蛋白(ultraspiracleprotein)(USP)，或包含至少两个不同核受体配体结合
结构域多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR和USP(见
WO01/70816A2和US 2004/0096942A1)。“伙伴”核受体配体结合结构域还可以包含截短突
变、缺失突变、取代突变或另一种修饰。
[0403] 在另一个实施方式中，所述基因开关包含第一转录因子序列和第二转录因子序列，所述第一转录因子序列编码包含核受体LBD和DBD的第一多肽，所述DBD识别与其表达
受到调节的治疗产物序列有关的响应元件，所述第二转录因子序列编码包含AD和核受体
LBD的第二多肽，其中核受体LBD之一是H组核受体LBD。在一个实施方式中，第一多肽基
本没有AD且第二多肽基本没有DBD。就本发明的目的而言，“基本没有”指研究的蛋白不含有所研究结构域的足够序列以提供活化或结合活性。
[0404] 本发明的另一个方面中，所述第一转录因子序列编码含有异二聚化伙伴和AD(″CAP")的蛋白，和第二转录因子序列编码含有DBD和LBD("LTF")的蛋白。
[0405] 当只有一个核受体LBD是H组LBD时，所述另一个核受体LBD可以来自与H组LBD形成二聚体的任何其他核受体。例如，当H组核受体LBD是EcR LBD时，所述另一个核受体
LBD"伙伴"可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包含至少
两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、非脊椎动物
RXR或USP(见WO 01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1，通
过引用整体纳入本文)。“伙伴”核受体配体结合结构域还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一种修饰。
[0406] 在一个实施方式中，所述脊椎动物RXR LBD来自人智人（Homo sapiens）、小鼠小家鼠（Mus musculus）、大鼠褐家鼠（Rattus norvegicus）、鸡原鸡（Gallusgallus）、猪家猪（Sus scrofa domestica）、蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、被囊动物（tunicate）（Polyandrocarpa misakiensis）或水母（Tripedalia cysophora）RXR。
[0407] 在一个实施方式中，所述非脊椎动物RXR配体结合结构域来自蝗虫东亚飞蝗（Locusta migratoria）超气门多肽(“LmUSP”)、蜱美洲钝眼蜱（Amblyommaamericanum）RXR同源物1(“AmaRXR1”)、蜱美洲钝眼蜱（Amblyommaamericanum）RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹（Celuca pugilator）RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫黄粉虫（Tenebrio molitor）RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂西方蜜蜂（Apis mellifera）RXR同源物(“AmRXR”)、蚜虫桃蚜（Myzuspersicae）RXR同源物(“MpRXR”)或非双翅类/非鳞翅类RXR同源物。
[0408] 在一个实施方式中，所述嵌合RXR LBD包含至少两个多肽片段，所述多肽片段选自脊椎动物种RXR多肽片段、无脊椎动物种RXR多肽片段、或非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。本发明使用的嵌合RXR配体结合结构域可以包含至少两个不同种
RXR多肽片段，或当所述种相同时，所述两个或多个多肽片段可以来自种RXR多肽片段的两
个或多个不同同种型。这种嵌合RXR LBD公开在例如WO 2002/066614中。
[0409] 在一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个无脊椎动物种RXR多肽片段。
[0410] 在另一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。
[0411] 所述配体与核受体的LBD结合并进而与治疗产物序列相关FRP的响应元件结合时，提供治疗产物序列表达的外部时间调节。本发明的各种组分互相结合的结合机理或顺
序（例如配体-LBD、DBD-响应元件、AD-启动子等）并不重要。
[0412] 在一个特定示例中，配体与H组核受体的LBD和其核受体LBD伙伴的结合能表达治疗产物序列。这个机理不排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伙伴的可能和得到活性
同源二聚体复合物的形成(例如GHNR+GHNR或伙伴+伙伴)。一个或多个受体结构域优
选在生成杂交基因开关上不同。通常，三个结构域（DBD、LBD和AD）中的一个或多个选自
与其他结构域来源不同的来源，从而所述杂交基因和所得的杂交蛋白在所选的宿主细胞或
生物中就反式激活活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本
身可修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件，例如酵母的GAL-4蛋白(参
见Sadowski等，Nature 335:563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell
43:729(1985))，或与就所述特定相互作用而设计、修饰和选择的蛋白靶向相互作用的特异性合成响应元件(例如参见Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94:3616(1997))以适合杂
交受体。双杂交系统的另一个优势是可以根据所需最终结果选择用于驱动基因表达的启动
子。因为可以控制表达的时间和表达发生的细胞，这种双控制可以对基因治疗领域特别重
要，尤其是当生成细胞毒性蛋白时。当操作性连接到合适启动子的基因引入对象细胞时，外源基因的表达受本发明系统的控制。启动子可以是组成型或诱导型调控，或是组织特异性
(即只在特定细胞类型中表达)或对生物的某些发育阶段特异。
[0413] 在有或没有配体的情况下，第一杂交蛋白的DNA结合结构域结合响应元件的DNA序列以启动或抑制受该响应元件调控的下游基因的转录。
[0414] 功能LDTFC例如EcR复合物，也可以包含其他蛋白例如亲免素。蛋白的核受体家族的其他成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)，也可以是EcR、USP和/或RXR的
配体依赖性或非依赖性伙伴。另外，可以需要其他辅助因子，如通常称为辅激活物的蛋白
(也称为衔接子或介质)。这些蛋白不是序列特异性结合DNA，并且不参与基底转录。其
可以通过多种机理影响转录活化，所述机理包含通过影响染色质结构或通过介导活化因
子起始复合物相互作用来刺激活化因子的DNA结合。这些辅激活物的示例包含RIP140、
TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB 1/RAC3/pCIP以及混杂辅激活物C响应元件B结合蛋白、CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.Cell
Biol.9:222(1997))。同样，可以需要通常称为辅阻遏物(也称为抑制子、沉默子或沉默调
节子)的蛋白辅助因子以在没有配体情况下有效抑制转录活性。这些辅阻遏物可以与无配
体的EcR相互作用以使响应元件处的活性沉默。目前证据显示配体的结合改变所述受体的
构象，造成辅阻遏物的释放和上述辅激活物的募集，从而消除其沉默活性。辅阻遏物的示例包含N-CoR和SMRT (综述参见Horwitz等，Mol Endocrinol.10:1167(1996))。这些辅助
因子可为细胞或生物内源，或可以作为以调节或不调节方式表达的转基因外源加入。
[0415] B.基于雷帕霉素的基因开关
[0416] 本发明还提供基因开关系统，利用FK506结合蛋白作为配体依赖性转录因子复合物和雷帕霉素作为配体。在一个实施方式中，所述编码基因开关的构建物包含
[0417] (a)编码第一嵌合蛋白的第一多核苷酸，所述第一嵌合蛋白结合雷帕霉素或其类似物，并且包含至少一个FK506-结合蛋白(FKBP)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中
所述FKBP结构域包含选自下列的肽序列：
[0418] (1)天然产生的FKBP
[0419] (2)天然发生的FKBP的变体，其中多至10个氨基酸残基被删除、插入或用取代的氨基酸置换，和
[0420] (3)DNA序列编码的FKBP，与编码(1)或(2)的FKBP的DNA序列选择性杂交。
[0421] (b)编码第二嵌合蛋白的第二多核苷酸，所述第二嵌合蛋白与(a)雷帕霉素或雷帕霉素类似物和(b)第一嵌合蛋白都形成复合物，并且包含至少一个FKBP:雷帕霉素结合
(FRB)结构域和至少一个异源蛋白结构域，其中FRB结构域包含选自下列的肽序列：
[0422] (4)天然产生的FRB结构域，
[0423] (5)天然产生的FRB结构域的变体，其中多至10个氨基酸残基被删除、插入或用取代的氨基酸置换，和
[0424] (6)DNA序列编码的FRB结构域，与编码(4)或(5)的FKB的DNA序列选择性杂交。
[0425] 在这个基因开关系统中，第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受本文他处所述的一种或多种治疗开关启动子控制。另外，在某些实施方式中，第一和第二嵌合蛋白中对FKBP
和/或FRB结构域异源的至少一个蛋白结构域可以是一个或多个“作用”或“效应器”结构
域。效应器结构域可以选自广泛的蛋白结构域，所述结构域包含DNA结合结构域、转录活化结构域、细胞定位结构域和信号转导结构域(即在聚类或多聚化后能激发细胞生长、增殖、分化、凋亡、基因转录等的结构域)。
[0426] 在某些实施方式中，一种融合蛋白包含至少一个DNA结合结构域(例如GAL4或ZFHD 1DNA-结合结构域)和另一个融合蛋白包含至少一个转录活化结构域(例如VP16或
p65转录活化结构域)。融合蛋白的配体介导的结合代表转录因子复合物的形成并引起与
DNA序列连接的靶标基因起始转录，所述DNA序列由融合蛋白之一的DNA-结合结构域识
别(即能与其结合)。关于基因表达系统和配体的信息公开于美国专利号6,187,757B1、
6,649,595B1、6,509,152B1、6,479,653B1和6,117,680B1。
[0427] 在另一些实施方式中，本发明提供基因开关系统，所述基因开关系统包含编码没有配体时自我聚合的两个融合蛋白的多核苷酸，其中(a)第一融合蛋白包含结合选定配体
的条件聚合结构域和转录活化结构域，和(b)第二融合蛋白包含结合选定配体的条件聚合
结构域和DNA结合结构域，和(c)没有配体时，所述细胞表达操作性连接调节DNA的基因，
所述调节DNA结合所述DNA结合结构域。存在足够量配体抑制基因时，包含所述基因开关
系统的修饰细胞扩增。配体移除会诱导造成细胞死亡的编码蛋白的表达。编码两个融合蛋
白的核酸受至少一个条件启动子控制。利用条件聚合结构域的基因表达系统公开于美国公
开号2002/0048792。
[0428] C.基于原核抑制子/操纵子的基因开关系统
[0429] 在一个实施方式中，本发明提供基因开关系统，包含(a)编码包含原核四环素("tet")抑制子和真核转录激活蛋白结构域的反式激活融合蛋白的第一多核苷酸；和(b)
编码治疗蛋白或治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接到最小启动
子和至少一个tet操纵子序列。编码反式激活融合蛋白的第一多核苷酸可以包含本文他
处所述的治疗开关启动子。致死蛋白的表达在没有四环素时上调。(见例如Gossen等，
(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:5547-5551;Gossen 等，(1993)TIBS 18:471-475;Furth
等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:9302-9306;和Shockett等，(1995)Proc.Natl.Acad.
Sci.92:6522-6526)。TetO表达系统公开于美国专利号5,464,758B1。
[0430] 在另一个实施方式中，所述基因开关系统包含来自细菌大肠杆菌的乳糖(“Lac”)抑制子-操纵子系统。本发明的基因开关系统也可以包含(a)编码包含原核lac I抑制子和真核转录激活蛋白结构域的反式激活融合蛋白的第一多核苷酸；和(b)编码治疗蛋白或
治疗多肽的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸操作性连接到治疗开关启动子。在Lac
系统中，在没有乳糖或合成类似物如异丙基-硫代半乳糖苷时，lac操纵子失活。
[0431] 其他基因开关系统包含下列所述的那些：US 7,091,038;WO2004078924;EP1266015;US20010044151;US20020110861;US20020119521;US20040033600;US20040197861;US200
40235097;US20060020146;US20040049437;US20040096942;US20050228016;US2005026645
7;US20060100416;WO2001/70816;WO2002/29075;WO2002/066612;WO2002/066613;WO2002/
066614;WO2002/066615;WO2005/108617;US6,258,603;US20050209283;US20050228016;US
20060020146;EP0965644;US7,304,162;US 7,304,161;MX234742;KR10-0563143;AU76530
6;AU2002-248500;和AU2002-306550。
[0432] D.基因开关系统的组合
[0433] 本发明提供包含含有不同的配体依赖性转录因子复合物的两个或多个基因开关系统的核酸组合物、修饰细胞和生物反应器，所述复合物由有效量的一种或多种配体活化，其中，所述两个或多个基因开关系统包含第一基因开关和第二基因开关，两者在结合一种
或多种配体后，都选择性诱导一种或多种多肽或治疗多核苷酸的表达。本发明的范围包括
任何数目和/或组合的基因表达系统。
[0434] 在一个实施方式中，本发明提供核酸组合物，包含：
[0435] a.第一基因开关系统，包含：
[0436] i.第一基因表达盒，包含编码第一杂交多肽的多核苷酸，所述第一杂交多肽包含：
[0437] 1.反式激活结构域，所述结构域活化因子调节的启动子，所述
[0438] 启动子操作性结合编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸；和
[0439] 2.异二聚体伙伴结构域，
[0440] ii第二基因表达盒，包含编码第二杂交多肽的多核苷酸，所述第二杂交多肽包含：
[0441] 1.DNA结合结构域，所述结合结构域识别因子调节的启动子，所
[0442] 述启动子操作性结合编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸；和
[0443] 2.配体结合结构域；和
[0444] iii.第三基因表达盒，包含编码治疗多肽的多核苷酸或包含下列的治疗多核苷酸：
[0445] 1.因子调节的启动子，由第二杂交多肽的反式激活结构域活化；
[0446] 和，
[0447] 2.编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸，和
[0448] b.第二基因表达系统，包含：
[0449] i.第一基因表达盒，包含编码第一杂交多肽的多核苷酸，所述第一杂交多肽包含：
[0450] 1.反式激活结构域，所述结构域活化因子调节的启动子，所述启动子操作性结合编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸；和
[0451] 2.异二聚体伙伴结构域，
[0452] ii第二基因表达盒，包含编码第二杂交多肽的多核苷酸，所述第二杂交多肽包含：
[0453] 1.DNA结合结构域，所述结合结构域识别因子调节的启动子，所述启动子操作性结合编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸；和
[0454] 2.配体结合结构域；和
[0455] iii.第三基因表达盒，包含编码治疗多肽的多核苷酸或包含下列的治疗多核苷酸：
[0456] 1.因子调节的启动子，由第二杂交多肽的反式激活结构域活化；
[0457] 和，
[0458] 2.编码治疗多肽的多核苷酸或治疗多核苷酸。
[0459] 多个诱导基因表达系统提供给定治疗多核苷酸或治疗多肽在与不同疾病、紊乱或病症相关条件下的表达，或多个治疗多肽和治疗多核苷酸在与不同疾病、紊乱或病症相关
的相同条件下或与不同疾病、紊乱或病症相关的不同条件下的表达。
[0460] 在某些实施方式中，两个或多个基因开关相同的组合可以是(1)基于双开关蜕皮激素受体的基因表达系统和(2)基于单开关蜕皮激素受体的基因开关。在另一些实施方式
中，所述组合可以是(1)基于单或双开关蜕皮激素受体的基因开关和(2)基于雷帕霉素的
基因开关。或者，基因开关系统的组合可以是上述两个相同的基于雷帕霉素的基因开关系
统。任何基因开关系统的可能组合在本发明范围内。双开关蜕皮激素受体的示例能参见例
如WO2002/29075和US 2002/0110861。
[0461] 配体
[0462] 本文使用的术语"配体"用于基于LDTFC的基因开关（如基于EcD复合物的基因开关）时，描述了小且可溶的分子，所述分子有活化基因开关的能力以刺激其中编码多肽的表达。本发明的配体依赖性转录因子复合物的配体结合蛋白复合物，所述蛋白复合物包含
一个或多个配体结合结构域、异二聚体伙伴结构域、DNA结合结构域和反式激活结构域。活化配体依赖性转录因子复合物的配体选择取决于使用的基因开关类型。
[0463] 配体的示例包括但不限于，蜕皮甾醇激素例如蜕皮激素、20-羟基蜕皮激素、松甾酮A、莫瑞甾A等，9-顺-视黄酸、视黄酸合成类似物，N,N'-二酰肼例如美国专利号
6,013,836;5,117,057;5,530,028;和5,378,726以及美国公开申请号2005/0209283和
2006/0020146公开的那些；恶二唑啉（oxadiazoline），如美国公开申请号2004/0171651
所述；二苯甲酰烷基氰基肼（dibenzoylalkylcyanohydrazine），如欧洲申请号461,809所公开；N-烷基-N,N'-二芳酰基肼（diaroylhydrazine），如美国专利号5,225,443所公
开；N-酰基-N-烷基碳酰肼（alkylcarbonylhydrazine），如欧洲申请号234,994所公开；
N-芳酰基-N-烷基-N'-芳酰基肼（aroylhydrazine），如美国专利号4,985,461所公开；
酰胺酮（amidoketone），如美国专利号2004/0049037所公开；各通过引用纳入本文以及其他类似材料，包含3,5-二-叔丁基-4-羟基N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、羟
甾醇、22(R)羟基胆固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐(ECHS),7-酮胆固醇-3-硫酸盐、金合欢醇（famesol）、胆酸、1,1-二
膦酸酯（biphosphonate ester）、保幼激素III等。本发明使用的二酰肼配体的示例
包含RG-115819(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲
基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼),RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁
基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔
丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)。参见例如，美国专利申请序列号
12/155,111和PCT申请号PCT/US2008/006757，两者都通过引用全文纳入本文。
[0464] 例如，用于蜕皮激素受体基因开关的配体可以选自任何合适的配体。天然产生的蜕皮激素或蜕皮激素类似物(例如20-羟基蜕皮激素、莫瑞甾酮A、松甾酮A、松甾酮B、
松甾酮C,26-碘松甾酮A,牛膝甾酮或26-mesylinokosterone)和非类固醇诱导物可以
用作本发明的基因开关的配体。美国专利号6,379,945B1描述了从烟芽夜蛾(Heliothis
virescens)("HEcR")中分离的昆虫类固醇受体，所述受体能用作响应类固醇和某些非类固
醇诱导物的基因开关。在响应类固醇和非类固醇诱导物的这个和很多其他系统中，由于很
多原因，非类固醇诱导物有与类固醇不同的优势，所述原因包含例如：更低的生产成本，代谢稳定性，昆虫、植物或哺乳动物中缺失，和环境可接受性。美国专利号6,379,945B1描述了使用2个二苯甲酰肼、1,2-二苯甲酰-1-叔丁基-肼和虫酰肼（tebufenozide）(N-(4-乙
基苯甲酰)-N'-(3,5-二甲基苯甲酰)-N'-叔丁基-肼)作为基于蜕皮激素基因开关的配
体。本发明也包含了作为配体的其他二苯甲酰肼，例如美国专利号No.5,117,057B1公开的
那些。使用虫酰肼（tebufenozide）作为来自黑腹果蝇的蜕皮激素受体的化学配体也公开
于美国专利号6,147,282。另外，蜕皮激素配体的非限定性示例是3,5-二-叔丁基-4-羟
基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、1,2-二酰基肼、N'-取代的-N,N'-双取代肼、
二苯甲酰烷基氰基肼、N-取代的-N-烷基-N,N-二芳酰基肼、N-取代的-N-酰基-N-烷基、
碳酰肼或N-芳酰基N'-烷基-N'-芳酰基肼。(参见美国专利号6,723,531)。
[0465] 在一个实施方式中，基于蜕皮激素配体的基因开关系统是二酰肼配体或手性二酰肼配体。用于基因开关系统的配体可以是式I所示的化合物
[0466] 式I
[0467] 其中
[0468] A是烷氧基、芳基烷氧基或芳氧基；
[0469] B是可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；和
[0470] R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环（heterocyclo）、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
[0471] 或药学上可接受的盐、水合物、其晶体形式或无定形形式。
[0472] 在另一个实施方式中，配体可以是式II的对映体富集的化合物
[0473] 式II
[0474] 其中
[0475] A是烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、芳基烷基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
[0476] B是可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；和
[0477] R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
[0478] 前提是R1不等于R2；
[0479] 其中有R1和R2的不对称碳原子的绝对构型主要是S；
[0480] 或药学上可接受的盐、水合物、其晶体形式或无定形形式。
[0481] 在某些实施方式中，配体可以是式III的对映体富集的化合物
[0482] 式III
[0483] 其中
[0484] A是烷氧基、芳基烷氧基、芳氧基、芳基烷基、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
[0485] B是可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；和
[0486] R1和R2独立地是可选取代的烷基、芳基烷基、羟基烷基、卤代烷基、可选取代的环烷基、可选取代的烯基、可选取代的炔基、可选取代的杂环、可选取代的芳基或可选取代的杂芳基；
[0487] 前提是R1不等于R2；
[0488] 其中有R1和R2的不对称碳原子的绝对构型主要是R；
[0489] 或药学上可接受的盐、水合物、其晶体形式或无定形形式。
[0490] 在一个实施方式中，配体可以是(R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼，其有至少95%的映体过量或药学上可接受
的盐、水合物、其晶体形式或无定形形式。
[0491] 式I的二酰肼配体和式II或III的手性二酰肼配体与基于蜕皮激素的基因开关系统一起使用时，提供本发明治疗多肽或治疗多核苷酸表达的外部时间调节方式。见2008
年5月29日提交的美国申请号12/155,111，通过引用全文纳入本文。
[0492] 本发明使用的配体可以形成盐。本文使用的术语“盐”表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸性和/或碱性盐。另外，当式I、II或III的化合物包含碱性部分和酸性部分
时，两性离子（“内盐”）可以形成，并且包含在本文术语“盐”中。例如在制备中可以使用的分离或纯化步骤中使用药学上可接受的盐(例如非毒性、生理上可接受)，尽管也使用其他
盐。例如通过化合物与一定量（例如等量）的酸或碱在某一介质如盐在其中沉淀的介质或冻干后的水介质中反应，可以形成式I、II或III的化合物的盐。
[0493] 包含碱性部分的配体可以与多种有机和无机酸形成盐。示例性的酸加成盐包含乙酸盐(例如与乙酸或三卤代乙酸（trihaloacetic acid）如三氟乙酸形成的那些)、己
二酸、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、安息香酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐（camphorate）、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐（cyclopentanepropionate）、二葡糖酸盐（digluconate）、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐
（glucoheptanoate）、甘油磷酸盐、半硫酸盐（hemisulfate）、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐(用盐酸形成)、氢溴酸盐(用氢溴酸形成)、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐(用
马来酸形成)、甲磺酸盐(用甲磺酸形成)、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如与硫酸形成的那些)、磺酸盐(例如本文提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、对
甲苯磺酸盐例如甲苯磺酸盐（tosylate）、十一酸盐（undecanoate）等。
[0494] 包含酸性部分的配体可以与多种有机和无机碱形成盐。示例性的碱性盐包含铵盐，碱金属盐如钠、锂和钾盐，碱土金属盐例如钙和镁盐，带有机碱(例如有机胺)的盐如
苄星盐，二环己胺、哈胺(与N,N-二(脱氢松香基)乙二胺)，N-甲基-D-葡糖胺，N-甲
基-D-葡糖胺，正丁基胺和具有氨基酸（如精氨酸、赖氨酸等）的盐。
[0495] 使用FK506结合结构域的诱导型基因表达系统的配体的非限定性示例是FK506、环孢菌素A或雷帕霉素。FK506、雷帕霉素和其类似物公开于美国专利号6,649,595B2和
6,187,757。还参见美国专利号7,276,498和7,273,874。
[0496] 本文描述的配体能单独给予或作为包含药学上可接受运载体的药物组合物的部分给予。在一个实施方式中，药物组合物是溶液、悬浮液、片剂、胶囊、软膏、酏剂或可注射的组合物形式。
[0497] 在一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于表达编码蛋白的多核苷酸，所述蛋白包括但不限于细胞因子、免疫调节剂、凝血因子、抗体或抗体片段、肿瘤坏死因子受体(TNFR)例如依那西普（Ertanercept）、红细胞生成素、α-1抗胰蛋白酶、干扰素(IFN)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素β-1a、干扰素β-1b、因子VII、因子VIII、因子IX、抗凝血酶III、乙型肝炎病毒蛋白、激素例如生长激素(GH)、人生长激素(hGH)、甲状旁腺激素(PH)、促甲状腺激素(TSH)、GCSF或其片段、GM-CSF或其片段。
[0498] 在一个实施方式中，编码抗体的多核苷酸编码单克隆抗体。
[0499] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于表达作为疫苗的核酸。本发明也提供包含本发明载体或表达系统的疫苗组合物。在另一实施方式中，所述疫苗组合物包
含佐剂。
[0500] 关于基因开关方面的术语"基于蜕皮激素受体"指某一基因开关，所述基因开关包含至少天然产生或合成的蜕皮激素受体配体结合结构域的功能部分，其响应结合蜕皮激
素受体配体结合结构域的配体而调节基因表达。蜕皮激素响应系统的示例描述于美国专利
号7,091,038和6,258,603。在一个实施方式中，所述系统是 治疗系统(RTS)，
所述系统包含两个融合蛋白，与Gal4DNA结合结构域融合的突变的蜕皮激素受体(EcR)DEF
结构域和与VP16转录激活结构域融合的嵌合RXR的EF结构域，如图1所示在组成型启动
子控制下表达。
[0501] 术语“调节”和“调控”指诱导、降低或抑制核酸或基因表达，分别造成蛋白或多肽生产的诱导、降低或抑制。
[0502] 本发明所述的多核苷酸或载体还可以包含适于驱动宿主细胞中基因表达的至少一个启动子。
[0503] 可用于本发明实施方式的增强子包括但不限于：SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子1(EF1)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子等。
[0504] 终止控制区即终止子或聚腺苷酸化序列也可以衍生自优选宿主的多种天然基因。可选地，终止位点不是必需的，然而，最优选包含终止位点。在本发明的一个实施方式中，终止控制区可以包含在或衍生自合成序列、合成聚腺苷酸化信号、SV40晚期聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号、病毒终止子序列等。
[0505] 术语“3’非编码序列”或“3’非翻译区(UTR)”指位于编码序列下游(3’)的DNA序列，并且可以包含聚腺苷酸化[聚(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号的特征通常是影响mRNA前体的3'末端加入其他的
聚腺苷酸区（tract）。
[0506] “调节序列”指调节第二核酸序列表达的核酸序列。调节区可以包含天然负责特定核酸表达的序列（同源区域），或可以包含负责表达不同蛋白或甚至合成蛋白的具有不同起点的序列(异源区域)。特别地，所述序列能是原核、真核或病毒基因序列，或以特定或非特定方式和诱导或非诱导方式刺激或抑制基因转录的衍生序列。调节区包含复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和指导多肽到靶标细胞中分泌通路的信号序列。
[0507] 来自“异源来源”的调节区指与表达的核酸不是天然相关的调节区。异源调节区中包含来自不同种的调节区、来自不同基因的调节区、杂交调节序列、和天然不产生但是由本领域普通技术人员设计的调节序列。
[0508] “RNA转录物”指RNA聚合酶催化的DNA序列转录所得的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，称为初级转录物，或可以是来自初级转录物转录后加工的RNA
序列，并称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子、并能被细胞翻译成蛋白的RNA。
“cDNA”指与mRNA互补并且从mRNA衍生的双链DNA。“正义”RNA指包含mRNA并因此能被细
胞翻译成蛋白的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶标初级转录物或mRNA互补并
阻断靶标基因表达的RNA转录物。反义RNA的互补可以具有特异基因转录物的任何部分，
即5'非编码序列、3'非编码序列或编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或没有翻
译但是对细胞过程有影响的其他RNA。
[0509] “多肽”“肽”和“蛋白”互换使用，并且指由共价连接的氨基酸残基构成的聚合化合物。
[0510] “分离的多肽”″分离的肽"或“分离的蛋白”指基本不含与其天然状态正常相关的那些化合物(例如其他蛋白或多肽、核酸、糖、脂质)的多肽或蛋白。"分离的"并不意味着排除有其他化合物的人工或合成混合物或者出现杂质，所述杂质不干扰生物功能并且可
以是例如由于不完全纯化、加入稳定剂或复合入药学上可接受制剂。
[0511] “取代突变多肽”或“取代突变体”会理解成指某些突变多肽，所述突变多肽包含用相对于野生型或天然产生氨基酸不同的氨基酸取代至少一个野生型或天然产生的氨基酸。取代突变多肽可以仅包含一个野生型或天然产生氨基酸的取代，并且可以称作“点突变”或“单点突变”多肽。或者，取代突变多肽可以包含用相对于野生型或天然产生多肽的两个或多个氨基酸取代两个或多个野生型或天然产生的氨基酸。根据本发明，包含取代突变的H
组核受体配体结合结构域多肽包含用相对于野生型或天然产生H组核受体配体结合结构
域多肽不同的氨基酸取代至少一个野生型或天然产生的氨基酸。
[0512] 当取代突变多肽包含两个或多个野生型或天然产生氨基酸的取代时，这种取代可以包含就取代删除的野生型或天然产生氨基酸数目相等，例如用2个非野生型或天然产生
的氨基酸替代2个野生型或天然产生的氨基酸，或者就取代删除的野生型氨基酸数目不
等，例如用1个非野生型氨基酸替代2个野生型氨基酸(取代+删除突变)或用3个非野
生型氨基酸替代2个野生型氨基酸(取代+插入突变)。
[0513] 取代突变体可以使用缩写术语系统描述以指示在参照多肽序列内取代的氨基酸th
残基和数目和新取代的氨基酸残基。例如，多肽的第20个（20 ）氨基酸残基被取代的取代突变体可以缩写成“x20z”，其中“x”是被取代的氨基酸，“20”是多肽内的氨基酸残基位置或数目和“z”是新取代的氨基酸。因此，互换缩写成“E20A”或“Glu20Ala”的取代突变体指示包含多肽位置20处的丙氨酸残基(本领域通常缩写成“A”或“Ala”)取代谷氨酸(本
领域通常缩写成“E”或“Glu”)的突变体。
[0514] 取代突变可以通过本领域任何已知的突变技术生产，包括但不限于体外定点诱变(Hutchinson 等，J.Biol.Chem.253:6551(1978);Zoller 等，DNA 3:479(1984);Oliphant
等，Gene 44:177(1986);Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:710(1986))，使用
接头(法玛西亚（Pharmacia）)、限制性内切核酸酶消化/片段删除和取代、PCR介
导/寡核苷酸定向突变等。对定点诱变优选基于PCR的技术(见Higuchi,1989,"Using
PCR to Engineer DNA（使用PCR工程改造DNA）",收录于PCR Technology:Principlesand
Applications forDNA Amplification(PCR技术：DNA扩增的原理和应用),H.Erlich编，斯
托克顿出版社（Stockton Press），第6章第61-70页)
[0515] 用于多肽的术语“片段”指某一多肽，所述多肽的氨基酸序列短于参照多肽的氨基酸序列并且在完整部分上包含与所述参照多肽相同的氨基酸序列。合适时，这些片段可以包含在其作为一部分的更大多肽中。根据本发明的这种多肽片段的长度可以是至少2、3、4、
5、6、8、10、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、25、26、30、35、40、45、50、100、200、240、或300或更多氨基酸。
[0516] 多肽或蛋白的“变体”指衍生自多肽或蛋白的任何类似物、片段、衍生物或突变体，并且保持所述多肽或蛋白的至少一种生物特性。多肽或蛋白的不同变体可以天然存在。这些变体可以是由编码蛋白结构基因的核苷酸序列差异来确定特征的等位基因变异，或者可
以涉及不同的剪接或转录后修饰。技术人员能生成有单个或多个氨基酸取代、删除、加入或替换的变体。这些变体可以包括：(a)一个或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸取代
的变体，(b)一个或多个氨基酸加入到所述多肽或蛋白的变体，(c)其中一个或多个氨基酸
包含取代基的变体，和(d)所述多肽或蛋白与另一个多肽如血清白蛋白融合的变体。获得
这些变体的技术包括遗传学(抑制、删除、突变等)、化学和酶学技术，所述技术为本领域普通技术人员已知。在一个实施方式中，变体多肽包含至少约14个氨基酸。
[0517] 术语“同源性”指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。一个部分和另一部分之间序列的对应性能通过本领域已知的技术测定。例如，通过比对序列信息和
使用易于获得的计算机程序，在两个多肽分子之间直接比较序列信息来测定同源性。或者，测定同源性可以通过多核苷酸在允许同源区域间形成稳定双链体的条件下杂交，然后用单
链特异性核酸酶消化并确定消化后片段的大小来。
[0518] 本文使用的术语"同源"（其所有语法形式和拼写变异）指有"共同进化起源"的蛋白之间的关系，包含来自超家族的蛋白(例如，免疫球蛋白超家族)和来自不同种的同源
蛋白(例如，肌球蛋白轻链等)。(Reeck等，Cell 50:667(1987))。这种蛋白(和其编码基
因)有序列同源性，如其高序列相似性程度所显示。然而，在通常使用和应用中，当用副词如“高度”修饰时，术语"同源"可以指序列相似性而不是共同进化起源。
[0519] 因此，术语"序列相似性"（其所有语法形式）指可以有或没有共同进化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(见Reeck等，Cell50:667(1987))。在
一个实施方式中，当至少约50%(如至少约75%、90%、95%)核苷酸在确定长度的DNA序列上
匹配时，两个DNA序列"基本同源"或"基本相似"。基本同源的序列能通过比较所述序
列来鉴定，所述比较使用序列数据库可用的标准软件或例如就特定系统定义的严格条件下
的Southern杂交实验。定义合适杂交条件在本领域技术内(见例如Sambrook等，1989，同
上)。
[0520] 本文使用的“基本相似”指某些核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变造成一个或多个氨基酸的取代，但是不影响DNA序列编码的蛋白的功能属性。“基本相似”也指某些核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸片段通过反义或共抑制技术调节基因表达改变的能力。“基本相似”也指本发明核酸片段的修饰，例如基本不影响所得转录物功能特性的一个或多个核苷酸碱基的删除或插入。因此应理解本发明包含的多于特
定示例性序列。每个提出的修饰都在本领域常规技术内，如测定编码产物的生物活性保留。
[0521] 另外，技术人员应认识，本发明包含的基本相似序列也由其在严谨条件(0.1X SSC0.1%SDS 65°C，并用2X SSC、0.1%SDS和然后的0.1X SSC 0.1%SDS洗涤)下与本文所示例
序列杂交的能力定义。本发明的基本相似核酸片段是其DNA序列与本文所报道核酸片段的
DNA序列至少约70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。
[0522] 当超过约40%的氨基酸相同或超过60%相似(功能相同)时，两个氨基酸序列"基本同源"或"基本相似"。优选地，所述相似或同源序列通过比对鉴定，例如使用GCG(威
斯康星州麦迪逊的遗传计算机组（Genetics Computer Group），GCG包的程序手册，第7版)堆积程序。
[0523] 本文使用的术语"相应"指相似或同源序列的准确位置是否与要测量相似性或同源性的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列的比对可以包含空白。因此，术语“相应”指序列相似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的数目。
[0524] 氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”包含足够的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列以推定鉴定多肽或基因，通过本领域技术人员的人工评价或通过计算机自动化
序列比较和鉴定，使用算法例如BLAST(基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment
Search Tool）;Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1993));可获自ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/)。通常，需要10个或更多毗连氨基酸或者30个或更多核苷酸序列以推定鉴定多肽
和核酸序列与已知蛋白或基因的同源性。此外，对核苷酸序列而言，包含20-30个毗连核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于基因鉴定(例如Southern杂交)和分离(例如细
菌菌落或噬菌体噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可
以用作PCR扩增引物以获得包含引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含足够序列以特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。
[0525] 本领域所知术语“相同性百分数”指，通过序列比较确定两个或多个多肽序列或两个或多个核苷酸序列之间的关系。本领域中“相同性”也指多肽或多核苷酸序
列之间序列相关的程度，视情况通过此类序列字串之间的匹配进行确定。“相同性”和
“相似性”能通过已知方法易于计算，所述方法包括但不限于以下所述：Computational
Molecular Biology (计算分子生物学)(Lesk,A.M.编)纽约的牛津大学出版
(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(生物计算：信息学和基因组
工程)(Smith,D.W.编)纽约学术出版社(AcademicPress,1993);Computer Analysis of
Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编)新
泽西州休曼（Humana）出版公司(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(分子
生物学的序列分析)(vonHeinje,G.编)学术出版社(1987);和Sequence Analysis Primer
(序列分析引物)(Gribskov,M.和Devereux,J.编)纽约斯托克顿出版社（Stockton
Press）(1991)。设计测定相同性的优选方法以给出测试序列之间的最好匹配。测定相同
性和相似性的方法在公共可用计算机程序中编码。序列比对和百分比相同性的计算可以
使用序列分析软件完成，所述软件例如LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序
(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR Inc.,))。序列的多个比对可以使用比对的
Clustal方法(Higgins等，CABIOS.5:151(1989))以默认参数(缺口罚分=10、缺口长度罚
分=10)完成。使用Clustal方法的配对比对的默认参数可以选自:KTUPLE 1、缺口罚分=3、
窗口=5和保存的斜线（DIAGONALS SAVED）=5。
[0526] 术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是市售可得的或独立开发的。常用序列分析软件包括但不限
于，程序的GCG套件(威斯康星包（Wisconsin Package）第9.0版,威斯康星州麦迪逊的
遗传计算机组(GCG))、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403(1990))和DNASTAR(美国威斯康星州麦迪逊S.Park大街1228的DNASTAR公司，53715)。本申请内
容中应理解，除非特别说明，当序列分析软件用于分析时，分析结果是基于参照程序的“默认值”。本文使用的“默认值”指当最初开始时，软件原始载入的任何组的值或参数。
[0527] 关于DNA序列的“化学合成”指体外组装的组分核苷酸。DNA的人工化学合成可以使用充分确认的工艺完成，或自动化学合成能使用很多市售可得的机器之一完成。因此，能根据反映宿主细胞中密码子偏好的核苷酸序列优化就最佳基因表达调整基因。技术人员应
了解如果密码子使用偏向宿主喜好的那些密码子，成功基因表达是可能的。优选密码子的
测定能基于源自序列信息可用的所述宿主细胞的基因调查。
[0528] 本文使用的两个或多个单独可操作基因调控系统称为“正交”，当a)通过各自配体以选定浓度调节每个给定系统，使得该系统的基因表达幅度发生可检测的改变，和b)不
论实际调节的同时性和顺序性如何，所述改变与所有其他在细胞、组织或生物中同时操作
的系统表达变化在统计学上显著不同。优选地，每个单独可操作基因调节系统的调节影响
基因表达的改变，所述改变多于细胞、组织或生物中所有其他可操作系统至少2倍，例如至少5倍、10倍、100倍、或500倍更多。理想地，通过其各自配体以选定浓度调节每个给定系统，使得该系统基因表达幅度发生可检测的改变，且细胞、组织或生物中可操作的所有其他系统没有可检测的改变。在这种示例中，多个可诱导基因调节系统被称为“全部正交”。可用的正交配体或基于正交受体的基因表达系统描述于US2002/0110861A1。
[0529] 术语“外源基因”指对象外来的基因，即通过转化过程引入到对象的基因，所述基因是内源突变基因的未突变形式或内源未突变基因的突变形式。转化方法对本发明不重要，可以是任何适于本领域那些已知对象的方法。外源基因能是天然或合成的基因，以DNA或RNA（通过诸如逆转录酶的DNA中间物起作用）形式引入对象。所述基因能引入到靶标
细胞、直接引入到对象或通过转化细胞的转移而间接引入到对象。
[0530] 术语“治疗产物”指对表达这种产物的宿主细胞施加有益功能的治疗多肽或治疗多核苷酸。治疗多肽可以包括但不限于小至3个氨基酸长度的肽、单链或多链蛋白和融合
蛋白。治疗多核苷酸可以包括但不限于反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶和RNA外部引导序
列。治疗产物可以包含天然产生的序列、合成序列或天然和合成序列的组合。
[0531] 术语"配体依赖性转录因子复合物"或"LDTFC"指包含一个或多个蛋白亚基的转录因子，其复合物能调节由本文定义的"因子调节启动子"驱动的基因表达。模型
LDTFC是“蜕皮激素受体复合物”，通常指异二聚体蛋白复合物，所述复合物有核受体家族、蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白中至少两个成员(见Yao等，Nature
366:476(1993));Yao等，Cell 71:63(1992))。功能性LDTFC例如EcR复合物，也可以包含
其他蛋白例如亲免素。蛋白的其他核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1
或其他昆虫同源物)，也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伙伴。LDTFC如
EcR复合物也能是EcR蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同源物、视黄酸X受体(“RXR”)蛋白
或USP和RXR嵌合体的异二聚体。术语"LDTFC"和"EcR复合物"也包含EcR蛋白或USP
以及单个多肽或三聚体、四聚体和其他功能相同的多聚体的同二聚体。
[0532] LDTFC如EcR复合物能通过结合到复合物蛋白之一的活性蜕皮甾醇激素或非甾体配体来活化，所述蛋白包含EcR但不排除复合物的其他蛋白。LDTFC如EcR复合物包含
作为核受体超家族成员的蛋白，其中所有成员的特征是出现包含氨基末端反式激活结构域
(″AD"、"TD"或"TA"，本文中互换使用)、DNA结合结构域(“DBD”)和配体结合结构域
(“LBD”)的一个或多个多肽亚基。AD可以与“异二聚化伙伴”或“HP”融合的形式出现。
包含本发明AD和HP的融合蛋白在本文中称为"共活化蛋白"或"CAP"。DBD和LBD可作
为融合蛋白表达，本文中称为"配体诱导转录因子(″LTF")。所述融合伙伴可以由接头分
开，例如铰链区。LTF家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式激活结构域。DBD的
特征是在两个氨基酸基序（P盒和D盒）之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对蜕皮激素响
应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源受体蛋白的不同结构域的嵌合
体。
[0533] 生成外源基因、响应元件和LDTFC如EcR复合物的DNA序列可以纳入到古细菌、原核细胞如大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）或其他肠细菌或真核细胞如植物或动物细胞。然而，因为由基因表达的很多蛋白在细菌中不正确加工，优选真核细胞。所述细胞可以是单细胞或多细胞生物的形式。外源基因、响应元件和受体复
合物的核苷酸序列也能作为RNA分子纳入，优选功能性病毒RNA如烟草花叶病毒形式。对
真核细胞而言，优选脊椎动物细胞，因为其天然缺乏某些分子，所述分子就EcR而言赋予对本发明配体的响应。因此，其对本发明的配体“基本不敏感”。因此，本发明使用的配体对转化细胞或全部生物的生理或其他影响可以忽略。因此，细胞能生长和表达所需产物，基本不受配体本身存在的影响。
[0534] 术语“蜕皮激素受体复合物”通常指异二聚体蛋白复合物，所述复合物有核受体家族、蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白中至少两个成员(见Yao等，Nature366:476(1993));Yao等，Cell 71:63(1992))。功能性EcR复合物，也可以包含其他蛋白例
如亲免素。蛋白的其他核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1或其他昆虫
同源物)，也可以是EcR和/或USP的配体依赖性或非依赖性伙伴。所述EcR复合物也能是
EcR蛋白和超气门蛋白的脊椎动物同源物、视黄酸X受体(“RXR”)蛋白或USP和RXR嵌合
体的异二聚体。术语EcR复合物也包含EcR蛋白或USP的同源二聚体复合物。
[0535] EcR复合物能通过结合到复合物蛋白之一的活性蜕皮甾醇激素或非甾体配体来活化，所述蛋白包含EcR但不排除复合物的其他蛋白。本文使用的术语"配体"用于基于
EcD的基因开关时描述了小且可溶的分子，所述分子有活化基因开关的能力以刺激其中编
码多肽的表达。配体的示例包括但不限于，蜕皮甾醇激素例如蜕皮激素、20-羟基蜕皮激
素、松甾酮A、莫瑞甾A等，9-顺-视黄酸、视黄酸合成类似物，N,N'-二酰肼例如美国专利
号6,013,836;5,117,057;5,530,028;和5,378,726以及美国公开申请号2005/0209283和
2006/0020146所述的那些；恶二唑啉（oxadiazoline），如美国公开申请号2004/0171651
所述；二苯甲酰烷基氰基肼（dibenzoylalkyl cyanohydrazine），如欧洲申请号461,809
所公开；N-烷基-N,N'-二芳酰基肼（diaroylhydrazine），如美国专利号5,225,443所
公开；N-酰基-N-烷基碳酰肼（alkylcarbonylhydrazine），如欧洲申请号234,994所公
开；N-芳酰基-N-烷基-N'-芳酰基肼（aroylhydrazine），如美国专利号4,985,461所公
开；酰胺酮（amidoketone），如美国专利号2004/0049037所公开；以及其他类似材料，包含
3,5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰哈巴苷、羟甾醇、22(R)羟基胆
固醇、24(S)羟基胆固醇、25-环氧胆固醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆固醇-3-硫酸盐
(ECHS),7-酮胆固醇-3-硫酸盐、金合欢醇（famesol）、胆酸、1,1-二膦酸酯（biphosphonate ester）、保幼激素III等。本发明使用的二酰肼配体的示例包含RG-115819(3,5-二甲
基-苯甲酸N-(1-乙基-2,2-二甲基-丙基)-N'-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰
肼),RG-115932((R)-3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙基-3-甲氧
基-苯甲酰)-酰肼)和RG-115830(3,5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N'-(2-乙
基-3-甲氧基-苯甲酰)-酰肼)。对实施本发明有用的其他二酰肼，见2008年5月29日
提交的美国申请12/155,111，和2008年5月29日提交的PCT/US2008/006757。
[0536] EcR复合物包含作为核受体超家族成员的蛋白，其中所有成员的特征是出现氨基末端反式激活结构域(″TA")、DNA结合结构域(“DBD”)和由铰链区分开的配体结合结构
域(“LBD”)。所述家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式激活结构域。DBD的特
征是在两个氨基酸基序（P盒和D盒）之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对蜕皮激素响应
元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源受体蛋白的不同结构域的嵌合体。
[0537] 生成外源基因、响应元件和EcR复合物的DNA序列可以纳入古细菌、原核细胞如大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或其他肠细菌或真核细胞如植物或动物细胞。然而，因为由基因表达的很多蛋白在细菌中不正确加工，优选真核细胞。所述细胞可以是单细胞或多细胞生物的形式。外源基因、响应元件和受体复合物的核
苷酸序列也能作为RNA分子纳入，优选功能性病毒RNA如烟草花叶病毒形式。对真核细胞
而言，优选脊椎动物细胞，因为其天然缺乏某些分子，所述分子就EcR而言赋予对本发明配体的响应。因此，其对本发明的配体“基本不敏感”。因此，本发明使用的配体对转化细胞或全部生物的生理或其他影响可以忽略。因此，细胞能生长和表达所需产物，基本不受配体本身存在的影响。
[0538] EcR配体与EcR复合物一起使用并进而与连接外源基因(例如IL-12)的响应元件结合时，提供外源基因表达的外部时间调节方式。多个成分互相结合（即配体-受体复合物和受体复合物-响应元件）的顺序并不重要。通常，外源基因表达的调控响应EcR复合物与
特异对照或调节DNA元件的结合。所述EcR蛋白如同其他核受体家族成员，有至少三个结
构域即一个反式激活结构域、一个DNA结合结构域和一个配体结合结构域。这种受体如同
核受体家族的子集，也有用于异二聚化性质的不太明确的区域。与USP或RXR蛋白的异二
聚化后，配体与EcR蛋白的配体结合结构域的结合能使异二聚体蛋白的DNA结合结构域与
活化形式的响应元件结合，因此引起外源基因的表达或抑制。这个机理不排除配体与EcR
或USP结合的潜能，和得到活性同源二聚体复合物的形成(例如EcR+EcR或USP+USP)。在
一个实施方式中，一个或多个受体结构域能是可变的，生成嵌合基因开关。通常，三个结构域中的一个或多个可选自与其他结构域来源不同的来源，从而所述嵌合受体在所选宿主细
胞和生物中对反式激活活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本身能修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件，如来自酵母的GAL-4蛋白
(见Sadowski等，Nature 335:563(1988)或来自大肠杆菌的LexA蛋白(见Brent等，Cell
43:729(1985))以适合嵌合EcR复合物。嵌合系统的另一个优势是可以根据所需最终结果
选择用于驱动外源基因的启动子。因为可以控制表达的时间和发生表达的细胞，这种双控
制可以对基因治疗领域特别重要，尤其是当生成细胞毒性蛋白时。当操作性连接到合适启
动子的外源基因引入对象细胞时，外源基因的表达受本发明配体存在的控制。启动子可以
是组成型或诱导型调控，或是组织特异性(即只在特定细胞类型中表达)或对生物的某些
发育阶段特异。
[0539] 在某些实施方式中，本方法描述的治疗开关启动子是组成型。在某些实施方式中，所述治疗开关启动子是在与疾病、紊乱或病症相关的条件下活化，例如响应疾病，响应特定生理、发育、分化或病理条件，和/或响应一个或多个特异生物分子，所述启动子被活化；和/或所述启动子在特定组织或细胞类型中活化。在某些实施方式中，所述疾病、紊乱或病症响应治疗多肽或多核苷酸。例如，在某些非限定性实施方式中，所述治疗多核苷酸或多肽用于治疗、预防、改善、减低症状、预防发展或治愈所述疾病、紊乱或病症，但是不需要完成这些事情的任何一个或全部。在某些实施方式中，引入第一和第二多核苷酸，从而使配体依赖性转录因子复合物在与疾病、紊乱或病症相关的条件下表达。在一个实施方式中，完成治疗方法，从而所述治疗多肽或治疗多核苷酸表达并且以足以治疗、改善或预防所述疾病、紊乱或病症的水平在对象中散布。本文使用的“散布”指多肽表达并从修饰细胞中充分释放以在对象中有效果或活性。散布可以是系统的、局部的或两者间的任何情况。例如，治疗多肽或治疗多核苷酸可以通过血液或淋巴系统系统散布。或者，治疗多肽或治疗多核苷酸可以
在待治疗的组织或器官中局部散布。
[0540] 编码各种多肽（如转录因子和受体蛋白）的多个基因组和cDNA核酸序列为本领域熟知。本领域那些技术人员可以利用几乎所有已知基因的核酸序列信息，和能从公共库、发表序列的研究所中直接获得核酸分子，或者使用常规方法制备分子。参见下文例如序列登
录号的描述。
[0541] 所述基因开关可以是通过加入或移除特定配体来调节基因表达的任何基因开关系统。在一个实施方式中，所述基因开关是基因表达水平取决于所出现配体水平的基因开
关。可以用于本发明基因开关的配体依赖性转录因子的示例包括但不限于其各自配体(例
如糖皮质激素、雌激素、孕激素、类维生素A、蜕皮激素和其类似物和模拟物)活化的核受体超家族成员和四环素活化的rTTA。本发明的一个方面中，所述基因开关是基于EcR的基因
开关。这些系统的示例包括但不限于，美国专利号6,258,603、7,045,315，美国公开专利申请号2006/0014711、2007/0161086和国际公开申请号WO 01/70816中所述的系统。嵌合的
蜕皮激素受体的示例描述于美国专利号7,091,038，美国公开专利申请号2002/0110861、
2004/0033600、2004/0096942、2005/0266457和2006/0100416以及国际公开申请号WO
01/70816、WO 02/066612、WO 02/066613、WO02/066614、WO 02/066615、WO 02/29075和WO
2005/108617。非甾体蜕皮激素激动剂调节系统的示例是 哺乳动物诱导表达
系统(马萨诸塞州伊普斯威奇（Ipswich MA）的NEB公司)。
[0542] 在一个实施方式中，编码所述基因开关的多核苷酸包含编码启动子控制下配体依赖性转录因子的单个转录因子序列。所述转录因子序列可以编码天然产生的配体依赖性转
录因子或人工转录因子。人工转录因子是转录因子的天然序列已经改变的那些，所述改变
是例如通过序列突变或不同转录因子结构域的组合。在一个实施方式中，所述转录因子包
含H组核受体配体结合结构域(LBD)。在一个实施方式中，H组核受体LBD来自EcR、遍在
受体、孤儿受体1、NER-1、甾体激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体
β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、法尼酯X-受体、受体相互作用蛋白14
或法尼酯受体。在另一个实施方式中，H组核受体LBD来自蜕皮激素受体。
[0543] EcR和其他H组核受体是核受体超家族成员，其中所有成员的特征通常是出现氨基末端反式激活结构域(TD)、DNA结合结构域(DBD)和通过铰链区与DBD分开的LBD。本
文所用的术语“DNA结合结构域”包括DNA结合蛋白的最小多肽序列，最长至整个DNA结
合蛋白长度，只要该DNA结合结构域能够与特定响应元件相关联。核受体超家族的成员
的特征也是出现四个或五个结构域：A/B、C、D、E和一些成员中的F (见US 4,981,784和
Evans,Science 240:889(1988))。“A/B”结构域对应反式激活结构域，“C”对应DNA结合结构域，“D”对应铰链区和“E”对应配体结合结构域。家族的一些成员在LBD羧基末端也有另一个反式激活结构域，对应“F”。
[0544] DBD的特征是在两个氨基酸基序（P盒和D盒）之间出现两个半胱氨酸锌指，这赋予对响应元件的特异性。这些结构域可以是天然的、修饰的或异源受体蛋白的不同结构域
的嵌合体。EcR类似核受体家族的子集，也有用于异二聚化性质的不太明确的区域。因为核受体结构域天然模块化，所述LBD、DBD和TD可以互换。
[0545] 在另一个实施方式中，所述转录因子包含TD、识别与表达被调控的外源基因相关的响应元件的DBD；和H组核受体LBD。在某些实施方式中，H组核受体LBD包含取代突变。
[0546] 在另一个实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序列，其中由所述第一转录因
子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋
白复合物，即基于“双开关”或"双杂交”的基因开关。所述第一和第二启动子可以相同或不同。
[0547] 在某些实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包含启动子控制下的第一转录因子序列和第二转录因子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编
码的蛋白相互作用形成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物，即“单基因开关”。所述
第一转录因子序列和第二转录因子序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。所述
IRES可以是EMCV IRES。
[0548] 在一个实施方式中，第一转录因子序列编码某一多肽，所述多肽包含TD、识别与表达受到调节的外源基因相关响应元件的DBD和H组核受体LBD，和第二转录因子序列编码包含核受体LBD的转录因子，所述LBD选自脊椎动物RXR LBD、无脊椎动物RXR LBD、超气门蛋
白LBD和包含两个多肽片段的嵌合LBD，其中所述第一多肽片段来自脊椎动物RXR LBD、无
脊椎动物RXRLBD或超气门蛋白LBD，和所述第二多肽片段来自不同的脊椎动物RXRLBD、无
脊椎动物RXR LBD或超气门蛋白LBD。
[0549] 在另一个实施方式中，所述基因开关包含编码第一多肽的第一转录因子序列和编码第二多肽的第二转录因子序列，所述第一多肽包含核受体LBD和识别与表达受到调节的
外源基因有关的响应元件的DBD，所述第二多肽包含TD和核受体LBD，其中核受体LBD之一
是H组核受体LBD。在一个实施方式中，第一多肽基本没有TD且第二多肽基本没有DBD。就
本发明的目的而言，“基本没有”指研究的蛋白不含有所研究结构域的足够序列以提供活化或结合活性。
[0550] 本发明的另一个方面中，所述第一转录因子序列编码含有异二聚体伙伴和TD的蛋白，和第二转录因子序列编码含有DBD和LBD的蛋白。
[0551] 当只有一个核受体LBD是H组LBD时，所述另一个核受体LBD可以来自与H组LBD形成二聚体的任何其他核受体。例如，当H组核受体LBD是EcR LBD时，所述另一个核受体
LBD"伙伴"可以来自EcR、脊椎动物RXR、无脊椎动物RXR、超气门蛋白(USP)或包含至少
两个不同核受体LBD多肽片段的嵌合核受体，所述多肽片段选自脊椎动物RXR、非脊椎动物
RXR和USP(见WO 01/70816A2、国际专利申请号PCT/US02/05235和US 2004/0096942A1)。
“伙伴”核受体配体结合结构域还可以包含截短突变、缺失突变、取代突变或另一种修饰。
[0552] 在一个实施方式中，所述脊椎动物RXR LBD来自人智人（Homo sapiens）、小鼠小家鼠（Mus musculus）、大鼠褐家鼠（Rattus norvegicus）、鸡原鸡（Gallusgallus）、猪家猪（Sus scrofa domestica）、蛙非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)、被囊动物（tunicate）（Polyandrocarpa misakiensis）或水母（Tripedalia cysophora）RXR。
[0553] 在一个实施方式中，所述非脊椎动物RXR配体结合结构域来自蝗虫东亚飞蝗（Locusta migratoria）超气门多肽(“LmUSP”)、蜱美洲钝眼蜱（Amblyommaamericanum）RXR同源物1(“AmaRXR1”)、蜱美洲钝眼蜱（Amblyommaamericanum）RXR同源物2(“AmaRXR2”)、招潮蟹（Celuca pugilator）RXR同源物(“CpRXR”)、甲虫黄粉虫（Tenebrio molitor）RXR同源物(“TmRXR”)、蜜蜂西方蜜蜂（Apis mellifera）RXR同源物(“AmRXR”)、蚜虫桃蚜（Myzuspersicae）RXR同源物(“MpRXR”)或非双翅类/非鳞翅类RXR同源物。
[0554] 在一个实施方式中，所述嵌合RXR LBD包含至少两个多肽片段，所述多肽片段选自脊椎动物种RXR多肽片段、无脊椎动物种RXR多肽片段、和非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物多肽片段。本发明使用的嵌合RXR配体结合结构域可以包含至少两个不同种
RXR多肽片段，或当所述种相同时，所述两个或多个多肽片段可以来自种RXR多肽片段的两
个或多个不同同种型。
[0555] 在一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个无脊椎动物种RXR多肽片段。
[0556] 在另一个实施方式中，所述嵌合RXR配体结合结构域包含至少一个脊椎动物种RXR多肽片段和一个非双翅类/非鳞翅类无脊椎动物种RXR同源物的多肽片段。
[0557] 所述配体与核受体的LBD结合并进而与外源基因相连的响应元件结合时，提供外源基因表达的外部时间调节。本发明的各种组分互相结合的结合机理或顺序（例如配
体-LBD、DBD-响应元件、TD-启动子等）并不重要。
[0558] 在一个特定示例中，配体与H组核受体的LBD和其核受体LBD伙伴的结合能表达外源基因。这个机理不能排除配体结合H组核受体(GHNR)或其伙伴的潜能并得到活性同
源二聚体复合物的形成(例如GHNR+GHNR或伙伴+伙伴)。一个或多个受体结构域优选
在生成杂交基因开关上不同。通常，三个结构域（DBD、LBD和TD）中的一个或多个可选自
与其他结构域来源不同的来源，从而所述杂交基因和所得的杂交蛋白在选定宿主细胞或生
物中对反式激活活性、配体的互补结合和特异响应元件的识别优化。另外，响应元件本身
可以修饰或取代有用于其他DNA结合蛋白结构域的响应元件，例如酵母的GAL-4蛋白(参
见Sadowski等，Nature 335:563(1988))或大肠杆菌的LexA蛋白(参见Brent等，Cell
43:729(1985))，或对就特定相互作用设计、修饰和选择的蛋白靶向相互作用特异的合成响应元件(参见例如Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，94:3616(1997))以适合杂交受体。
[0559] 功能性EcR复合物也可以包含其他蛋白例如亲免素。蛋白的其他核受体家族成员称为转录因子(例如DHR38或βFTZ-1)，也可以是EcR、USP和/或RXR的配体依赖性或非
依赖性伙伴。另外，可以需要其他辅助因子，如称为辅激活物的蛋白(也称为衔接子或介
质)。这些蛋白不是序列特异性结合DNA，并且不参与基底转录。其可以通过多种机理影响
转录活化，所述机理包含通过影响染色质结构或通过介导活化因子起始复合物相互作用来
刺激活化因子的DNA结合。这些辅助激活物的示例包含RIP140、TIF1、RAP46/Bag-1、ARA70、SRC-1/NCoA-1、TIF2/GRIP/NCoA-2、ACTR/AIB 1/RAC3/pCIP以及混杂辅助激活物C响应元
件B结合蛋白、CBP/p300(综述参见Glass等，Curr.Opin.CellBiol.9:222(1997))。同样，
可需要通常称为辅阻遏物(也称为抑制子、沉默子或沉默调节子)的蛋白辅助因子以在没
有配体情况下有效抑制转录活化。这些辅阻遏物可以与无配体的EcR相互作用以使响应元
件处的活性沉默。目前证据显示配体的结合改变所述受体的构象，造成辅阻遏物的释放和
上述辅助激活物的募集，从而消除其沉默活性。辅阻遏物的示例包含N-CoR和SMRT(综述
参见Horwitz等，MolEndocrinol.10:1167(1996))。这些辅助激活子可以是细胞或生物内
源，或可作为以调节或不调节方式表达的转基因外源加入。
[0560] 外源基因操作性连接到启动子上，所述启动子包含由所述基因开关编码的配体依赖性转录因子的DBD识别的至少一个响应元件。在一个实施方式中，所述启动子包含所述
响应元件的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多拷贝。包含所需响应元件的启动子可以是天然产生的启动子或使用本领域熟知技术生成的人工启动子，例如操作性连接到最小启动子的
一个或多个响应元件。
[0561] 编码免疫调节剂（如IL-12、TNFα、信号肽或本文的任何转录因子）的基因也能是密码子优化的基因。在一个实施方式中，免疫调节剂（如IL-12、TNFα、信号肽或转录因子）的编码区进行密码子优化以在人中表达。本领域普通技术人员应理解，由于遗传密码的冗余性，各种核酸编码区域会编码相同的多肽。包括编码任何多肽链氨基酸的密码子的核苷
酸序列偏差允许编码基因的序列不同。由于各密码子由三个核苷酸组成，且含DNA的核苷
酸局限于四种特异碱基，所以有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸（剩余三种
密码子编码信号终止翻译）。显示哪种密码子编码哪种氨基酸的“遗传密码”示于表4。因此，许多氨基酸被多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码,
丝氨酸和精氨酸由6种编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性使DNA
碱基组成在较广的范围内不同，而不用改变DNA编码的多肽的氨基酸序列。
[0562] 表4：标准遗传密码
[0563]
[0564] 应理解任何编码本发明所述多肽的多核苷酸都落入本发明范围，不论所用的密码子如何。
[0565] 许多生物体对具体密码子的使用显示出偏好，用于编码生长的多肽链中具体氨基酸的插入。密码子优选或密码子偏好，生物体之间密码子使用的差异，由遗传密码的简并性提供，且在许多生物体之间详细记载。密码子偏好常和信使RNA（mRNA）的翻译效率相关，继而认为其依赖于被翻译的密码子性质和具体转移RNA（tRNA）分子的有效性。所选tRNA
在细胞中优势通常反映了肽合成中使用最频繁的密码子。因此，可基于密码子优化就给定
生物体中最佳的基因表达来调整基因。
[0566] 通过将优选用于给定物种基因的密码子纳入DNA序列来制备多核苷酸。
[0567] 鉴于各种动物、植物和微生物物种可获得的大量基因序列，可计算密码子使用的相对频率。密码子使用表可获自例如http://www.kazusa.or.jp/codon/（2006年5
月30日访问）的“密码子使用数据库”，这些表可适用于许多方面。参见Nakamura,Y.
等,“Codon usagetabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000（国际DNA序列数据库制得的密码子使用：2000年状态）”Nucl.
AcidsRes.28:292(2000)。从GenBank Release 151.0版计算的人密码子使用表在下表5
中再现(来自www.kazusa.or.jp/codon/同上)。这些表使用mRNA命名法，因此该表使用
RNA中发现的尿嘧啶(U)，而不是DNA中发现的胸腺嘧啶(T)。所述表经过调整，从而频率针
对各氨基酸计算，而不是所有64个密码子。
[0568] 表5：人基因（智人（Homo sapiens））的密码子使用表
[0569]
[0570]
[0571]
[0572] 通过使用这些或相似的表，本领域普通技术人员可将所述频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码区域的核酸片段，所述编码区域编码多肽但使用对给
定物种最优的密码子。
[0573] 合成上述任何方法所设计的密码子优化的编码区域有很多选择，使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物操作。
[0574] 在一个实施方式中，本发明的载体中编码免疫调节剂（例如TNFα）的编码区是密码子优化的。在另一个实施方式中，所述编码区对于人中的表达是密码子优化的。在特定实施方式中，本发明的TNFα由密码子优化的核酸序列编码。
[0575] 为了向细胞体内或离体引入多核苷酸，能使用载体。例如，所述载体可以是质粒载体或单链或双链RNA或DNA病毒载体。所述载体可以通过将DNA和RNA引入细胞的熟知技术,引入到有此需要的对象（例如哺乳动物）的细胞中。病毒载体可以是复制型或复制缺陷型。后一种示例中，病毒增殖通常只在互补宿主细胞中发生。本文使用的术语“宿主细胞”或“宿主”用于指有一个或多个本发明多核苷酸的本发明细胞。
[0576] 因此，在最小量，载体必需包含本发明的多核苷酸。载体的其他组分可以包括但不限于，选择性标记、染色质修饰结构域、驱动载体上还出现的其他多肽(例如致死多肽)表达的其他启动子、基因组整合位点、重组位点和分子插入支点。所述载体可以包含在或不在多核苷酸内的任何数目的这些附加元件，从而能为了所需治疗方法的特定目标调整所述载
体。
[0577] 在本发明的一个实施方式中，引入细胞的所述载体还包含“选择标记基因”，其表达时指示本发明的基因开关构建物已经整合到宿主细胞的基因组中。在这个方式中，所述选择基因能是基因组整合的阳性标记。尽管对本发明方法不重要，存在选择标记基因使操
作者能选择所述细胞的基因组中已经整合载体构建物的活细胞群。因此，本发明的某些实
施方式包含选择载体成功整合的细胞。当与细胞联用时，本文使用的术语“选择”或其变化意在指选择有特定遗传组成或表型的细胞的标准、熟知的方法。一般方法包括但不限于在
抗生素如G418、新霉素和氨苄青霉素存在时培养细胞。选择标记基因的其他示例包括但不
限于赋予对二氢叶酸还原酶、潮霉素或霉酚酸抗性的基因。其他选择方法包括但不限于能
使用胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶或腺嘌呤磷酸核糖基转移酶作为选择
试剂的选择标记基因。包含含有一个或多个抗生素抗性基因的载体构建物的细胞然后能耐
受培养中的抗生素。类似地，不包含含有一个或多个抗生素抗性基因的载体构建物的细胞
不能耐受培养中的抗生素。
[0578] 本文使用的“染色质修饰结构域”(CMD)指某些核苷酸序列，所述核苷酸序列与维持和/或改变染色质结构有关的多种蛋白（例如但不限于DNA隔离子（insulator））相互作用。见Ciavatta等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103:9958（2006）。CMD示例包括但不限于鸡β-球蛋白隔离子和鸡超敏感位点4(cHS4)。一种或多种基因程序(即启动子、编码序
列和3'调节区)之间不同CMD序列的使用例如能辅助使用与多种微生物或体外重组技术
组合的不同CMDDNA序列作为“最小同源臂”，以在现有的多基因和单基因穿梭载体之间“交换”基因程序。染色质修饰结构域的其他示例为本领域已知或易于鉴定。
[0579] 本发明载体的多核苷酸和核酸编码区能与其他编码区结合，所述其他编码区编码指导免疫调节剂（如TNFα）分泌的分泌或信号肽。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链跨粗面内质网的输出启动，所述序
列从成熟蛋白质上切除。脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合于所述多肽N末端的信号
肽，它们从完整或“全长”多肽上切除以产生分泌或“成熟”形式的多肽。
[0580] 在一个实施方式中，本发明的载体包含编码基因开关的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(1)操作性连接启动子的至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子
序列编码配体依赖性转录因子，和(2)编码有免疫调节剂功能的一种或多种蛋白的多核苷
酸，所述免疫调节剂操作性连接由所述配体依赖性转录因子活化的启动子，其中所述编码
有免疫调节剂功能的一种或多种蛋白的多核苷酸还包含编码信号肽的核酸序列。在另一个
实施方式中，与包含免疫调节剂的天然信号肽基因（如TNFα野生型信号肽基因）的载体相比，所述信号肽增加由载体编码的免疫调节剂（如TNFα）的分泌。本发明所用的信号肽特定可以进行密码子优化。在特定实施方式中，信号肽由IL-2野生型信号肽基因编码。在另
一个特定实施方式中，信号肽由密码子优化的IL-2信号肽基因编码。
[0581] 本发明的载体能包含多个调节区，例如5’非翻译区(5’UTR)、3’UTR或两者都有。本发明也针对使用多个调节区来诱导改善的分泌、蛋白翻译、翻译后、mRNA转录或转录后加工。本文使用的基因的“5’非翻译区”或“5’UTR”应理解为，转录成初级RNA转录物（前mRNA）的基因的一部分，并且所述部分位于编码区的上游。所述初级转录物是DNA转录生
成的起始RNA产物，包含内含子和外显子。很多初级转录物必需经过RNA加工以形成生理
活性RNA种。所述加工成成熟mRNA可以包含修剪末端、去除内含子，加帽和/或从其前体
RNA上切除单个rRNA分子。因此mRNA的5'UTR是mRNA不翻译成蛋白并且位于编码序列
上游的一部分。在基因组序列中，所述5'UTR通常定义为转录起始位点和起始密码子之间
的区域。脊椎动物mRNA的所述5'非翻译区(5'UTR)的长度可以是几十个碱基到几百个碱
基(Crowe等，2006BMCGenomics 7:16)。本文使用的5'UTR可以天然产生或修饰成包含天
然中不毗连的一个或多个核酸序列(嵌合序列)和/或可以包含取代、插入和缺失和其组
合。在一个实施方式中，所述5’UTR序列来自野生型TNFα序列或5U2序列。在另一个实
施方式中，所述5'UTR序列是5U2的5'UTR。在一些实施方式中，所述5'UTR诱导改善的蛋
白表达，例如mRNA转录、转录前或转录后。
[0582] 本发明使用的3’非编码区(UTR)指位于编码序列下游(3’)DNA序列，并且可以包含聚腺苷酸化[聚(A)]识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序
列。聚腺苷酸化信号的特征通常是影响mRNA前体的3'末端加入其他聚腺苷酸区（tract）。
能使用任何合适的聚腺苷酸化序列，包含合成的优化序列，以及BGH(牛生长激素)、多瘤病毒、TK(胸苷激酶)、EBV(爱波斯坦-巴尔病毒)和包含人乳头瘤病毒及BPV(牛乳头瘤病
毒)在内的乳头瘤病毒的聚腺苷酸化序列。在特定实施方式中，3’调节区是SV40e(人肉瘤
病毒-40)聚腺苷酸化序列。在另一个特定实施方式中，3'调节区是人生长激素的聚腺苷酸
化序列。
[0583] 在某些实施方式中，与不含所述信号肽和/或调节区的对照相比，所述单独或联合的信号肽和/或调节区能使蛋白分泌、转录或翻译提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、
7倍、8倍、9倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍或500倍。蛋白例如TNFα的分泌水平能相对有野生型基因的载体所编码蛋白表达标准化。在本发明的另一个特定实施
方式中，所述单独或联合的信号肽和/或调节区能使免疫调节剂（例如TNFα）的产率增加
约5%-约10%、约11%-约20%、约21%-约30%、约31%-约40%、约41%-约50%、约51%-约
60%、约61%-约70%、约71%-约80%、约81%-约90%,约91%-约100%、约101%-约149%、约
150%-约199%、约200%-约299%、约300%-约499%或约500%-约1000%。在特定实施方式
中，本发明包含条件表达免疫调节剂例如TNFα的载体，其中所述载体包含5U2的5'UTR、编码IL-2信号肽的密码子优化的核酸序列、编码免疫调节剂例如TNFα的密码子优化的编码
区和SV40e或人生长激素的聚腺苷酸化信号。
[0584] 在另一个实施方式中，本发明的载体包含选自下组的多核苷酸序列：SEQIDNO:47(载体43318)、SEQ ID NO:48(载体43319)、SEQ ID NO:49(载体43320)、SEQ ID
NO:50(载体43321)、SEQ ID NO:51(载体43322)、SEQ IDNO:52(载体43323)、SEQ ID
NO:53(载体43324)、SEQ ID NO:54(载体43325)、SEQ ID NO:55(载体43326)、SEQ ID
NO:56(载体43327)、SEQ IDNO:57(载体43328)和SEQ ID NO:58(载体43329)。在特定实
施方式中，所述载体包含SEQ ID NO:52(载体43323)或SEQ ID NO:58(载体43329)的多
核苷酸序列。
[0585] 本发明使用的特定载体是编码蛋白或多核苷酸的表达载体。通常，所述载体包含对宿主中表达有效的顺式作用控制区域，所述区域操作性连接要表达的多核苷酸。合适的
反式作用因子可以由宿主提供，由互补载体提供或引入宿主后由载体本身提供。
[0586] 很多表达载体能用于表达蛋白或多核苷酸。这种载体包含染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件、病毒如腺相关病毒、慢病毒、杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、狂犬病毒和逆转录病毒的载体，和衍生自其结合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体基因元件如粘粒和噬菌粒
的那些。所有都可以用于本发明此方面所述的表达。通常，任何适于在宿主中维持、增殖或表达多核苷酸或蛋白的载体可以用于这方面的表达。
[0587] 用于本发明的合适病毒载体包括但不限于基于腺病毒的载体、逆转录病毒病毒、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、基于细小病毒的载体如基于腺相关病毒(AAV)的载体
和AAV腺病毒嵌合载体。这些病毒载体能使用标准重组DNA技术制备，所述技术描述于例
如Sambrook等，Molecular Cloning,aLaboratory Manual（《分子克隆：实验室手册》）,第2版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(1989)，和Ausubel等，Current Protocols
in MolecularBiology（《新编分子生物学实验指南》），纽约州纽约的格林出版联合公司(Greene Publishing Associates)和约翰韦利森出版公司(John Wiley&Sons)(1994)。
[0588] 在一个实施方式中，本发明的病毒载体是腺病毒载体。腺病毒(Ad)是在体内有效转移DNA到多种不同靶标细胞类型的36kb双链DNA病毒。腺病毒载体能以高效价（titer）
生成，并能有效转移DNA到复制和非复制细胞中。腺病毒载体基因组能使用任何种，株，亚型，种、株、亚型的混合物或嵌合腺病毒作为载体DNA的来源生成。能用作腺病毒来源的腺病毒储液能从腺病毒血清型1-51（目前可得自美国典型培养物保藏中心（American Type
CultureCollection）(ATCC，弗吉尼亚州玛纳萨斯)）或从来自任何其他来源的任何其他腺病毒血清型中扩增。例如，腺病毒能是亚组A(例如血清型12、18和31)、亚组B(例如血清
型3、7、11、14、16、21、34和35)、亚组C(例如血清型1、2、5和6)、亚组D(例如血清型8、9、
10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39和42-47)、亚组E(血清型4)、亚组F(血清型40和
41)或任何其他腺病毒血清型。鉴于所述人腺病毒血清型5(Ad5)基因组已经完整测序，本
发明的腺病毒载体在本文中就Ad5血清型方面进行描述。所述腺病毒载体可以是能在细胞
中能生长的任何腺病毒载体，其一些重要部分(尽管基本上不必需)衍生自或基于腺病毒
的基因组。所述腺病毒载体能基于任何合适的野生型腺病毒基因组。在某些实施方式中，所述腺病毒载体衍生自组C的野生型腺病毒基因组，特别是血清型2或5。腺病毒载体为本领
域熟知，描述于例如美国专利号5,559,099、5,712,136、5,731,190、5,837,511、5,846,782、
5,851,806、5,962,311、5,965,541、5,981,225、5,994,106、6,020,191和6,113,913，国际专利申请WO 95/34671、WO 97/21826、和WO 00/00628，和Thomas Shenk,"Adenoviridae
and their Replication（腺病毒科和其复制）"和M.S.Horwitz,"Adenoviruses（腺病毒）"分别收录于Virology（《病毒学》）第67和68章，B.N.Fields等编，第3版，纽约的雷文
出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)(1996)。
[0589] 在其他实施方式中，所述腺病毒载体是复制缺陷型。本文使用的术语“复制缺陷型”指所述腺病毒载体包含缺乏至少一个复制必需基因功能的基因组。本文使用的基因、
基因功能、或者基因或基因组区的缺陷定义为缺失病毒基因组的充分遗传材料以损坏或消
除基因的功能，所述基因的核酸序列全部或部分被删除。复制必需基因功能是对复制缺陷
型腺病毒载体的复制（即增殖）必需的那些基因功能。复制必需基因功能由例如腺病毒早
期区(例如E1、E2和E4区)、晚期区(例如L1-L5区)、涉及病毒包装的基因(例如IVa2
基因)和病毒相关RNA(例如VA-RNA I和/或VA-RNA II)来编码。在其他实施方式中，所
述复制缺陷型腺病毒载体包含一个或多个腺病毒基因组区的至少一个复制必需基因功能
缺陷的腺病毒基因组(例如，腺病毒基因组的两个或多个区从而产生多个复制缺陷型腺病
毒载体)。腺病毒基因组的一个或多个区选自E1、E2和E4区。所述复制缺陷型腺病毒载
体能包含E1区的至少一个复制必需基因功能的缺失(标注为E1缺陷型腺病毒载体)，特
别是每个腺病毒E1A区和腺病毒E1B区的复制必需基因功能的缺失。除了所述E1区的缺
陷，重组腺病毒也能有主要晚期启动子(MLP)的突变，如国际专利申请WO 00/00628中所讨
论。在一个特定的实施方式中，所述载体在E1区的至少一个复制必需基因功能和至少部分
非必需E3区(例如E3区的Xba I删除)(标注为E1/E3缺陷型腺病毒载体)上缺失。
[0590] 在某些实施方式中，所述腺病毒载体是“多重缺陷”，指所述腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或多个区各自病毒复制所需的一个或多个基因功能上缺陷。例如，前述E1缺陷型或E1/E3缺陷型腺病毒载体还能在E4区的至少一个复制必需基因功能上缺陷（标注为
E1/E4缺陷型腺病毒载体）。删除整个E4区的腺病毒载体能引起更低的宿主免疫反应。
[0591] 或者，所述腺病毒载体缺乏全部或部分E1区和全部或部分E2区中的复制必需基因功能（标注为E1/E2缺陷型腺病毒载体）。本文也考虑缺乏全部或部分E1区、全部或部分E2区和全部或部分E3区中复制必需基因功能的腺病毒载体。如果本发明的腺病毒载体缺
乏E2A区复制必需基因功能，所述载体不包含长度小于约230碱基对的E2A区完全删除。通
常，腺病毒的E2A区编码DBP（DNA结合蛋白），DBP是DNA复制所需的多肽。DBP由根据病毒
血清型的473-529氨基酸组成。认为DBP是作为由带延伸Nt结构域的球形Ct组成的长椭球
存在的不对称蛋白。研究显示Ct结构域负责DBP结合核酸、结合锌的能力和在DNA链延长
水平的DNA合成中的功能。然而，认为所述Nt结构域在晚期基因表达的转录和转录后水平
中有功能，负责蛋白的有效的核定位，并且也可以涉及其自身表达的提高。Nt结构域在氨基酸2–38的删除显示这个区对DBP功能重要(Brough等，Virology,196,269-281(1993))。
而编码DBP中Ct区的E2A区删除对病毒复制没有影响，编码DBP中Nt结构域氨基酸2–38
的E2A区删除削弱病毒复制。在一个实施方式中，多个复制缺陷型腺病毒载体包含腺病
毒基因组E2A区的此部分。特别是例如，要保持的所需E2A区部分是腺病毒基因组E2A
区的部分，其由E2A区的5'末端定义，特别是血清型Ad5的腺病毒基因组E2A区的位置
Ad5(23816)-Ad5(24032)。
[0592] 所述腺病毒载体能仅缺乏腺病毒基因组早期区的复制必需基因功能、仅缺乏腺病毒基因组晚期区的复制必需基因功能、和缺乏腺病毒基因组早期区和晚期区的复制必需基
因功能。所述腺病毒载体也能是基本上移除全部腺病毒基因组，其中至少病毒的反向末端
重复(ITR)和一个或多个启动子或病毒ITR和包装信号完好保留(例如腺病毒扩增子)。
移除的腺病毒基因组区域越大，能插入基因组的外源核酸序列段越大。例如，鉴于病毒ITR和一个或多个启动子保持完整时所述腺病毒基因组是36kb，所述腺病毒的外源插入能力是
约35kb。或者，只包含ITR和包装信号的多重缺陷型腺病毒载体能有效地插入约37-38kb
的外源核酸序列。当然，包含任何或全部缺陷型腺病毒区中的间隔子元件会降低腺病毒载
体就大插入物而言的容量。包含多个缺陷型腺病毒载体的合适复制缺陷型腺病毒载体公开
于美国专利号5,851,806和5,994,106和国际专利申请WO 95/34671和WO 97/21826。在
一个实施方式中，用于本发明方法的载体描述于国际专利申请PCT/US01/20536中。
[0593] 应理解腺病毒载体的不同区域删除能改变哺乳动物的免疫反应。特别地，不同区域的删除会降低由腺病毒载体引起的炎症反应。另外，所述腺病毒载体外壳蛋白能经修饰
以降低腺病毒载体能或不能被针对野生型外壳蛋白的中和抗体识别，如国际专利申请WO
98/4050所述。
[0594] 当腺病毒载体是多重复制缺陷型（特别是E1和E4区的复制必需基因功能）时，能包含间隔子元件以提供在互补细胞系中的病毒生长，这类似于单个复制缺陷型腺病毒载体
（特别是包含E1区缺陷的腺病毒载体）所实现的。所述间隔子元件能包含具有所需长度的
任何一个或多个序列。所述间隔子元件序列相对腺病毒基因组能是编码或非编码和天然或
非天然，但不恢复缺陷区的复制必需功能。没有间隔子时，多重复制缺陷型腺病毒载体的纤维蛋白的生成和/或病毒生长通过与单个复制缺陷型腺病毒载体的比较而降低。然而，在
至少一个缺陷型腺病毒区（优选E4区）中包含间隔子能抵消纤维蛋白生成和病毒生长中的
这种降低。腺病毒载体中间隔子的使用描述于美国专利号5,851,806。
[0595] 腺病毒载体的构建为本领域熟知。腺病毒载体能使用例如美国专利号5,965,358和国际专利申请WO 98/56937、WO 99/15686和WO 99/54441所述的方法构建和/或纯
化。腺病毒基因转移载体的生成为本领域熟知，并且涉及使用标准分子生物学技术，例如
Sambrook等，同上，Watson等，同上，Ausubel等，同上，和本文引用的其他几篇参考文献中所述的那些。
[0596] 复制缺陷型腺病毒载体通常在互补细胞系中生成，所述互补细胞系以合适水平提供复制缺陷型腺病毒载体中没有但病毒增殖需要的基因功能，以生成高效价的病毒载体储
液。在一个实施方式中，细胞系对复制缺陷型腺病毒中没有的至少一个和/或所有复制必
需基因功能互补。所述互补细胞系能对至少一个复制必需基因功能缺陷互补，所述复制
必需基因功能由早期区、晚期区、病毒包装区、病毒相关RNA区或其组合编码，包含所有的腺病毒功能(例如能增殖包含最小腺病毒序列的腺病毒扩增子，例如仅是反向末端重复
(ITR)和包装信号或者仅ITR和腺病毒启动子)。在另一个实施方式中，所述互补细胞系对
腺病毒基因组E1区的至少一个复制必需基因功能(例如，两个或多个复制必需基因功能)
缺陷互补，特别是对每个E1A和E1B区的复制必需基因功能缺陷互补。另外，所述互补细
胞系能对腺病毒基因组E2(特别是考虑腺病毒DNA聚合酶和末端蛋白)和/或E4区的至
少一个复制必需基因功能缺陷互补。理想地，对E4区缺陷互补的细胞包含E4-ORF6基因
序列且生成E4-ORF6蛋白。这种细胞需要包含腺病毒基因组E4区的至少ORF6且没有其他
ORF。优选细胞系的特征还在于其包含以不重叠方式与腺病毒载体互补的基因，所述腺病毒载体最小化和实际上消除载体基因组与细胞DNA重组的可能性。因此，如果不能在载体储
液中避免，复制型腺病毒(RCA)的出现最小化，从而适合某些治疗目的，特别是基因治疗目的。载体储液中RCA的缺乏避免了非互补细胞中腺病毒载体的复制。构建互补细胞系涉及
到标准的分子生物学和细胞培养技术，例如Sambrook等，同上和Ausubel等，同上所述的那些。生产基因转移载体的互补细胞系(例如腺病毒载体)包括但不限于293细胞(描述于
例如Graham等，J.Gen.Virol.,36,59-72(1977))、PER.C6细胞(描述于例如国际专利申请
WO 97/00326和美国专利号5,994,128和6,033,908)和293-ORF6细胞(描述于例如国际
专利申请WO 95/34671和Brough等，J.Virol.,71,9206-9213(1997))。通过已知方法如在
给定腺病毒基因组位置引入独特限制性位点，能帮助插入核酸序列到腺病毒基因组(例如
腺病毒基因组的E1区)中。
[0597] 逆转录病毒是能感染广泛宿主细胞的RNA病毒。转染时，所述逆转录病毒基因组整合到宿主细胞的基因组中，并且与宿主细胞DNA一起复制，因此持续生成病毒RNA和任何
整合到逆转录病毒基因组中的核酸序列。如此，使用逆转录病毒时可实现治疗因子的长期
表达。考虑用于基因治疗的逆转录病毒为相对非致病性，尽管存在致病性逆转录病毒。当
使用致病性逆转录病毒例如人免疫缺陷病毒(HIV)或人T细胞淋巴营养性病毒(HTLV)时，
必需注意改变病毒基因组以消除对宿主的毒性。还能操作逆转录病毒载体以产生病毒复制
缺陷型。如此，认为逆转录病毒载体对体内稳定基因转移尤其有用。慢病毒载体例如基于
HIV的载体，是用于基因递送的逆转录病毒载体的示例。不同于其他逆转录病毒，已知基于HIV的载体整合其乘客（passenger）基因到非分裂细胞，并且因此能用于治疗持久型疾病。
[0598] 基于HSV的病毒载体适用于基因转移载体以引入核酸到多种细胞类型。成熟HSV病毒颗粒由封装的二十四面衣壳和病毒基因组组成，所述病毒基因组由152kb的线性双链
DNA分子组成。大部分复制缺陷型HSV载体包含删除以去除一个或多个中间-早期基因从
而防止复制。HSV载体的优势是能进入可产生长期DNA表达的潜在阶段和其能适应多至
25kb外源DNA插入的大病毒DNA基因组。当然，HSV促进长期外源蛋白生成的能力在短期
治疗方案中是潜在的劣势。然而，本领域普通技术之一具有必需的了解以决定用于特定情
况的合适载体。基于HSV的载体描述于例如美国专利号5,837,532、5,846,782、5,849,572
和5,804,413，和国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583。
[0599] AAV载体是基因治疗方案中使用的特别感兴趣的病毒载体。AAV是DNA病毒，在造成人疾病方面未知。所述AAV基因组由两个基因即侧接有反向末端重复(ITR)的rep和
cap组成，包含DNA复制和病毒包装的识别信号。为了有效复制，AAV需要与辅助病毒(例
如腺病毒或单纯疱疹病毒)或辅助基因的表达共感染。根据使用的辅助病毒，AAV能在广
泛的宿主细胞中增殖，所述细胞包含人、猿和啮齿动物细胞。用于给予核酸序列的AAV载体通常删除约96%的亲本基因组，从而只保留ITR。这消除了由于表达病毒基因造成的免疫学
或毒性副作用。如果需要，所述AAV rep蛋白能与AAV载体共同给予以使AAV载体整合到
宿主细胞基因组中。包含有整合的AAV基因组的宿主细胞在细胞生长或形态方面没有显示
改变（参见例如美国专利号4,797,368）。如此，来自AAV载体的治疗因子的延长表达能用于治疗持续和慢性疾病。
[0600] 表达载体中的多核苷酸序列操作性连接合适的表达控制序列，包含例如指导mRNA转录的启动子。其他启动子的代表包括但不限于组成型启动子和组织特异性或诱导型启动
子。组成型真核启动子的示例包括但不限于，小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，
J.Mol.Appl.Gen.1:273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell 31:355(1982))；
SV40早期启动子(Benoist等，Nature 290:304(1981))和痘苗病毒启动子。能用于驱动蛋
白或多核苷酸表达的启动子的其他示例包括但不限于，用于特定蛋白的组织特异性启动子
和其他内源启动子如白蛋白启动子(肝实质细胞)、胰岛素原启动子(胰腺β细胞)等。通
常，表达构建物会包含转录、起始和终止位点，以及转录区域中的核糖体翻译结合位点。构建物表达的成熟转录物的编码部分可以包含开始处的翻译起始AUG和待翻译多肽末端合
适位置处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
[0601] 另外，所述构建物可以包含调节和产生表达的控制区。通常，这类区域会通过控制转录操作，例如抑制子结合位点和增强子等。
[0602] 真核载体的示例包括但不限于可获自司查塔基公司（Stratagene）的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；可获自安法马西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia
Biotech)的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和 可获 自 克 隆 泰克 公 司(Clontech)的
pCMVDsRed2-express（表达）、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito和pCMV-EGFP。很多其他载体是熟知的，并且市售可得。
[0603] 包含分子插入支点以快速插入和移除基因程序元件的特别有用载体描述于美国公开专利申请号2004/0185556、美国专利申请号11/233,246和国际公开申请号
WO 2005/040336和WO 2005/116231。这种载体的示例是 生成系统
（Production System）(弗吉尼亚州布莱克斯堡的英创松公司)，如WO 2007/038276所述。
本文使用的“基因程序”是基因元件的组合，所述元件包含启动子(P)、表达序列(E)和3′调节序列(3)，从而“PE3”是基因程序。基因程序内的元件能在所述基因程序每个元件两侧的分子支点之间容易地交换。本文使用的分子支点定义为包含以线性方式排列的至少两个
非可变的罕见和不常见限制位点的多核苷酸。在一个实施方式中，所述分子支点包含以线
性方式排列的至少三个非可变的罕见和不常见限制位点。通常任何一个分子支点可以不包
含相同基因程序中任何其他分子枢的罕见和不常见限制位点。限制性酶作用的大于6个核
苷酸的关联序列称为“罕见”的限制位点。然而，有6bp的限制性位点的出现频率高于统计学预测，这些位点和切割它们的核酸内切酶称作“不常见”限制位点。罕见或不常见限制位点的示例包括但不限于AsiS I、Pac I、SbfI、Fse I、Asc I、Mlu I、SnaB I、Not I、Sal I、Swa I、Rsr II、BSiW I、Sfo I、Sgr AI、AflIII、Pvu I、Ngo MIV、Ase I、Flp I、Pme I、Sda I、SgfI、SrfI、Nru I、Acl I、Cla I、Csp45I、Age I、Bst1107I、BstB I、Hpa I、Aat II、EcoR V、Nhe I、Spe I、Avi II、Avr II、Mfe I、Afe I、Fsp I、Kpn I、Sca I、BspE I、Nde I、Bfr I、Xho I、Pml I、ApaL I、Kas I、XmaI、BsrB I、Nsi I、SacII、Sac I、Blp I、PspoM I、Pci I、Stu I、Sph I、BamH I、Bsu36I、Xba I、BbvC I、Bgl II、Nco I、Hind III、EcoR I、BsrG I和Sse8781I。
[0604] 载体也可以包含称为寻靶（homing）核酸内切酶(HE)的第二类限制性酶的限制位点。HE酶有大的、不对称的限制位点(12-40碱基对)并且其限制位点天然稀少。例如，称
为I-SceI的HE具有18bp限制性位点(5'TAGGGATAACAGGGTAAT 3'(SEQ ID NO:28))，预计
10
在每7x10 个碱基对的随机序列中仅出现一次。这个发生率等于哺乳动物基因组20倍大
小的基因组中只有一个位点。如果克隆载体质粒的合适位置上含有HE位点，HE位点的罕
见特性将大大提高遗传工程技术人员切割基因程序而不破坏基因程序完整性的可能性。
[0605] 选择合适的载体和启动子以在宿主细胞中表达是熟知的过程，并且用于载体构建和引入宿主以及宿主中表达的必需技术是本领域的普通技术。
[0606] 引入多核苷酸到细胞中能是短暂转染、稳定转染或能是载体的基因座特异性插入。向宿主细胞中短暂和稳定转染载体能通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、
阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现。这种方法描述于很多标准
实验室手册，例如Davis等，Basic Methods inMolecular Biology（分子生物学基本方
法）(1986);Keown 等，1990,MethodsEnzymol.185:527-37;Sambrook 等，2001,Molecular Cloning,A LaboratoryManual（分子克隆：实验室手册）,第三版，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社。这些稳定转染方法造成载体随机插入细胞基因组中。另外，载体的拷贝数和
方向通常来说也是随机的。
[0607] 在本发明的一个实施方式中，载体插入到基因组的生物中性（bio-neutral）位点。生物中性位点是基因组中多核苷酸插入对细胞的正常功能干扰（若有）非常小的位点。生
物中性位点能用可用的生物信息学分析。很多生物中性位点为本领域已知，如ROSA等同
（ROSA-equivalent）基因座。其他生物中性位点可以使用本领域熟知的常规技术确定。使用本领域已知方法进行基因组插入位点的鉴定。为了在引入载体到细胞中时控制位点、多
核苷酸的拷贝数和/或方向，可以使用基因座特异性插入方法。基因座特异性插入方法为
本领域熟知，并且包括但不限于同源重组和重组酶介导的基因组插入。当然，如果基因座
特异性插入方法用于本发明的方法，载体可以包含辅助此基因座特异性插入（例如但不限
于同源重组）的元件。例如，载体可以包含一个、两个、三个、四个或更多的基因组整合位点（GIS）。本文使用的“基因组整合位点”定义为载体序列的部分，其核苷酸序列与细胞中使载体插入基因组的基因组部分相同或基本相同。特别地，载体可以包含在至少多核苷酸侧
翼的两个基因组插入位点。当然，所述GIS可以在其他元件或甚至载体上出现的所有元件
的侧翼。
[0608] 在另一个实施方式中，基因座特异性插入可以通过重组酶位点特异性基因插入完成。简单说，细菌重组酶（例如但不限于PhiC31整合酶）能作用于人基因组内的“假”重组位点。这些假重组位点能使用重组酶靶向基因座特异性插入。重组酶位点特异性基因插入
描述于Thyagarajan等，Mol.Cell Biol.21:3926(2001)。重组酶和其可用于重组酶位点
特异性基因插入的各自位点的其他示例包括但不限于丝氨酸重组酶如R4和TP901-1和WO
2006/083253所述的重组酶。
[0609] 在另一个实施方式中，所述载体可以包含化疗耐药基因，如多药耐药基因mdr1、二6
氢叶酸还原酶或O-甲基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。所述化疗抗性基因可以受组成型(例如
CMV)或诱导型(例如 )启动子控制。在这个实施方式中，如果需要治疗对象
中的疾病而维持对象中修饰的细胞，临床医生可以应用化疗试剂来破坏患病细胞，而所述
修饰细胞会由于表达合适的化疗抗性基因而受到保护抵御所述试剂，并且可以持续用于疾
病或紊乱的治疗、改善或预防。通过将化疗抗性基因置于诱导型启动子下，能避免化疗抗性基因的不必要表达，但是在需要持续治疗的示例中其仍然可用。如果所述修饰细胞本身患
病，其仍然会通过诱导下述致死多肽的表达而被破坏。
[0610] 本发明的方法通过把编码基因开关的多核苷酸和外源基因引入到对象细胞中完成。能使用本领域已知的引入多核苷酸到细胞的任何已知方法，如上面描述的那些。
[0611] 当所述多核苷酸离体引入细胞中时，所述细胞可以使用任何本领域已知的技术从所述对象获得，包括但不限于活检、刮擦和手术组织去除。所述分离细胞可培养足够时间以使多核苷酸能引入到所述细胞中，所述时间如2、4、6、8、10、12、18、24、36、48小时或更多。
短时间段培养初级细胞的方法为本领域熟知。例如，细胞能在平板（如微孔板）中贴壁或悬浮培养。
[0612] 对离体治疗方法而言，从对象分离细胞并在适于引入多核苷酸到所述细胞的条件下培养。一旦多核苷酸引入到细胞中，培养所述细胞足够的时间段以表达配体依赖性转录
因子，所述时间如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、18或24小时或更多。在所述多核苷酸引入到所述细胞后的一些点(表达显著水平的配体依赖性转录因子之前或之后)，引入所
述细胞回到所述对象。重新引入可以通过本领域已知的任何方法完成，如静脉内输注或直
接注射到组织或空腔。在一个实施方式中，在引入细胞回到对象前测定细胞中多核苷酸的
存在。在另一个实施方式中，选择包含多核苷酸的细胞(例如基于多核苷酸中选择标记的
出现)并且只有那些包含多核苷酸的细胞重新引入到对象中。所述细胞重新引入所述对象
后，给予所述对象配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。在另一个实施方式中，甚至在所述细胞重新引入到所述对象前，向细胞加入所述配体，从而在重新引入所述细胞前表
达治疗多肽或治疗多核苷酸。可以通过任何合适的方法给予配体，或系统地给予(例如口
服、静脉)或局部给予(例如腹膜内、鞘内、心室内、直接注射到重新引入细胞的所述组织或器官中)。对于每种类型的细胞和疾病或紊乱，仅使用常规技术能测定配体给予的最佳时
间。
[0613] 本发明的体内治疗方法涉及体内向对象细胞直接引入多核苷酸，例如腺病毒载体。所述多核苷酸可以系统地或局部地（例如在所述局部或紊乱的位点）引入到对象中。一旦多核苷酸引入到所述对象中，给予所述配体以诱导治疗多肽或治疗多核苷酸的表达。可
以通过任何合适的方法给予配体，或系统地给予(例如口服、静脉)或局部给予(例如腹膜
内、鞘内、心室内、直接注射到所述疾病或紊乱发生的组织或器官中)。对于每种类型的细胞和疾病或紊乱，仅使用常规技术能测定配体给予的最佳时间。
[0614] 对体内使用而言，本文所述配体可以药学上可接受运载体吸收，例如溶液、悬浮液、片剂、胶囊、软膏、酏剂和可注射的组合物。药物组合物可以包含0.01%-99%重量的配体。组合物可以是单个或多个剂量形式。任何特定药物组合物的配体量取决于所述有效剂
量，即引起所需基因表达或抑制需要的剂量。
[0615] 给予药物制剂的合适途径包含口腔、直肠、局部(包含皮肤、口颊和舌下)、阴道、胃肠外(包含皮下、肌肉内、静脉内、肿瘤内、皮内、鞘内和硬膜外)、玻璃体内和通过鼻胃管。本领域技术人员应理解给予途径取决于要治疗的病症，并且根据诸如受体情况等因素而变化。
[0616] 本文使用的术语"rAD.RheoIL12"指有基因开关 治疗系统(RTS)控制下IL-12基因的腺病毒多核苷酸载体，在活化配体出现时能生成IL-12蛋白。本文使用
的术语"rAd.cIL12"指包含组成型启动子控制下IL-12基因的腺病毒多核苷酸控制载体。
[0617] 本文使用的术语"IL-12p70"指天然有两个亚基（通常称为p40和p35）的IL-12蛋白。术语IL-12p70包含含有IL-12的两个亚基(p40和p35)的融合蛋白，其中所述融合
蛋白可以包含亚基之间的接头氨基酸。
[0618] 本文使用的术语“有免疫调节剂功能的蛋白”指有至少20%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)任何免疫调节剂生物活性的蛋白，所述免疫调节剂选自IL-1、
IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10RDN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNα、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。类似地，术语"有IL-12功能的蛋白"指有至少20%(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或
90%)任何人IL-12生物活性的蛋白。熟知这种免疫调节剂的生物活性。参见下表。
[0619] 表6免疫调节剂和其功能
[0620]
[0621]
[0622]
[0623]
[0624]
[0625]
[0626] IL-12的生物活性也熟知，并且包括但不限于，将天然T细胞分化成Th1细胞、刺激T细胞的生长和功能、从T和自然杀伤(NK)细胞生成干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子、降低IL-4介导的IFNγ抑制、增加NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性、刺激
IL-12R-β1和IL-12R-β2表达、通过上调MHC I和II分子辅助肿瘤抗原的呈递和抗血管
生成活性。术语"有IL-12功能的蛋白"包含野生型IL-12序列的突变体，其中通过一个
或多个氨基酸的加入、删除或取代改变了所述野生型序列，以及包含模仿一种或多种IL-12生物活性的非IL-12蛋白。
[0627] 本文使用的术语“活化”或“激活”指基因开关细胞活性的任何可测量增加，引起感兴趣基因的表达（例如选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、
IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNα、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、
OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1、RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和S100。
[0628] 本文使用的术语"治疗"或"处理"疾病指操作某一方案，所述方案可以包含给予哺乳动物(人或非人)一种或多种药物或体外工程改造的细胞，以缓解疾病的征兆或症
状。因此，"治疗"或"处理"不应该解释为需要完全改善征兆或症状，不需要治愈，且特
定包含对对象只有边际效果的方案。
[0629] 本文使用的“免疫细胞”包含树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞（neurophil）、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和淋巴细胞(例如B和T细胞)。
[0630] 本文使用的术语“树突细胞”和“DC”互换使用。
[0631] 本文使用的术语"治疗支持细胞"(TSC)是能用本发明的载体修饰(例如转染、电穿孔等)以向肿瘤微环境递送一种或多种有免疫调节剂功能蛋白（并且可选有IL-12功能
的蛋白）的细胞。这种TSC包括但不限于干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞。
[0632] 本文使用的术语"体外工程改造的免疫细胞"或"体外工程改造的免疫细胞群"或"工程改造的免疫细胞群"或“表达免疫调节剂的免疫细胞”或"表达IL-12的免疫细
胞"指某些免疫细胞例如树突细胞，所述细胞在基因开关控制下条件性表达免疫调节剂和
/或IL-12，其能通过活化配体而激活。
[0633] 本文使用的术语"体外工程改造的TSC"或"体外工程改造的TSC群"或"工程改造的TSC群"或“表达免疫调节剂的TSC”或"表达IL-12的TSC"指某些治疗支持细胞
例如干细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞，所述细胞在基因开关控制下条件性表达免疫调节剂和/或IL-12，其能通过活化配体而激活。
[0634] 本文使用的术语"修饰的细胞"指通过某一过程改变的细胞，所述过程包括但不限于转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀和脂质转染(溶酶体融合)。
[0635] 本文使用的术语"MOI"或"感染复数（Multiplicity of Infection）"指特定实验中感染单个细胞的腺病毒颗粒的平均数目(例如重组腺病毒或对照腺病毒)。
[0636] 本文使用的术语"肿瘤"指体内或体外生长和增殖的所有良性或恶性细胞，不论是癌前或癌细胞和/或组织。
[0637] 在另一个实施方式中，本发明的所述载体和方法能用于治疗疾病。
[0638] 在另一个实施方式中，本发明的所述载体和方法能用于治疗癌症。能根据本发明治疗的癌症的非限定性示例包含乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠
癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑癌、头颈癌、胶质瘤、胶质细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈恶性肿瘤（carcinoma）、乳腺恶性肿瘤（carcinoma）、卵巢恶性肿瘤（carcinoma）、肺癌（carcinoma）、小细胞肺癌（carcinoma）、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌（carcinoma）、睾丸癌（carcinoma）、膀胱恶性肿瘤（carcinoma）、胰腺恶性肿瘤（carcinoma）、胃癌（carcinoma）、结肠恶性肿瘤（carcinoma）、前列腺恶性肿瘤（carcinoma）、泌尿生殖器癌（carcinoma）、甲状腺癌（carcinoma）、食道癌（carcinoma）、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌（carcinoma）、肾细胞癌（carcinoma）、子宫内膜癌
（carcinoma）、肾上腺皮质癌（carcinoma）、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌瘤、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、多毛细胞白血病、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、真性红细胞增多、特发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、成骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤等。在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗代谢
相关紊乱，包括但不限于选自下组的紊乱：血脂障碍、动脉粥样硬化、胰岛素抗性、糖尿病(例如I型糖尿病、II型糖尿病、MODY和孕龄糖尿病)，肥胖，葡萄糖耐量受损，动脉粥样化病，高血压，心脏病(包括但不限于冠心病、中风、心功能不全、冠状功能不全和高血压)，高脂血症，葡萄糖不耐受，胰岛素抗性，高血糖症，高胰岛素血症，代谢综合症X(或综合症X或抗胰岛素综合症或格林综合症，或代谢心血管风险综合症)，高血压，慢性疲劳，加速老化，变性疾病，内分泌缺陷老化，Gm1神经节苷脂沉积症，Morquio-B病，克拉伯（Krabbe）病，法布瑞氏症（Fabry），高歇（Gaucher）病，泰—萨二氏（Tay-Sachs）病，山霍夫氏（Sandhoff）病，岩藻糖苷贮积症（fucosidosis），糖代谢紊乱(例如糖原贮积病)，氨基酸代谢紊乱(例如苯丙酮尿症、槭树糖浆尿病、1型戊二酸尿症)，有机酸代谢紊乱(例如黑尿病)，脂肪酸氧化和线粒体代谢紊乱(例如中链酰基脱氢酶缺乏症)，卟啉代谢紊乱(例如急性间歇性卟啉
病)，嘌呤和嘧啶代谢紊乱(例如莱希-尼亨（Lesch-Nyhan）综合症)，类固醇代谢紊乱(例
如先天性肾上腺皮质增生症)，线粒体功能紊乱(例如卡恩斯-塞尔（Kearns-Sayre）综合
症)，和过氧化物酶体功能紊乱(例如泽韦格（Zellweger）综合症)。
[0639] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗自体免疫疾病，包括但不限于选自下组的疾病：Achlorhydra自体免疫慢性活动性肝炎、急性播散性脑脊髓炎、急
性出血性脑白质炎、阿狄森氏（Addison）病、丙种球蛋白血症（gammaglobulinemia）、丙种球蛋白缺乏症、斑秃、肌萎缩侧索硬化、关节黏连脊椎炎、抗GBM/TBM肾炎、抗磷脂综合症、抗合成酶综合症、关节炎、特异反应性过敏、特应性皮炎、再生障碍性贫血、自体免疫性心肌病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳病、自体免疫淋巴增生综合症、自体免疫性周围神经病、自体免疫性胰腺炎、I、II和III型自体免疫性多内分泌腺
病综合症、自体免疫性孕酮性皮炎、自体免疫性血小板减少性紫癜、自体免疫性葡萄膜炎、巴洛（Balo）病/巴洛同心圆性硬化、贝赛特氏（Bechets）综合症、Berger病、比克斯塔夫（Bickerstaff）脑干脑炎、Blau综合症、大疱型类天疱疮、巨淋巴结增生症、慢性疲劳免疫功能障碍综合症、慢性炎症脱髓鞘多神经病、慢性复发性多病灶性骨髓炎、丘-施二氏综
合症（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性类天疱疮、腹部疾病、柯根化（Cogan）综合症、冷凝集素疾病、补体成分2缺乏、颅动脉炎、CREST综合症、克罗恩（Crohns）病、Cushing综合症、皮肤白细胞破碎性血管炎、Dego病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型melites糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、心肌梗死后（Dressler）综合症、盘状红斑狼疮、湿疹、与附着点炎症相关的幼年特发性关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症、Evan综合症、进行性肌肉骨化症、纤维肌炎、致纤维化性肺
泡炎、胃炎、胃肠道天疱疮、巨细胞性动脉炎、肺出血肾炎综合症、Graves病、格-巴综合症（Guillain-Barrésyndrome）(GBS)、桥本脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、Hughes综合症(或抗磷脂综合症)、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘
病、;特发性肺间质纤维化、原发性血小板减少性紫癜、IgA肾病(或Berger病)、包含体
肌炎、ory去髓鞘多发性神经病变、青少年特发性关节炎、青少年类风湿性关节炎、朗伯-伊顿（Lambert-Eaton）肌无力综合症、白细胞破裂性血管炎、扁平苔藓、硬化萎缩性苔藓、线状IgA病(LAD)、卢格里格（Lou Gehrig）病、狼疮肝炎、红斑狼疮、Majeed综合症、梅尼埃尔氏（Ménière）病、显微镜下多血管炎、及米费综合征（Miller-Fisher）、混合性结缔组织病、穆-哈（Mucha-Habermann）二氏病、穆-韦（MuckleWells）二氏综合症、多发性骨髓瘤、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(也是德维克（Devic）病)、疤痕性类天疱疮、Ord甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS(链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副肿瘤性小脑变性、帕-罗二氏（Parry Romberg）综合征、帕瑟纳-特纳综合症（Parsonnage-Turner syndrome）、睫状体平部炎、天疱疮、慢性天疱疮、恶性贫血、静脉周围性脑脊髓炎、POEMS综合症、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、拉斯姆森（Rasmussen）脑炎、雷诺（Raynaud）现象、复发性多发软骨炎、莱特尔氏（Reiter）综合症、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热病、施稀特（Schmidt）综合症、Schnitzler综合症、巩膜炎、斯耶格伦氏 综合症、脊椎关节病、血液粘滞综合症、斯提耳氏（Still）病、
亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏（Susac）症候群、斯威特（Sweet）综合症、西登哈姆（Sydenham）舞蹈病、交感性眼炎、无脉病、巨细胞性动脉炎、托洛萨-亨特（Tolosa-Hunt）综合症、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊椎关节病变、脉管炎、韦格纳（Wegener）肉芽肿病、威尔逊（Wilson）综合症和威-奥二氏（Wiskott-Aldrich）综合症。
[0640] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗眼部疾病，包括但不限于选自下组的疾病：青光眼，包含开角型青光眼(例如原发性开角型青光眼、色素性青光眼
和剥脱性青光眼、低眼压性青光眼)、闭角型青光眼(临床上也称为闭角型青光眼（closed angle glaucoma）、狭角性青光眼、瞳孔阻滞性青光眼和睫状环阻塞性青光眼)(例如急性闭角型青光眼和慢性闭角型青光眼)、无虹膜性（Aniridic）青光眼、先天性青光眼、青少年型青光眼、晶状体诱导青光眼、新生血管性青光眼(例如使用由血管内皮生长因子(VEGF)诱
饵（decoy）、色素衍生因子(PDGF)、内皮他丁、血管他丁或血管生成素1构成的载体)、外伤后青光眼、类固醇诱导青光眼、Sturge-Weber综合症并发青光眼和色素层炎诱导青光眼、糖尿病性视网膜病(例如使用由VEGF诱饵、PDGF、内皮他丁、血管他丁或血管生成素1构成的
载体)、黄斑变性(例如由VEGF诱饵（decoy）、PDGF、内皮他丁、血管他丁、血管生成素-1、ATP结合盒亚家族A成员4构成的载体)、黄斑变性(例如使用由VEGF诱饵（decoy）、PDGF、
内皮他丁、血管他丁、血管生成素-1、ATP结合盒亚家族A成员4构成的载体)、脉络膜新生
血管性疾病(例如使用由VEGF诱饵（decoy）、PDGF、内皮他丁、血管他丁或血管生成素-1构成的载体)、血管裂隙和/或视网膜水肿、细菌性结膜炎、真菌性结膜炎、病毒性结膜炎、葡萄膜炎、角膜后沉淀物、黄斑水肿(例如例如使用由VEGF诱饵（decoy）、PDGF、内皮他丁、血管他丁或血管生成素-1构成的载体)，人工晶体植入术后的炎症反应，葡萄膜炎综合症(例
如慢性虹膜睫状体炎或慢性眼内炎)，视网膜血管炎(例如如在类风湿性关节炎、幼年型类
风湿关节炎、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化病、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、颞动脉炎、亚-贝二氏（Adamantiades Bechcet）病、Sjorgen病、复发性多发软骨炎和HLA-B27相关脊椎炎)，肉状瘤病，伊尔斯（Eales）病，急性视网膜坏死，Vogt-小柳-原田（Vogt Koyanaki Harada）综合症，眼弓形体病、放射视网膜病、增殖性玻璃体视网膜病变、眼内炎、眼部青光眼(例如炎性青光眼)，视神经炎，缺血性视神经病变(例如由异位NADH脱氢酶单
位4组成的载体)，甲状腺相关眼病，眼眶炎性假瘤，色素播散综合症(色素性青光眼)，巩
膜炎，表层巩膜炎脉络膜病(例如″白点（White-dot）"综合症包括但不限于急性多灶性后盾)，视网膜病变(例如囊样黄斑水肿、中心性浆液性脉络膜病变和眼假组织胞浆菌病综合
症(例如由胶质细胞源性神经营养因子、外周蛋白2构成的载体)，视网膜血管病(例如糖
尿病性视网膜病变、Coat病和视网膜大动脉瘤)，视网膜动脉闭塞，视网膜静脉闭塞，早产儿视网膜病变，视网膜色素变性(例如由视网膜色素特异性65kDa蛋白组成的载体)，家族
性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)，特发性水螅状脉络膜血管病变，黄斑前膜和白内障。
[0641] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗血液疾病，包括但不限于选自下组的血液疾病：贫血症、出血和凝血障碍(例如弥散性血管内凝血(DIC)、血友病、过敏性紫癜（Henoch-Schonlien Purpura）、遗传性出血性毛细血管扩张、血小板减少(ITP、TTP)、血栓形成、维勒布兰德氏（VonWillebrand）病)、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病)、淋巴瘤(例如霍奇金淋
巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生病(例如骨髓纤维化、真性红细胞增多症、血小板增多
症)、浆细胞病(例如巨球蛋白血症、显著性未确定的单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤
（lyeloma）)、脾脏疾病、白细胞疾病(例如嗜碱性疾病、嗜酸性疾病、淋巴细胞减少、单核细胞疾病、嗜中性白血球减少症、中性粒细胞增多)、血栓症、深静脉血栓(DVT)、血色沉着病、月经过多、镰刀形红细胞贫血症和珠蛋白生成障碍性贫血。
[0642] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗神经疾病，包括但不限于选自下组的神经疾病：高歇（Gaucher）病、帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、亨延顿氏病、弗里德赖希共济失调、轻度认知损害、脑淀粉样血管病、帕金森病（ParkinsonismDisease）、路易体病（Lewy Body Disease）、额颞性痴呆(FTD)、多系统萎缩症(MSA)、进行性核上性麻痹和运动疾病(包含共济失调（ataxia）、大脑性瘫痪、舞蹈手足徐动症、张力失常、妥瑞氏（Tourette）综合症、核黄疽)和震颤病和白质营养不良(包含肾上腺脑白质失养症、异染性脑白质营养不良、Canavan病、亚历山大
病、佩梅病（Pelizaeus-Merzbacher disease）)、神经元蜡样脂褐质沉积症、共济失调性毛细血管扩张症、Rett综合症、α共核蛋白病(例如路易体病（Lewy Body Disease）、多系
统萎缩症、哈勒沃登-施帕茨（Hallervorden-Spatz）病或额颞叶痴呆)、C型尼曼-匹克
（Niemann-Pick）病(NPCD)、1型、2型和3型脊髓性小脑萎缩症和齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩（dentatorubral pallidoluysian atrophy）(DRLPA)。
[0643] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗肺部疾病，包括但不限于选自下组的肺部疾病：哮喘、肺不张、支气管炎、COPD (慢性阻塞性肺疾患)、肺气肿、肺癌、间皮瘤、肺炎、石棉肺、曲霉肿、曲霉菌病（Aspergillosis）、急性侵袭性曲霉菌病、支气管扩张、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎(BOOP)、嗜伊红细胞性肺炎、坏死性肺炎、ral渗出、肺尘症、气胸、肺放线菌病、肺泡蛋白沉积症、肺炭疽、肺动静脉畸形、肺纤维化、肺栓子、肺组织细胞增生症X(嗜酸细胞肉芽肿)、肺动脉高压、肺水肿、肺出血、肺诺卡氏菌病、肺结核、肺静脉闭塞病、类风湿肺疾病、结节病、放射性纤维化、过敏性肺炎、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、婴儿特发性呼吸窘迫综合症、特发性肺纤维变性、特发性间质性肺炎、淋巴管平滑肌瘤病、肺朗格汉斯细胞组织细胞增多症、肺泡蛋白质沉积症、鼻窦炎、扁桃体炎、中耳炎、咽炎、喉炎、肺错构瘤、肺隔离症、先天性囊性腺瘤样畸形(CCAM)和囊肿性纤维化。
[0644] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗风湿病，包括但不限于选自下组的风湿病：系统性红斑狼疮、皮肌炎、硬皮病、系统性坏死性动脉炎、皮肤坏死性静脉炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏（Sjogren）综合症、雷诺氏（Raynaud）现象、莱特尔氏（Reiter）综合症、关节炎、牛皮癣关节炎、血清阴性脊椎关节病变、斯耶格伦氏（Sjogren）综合症、系统性硬化病、皮肌炎/多发性肌炎、混合性结缔组织病和强直性脊柱炎。
[0645] 在另一个实施方式中，本发明的载体和方法能用于治疗传染病，包括但不限于选自下组的传染病：真菌疾病例如皮真菌病(如毛癣菌病、环癣或癣感染)、足癣、甲沟
炎、花斑癣、红癣、擦烂红斑、真菌尿布疹、念珠菌外阴炎、念珠菌龟头炎、外耳道炎、念珠菌病(皮肤和粘膜)、慢性粘膜念珠菌病（mucocandidiasis）(如鹅口疮和阴道念珠菌
病)、隐球菌病、地霉菌病、异处生毛症、曲霉菌病、青霉病、镰刀菌病、接合菌病、孢子丝菌病、着色真菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病、假霉样真菌病（pseudallescheriosis）、足分支菌病、真菌性角膜炎、耳真菌病、肺囊虫病和真菌血症、不动杆菌属（Acinetobacter）感染、放线菌病、非洲昏睡病、AIDS(获得性免疫缺陷综合
症)、阿米巴病、边虫病、炭疽病、溶血隐秘杆菌（Arcanobacterium haemolyticum）感染、大腹菌出血热、蛔虫病、曲霉菌病、星状病毒（atrovirus）感染、巴贝西虫病、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)感染、细菌性肺炎、细菌性阴道病(BV)、拟杆菌属（Bacteroides）
感染、小袋虫病、贝蛔虫（Baylisascaris）感染、BK病毒感染、黑色发结节病、人芽囊原虫（Blastocystis hominis）感染、伯疏氏菌（Borrelia）感染、肉毒杆菌(和婴儿型肉毒中毒)、巴西出血热、布氏杆菌病、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）感染、布鲁里溃疡、杯状病毒感染(诺如病毒和札幌病毒)、念珠菌病、猫抓病、蜂窝组织炎、查加斯氏（Chagas）病(美洲锥虫病)、软下疳、水痘、衣原体属（Chlamydia）病、霍乱、着色芽生菌病、吸虫病、艰难梭菌（Clostridium difficile）病、球孢子菌病、科罗拉多蜱热(CTF)、普通感冒（Common cold）(急性病毒性鼻咽炎；急性感冒)、古兹菲德-雅各氏（Creutzfeldt-Jakob）病(CJD)、隐球菌病、隐孢子虫病、幼虫移行症（ous larva migrans）(CLM)、登革热、双核阿米巴病（Dientamoebiasis）、白喉、裂头绦虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、埃博拉出血热、包虫病、埃立克体病、蛲虫病(蛲虫感染)、肠球菌属（Enterococcus）感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑、幼儿急疹、姜片虫病、肝片形吸虫病、致命性家族性失眠症(FFI)、丝虫病、梭杆菌（Fusobacterium）感染、气性坏疽(梭状芽胞杆菌性肌坏死)、地霉菌病、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克（Gerstmann- -Scheinker）综合症(GSS)、贾第虫病马鼻
疽病、颚口线虫病、淋病、性病肉芽肿(腹股沟肉芽肿)、A组链状球菌感染、B组链状球菌
感染、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）病、手、足和口病(HFMD)、汉坦病毒肺综合症(HPS)幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染、溶血性尿毒症（ic-uremic syndrome）(HUS)、肾综合症出血热(HFRS)、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎、单纯疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、博卡病毒感染、人埃文氏埃希氏病（ewingii ehrlichiosis）、人粒细胞无形体病(HGA)、人粒细胞无形体病(HGA)、人单核细胞埃立克体病、人乳头瘤病毒(HPV)感
染、人副流感病毒感染、膜壳绦虫病、爱波斯坦-巴尔病毒感染传染性单核细胞增多(单
（Mono）)、流感(流行性感冒)、等孢球虫病、川崎病、角膜炎、金格杆菌（Kingellakingae）感染、库鲁病（Kuru）、拉萨热、退伍军人病(军团病)、退伍军人病(庞蒂亚克热)、利什曼病、麻风病、细螺旋体病、利斯特菌病、莱姆病(莱姆疏螺旋体病（Lyme borreliosis）)、淋巴丝虫病(象皮肿)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热(MHF)、麻疹、鼻疽(类鼻
疽)、脑膜炎、脑膜炎病、后殖吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣(MC)、腮腺炎、鼠型斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)、支原体肺炎、足分支菌病、蝇蛆病、新生儿结膜炎(新生儿眼炎)、(新)变异型古兹菲德-雅各氏（Creutzfeldt-Jakob）病(vCJD、nvCJD)、肺诺卡菌病、盘尾丝虫病(河盲症)、类球孢子菌病(南美芽生菌病)、并殖吸虫病、巴斯德氏菌病、头虱病(头虱症)、体虱病(体虱症)、阴虱病(阴虱症、毛虱症)、盆腔炎(PID)、百日咳(顿咳)、瘟疫、肺炎
球菌感染、肺孢子虫肺炎(PCP)、肺炎、脊髓灰质炎、小儿麻痹症、普雷沃菌属（Prevotella）感染、原发性阿米巴性脑膜脑炎(PAM)、进行性多灶性白质脑病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、鼠咬热、呼吸道合胞体病毒感染、鼻孢子虫病、丝状病毒感染、立克次氏体属感染、立克次氏体痘、裂谷热(RVF)、落基山斑疹热(RMSF)、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、SARS(严重急性呼吸道综合症)、疥疮、血吸虫病、脓毒疾、志贺氏菌病(细菌性痢疾)、带状疮疹(火带疮)、天花(痘疮)、孢子丝菌病、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌感染、粪类圆线虫病、梅毒、绦虫病、破伤风(牙关紧闭症)、颜面癣(须癣)、头癣(发癣)、体癣(体癣菌病)、股癣(股癣菌
病)、手癣(手癣菌病)、黑癣、甲癣(甲真菌病)、花斑癣(花斑糠疹)、弓蛔虫病(内脏幼
虫移行症(VLM))、弓形体病、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病(鞭虫感染)、肺结核、野兔病、溶脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum）感染、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、病毒性肺炎、西尼罗河热、须部毛孢子菌病(白癣)、假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）感染、耶氏菌感染、黄热病和接合菌病。
[0646] 在另一个实施方式中，本发明的所述载体和方法能用于治疗哺乳动物中的一种或多种疾病。一方面，所述哺乳动物是人。在另一方面，所述哺乳动物对象是非人动物。能容易考虑可用本发明内容治疗的多种疾病。这些疾病包括但不限于：慢性肾病、骨关节炎、肿瘤学、病毒性上呼吸道感染、猫浆细胞口腔炎、猫酸细胞性肉芽肿、猫白血病病毒感染、犬瘟热感染、系统性真菌感染、心肌病、黏多糖贮积症VII和传染病。
[0647] 一方面，治疗的疾病是动物中的传染病，这种传染病包括但不限于牛呼吸道疾病、猪呼吸道疾病、家禽流行性感冒、鸟类感染性支气管炎、牛脑海绵状病、犬利什曼病、慢性消耗性疾病、人体免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、古典猪瘟、包虫病、流行性肺炎、FIP、口蹄疫、肺腺瘤病、梅迪维斯纳（Maedi-Visna）病、动物乳腺炎、犬小孢子菌、Orf(动物疾病)、小反刍兽疫、痘病、鹦鹉喙羽病、狂犬病、地中海热(布氏杆菌病)或牛传染性流产或波状热、马尔他热、接触性流产、传染性流产、沙门菌性食物中毒、肠副伤寒样症状（paratyphosis）、细菌性痢疾、假结核病（Pseudotuberculosis）、鼠疫、瘟疫热、结核病、霍乱、利斯特菌病、钩端螺旋体性黄疸(细螺旋体病)或钩端螺旋体病、出血性黄疸病(出血性黄疸钩端螺旋体)、乳品业工人发烧(牛钩端螺旋体（L.hardjo）)、回归热、
蜱媒回归热、钩端螺旋体性热、流浪热（vagabond fever）、饥馑热、莱姆关节炎、Bannworth综合症(莱姆病（lime disease）)、蜱传脑膜多神经炎、慢性迁移性红斑、弧菌病、大肠
菌感染症（Colibacteriosis）、大肠杆菌毒血症、白泻病、猪肠道水肿、肠副伤寒样症状（paratyphosis）、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌性胃肠炎、犬冠状病毒(CCV)或犬小病毒肠炎、猫感染性腹膜炎病毒、传染性胃肠炎(TGE)病毒、豪氏（Hagerman）红口病(ERMD)、感染性造血坏死病毒(IHN)、猪胸膜肺炎放线杆菌(嗜血杆菌属)、麻疯病、链丝菌病、绵羊霉菌性皮炎、马伪鼻疽、惠特莫尔氏（Whitmore）病、Francis病、土拉菌病、兔热病、O'Hara病、念珠状链杆菌性热、哈佛希耳（Haverhill）热、流性斑、鼠咬热（sodoku）、航运或运输热、出血性败血症、饲鸟病、鹦鹉热、禽衣原体病、北美皮肤芽生菌病、芝加哥病、吉耳克里斯特氏（Gilchrist）病、猫抓热、良性淋巴网状内皮细胞增生、良性非细菌性淋巴结炎、杆菌性血骨病、杆菌性紫癜、寇热、巴尔干流感、巴尔干流感、屠宰场热（abattoir fever）、蜱传热、肺炎立克体病、美国蜱斑疹伤寒、蜱传斑疹伤寒、疱疹样立克次体病、立克次氏体痘、蚤传斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、都市伤寒、癣菌病、皮肤癣菌病、癣、毛癣菌病、小孢子菌病、股癣、脚癣、申克孢子丝菌、双态性真菌、隐球菌病和组织胞浆菌病、良性表皮猴痘、BEMP、猴疱疹病毒、乙型猿猴病毒病、委内瑞拉马脑炎病毒、C型昏睡性脑炎、黄热病、黑色呕吐、汉坦病毒肺综合症、朝鲜出血热、流行性肾病、流行性出血热、出血性肾病肾炎、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、加利福尼亚脑炎/大地病毒脑炎、非洲出血热、绿猴或南非小猿猴病、恐水病、狂犬病、传染性肝炎、流行性肝炎、流行性黄疸、麻疹、麻疹、猪和马流感、禽疫、新堡病、梨浆虫病、弓浆虫病、非洲昏睡病、冈比亚锥虫病、非洲锥虫病、南美锥虫病、查加斯（Chagas-Mazza）病、南美锥虫病、痢疾形虫、小袋虫痢疾、隐孢子虫病、贾第虫病、皮肤利什曼病:糖胶树胶工人（Chiclero）溃疡、鼻咽粘膜利什曼病、pianbols、粘膜皮肤利什曼病（uta）和布巴病（buba）(在美洲)；东方疖、皮肤利什曼病(在旧大陆);巴格达疖、德里（Delhi）疖、包鲁（Bauru）疖，内脏利什曼病:黑热病、微孢子虫病、异尖线虫病、旋毛虫病、血管圆线虫蚴移行症、嗜酸性粒细胞脑膜炎或脑膜脑炎(广州管圆线虫（A.cantonensis）)、腹部管圆线虫病(脊
形管圆线虫（A.costaricensis）)、钩虫病、板口线虫病、钩虫病、毛细线虫病、马来丝虫病（Brugiasis）、毒蛔虫病、食道口线虫病、粪类圆线虫病、毛状腺虫病、蛔虫症、裂头绦虫病、裂头蚴病、牛羊棘球蚴病、棘球蚴病、尖绦虫（Echinococcus granulosis）、囊性包虫病、绦虫感染、血吸虫（Schistosoma）等。
[0648] 也考虑由感染病原体引起的恶性疾病的治疗。这种疾病的示例包括但不限于骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、EBV引起的伯奇氏淋巴瘤、劳氏（Rous）逆转录病毒引起的劳氏肉瘤、8型疱疹病毒引起的卡波济氏肉瘤、HTLV-I逆转录病毒引起的成年T细胞白血病或HTLV-II
引起的多毛细胞白血病和感染剂和病毒引起的很多其他肿瘤和白血病。
[0649] 在一个实施方式中，用于治疗一种或多种上述疾病的一种或多种蛋白包括但不限于，促血红细胞生长素、生长素释放肽、骨保护素、RANKL、RANKL诱饵（decoy）、TNF-α拮抗剂、IL-1拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、血管他汀、内皮他汀、TNF-α、PP1DCY-LSRLOC、β-葡糖苷酸酶和IL-12。在另一个实施方式中，本发明的一种或多种蛋白包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN或其亚基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNα、IFNγ、IFNα1、IFNα2、IL-15-R-α、CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CXCL1(MGSAα)、CCR7、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)、CCL21(6Ckine)、
OX40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNFα、dnFADD、BCG、TGFα、PD-L1RNAi、PD-L1反义寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L和PSMA。
[0650] 在一个实施方式中，给予遭受一种或多种所公开疾病的哺乳动物的载体是腺病毒载体。在一个实施方式中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸。一方面，所述基
因开关是基于EcR的基因开关。在另一个实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包
含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序
列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作
为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。一方面，所述配体是二酰肼。另一方面，所述配
体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。另一方面，所述配体是酰胺酮或恶二唑啉
（oxadiazoline）。
[0651] 在另一个实施方式中，本发明能用于治疗哺乳动物中的一种或多种溶酶体贮积病。一方面，所述哺乳动物是人。在另一方面，所述哺乳动物是非人动物。能根据本发明治疗的溶酶体贮积病的示例包括但不限于，庞培氏病/II型糖原贮积病、高歇病(I型、II型、III型)、法布里病、黏多糖贮积症II(亨特(Hunter)综合症)、黏多糖贮积症VI(马-拉
二氏(Maroteaux-Lamy)症)、黏多糖贮积症I、异染性脑白质营养不良、神经元蜡样质脂褐
质沉积病或CLN6病(非典型晚婴型、晚发型变异、若年、芬兰晚婴型变异CLN5、詹-比二
氏（Jansky-Bielschowsky）病/晚婴型CLN2/TPP1病、库夫斯病(Kufs)/成年发作性NCL/
CLN4病、北方癫痫/变异晚婴型CLN8、神经元蜡样脂褐质沉积症(Santavuori-Haltia)/
婴儿CLN1/PPT病、β-甘露糖苷病)、巴-斯-沃三氏（Batten-Spielmeyer-Vogt）/青少
年NCL/CLN3病、A型沙费利波综合症、B型沙费利波综合症、C型沙费利波综合症、D型沙费
利波综合症、MPSI贺勒综合症、尼曼-匹克氏（Niemann-Pick）病(A型、B型、C型、D型)、激活因子缺乏症/GM2神经节苷脂累积病、α-甘露糖苷病、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇
酯沉积病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏、胱氨酸累积症、Danon病、Farber病、岩藻糖苷贮积症（Fucosidosis）、半乳糖唾液酸沉积症(Goldberg综合症)、GM1神经节苷脂累积病(婴儿、晚婴型/少年、成年/慢性)、I细胞疾病/黏脂沉积II、婴儿游离唾液酸贮积病/ISSD、少年
己糖胺酶A缺乏症、Krabbe病(婴儿发病，迟发性)、黏多醣症(假性赫尔利（Hurler）多营
养障碍综合征/黏脂沉积IIIA、沙伊综合症、MPS I贺勒氏-施艾氏(Hurler-Scheie)症、
莫奎欧氏(Morquio)症A型/MPS IVA、莫奎欧氏症B型/MPS IVB、MPS IX透明质酸酶缺乏、
Sly综合症(MPS VII)、黏脂沉积I/唾液酸沉积症、黏脂沉积IIIC,、黏脂沉积IV型)、多发
性硫酸酯酶缺乏症、致密性成骨不全症、山霍夫氏(Sandhoff)病/成年发病/GM2神经节苷
脂累积病、山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积病-婴儿、山霍夫氏病/GM2神经节苷脂累积
病–青少年、Schindler病、Salla病、婴儿唾液酸贮积病、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs)/
GM2神经节苷脂累积病、Wolman病、天冬氨酰葡糖胺尿症（Asparylglucosaminuria）和鞘脂激活蛋白原（prosaposin）。
[0652] 应理解A型沙费利波综合征与A型沙费利波综合征/MPS IIIA同义，B型沙费利波综合征与B型沙费利波综合征/MPS IIIB同义，C型沙费利波综合征与C型沙费利波综
合征/MPS IIIC同义，D型沙费利波综合征与D型沙费利波综合征/MPS IIID同义。
[0653] 在一个实施方式中，本发明载体表达的一种或多种蛋白用于治疗一种或多种上述溶酶体贮积病，包括但不限于，a-半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、
b-葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、CLN6蛋白、CLN3相关的青少年、N-磺氨基葡糖磺基氢化酶
（sulfoglucosamine sulfohyrolase）(SGSH)、a-N-乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-辅酶A-氨基葡糖苷乙酰基转移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶（iduronidase）、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase）和艾杜糖醛酸硫酸酯酶
（iuduronate sulfatase）。
[0654] 在一个实施方式中，给予遭受一种或多种所公开溶酶体贮积病的哺乳动物的载体是腺病毒载体。在一个实施方式中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸。一方面，
所述基因开关是基于EcR的基因开关。在另一个实施方式中，所述编码基因开关的多核苷
酸包含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因
子序列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形
成作为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。一方面，所述配体是二酰肼。另一方面，所述
配体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。另一方面，所述配体是酰胺酮和恶二唑啉
（oxadiazoline）。
[0655] 在另一个实施方式中，本发明能用于治疗哺乳动物中的一种或多种肝病。一方面，所述哺乳动物是人。在另一方面，所述哺乳动物对象是非人动物。一方面，所述肝病是乙型肝炎。另一方面，所述肝病是丙型肝炎。在一个实施方式中，本发明载体表达的蛋白是
IFN-α。在另一个实施方式中，本发明载体表达的蛋白是一种或多种肝病，包含血浆铜蓝蛋白。
[0656] 用于乙型肝炎和丙型肝炎感染和治疗的人肝嵌合小鼠模型的非限定性示例公开于Bissig,K.D.等，J.Clin.Investigation 120:924(2010)。人肝细胞模型的非限定性示
TM
例是由Yecuris (俄勒冈州波特兰（Portlan）)市售的人源化小鼠系统。
[0657] 用于评价抗病毒/抗感染治疗的脑炎模型的非限定性示例公开于O’Brien,L.等，J.General Virology 90:874-882(2009)。
[0658] 用于评价抗病毒/抗感染治疗的流感模型的非限定性示例公开于Beilharz,M.W. 等，Biochemical Biophysical Research Communications 355:740-744(2007); 和
Koerner,I.等，J.Virology 81:2025-2030(2007)。
[0659] 在一个实施方式中，给予遭受一种或多种所公开肝病的哺乳动物的载体是腺病毒载体。在另一个实施方式中，所述载体不是腺病毒载体。在另一个实施方式中，所述载
体是质粒。在一个实施方式中，所述载体包含编码基因开关的多核苷酸。一方面，所述基
因开关是基于EcR的基因开关。在另一些实施方式中，所述编码基因开关的多核苷酸包
含在第一启动子控制下的第一转录因子序列，和在第二启动子控制下的第二转录因子序
列，其中由所述第一转录因子序列和所述第二转录因子序列编码的蛋白相互作用形成作
为配体依赖性转录因子的蛋白复合物。一方面，所述配体是二酰肼。另一方面，所述配
体选自RG-115819、RG-115932和RG-115830。另一方面，所述配体是酰胺酮和恶二唑啉
（oxadiazoline）。
[0660] 本发明提供细胞（如免疫细胞和TSC）的工程改造以条件表达有免疫调节剂和可选IL-12功能的蛋白以及治疗癌症或肿瘤或两者的治疗用途和/或应用。条件表达有免疫调节剂和可选IL-12功能的蛋白的体外工程改造免疫细胞和TSC相对于组成型生成蛋白是安
全的改进。另外，控制免疫调节剂和可选IL-12的时间和水平的能力提供了改善的治疗功
效控制。因此，体外工程改造的免疫细胞和TSC可以制成药物组合物，作为治疗人或非人
生物的癌症或肿瘤的治疗剂。或者，体外工程改造的免疫细胞群、TSC群或其亚组的群可以用作载剂(vehicle)以条件递送免疫调节剂和可选的IL-12蛋白生成到人或非人生物体
内的特定区域(正常组织、癌症或肿瘤)。免疫细胞可以是自体或非自体树突细胞。所述
树突细胞可以从骨髓或外周血循环中分离。在人患者中，树突细胞群可以通过白细胞透入
(leukophoresis)工艺分离，其中分离和除去白细胞部分并重新灌输其他血液成分到患者。
[0661] 在另一个实施方式中，制备所述树突细胞可以通过用本发明的载体转染人造血干细胞，所述载体表达免疫调节剂功能的蛋白和可选有IL-12功能的蛋白并分化转染的干细
胞产生树突细胞。参见美国专利6,734,014。
[0662] 在一个实施方式中，提供包含基因开关的核酸腺病毒载体，其中VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列由EMCV内部核糖体进入位点(IRES)序列分开，插入到受人泛素C启
动子控制的腺病毒穿梭载体中。例如，由IRES序列分开并置于合成诱导型启动子控制下的
IL12的p40和p35亚基的编码序列插入到泛素C启动子的上游。在另一个实施方式中，置
于合成诱导型启动子控制下的TNFα的编码序列插入到泛素C启动子的上游。
[0663] 在另一个实施方式中，本发明提供某种穿梭载体，所述载体载有两个融合蛋白的转录单位(VP16-RXR和Gal4-EcR)和与大肠杆菌BJ5183细胞中腺病毒主链(AdEasy1)重
组的诱导型IL-12或TNFα亚基。在确定了重组克隆后，载有rAd.RheoIL12基因组的质粒
在XL10-金细胞中生长和纯化，从质粒主链上消化和通过转染到HEK 293细胞或CHO细胞
封装。
[0664] 纯化载体以增加浓度能通过任何合适的方法完成，所述方法例如密度梯度纯化(例如氯化铯(CsCl))或色谱技术(例如柱或分批（batch）色谱)。例如，本发明的载体能
进行两个或三个CsCl密度梯度纯化步骤。载体（例如复制缺陷型腺病毒载体）需要从感染
有复制缺陷型腺病毒载体的细胞中纯化，所用方法包含裂解感染有腺病毒的细胞、将裂解
液用于色谱树脂、从色谱树脂洗脱所述腺病毒和收集含有腺病毒的组分。
[0665] 在一个特定的实施方式中，所得的初级病毒储液通过重新感染HEK 293细胞或CHO细胞扩增并且通过CsCl密度梯度离心纯化。
[0666] 在一个实施方式中，所述免疫调节剂例如TNF-α和/或IL-12基因是野生型基因序列。在另一个实施方式中，所述免疫调节剂例如TNF-α和/或IL-12基因是修饰的基因
序列，例如嵌合序列或修饰成使用优选密码子的序列。
[0667] 在一个实施方式中，所述免疫调节剂例如TNF-α和/或IL-12基因是人野生型序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型人序列至少85%相同，例如与野生型人序列至少90%、95%或99%相同。在另一个实施方式中，所述基因序列编码人类多肽。在另一个实
施方式中，所述基因序列编码与野生型人多肽至少85%的相同的多肽，例如与野生型人多
肽至少90%、95%或99%相同。
[0668] 在一个实施方式中，所述IL-12基因是野生型小鼠IL-12序列。在另一个实施方式中，所述序列与野生型小鼠IL-12至少85%相同，例如与野生型小鼠IL-12至少90%、95%
或99%相同。在另一个实施方式中，所述IL-12基因编码小鼠IL-12多肽。在另一个实施
方式中，所述基因编码与野生型小鼠IL-12至少85%相同的多肽，例如与野生型小鼠IL-12
至少90%、95%或99%相同。
[0669] DC可以从人、小鼠或其他哺乳动物的骨髓中分离。树突细胞可以从人、小鼠或其他哺乳动物的血液中分离。在人患者中，树突细胞群可以通过本领域已知的白细胞透
入(leukophoresis)工艺分离，其中分离和除去白细胞部分并重新灌输其他血液成分到患
者。在一个实施方式中，DC衍生自鼠骨髓，如前所述（Tatsumi等，2003）。简单说，野生型或EGFP Tg小鼠骨髓(BM)在补充有1000单位/ml重组鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因
子和重组mIL-4的条件培养基（CM）(新泽西州洛基山脉的派罗科技公司（Peprotech）)中
37°C于潮湿、5%CO2培养箱中培养7天。然后例如使用特异性MACSTM珠，根据生产商说
明分离CD11c+DC(加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司（MiltenyiBiotec）)。根据形
态和CD11b、CD40、CD80与I型和II型MHC抗原的共表达，以这种方式生成的CD11c+DC是
>95%纯。
[0670] 本发明的一个实施方式提供工程改造的免疫细胞和TSC，所述细胞条件表达有免疫调节剂和可选IL-12功能的蛋白，所述蛋白作为对人或非人生物的基因治疗，适合癌症、肿瘤或两者的治疗应用。在一个实施方式中，本发明提供包含基因开关的经工程改造免疫
细胞和TSC。
[0671] 在另一个实施方式中，本发明提供包含至少一部分蜕皮激素受体的经工程改造免疫细胞和TSC。在另一个实施方式中，本发明提供包含基于蜕皮激素受体的基因开关的经工程改造免疫细胞和TSC。在另一个实施方式中，本发明提供包含RheoSwitch的经工程改造
免疫细胞和TSC。在另一个实施方式中，本发明提供包含经工程改造免疫细胞和TSC的试剂
盒，所述细胞包含基因开关和调节基因开关的配体。在另一个实施方式中，所述试剂盒还包含二酰肼配体。在另一个实施方式中，所述试剂盒还包含RG-115830或RG-115932。
[0672] 在一个实施方式中，本发明提供工程改造的免疫细胞群和TSC群。在一个实施方式中，第7天培养的DC用重组腺病毒处理（所述腺病毒编码组成型或诱导型启动子驱动的
免疫调节剂和/或IL-12）或在一定范围感染复数(MOI)内感染有模拟、对照腺病毒载体
(rAdψ5)。48小时后，收获感染的DC并分析表型和使用特定ELISA试剂盒(加利福尼亚州
圣地亚哥BD法明基公司（BD-PharMingen）)分析免疫调节剂和/或IL-12的生成，更低的
检测水平为62.5pg/ml）。
[0673] 在另一个实施方式中，本发明提供体外工程改造的免疫细胞群和TSC群，所述细胞包含载体例如DNA载体，有能条件表达具免疫调节剂和/或IL-12功能的蛋白的基因开
关且还包含活化配体。在另一个实施方式中，本发明提供通过给予患者工程改造的DC和然
后给予所述患者活化配体（例如RG-115819、RG-115830或RG-115932）来治疗癌症（例如黑素瘤或胶质瘤）的方法。在某些实施方式中，本发明针对治疗癌症（例如黑素瘤或前列腺癌）的方法，所述方法包含给予含有条件表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸的腺病毒和给予活化配体。所述患者可以是有癌症的人或动物。所述治疗方法和产物、工程改造的细胞、试剂盒和配体应用于人类治疗和兽医学动物治疗。因此，考虑所述产物和方法用于人和兽
医学动物的目的。
[0674] 因此，在一个实施方式中，共同给予癌症患者所述表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸和活化配体。通常在数天内给予所述活化配体，例如在给予多核苷酸之前和之后。如果由于免疫调节剂（如TNFα）发展出系统毒性，则能降低或消除给予所述活性配体以减小副作用。
[0675] 在另一个实施方式中，将表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸和活化配体共同给予遭受一种或多种溶酶体贮积病或一种或多种肝病的患者。通常在数天内给予所述活化配体，例如在给予多核苷酸之前和之后。如果发生系统毒性，则能降低或消除给予所述活性配体以减小副作用。
[0676] 在某些实施方式中，本发明提供降低肿瘤大小的方法，所述方法包含给予含有条件表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸的腺病毒载体和给予活化配体。也提供预防肿瘤形成的方法，所述方法包含给予含有条件表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸的腺病毒载体和给予活化配体。在一些实施方式中，本发明提供降低或改善一种或多种肿瘤疾病症
状的方法，所述方法包含给予含有条件表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸的腺病毒载体和给予活化配体。特别地，与组成型表达所述免疫调节剂的载体相比，包含条件表达所述免疫调节剂的载体（例如腺病毒载体）的所述组合物能降低、预防或改善治疗对象中的系统毒性。
[0677] 在某些实施方式中，本发明提供治疗哺乳动物中一种或多种疾病或者一种或多种溶酶体贮积病或者一种或多种肝病的方法，所述方法包含给予含有条件表达一种或多种蛋
白的多核苷酸的腺病毒载体和给予活化配体。在一些实施方式中，本发明提供降低或改善
一种或多种疾病或者一种或多种溶酶体贮积病或者一种或多种肝病的症状的方法，所述方
法包含给予含有条件表达免疫调节剂（如TNFα）的多核苷酸的腺病毒载体和给予活化配
体。
[0678] 基于蛋白的标记降低或消除对用于有效靶定的高特异性翻译后修饰的需要。可用的基于蛋白的标记包括但不限于，IGF2R靶定(IGF2(GILT)/IGF2工程改造)、转铁蛋白受体
靶定(转铁蛋白、TfR靶向肽)和Tat蛋白(其中细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)
调节Tat内化)。
[0679] 靶向溶酶体、能用作标记的其他蛋白包括但不限于维生素D结合蛋白、叶酸结合蛋白、乳酸转铁蛋白、性激素结合球蛋白、转甲状腺素、鞘脂激活蛋白原、视黄醇结合蛋白、Apo脂蛋白B、Apo脂蛋白E、促乳激素、受体相关蛋白(在一个实施方式中，没有HNEL序列)、天然转铁蛋白和突变的转铁蛋白(例如K225E/R651A突变体或K225E/K553A突变体)。
[0680] 在一个实施方式中，所述表达构建物也编码一个或多个受体序列、定位标记序列和检测标记序列。还了解本发明的所述组合物或使用组合物的方法能与任何一种或多种化
疗试剂联合(例如提供组合治疗方案)，消除、降低、抑制或控制体内肿瘤细胞或肿瘤的生
长。本文使用的术语"化疗剂"或"化学疗法"应该指给予以治疗或预防体内肿瘤生长的
任何治疗化合物。特别地，与本发明相容的化疗剂包含用于降低或减缓恶性分子生长的"
传统"化疗剂（如小分子）和近期开发的生物制剂（如抗体、细胞因子、反义分子等）。
[0681] 一方面，本发明提供适于给予人或非人的药物组合物，所述组合物包含体外工程改造的免疫细胞群或TSC群或表达有免疫调节剂（如TNFα）和/或IL-12功能的蛋白的载
体（例如腺病毒载体），其中所述制剂适于通过瘤内给予来施用。在另一个实施方式中，组合物（如药物组合物）包含条件表达免疫调节剂（如TNFα）的载体。在一些实施方式中，所述
5
组合物包含约1x10 或更多颗粒单位（pu）的基因转移载体。“颗粒单位”是单一载体颗粒。
6 7
在某些实施方式中，所述组合物包含约1x10 颗粒单位(例如约1x 10 或更多颗粒单位、约
8 9
1x 10 或更多颗粒单位、或约1x 10 或更多颗粒单位)的基因转移载体。在其他实施方式
10 11 12 13
中，所述组合物包含约1x 10 或更多pu、1x 10 或更多pu、1x 10 或更多pu、1x 10 或
14 15
更多pu、1x 10 或更多pu或1x 10 或更多pu的基因转移载体，特别是病毒载体，例如复
制缺陷型腺病毒载体。所述组合物中基因转移载体的颗粒单位数目能使用任何已知的合适
方法测定，所述方法例如通过比较所述组合物的吸光度和基因转移载体标准溶液的吸光度
(即已知基因转移载体浓度的溶液)，如本文进一步所述。
[0682] 本发明还提供包含活化配体如RG-115819、RG-115830或RG-115932的药物组合物，其中所述组合物适于通过腹膜内、口服或皮下给予来施用。
[0683] 本发明的组合物如包含经工程改造DC、载体（如腺病毒载体）或活化配体的载体，还能包含药学上可接受的运载体（carrier）。所述运载体能是用于经工程改造树突细胞、基因转移载体或活化配体的任何合适运载体。所述组合物的合适运载体描述于美国专利号6,225,289。所述运载体通常是液体，但也能是固体或者是液体和固体成分的组合。所述运载体需要是药学上可接受（如生理学或药理学上可接受）运载体（如赋形剂或稀释液）。熟知药学上可接受运载体并且易于获得。运载体的选择至少部分通过组合物中的特定成分和用
于给予组合物的特定方法来确定。所述组合物还能包含任何其他合适的成分，特别是增强
组合物和/或其末端使用稳定性的成分。因此，有各种合适的本发明组合物制剂。
[0684] 适于口服给予的制剂包含(a)液体溶液，如有效量的溶于稀释液（如水、盐水或橙汁）的活性成分，(b)胶囊、囊袋或片剂，各包含预定量的活性成分，如固体或颗粒，(c)合适液体的悬浮液，和(d)合适的乳液。片剂形式能包含一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和药学上相容的赋形剂。锭剂形式能包含调味料中的活性成分，通常是含有惰性基料中活性成分的蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶以及软锭剂(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)，和在活性成分以外
含有如本领域已知赋形剂的乳剂、凝胶等。
[0685] 例如，包含所述载体、免疫细胞群或TSC群或体外经工程改造细胞的组合物能包含缓冲剂，如TRIS。在一个实施方式中，所述组合物能包含TRIS和/或甘油。在另一个实
施方式中，所述组合物也包含成酸剂、阴离子型或非离子型表面活性剂、相容剂和/或稀释剂。
[0686] 适于通过吸入给予的制剂包含气雾制剂。可将气雾制剂置于可接受的加压推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。其也能制成非加压的制剂以从喷雾器或雾化器中递送。
[0687] 适于胃肠道外给予的制剂包含水性和非水性、等渗无菌注射溶液，能包含使该制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，以及含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。可以用单位剂量或多剂量密封容器
例如安瓿和药瓶提供该制剂，也可通过冷冻干燥（冻干）条件保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体赋形剂如注射用水即可使用。临时注射溶液和混悬液可以由前述无菌粉末、颗
粒和片剂进行制备。
[0688] 适于肛门给予的制剂能通过混合活性成分与各种基料如乳化基料或水溶性基料来制成栓剂。适于阴道给药的制剂可制成阴道栓剂、棉塞剂，乳膏剂、凝胶剂、贴剂、泡沫剂或喷雾制剂，除了所述活性成分以外还包含所述本领域已知的合适运载体。
[0689] 另外，所述组合物能包含其他治疗或生物活性试剂。例如，能出现用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子（如布洛芬或类固醇）能是组合物的一部分以降低与体内给予基因转移载体和生理压力有关的溶胀和炎症。免疫系统抑制剂能与所述组合物方法一起给予以降低对所述基因转移载体本身或与疾病相关的任何免疫反应。或者，所述组合物
中能包含免疫增强剂以上调身体针对疾病的天然防御。另外，细胞因子能与所述组合物一
起给予以吸引免疫效应细胞到肿瘤位点。
[0690] 在本文公开的特定实施方式中，本发明提供治疗肿瘤的方法，包含以下顺序的步骤：
[0691] a.哺乳动物中瘤内给予体外工程改造的免疫细胞群或TSC群；和
[0692] b.向所述哺乳动物给予治疗有效剂量的活化配体；
[0693] 在一个实施方式中，基本在相同时间给予所述活化配体和所述组合物（所述组合物包含体外工程改造的免疫细胞或TSC或载体如腺病毒载体），例如给予所述细胞或载体组合物之前或之后1小时内。在另一个实施方式中，在给予体外工程改造的免疫细胞或TSC
或载体后24小时或小于24小时内给予所述活化配体。在另一个实施方式中，在给予体外
工程改造的免疫细胞或TSC或载体后48小时或小于48小时内给予所述活化配体。在另一
实施方式中，所述配体是RG-115932。在另一个实施方式中，以约1-50mg/kg/天的剂量给予所述配体。在另一个实施方式中，以约30mg/kg/天的剂量给予所述配体。在另一个实施方
式中，以7–28天阶段每天给予所述配体。在另一个实施方式中，以14天阶段每天给予所
6 8
述配体。在另一个实施方式中，给予约1x 10-1x 10 细胞。在另一个实施方式中，给予约
7
1x 10 细胞。
[0694] 在一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达IL-2和IL-12。IL-2对效应和调节T、NK和NK-T细胞施加潜在的免疫调节效果。预期细胞中表达IL-2和IL-12
会造成各受体之间的交互上调和通过单独信号通路互补的生物效果来诱导差异。也
预期IL-2和IL-12的组合会加强免疫刺激的持续时间和使动物可以更加耐受的细
胞有效剂量降低。见Dietrich 2002、Wigginton 2002、2001、1996和Koyama,1997、
McDermott 和 Atkins 2008；Berntsen 等，2008；Tarhini 等，2008；Heemskerk 等，2008；
Horton等2008。IL-2的多核苷酸序列可用，登录号U25676(人);NM_008366(小
鼠);NM_204153(鸡);和NM_053836(大鼠)。IL-12的多核苷酸序列可用，登录号
NM_000882(人 IL12A);NM_002187( 人IL12B);NM_008351( 小 鼠 IL12a);NM_008352(小
鼠IL12b);NM_213588( 鸡 IL12A);NM_213571( 鸡IL12B);NM_053390( 大 鼠 IL12a);和
NM_022611(大鼠IL12b)。SEQ ID NO：13、15、21和23编码人和小鼠IL-12和其亚基。
[0695] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达IL-18和IL-12。IL-18诱导IFN-γ的生成和促进T辅助细胞发育和NK活化。另外，IL-18能增加GM-CSF生成和降低
IL-10生成。期望表达IL-18和IL-12会克服仅给予任一种细胞因子时观察到的局限。期
望在树突细胞中表达IL-18和IL-12会比树突细胞仅用任一种细胞因子转导时，刺激更强
烈的肿瘤抗原特异性Th1反应。
[0696] 瘤内注射工程改造成分泌IL-12和IL-18的DC可调节最高水平的INF-γ生成和完整肿瘤注射(Tatsumi 2003)。见Vujanovic,2006。也见Coughlin,1998、Subleski,206、Tatsumi,2003 和 Sabel,2007;Shiratori 等，2007;Lian 等 2007;Iinuma 等 2006IL-12
多核苷酸序列见上。IL-18的多核苷酸序列可用，登录号U90434(人);NM_008360(小
鼠);EU747333(小);和AY258448(大鼠)。
[0697] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达IL-15和IL-12。IL-15与IL-2共有一些生物活性，也使其潜在可用于对癌症的治疗。IL-15刺激NK细胞和活化T细
胞的增殖并支持效应T细胞的扩增。已报道IL-15的出现与IL-12协同以增强NK细胞生
成INF-γ。Koka,2004;Basak 2008;Lasek等2004。瘤内递送IL-15和IL-12在黑素瘤模
型中诱导显著的肿瘤抑制(Lasek 1999)。IL-12多核苷酸序列见上。SEQ ID NO：11和19
编码人和小鼠IL-15。图2和4是可以用于人和小鼠IL-12和IL-15的表达系统的质粒图。
[0698] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达IL-21和IL-12。IL-21和其受体与IL-2和IL-15共有序列同源性。IL-21促进NK细胞的扩增和成熟。IL-21的
生物效果与IL-12潜在协同，因为用IL-21治疗NK细胞引起IL-12受体显著上调。另外，
IL-21能增加IL-12信号转导和合作提高IFN-γ生成。IL-12多核苷酸序列见上。IL-21
的多核苷酸序列可用，登录号AF254069(人);NM_021782(小鼠);NM_001024835(鸡);和
NM_001108943(大鼠)。SEQ IDNO：6、7、8、9和17编码人和小鼠IL-21。SEQ ID NO：1和2
是编码小鼠和人IL-12和IL-21的多核苷酸构建物。图7和8是可用于分别表达人和小鼠
IL-12和IL-21的表达系统的质粒图。
[0699] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达TNFα和IL-12。TNFα是免疫细胞的潜在激活剂并调节抗肿瘤特性。另外，TNFα能与IL-12协同以增加T
细胞上IFNγ和IL-12受体的表达。在动物研究中，IL-12和TNFα的应用产生通过
DN8+T细胞的肿瘤浸润、显著的IFNγ生成和随后的肿瘤抑制。见Sabel,2003、2004、
2007,Taniguchi,1998,Lasek,2000;和Xia等2008。IL-12多核苷酸序列见上。编码TNFα
的多核苷酸序列可用，登录号X02910(人);NM_013693(小鼠);和BC107671(大鼠)。
[0700] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达IL-7和IL-12。IL-7是IL-2家族的成员，并且对T细胞和B细胞淋巴细胞增殖重要(lympophoeisis)。IL-7调节天然
和记忆CD8+T细胞的存活和增殖的内稳态。证明IL-7增强针对肿瘤的CTL生成。另外，
IL-12定向作用于CD8+T细胞以增强IL-7调节的增殖。再者，已报道IL-7和IL-12协同增
强CD8+T细胞细胞毒性。Mehrotra,1995;Sharma等2003;Tirapu等2002。因此，期望共同
表达IL-7和IL-12会提供更多最优的抗肿瘤反应。编码IL-12的多核苷酸序列见上。编码
IL-7的多核苷酸序列可用，登录号J04156(人);NM_008371(小鼠);NM_001037833(鸡);
和NM_013110(大鼠)。
[0701] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达GM-CSF和IL-12。GM-CSF调节造血祖细胞的分化和增殖，并且在专门抗原呈递细胞(APC)如树突细胞的成熟中起特别
重要的作用。GM-CSF也增加树突细胞加工和呈递抗原的能力。GM-CSF功能不同于IL-12，
并且两者在动物研究中都引起显著的抗肿瘤反应。期望IL-12(T细胞活化)和GM-CSF(树
突细胞活化)的联合产生更多潜在抗肿瘤免疫。在动物研究中，GM-CSF和IL-12治疗的
联合在多个癌症模型功能中显著抑制肿瘤生长。Wang,2001;Chang,2007;Jean,2004;N
air,2006;Hill 2002;Small等2007。人试验中，GM-CSF+IL-12成功用于治疗骨髓瘤患
者，其中两个细胞因子的组合作用造成循环B细胞降低。Rasmussen,2003;Hansson,200
7;Abdalla,2007。预期单个细胞中共同表达GM-CSF和IL-12会避免不需要的系统影响，
如循环B细胞的降低。编码IL-12多核苷酸序列见上。GM-CSF的多核苷酸序列可用，登
录号M11734(人);NM_009969(小鼠);EU520303(鸡);NM_001037660(大鼠Csf2ra);和
NM_133555(大鼠Csf2rb)。
[0702] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达趋化因子(例如CCL3(MIP-1a)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP3)、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、CCL19(MIP-3b)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10)、CXCL12(SDF-1)或CCL21(6Ckine))和IL-12趋化因子是化学
诱导细胞因子，在各种炎性和非炎性条件下调节白细胞和其他细胞类型的运输和活化。炎
性细胞因子控制炎症和细胞损伤中白细胞的募集。内稳态趋化因子实现看家功能，例如引
导白细胞(如树突细胞)到次级淋巴器官和其内部，以及在血细胞生成期间到骨髓和胸腺
中。动物研究中，瘤内共注射表达IL-12和CXCL10的两个单独腺病毒使得衍生自CT26鼠结
直肠腺癌细胞系的肿瘤结节100%消退。Narvaiza等,2000。Emtage等,1999描述了表达
IL2和XCL1(淋巴细胞趋化因子)或者IL-12和XCL1的两个双重组腺病毒载体。小鼠中乳
腺腺癌肿瘤的瘤内注射载体引起潜在的抗肿瘤反应和产生保护免疫。其他动物研究中，表
达IL-12和CCL27的腺病毒载体的共转导造成肿瘤消退和长期特异性免疫。Gao等,2007。
因此，预期本发明所述共表达趋化因子和IL-12会产生协同抗肿瘤活性。
[0703] 在另一个实施方式中，工程改造树突细胞以条件表达抗血管生成细胞因子（例如IP-10和Mig）和IL-12。IP-10和Mig是T细胞和NK细胞的化学引诱物，并且其抑制血管
生成的能力依赖于NK细胞。动物研究显示两种腺病毒的组合治疗（一种表达IP10和另一种
表达IL-12）产生显著的抗肿瘤协同作用。Narvaiza等,2000。其他研究中，在鼠乳腺腺癌
和纤维肉瘤模型中瘤内给予表达IP10或MIG和/或IL-12的腺病毒载体。发现与仅IP10、
MIG、IL-12或对照治疗动物相比，与IL-12联合给予IP-10或MIG产生相当大的肿瘤消退且
荷瘤动物生存时间增加，IP-10、IL12的组合最有效。Palmer,2001。也见Mazzolini,2003;
和Huang 2004。因此，预期共表达抗血管生成细胞因子和IL-12会产生协同抗肿瘤活性。
[0704] 为显示有效的IL-12介导基因治疗，使用条件cDNA表达系统，所述系统在瘤内注射后的多个时间点通过免疫细胞或TSC开始生成免疫调节剂和/或IL-12。根据C57BL/6
小鼠中侵袭性B16黑素瘤模型的结果，得出下列结论：1)在出现活化配体RG-115830但不
是没有配体时，DC.RheoIL12分泌的IL-12水平增加;2)瘤内基于DC.RheoIL12的治疗与
瘤内基于DC.cIL12的治疗同样有效，只要DC注射24小时内给予治疗动物RG-115830(和
在配体供应的晚期时间点，RG-115830治疗失败);3)DC中IL-12的表达似乎延长肿瘤微环
境中这些细胞的存活，并且与瘤内注射的迁移到肿瘤引流淋巴结的DC数目更多相关;和4)
与治疗结果相关的最强免疫是通过治疗交叉激活的肿瘤特异性CD8+T细胞的水平，而不是
维持在肿瘤微环境中注射的DC的数目。总之，这些数据提示根据其对1型CD8+T细胞效应
器的输入(交叉激活)的正影响和对晚期输出事件（例如注射的DC介导的抗肿瘤T细胞募
集到肿瘤微环境等）没有正影响，基于DC.IL12的治疗很可能成功。
[0705] 瘤内注射前，所述细胞（免疫细胞或TSC）可以用因子处理以刺激细胞活性。例如，所述细胞可以用共刺激分子处理，所述分子例如正共刺激分子，包含OX40L、4-1BBL、CD40、CD40L、GITRL、CD70、LIGHT或ICOS-L或者负共刺激分子例如抗CTLA4、抗PD-L1或抗PD-L2抗体。例如，所述细胞(例如免疫细胞或TSC)可以与表达一种或多种共刺激分子的细胞（例如表达CD40配体分子的J588淋巴瘤细胞）一起孵育。在另一个实施方式中，所述细胞(免
疫细胞或TSC)可以用逆向免疫抑制剂分子(耐受性抑制剂)处理，所述分子例如抗TGFβ
抗体(微环境中抑制TGF信号转导)、抗IL10抗体、TGFbRIIDN(在基因修饰的细胞内抑制
TGF信号转导)、IL-10R DN、dnFADD(在细胞中抑制细胞死亡通路)、抗SOCS1抗体、siRNA
或诱饵（decoy）(在细胞中阻遏抑制性细胞因子信号转导)或抗TGFa抗体。
[0706] 生成载有图1-8所示多核苷酸序列的重组腺病毒。例如，在允许的细胞系如HEK293细胞中，hIL-21通过hIL-21表达载体和合适(删除示例E3)腺病毒主链的共转染
生成，通过左侧ITR上游位点的限制性消化来线性化。有鼠免疫调节剂基因的腺病毒载体
用于转导鼠树突细胞或TSC，以用于鼠治疗模型。人治疗应用中，将编码免疫调节剂基因的人同源物的多核苷酸插入合适的载体。人治疗应用的腺病毒载体在GMP条件下生成。III/
IV期黑素瘤或者的治疗概要（临床试验）的示例如下：此示例中的治疗涉及瘤内注射腺病毒转导树突细胞和每天口服给予激活剂药物(配体)持续14天。在临床试验前30天-一周
筛选对象。开始任何过程前，要求每个对象签署知情同意书。研究员会通知所有对象试验
中要进行的性质、目标、持续时间、潜在风险和过程，和FDA审查其医疗记录的可能性。对象
7
(总共16-20)随机分成4组。第一剂量口服给予配体后约3小时，所有组接受多至5x10
的转导树突细胞的瘤内注射。4组每天接受的配体口服剂量不同：示例组1＝0.01mg/kg;
组2=0.3mg/kg;组3=1mg/kg;组4=3mg/kg。治疗过程中，在特定时间间隔取血以评价激活
剂药物和其主要代谢物的单个剂量和稳定状态的药物动力学。同样，在特定时间间隔取血
以评价针对病毒载体、RTS组分和肿瘤的体液和细胞免疫反应。在特定时间收集尿液和取
血以用于血清化学、尿分析和血液学(安全性概况)。在特定时间提取肿瘤和/或引流淋巴
结活检以评估作为治疗结果的转基因表达和对肿瘤的免疫反应。对患者建立不良事件情况
下早期终止的标准，和记录所述不良事件。对于不良事件和治疗结果，跟踪患者多至1、2、3和4个月。在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象是(a)给予工程改造以组成型或条
件表达免疫调节剂（如本文公开的免疫调节剂）的树突细胞，和/或(b)向对象瘤内注射组
成型或条件表达免疫调节剂（如本文公开的免疫调节剂）的载体。在一个实施方式中，工程改造所述树突细胞以表达Ad-免疫调节剂载体，且特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。在另
一个实施方式中，瘤内注射到对象的载体是Ad-免疫调节剂载体，且特别是Ad-RTS-免疫调
节剂载体。
[0707] 在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予工程改造以组成型或条件表达IL-12的树突细胞，和(b)向对象瘤内注射组成型或条件表达IL-12的载体。在一个实施
方式中，工程改造所述树突细胞以表达Ad-IL-12载体，且特别是Ad-RTS-IL-12载体。在另
一个实施方式中，瘤内注射到对象的载体是Ad-IL-12载体，且特别是Ad-RTS-IL-12载体。
[0708] 在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象是(a)给予工程改造以组成型或条件表达IL-12的树突细胞，和(b)给予患者一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，所述
经改造的树突细胞工程改造成表达Ad-IL-12载体，且特别是Ad-RTS-IL-12载体。能在给予
工程改造的树突细胞前、给予工程改造的树突细胞后、或与给予工程改造的树突细胞同时，给予一种或多种抗癌化疗剂。在另一个实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、舒尼替尼、舒尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
[0709] 在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象(a)给予工程改造以组成型或条件表达IL-12的树突细胞，(b)向对象瘤内注射组成型或条件表达IL-12的载体，和(c)给予
对象一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，工程改造所述树突细胞以表达Ad-IL-12
载体，且特别是Ad-RTS-IL-12载体。在另一个实施方式中，瘤内注射到对象的载体是
Ad-IL-12载体，且特别是Ad-RTS-IL-12载体。能在给予工程改造的树突细胞和表达IL-12
的载体前、给予工程改造的树突细胞和表达IL-12的载体后、或与给予工程改造的树突细
胞和表达IL-12的载体同时，给予一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、舒尼替尼、舒尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
[0710] 在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象是(a)给予工程改造以组成型或条件表达免疫调节剂（如本文公开的免疫调节剂）的树突细胞，和(b)给予对象一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，所述经改造的树突细胞工程改造成表达Ad-免疫调节剂载体，且特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。能在给予工程改造的树突细胞前、给予工程改造的树
突细胞后、或与给予工程改造的树突细胞同时，给予一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、舒尼替尼、舒尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
[0711] 在另一个实施方式中，需要治疗肿瘤的对象是(a)给予工程改造以组成型或条件表达免疫调节剂（如本文公开的免疫调节剂）的树突细胞，(b)向对象瘤内注射组成型或条件表达免疫调节剂（如本文公开的免疫调节剂）的载体，和(c)给予对象一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式中，工程改造所述树突细胞以表达Ad-免疫调节剂载体，且特别是
Ad-RTS-免疫调节剂载体。在另一个实施方式中，瘤内注射到对象的载体是Ad-免疫调节
剂载体，且特别是Ad-RTS-免疫调节剂载体。能在给予工程改造的树突细胞和表达免疫调
节剂的载体前、给予工程改造的树突细胞和表达免疫调节剂的载体后、或与给予工程改造
的树突细胞和表达免疫调节剂的载体同时，给予一种或多种抗癌化疗剂。在一个实施方式
中，抗癌化疗剂是紫杉醇、紫杉醇衍生物或类似物、替莫唑胺、替莫唑胺衍生物或类似物、舒尼替尼、舒尼替尼衍生物或类似物、吉西他滨或吉西他滨衍生物或类似物。
[0712] 本发明的任何方法中，所述疾病或紊乱可以是本申请公开的疾病或紊乱。在一个实施方式中，所述疾病或紊乱是本文表1列举的疾病或紊乱。在另一个实施方式中，所述疾病或紊乱是本文表3列举的疾病或紊乱。
[0713] 本发明的任何方法中，所述癌症或肿瘤可以是本申请公开的疾病或紊乱。在一个实施方式中，所述癌症或肿瘤是本文表1列举的癌症或肿瘤。在另一个实施方式中，所述癌症或肿瘤是本文表3列举的癌症或肿瘤。
[0714] 能通过测量患者生物样品中Th1/Tc1型细胞因子、IFN-γ的表达或活性水平来测量免疫调节剂和/或IL-12表达对细胞群的影响。
[0715] 就本发明的目的而言，本发明提供测定癌症患者中体外工程改造的基于免疫或TSC治疗方案功效的方法，包含：
[0716] a在给予体外工程改造的细胞（如免疫细胞或TSC）前，测量人患者所得第一生物样品中干扰素γ（IFNγ）的表达水平或活性水平或两者，从而生成对照水平；
[0717] b.瘤内给予所述患者体外工程改造的细胞；
[0718] c.给予所述患者有效量的活化配体；
[0719] d.在给予所述活化配体后的某一时间，测量所述患者所得第二生物样品中干扰素γ的表达水平或活性水平或两者，从而生成测试水平的数据；和
[0720] e.比较IFNγ的所述对照水平和测试水平，其中数据显示测试水平的IFNγ表达水平、活性或两者相对于对照水平的增加指示所述治疗处理方案对所述患者有效。本发明
也可选包含其他步骤
[0721] f.进行生物活检和计数肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和/或
[0722] g.观察响应治疗的肿瘤消退。
[0723] 术语“对象”指完整的昆虫、植物或动物。也预期当所述对象是真菌或酵母时，所述配体同样作用良好。本发明使用的动物包括但不限于脊椎动物如哺乳动物如人、啮齿动物、猴和其他动物，更优选人或小鼠。其他动物包含兽医学动物，如狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、猪等。
[0724] 本发明还提供增加表达免疫调节剂（如TNFα）表达的方法，所述方法通过将一种或多种调节序列和可选编码信号肽的核酸引入到载体如复制缺陷型腺病毒载体，其中所述载体条件表达所述免疫调节剂。本文使用的术语“蛋白表达”包括但不限于转录、转录后、翻译和/或翻译后。本发明也包含增加免疫调节剂如TNFα的mRNA或蛋白表达的方法，所述
方法包含生成条件表达TNF-α的载体，其中所述载体还包含连接到编码所述TNFα的多核
苷酸序列的一种或多种调节序列，和加入活化配体，从而诱导所述免疫调节剂的表达，其中所述一种或多种调节序列和/或信号肽提高所述TNFα的表达。本发明的各种调节区包括
但不限于已经描述的5’非翻译区(5’UTR)、3’UTR或两者。在一个实施方式中，所述5'UTR是5U2。5U2是融合的犬SERCA2内含子2，有突变的推测共有序列聚A位点，有5’末端侧接
的外显子2剪接供体和3’末端侧接的外显子3剪接受体，随后是牛酪蛋白5’UTR部分的一
部分。在另一个实施方式中，所述3'调节区是SV40或hGH的聚腺苷酸化信号。
[0725] 在某些实施方式中，本发明的方法也针对通过生成条件表达TNF-α的载体来提高TNF-α分泌，其中所述载体还包含信号肽，从而相对于包含TNF-α天然信号肽基因（如
TNF-α野生型信号肽）的载体，增加TNF-α的分泌。本发明所用的信号肽特定是密码子优
化的。在特定实施方式中，信号肽由IL-2野生型信号肽基因编码。在另一个特定实施方式
中，信号肽由密码子优化的IL-2信号肽基因编码。
[0726] 不希望受理论限制，期望本发明支持在临床设置中使用瘤内给予体外工程改造的基于免疫和TSC的基因治疗，集中于作为初级研究终点的对象临床反应和作为次级研究终
点的交叉激活的抗肿瘤CD8+T细胞(产生IFNγ)。体内开启和关闭所述免疫调节剂和/或
IL-12表达的能力增加了治疗的安全元件和治疗控制，因为蛋白表达的时间和水平可以受
配体给予的控制，并且还期望免疫调节剂和/或IL-12的表达时间对所述方法的治疗功效
重要。
[0727] 本发明还支持条件表达感兴趣基因的体外工程改造细胞的治疗应用，作为有效和高效治疗人类疾病的创新方案。
[0728] 本发明也提供在有此需要的哺乳动物中治疗肿瘤、减小肿瘤大小或预防肿瘤形成的方法，其中将条件表达一种或多种细胞内不含有的免疫调节剂功能的蛋白的载体瘤内给
予到肿瘤微环境。在这个实施方式中，将所述载体给予肿瘤，而不在细胞如免疫细胞或TSC中封装。本发明也提供在有此需要的哺乳动物中治疗疾病的方法，其中将条件表达有一种
或多种细胞内不含有的免疫调节剂功能的蛋白的载体给予所述哺乳动物。在这个实施方式
中，将所述载体给予肿瘤，而不在细胞如免疫细胞或TSC中封装。
[0729] 在一个实施方式中，免疫细胞、TSC、树突细胞或骨髓树突细胞没有用载体瘤内给予。
[0730] 在另一个实施方式中，在瘤内给予免疫细胞、TSC、树突细胞或骨髓树突细胞的同时、之前或之后，瘤内给予细胞内不包含的本发明载体。
[0731] 在一个实施方式中，在给予所述免疫细胞或TSC的相同伤口瘤内给予细胞内不包含的本发明载体。在另一个实施方式中，在给予所述免疫细胞或TSC的不同伤口处瘤内给
予细胞内不包含的本发明载体。
[0732] 在一个实施方式中，给予所述载体到各给药周期的相同伤口处。在另一个实施方式中，给予的所述载体没有给予到各给药周期的相同伤口处。
[0733] 在一个实施方式中，所述肿瘤是本文如表1和3中列举的任何癌症的肿瘤。在另一个实施方式中，所述肿瘤是黑素瘤、结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤或肾肿瘤。在另一个实施方式中，所述肿瘤是恶性黑素瘤。在另一个实施方式中，所述肿瘤是III C或IV期的恶性黑素瘤。
[0734] 在一个实施方式中，瘤内剂量是每个载体给予周期至少约1.0x 109病毒颗粒。在10
另一个实施方式中，瘤内剂量是每个载体给予周期至少约1.0x 10 病毒颗粒。在另一个实
9 13
施方式中，瘤内剂量是每个载体给予周期约1.0x 10-1.0x 10 病毒颗粒。在另一个实施
10 13
方式中，瘤内剂量是每个载体给予周期约1.0x10 -1.0x 10 病毒颗粒。在另一个实施方式
10 11 12 13
中，瘤内剂量是每个载体给予周期约1.0x 10 、约1.0x 10 、约1.0x 10 或约1.0x 10 病
毒颗粒。在一个实施方式中，所述载体是AD-RTS-IL-12。
[0735] 在另一个实施方式中，本发明还提供治疗有此需要的哺乳动物中肝病的方法，其中向所述哺乳动物给予条件表达细胞中不含有的蛋白的载体。
[0736] 在另一个实施方式中，本发明还提供治疗有此需要的哺乳动物中溶酶体贮积病的方法，其中向所述哺乳动物给予条件表达细胞中不含有的蛋白的载体。
[0737] 在另一个实施方式中，本发明还提供治疗有此需要的非人哺乳动物中疾病的方法，其中向所述哺乳动物给予条件表达细胞中不含有的蛋白的载体。
[0738] 活化配体剂量是约5-100mg/天，如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/天。在一个实施方式中，所述活化配体一天最少给予一次。在另一个实施方式中，每天给予所述活化配体一次，持续约14天。
[0739] 在一个实施方式中，至少两个剂量的所述载体(例如约1x1011和1x1012)与至少三个不同剂量水平的活化配体联用(例如约5mg/天-约100mg/天)。
[0740] 本领域的普通技术之一能优化剂量以对不同程度的活化配体激活提供一定范围的有效载体血浆水平。
[0741] 在一个实施方式中，给予所述对象的活化配体剂量随着瘤内载体给予周期内的活化配体给予阶段而改变。在另一个实施方式中，给予所述对象的活化配体剂量随着瘤内载
体给予周期内活化配体给予阶段而降低。在另一个实施方式中，给予所述对象的活化配体
剂量随着瘤内载体给予周期内活化配体给予阶段而增加（逐步升高）。
[0742] 在一个实施方式中，用2、3、4、5、6、7、8、9或10个瘤内载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用3-7个瘤内载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用4-6个瘤内载体给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用5或6个瘤内载体
给予周期治疗所述对象。在另一个实施方式中，用6个瘤内载体给予周期治疗所述对象。
[0743] 在一个实施方式中，每个瘤内载体给予周期间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周完成。在另一个实施方式中，每个瘤内载体给予周期间隔4周完成。
[0744] 在一个实施方式中，在每个后续瘤内载体给予周期中改变载体的剂量。在另一个实施方式中，在每个后续瘤内载体给予周期中降低载体的剂量。在另一个实施方式中，在每个后续瘤内载体给予周期中增加载体的剂量。
[0745] 在一个实施方式中，载体和活化配体的剂量、瘤内载体给予周期的数目和长度、载体给予的频率和活化配体给予的频率示于本文实施例11的表8。
[0746] 在一个实施方式中，本发明也提供药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的运载体和细胞不含有的本发明载体。合适的运载体包括但不限于，盐水，蒸馏水，氯化钠溶液，氯化钠和无机盐的混合物或其相似混合物，材料的溶液如甘露醇、乳糖、葡聚糖和葡萄糖，氨基酸溶液如甘氨酸和精氨酸，有机酸溶液或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物，含有抗氧化剂、螯合剂、缓冲液、抑菌剂和溶质以使该制剂等渗的水性和非水性、等渗无菌注射溶液，和含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。可以用单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和药瓶提供该制剂，也可通过冷冻干燥（冻干）条件保存该制剂，临用前只需要加入无菌液体运载体如注射用水。
[0747] 在本文所引用任何参考文献的任何内容或建议与本说明书之间发生抵触的情况中，应以后者为准以用于本发明目的。
[0748] 本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过充分引用全文纳入。
[0749] 应理解上面描述的实施方式和实施例并不意在限定本发明范围的任何方面，并且本文所述权利要求旨在包含所有实施方式和实施例，不论本文是否明确讲述。
[0750] 2008 年 10 月 8 日 提 交 的 题 为 "Engineered Dendritic Cells AndUses ForTreatment Of Cancer（工程改造的树突细胞和用于肿瘤治疗）"的美
国申请号12/247,738通过引用全文纳入本文。2008年9月29日提交的题为
"TherapeuticGene-Switch Constructs And Bioreactors For The Expression Of
BiotherapeuticMolecules,And Uses Thereof（生物治疗分子表达的治疗基因开关构建物
和生物反应器，和其应用）"的美国申请号12/241,018也通过引用全文纳入本文。
[0751] 实施例1
[0752] 进行研究以测定树突细胞的剂量和在Renca肾细胞癌肿瘤模型中能诱导肿瘤特异性免疫反应和抗肿瘤活性的最有效的细胞因子。
[0753] 本研究使用两个肿瘤细胞系:Renca和Renca-HA。后一种细胞系是用流感病毒血细胞凝集素(HA)转染Renca细胞生成。Renca-HA模型的优势是能追踪抗原特异性T细胞，
因为已知并且使用两个CD8和CD4特异性HA衍生表位。
[0754] 具体目的-在瘤内给予树突细胞后，测定HA特异性免疫反应的诱导。
[0755] Renca-HA肿瘤在BALB/c小鼠中皮下确立。当所述肿瘤变成可触摸时，瘤内注射树突细胞。以7天间隔重复两次给予树突细胞，总共3次给予。
[0756] 使用下列小鼠组（每组包含3只小鼠）：
[0757] 1.未处理小鼠；
[0758] 2.用转导有对照质粒的5x105树突细胞处理的小鼠；
[0759] 3.用转导有对照质粒的106树突细胞处理的小鼠；
[0760] 4.用转导有对照质粒的5x106树突细胞处理的小鼠；
[0761] 5.与2-4组相同，使用IL-12转导的树突细胞；
[0762] 6.与2-4组相同，使用IL-15转导的树突细胞；和
[0763] 7.与2-4组相同，使用IL-21转导的树突细胞。
[0764] 为检测不同细胞因子组合的效果，小鼠同时用以下处理：
[0765] 8.用IL-12转导的5x105树突细胞，和用IL-15转导的5x105树突细胞，
[0766] 9.用IL-12转导的5x105树突细胞，和用IL-21转导的5x105树突细胞，和
[0767] 10.用IL-15转导的5x105树突细胞，和用IL-21转导的5x105树突细胞。
[0768] 最后给予后4天，收集荷瘤小鼠的淋巴结，并且用MHC I型匹配的肽(检测CD8+T细胞反应)或MHC II型匹配的肽(检测CD4+T细胞反应)刺激细胞。
[0769] 使用以下试验：
[0770] 1.ELISPOT IFN-γ和IL-2;
[0771] 2.T细胞增殖；
[0772] 3.淋巴结细胞中TNFα、IL-10、IL-4和GM-CSF释放的检测。
[0773] 另外，淋巴结细胞的NK活性使用YAC细胞作为靶标评价。
[0774] 平行地，用抗CD3/CD28抗体刺激细胞以评价T细胞的非特异性反应。
[0775] 测定能诱导抗原特异性免疫反应的最有效树突细胞剂量。
[0776] 具体目的2–评价转导有细胞因子基因的树突细胞的抗肿瘤活性。
[0777] 只有显示统计学上显著免疫反应诱导的那些细胞因子转导的树突细胞用于进一步的实验。
[0778] 如具体目标1所述治疗Renca-HA荷瘤小鼠。使用在前面实验中显示特异活性的细胞因子转导DC的一个剂量。作为对照，使用转导有对照腺病毒的树突细胞。为获得统计
学显著性，每个小组包含10只小鼠。
[0779] 评价肿瘤生长。Renca-HA肿瘤包含用于免疫监控和起始测试抗肿瘤效果的免疫原性表位。然而，为确定治疗的潜在抗肿瘤活性，需要使用未转染肿瘤细胞。因此，使用Renca肿瘤模型重复上述实验。
[0780] 实施例2
[0781] 在有III和IV期黑素瘤的对象中，工程改造成表达RTS控制下hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂的腺病毒转导自体树突细胞的瘤内注射的安全性、耐受性、转基因功
能和免疫效果通过如下述过程评价。
[0782] 涉及研究有III和IV期黑素瘤的对象的研究分成4个对象组(群)，每个对象接受单个瘤内注射(进入黑素瘤)腺病毒转导的自体(重新插入到其来源的相同对象)树
突细胞(DC)，所述细胞工程改造成表达人白介素-12(hIL-12)和一种或多种其他免疫调节
7
剂，采用5x 10 剂量和日口服剂量激活剂药物(活化配体)的组合。研究使用注射离体转
导有腺病毒载体以诱导表达人IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的树突细胞(细胞从对
象中移除后)。通过口服给予激活剂药物(RG-115932)从注射的DC中经RTS激活“启动”
（诱导）生成IL-12和一种或多种其他免疫调节剂。通过物理检查(包含ECOG体能状态)、
生命体征测量、血清化学、尿分析、血液学、不良事件“副作用”和对腺病毒、RTS成分和激活剂药物的抗体和细胞免疫反应来评估安全性和耐受性。为评价进展，测量口服激活剂药物
和其主要代谢物的单剂量和稳态药物动力学/ADME、hIL-12水平分析、其他免疫调节剂水
平和靶标肿瘤、引流淋巴结和外周循环的生物活检的细胞免疫反应(T细胞)，以及血清细
胞因子概况。
[0783] 例如，有III和IV期黑素瘤的16个对象分成4个组，组1和2包含三个对象，组7
3和4包含5个对象。所有对象接受单个瘤内注射5x10 自体DC，所述DC转导有编码RTS
控制下人IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的腺病毒载体。例如，给予对象自体DC瘤内
注射，所述DC转导有编码RTS控制下人IL-12和免疫调节剂如IL-15或IL-21的腺病毒载
体。
[0784] 对象接受激活剂药物的单个每天口服剂量(组1:0.01mg/kg,组2:0.1mg/kg,组3:1.0mg/kg或组4:3mg/kg)，在第1天DC注射前约3小时开始第一剂量并且持续多余13
天的更多连续天数。腺病毒转导自体树突细胞与14个单一（一次）每天口服剂量激活剂药
物组合的额外注射可给予符合重新治疗标准的合适对象。招募对象接受所述激活剂药物的
下一个最高剂量前，在注射体外工程改造的树突细胞后多至1个月，评价组1每群中所有对
象的安全性、耐受性和树突细胞功能。所述安全性评价会在所有对象中持续到开始注射工
程改造树突细胞后的3个月，如果观察到毒性或所述对象接受额外树突细胞注射，有可能
延伸后续阶段到总共6个月以监控对象安全性。
[0785] 这个研究显示在有黑素瘤对象中，腺病毒转导自体树突细胞的单个或多个瘤内注射与口服激活剂药物联合的安全性和耐受性。研究提供口服激活剂药物的稳态药物动力学
/ADME。研究通过测量在靶标肿瘤和/或引流淋巴结中响应口服给予激活剂药物的RTS活
化，腺病毒转导自体树突细胞的hIL-12表达和一种或多种其他免疫调节剂表达，显示了对
象中RTS的功能性。另外，研究显示在口服给予激活剂药物后，腺病毒转导自体树突细胞在靶标肿瘤、引流淋巴结和外周循环中的细胞免疫反应方面的免疫效果。
[0786] 选择黑素瘤作为示例性癌症，特别是在黑素瘤方面。特定实体瘤中的黑素瘤已经显示响应免疫治疗方案，并且黑素瘤易于肿瘤内注射和活检。包含在研究中的对象有不可
切除的III或IV期黑素瘤，其有最小0.5cm直径、任何肿瘤厚度、任何参与的淋巴结数目、
在途转移或远距离转移。
[0787] 有RheoSwitch治疗系统、hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂的腺病毒的制备
[0788] 通过离体腺病毒载体转导向树突细胞转移重组DNA。重组DNA用于从瘤内注射的不成熟树突细胞中表达人IL-12(p70)和一种或多种其他免疫调节剂，这使得肿瘤环境中
DC存活并刺激成熟，造成其随后迁移到引流淋巴结。这产生对T辅助细胞分化成Th1型的
偏好，也通过肿瘤抗原的交叉激活来活化肿瘤特异性细胞毒性T细胞。
[0789] 用作重组腺病毒载体的重组DNA允许在 治疗系统（RTS）控制下表达人IL-12和一种或多种其他免疫调节剂。所述RTS包含从人泛素C启动子表达的双顺反子
信使和编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4的DNA结合结构
域(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）的蜕皮激素受体的DEF
结构域之间的融合。在另一个实施方式中，所述RTS由从人泛素C启动子表达的双顺反子信
使组成并编码两个融合蛋白：Gal4-EcR和VP16-RXR。Gal4-EcR是酵母Gal4的DNA结合结
构域(氨基酸1-147)和昆虫云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）的蜕皮激素受体的
DEF结构域之间的融合。VP16-RXR是HSV-VP16的转录因子激活结构域和衍生自人和蝉序列
的嵌合RXR的EF结构域之间的融合。这些Gal4-EcR和VP16-RXR序列由EMCV的内部核糖
体进入位点(IRES)分开。Gal4-EcR结合到小分子药物(RG-115932)时，这两个融合蛋白二
聚化并且激活Gal4响应启动子的hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂的转录，所述启动
子包含6个Gal4结合位点和合成的最小启动子。上述RTS转录单位置于所述hIL-12和一
种或多种其他免疫调节剂转录单位的下游。这个全RTS-hIL12免疫调节剂盒在E1区删除
的位点纳入腺病毒5基因组。所述腺病毒主链也缺少E3基因。腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12
的图示于US 2009/0123441A1的图8。
[0790] 用于这个研究的重组腺病毒载体包含腺病毒载体序列以外的下列示例性调节元件：人泛素C启动子，衍生自EMCV的内部核糖体进入位点，包含6拷贝Gal4结合位点、3拷
贝SP-1结合位点和合成最小启动子序列的诱导型启动子，SV40聚腺苷酸化位点和衍生自
人α珠蛋白基因的转录终止序列。应该理解其他调节元件可以替代使用。
[0791] 示例性重组腺病毒载体Ad-RTS-hIL-12-免疫调节剂以下列方式生成。将受体融合蛋白、由EMCV-IRES（内部核糖体进入位点）所分开VP16-RXR和Gal4-EcR的编码序列插
入到受人泛素C启动子（组成型启动子）控制的腺病毒穿梭载体中。随后，将由IRES所分
开hIL-12的p40和p35亚基，和一种或多种其他免疫调节剂的编码序列置于合成诱导型启
动子控制下，所述启动子包含插入泛素C启动子和受体序列上游的6拷贝Gal4结合位点。
穿梭载体包含从左侧末端到图单位16(mu16)的腺病毒血清型5序列，其中删除E1序列并
用RTS、IL-12和一种或多种其他免疫调节剂(RTS-hIL-12)取代。载有RTS-hIL-12-免疫
调节剂的穿梭载体通过短暂转染HT-1080细胞来测试，用于激活剂药物依赖性IL-12和其
他免疫调节剂的表达。通过共转染HEK 293细胞以获得重组腺病毒Ad-RTS-hIL-12-免疫
调节剂，所述穿梭载体然后与腺病毒主链重组。腺病毒主链包含基因组和E3基因的左侧末
端mu 0-9.2的序列删除。所述穿梭载体和腺病毒主链包含mu 9.2-mu 16的重叠序列，使
它们之间能重组并且生成重组腺病毒载体。由于重组腺病毒载体缺乏E1和E3区，所述病
毒在正常哺乳动物细胞中是复制缺陷型。然而，病毒能在有腺病毒5E1区的HEK 293细胞
中复制，并且因此提供反式E1功能。
[0792] 示例性重组腺病毒载体按下列方式生成：用载有诱导型表达人IL12和一种或多种其他免疫调节剂的DNA元件的线性穿梭载体和腺病毒主链共转染HEK293细胞。所述穿
梭载体和病毒主链的重叠序列之间的重组引起重组腺病毒生成和在HEK293细胞中包装成
病毒颗粒。HEK293细胞在包含胎牛血清的DMEM中生长。
[0793] 用于所建议研究的病毒通过CsCl密度梯度离心纯化。所述重组腺病毒经历两轮空斑纯化，和所得种子储液用于通过在来自充分鉴定的主要（master）病毒库的HEK293细
胞中扩增来生成主要（master）病毒库(MVB)。所述MVB进行广泛的cGMP/GLP释放测试，
包含复制型腺病毒(RCA)，无菌，支原体，外来病毒，逆转录病毒，人病毒HIV1/2、HTLV1/2、HAV、HBV、HCV、EBV、B19、CMV、HHV-6、7和8，牛和猪病毒，完整病毒测序和在人细胞系中通过AD诱导表达IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的功能测试。
[0794] 来自MVB的病毒可以用于在cGMP装置中生产纯化的病毒，并且可以再进行释放测试，包含相同性，RCA，无菌，支原体，外来病毒，病毒颗粒-感染单位之比，宿主细胞DNA的污染，内毒素和蛋白和在人细胞系中通过AD诱导表达IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的
功能测试。
[0795] 生 成 重 组 腺 病 毒 的 合 适 方 法 也 示 于 Anderson,R.D.,Gene Therapy7:1034-1038(2000)。
[0796] 重组腺病毒进入宿主细胞的合适方法示于Komita,H.等，Cancer GeneTherapy16:883-891(2009)。
[0797] 通过包含hIL-12转基因和一种或多种其他免疫调节剂的腺病毒和治疗系统(RTS)转导自体树突细胞。
[0798] 衍生自人对象的树突细胞被离体转导并且注射到肿瘤。病毒转导前，鉴定DC的活力，纯度(通常>80%细胞显示DC表现型)，无菌，支原体和内毒素。病毒转导后，重复洗涤
所述细胞以除去任何未吸附的病毒。通过PCR测试最后洗涤的上清液中的残余病毒含量。
由于用腺病毒载体（未整合病毒）离体转导DC，和在瘤内注射及随后迁移到引流淋巴结之后DC寿命较短，不期望所述病毒DNA纳入任何非靶标细胞上。预期用于DC腺病毒转导的方案
产生80-90%转导，并且认为非常有效。
[0799] 通过白细胞单采术收获PBMC：对象以UPCI门诊患者单采血液成分单位接受标准的90-120白细胞单采术。所述白细胞单采术过程涉及从一个臂的静脉移除血液；血液通过
离心机(细胞分离器)，其中分离其组分和除去一种或多种组分；和使剩余组分回到相同或
另一个臂的对象静脉。因为血液通过细胞分离器设备加工，在任何一个时间收回不多于15%的对象总血液体积。在所述细胞分离器中，血液分离成血浆、血小板、白细胞和红细胞。移除白细胞(WBC)和使所有其他组分回到对象循环中。进行各种尝试以就此过程使用两个末
梢静脉（IV）。如果不可能，可以需要中央静脉。所述对象必需由医师清理以进行白细胞单采术，且在该过程前通常筛选病毒信号(包含血压)。
[0800] 加工:收集后，将leukapack通过手工递送到CPL，且立即通过ELUTRATM中离心淘析加工。这是对临床应用验证有效的封闭系统。回收单核细胞组分，并且在确立细胞的回
收和活力后，将其在IL-4和GM-CSF存在下转移到Aastrom筒培养6天。所有加工和洗涤
过程在无菌条件下进行。
[0801] 开始接种：从单个leukapack回收的单核细胞在有台盼蓝染料时计数以测定存活细胞的数目。单核细胞通过流式细胞仪评价纯度。单核细胞在无血清和无抗生素的
CellGenix培养基（每个SOP-CPL-0166包含1,000IU/mL IL-4和1,000IU/mL GM-CSF）中以
6
5-10x 10 细胞/mL重新悬浮，并且置于Aastrom筒中。盒接种需要最小加载体积50ml和
最小细胞数目。
[0802] 培养：Aastrom筒置于Replicell系统的培养器中，所述培养器是用于不成熟DC生成的全封闭、cGMP相容性自动化培养设备。
[0803] 不成熟DC的收获：在第6天，所述Aastrom筒从培养器中移出，并且收获不成熟DC。所述细胞通过1,500rpm离心回收，在CellGenix培养基中洗涤，在有台盼蓝染料时计
数并且检查形态学和表型特性。
[0804] 活力：这通过在台盼蓝染料存在下进行血球计数板细胞计数来测定。通常>95%的收获细胞有活力，即排除台盼蓝染料。如果活力小于70%，弃去所述不成熟DC。
[0805] 表型：培养生成的细胞通过在血球计数板上显微镜观察计数，并且使用台盼蓝染料获得初步的差异计数（differential count）(DC对比淋巴细胞)。差异计数通过流式细
胞仪确证，以DC对比淋巴细胞为门控（gate on）和使用不成熟DC的高正向和侧面散射特
性作为其鉴定的标准。不成熟DC通常包含>80%的有树突细胞形态细胞且有DC表型。
[0806] IL-12p70效力试验：已确定成熟的DC(mDC)在有或没有先天免疫信号(例如LPS)加入下，能与CD40L活化同时或之后生成IL-12p70。近期内确定了标准化IL-12p70生成
试验，并且能应用于各种条件下生成的小样品或大量DC疫苗。当前效力试验由两个分别的
步骤组成，第一个涉及应答DC和稳定转染有人CD40配体基因作为刺激物的J588淋巴瘤
细胞的共孵育。第二个步骤涉及就Luminex系统中用J558/CD40L+/-LPS刺激DC分泌的
IL-12p70水平，测试来自这些共培养物的上清液。这个效力试验有18.5%(n=30)的试验间
CV和广泛的动态范围，这有助于评价由极为不同的IL-12p70生成水平定性的多个DC产物。
使用13个正常供体的单核细胞所生成DC产物建立的试验正常范围是8-999pg/mL，平均值
为270pg/mL。
[0807] 树突细胞的生成和释放标准
[0808] 检测各批体外生成树突细胞是否存在微生物污染物（有氧和厌氧细菌、真菌和支原体）以及内毒素，并且鉴定表型和功能。所有注射到对象中的树突细胞是新鲜的，并且没有经历冷冻保藏（croypreservation）。
[0809] DC的质量保证测试：评价上述生成的DC的无菌、活力、纯度、效力和稳定性。建立细胞产物释放的标准并且严格遵守。
[0810] 活力：培养生成的细胞通过在血球计数板上显微镜观察计数，并且使用台盼蓝染料获得差异计数(DC对比淋巴细胞)。此计数提供测试培养物中活细胞的百分比。通过释
放标准需要台盼蓝排除超过70%的细胞活力和最少70%细胞表达HLA-DR和CD86作为单核
细胞衍生的DC标记。探索性分析可以包含其他标记，例如CD83和CCR7以评价DC成熟状
态，以及CD3和CD19以评价淋巴细胞污染。
[0811] 纯度:用FITC-和PE-偶联单抗染色的细胞的双色流式细胞仪分析用于检测形态确定的DC群表达就DC定义的表面抗原并且缺少单核细胞以及T和B细胞谱系抗原。对疫
苗制备而言，生成的DC必须表达HLA-DR和CD86，并且必须不表达CD3、CD19或CD14。为了
视作mDC，所述细胞必须表达CD83+和CCR7+。
[0812] 效力:为定义DC效力的量度，如上所述测定其生成IL-12p70的能力。
[0813] 无菌性：在匹兹堡大学医学中心微生物实验室使用BD Bactec系统(马里兰州斯帕克斯的BD公司（Becton Dickinson Co.）)通过细菌(需氧和厌氧)和真菌培养测试DC。
14天后可见微生物培养的最终结果。用于疫苗使用的DC释放前，进行革兰氏染色并且必须
对微生物的出现是阴性。
[0814] 通过使用Gen-Probe支原体组织培养快速检测系统(加利福尼亚州圣地亚哥的基因探针公司(Gen-Probe，Inc.))根据核酸杂交技术来测试IMCPL的支原体。使用鲎变形细
胞溶解物加热原（Limulus Amoebocyte Lysate PyrogenPlus）试验进行内毒素测试(马里
兰州沃克威尔的Bio Whittaker公司)。在收获时间和最终产物释放前，对细胞培养物进行
内毒素测试。可接受的内毒素水平是<5EU/kg体重。为将来分析，冷冻保藏未转导和转导
的树突细胞。
[0815] 期望所有转导的细胞表达转基因。期望多于80%的DC被转导。因为转基因中保留了天然编码序列，所述产物有生物活性。注射入肿瘤的所述病毒转导的DC具有未成熟
DC表型，并且不表达IL-12和一种或多种其他免疫调节剂，直到其变成熟，因此在这个阶段IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的表达大部分来自转基因。因为IL-12和一种或多
种其他免疫调节剂转基因的表达通过小分子激活剂药物RG-115932以剂量依赖方式诱导，
能在转导的DC中控制转基因表达的水平到所需水平。制备用于给予人对象的一小部分转
导DC可以体外测试IL-12和一种或多种其他免疫调节剂表达的激活剂药物依赖性诱导。
IL-12和一种或多种其他免疫调节剂的表达可以通过灵敏度为4ng/ml的ELISA测试。
[0816] 期望来自此建议研究所用载体转导细胞的IL-12和一种或多种其他免疫调节剂6
的体外诱导在24小时内每10 个细胞中产生约500ng IL-12或多种其他免疫调节剂，由
6
ELISA测定。在使用黑素瘤小鼠模型的临床前研究中，10 或更多转导DC的瘤内注射显示
7
功效。然而，期望所需瘤内注射可以显示低于此量水平的功效，并且因此注射5x10 转导DC可以用作测定是否需要更小量或更大量的起点。
[0817] 例如，用载有IL12和一种或多种其他免疫调节剂基因的重组腺病毒载体转导的人和小鼠细胞系和初级树突细胞体外显示以剂量依赖方式响应激活剂药物的IL12表达诱
导。
[0818] 6.3.激活剂药物的配制
[0819] 本文使用的所述激活剂药物以下列任何一种制剂制备：
[0820] (1)100%Labrasol（辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯);
[0821] (2)李 斯 德 林（Listerine）调 味 的 Labrasol(美 国 纬 度 制 药 公 司（LatitudePharmaceuticals Inc.）)包含(a)薄荷醇，(b)百里酚，(c)桉叶脑，(d)阿斯巴甜，(e)糖精钠，(f)柠檬酸，(g)薄荷香料，(h)乳酪调味料，(i)Labrasol;
[0822] (3)Miglyol（辛酸癸酸甘油三酯)812和多烯卵磷酯胆碱（phospholipon）90G(美国纬度制药公司);或
[0823] (4)Miglyol 812,多烯卵磷酯胆碱90G和维生素E生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(美国纬度制药公司)。
[0824] 递送
[0825] 当可以设想各种浓度和特异性方案时，治疗患者的一个示例包含患者接受以7
5x 10 浓度悬浮于无菌盐水的转化自体树突细胞(AdDC)的瘤内注射，与口服激活剂药物
(RG-115932)的组合，所述细胞工程改造成表达受RTS控制的hIL-12(人白介素12)和一种
或多种其他免疫调节剂。
[0826] 起始治疗
[0827] 第1天住院病人访视：第1天进行基线物理检查（包含生命体征、重量和ECOG状态）。收集尿液和取血以用于基线血清化学、尿分析和血液学(安全性概况)。瘤内注射体
外工程改造的树突细胞前约3小时，每个对象在饭后立即给予激活剂药物(组1-0.01mg/
kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg和3mg/kg)。在第1天以特定时间间隔取血（给药前、AD给予后0.5、
1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时）以评价所述激活剂药物和其主要代谢物的单剂量药物动
7
力学。每个对象接受5x 10 细胞浓度的腺病毒转导自体树突细胞的单个瘤内注射，所述细
胞工程改造以表达受RTS控制的hIL-12和一个或多个其他免疫调节剂。仔细监控对象的
局部注射位点反应和/或超敏反应。第2-14天住院病人访视：第2-14天，每个对象在饭后
立即给予激活剂药物。第2-14天每天收集生命体征和不良事件。在第4天±24小时，从
约50%对象中除去所述肿瘤和/或引流淋巴结的生物活检以测量hIL-12和细胞免疫反应。
第8天，测量重量。在第8天±24小时，从没有在第4天进行生物活检的对象中除去所述
肿瘤和/或引流淋巴结的生物活检以测量hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂和细胞免
疫反应。在第4天±24小时和第8天±24小时取血，以检测针对腺病毒和/或RTS组分
的潜在抗体和细胞免疫反应。也获得血清细胞因子概况以测定其他细胞因子的表达是否受
hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂转基因的影响。在第8天，收集尿液和取血以用于基
线血清化学、尿分析和血液学(安全性概况)。在第8天以特定时间间隔取血（给药前、AD
给予后0.5、1、2、4、6、8、12、16和24小时）以评价所述激活剂药物和其主要代谢物的稳态药物动力学/ADME。
[0828] 第14天住院病人访视：在第14天，每个对象在饭后立即给予激活剂药物。每个对象接受物理检查(包含生命体征、身高、重量和ECOG状态)。收集尿液和取血以用于血清化
学、尿分析和血液学(安全性概况)。在第14天±24小时取血，以检测针对腺病毒和/或
RTS组分的潜在抗体和细胞免疫反应。也获得血清细胞因子概况以测定其他细胞因子的表
达是否受影响。
[0829] 在特定住院病人和门诊病人访视中从对象收集血液以测量对腺病毒和RTS成分的潜在抗体和细胞免疫反应。就基线血清细胞因子概况获取血液。AdVeGFP感染性阻断类
型试验用于检测针对腺病毒载体的抗体反应(Gambotto,Robins等2004)。针对RTS组分的
抗体反应通过western印迹和/或ELISA使用来自患者的血清和由表达载体生成的RTS蛋
白来评价。另外，在血清中通过Luminex就IL-12、IFN-γ、IP-10和其他Th1/Th2细胞因子
如IL-2、TNF α、IL-4、IL-5和IL-10完成多重细胞因子检测。这些抗体和细胞因子试验
需要约10ml血液。
[0830] 对腺病毒和/或RTS组分的潜在的抗体和细胞免疫反应：在特定住院病人和门诊病人访视中从对象收集血液以评价对腺病毒和RTS成分和肿瘤抗原的潜在抗体和细胞免
疫反应。AdVeGFP感染性阻断类型试验用于检测针对腺病毒载体的抗体反应(Nwanegbo等
2004)。针对RTS组分的抗体反应通过western印迹和/或ELISA使用来自对象的血清和
由表达载体生成的RTS蛋白来评价。另外，在血清中通过Luminex就IL-12、IFN-γ、IP-10
和其他Th1/Th2细胞因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10完成多重细胞因子检测。这
些抗体和细胞因子试验需要约10ml血液。
[0831] 所述细胞免疫反应试验使用约50-60ml血液，并且从其分离CD4和CD8T细胞亚组。在用于AdV-和RTS衍生抗原所活化T细胞的IFN-γ生成（如果有）的ELISPOT试验
中，分离的T细胞会与用空AdV载体、AdV-RTS或AdV-RTS-hIL12-免疫调节剂载体转导的
自体DC混合。使用如此的肿瘤细胞和/或表达共有黑素瘤抗原的DC完成相似试验以评价
针对肿瘤的早期免疫反应。如果需要，也完成其他试验。
[0832] 妊娠测试：在筛检随访和重新治疗期的第一次住院病人访视前，向给予可能分娩的女性尿液妊娠测试。在开始治疗和所有的重新治疗期中，在给予激活剂药物前至少72、
48、24或12小时完成所述测试。如果尿妊娠测试是阳性，则用血清妊娠测试确认。如果确
认妊娠，对象不能进入试验或持续进入重新治疗期。如果需要，所述妊娠测试可以多次重新进行。
[0833] 伴随用药调查：筛选中和重新治疗期的第一次住院病人访视前，会要求每个对象提供同时用药的列表以测定与试验和随后时期中发生的不良事件之间任何可能的关系。
[0834] 重新治疗的标准：如果对象在AdDC接种前有耐受而没有有限的不良反应，并且在潜在重新治疗的时间已经显示没有疾病或症状减弱的进展，会考虑他们进行重新治疗。在
研究负责人和治疗医生看来，如果其他AdDC瘤内注射与激活剂药物(组1的最大耐受剂
量)联用连续14天有潜在的临床优势，则提供对象重新治疗，前提是符合下列标准：
[0835] 1.没有最大容许毒性，
[0836] 2.对象疾病稳定或显示改善的临床或主观的症状，和
[0837] 3.没有证据显示针对 治疗系统的腺病毒组分的抗体或细胞免疫反应。
[0838] 转基因功能和免疫学效果的评价：在试验的筛选期间(第-12天–第-7天)、第4天、第8天和第14天和随后1个月收集肿瘤和相关引流淋巴结的钻取或切除活检，用于
体内评价hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂的转基因表达和细胞免疫反应。在重新治
疗期间的第-12天–第-7天和第14天收集肿瘤和相关引流淋巴结的细针抽吸生物活检，
用于体内评价hIL-12和一种或多种其他免疫调节剂的转基因表达和细胞免疫反应。通过
标准光学显微镜和免疫组织化学评价生物活检以评估T细胞向肿瘤和引流淋巴结的细胞
渗透。由不知道研究对象背景的病理学家读取生物活检部分。为区别肿瘤和引流淋巴结中
DC的内源和诱导的IL-12表达，RNA上的RT-PCR使用合适设计的引物。在试验的筛选、第4
天、第8天和第14天、随后1个月和重新治疗期的第-12-第-7天、第8天和第14天，从血
清细胞因子概况中取血。获得血清细胞因子概况以测定其他细胞因子的表达是否受hIL-12
转基因治疗的影响。在血清中通过Luminex就IL-12、IFN-γ、IP-10和其他Th1/Th2细胞
因子如IL-2、TNFa、IL-4、IL-5和IL-10完成多重细胞因子检测。这些抗体和细胞因子试
验需要约10ml血液。
[0839] 激活剂药物的单个剂量和稳态药物动力学:在试验第1天以特定时间间隔取血（给药前、早晨给予后0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16和24小时）以评价所述激活剂药物和其主要代谢物的单剂量药物动力学和在试验第8天如上进行以测量所述激活剂药物和其主要
代谢物的稳态药物动力学/ADME。通过HPLC评价血浆以获得随后所述激活剂药物和其主要
代谢物的稳态药物动力学终点：Cmax(观察到的最大血浆浓度)、Tmax(观察到的最大血浆
浓度时间)、Ctrough(观察到的最小血浆浓度，计算为0–24小时浓度的平均值)、C24h(24
小时的血浆浓度)、AUC24h(时间0–24小时的血浆浓度-时间曲线下的面积)、Ke(表观消
除速率)和T112(表观半衰期)。
[0840] 应理解上面描述的实施方式和实施例并不意在限定本发明范围的任何方面，并且本文所述的权利要求旨在包含所有实施方式和实施例，不论本文是否明确讲述。
[0841] 实施例3
[0842] 通过组合转基因技术如 的应用，具有合理选择、模块基因组分的基质能快速组装成DNA表达构建物。为了显示单独影响转录、转录后、翻译和翻译后过程的已组装基因组分能一起影响基因表达水平，可选与人工5’UTR、多个3’调节(Reg)+聚(A)信号(SV40和hGH)、信号肽(TNFα和IL-2)、和密码子优化(+/-)方案联用RheoSwitch
技术，以调节转录增加细胞生产和分泌TNFα的能力。图11显示使用的模块元件且图片显
示侧接独特限制性位点的各模块元件以提供模块组合的精确组装方法。
[0843] 在设计成接受合成基因的DNA主链的背景下进行模块组装。就腺病毒包装进行工程改造的 主链的一个示例示于图12，组合模块设计与治疗的腺病毒递
送良好结合，因为其使用短于自然发现的紧密调节序列。
[0844] 模块组合的体外评价
[0845] 表7.生成11个测试载体和组装DNA的基质
[0846]载体 5’UTR 信号肽 ORF(CDS) 3’调节（Reg） 图
43318(17) TNFwt(1) TNFwtUV(4) TNFwtUV(6) SV40e+pA(8) 图13
[0847]43319(18) TNFwt(1) TNFOptUV(1,2)(5) TNFoptUV(7) SV40e+pA(8) 图14
43320(19) TNFwt(1) IL-2optUV(3) TNFoptUV(7) SV40e+pA(8) 图15
43321(20) 5U2(2) TNFwtUV(4) TNFwtUV(6) SV40e+pA(8) 图16
43322(21) 5U2(2) TNFOptUV(1,2)(5) TNFoptUV(7) SV40e+pA(8) 图17
43323(22) 5U2(2) IL-2optUV(3) TNFoptUV(7) SV40e+pA(8) 图18
43324(23) TNFwt(1) TNFwtUV(4) TNFwtUV(6) hGH+pA(9) 图19
43325(24) TNFwt(1) TNFOptUV(1,2)(5) TNFoptUV(7) hGH+pA(9) 图20
43326(25) TNFwt(1) IL-2optUV(3) TNFoptUV(7) hGH+pA(9) 图21
43327(26) 5U2(2) TNFwtUV(4) TNFwtUV(6) hGH+pA(9) 图22
43329(28) 5U2(2) IL-2optUV(3) TNFoptUV(7) hGH+pA(9) 图24
[0848] 将载体瞬时转染入HEK293T细胞系以评价哪个模块组合使TNF α输出增加。为诱导TNF α的表达，给予细胞配体或载剂对照。收集上清液和通过ELISA测量TNF α水
平。为设定基线接近的野生型，载体43318包含UV确认的野生型TNF α5’UTR、信号肽、编码序列和SV40pA 3’调节（Reg）。独立地，TNF α信号肽或成熟蛋白编码序列的Opt(1,2)密码子优化的模块改变造成蛋白分泌逐步增加(载体43319,43320)。5U2 5’UTR额外模块
取代TNF-wt 5’UTR也提高分泌水平(载体43322,43323)。当野生型5’UTR、信号肽、编码
序列模块用5U2、IL2和TNFOptUV的各自模块取代时(载体43329)，实现最高的TNF-α分
泌。
[0849] 为证明TNF-α分泌的增加不是细胞类型依赖性，转染11个实验载体到CHO-K1细胞，并且加入两个对照载体(见图27)。载体43534(图26)和载体43533(图25)包含野生
型TNF-α模块以用作对照。载体43534由不存在 组装支点的野生型
TNF-α序列组成。显然， 组装支点的出现没有不利影响TNF-α的生
成和分泌。在这个数据组中，也显示TNF-α野生型3’调节（Reg）用含有聚A模块的SV40e
或hGH取代造成TNF-α分泌的增加。用5U2、IL2信号肽、TNFOptUV和hGHpA的组合实现
最大TNF-α输出。CHO-K1细胞的数据显示了在5’UTR、IL-2信号肽和TNFOptUV编码序列
中5U2的每个模块取代相同的逐步增加趋势。有趣地是，增加的量级在连个细胞类型中稍
有不同。这显示了当模块在每个细胞类型中表现相似时，特定细胞或组织类型中的生理区
别可以影响模块取代效果的幅度。在每个分类中增加组合基质以包含更多模块可以根据测
试的细胞类型或组织来鉴定优异组合。能包含在更大基质中的其他模块示例作为SEQ ID
NO:41-46包括在内。
[0850] 实施例4.动物模型中治疗候选物的评价
[0851] 为显示诱导的优化TNF-α构建物对治疗癌，例如前列腺癌或头颈癌的有效性，能使用疾病的头颈癌小鼠模型。Smad4的单个基因敲除已经显示产生恶性人头颈鳞状细胞癌
(HNSCC)的自发模型。(PMID:19841536)
[0852] 在没有这种小鼠系时，人衍生的HNSCC肿瘤细胞能植入裸小鼠。肿瘤建立后，所述优化的TNF-α构建物能引入到有腺病毒的肿瘤中。能给予小鼠不同剂量的配体以调节优化的TNF-α生成水平。测量肿瘤负荷和评价肿瘤坏死以从优化的TNF-α构建物中确定潜
在的治疗候选物。
[0853] 实施例5.治疗实施方式示例
[0854] 通过瘤内注射无复制腺病毒DNA载体，给予患者工程改造的TNF-α转基因。这个基因程序编码与IL-2的密码子优化信号肽融合的哺乳动物密码子优化的成熟细胞因
子。所述转基因cds(IL-2SP+TNF-α)进而侧接有野生型TNF-α5’UTR和SV403’调节
（Reg）+聚(A)信号，并且其表达通过给予激活剂配体的谨慎“拨入（dialed-in）”剂量而受RheoSwitch技术控制(即载体VVN-43320中呈现的DNA，见图15)。当仍提供表达的“紧密”
和“无渗漏”控制时，初级数据显示这种DNA元件的组合产生最大可能的分泌TNF-α诱导。
即此转基因结构中的未诱导、基本表达水平仍较低，并且不太可能对患者产生不受控、脱靶效果。
[0855] 在本发明的另一个实施方式中，通过腺病毒以类似于载体VVN-43329的模块DNA构型给予患者工程改造的TNF-α转基因(见图24)，显示了高的基底表达和最高的转基因
表达。这个DNA使用人工工程改造的5’U2和hGH聚(A)信号以及完全哺乳动物密码子优
化和IL-2信号肽。患者中系统毒性的控制通过使用瘤内注射的低腺病毒MOI实现。也通
过RheoSwitch激活剂配体更小程度地调节表达水平和时间控制。这个基因产物分布的其
他控制可通过纳入会阻止生命器官中脱靶表达的组织特性miRNA响应元件，或通过人工工
程改造腺病毒衣壳以增加趋向性来实现。
[0856] 在本发明的其他实施方式中，工程改造的TNF-α转基因与假设通过5’U2元件赋予人工mRNA高稳定性的VVN-43328中的DNA相似(图23)。然而，这个构建物不使用IL-2
信号肽以增加分泌，并且其保留了来自编码TNF-αN’末端的DNA的野生型序列。由于未知
原因，人工TNF-α的高水平分泌已充分证明对患者结果是有害的（不考虑背景），而通过金属蛋白酶“细胞因子蜕落”的天然机理可以通过将所述因子限于肿瘤周围来限定患者毒性。
如果外源TNF-α的天然脱落仍然显示脱靶效果，其胞外域茎部可以通过突变截短以防止
被天然蛋白酶溶解，并且所述因子会通过细胞-细胞接触（如实际上II型跨膜蛋白）增强活性。或者，与载体VVN-43328所述构建物相似的转基因会编码组成型表达的TNF-α，具有包含外源蛋白酶剪切位点的突变茎部胞外域。这个外源蛋白酶会进而在RheoSwitch技术控
制的启动子元件下，仅在出现激活剂配体时表达。因此，TNF-α的剪切和体内溶解（不是表面表达）会通过模块转基因元件控制。
[0857] 实施例6.Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤功效
[0858] Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤效果在黑素瘤、结直肠、胰腺、乳腺、肺部和肾部癌症的一系列鼠肿瘤模型中评价。下面显示示例性剂量反应实验。用B16F0鼠黑素瘤癌细胞
皮下接种免疫活性的雌性C57bl/6小鼠(6-8周龄)。肿瘤细胞接种后11天，当肉眼可
3
见的肿瘤结明显(肿瘤体积平均约40mm)时，将小鼠分组，每个组5只动物。有9组，包
含：对照盐水处理；激活剂配体处理；仅Ad-RTS-mIL12(1ee10vp)和6组用不同剂量载体
Ad-RTS-mIL-12(1e7、1e8、1e9、5e9、1e10、5e10病毒颗粒)加激活剂配体处理。在载体给予前一天，向在+配体组的小鼠提供含100mg/kg激活剂配体的2018Teklad总体18%蛋白啮
齿动物饲料(哈兰（Harlan）实验室)饮食(1000mg配体/kg饮食)。对照组中的小鼠接受
2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料饮食。在第12天注入肿瘤溶于100ul PBS的单个
Ad-RTS-mIL12给予。使用卡尺和体重秤每2-3天测量肿瘤体积和体重，并且追踪所述动物
3
直到对照肿瘤达到2000mm。数据载入研究日志（StudyLog）动物研究软件。
[0859] 如图31显示，在大于1ee8 vp的Ad-RTS-IL-12剂量(范围73-99%)观察到大量抗肿瘤效果。测试的最低Ad-RTS-IL-12剂量1ee7vp没有显示抗肿瘤效果。没有激活剂配
体时，处于1ee10vp的高剂量Ad-RTS-IL-12显示没有效果，显示需要结合Ad-RTS-IL-12和
激活剂配体。仅配体本身的治疗显示没有效果。因此，这个研究显示通过RTS-IL-12联合
激活剂配体调节的潜在抗肿瘤效果。
[0860] 体重分析示于图32。以Ad-RTS-IL-12的最高剂量水平(5ee10vp)治疗动物显示在第19天有短暂体重减少，但是在第26天恢复。处理其他组的动物没有显示任何明显的
剂量响应关系，并且只观察到体重增加的微小改变。
[0861] 实施例7.Lewis肺癌模型中Ad-RTS-IL-12的功效
[0862] 用鼠Lewis肺癌模型细胞(LLC)皮下(s.c)接种雌性6-8周龄C57b/6的免疫活性小鼠。细胞接种后5天，所述小鼠随机分成治疗和对照组(n=5)，总共4组：没有治疗(对
照)、仅激活剂(RG-115932)、仅Ad-RTS-mIL12和Ad-RTS-mIL12加激活剂。接受激活剂(L)
的组用混合有激活剂(1000mg/kg饮食)的(2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料(哈
兰（Harlan）实验室)饮食随意饲养。接受仅Ad-RTS-mIL12治疗或没有治疗的组继续接受
3
常规饮食。当肿瘤达到28±6mm 时，开始治疗。在肿瘤细胞接种后第6、9和13天，通过瘤
内(i.t.)注射给予小鼠Ad-RTS-mIL12(PBS中1e10vp/100ul)。在载体给予前24小时开始
给予小鼠激活剂饲料(L)。每个小鼠的肿瘤大小和体重使用卡尺和体重秤每周监控三次，直
3
到实验结束。当小鼠肿瘤大小超过>1200mm 时，终止实验。数据载入研究日志动物研究软
件。
[0863] 治疗后肿瘤体积示于图33A。对照和仅激活剂(L)组中的Lewis肺癌负荷小鼠显示大致相似的肿瘤生长动力学。仅Ad-RTS-mIL12的三个剂量造成中度肿瘤生长。重要地，
有激活剂（L）的Ad-RTS-mIL12产生相对于对照组的显著肿瘤生长抑制（78%）。这个数据提示在激活剂出现时，Ad-RTS-mIL12抑制Lewis肺癌生长。监控体重作为毒性的指示物。发
现在实验过程中没有大的体重减少。
[0864] 实施例8.黑素瘤模型中Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤功效
[0865] 用鼠黑素瘤癌细胞(B16F0)皮下(s.c.)接种雌性6-8周龄C57b/6的免疫活性小鼠。细胞接种后第10天，小鼠随机分成治疗和对照组(n=5)，总共9组：没有治疗(对照)、
仅激活剂(L)(RG-115932)、和仅Ad-RTS-mIL12、和Ad-RTS-mIL12与配体的不同激活剂剂量
(50、100、250、500和1000mg/kg)。接受激活剂(L)的组用混合有激活剂(1000mg/kg饲料)
的啮齿动物2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料随意饲养。接受仅Ad-RTS-mIL12治疗
或没有治疗的组继续接受常规2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料饮食。当肿瘤达到
3
56±18mm 时，开始治疗。在肿瘤细胞接种后第13天，通过瘤内(i.t.)注射给予小鼠单个
剂量Ad-RTS-mIL12(PBS中1e10vp/100ul)。在载体注射前24小时给予小鼠激活剂(L)饲
料。每个小鼠的肿瘤大小和体重使用卡尺和体重秤每周监控三次，直到实验结束。当肿瘤
3
大小超过>2000mm 时，终止实验。数据载入研究日志动物研究软件。
[0866] 治疗后肿瘤体积和体重改变示于图34A和34B。对照和仅激活剂(L)组中的黑素瘤负荷小鼠显示相似的侵袭性肿瘤生长。肿瘤生长动力学指示所述激活剂饲料没有抗肿瘤
活性。当动物接受没有配体的单个剂量Ad-RTS-mIL12(1e10vp)时，在第26天观察到轻微肿
瘤生长抑制(12%)。用Ad-RTS-mIL12加激活剂（L）治疗产生相较对照小鼠的肿瘤生长抑制
（73-98%）。有50mg/kg激活剂(L)的单个剂量Ad-RTS-mIL12产生相对于对照肿瘤的显著
肿瘤下降。值得注意的是，显然相较50mg/kg的激活剂饲料有显著的抗肿瘤活性(90-98%)，因为激活剂饲料从100-1000mg/kg增加。这个数据清楚地显示Ad-RTS-mIL12在黑素瘤模
型中有活性并且显示了广泛的治疗激活剂配体剂量窗口。监控体重作为毒性的指示物。在
第13和17天，在1000mg/kg激活剂剂量中发现轻微短暂的体重改变(<5%)。在实验剩余部
分中没有发现大的体重损失。没有发现与激活剂剂量响应相关的体重改变。在不同剂量下
用AdRTS-mIL12治疗耐受良好，没有任何毒性的任何指示。
[0867] 实施例9.结肠癌模型中Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤功效
[0868] 用萤光素酶表达稳定的鼠结肠癌细胞(CT26Luc)皮下(s.c)接种雌性6-8周龄Balb/C的免疫活性小鼠。细胞接种后10天，所述小鼠随机分成治疗和对照组(n=5)，总共3
组：没有治疗(对照)、仅激活剂(RG-115932)、和Ad-RTS-mIL12加激活剂。接受激活剂(L)
的组用混合有激活剂(1000mg/kg饲料)的2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料(哈兰
（Harlan）实验室)随意饲养。没有接受治疗的组继续接受2018Teklad总体18%蛋白啮齿
3
动物饲料饮食。当肿瘤达到40±17mm 时，开始治疗。在肿瘤细胞接种后第11和18天，通
过瘤内(i.t.)注射给予小鼠Ad-RTS-mIL12(PBS中1e10vp/100ul)。在载体注射前24小时
给予小鼠激活剂(L)饲料。每个小鼠的肿瘤大小和体重使用卡尺和体重秤每周监控三次，
3
直到实验结束。当小鼠肿瘤大小超过>2000mm 时，终止实验。数据载入研究日志动物研究
软件。
[0869] 治疗后肿瘤体积和体重改变示于图35A和35B。对照和仅激活剂(L)组中的结肠腺癌（carcinoma）负荷小鼠显示相似的侵袭性肿瘤生长。肿瘤生长动力学指示所述激活剂饲料没有抑制肿瘤生长。仅Ad-RTS-mIL12加激活剂(L)的两个剂量产生相较对照小鼠的全
部消退和肿瘤生长抑制(100%)。显然，由于Ad-RTS-mIL12的治疗，5只动物中的5只完全
没有肿瘤。用亲本CT26Luc细胞重新攻击Ad-RTS-mIL12治疗后没有产生肿瘤的小鼠。5只
天然Balb/c动物也用CT26Luc接种以作为对照组。所述对照动物如期发展出肿瘤结。重要
地，在所有重新攻击的动物中，重新攻击4周后没有发生肿瘤。这个研究显示Ad-RTS-mIL12治疗发展出针对侵袭性结肠癌模型的强抗肿瘤免疫。监控体重作为毒性的指示物。发现在
实验过程中没有大的体重减少。
[0870] 实施例10.胰腺癌模型中Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤功效
[0871] 用同系PAN02胰腺癌细胞(ATCC)皮下(s.c)接种雌性6-8周龄C57b/6的免疫活性小鼠。细胞接种后6天，所述小鼠随机分成4组（每组5只动物）：没有治疗、仅激活剂(RG-115932)、仅Ad-RTS-mIL12和Ad-RTS-mIL12加激活剂。接受激活剂配体的组用混合有
激活剂(1000mg/kg饲料)的2018Teklad总体18%蛋白啮齿动物饲料(哈兰（Harlan）实验
室)随意饲养。接受仅Ad-RTS-mIL12治疗或没有治疗的组继续接受2018Teklad总体18%蛋
白啮齿动物饲料饮食。在植入肿瘤细胞后第7和14天，小鼠接受采用PBS中1e10vp/100ul
剂量水平的单个瘤内(i.t.)注射Ad-RTS-mIL12治疗。在载体治疗开始时，肿瘤大小平均
3
STGT mm。
[0872] 每个小鼠的肿瘤大小和体重每周监控三次，直到实验结束。当小鼠肿瘤大小超过3
>600mm 时，终止实验。由于胰腺肿瘤生长非常慢，将其定义为实验的终点。没有接受治疗的小鼠中肿瘤生长正常。
[0873] 在这个肿瘤模型中，注意到接受仅激活剂或仅Ad-RTS-mIL12治疗的小鼠中较小的肿瘤生长延迟。相反，与没有接受治疗的对照小鼠相比，所有Ad-RTS-mIL12治疗小鼠中
肿瘤生长被显著抑制(97%)。使用卡尺和体重秤通过实验测量体重作为毒性的度量。用
Ad-RTS-mIL12注射的动物的体重显示给药后，除了在第12-13天有短暂的体重下降(<5%)，
没有明显的体重下降。另外，在任何动物中没有观察到病理行为（嗜睡、皱皮（ruffle fur）、跛行、脱水、弓背姿势（hunched posture）等）。维持肿瘤消退直到第37天处死对照动物时。
数据载入研究日志动物研究软件。
[0874] 结果见图36A和36B。
[0875] 实施例11.乳腺癌模型中Ad-RTS-IL-12的抗肿瘤功效
[0876] 这个研究的目标是评价用Ad-RTS-mIL12的瘤内治疗在鼠乳腺癌模型中的功效和毒性。
[0877] 6–8周龄雌性BalbC小鼠购买自查尔斯河实验室（Charles RiverLaboratories）或哈伦（Harlan）(美国)。根据Intrexon机构动物管理和使用委员会（Institutional
Animal Care and Use Committee）指南进行动物护理和实验过程。
[0878] 鼠乳腺腺癌（carcinoma）(4T1)细胞系购买自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。4T1细胞在洛斯维公园纪念研究所（Roswell Park Memorial Institute）培养基
(RPMI)1640(弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC)中生长。用热灭活胎牛血清(FCS)10%v/v、2-mM
L-谷氨酰胺(佐治亚劳伦斯维尔的亚特兰大生物公司（Atlanta Biologicals,Inc）)、
100IU/ml青霉素G和100μg/ml链霉素补充培养基。细胞在37°C 5%CO2生长。常规检
测所有细胞系并且发现没有支原体。
[0879] 用同系乳腺癌(4T1)（1e5细胞/50ul）细胞皮下(s.c)接种雌性6-8周龄BALB/c的免疫活性小鼠。细胞接种8天后，所述小鼠随机分成4组（每组5只动物）：没有治疗、仅激活剂、仅Ad-RTS-mIL12和Ad-RTS-mIL12加激活剂。用混合有激活剂(1000mg/kg)的啮
齿动物饲料随机饲养接受激活剂配体的组。接受仅Ad-RTS-mIL12治疗或没有治疗的组继
续接受标准饮食(美国哈伦实验室)。通过从哈伦Teklad(哈伦的定制饮食部门)生成的
定制饮食给予激活剂配体，所述饮食以1000mg激活剂配体到1Kg给予对照动物的相同饲料
来配制。在植入肿瘤细胞后第9、12和14天，小鼠接受采用PBS中1e10vp/100ul剂量水平
3
的单个瘤内(i.t.)注射Ad-RTS-mIL12治疗。在载体治疗开始时，平均肿瘤大小为36mm。
3
每个小鼠的肿瘤大小和体重每周监控三次，直到实验结束。当小鼠肿瘤大小超过>1000mm
时，终止实验。
[0880] 用乳腺癌4T1细胞接种后8天，所述小鼠随机分成治疗和对照组(n=5/组)，总共4组：没有治疗(对照)、仅激活剂(L)、仅Ad-RTS-mIL12和Ad-RTS-mIL12加激活剂，如下
表所示。
[0881]
[0882] 当肿瘤达到36mm3平均体积时，开始治疗。治疗后肿瘤体积示于图39A。对照、Ad-RTS-IL-12治疗和仅激活剂配体(L)的组中4T1荷瘤小鼠在第26天分别显示肿瘤生长
抑制~20%和35%(图39A)。重要地，有激活剂配体的三个Ad-RTS-mIL12剂量产生相对于对
照组的显著肿瘤生长抑制（82%）(p<0.005)。这个数据提示乳腺癌(4T1)模型中，激活剂出现时Ad-RTS-mIL12显示潜在的抗肿瘤活性。监控体重作为毒性的指示物。发现在实验过
程中没有大的体重减少或死亡(图39B)。
[0883] 这个结果显示直接瘤内注射Ad-RTS-mIL12加激活剂配体可高效诱导肿瘤消退并且在乳腺癌模型中安全。在这个模型中抗肿瘤活性显著(p<0.005)。
[0884] 实施例12.没有免疫细胞的Ad-RTS-IL-12载体给予的临床方案
[0885] 下面是采用给予Ad-RTS-IL-12载体的形式能用于实施本发明的临床方案，以治疗不可切除的III或IV期恶性黑素瘤。
[0886] 此1b期临床试验的目标是对瘤内注射Ad-RTS-IL-12与14天活化配体每天口服剂量联用的6个治疗周期，评价安全性和对象反应、肿瘤反应速率和免疫学及其他生物活
11
性。Ad-RTS-IL-12剂量开始(第一个周期)以1x10 病毒颗粒(vp)与活化配体5mg/天
剂量一起给予。病毒颗粒和活化配体的剂量然后根据固定安排(表8)就每个患者的每个
重复治疗周期而逐步升高，前提是患者能耐受前述治疗周期。
[0887] 1b期研究的目标如下：
[0888] 1.在有不可切除的III C或IV期恶性黑素瘤的患者中，联合患者内逐步升高的剂量与活化配体逐步升高的剂量，评价瘤内注射AD-RTS-IL-12的重复治疗周期的安全性和
耐受性。
[0889] 2.通过使用诊断CT扫描(实体瘤响应评价标准(RECIST 1.1)标准)、PET扫描和照片(如果可行)获得功效的指示。
[0890] 3.评价患者中RheoSwitch治疗系统（RheoSwitch TherapeuticSystemTM）(RTSTM)的功能，通过评价AD-RTS-IL-12与活性配体联用在细胞免疫(特别是IL-12和其他细胞因子的基因表达，细胞毒性T淋巴细胞和Tregs的频率)，和在注射的靶标肿瘤、肿瘤相关引流淋巴结(如果可及)和外周循环中其他生物活性(例如凋亡和免疫细胞浸润)方面的免疫
学效果，并且将免疫学和其他生物参数的改变与前面活化配体剂量和肿瘤反应相关联。
[0891] 4.评价进入肿瘤细胞和进入肿瘤中树突细胞和巨噬细胞的AD-RTS-IL-12的摄入程度，以决定哪种细胞摄取病毒和摄取程度是否依赖于AD-RTS-IL-12的剂量。测定肿
瘤中、肿瘤相关引流淋巴结(如果可及)和外周循环中的炎性反应和免疫反应（细胞的，例
如细胞毒性淋巴细胞和Tregs，和细胞因子的诱导）。免疫学和其他生物活性参数的改变与AD-RTS-IL-12和活化配体剂量和肿瘤反应相关。
[0892] 5.在患者亚组中，评价第8–9天中每个周期稳态期间的药物动力学概况。
[0893] 6.在将要进行PK评估的患者中，评价Holter监控获得的ECG中的QT/QTc间隔。
[0894] 适应症：
[0895] 有至少4个可及损伤的不可切除的III C期(在途)、IV期(M1a、M1b或M1c(LDH≤2xULN)恶性黑素瘤。
[0896] 研究设计：
[0897] 1b期，开放标记，单臂（single arm），安全性、耐受性、肿瘤反应的多中心评价(RECIST 1.1)，和免疫学和其他生物效果，6个治疗周期，每个持续28天，每个联用
Ad-RTS-IL-12的瘤内注射与14天的每天一次活化配体口服剂量。根据图1和表1对所有
耐受前述治疗周期的患者逐步增加AD-RTS-IL-12和活化配体的剂量。
[0898] 研究群体：
[0899] 所有种族的男性和女性，≥18岁，有不可切除的III C期或IV期恶性黑素瘤且ECOG体能状态为0-1，有最少4个可及损伤(最长直径≤3cm;最短直径≥1cm)或可触知
的肿瘤相关淋巴结(最长直径≤5cm;最短≥1.5cm)用以瘤内注射或活检。
[0900] 样品尺寸：
[0901] 有III C期或IV期黑素瘤的最少12和最多28例患者进入这项研究。这个方案中的所有患者会进入单臂，根据图1和表1，每个重复治疗周期中AD-RTS-IL-12和活化配体
的患者内剂量逐步升高，前提是良好耐受前述治疗周期。
[0902] 测试产物：
[0903] 每个周期中，患者用口服活化配体和瘤内注射基因疗法(Ad-RTS-IL-12)联合治疗，所述Ad-RTS-IL-12工程改造成以对活化配体剂量依赖性反应形式表达诱导型hIL-12。
AD-RTS-IL-12在中心生成位点制备，然后冷冻并送至合适的临床基地。所有的患者接受瘤
11
内注射AD-RTS-IL-12(每个周期一次，多至6个循环，间隔4周)(每次注射约1.0x 10 和
12
1.0x 10 总病毒颗粒)。患者也接受每个周期中连续14天的单个每日活化配体口服剂量。
在所有耐受前面治疗周期的患者中，AD-RTS-IL-12和/或活化配体剂量于周期2-6开始时
在患者内逐步升高(见表8)。AD-RTS-IL-12在每个周期注射到不同的损伤中，并且如果损
伤的数目有限，在依序轮转中完成注射。最少四个可及损伤之一没有注射，因为所述损伤会用于评价AD-RTS-IL-12的系统效果。患者给药错开至少24小时间隔。一个周期进行一次
各瘤内注射，在活化配体的第一次剂量后约3小时(±30分种)。
[0904] 剂量：
[0905] 活化配体：最低剂量/天：5mg;中等剂量/天:20mg;最高剂量/天:100mg。每个周期的前14天中给予活化配体。
[0906] Ad-RTS-IL-12：剂量：每次注射在0.5ml无菌溶液的总体积中悬浮约1.0x 1011或12
1.0x 10 病毒颗粒/肿瘤，注射体积分布遍及损伤，特别是肿瘤边缘的区域。
[0907]
[0908] 不开始更高一级剂量水平的治疗，直到确证前面治疗的安全性和耐受性。如果确定MTD，则不会出现进一步的递增。
[0909] 给药途径：
[0910] 活化配体：进餐30分钟内口服摄入软明胶胶囊中的溶液。
[0911] AD-RTS-IL-12：
[0912] 需要时，每个周的第一天注射入一个可及的肿瘤损伤或肿瘤相关(可触知的)引流淋巴结。
[0913] 患者分配的方法：
[0914] 所有患者根据表8接受治疗并且进入一个臂（one arm）。在每个治疗周期中和之后，对所有患者精确评价安全性和耐受性。仅在前面周期治疗耐受时，进行剂量递增。
[0915] 试验持续时间：
[0916] 筛选后，此项研究对每个患者持续约28周。
[0917] 在多至23天用于筛选评价（第-30–第-7天）的阶段后，批准患者参加此项研究。在第-6–第-2天，进行基线活检，和在第0天，在评价PK的患者中完成使用Holter
监控心脏功能的基线评价。在每个周期的第1天，经批准的患者开始接受实验治疗（一次
AD-RTS-IL-12的瘤内注射和一次活化配体的口服剂量）。每个周期的活化配体治疗会持续
总共14天，然后是14天清除并观察安全性。此项研究治疗由6个周期组成，每个持续总共
28天，包含14天的随访。最后一次注射后6周开始治疗后的随访评价（活化配体的最后一
次剂量后4周）。测定血液中的病毒DNA。如果病毒DNA在最后一次注射后6周出现，继续
进一步的病毒DNA评价。然而，如果就每个来源显示Q-PCR的两个连续负结果，不需要更多
的测试。
[0918] 一级终点：
[0919] 通过物理检测(包含ECOG体能状态)、ECG中的QT/QTc间隔(PK患者中)、生命体征、血清化学、尿分析、血液学和任何不利事件的患者报告来评价安全性和耐受性。
[0920] 通过CT扫描评价目标反应和反应速率。
[0921] 二级终点：
[0922] 8个患者的亚组中活化配体的稳态药物动力学(每个AD-RTS-IL-12剂量水平4个)。
[0923] b.作为治疗的结果，肿瘤中、肿瘤相关引流淋巴结(如果可及)和外周循环中炎性反应和免疫反应的程度（细胞的，例如细胞毒性淋巴细胞和Tregs，和细胞因子的诱导）。
[0924] c.免疫学和其他生物活性参数的改变与AD-RTS-IL-12和活化配体剂量和肿瘤反应相关。
[0925] d.也通过PET扫描和照片评价功效。
[0926] e.进行多至5年的长期随访。研究员每年接触患者。
[0927] 纳入标准：
[0928] a.所有种族≥18岁的男性和女性；
[0929] b.源自具有任何肿瘤厚度的原发性皮肤、粘膜或甲下黑素瘤或来自未知主要位点的不可切除的III C期(在途)或IV期黑素瘤(M1a、M1b、M1c，LDH≤2x ULN)；
[0930] c.瘤内注射或活检最少4个可及的非内脏损伤(最长直径≤3cm;最短≥1cm)或可触知的肿瘤相关淋巴结(最长直径≤5cm;最短≥1.5cm)。至少一个损伤不注射。
[0931] d.ECOG体能状态为0或1。
[0932] e.在筛选时或研究开始前30天内，由MRI对比度增强扫描来评价没有可见脑转移的患者；
[0933] f.用研究治疗处理前和重复治疗周期前30天内实验室数据值评价合适的基线血3
液学和器官功能，并且活化配体剂量递增如下：血红蛋白≥10g/L,粒细胞>2500/mm,淋巴
3 3
细胞>1000/mm,血小板>100,000/mm,血清肌酸酐<1.5x ULN,AST,ALT,碱性磷酸酶<2.5x
3
ULN,LDH≤2xULN,血清胆红素<1.5x ULN,绝对嗜中性粒细胞>500/mm;
[0934] g.在研究员看来，预期至少约6个月的存活(主要由体能状态评价)；
[0935] h.女性必须是绝经后或做过绝育手术或实施有效避孕法；没有做过绝育手术的男性和其伴侣不是绝经后或做过绝育手术的男性必需实施有效避孕法；
[0936] i.通过PT/PTT测量的正常凝结参数；
[0937] j.签字的、IRB-批准的自愿知情同意书。
[0938] 排除标准：
[0939] a.需要特定治疗的活性、急性病毒、细菌或真菌感染；
[0940] b.HIV-感染，因为考虑到引起有效免疫反应的能力；
[0941] c.需要类固醇(>10mg泼尼松龙或相当)或其他免疫抑制治疗的活性自体免疫疾病；
[0942] d.在筛选时（或在研究开始前30天内）有可检测脑转移的患者，由MRI对比度增强扫描评价；
[0943] e.有损伤>3cm(LD)或可触知的肿瘤相关淋巴结>5cm(LD)的患者；
[0944] f.血红蛋白<10g/L的患者；
[0945] g.如果LDH>2x ULN，出现IV期内脏转移或其他远端转移；
[0946] h.先前用AD-RTS-IL-12或活化配体治疗的患者；
[0947] i.先前用瘤内基因治疗处理的患者。
[0948] J.器官同种异体移植的受体；
[0949] k.除了其他皮肤癌症以外，其他并发的临床活性恶性疾病；
[0950] l.自完成前面化疗、激素治疗、放疗、免疫治疗或任何一线治疗后过去少于30天(研究用药的第一剂量前)；
[0951] m.临床显著脑血管疾病；
[0952] n.严重心功能不全(纽约心脏协会III或IV级)或冠心病史或者并发的严重心功能不全或冠心病；
[0953] o.急性医疗情况，例如认为是不可接受的麻醉剂或手术危险的缺血性心脏或肺部疾病；
[0954] p.出血或凝血障碍病史或者并发的出血或凝血障碍；
[0955] q.平行的免疫抑制治疗，例如皮质类固醇(>10mg泼尼松龙或相当)和环孢菌素A；
[0956] r.平行的研究治疗或过去30天内用任何研究治疗处理(研究用药的第一剂量前)；
[0957] s.通过CYP4503A4通路代谢的同时用药；
[0958] t.泌乳或怀孕的女性；
[0959] u.有可与任何产物组分相关的过敏症史的患者，所述组分如可以与活化配体相关的包含两个苯环的苯甲酸；
[0960] v.在研究员看来会不可接受地降低所提议治疗的安全性或递送或可以排除获得自愿知情同意书的任何医疗或精神状况。
[0961] 统计方法：
[0962] 对象反应(CR+PR)是基于通过CT扫描的已注射和未注射肿瘤损伤以及可触知的肿瘤相关淋巴结的大小变化[使用实体瘤响应评价标准(RECIST1.1)]。PET扫描和/或照
片会用于分别评价代谢活性或大小的变化(皮肤损伤)。
[0963] OS和ORR的初级分析会包含置信区间，并且当样品大小达到12、16、20、24个患者和在最后患者的治疗后6周开始。
[0964] 在随访结束时，描述性分析人口统计学、免疫学和生物活性测量以及包含不利事件率和实验室值在内的安全性参数。所述结果概括在表格、图和患者-患者列表中。
[0965] 描述统计包含平均值、中值、标准偏差和柱状图，用于概括连续测量。频率计数用于分类变量，包含对象肿瘤反应。免疫学和生物活性与抗肿瘤效果相关。这些统计学由层来提供(肿瘤损伤的大小:≤1cm最大直径[LD],>1cm LD;相关DLN的大小:≤3cm LD,>3cmLD;损伤的定位:内脏，非内脏;损伤的注射状态:注射的，非注射的)。在各处理周期结
束时并总体进行统计。对总体分析而言，观察跨层但不跨周期合并。
[0966] 顺应性：
[0967] 试验按照目前的良好药品临床试验规范（Good Clinical Practice(cGCP)）进行。
[0968] 文献
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