本发明涉及在植物和包括营养贮藏器官的植物部分中控制芽形 成的方法。

马铃薯块茎在经济上非常重要。它们代表许多食物的碳水化合 物资源，并且做为各种加工产品的基础使用。除了淀粉之外，块茎 含有高质量的蛋白质、大量的维生素、矿物质和痕量元素。在种植 马铃薯的大多数地区都不可能全年持续生产马铃薯块茎。因此需要 储存收获的块茎。

储存期间潜在的最具破坏性的现象之一是早熟发芽。长期储存 涉及冷却、强制通风和使用化学发芽抑制剂。与长期储存直接相关 的问题是多方面的。

冷却是抑制发芽的方法之一，在北欧通常通过用室温的空气通 风进行冷却。除了相关的费用之外，于4℃长期冷却导致冷甜化和 黑化(变深)的问题。

目前，化学发芽抑制剂是拟用于加工和新鲜消费的马铃薯抑制 发芽的唯一可能，因为低温储存导致不能接受的还原糖积累。但是， 近年来产生了诸如氯化烃的化学抑制剂对环境和营养的影响的问 题。因此确实需要替代方法以控制诸如块茎的营养贮藏器官的发芽。

延迟发芽的一个替代途径是使用具有延长的休眠期的转基因植 物。马铃薯块茎的发芽涉及几个独立的步骤，这些步骤可能是遗传 工程的目标。第一个步骤以淀粉为主的储备的活动化。淀粉降解在 造粉体中发生，由淀粉磷酸化酶和/或淀粉酶介导。在淀粉降解后的 下一步骤中，必须将产生的己糖和/或磷酸己糖从造粉体输出。产生 的己糖和磷酸己糖在转移入细胞溶胶后就分布于糖酵解和蔗糖合成 之间。第三个步骤是在细胞溶胶中形成蔗糖。蔗糖合成依赖于能量， 因此需要进行糖酵解和呼吸。第四个步骤是将蔗糖运输至发育的芽。 最后，输入的蔗糖在所述芽中被利用以支持生长和发育。

我们已经开发了在营养贮藏器官中控制发芽的方法，使得可以 关闭或启动发芽，且没有任何诸如产量降低的不需要的副作用。该 新方法涉及导致破坏发芽的基因的定向表达与在需要时恢复发芽的 基因开关技术的结合。

按照本发明的第一个方面，提供在植物中选择性的诱导或抑制 发芽的方法，该方法包括通过转化将DNA构建物整合并最好稳定地 整合入所述植物的基因组，所述DNA构建物包含一个第一多核苷酸 序列和一个第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一 个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可操作地 连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可控制的 启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并可选地与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的 DNA序列在源自所述转基因植物的营养器官的休眠期间表达，导致 有效地抑制发芽，并且所述抑制被通过外部使用诱导物质从所述可 控制启动子区诱导所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表达而中 和，使得所述营养贮藏器官发芽的恢复取决于该诱导物的使用。

本文使用的术语“组织或器官选择性启动子区”指那些在所需 组织或器官中产生目的DNA序列的优先表达的启动子区。

对于所述转化的宿主而言，所述DNA构建物中的DNA序列可 以是内源的或异源的。

可以用于本发明控制发芽的方法的DNA序列的实例包括那些 DNA序列，所述DNA序列编码参与休眠期中储备活动化诸如储存 化合物降解的蛋白质，例如在淀粉降解中的蛋白质，即淀粉磷酸化 酶、淀粉酶(例如α或β淀粉酶)和麦芽糖酶；例如糖酵解和后续代谢中 的蛋白质，例如果糖磷酸激酶、己糖激酶；蔗糖生物合成中的蛋白 质，例如蔗糖合酶；休眠期中储备运输中例如在韧皮部装入中的蛋 白质，例如ATP酶；在长距离韧皮部运输中和韧皮部卸出中的蛋白 质，例如无机焦磷酸化酶(iPPase)；和在休眠期中储备的利用中诸如 同化物降解中的蛋白质，例如在生长的芽中蔗糖的降解的蛋白质， 即转化酶；和在同化物利用中例如利用蔗糖衍生的代谢物以提供芽 形成所需的能量，例如编码参与线粒体功能的蛋白质的DNA序列， 诸如呼吸中的蛋白质诸如线粒体酶和诸如转运蛋白的运输蛋白，例 如腺苷酸转运蛋白(ANT)和苹果酸氧化戊二酸转运蛋白(MOT)和其诸 如解偶联蛋白的抑制剂。有用的DNA序列的实例亦包括参与马铃薯 发芽的任何其它序列。

可以用于本发明控制发芽的方法的优选DNA序列的实例，包括 那些导致产生参与马铃薯发芽和线粒体功能(诸如呼吸)中的活动化和/ 或蔗糖利用的蛋白质的有义、反义或部分有义序列，和/或编码所述 蛋白质的有义、反义和部分有义序列。

特别优选的DNA序列的实例包括那些编码源自植物、细菌或真 菌源(例如来自酵母)的转化酶、源自植物、细菌或真菌源的焦磷酸酶 和源自植物、细菌或真菌源的诸如MOT和ANT的参与线粒体功能 的蛋白质的序列，在下文描述。

可以以各种途径实现抑制发芽。所述第一DNA序列可以在所述 营养贮藏器官休眠期表达，并在需要发芽是被减量调节。当需要发 芽时，所述第二DNA序列的表达被启动，导致第一DNA序列的减 量调节，由此恢复发芽。

可以使用本领域众所周知的方法实现所需DNA序列的减量表 达，诸如例如使用阻抑蛋白、有义、反义、部分有义和表达互补蛋 白。合适的操纵基因/阻抑蛋白系统的实例包括例如lac、tet或λ434 系统和其突变型，诸如Lac IΔ His突变型(Lehming，N.，Sartoris，J.， Niemoeller，M.，Geneger，G.，v.Wilcken-Bergman，B.和Muller-Hill， Benno(1987)，EMBO J.6(10)3145-3153-其中所述突变型在Lac I的 氨基酸17有一个变化，将酪氨酸变为组氨酸)。或者，可以使用 AmpliconTM减量调节基因(Angell，S.M.，Baulcombe，D.C.，(1997)16， 3675-3684)。在这方面，使用其中插入了转基因的复制型马铃薯病毒 (PVX)RNA的cDNA，藉此与该转基因有同源性的瞬时表达的RNA 被抑制。

或者，第一多核苷酸序列中的DNA序列的表达可以导致产生有 义、反义或部分有义序列，这些序列起作用抑制参与发芽的基因或 参与AmpliconTM表达的基因。在这种情况下，通过启动第二多核苷 酸序列中的DNA序列的表达恢复发芽，所述表达导致产生所述蛋白 或其对应蛋白，所述蛋白的产生被第一DNA序列中的有义、反义和 部分有义序列所抑制。亦可以利用合适的操纵基因/阻抑蛋白系统恢 复发芽。

如果所述构建物中的任一个或两个多核苷酸序列包含超过一个 DNA序列，则最好它们不相同，以避免任何共抑制效应。

第一多核苷酸序列中的DNA序列的表达在组织或器官选择性启 动子的控制之下，以确保所述DNA序列的定向表达，藉此以器官或 组织特异性方式诱导表达。组织选择性启动子的实例包括韧皮部选 择性启动子，例如rolC启动子，器官选择性启动子的实例包括块茎 特异性启动子，诸如patatin启动子。特别优选使用诸如rolC和块茎 启动子的组织或器官选择性启动子。

所述构建物的第二多核苷酸序列中的DNA序列在可控制启动子 区的控制之下。

本文使用的术语“可控制启动子区”包括可以被化学诱导的启 动子。最特别优选使用由外源化学刺激物的使用控制的启动子序列。 所述外源化学刺激物优选为农业可接受的化学药品，使用该化学药 品与农业实践相匹配，并且对植物或哺乳动物无害。

所述可控制启动子区最优选包含一个诱导型开关启动子系统， 诸如例如双组分系统，例如我们的公开国际专利申请WO 93/21334 中描述的alcA/alcR基因开关启动子系统；我们的公开国际专利申请 WO 90/08826和WO 93/031294中描述的GST启动子；我们的公开 国际专利申请WO 96/37609中描述的蜕皮激素开关系统，其内容通 过引用结合到本文中。本文将这种启动子系统称为“开关启动子”。 与所述开关启动子结合使用的开关化学药品是农业可接受的化学药 品，使得该系统对本发明的方法特别有用。在alcA/alcR启动子开关 系统的情况下，优选的化学诱导物是或者液体或者更优选的蒸汽形 式的乙醇。使用乙醇蒸汽的主要优点之一是仅需要小量的乙醇，并 且达到高水平的表达。在以上刚刚列出的专利申请中提供了开关化 学药品的详情。

可以使用的合适的转录终止子亦是本领域众所周知的，包括例 如胭脂氨酸合酶终止子和章鱼氨酸合酶终止子。所述启动子最好是 晚期块茎启动子，该启动子在休眠期的晚期即在即将发芽之前有活 性。

用于本发明的方法的可控制启动子区最好是GST或alcA/alcR 启动子开关系统。最好使用本文详细描述的可开关反义或可开关有 义或部分有义物的方法，或者通过使用AmpliconTM，或利用合适的 操纵基因/阻抑蛋白系统的方法，达到恢复发芽。在我们的国际专利 申请WO 91/08299(其内容通过引用结合到本文中)描述了由部分有义 共抑制引起的基因活性的减量调节，必要时通过使用源自不同生物 体的基因序列可以避免这种情况。

按照本发明的第二个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的 DNA序列编码参与蔗糖活动化和/或利用的蛋白质，所述第二多核苷 酸序列包含的DNA序列对于所述蛋白质是有义、反义或部分有义序 列，或者包含可以引起对所述蛋白质的抑制的DNA序列。

按照本发明的第三个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含编 码参与蔗糖活动化和/或利用的蛋白质的第一DNA序列，并且还包含 编码与所述第一DNA序列可操作地连接的操纵基因序列的DNA序 列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列编码可以与所述操纵基 因序列结合的阻抑蛋白。

按照本发明的第四个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的 DNA序列对于参与马铃薯发芽的蛋白质是有义、反义或部分有义序 列，或者包含的DNA序列可以引起抑制参与马铃薯发芽的蛋白质， 所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列编码参与马铃薯发芽的蛋白 质。

按照本发明的第五个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的 第一DNA序列对于参与马铃薯发芽的蛋白质是有义、反义或部分有 义序列，或者包含可以引起抑制参与马铃薯发芽的蛋白质的DNA序 列，还包含编码与所述第一DNA序列可操作地连接的操纵基因序列 的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列编码可以与 所述操纵基因序列结合的阻抑蛋白。

按照本发明的第六个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的 DNA序列对于参与线粒体功能的蛋白质是有义、反义或部分有义序 列，或者包含可以引起抑制参与线粒体功能的蛋白质的DNA序列， 所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列编码参与线粒体功能的蛋白 质。

按照本发明的第七个方面，提供包含一个第一多核苷酸序列和 一个第二多核苷酸序列的DNA构建物，所述第一多核苷酸序列包含 至少一个与组织或器官选择性启动子区和可选地与转录终止子区可 操作地连接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可 控制的启动子区可操作地连接并受该启动子区控制、并与转录终止 子区可操作地连接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的 第一DNA序列对于参与线粒体功能的蛋白质是有义、反义或部分有 义序列，或者包含可以引起抑制参与线粒体功能的蛋白质的DNA序 列，还包含编码与所述第一DNA序列可操作地连接的操纵基因序列 的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列编码可以与 所述操纵基因序列结合的阻抑蛋白。

我们已经发现以下DNA序列的组合特别适用于本发明的方法： 通过将编码转化酶的DNA序列置于韧皮部选择性启动子诸如rolC启 动子的控制之下，可以将所述DNA序列的表达定向至韧皮部并且有 效地抑制发芽，然后可以通过使用alcA/alcR化学开关启动子启动编 码转化酶反义的DNA序列恢复发芽。叶子韧皮部中的蔗糖浓度是如 此之高，以至于转化酶表达的效应被有效地压倒，避免了任何不想 要的副作用。这与芽韧皮部的情况形成对比，在芽韧皮部中转化酶 的表达具有显性效应，结果使得蔗糖被降解，发芽被有效地抑制。

再一有用的组合是在块茎启动子控制之下的编码无机焦磷酸酶 (iPPase)的DNA序列。蔗糖的摄取和在韧皮部中的运输是一个需能 过程，通过表达编码无机焦磷酸酶的DNA序列抑制能量的提供，可 以抑制摄取过程。通过使用例如alcA/alcR化学诱导开关启动子启动 编码与iPPase反义、有义或部分有义的序列的DNA序列，可以逆转 这种抑制，恢复发芽。使用组织或器官特异性启动子再一次确保对 蔗糖摄取和在韧皮部中运输的抑制不在整个植株中发生，而仅在块 茎中发生，由此消除了在所述植株中的任何有害效应。

在这二种情况下，恢复发芽的替代方法是通过使用AmpliconTM， 其中与转基因享有同源性的瞬时表达的RNA被抑制。这种转基因可 以例如是转化酶或iPPase的cDNA。恢复发芽的再一替代方法是通 过使用合适的操纵基因/阻抑蛋白系统。

我们亦发现，通过选择性地抑制块茎中芽生长和发育所需的能 量的提供，可以抑制发芽而且没有任何不想要的副作用，即将编码 与编码参与线粒体功能的蛋白质的DNA序列有义、反义或部分有义 的DNA序列置于块茎选择性启动子的控制之下，所述蛋白质例如腺 苷酸转运蛋白(ANT)或线粒体氧化戊二酸转运蛋白(MOT)。或者，可 以使用引起这种蛋白质的抑制的DNA序列。可以实现这种抑制的逆 转的一种方法是启动第二DNA序列的表达，第二DNA序列的产物 与第一DNA序列互补，例如可以使用编码源自不同来源(最好源自 拟南芥属(Arabidopsis))的ANT的DNA序列，以抵消所述ANT反义 表达的效果。在MOT的情况下，合适的互补序列可以是由Taniguchi 和Sugiyama在Plant Molec.Biol.30，51-64(1996)中描述的源自黍 (Panicum miliaceum)的序列。或者，可以使用合适的操纵基因/阻抑蛋 白系统逆转抑制。如上所述可以使用alcA/alcR化学开关启动子。这 里更详细地描述上述实例。

按照本发明的一些实施方案，第一多核苷酸序列包含再一个编 码与第一DNA序列可操作地连接的操纵基因序列的DNA序列，第 二多核苷酸序列包含编码可以与所述操纵基因序列结合的阻抑蛋白 的DNA序列，它处于开关启动子的控制之下，使得使用诱导物时导 致编码所述阻抑蛋白的DNA序列的表达，该阻抑蛋白接着就与所述 操纵基因结合，则第一多核苷酸序列中的第一DNA序列的表达被关 闭。这种系统的实例是乳糖操纵子和阻抑蛋白，如公开的国际专利 申请WO 90/08830中所述。其它实例包括四环素和λ434操纵基因/阻 抑蛋白系统。

可以按照各种已知方法用重组DNA构建物转化植物细胞，所述 方法例如农杆菌Ti质粒、电穿孔、微注射和使用微粒枪。然后可以 在合适的情况下将转化的细胞再生成完整的植株，其中新的核酸物 质已经整合、最好是稳定地整合入其基因组。以此方法可以得到转 化的单子叶和双子叶植物。

按照本发明的第八方面，提供用上述任何一种DNA构建物转化 的植物细胞。

按照本发明的第九方面，亦提供用按照本发明的上述方面的DNA 构建物转化的完整植株，其中所述DNA构建物被整合、最好是稳定 地整合入所述植株的基因组。

按照本发明的第十方面，本发明再包括前述段落的植株的后代 以及这种植株和这种后代的种子和块茎，所述后代包含整合入、最 好是稳定地整合入其基因组的按照本发明的上述方面的DNA构建 物。

本发明的方法特别适用于控制马铃薯块茎发芽。

在优选实施方案中，本发明提供在马铃薯中选择性诱导或抑制 发芽的方法，包括通过转化将DNA构建物稳定地整合入所述马铃薯 的基因组，所述DNA构建物包含一个第一多核苷酸序列和一个第二 多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一个与组织或器官 选择性启动子区和可选地与转录终止子区可操作地连接的DNA序 列，所述第二多核苷酸序列包含至少一个与可控制的启动子区可操 作地连接并受该启动子区控制、并可选地与转录终止子区可操作地 连接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源 自所述转基因植物马铃薯的块茎的休眠期间表达，导致有效地抑制 发芽；所述抑制通过外部使用诱导物质从所述可控制启动子区诱导 所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表达而被中和，使得所述块 茎发芽的恢复取决于该诱导物的使用。

我们亦鉴别了五种我们认为在本发明的方法中特别有用的特别 优选的DNA序列。我们在块茎储存期间诱导时鉴别了这些DNA序 列，并将其命名为16-3(序列2)、16-8(序列-3)、10-1(序列4)和AC4 (序列5)、M-1-1(MOT)(图19中的序列)和MOT变异体(序列6，EMBL 储存号码为X99853)。在所附的实施例中全面描述了所述DNA序列 及其分离。因此按照再一方面，本发明提供在按照本发明的控制植 物发芽的方法中源自克隆16-3、10-1、AC4、16-8、M-1-1和MOT 变异体的全部或部分DNA序列的用途。

相信16-3、16-8、AC4和M-1-1的DNA序列是新颖的，本发明 的第十二方面扩展至包含以下核苷酸的多核苷酸：序列2(对应于16- 3)中的核苷酸1-870、序列3(对应于16-8)中的核苷酸1-712或序列5 (对应于AC4)中的核苷酸1-386或图19序列(对应于编码MOT的M- 1-1)中的核苷酸1-1351，本发明的第十二方面再扩展至由这些核苷酸 序列编码的蛋白质产物，且扩展至具有与所述产物大致类似活性和 具有至少85％氨基酸序列类似的那些蛋白质。类似程度优选为至少 90％，类似程度更优选为95％，类似程度最优选为97％。

所述多核苷酸的特别优选的实施方案包括序列2中的核苷酸55- 751、序列3中的核苷酸87-473、和图19中的核苷酸192-1164，及 其编码的翻译产物和具有与所述产物大致类似活性和具有至少85％ 氨基酸序列类似的那些蛋白质。类似程度优选为至少90％，类似程 度更优选为95％，类似程度最优选为97％。

本文使用的术语“类似程度”用来指那些序列，当进行序列对 比时，在同样的位置或区具有类似的(相同或保守置换的)氨基酸，相 同或保守置换的氨基酸是那些与起始蛋白质相对比不改变所述蛋白 质的活性或功能的氨基酸。例如，相互之间具有至少85％同源性的 两个氨基酸序列当最多允许三个缺口(gap)而进行最佳对比时，在同 样的位置具有至少85％的相似性(相同或保守置换的氨基酸残基 (amido residue))，前提是，所述缺口最多影响不超过15个氨基酸残 基。类似程度可以使用本领域众所周知的方法确定(参见，例如，Wilbur， W.J.和Lipman，D.J.“核酸和蛋白质数据库的快速相似性检索” Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80，726-730(1983) 和Myers E.和Miller W.“线性空间中的最佳序列对比”，Comput. Appl.Biosci.4：11-17(1988))。可以用于确定类似程度的一个程序是 MegAlign Lipman-Pearson一对方法(使用缺省参数)，该程序可以从 DNAstar Inc，1228，Selfpark Street，Madison，Wisconsin，53715，USA做 为Lasergene系统的一部分而得到。

按照本发明的第十三方面，提供其编码的蛋白质具有与由序列 2、3和5和图19中提供的核苷酸编码的蛋白质大致相似活性的多核 苷酸序列，该多核苷酸与当在低、高严格条件下或在低、高严格条 件之间温育时仍然与序列2、3或5或图19中提供的序列所包含的 序列杂交的多核苷酸互补。一般而言，低严格条件可以定义为约室 温至约65℃下的3×SSC，高度严格条件定义为约65℃下的0.1× SSC。SSC指缓冲液0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，3×SSC的强 度是SSC的三倍，0.1×SSC的强度是SSC的十分之一。

本发明再提供其编码的蛋白质具有与以下核苷酸编码的蛋白大 致相似活性的多核苷酸序列：序列2中的核苷酸55-751、序列3中 的核苷酸87-473、或图19中的核苷酸192-1164，该多核苷酸与当在 低、高严格条件下或在低、高严格条件之间温育时仍然与序列2中 的核苷酸55-751、序列3中的核苷酸87-473包含的序列杂交或与图 19中的核苷酸192-1164杂交的多核苷酸互补。一般而言，低严格条 件可以定义为约室温至约65℃下的3×SSC，高度严格条件定义为约 65℃下的0.1×SSC。SSC指缓冲液0.15MNaCl，0.015M柠檬酸三钠， 3×SSC的强度是SSC的三倍，0.1×SSC的强度是SSC的十分之一。

描述于序列2、3和5和图19中的按照本发明的多核苷酸可以 可操作地连接至启动子区，该启动子区对于所述多核苷酸可以是同 源的或异源的，本发明扩展至这种构建物。本发明亦扩展至包含所 述多核苷酸的DNA构建物，该多核苷酸再包含编码可以将所述多核 苷酸的翻译产物定向至所需细胞或亚细胞位置的肽的一个区。本发 明再提供包含优选地可操作地连接至启动子区并可选地连接至转录 终止子和或如上述的定向序列的如序列2、3、5和图19描述的所述 多核苷酸序列的载体。

本文提供的16-3、16-8、10-1、AC-4、M1-1和MOT变异体的 序列是cDNA序列，按照本发明的再一方面可以用作探针，以从基 因组文库分离和鉴别含有天然启动子区的5’区上游的序列。然后可 以鉴别、分离和测序所述启动子区。

按照本发明的第十五方面，提供用包含如序列2、3和5和图19 所述的多核苷酸序列的DNA构建物或者包含所述多核苷酸序列的上 述载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞优选为如前述的植物细胞， 并且本发明亦扩展至已在其基因组中整合、最好是稳定整合如上述 的多核苷酸序列、DNA构建物或载体的完整植株以及所述植株的种 子、块茎和后代。

按照本发明的第十六方面，提供包含多核苷酸序列的DNA构建 物，所述多核苷酸序列包含一个开关启动子系统，该启动子系统可 操作地连接至包含有义、反义或部分有义转录构建物的多核苷酸序 列，其中当从所述开关启动子开启所述多核苷酸序列的表达时，产 生所述有义、反义或部分有义序列的表达，导致编码转基因的再一 多核苷酸序列表达的减量调节。

在第十七方面中本发明提供控制转基因表达的方法，包括：用 二种DNA构建物转化宿主细胞，所述第一种DNA构建物包含一个 可操作地连接至包含有义、反义或部分有义转录构建物的多核苷酸 序列的开关启动子系统，再一种DNA构建物包含一个编码转基因的 编码序列；控制从所述开关启动子表达所述多核苷酸序列，使得产 生的所述有义、反义或部分有义构建物的表达导致所述转基因的表 达的减量调节。

本文使用的术语“转基因”用于指对于转化的宿主细胞是外源 的或异源的基因。

在上述方面的优选实施方案中，本发明提供DNA构建物，所述 构建物包含可操作地连接至包含有义、反义或部分有义转录构建物 的多核苷酸序列的alcA/alcR开关启动子。

本发明亦扩展至包含按照本发明上述方面的所述DNA构建物的 载体。

按照本发明的第十八方面，提供用包含多核苷酸序列的DNA构 建物转化的宿主细胞，所述多核苷酸序列包含一个可以通过施用的 化学刺激物启动的开关启动子，该启动子系统可操作地连接至包含 有义、反义或部分有义转录构建物的多核苷酸序列，其中当从所述 开关启动子开启所述多核苷酸序列的表达时，产生所述有义、反义 或部分有义序列的表达，导致编码转基因的再一多核苷酸序列表达 的减量调节。

所述宿主细胞最好是前述的植物细胞，本发明亦扩展至由其衍 生的、已在其基因组中整合、最好是稳定地整合了上述多核苷酸序 列、DNA构建物或载体的完整植株，本发明亦扩展至所述植株的种 子、块茎和后代。

使用开关启动子系统控制所述有义、反义或部分有义构建物的 表达有许多用途。对于其表达会产生致死或抑制效应的基因，使用 可开关的有义、反义或部分有义物可以控制该基因的减量调节，以 便于鉴别合适的除草剂靶。亦可以使用采用有义、反义或部分有义 序列的可开关减量调节鉴别细胞脱离(cell ablation)的机制。

按照第十九方面，本发明因此提供可能是与除草剂相互作用的 合适靶位点的鉴别方法，包括以下步骤：用多核苷酸序列转化植物， 所述多核苷酸序列包含可以影响所述靶位点DNA表达的第一DNA 序列，其中所述第一DNA序列的表达在开关启动子的控制之下；控 制从所述开关启动子的所述DNA序列的表达，使得编码除草剂靶位 点的DNA的表达被减量调节，并且确定所述减量调节对所述植株生 存力的影响。

将要监测的影响的类型包括靶位点的减量调节必须维持的时 间、需要的减量调节水平，以得到的结果为基础，可以决定所述靶 位点是否合适作为除草剂靶位点。

我们极其意外地发现，STLS-1叶启动子序列以块茎中基因表达 的增强子起作用，使用STLS-1序列做为块茎中基因表达的增强子形 成了本发明的再一方面。

在第二十方面中，本发明提供增强块茎中基因表达的方法，包 括用多核苷酸序列转化块茎植物细胞，所述多核苷酸序列包含连接 至再一启动子区的编码全部或部分STLS-1叶启动子的DNA序列。

STLS-1叶启动子是本领域中已知的(Eckes等(1986)Mol.Gen. Genet.205，14-22)，在所附的实施例中进行描述。全部或部分编码 STLS-1叶启动子的DNA序列可以用作按照本发明的增强子。使用 本领域众所周知的技术可以鉴别STLS-1的活性片段，所述技术诸如 限制酶消化，接着进行由此所获片段的基因表达增强的分析。该 STLS-1启动子序列可以插入在所述再一启动子区的或者上游即5’ 端或者下游即3’端。特别优选将所述STLS-1序列插入在所述启动 子区的上游。在本发明此方面的特别优选实施方案中，将所述STLS- 1序列插入在35S CaMV启动子的上游。

在第二十一方面中，本发明提供源自转基因植物的用化学诱导 物处理才发芽的块茎，最好是马铃薯块茎。

按照本发明的第二十二方面，提供多核苷酸序列，该多核苷酸 序列包含图25、26或27中所描述序列中的至少一个的全部或部分 序列，还提供与描述于图25、26或27中的序列功能相同的多核苷 酸，该多核苷酸与当在低、高严格条件下或在低、高严格条件之间 温育时仍然与图25、26或5或27中提供的序列所包含的序列杂交 的多核苷酸互补。这种序列最好是块茎特异性启动子。

按照本发明的第二十三方面，提供控制植物或其部分的基因表 达的方法，包括用化学诱导型植物基因表达盒转化植物细胞，该表 达盒包含可操作地连接至源自alc R基因的调节基因序列的第一启动 子和可操作地连接至靶基因的源自alc A基因的可控制启动子，其中 该可控制启动子在存在乙醇蒸汽时由调节蛋白激活，由此引起所述 靶基因表达。

现在通过以下非限制性实施例描述本发明，并用附图做为参考， 其中：

图1：显示质粒pBIN-IN8构建图解。

图2：显示质粒PPA-2的结构图。

图3：显示野生型(Desiree)和具有韧皮部特异性胞质转化酶的转 基因马铃薯植株(基因型DIN-87、DIN-90和DIN-30)在黑暗中于室温 延长储存后的照片。

图4：显示使用抗无机焦磷酸酶的抗体进行的对照植株和PPaII- 2、-3和-5和PPaI-2和PPaI-55的马铃薯块茎蛋白提取物的蛋白印迹 分析。泳道1和2是来自两个不同块茎的样品。

图5：显示从野生型和转基因植株收获的块茎在黑暗中于室温储 存5个月后的照片。 A：野生型对照(Desiree)；B：转基因植株PPaII-2；C：转基因植株 PPaII-3；D：转基因植株PPaII-5。

图6：显示：A：质粒pJIT 166图解

           B：pAGS/pUC GUS报道基因构建物图解

图7：显示质粒AlcR/AGUS的图谱

图8：将组织培养生长的马铃薯植株转移至温室中。于2.5升花 盆中栽培8周后，通过用50ml 5％乙醇溶液给所述植株浇水三次(第 0、1和2天)，诱导Alc表达。首次诱导后第4天，收获匍匐茎和发 育的块茎，使用组织化学染色程序展现GUS活性。0天：诱导前；4 天，首次诱导后4天显示茎、根和匍匐茎中的alc：GUS活性的组织化 学检测。 1：未诱导的匍匐茎，2：膨胀的块茎；3：发育的块茎和4：成熟块 茎。 图9：显示乙醇蒸汽处理后组织化学检测alc：GUS活性后的马铃薯块 茎照片。 A：0天，B：3天，C：7天，D，未处理的对照，E，处理后7天。

图10：显示质粒pGSTTAK图谱。

图11：显示GST-GUS转化的植株在含有0％■、0.4％ 、2.0％ □和10％ R-25788的MS培养基上培养14天后的完全发育叶的 GUS活性直方图分析。

图12：显示质粒SQ03构建图解。

图13：显示质粒SQ-01构建图解。

图14：显示质粒SQ-02构建图解。

图15：显示马铃薯ANT克隆图解。

图16：显示马铃薯块茎于室温储存时UBL-、GTP-结合-、AC-4- 和16-8-特异性转录物的积累。

图17：显示发芽块茎的不同区域的UBL-、GTP-结合、16-8-， 和MOT特异性转录物的积累。

图18：显示反义MOT构建物构建图解

图19：显示编码分离自马铃薯的MOT的DNA序列。

图20：显示由克隆M-1-1(MOT)编码的蛋白质与黍线粒体氧化 戊二酸之间的序列同源性。

图21：显示将lac操纵子序列克隆入RolC-转化酶质粒的策略。

图22：显示将Lac I克隆入Alc开关双载体和连接入RolCopINV 的策略。

图23：显示通过PCR分离UBL-1启动子。

图24：显示通过PCR分离MOT-启动子。

图25：显示UBL-1启动子核酸序列。

图26：显示MOT3启动子核酸序列。

图27：显示MOT6启动子核酸序列。

图28：显示CAT检测用乙醇源封住24小时的植株的ALC-CAT 烟草叶。各列上面的数字代表ng乙醇/ml液面上空间。

图29：显示乙醇诱导后35S-Alc-GUS马铃薯块茎中CUS RNA 转录物的动力学。外部指所述马铃薯块茎皮下1-3mm的部分，所述 马铃薯的剩余部分称为内部部分。在用橡胶密封的40升塑料箱中进 行诱导1周。乙醇浓度是0.02％气相(8ml 96％乙醇/40升)，向每个槽 中加入20μg总RNA。

图30显示用1％乙醇诱导的35S-Alc-GUS马铃薯块茎中GUS转 录物的动力学和活性。

实施例 I.芽抑制的范例 1.通过表达韧皮部特异性转化酶抑制马铃薯块茎发芽 1.1.构建质粒pBIN-RolC

按照制造商的说明书(Perkin Elmer，Ueberlingen，德国)通过聚合 酶链式反应(PCR)克隆发根农杆菌的rolC启动子。PCR循环(40个循 环)的温度分布型如下：95℃ 1分钟、45℃ 1分钟和72℃ 2分钟。使 用标准程序(Sambrook等，A Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)，从携带质粒pABC002的发根农杆菌 (Schmülling等，Plant Cell 1，665-670(1989))分离含有所述rolC启动 子的质粒DNA。基于rolC启动子片段的已发表序列(Slightom等，J. Biol Chem 261(1)108-121，1986)，合成合成寡核苷酸。引物序列是： 5’-rolC引物d(GGAATTCGATACGAAAAAGGCAAGTGCC AGGGCC)和3’-rolC引物d(CCCATG GTACCCCATAACTCGAA GCATCC)。将扩增的DNA克隆入PCR载体pCR1000TM(Invitrogen， Norwalk，CT)。为排除PCR循环中扩增DNA的突变，使用双脱氧法 对所述克隆测序。然后通过使用包含于所述PCR引物中的EcoRI的 5’-限制位点和Asp718的3’-限制位点，通过rolC启动子置换35S 花椰菜花叶病毒启动子序列(Franck等，Cell 21 285-294(1980))，将 1150-bp启动子片段克隆入植物表达盒pBINAR(Hfgen和Willmitzer Plant Sci.66，221-230 1990)。最终的构建物是基于双载体pBin19 (Bevan，Nucl Acid Res 12，8711-8721(1984))。产生的质粒含有rolC启 动子和章鱼氨酸合酶多聚腺苷酸化信号(Gielen等，EMBO J 3，835-846 1984)。 1.2.构建质粒pBIN-IN8(图1)

为获得酵母Suc 2基因的截短形式，进行PCR以从质粒PI-3- INV(von Schaewen等EMBO J 9 3033-3044，(1990))扩增转化酶基因， 该PCR使用了寡核苷酸5’-Suc2 d(GAGCTGCAGATGGCAAACGA AACTAGCGATAGACCTTTGGTCACA)和3’-Suc2 d (GAGACTAGTTTATAACCTCTATTTTACTTCCCTTACTTGGAA)。 将所述PCR产物用PstI/SpeI消化，克隆入质粒YIP128A1的PstI/XbaI 位点，产生质粒181A1-INV(Riesmeier等，EMBO J.11 4705-13 (1992))。为在转化酶基因的两端均得到BamHI位点，用PstI/BamHI 消化质粒181A1-INV，将转化酶片段连接入载体pBlueSK-产生质粒 pBlue-Suc2A。接着，将质粒pBlue-Suc2A用SpeI/EcoRV消化，用DNA 聚合酶平端化，并克隆入pBlueSK-的SmaI位点，产生质粒pBlue- Suc2B。使用质粒pBlue-Suc2B，将转化酶基因做为BamHI片段分离， 并克隆入质粒pBIN-RolC的BamHI位点。产生的质粒(pBIN-IN8)在 rolC启动子和章鱼氨酸合酶多聚腺苷酸化信号(Gielen等，EMBO J.3， 835-46，1984)之间具有所述Suc2基因(核苷酸849-2393)。 1.3.构建物pBIN-IN8的转化

如Hfgen和Willmitzer(Nucl Acid Res.16，9877(1988))所述，用 质粒pBIN-IN8通过直接转化变种Desiree，转化含有pGV2260的根 癌农杆菌菌株C58Cl(Deblaere等，Nuc.Acid Res.13，4777-4788 (1989))。按照Rocha-Sosa等(EMBO J.8，23-29(1989))的方法，完成 马铃薯的转化。在组织培养再生植株的中脉完成增加的转化酶活性 的初步筛选。从75个独立的转化子中选择出三个系(DIN-87、90和30) 做进一步分析。为详细分析，将每种预选择的转化子的十个复制物 转移至温室以产生块茎。 1.4.转化酶活性

转化酶检测。将在液氮中快速冷冻的植物组织在提取缓冲液(50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(Hepes)-KOH，pH 7.4；5mM MgCl2； 1mM EDTA；1mM乙二醇-二(b-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸 (EGTA)；1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)；5mM二硫苏糖醇(DTT)；0.1％ Triton X-100，10％甘油)中匀浆和离心(5分钟，4℃，9000g，Biofuge 13； Heraeus，Hanau，德国)。为检测中性转化酶，该反应混合物在100μl 终体积中含有20mM Hepes-KOH pH 7.5 100mM蔗糖和10-30μl 的所述蛋白提取液。于30℃温育30-60分钟，于95℃终止3分钟。 空白具有相同的反应混合物，但是被热灭活、未进行温育。如Stitt 等所述(Methods Enzymol.174，518-522(1989))测定葡萄糖和果糖。为 检测可溶性酸性转化酶，该反应混合物在100μl终体积中含有20mM 乙酸钠pH 4.7、100mM蔗糖和10-30μl的所述蛋白提取液。于30℃ 温育30-90分钟，为在95℃终止所述反应3分钟之前中和该反应混 合物，加入10μl 1M磷酸钠pH 7.2。空白具有相同的反应混合物， 但是被热灭活、未进行温育。

收获后，将转化的和未转化的马铃薯植株的块茎于20℃储存5 个月。接着测定马铃薯块中的中性和酸性转化酶活性。结果示于表1。 表1：20℃储存5个月的马铃薯块茎中的转化酶活性 基因型              中性转化酶            酸性转化酶 对照                32.7±4.2             18.0±1.3 DIN-87              115.3±6.1            141.2±8.8 DIN-90              93.9±4.7             126.0±6.2 DIN-30              121.5±8.4            174.8±16.5

给出平均值±标准差(n＝4)。以nmol gFW-1min-1表示转化酶活 性。对照是野生型Desiree。 1.5.转化酶对马铃薯块茎中糖积累的影响

测定可溶性糖。收获块茎，将块茎块(60-70mg鲜重，0.1cm3平 均体积)立即在液氮中冷冻。用1ml 80％乙醇(10mM Hepes-KOH，pH 7.4)于80℃提取所述块1-2小时。如Stitt等所述(1989)，使用上清液 测定葡萄糖、果糖和蔗糖。将沉淀第二次提取，在水中洗涤并干燥。 使用淀粉测定药盒(Boehringer Mannheim)进行淀粉含量测定。结果示 于表2。 表2：在RolC启动子控制下表达胞质酵母转化酶的马铃薯块茎的糖 类组成。 基因型     果糖          葡萄糖      蔗糖          淀粉 对照       0.9±0.1      6.2±0.2    8.7±0.4      652±15 DIN-30     0.3±0.1      8.7±1.0    2.1±0.2      604±19 DIN-87     0.8±0.1      6.5±0.4    3.1±0.2      753±26 DIN-90     0.8±0.01     3.1±0.6    3.5±0.1      903±39

给出平均值±标准差(n＝12，对照；n＝4，转基因植株)。以μmol己 糖gFW-1表示糖含量。对照是野生型Desiree。 1.6.产量

马铃薯植株生长于温室中，相对湿度60％、16小时光照(22℃) 和8小时黑暗(15℃)循环(辐照度300μmol m-2s-1)。为评估韧皮部特异 性胞质酵母源转化酶对块茎鲜重和块茎数量的影响，将每种基因型10 个植株在2升花盆中培养。如表3所示，所述转基因植株的总鲜重 和块茎数量与野生型没有区别。 表3：表达转化酶的马铃薯植株的块茎产量 基因型               总鲜重                       块茎数量 对照                 118.3±1.1                   15±0.01 DIN-87               116.5±6.1                   11±1.9 DIN-90               121.1±0.2                   12±1.9 DIN-30               106±10.5                    13.5±2.8

给出平均值±标准差(n＝10)。以克表示块茎鲜重。对照是野生型 Desiree。 1.7.转基因植株的发芽抑制

为研究韧皮部特异性胞质转化酶对块茎发芽的影响，将转化的 和野生型植株收获的块茎于室温在黑暗中储存延长的时间。野生型 Desiree块茎在5-6个月后开始发芽，而转基因植株的块茎未显示发 芽的任何可见迹象。转基因植株的块茎甚至在储存一年后也未发育 出任何有活力的芽(图3)。因此，韧皮部特异性转化酶的表达导致对 马铃薯块茎发芽的完全抑制。 2.通过表达大肠杆菌无机焦磷酸酶抑制块茎发芽 2.1.构建质粒PPA-2和马铃薯转化(图2)

将STLS-1基因(Eckes等，Mol.Gen.Genet.205，14-22(1986))的 1600bp启动子片段做为EcoRI-BamHI片段从质粒1600-CAT (Stockhaus等，1987)分离。除去重叠的核苷酸后，将该片段克隆入 如Sonnewald(Plam J.2，571-581(1992))所述的嵌合ppa基因的平端 化EcoRI位点。将最终构建物做为EcoRI-HindIII片段克隆入双载体 Bin19(Bevan，1984上述引文中的杂志(J.loc cit))，所述最终构建物含 有STLS-1启动子/增强子、35S CaMV启动子、TMV-U1翻译增强子、 大肠杆菌ppa编码区和章鱼氨酸合酶多聚腺苷酸化信号。如Hfgen 和Wilmitzer所述(Nucl Acid Res.16 9877(1988))完成根癌农杆菌菌株 C58C1：pGV2260的直接转化。如Rocha-Sosa等所述(EMBO J.8 23-29 (1989))进行使用农杆菌介导的基因转移的马铃薯转化。

在农杆菌介导的基因转移之后，使用免疫印迹分析40个独立的 转化植株PPase蛋白质的存在。选择具有最高量的PPase蛋白质的三 个植株(PPaII-2、3和5)进行进一步分析。为比较嵌合35S CaMV启 动子(PPaII)和未修饰的35S CaMV启动子(PPaI)的启动子强度，通过 蛋白质印迹分析马铃薯块茎的蛋白提取物。如图4中所示，与PPaI 对照相比，生长中的PPaII块茎中蛋白质提取物中可检测到的PPase 蛋白质的量显著地较高。在于室温储存3个月和12个月的块茎中得 到了同样的结果。这个分析比较了PPaI和PPaII群体的最高水平表 达系，选择了70个独立的PPaI转化子，选择了40个独立的PPaII 转化子。该分析清楚地表明，STL1启动子片段增强了块茎的无机焦 磷酸酶表达。与所述大肠杆菌无机焦磷酸酶表达相平行的是在PPaII 块茎蛋白质提取物中检测到的焦磷酸酶活性的增加(表4)。根据焦磷 酸酶活性的量，焦磷酸含量最多降低了二倍(表4)。 表4：水平升高的胞质无机焦磷酸酶导致PPaII转化子块茎中PPi积 累的降低 基因型               焦磷酸酶活性               焦磷酸

                 [μmolg FW-1分钟-1]    [nmolg FW-1] 对照                 3600±410                2.4±0.2 PPaII-2              5600±150                1.4±0.2 PPaII-3              6200±220                1.2±0.3 PPaII-5              8500±220                1.1±0.1

从在温室中生长150天的植株收获块茎。结果是三种不同的野 生型植株的三个块茎和每种PPaII植株2-4个块茎的平均值±标准差(野 生型n＝3，转基因植株n＝4)。 2.2.免疫印迹分析

在12.5％ SDS聚丙烯酰胺凝胶(Laemmli，1970)上分离后，使用 半干电印迹装置(Multiphore II；LKB，Bromma，Sweden)将蛋白质转移 至硝酸纤维素膜(Millipore，Bradford，Mass.，美国)。于室温与1∶1000 稀释度的抗-PPase多克隆抗体(Lerchl等，Plant Cell 7 259-270(1995)) 温育90分钟。使用Amersham Buchler的生物素-链霉抗生物素系统， 用兔生物素化种特异性全抗体(源自驴)和链霉抗生物素-生物素化辣 根过氧化物酶完成所述抗原的免疫检测。 2.3.焦磷酸酶活性检测

为检测焦磷酸酶(PPase)活性，将100-200mg马铃薯块茎块在0.5 ml 100mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)-KOH(pH 7.5)、2 mM MgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM巯基乙醇中匀浆。离 心(10分钟，4℃，13,000rpm)后，将20μl的上清液在160μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)、16mM MgSO4和100mM KCl中分析PPase活性。 在加入20μl 50mM NaPPi后，于30℃进行反应20分钟。通过加入 20μl 1M柠檬酸终止反应，如Heinonen和Lathi所述(Anal Biochem 113，313-317(1981))分析无机磷酸的释放。该分析对于时间和提取物 的量是线性的。 2.4.测定块茎组织中无机焦磷酸

为测定焦磷酸，将200-300mg块茎组织在液氮中冷冻。然后将 冷冻的材料在置于粉状干冰(固体二氧化碳)上的研钵内的液氮中匀浆 为细粉末。加入预先冷却至干冰温度的15ml等份的乙醚中的16％(v/v) 三氯乙酸(TCA)，将该样品进一步匀浆。在将该匀浆置于干冰上20 分钟后，加入0.8ml水中的含有5mM NaF的16％TCA。将该混合 物温至4℃并静置3小时。接着如Weiner等所述(Biochem Biophys Acta 893，13-21(1987))，用乙醚抽提该匀浆4次并用KOH/三乙胺中和。 所有的研钵和材料都在2N HCl中预洗涤12小时，平行制备假提取 物以检查所述试剂和装置未被焦磷酸污染。在检测焦磷酸含量之前， 将400μl的提取液加入400μl阳离子交换剂(Serva，Heidelberg，联邦 德国；Dowex AG 50×8，100-200目，用2N HCl预平衡，用水调至pH 5，然后于室温干燥12小时)，混合20秒钟，离心除去提取液中的干 扰该代谢物检测的化合物。如Weiner等所述，用光度法检测焦磷酸。 通过在TCA和乙醚杀死的混合物中的植物材料中加入小的代表性量 (内源含量的2-3倍)焦磷酸，检查该提取液和检测的可靠性。 2.5.产量

马铃薯植株生长于温室中，相对湿度60％、16小时光照(22℃) 和8小时黑暗(15℃)循环(辐照度300μmol m-2s-1)。为评估大肠杆菌无 机焦磷酸酶对块茎鲜重和块茎数量的影响，将每种基因型5个植株 在2升花盆中培养。PPaII植株的总块茎鲜重与野生型对照相比没有 改变(表5)。 表5：大肠杆菌无机焦磷酸酶对马铃薯块茎发育的影响。从已在温室 中生长150天的植株收获块茎。结果是每种基因型的5个单独植株 的平均值。 基因型             总鲜重[克]             块茎数 对照               89-148                 12±0.6 PPaII-3            99-139                 19±1.7 PPaII-5            110-167                21±4.0 PPaII-2            89-192                 19±0.5 2.6.转基因植株的发芽抑制

从野生型植株收获的块茎在储存5-6个月后开始发芽，而PPaII 的块茎未发育出任何可见的芽(图5)。随着野生型块茎的芽发育继续 进行，储存12个月后PPaII块茎中仍然没有发芽的迹象。甚至在延 长储存2年后，PPaII块茎也未发芽。用赤霉素、乙烯磷、高温和低 温或光照处理马铃薯块茎，都未诱导PPaII块茎发芽。PPaI转基因植 株中的低水平表达不足以防止发芽。 II.马铃薯块茎中诱导型基因表达的范例 3.乙醇诱导型基因表达 3.1.构建质粒Alc：GUS

GUS基因的来源是基于pUC的质粒pJIT166(图6)。使用SalI 和BglII，将含有GUS编码区和CaMV35S终止子的源自pJIT166的 片段克隆入pACN/pUC载体。BglII在CaMV35S终止子中切割三次。 第一次切割在GUS基因末端之外的250碱基处发生。尽管这只取出 了所述终止子的一小部分，但该片段含有终止转录所需的所有必需 的序列。pJIT166的SalI-BglII消化产生了一个含有所述GUS基因加 上截短的CaMV35S终止子的1.8kbp片段。将该片段克隆入 pACN/pUC，所述pACN/pUC已用SalI和BglII消化以除去CAT基 因和nos终止子，在alcA启动子后的5’端留下一个SalI突出，在 该线性化载体的3’端留下一个BglII突出。使用标准程序，将含有 所述GUS基因和CaMV35S终止子的片段连接入含有alcA启动子的 线性化pUC载体。克隆程序的最后一步是将alcA-GUS-35St片段克 隆入pSRN-ACN/BinN19，代替alcA-CAT-nos片段。则产生的Bin19 载体含有alc调节子的所有组分，但却具有GUS报道基因。用HindIII 消化，从pSRN-ACN/Bin19载体切出alcA-CAT-nos片段。通过电洗 脱从凝胶提取剩余的16.1kbp片段，该片段是仍然具有35S-alcR-nos 区的Bin19载体。然后用HindIII XmnI双消化pAGS/pUC，切出 alcA-GUS-35St片段。限制性酶XmnI将pUC19载体切掉850bp，产 生分离并使得可取出alcA-GUS-35St片段。然后将alcA-GUS-35St片 段克隆入pSRN/Bin19中未被占用的HindIII位点。使用限制酶切作 图将该片段定向，然后测序以确认它们含有正确的序列。在图7中 提供了质粒AlcR/AGUS的图谱。 3.2.构建物的转化

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，完成根 癌农杆菌菌株C58C1：pGV2260的直接转化。按照Rocha-Sosa等(1989) (上述引文中的杂志)的方法，进行采用农杆菌介导的基因转移的马铃 薯(Solara)的转化。

在农杆菌介导的基因转移后，选择100个独立的转化植株。为 测试GUS活性的诱导性，在组织培养中复制转基因植物的苗。根形 成后，将一组植株转移进入温室。转移进入温室2周后，通过向所 述马铃薯植株的根系统加入50ml 5％乙醇溶液检测乙醇诱导性。接 着使用组织化学检测系统展示GUS活性。乙醇诱导后，在所有测试 的组织中都可见到GUS活性(sink-和源叶、茎、根和匍匐茎)。如图8 所示，GUS活性在发育和成熟的块茎中是高度可诱导的。在未诱导 的马铃薯植株的任何器官中都没有可检测的GUS活性。

为研究Alc-开关对乙醇蒸汽的敏感性，使用了一个实验系统， 其中将一个Alc-CAT(氯霉素乙酰转移酶)烟草植株(CaMV35S-AlcR- nos，AlcA-CAT-nos；Caddick等，1988)封闭于一个密封的容器中，用 一盆特定浓度的乙醇做为乙醇蒸汽源。24小时后取液面上空间和叶 样品。通过将用气密针管注射入配有质谱分析检测仪的气相色谱仪 得到的峰与乙醇标准溶液得到的峰进行比较，将液面上空间样品中 乙醇的绝对量定量。通过CAT ELISA测定叶中总CAT表达水平。 在用5、1、0.1和0.05％乙醇溶液封闭的烟草植株中，CAT的表达相 对稳定，但在使用0.01、0.005和0.001％乙醇溶液时显著下降(参见 图28)。将CAT活性水平与容器中的乙醇蒸汽浓度相联系，看出Alc- 开关激活的阈值在乙醇浓度为72和21ng/ml空气之间。

为进一步研究储存马铃薯块茎中GUS的诱导性，选择四个GUS 阳性转基因系进行详细分析。在组织培养中增殖后，将每种基因型5 个植株转移至温室进行块茎的产生。收获后，将块茎置于密封的玻 璃容器中，该容器中具有用5％乙醇溶液浸泡的3MM纸。

为证明乙醇诱导在整个马铃薯块茎中都是有效的，在乙醇诱导 后不同的时间取块茎小块，使用组织化学检测方法展示GUS活性。 如图9中所示，在整个马铃薯块茎中都发现GUS活性的均匀诱导。

在Alc-GUS马铃薯块茎(CaMV35S-AlcR-nos，AlcA-GUS-nos)中 研究使用乙醇蒸汽激活Alc-开关。通过RNA分析测定GUS RNA转 录物积累的动力学。用乙醇源封闭马铃薯块茎3、6、9、12、24、48 小时和1周时间，移走乙醇源，于2、3和4周的时间点取样。通过 改变所述封闭系统中用于诱导的乙醇浓度，可以改变GUS转录物积 累的时间进程。在40升容器中使用8ml无水乙醇，首先在6小时时 在块茎皮下的外层1-3mm中检测到低水平的GUS转录物，于12小 时时在皮下3mm或更深处检测到低水平的GUS转录物(参见图29)。 于24小时时检测到最高水平的转录物，转录物持续到4周。与之相 对比，使用5％乙醇溶液产生较低的乙醇蒸汽浓度时，首次在1周时 检测到转录物。通过保持恒定的乙醇源，在整个实验过程中检测到 高水平的GUS转录物(最后一个时间点是3个月)(参见图30)。

这些乙醇蒸汽研究的延伸是研究西红柿果实中Alc-开关诱导。 将5％乙醇溶液封闭于装有Alc-GUS西红柿果实(CaMV35S-AlcR-nos， AlcA-GUS-nos)的2.6升容器中，在暴露于乙醇中4周后，在源自果 实中stig的果皮壁中观察到显著的GUS染色。将西红柿果实切片， 在50mM磷酸钠缓冲液pH 7.0中简单地洗涤，并在染色缓冲液(50mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.0，50μM铁氰化钾，50μM亚铁氰化钾，2％triton X-100，20％甲醇和1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-葡糖苷酸)按照需要 进行温育。通过进行100％和70％乙醇洗涤终止染色，将果实切片储 存于4℃中的70％乙醇中。 3.3.GUS活性的荧光测定

如下进行GUS活性的荧光测定：将乙醇诱导后指定时间收获的 块茎块在液氮中冷冻。接着将块茎组织在50mM NaHPO4(pH 7.0)、 10mM巯基乙醇、10mM EDTA、0.1％月桂基肌氨酸钠、0.1％ Triton X-100中匀浆。将匀浆在4℃于13,000rpm离心10分钟，收集澄清 的上清液并用于测定蛋白含量和GUS活性。对于荧光测定，将20μl 提取液(稀释至合适的浓度)加入480μl GUS检测缓冲液(提取缓冲液 中2mM MUG)，并于37℃温育30分钟。然后将50μl的反应混合 物转移至1950μl终止溶液中。用TKO 100微型荧光计(于365nm激 发，于455nm发射)测定每个样品的荧光测定信号。根据通过将荧光 测定值对时间作图得到的曲线的起始斜率，计算酶活性。热灭活的 提取物做为对照。将活性值针对每个提取液的蛋白浓度归一化。 3.4.组织化学检测GUS活性

为组织化学检测GUS活性，将组织样品在X-gluc缓冲液(25mM 磷酸钠缓冲液(pH 7.2)，25mM磷酸钾(pH 7.2)，0.1％ Triton X-100， 1mM X-gluc)中温育。使用短暂的真空渗入(30秒)以支持底物穿透入 植物组织。接着，将该材料于37℃温育3-24小时，在照相之前用水 漂洗。用乙醇漂白光合成组织。使用配备了Wild MPS46自动照相装 置(photoautomat)的Wild Makroskop M420进行显微分析。 III.马铃薯植株中安全剂诱导型基因表达 4.1.构建GST：GUS质粒

在构建质粒载体时采用标准重组DNA方法。将含有源自pG1E7 的GST-27 3.8kb EcoRI-Nde I 5’侧翼区的报道基因构建物平端化， 并连接入农杆菌Ti载体pBI101的Sma I位点。平端化后，位于GST-27 的预期翻译起始密码子的Nde I位点被破坏。这形成方便的与在 pBI101中编码b-葡糖醛酸酶(GUS)的大肠杆菌UidA基因融合的点。 通过限制和序列分析，确认了产生的嵌合报道基因构建物pGSTTAK 的结构。在图10中提供了质粒pGSTTAK的图谱。 4.2.构建物的转化和诱导性的测试

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，使用 质粒pGST∷GUS完成根癌农杆菌菌株C58C1：pGV2260的直接转化。 按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的杂志)的方法，进行采用农杆 菌介导的基因转移的马铃薯(Solara)的转化。

在农杆菌介导的基因转移后，选择100个卡那霉素抗性再生的 苗。通过将GST∷GUS转化的马铃薯植株的茎插条转移至含有0、0.4、 2.0和10‰R-25788(终浓度)的MS培养基，检测安全剂诱导性。培 养14天后，收获完全发育的叶，测定GUS活性。如图11中所示， 安全剂诱导后GUS活性得到3-20倍的增长。 IV.靶基因表达的诱导型阻抑 5.诱导型共抑制 5.1.构建诱导型FNR共抑制的嵌合基因

为达到NADP-铁氧化还原蛋白氧化还原酶(FNR)的乙醇诱导型 共抑制，将烟草FNR cDNA的一个约450碱基对3’-片段(序列1)以 有义定向融合至alcA启动子，产生质粒SQ03。在图12中描绘了克 隆策略。

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，完成 根癌农杆菌菌株C58C1：pGV2260的直接转化。如Rosahl等(EMBO J 6， 23-29，(1987))所述，进行采用农杆菌介导的基因转移的烟草转化 (Samsun)。

在农杆菌介导的基因转移后，选择100个独立的转化植株。 序列1：碱基总数423 AATTTCAAAG GAAAAATTTA CCTATCTACA TGGATGCAGG GGGAGAGAAG CATAAAGTTG GCTCATATTT GTACAAAGAA AAGTAAAAAT ATTTAGTAGA CTTCAACATT CCATTGCTCT GCCTTCTTCA ATTGCTTCTT GTAGTCCGCC CAGACAATAC CATCTCTTTC AGCAAGAGCA GACATAATTT CATCAATTCC CTGCTCCATG CCCTTGAGTC CACACATGTA GATGAAGGTG TTGTCTTTTT GGAGCAAAGT CCATAGTTCT TCAGCATATT GAGCCATTCT GGTTTGAATG TACATCTTTT CACCCTTTCC GTTCGTTTGC TCTCTGCTCA CAGCAAAGTC CAATCTGAAG TTT-3′ V.异源基因的诱导型反义阻抑

如I节中所述，当使用合适的启动子驱动相应基因表达时，胞 质转化酶和无机焦磷酸酶的表达可以导致不发芽表现型。为达到所 述不发芽表现型的诱导型逆转，采用了异源基因诱导型反义策略。 6.焦磷酸酶表达的诱导型反义阻抑 6.1.构建质粒SQ01

如图5中所示，大肠杆菌无机焦磷酸酶的高水平表达导致收获 的马铃薯块茎的不发芽表现型。为化学控制大肠杆菌无机焦磷酸酶 的表达，设计了质粒SQ01。该质粒含有三个嵌合基因：(a)在35S CaMV 启动子控制之下的alcR基因，(b)在增强的35S CaMV启动子控制之 下的ppa基因和(c)在alcA启动子控制之下的反义定向的ppa基因。 质粒SQ01的构建示于图13。 6.2.植物转化

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，完成 根癌农杆菌菌株C58C1：pGV2260的直接转化。按照Rocha-Sosa等 (1989)(上述引文中的杂志)所述和如Rosahl等(1987)(上述引文中的 杂志)所述，进行采用农杆菌介导的基因转移的马铃薯转化(Solara)和 烟草转化(Samsun)。

在农杆菌介导的基因转移后，选择100个独立的转化植株。 6.3.ppa的免疫学检测

通过免疫学检测组织培养生长的马铃薯植株的叶提取物中的大 肠杆菌焦磷酸酶蛋白，检测成功的转化。根据初次筛选，可以鉴定15 个独立的转基因植株。在组织培养中复制后，将表达焦磷酸酶的转 基因马铃薯植株转移至温室以形成块茎。 7.转化酶表达的诱导型反义阻抑 7.1.构建质粒SQ02

如图3中所示，胞质酵母源转化酶的韧皮部特异性表达导致收 获的马铃薯块茎的不发芽表现型。为化学控制酵母转化酶的表达， 构建了质粒SQ02。该质粒含有三个嵌合基因：(a)在35S CaMV启动 子控制之下的alcR基因，(b)在rolC启动子控制之下的编码成熟转化 酶蛋白的截短的suc2基因和(c)在alcA启动子控制之下的反义定向的 suc2基因。质粒SQ02的构建示于图14。 7.2.植物转化

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，完成根 癌农杆菌菌株C58C1：pGV2260的直接转化。按照Rocha-Sosa等 (1989)(上述引文中的杂志)所述和如Rosahl等(1987)(上述引文中的杂 志)所述，进行采用农杆菌介导的基因转移的马铃薯转化(Solara)和烟 草转化(Samsun)。

在农杆菌介导的基因转移后，选择100个独立的转化植株。 7.3.转化酶活性

通过如von Schaewen等所述(EMBO J.9，3033-3044(1990))检测 SDS PAA凝胶中转化酶活性，检测成功的转化。为此目的，从组织 培养生长的马铃薯植株中脉制备蛋白提取物。在12.5％SDS PAA凝 胶中分离蛋白提取物后，将该凝胶在100mM乙酸钠缓冲液pH 5.0 中洗涤30分钟。接着将该凝胶在含有100mM蔗糖的100mM乙酸 钠缓冲液中于37℃温育1小时。在用蒸馏水简单洗涤后，通过检测 释放的还原糖(葡萄糖和果糖)展示转化酶活性。通过将该凝胶在0.5N NaOH中的0.1％氯化2，3，5-三苯基四氮唑中煮沸2-5分钟检测己糖。 转化酶活性由于形成浓厚的红色而可见。基于初次筛选，可以鉴定18 个独立的转基因植株。在组织培养中复制后，将表达转化酶的转基 因马铃薯植株转移至温室以形成块茎。 VI.使用操纵基因/阻抑蛋白系统阻抑异源基因 8.使用具有rolC启动子、酵母源转化酶基因和Alc开关的Lac操纵 基因/阻抑蛋白系统 8.1.将lacI克隆入ALC开关双载体

从图22可见，用BamH1/HindIII从35S-LacI-nos质粒切出lacI- nos区，并克隆入BamH1/HindIII消化的pMSC2载体。该载体具有 一个距BamH1位点5’几个碱基的Pst1位点，所以Pst1消化取出了 lacI编码区。然后将此编码区克隆入pst1消化的pACN载体(AlcA- cat-nos)，用lacI基因取代了AlcA基因，产生pALN载体(AlcA-lacI- nos)。用HindIII消化从该载体移出所述ALN区并克隆入HindIII消 化的双SRNACN(35S-AlcR-Nos-AlcA-Cat-Nos)载体，用ALN盒取 代CAN。 8.2.将lacI操纵基因克隆入RolC-转化酶

合成具有BamHI和Asp718限制位点的两个寡核苷酸 SC24：TTGGTACCAATTGTGAGCGCTCACAATTGGATCCTT SC25：AAGGATCCAATTGTGAGCGCTCACAATTGGTACCAA 将各10μM的这二种寡核苷酸退火，即在存在20mM Tris.Cl(pH 8.4) 50mM KCl和1.5mM MgCl2的情况下在水浴中煮沸5分钟，然后在 约1小时内冷却至30℃，接着在冰上静置5分钟。用BamH1和Asp718 消化该退火的寡核苷酸，通过酚抽提和乙醇沉淀灭活所述限制酶。 将所述片段连接入BamH1和Asp718切割的pUC19，产生pUC-lacO。 通过测序确认所述质粒。从BINAR质粒移出OCS终止子并克隆入 质粒pUC-lacO的SalI和HindIII限制位点，产生质粒pUC-lacO-ocs。 用EcoR1和Asp718(KpnI)插入RolC启动子，产生质粒pUC-RolC- lacO-ocs。将酵母源的转化酶插入pUC-RolC-lacO-ocs的BamHI位 点，产生质粒pUC-RolC-lacO-INV-ocs。图21显示了该质粒的克隆 策略。 8.3.连接上述二种组分产生最终的双载体

RolCopINVocs盒位于HindIII片段上(使用865bp RolC启动子)， 以三方式连接将其连接入HindIII消化的双SRNAlacI，产生最终的构 建物35S-AlcR-nos-AlcA-lacI-nos-RolC-op-转化酶-ocs。 VII.另外的靶

基于已知的参与马铃薯块茎发芽的生化步骤，我们已经鉴别了 可以用于产生遗传工程改造的不发芽马铃薯块茎的几个另外的靶。 此外，呼吸酶或参与线粒体输出代谢物的膜蛋白质是有希望的。这 些候选者之一就是线粒体ATP/ADP转运蛋白和第二苹果酸氧化戊二 酸转运蛋白。 9.参与线粒体功能的基因 9.1.克隆ATP/ADP转运蛋白(ANT)和构建嵌合反义基因

基于已发表的马铃薯ADP/ATP转运蛋白的序列(Emmermann等 (1991)Curr.Genet.20，405-410)，设计及寡核苷酸以允许PCR扩增内 部ANT-片段(参见图5)。使用以下PCR引物：5’-ANT引物：5’- AACGGATCCATGGCAGATATGAACCAGC-3’；3’ANT引物： 5’-TTGGATCCTTACAACACACCCGCCCAGGC-3’。为优化后续 的ANT-片段克隆入植物表达载体，在这两个PCR引物中都包含有 BamHI位点。使用从生长的马铃薯块茎分离的mRNA做为逆转录模 板。按照Logemann等的方法(1987；Anal.Biochem.，163，16-20)完成 RNA分离。按照制造商说明书(Gibco，BRL)，使用M-MLV superscipt 逆转录酶合成单链cDNA。PCR循环(40个循环)的温度分布型如下： 95℃ 1分钟、45℃ 1分钟和72℃ 2分钟。将扩增的DNA克隆入PCR 载体pCR1000TM(Invitrogen，Norwalk，CT)。为排除PCR循环中扩增 DNA的突变，使用双脱氧法对所述克隆测序。然后将1120-bp ANT 片段以反义定向克隆入植物表达盒pBINAR(Hfgen和Willmitzer Plant Sci.66，221-230(1990))。 9.2.克隆线粒体氧化戊二酸转运蛋白(MOT)

使用9.1.节描述的方法分离编码MOT的cDNA片段。图17的 RNA分析显示，当刚好在块茎芽下抽提RNA时，MOT mRNA表达 是最高的。该区对应于高代谢活性。基本如8.1.节用于ANT的所述 方法，但是使用示于图18的引物，通过扩增MOT片段制备反义减 量调节构建物。将BamHI/SalI PCR片段克隆入Bam/Sal切割的 pBluescript SK。为排除PCR循环中扩增DNA的突变，使用双脱氧 法对所述克隆测序。从所述的pBluescript载体切出Asp718/BamHI片 段并克隆入BamHI/Asp718切割的pBinAR。这产生了具有驱动反义 定向的MOT的35S CaMV启动子的植物转化盒。 9.3.转化

如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的杂志)所述，完成根 癌农杆菌菌株C58Cl：pGV2260的直接转化。按照Rocha-Sosa等 (1989)(上述引文中的杂志)所述，进行采用农杆菌介导的基因转移的 马铃薯转化。

在农杆菌介导的基因转移后，选择70个独立的转化植株。 10.马铃薯块茎储存期间诱导的基因 10.1.分离在块茎储存期间诱导的基因 10.1.1.差异显示

为探究在生长至发芽块茎的转变期间发生的分子变化，使用差 异显示技术。为此目的，从生长和储存的马铃薯块茎(Desiree)分离总 RNA。在DNaseI消化后，使用M-MLV superscipt逆转录酶(Gibco，BRL) 逆转录5μg的总RNA，产生单链cDNA模板。接着，在存在(α-35S)dATP 的情况下，使用寡聚d(T)11-XN和100种不同的RAPD引物进行所 制备的cDNA模板的PCR扩增。使用以下RAPD-引物导致分离源块 茎特异性cDNA片段：5’-AAGCGACCTG-3’；5’- GTTGGTGGCT-3’；5’-ACGGGACCTG-3’。

PCR循环(40个循环)的温度分布型如下：94℃ 30秒钟、42℃ 1 分钟和72℃ 30秒钟。将扩增的DNA于94℃在甲酰胺缓冲液中变 性5分钟，上样至PAA凝胶(TBE缓冲液中6％丙烯酰胺、0.3％双丙 烯酰胺、7M尿素)。于1.75KV、130mA 3小时完成所述cDNA片 段的分离。分离后，将该凝胶于80℃干燥，使用Kodak X-OMAT X 胶片通过放射自显影展示放射性标记的cDNA片段。曝光时间为2-5 天。比较从生长或发芽的块茎扩增的cDNA片段使得检测到仅在发 芽马铃薯块茎中存在的cDNA片段。然后从所述PAAG洗脱发芽块 茎特异性cDNA片段，使用相应的PCR引物再扩增。将所述再扩增 的cDNA片段接着克隆入PGEMT载体(Promega)。所述扩增的cDNA 片段的大小在200和450碱基对之间变化。 10.1.2.块茎储存期间诱导的基因的RNA印迹分析

为确认所分离的cDNA片段是在储存的马铃薯块茎中诱导的， 分离生长的和储存1、7、14、21、30、60、90、120、150和180天 的马铃薯块茎的总RNA，在1.5％含甲醛(15％v/v)的琼脂糖凝胶上分 离，并在将所述RNA转移至尼龙膜上之后探测相应转录物的存在。 如图16所示，4个分离克隆(16-3，10-1，AC4和16-8)的转录物在马 铃薯块茎储存期间积累。 10.1.4.构建cDNA文库

为得到编码M-1-1、16-3、10-1、AC4和16-8的全长cDNA克 隆，构建储存的块茎特异性cDNA文库。为此目的，从于室温储存5 个月的马铃薯块茎分离polyA RNA。使用Pharmacia的cDNA合成药 盒进行cDNA合成。在接头连接后(EcoRI/NotI-接头)，按照制造商说 明书(Stratagene)将所述cDNA连接入λZAP II载体。使用Stratagene 的Gigapack2II Gold包装提取物进行体外包装。 10.1.5.分离编码储存的块茎特异性cDNA克隆的cDNA克隆

在扩增一级cDNA文库后，筛选2×105Pfu(噬斑形成单位)中存 在的与M-1-1、16-3、10-1、AC4和16-8 PCR片段杂交的噬菌体。 在所有的情况下，分离了几个与相应的PCR探针杂交的独立的噬菌 体，进行分离克隆的体内切除之后的限制分析。在四种情况下(M1-1、 16-3、10-1和16-8)可以得到全长cDNA克隆。在测定完整核苷酸序 列(序列2-6)和图19之后，进行同源检索。根据同源性，克隆16-3 对应于人、果蝇属和酵母遍在蛋白质羧基末端水解酶，发现克隆10- 1与马铃薯ADP-核糖基化因子1(属于GTP结合蛋白家族)相同，而 克隆16-8与草莓未知功能的生长素阻抑的蛋白质有同源性。未发现 克隆AC4的同源性。差异表达的克隆M-1-1编码一种我们命名为MOT 的蛋白质，我们发现它与牛和人线粒体2-氧化戊二酸载体蛋白有同 源性。在图20中提供了序列对比。 10.1.6.所诱导克隆的核苷酸序列 序列2：16-3(与人、果蝇属和酵母的遍在蛋白质羧基末端水解酶有 同源性) GGGCTGCAGGAATTCGAGGCCGCTAGAGAGAGTTAAAATAGAGGAAAGGAATCCATGGCGGAAAGCACAGGCTC TAAGAAGAGATGGCTTCCTCTTGAAGCTAACCCCGATGTCATGAATCAGTTTCTTTGGGGTCTTGGTGTTCCAC CGAATGAGGCCGAGTGCTGTGATGTTTATGGGTTAGATGAAGAACTTCTGGAGATGGTGCCAAAGCCAGTGCTT GCTGTTTTATTTCTCTATCCTCTCACATCTCAGAGTGAAGAAGAGAGAATAAAGCAAGACAGCGAAACAAAGGT GCAGGATCCCAGTAGTACAGTTTACTACATGAAACAAACAGTGGGAAATGCATGCGGAACAATTGGCCTTCTTC ATGCTATTGGGAATATCACCTCTCAGATAAAACTTACCGAGGGTTCATTCTTGGACAAGTTCTTTAAATCAACC TCAAGCATGGACCCAATGCAGCGTGCTTTGTTCCTTGAAAATGATAGGGAAATGGAAGTTGCTCATTCAGTGGC AGCCACTGCTGGTGATACTGAGGCTACCGACGATGTGAACGCTCATTTCATCTGCTTCACCTGTGTTGATGGAC AACTCTATGAACTTGATGGAAGGAGGGCTGGACCTATTACACATGGCGCATCCTCTCCAAACAGCTTATTAAAG GATGCAGCCAGAGTTATCAAAAAGATAATCGAGAAAAATCCAGACTCAATCAACTTCAACGTTATTGCTATTTC CCAAAACGTTTAGGCCAATCTAGAGGCTTTTATCGATGAGATGGTTTAAACCAATTTTAGCTTTTCATGTTTCT GCCGTTTCCAGTACTATGTTTCTTCTTGTTTGCAATAAGTTACTTTTGAGAAAAAA 序列3：16-8(与生长素阻抑的草莓蛋白质有同源性) TGTTCTATCCCAGCGGACGCAGAATTTCCTTTTTTATTCTTCTCTTCTTCTCCCCTAAAACGTGAGCCGATTGG CTAACCTGCACCATGAGCTTACTTGACAAGCTCTGGGACGACACCGTTGCCGGTCCCCTGCCAGATAGTGGCCT CGGGAAACTCCGGAAGTATTCTACTTTTAGTCCGCGTTCAAATTCCGGCAAGGAATCAGAAGTTTCCACACCGA GATCCTTCACCGAGGAAGCAAGTGAGGACGTGGTGAAGGTGACGAGAAGTATCATGATAGTAAAGCCTTCCGGG AGTCAGAATAGAGATTCACCTCCAGTTTCTCCGGCCGGTACTACTCCTCCGGTATCTCCTTTTGCCGGTTCCGC TGGAAGAGAAGCATTTCGGTTCCGGCGGCGATCAGCGTCATTTGCATACGAGAATGCCAGTGGGGTTGGACCCA GAAGCCCTCGTCCTCCTTACGACCTGTGAGATATAGTCGGGTTCTCTTTTTTTGTTATCCCTCTTGAGGCGGTT GAATGTAGTATAGCTAGTCGACATACTCAACATGTTCCTGGTTGAGAGTGTTGTTTTGTGTGGTGTTTAATTTG TTTGCTTAATTTTGTAAATAGTGCAAGTGGTTCTTCATCTTGCGGATGTTGTGACGAAGGTTTAGCACAAGATG TAAGCGTCCAAGTTGGTCATGTATTCTGCTTTGTATTAAAAAAAAA 序列4：10-1(马铃薯的ADP-核糖基化因子1，属于GTP结合蛋白家 族) TGGACAATAGAGATCTACTGATTTCATCCTCTCTCATCGGCCGATCTTCGATTAACGGAGATGGGGCTGTCTTT CACTAAACTCTTTAGTTCGCCTCTTTGCAAGAAAGAAATGCGAATTCTTATGGTTGGTCTCGATGCTGCTGGTA AAACCACAATTCTGTACAAGCTCAAGTTGGGAGAAATTGTTACCACTATCCCAACCATTGGTTTCAATGTGGAG ACTGTTGAATACAAAAACATCAGCTTTACTGTGTGGGATGTTGGTGGTCAGGACAAGATTAGACCTCTATGGAG GCACTATTTCCAGAACACACAGGGCCTCATCTTTGTGGTTGATAGCAATGACAGAGACCGTGTAGTTGAGGCAA GGGATGAGCTTCACAGGATGTTAAATGAGGATGAATTAAGAGAAGCTGTGTTGCTTGTTTTTGCGAACAAACAA GATCTTCCAAATGCAATGAATGCNNCTGAAATCACCGACAAGCTTGGCCTTCATTCTCTCAGACAACGACACTG GTATATCCAGAGTACATGTGCTACTTCTGGAGAAGGGCTATATGAGGGACTGGATTGGCTTTCAAACAACATCG CCAGCAAGGCCTAATGCAATGGTACTATGCTTCTTGTGTTGCTATATCCGGAGAAATAAACATCATTGTCTCGA GATTTTAAATATCTGTTCAGCTCACAATTCTGGGGAAGGCCTTACCCTTCTTCACTCTCTATGGTTTATGTCAA AGACCATGACATAGTTTACACATTGCTGGATGCACATTGGCAATGTAATGATATTTTAGTATAATATCTGGTTT TGAAACTTGGCGCAGCCGTGTGCACCATTTTGTTGTCCTGTGTGTCTGATGTTGCAATGGGTGTACAAAATGTA ATACAGATCAATAGTAAGTATCGGA 序列5：AC4(无同源性) ACGGGACCTGGTCAATACTAATGTATCAGTCAACCAGCTCGAAAATCCACAAAATATAGAAGGGGAGGGAGGAT CACCAAGGATAAACCATCTGAACCCAGACGACAACCTCCTTCTTCTTCTTCGATCCCTTAGGGAAGAGATACCC CGATCACCTGGATTAGGAAATAAGAGGAGCAAAATAACTTCAGAAACAGGAGGAATAAAGAGATCTAGTAAGGA GAGGGGAAGCACAAACTCTGAACCTTGGAAATGTGAAGCAGAGTAATGGTCTAACAGAGTTCACCATCGACTAG TGGAAGCACAAGCATAAGAACATCCAAAGGAGAAGGAGCTTAAGTCGGTGGTTCCAGCGACATG 序列6：MOT变异体 GAATTCGCGGCCGCAAGAGAAAGAGAGCTGAGAAAGAATGGGTGAGAAGCCAGTATCTGGAGGTGTTTGGCCTA CTGTTAAGCCATTTATTAATGGAGGTGTTTCTGGTATGCTTGCTACCTGTGTTATTCAGCCTATTGATATGATA AAGGTGAGGATACAATTGGGACAGGGATCAGCAGCTGATGTTACCAAAACCATGCTTAAAAATGAAGGCTTTGG TGCCTTTTACAAGGGTCTGTCAGCTGGGCTTCTTAGGCAGGCAACCTACACAACTGCCCGACTTGGGTCATTCA GAATTTTGACGAACAAGGCCATTGAGGCTAATGAAGGGAAGCCCTTACCTCTGTACCAAAAGGCTTTGTGTGGT CTAACTGCTGGAGCAATTGGTGCAACTGTTGGCAGTCCAGCAGATTTGGCCCTCATTCGTATGCAAGCTGATGC TACCTTGCCTTTAGCACAGAGACGCAATTACACAAATGCATTCCATGCACTCTCCCGTATTGCGGTTGATGAGG GAGTTCTAGCCCTCTGGAAAGGTGCTGGCCCAACAGTAGTAAGGGCAATGGCATTGAACATGGGTATGCTTGCC TCTTATGATCAGAGTGTGGAGTTCTTCAGGGACAACCTTGGCATGGGCGAGGCTGCTACAGTAGTAGGGGCCAG CAGTGTCTCTGGGTTCTTTGCTGCTGCTTGCAGTTTACCATTTGATTACGTCAAGACCCAGATTCAGAAAATGC AGCCAGATGCTGAAGGAAAATTGCCCTACACTGGTTCTTTCGATTGTGCCATGAAGACTTTGAAGGCAGGAGGA CCCTTCAAATTTTACACTGGATTTCCAGTATATTGTATTAGGATTGCCCCTCATGTTATGATGACTTGGATTTT CCTTAACCAAATTCAGAAGGTGGAGAAGAAAATCGGATTGTGATTGTTGCAAAAAAAGATACATCCTCTCAA GTTGAGCTTTATTAGAAATAACATCTTCGCCTTGTTGTATTAGTACTGTTTTCGCTCTTTCTTTATCCTCACGC CTTCAAAGGCTTTAAGATTTTTGTGGTGATACATTGACTCGCGGAAATTTAGGGTTAGACATTTGGTCTTTTCA ATATTCCTACCAATATAGTTTTGGGAAGATTACTTTATCCAAACTGATGGGAAGATTCTTTTAGCTGAATAATC TATGTACTTCAAAAACCGTCTTGAAGTAGGTAGTATGGAGTTCACCAATTTTGGTGTCATCTTGAACTTGATCT TGTTGCCTATTTTTGGATATACACTCATTTGTTAGCATCCTTCCTGGTATGAGCTATTGAGTATTATTGGAGTA AAAATGCATCCTAATGTTCTTGCTCCATTTGGATATATAGTTTTTTCATGCACCGCGGCCGCGAATTC VIII.鉴别启动子区 11.分离基因组克隆 11.1筛选了Zap-表达载体(Stratagene)中的马铃薯Solara变种 (Solanum tuberosum var.Solara)的基因组文库(筛选了750 000个噬 斑)。用差异显示的cDNA片段做为探针。 11.1.1UBL(图23)

在第三次筛选中分离了三种噬菌体，体内制备表明其中二种是 相同的，第三种没有UBL基因的5’区。使用二种相同的噬菌体之 一用于PCR方法。用读入启动子的寡核苷酸(GCT TTC CGC CCA TGG ATT CC)对该克隆测序。从该序列，推导出另一个寡核苷酸(加 入一个BamHI-位点)，并将其用于进行使用反向引物(Stratagene)的 PCR。将此片段克隆入pGemT(Promega)并进行测序。将其做为BamHI 片段克隆入pBI101(Jefferson等1987 EMBO 6)。产生了具有如前述 的UBL启动子GUS构建物的转基因马铃薯系。在包括茎和叶在内 的各种组织中未观察到可检测的GUS活性。收获块茎，发现一些转 基因系表现出GUS表达。 11.1.2.MOT(图24)

从所述文库分离出6个克隆。用基因特异性引物(CCA GGA GAT GGG AAT GGA GAC CG)对其中两个测序，推导出这两个克隆的寡 核苷酸。结合通用引物(Stratagene)分离MOT6和MOT3片段并克隆 入pGemT。将MOT3做为BamHI片段克隆入pBI101，MOT6做为 BamHI/XbaI片段。 12.构建反义/有义构建物 12.1.1.UBL-反义构建物

将BamHI(内部限制位点bp 301)/Asp718(位于载体pBluescript 中的cDNA的3-引物(Prime)端)片段克隆入pBinAR。pBinAR是pBin19 的衍生物，含有35S-启动子(Hoefgen und Willitzer 1990，Plant Sci.，66， 221-230)。 12.1.2.MOT-反义/有义构建物

将具有cDNA的限制位点5引物BamHI碱基对292-315和3引 物SalI碱基对993-969的寡核苷酸用于PCR。将以下片段克隆入 pGemT：在pBinAR(有义)和pBluescript(stratagene)中的-BamHI/SalI- 片段，和pBinAR(反义)中的源自pBluescript的BamHI/Asp718片段。 12.1.3.16-8有义/反义构建物

使用具有限制位点5引物BamHI bp 6-29 cDNA和3引物XbaI(有 义)或Asp718(反义)bp 682-662 cDNA的寡核苷酸。将片段克隆入 pGemT，并从pGemT克隆入pBinAR。 12.1.4.UBL-1、MOT6和MOT6启动子序列

在图25、26和27中给出了这些启动子的序列。

不偏离本发明的范围的本发明的其它修改对本领域技术人员是 显而易见的。