一种蜕皮抑制类杀虫剂及其应用
阅读：678发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种蜕皮抑制类杀虫剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 蜕皮 类抑制 杀虫剂 及其应用。该蜕皮类抑制杀虫剂的主要活性成分为双链RNA，该双链RNA的转录模板为NlEcR-A、NlEcR-B或NlEcR-A/B中的至少一种。NlEcR-A的正义链如SEQ ID：NO.1所示，反义链如SEQ ID：NO.2所示；NlEcR-B的正义链如SEQ ID：NO.3所示，反义链如SEQ ID：NO.4所示；NlEcR-A/B的正义链如SEQ ID：NO.5所示，反义链如SEQ ID：NO.6所示。本发明通过利用褐飞虱自身生长发育相关的重要基因，筛选得到双链RNA，将其用以褐飞虱防治，效果显著。因此，可将该蜕皮抑制杀虫剂用于制备防治褐飞虱的药物。，下面是一种蜕皮抑制类杀虫剂及其应用专利的具体信息内容。
一种蜕皮抑制类杀虫剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 昆虫的生长发育离不开蜕皮变态，在这一生命历程之中前胸腺分泌的蜕皮激素扮演着重要的角色，在大多数昆虫之中这些蜕皮激素通常为20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)(Perera et al.，1999；Soin et al.，2009)。编码20E结合的蜕皮激素受体(Ecdysone receptor，EcR)基因首先在果蝇D.melanogaster中被克隆鉴定出来(Koelle et al.，1991)。EcR与超气门蛋白USP(ultraspicacle)结合形成异二聚体(heterodimer)之后才能发挥蜕皮激素受体的功能，USP与脊椎动物之中的RXR(retinoid X receptor)是同源物(Perera et al.，1999；Kozlova and Thummel，2000)。在不同种昆虫之中EcR和USP的特性亦有所异(Beatty et al.，2009)。功能性的EcR可以结合目标基因启动子区域的特定DNA序列，激活诱导一系列编码转录因子的早期应答基因(primary response gene)如E74、E75和Broad等的表达，这些早期基因再进一步调节次级应答基因的表达和蜕皮变态等发育过程(Cruz et al.，2006)。因此，EcR对于昆虫正常的生长发育有着非常重要的作用，下面主要就昆虫之中EcR的结构和功能作一简要概述。
[0003] 单独的EcR是无法调控下游基因的表达，只有当EcR与USP形成异二聚体，然后在20E的作用下才可以行使其蜕皮激素受体的真正功能。自从EcR和USP的基因序列在果蝇D.melanogaster之中首先被鉴定以后，现在越来越多的昆虫之中都发现了这个核受体家族的基因(Ogura et al.，2005；Martin et al.，2006；Tan and Palli，2008)。现已发现EcR在前胸腺、表皮、脂肪体和卵巢等多个组织之中和发育时期有所表达(Cruz et al.，2006)，然而不同的EcR同工体在昆虫之中的表达还是有所差异，如在果蝇D.melanogaster中EcRB1主要在幼虫组织中表达而EcRA则主要在成虫盘(imaginal discs)中表达；在家蚕B.mori和烟草天蛾M.sexta等鳞翅目昆虫之中发现EcRB1也是主要在幼虫之中表达；然而在鞘翅目马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata之中却发现EcRA在幼虫之中的表达要比EcRB1高很多(Ogura et al.，2005)。这即说明在不同目昆虫之中占主导表达的EcR的同工体的表达是有所差异的。
[0004] 除了EcR不同同工体表达的差异之外，每个同工体的功能也各有不同。在果蝇D.melanogaster中对EcRA、EcRB1和EcRB2述三个基因同时突变可以导致果蝇胚胎的死亡，但对每个基因分别独自研究却发现EcRA主要对成虫结构分化以前蛹的形成起着重要的作用；对EcRB1的突变会导致无法正常化蛹；而对EcRB1和EcRB2的同时突变则会导致大多数幼虫早期发育的停止，少数可以发育的幼虫则无法完成正常的化蛹(Cruz et al.，2006)。以前在除果蝇外的其它非模式昆虫之中，由于缺乏有效的遗传研究工具，对EcR基因功能的了解一直停滞不前。自从RNAi发现并广泛应用于昆虫基因功能研究之后，目前已经对德国小蠊B.germanica和赤拟谷盗T.castaneum等昆虫的EcR基因功能进行了研究(Cruz et al.，2006；Tan and Palli，2008)。在德国小蠊中的研究发现EcRA在其幼虫的发育、前胸腺解体(prothoracic gland degeneration)和绒毛膜生成(normal choriogenesis)之中均有着重要的作用(Cruz et al.，2006)。在赤拟谷盗之中的研究表明，在从幼虫到蛹的变态发育之中EcRA在蜕皮激素反应的信号转导中起着主导的作用，EcRB在此过程之中的作用则要弱很多(Tan and Palli，2008)。
[0005] 由于EcR在昆虫生长发育之中的重要作用，许多非激素类蜕皮抑制剂被开发出来用于害虫的控制。这些主要为二苯甲酰肼类(dibenzoylhydrazine，DBH)化合物，目前在市场上销售的包括四大类：虫酰肼(tebufenozide)RH-5992、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)RH-2485、环虫酰肼(chromafenozide)ANS-118和氯虫酰肼(Halofenozide)RH-0345。这些杀虫剂一个重要的优点就是对环境安全友好，但是目前这些杀虫剂大部分只对鳞翅目昆虫有效(包括RH-5992、RH-2485和ANS-118)，极少部分对鞘翅目昆虫也有作用(RH-0345)。这极大的限制了此类杀虫剂的应用范围，对基于EcR的昆虫生长发育的机理进行深入研究将有助于我们寻找到新的蜕皮抑制类杀虫剂(Nakagawa，2005；Soin et al.，2009)。
发明内容
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种蜕皮抑制类杀虫剂。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述的蜕皮抑制类杀虫剂的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蜕皮类抑制杀虫剂，主要活性成分为双链RNA，该双链RNA的转录模板为NlEcR-A、NlEcR-B或NlEcR-A/B中的至少一种；
[0009] NlEcR-A的正义链的核苷酸序列如下所示(216bp)：
[0010] 5’-GCTAGTAAAGCGAGAACAGTTGGACGACACCACCCCGTTACGGGGGGGTTCCCCAAGGGGCAGCCCGACCCCCCAGGGGGGCCTGAGGGGCTCCTCGTGGCCCCCCTCGCCAAGGGACATGACTCCCTCCTATGGCGGGGGTGGCACTCCCCTAAATGGCTACCCTTCTCCCACCATGTCATCGCAGCACAGCAACTATGACAGCTGCCTCAGTCC-3’；
[0011] NlEcR-A的反义链的核苷酸序列如下所示(216bp)：
[0012] 5’-GGACTGAGGCAGCTGTCATAGTTGCTGTGCTGCGATGACATGGTGGGAGAAGGGTAGCCATTTAGGGGAGTGCCACCCCCGCCATAGGAGGGAGTCATGTCCCTTGGCGAGGGGGGCCACGAGGAGCCCCTCAGGCCCCCCTGGGGGGTCGGGCTGCCCCTTGGGGAACCCCCCCGTAACGGGGTGGTGTCGTCCAACTGTTCTCGCTTTACTAGC-3’；
[0013] NlEcR-B的正义链的核苷酸序列如下所示(223bp)：
[0014] 5’-GAGGAGGTGGAGGAGTAGTGATGGGTCATCATCTGCATCAGGCCGGCCTGGCAATGCTGCAGCAGCGGATGATGATGAGTCAGCATGGATTTCATCAGCAGAGTCAGCATCAGGGTGGGCTGCATCATGGTGGGACTACAACACTGGTGCGAGCGGCGGTTGCACATGTTTCGAGCAATGTGTCGGATAGCGGATCTGTGTCAGGACGCGAAGACCTGTCACC-3’；
[0015] NlEcR-B的反义链的核苷酸序列如下所示(223bp)：
[0016] 5’-GGTGACAGGTCTTCGCGTCCTGACACAGATCCGCTATCCGACACATTGCTCGAAACATGTGCAACCGCCGCTCGCACCAGTGTTGTAGTCCCACCATGATGCAGCCCACCCTGATGCTGACTCTGCTGATGAAATCCATGCTGACTCATCATCATCCGCTGCTGCAGCATTGCCAGGCCGGCCTGATGCAGATGATGACCCATCACTACTCCTCCACCTCCTC-3’；
[0017] NlEcR-A/B的正义链的核苷酸序列如下所示(360bp)：
[0018] 5’-ACTTCCAGAACGAATTCGAGCACCCGAGCGAGGAGGACCTGAAGAGGATTGGATGTTTGAATCTACCCAGTCAGGTGGCCCAAGACCAGCAGGCGGAGAGCGACATGAGATTCCGTCACATAACAGAAATCACCATTTTGACAGTGCAGCTGATTGTCGAATTCGCCAAACGACTGCCCGGCTTCGACAAACTACTCAGAGAGGACCAGATTGTACTGCTCAAGGCATGTTCCAGCGAAGTGATGATGCTTCGCACGGCCAGAAAGTACGACGTGAACACAGACTCTATCCTGTTCGCCAACAACCAGCCCTACACGAGGGACTCCTACACGCTGGCGGGCATGGGTTATGTGGTGGAGG-3’；
[0019] NlEcR-A/B的反义链的核苷酸序列如下所示(360bp)：
[0020] 5’-CCTCCACCACATAACCCATGCCCGCCAGCGTGTAGGAGTCCCTCGTGTAGGGCTGGTTGTTGGCGAACAGGATAGAGTCTGTGTTCACGTCGTACTTTCTGGCCGTGCGAAGCATCATCACTTCGCTGGAACATGCCTTGAGCAGTACAATCTGGTCCTCTCTGAGTAGTTTGTCGAAGCCGGGCAGTCGTTTGGCGAATTCGACAATCAGCTGCACTGTCAAAATGGTGATTTCTGTTATGTGACGGAATCTCATGTCGCTCTCCGCCTGCTGGTCTTGGGCCACCTGACTGGGTAGATTCAAACATCCAATCCTCTTCAGGTCCTCCTCGCTCGGGTGCTCGAATTCGTTCTGGAAGT-3’；
[0021] 所述的蜕皮抑制杀虫剂应用于制备防治褐飞虱的药物。
[0022] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023] 目前防治褐飞虱的主要方法有农业防治、化学防治和生物防治。由于普及率难以提高和化学药物带来的抗性作用以及环境污染等问题，使得褐飞虱防治工作难以得到持续性发展。本发明通过利用褐飞虱自身生长发育相关的重要基因，筛选得到双链RNA，用以褐飞虱防治，效果显著。附图说明
[0024] 图1是饲喂0.1μg/μl dsEcRAs后褐飞虱的存活率图。
[0025] 图2是饲喂0.5μg/μl dsEcRAs后褐飞虱的存活率图。
[0026] 图3是饲喂0.1μg/μl dsEcRBs后褐飞虱的存活率图。
[0027] 图4是饲喂0.5μg/μl dsEcRBs后褐飞虱的存活率图。
[0028] 图5是饲喂0.1μg/μl dsEcRc后褐飞虱的存活率图。
[0029] 图6是饲喂0.5μg/μl dsEcRc后褐飞虱的存活率图。
[0030] 图7是饲喂dsRNA后褐飞虱的表型变化图。
[0031] 图8是饲喂0.1μg/μl dsEcRc 10天后的孵化后代数量图。
[0032] 图9是饲喂0.1μg/μl dsEcRAs后褐飞虱的mRNA表达量图。
[0033] 图10是饲喂0.5μg/μl dsEcRAs后褐飞虱的mRNA表达量图。
[0034] 图11是饲喂0.1μg/μl dsEcRc后褐飞虱的mRNA表达量图。
[0035] 图12是饲喂0.5μg/μl dsEcRc后褐飞虱的mRNA表达量图。
[0036] 图13是饲喂dsEcRc转基因水稻后褐飞虱的存活率图。
[0037] 图14是饲喂dsEcRc转基因水稻后褐飞虱的孵化后代数量图。
[0038] 图15是饲喂dsEcRc转基因水稻后褐飞虱的孵化后代数量图。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0040] 实施例1
[0041] (1)选 取褐 飞 虱 各龄 期 若虫 (J.Chen et al.，2010.Feeding-based RNA interference of a trhalose phosphate synthase gene in the brown planthopper，Nilaparvata lugens.Insect Molecular Biology.19(6)：777-786)。
[0042] (2)总RNA的提取：取20头若虫，液氮中研磨，用异硫氰酸胍法提取总RNA(J.Chen et al.，2010.Feeding-based RNA interference of a trhalose phosphate synthase gene in the brown planthopper，Nilaparvata lugens.Insect Molecular Biology.19(6)：777-786)。
[0043] (3)cDNA第一链的合成：按照CLONTECH公司RACE试剂 盒(Clontech BD TMSMART RACE cDNA Amplification Kit，Takara，Japan)说明书进行，10μg总RNA，加反应液20μl。42℃反应90min，72℃10min终止反应。每20μl反应液组成：50mmol氯化钾，
3mmol氯化镁，10mmol Tris-HCl pH8.3，1mmol DTT，5μmold NTP，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。
3mmol氯化镁，10mmol Tris-HCl pH8.3，1mmol DTT，5μmold NTP，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶。
[0044] (4)下面以NlEcR-A特异片段为例描述制备过程，NlECR-B特异片段和NlEcR-A/B共同保守片段的制备过程同NlEcR-A。
[0045] ①聚合酶链式反应试剂(TransTaq DNA聚合酶HiFi，北京全式金生物技术有限公司)和反应条件：
[0046] 首先在PCR管中加入下列试剂：
[0047]
[0048]
[0049] 上述聚合酶链式反应的具体步骤如下：
[0050] 将上述混合液94℃变性4min，然后进入下列循环：94℃30s，65℃30s，72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
[0051] 其 中，扩 增 NlEcR-A 特 异 片 段 的 上 游 引 物 EcR-AsF 的 序 列为：5 ′ -GCTAGTAAAGCGAGAACAGTTGG-3 ′；下 游 引 物 EcR-AsR 的 序 列 为：5′-GGACTGAGGCAGCTGTCATAG-3′；
[0052] 扩 增 NlEcR-B 特 异 片 段 的 上 游 引 物 EcR-BsF 的 序 列 为：5 ′ -GAGGAGGTGGAGGAGTAGTGATG-3 ′；下 游 引 物 EcR-BsR 的 序 列 为：
5′-GGTGACAGGTCTTCGCGTC-3′；
5′-GGTGACAGGTCTTCGCGTC-3′；
[0053] 扩 增 NlEcR-A/B 共 同 保 守 区 域 的 上 游 引 物 EcR-CF 的 序 列为：5 ′ -ACTTCCAGAACGAATTCGAGC-3 ′； 下 游 引 物 EcR-CR 的 序 列 为：5′-CCTCCACCACATAACCCATG-3′。
[0054] ②扩增产物纯化：利用OMEGA纯化试剂盒纯化PCR扩增片段。
[0055] ③中间载体获得：将纯化产物按照下面连接反应体系，克隆到pMD18-T载体(TAKARA公司产品)，转化大肠杆菌DH5α细胞(北京全式金生物技术有限公司产品)，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和5-嗅-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)的LB平板上过夜培养。
[0056] 连接反应体系：
[0057]
[0058] ④质粒的纯化：挑取白斑，接种于LB液体培养基，37℃摇床过夜培养后收取菌液，按OMEGA试剂盒提取质粒。
[0059] ⑤序列测定与同源检索：经测序结果分析，得到以下序列：
[0060] NlECR-A基因的核苷酸序列(长216bp)：
[0061] GCTAGTAAAGCGAGAACAGTTGGACGACACCACCCCGTTACGGGGGGGTTCCCCAAGGGGCAGCCCGACCCCCCAGGGGGGCCTGAGGGGCTCCTCGTGGCCCCCCTCGCCAAGGGACATGACTCCCTCCTATGGCGGGGGTGGCACTCCCCTAAATGGCTACCCTTCTCCCACCATGTCATCGCAGCACAGCAACTATGACAGCTGCCTCAGTCC；
[0062] NlECR-B基因的核苷酸序列(长223bp)：
[0063] GAGGAGGTGGAGGAGTAGTGATGGGTCATCATCTGCATCAGGCCGGCCTGGCAATGCTGCAGCAGCGGATGATGATGAGTCAGCATGGATTTCATCAGCAGAGTCAGCATCAGGGTGGGCTGCATCATGGTGGGACTACAACACTGGTGCGAGCGGCGGTTGCACATGTTTCGAGCAATGTGTCGGATAGCGGATCTGTGTCAGGACGCGAAGACCTGTCACC；
[0064] NlECR-A/B基因的核苷酸序列(长360bp)：
[0065] ACTTCCAGAACGAATTCGAGCACCCGAGCGAGGAGGACCTGAAGAGGATTGGATGTTTGAATCTACCCAGTCAGGTGGCCCAAGACCAGCAGGCGGAGAGCGACATGAGATTCCGTCACATAACAGAAATCACCATTTTGACAGTGCAGCTGATTGTCGAATTCGCCAAACGACTGCCCGGCTTCGACAAACTACTCAGAGAGGACCAGATTGTACTGCTCAAGGCATGTTCCAGCGAAGTGATGATGCTTCGCACGGCCAGAAAGTACGACGTGAACACAGACTCTATCCTGTTCGCCAACAACCAGCCCTACACGAGGGACTCCTACACGCTGGCGGGCATGGGTTATGTGGTGGAGG。
[0066] 含有NlECR-A基因的质粒命名为pMDR-EcRAs；含有NlECR-B基因的质粒，命名为pMDT-EcRBs；含有NlECR-A/B基因的质粒命名为pMDT-EcRc。
[0067] 实施例2
[0068] (1)设计带有T7启动的特异性引物，进行三个序列片段的dsRNA体外合成，同时亦设计绿色荧光蛋白基因的引物，作为作为对照。
[0069] NlEcR-As dsRNA扩增引物：
[0070] EcR-AsF：5′-GCTAGTAAAGCGAGAACAGTTGG-3′；
[0071] EcR-AsR：5′-GGACTGAGGCAGCTGTCATAG-3′；
[0072] EcR-AsT7F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGCTAGTAAAGCGAGAACAGTTGG-3′；
[0073] EcR-AsT7R：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGACTGAGGCAGCTGTCATAG-3′；
[0074] NlEcR-Bs dsRNA扩增引物：
[0075] EcR-BsF：5′-GAGGAGGTGGAGGAGTAGTGATG-3′；
[0076] EcR-BsR：5′-GGTGACAGGTCTTCGCGTC-3′；
[0077] EcR-BsT7F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGAGGAGGTGGAGGAGTAGTGATG-3′；
[0078] EcR-BsT7R：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGGTGACAGGTCTTCGCGTC-3′；
[0079] NlEcR-c dsRNA扩增引物：
[0080] EcR-cF：5′-ACTTCCAGAACGAATTCGAGC-3′；
[0081] EcR-cR：5′-CCTCCACCACATAACCCATG-3′；
[0082] EcR-cT7F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGACTTCCAGAACGAATTCGAGC-3′；
[0083] EcR-cT7R：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCCACCACATAACCCATG-3′；
[0084] GFP dsRNA扩增引物：
[0085] GFP-F：5′-GCACCATCTTCTTCAAGGACG-3′；
[0086] GFP-R：5′-ACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′；
[0087] GFP-T7F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGGCACCATCTTCTTCAAGGACG-3′；
[0088] GFP-T7R：5′-TAATACGACTCACTATAGGGACTCCAGCAGGACCATGTGAT-3′。
[0089] (2)分别以实施例1得到的名称为pMDT-EcRAs、pMDT-EcRBs和pMDT-EcRc的质粒为模板，使用步骤(1)设计的引物按照以下反应条件进行扩增，分别得到A片段、B片段和C片段。通过dsRNA合成试剂盒(T7RiboMAXTMExpress RNAi System，Promega，USA)法，合成这三个片段相应的dsRNA，命名为dsEcRAs，dsEcRBs和dsEcRc，单独混在褐飞虱人工饲料(Fu et al.，2001)中，对褐飞虱进行饲喂。采用dsRNA在人工饲料中终浓度为0.1μg/μl和0.5μg/μl两个梯度，持续饲喂10天，以绿色荧光蛋白的双链RNA dsGFP作为对照(上海吉然生物科技有限公司，pEGFP-N1质粒)。
[0090] PCR反应条件：94℃变性4min，然后进入下列循环：94℃30s，50℃30s，72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。
[0091] (3)在步骤(2)中提到的饲喂过程当中，统计褐飞虱每一天的存活率和观察表型变化，无论是在0.1μg/μl或0.5μg/μl浓度下，三个片段的dsRNA对褐飞虱的生长发育有显著影响，其存活率均与对照组存在显著差异(如图1～6所示)，并出现褐飞虱蜕皮障碍表型(如图7所示)。图7中，由dsEcRAs引起的蜕皮障碍主要集中在褐飞虱的头部和背部，由dsEcRBs引起的蜕皮障碍主要集中在褐飞虱的腹部和足，而由dsEcRc引起的蜕皮障碍表型则涵盖了以上所提到的。另外选取饲喂了dsEcRc后，羽化一天的短翅型单雌单雄进行配对，产卵15天后，统计孵化出来的后代数，与对照相比，有显著性降低(如图8所示)，说明通过对褐飞虱持续饲喂这三个片段的dsRNA，阻碍了褐飞虱的正常发育和繁殖。
[0092] (4)方法同步骤(2)，在饲喂dsRNA过程当中的2天，4天，8天，10天取样，通过荧光定量PCR的方法进行褐飞虱蜕皮激素受体基因的mRNA相对表达量变化，dsEcRAs和dsEcRc无论是在0.1μg/μl和0.5μg/μl浓度下，对NlEcR基因mRNA表达量均显著降低(如图9～12所示)。结果说明通过对褐飞虱持续饲喂dsEcRAs和dsEcRc片段的dsRNA，能有效干扰靶标基因的表达。
[0093] (5)在以上的功能分析基础上，我们选取片段三即NlECR-A/B基因保守核苷酸序列(长360bp)进行转基因水稻构建，由添加了相应酶切位点引物扩增得到正向序列(BamHI/SacI)和反向序列(HindIII/SalI)，扩增引物分别如下：
[0094] 正向序列上游引物(BamHI)：5′-CACTGGATCCACTTCCAGAACGAATTCGAGC-3′；
[0095] 正向序列下游引物(SacI)：5′-GACGAGCTCCCTCCACCACATAACCCATG-3′；
[0096] 反向序列上游引物(SalI)：5′-GACGTCGACCCTCCACCACATAACCCATG-3′；
[0097] 反向序列下游引物(HindIII)：5′-CACAAGCTTACTTCCAGAACGAATTCGAGC-3′。
[0098] 先将正向序列和反向序列连接到pSK-int载体(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab)上内含子两边，即形成发夹结构，其次通过SacI和SalI酶切得到正向序列+内含子+反向序列的结构，并连接到pCanG-HA(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab)转化载体T-DNA区中SacI和SalI酶切位点间，该载体以CaMV35S为启动子，以NPTII为筛选标记，随后通过农杆菌LBA4404(中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心-Biovector Science Lab)转化到水稻品种日本晴(广东省农业科学院水稻研究所)，以此获得能够表达褐飞虱蜕皮激素受体dsRNA的转基因水稻，通过存活率统计和表型观察以及繁殖力三个指标，评估该转基因水稻在褐飞虱防治中的作用。
[0099] 酶切反应体系：
[0100]
[0101] 酶切反应条件：37℃，酶切过夜。
[0102] 连接反应体系：
[0103]
[0104] 连接反应条件：16℃，反应过夜。
[0105] 选取7个转基因水稻株系进行实验，每株转基因苗上接入25头一龄褐飞虱若虫，持续饲喂11天，统计得到存活率约为90％(如图13所示)，与非转基因日本晴对照相比有差异；饲喂过程中，褐飞虱蜕皮障碍致死表型；将饲喂转基因水稻至羽化一天的褐飞虱成虫进行短翅型单雌单雄配对，产卵15天后，统计孵化出的后代数，与对照相比，均有显著降低(如图14和15所示)。以上结果表明，通过饲喂dsEcRc转基因水稻，能有效控制褐飞虱危害，为褐飞虱防治提供了新的研究方向和思路。
[0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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