携带基孔肯亚相关肽的纳米胶囊
阅读：560发布：2020-08-01
专利汇可以提供携带基孔肯亚相关肽的纳米胶囊专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含病毒 蛋白质 或其 片段 的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段被包封在自组装蛋白质 纳米胶囊 内，优选 铁 蛋白，并且其中所述病毒蛋白质或其片段选自披膜病毒科的病毒。所述病毒蛋白质或其片段还可进一步选自甲病毒亚科的病毒。，下面是携带基孔肯亚相关肽的纳米胶囊专利的具体信息内容。
1.一种包含病毒蛋白质或其片段的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段被包封在纳米胶囊内，并且其中所述病毒蛋白质或其片段选自披膜病毒科(Togaviridae)的病毒。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段选自由甲病毒属(alphavirus)和风疹病毒属(Rubivirus)组成的组。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述甲病毒属选自由以下组成的组：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述甲病毒属选自由基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒组成的组。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述甲病毒属是基孔肯亚病毒。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段是所述基孔肯亚病毒的表位。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段是针对选自由E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:ID NO：4)和CV(SEQ ID NO:6)组成的组的序列的共有序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段与选自由E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:4)和CV(SEQ ID NO:6)组成的组的病毒蛋白质或其片段具有至少约70％、约80％、约90％、约92％、约95％、约97％、约
98％或约99％的同一性。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段选自由E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP3突变体(SEQ ID NO:2)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:4)、E2EP5突变体(SEQ ID NO:5)和CV(SEQ ID NO:6)组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段与选自由E2EP3(SEQ ID NO:7)、E2EP4(SEQ ID NO:9)、E2EP5(SEQ ID NO:10)和CV(SEQ ID NO:12)组成的组的病毒蛋白质或其片段相差至少1个、至少2个或至少3个氨基酸。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段选自由E2EP3(SEQ ID NO:7)、E2EP3突变体(SEQ ID NO:8)、E2EP4(SEQ ID NO:9)、E2EP5(SEQ ID NO:10)、E2EP5突变体(SEQ ID NO:11)和CV(SEQ ID NO:12)组成的组。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米胶囊包含仅一种类型的病毒蛋白质或其片段，或其中所述纳米胶囊包含2种或3种或4种或更多种病毒蛋白质或其片段。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米胶囊是纳米笼。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述纳米胶囊是由选自由铁蛋白、脱铁铁蛋白和细菌铁蛋白组成的组的支架蛋白质形成的。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述支架蛋白质是从选自由哺乳动物、人科、马科、骆驼科、鼠科、细菌和古细菌组成的组的代表中分离的。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述代表选自由人、马、美洲驼、大鼠、小鼠和闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidus)组成的组。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述代表是闪烁古生球菌。
18.权利要求14所述的组合物，其中所述支架蛋白质是重组支架蛋白质。
19.权利要求14所述的组合物，其中所述支架蛋白质是针对SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的野生型铁蛋白的序列的共有序列。
20.权利要求14所述的组合物，其中所述支架蛋白质是突变的铁蛋白蛋白质，其中至少
1个、至少2个、至少3个或更多个氨基酸与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的野生型铁蛋白不同。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述突变铁蛋白具有根据SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段被连接到根据权利要求14到21中任一项所述的支架蛋白质。
23.根据权利要求23所述的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段通过接头序列被连接到所述支架蛋白质。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述接头序列包含(GXSY)Z形式的氨基酸。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述接头序列包含氨基酸SGG。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述纳米胶囊自组装。
27.一种诱发受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到26中任一项所述的组合物。
28.一种用于预防感染的疫苗，所述感染由选自由以下组成的组的物质引起：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒，所述疫苗包含根据权利要求1到26中任一项所述的组合物。
29.根据权利要求28所述的疫苗，其中所述病原选自由基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒组成的组。
30.一种预防或改善由病原引起的感染的方法，所述病原选自由以下组成的组：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1到26中任一项所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述病原选自由基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒组成的组。
32.一种核酸序列，其包含编码根据权利要求1到12中任一项所述的病毒蛋白质或其片段、根据权利要求23到25中任一项所述的接头序列和根据权利要求14到23中任一项所述的支架蛋白质的基因。
33.一种载体，其包含根据权利要求32所述的核酸序列。
34.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求33所述的载体。
35.一种生产根据权利要求1到26中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括●分离由根据权利要求33所述的载体表达的蛋白质，和
●添加足以催化所述纳米胶囊形成的量的催化剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述催化剂选自由Mn2+、Mg2+、Co2+、Pt、Fe3+和Fe2+组成的组。
携带基孔肯亚相关肽的纳米胶囊
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2015年1月29日提交的新加坡临时申请号10201500725U的优先权的权益，该新加坡临时申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。
技术领域
背景技术
[0004] 基孔肯亚病毒(CHIKV)是一种人类病原体，并且是非洲、印度和东南亚部分地区蚊媒性关节痛的主要原因之一。同一名称基孔肯亚疾病是由携带基孔肯亚病毒(CHIKV)的伊蚊属蚊子传播的。由于基孔肯亚症状与登革热非常相似，因此经常被误诊。在2006年，印度报道了共数1,390,322的疑似基孔肯亚热病例。该疾病在新加坡直到2008年才为人所知，当时新加坡经历了其连续第一波的基孔肯亚热病。根据新加坡卫生部和海峡时报，过去五年的感染总数约为1500人。没有具体的治疗或任何经过许可的疫苗来预防基孔肯亚，这种疾病仍然是公共健康的威胁。
[0005] 因此，需要开发针对基孔肯亚病毒引起的疾病的有效疫苗。
发明内容
[0007] 在一个方面，本发明涉及诱发受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的组合物。
[0008] 在另一方面，本发明涉及用于预防由选自由以下组成的组的病原引起的感染的疫苗：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒，所述疫苗包含如本文所述的组合物。
[0009] 在再一方面，本发明涉及预防或改善由选自由以下组成的组的病原引起的感染的方法：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。
[0010] 在又一方面，本发明涉及包含编码如本文所述的病毒蛋白质或其片段、如本文所述的接头序列和如本文所述的支架蛋白质的基因的核酸序列。
[0011] 在再又一方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸序列的载体。
[0012] 在一个方面，本发明涉及包含如本文所述的载体的分离的宿主细胞。
[0014] 当结合非限制性实施例和附图考虑时，参考具体实施方式将更好地理解本发明，其中：
[0015] 图1显示基孔肯亚病毒组合物/疫苗的基因结构域布置的示意图，所述基孔肯亚病毒组合物/疫苗包含表位(例如CHIKV表位)、接头序列(例如SGG)和支架蛋白质(例如铁蛋白)。NdeI、NHeI和BamHI是所述序列内或末端的限制位点。
[0016] 图2显示病毒基孔肯亚糖蛋白E2的示意性蛋白质建模图像，其显示各种蛋白质结构以及E2EP3表位的空间取向。
[0017] 图3显示分别由(A)野生型(AfFtn)和(B)突变型(AfFtn-AA)闪烁古生球菌(Archaeoglobulus fulgidus)铁蛋白形成的四级蛋白质结构的示意图。野生型铁蛋白(AfFtn；SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16)具有每六个亚单位具有三角形开口(直径约为)的独特的二十四聚体结构，而突变的铁蛋白AfFtn-AA是来自所述野生型的突变蛋白质，其中150位的氨基酸残基赖氨酸和151位的氨基酸残基精氨酸均被丙氨酸替代。作为突变的结果，AfFtn-AA具有封闭的球形结构。
[0018] 图4显示概括定点诱变的潜在机制的一般示意图。
[0019] 图5显示闪烁古生球菌铁蛋白蛋白质的示意图。单个亚单位的N-末端已被以较暗的阴影标记。在进行成功的亚单位生产和随后的24聚体组装后，附着的病毒表位应当从铁蛋白结构从每个亚单位的N末端突出出来。
[0020] 图6显示用于生产如本公开中所述的组合物的实验程序的示意性概图。
[0021] 图7显示不同构建体在LB琼脂板上生长的图像。(A)显示氨苄青霉素板上用pCVAf-IDT质粒转化的DH5α细胞的集落形成。(B)显示氨苄青霉素板上用pCVcAf-IDT质粒转化的DH5α细胞的集落形成。(C)显示在没有选择抗生素的LB琼脂上空白DH5α细胞的集落形成，其显示DH5α细胞是活的并且能够在LB琼脂板上生长。(D)显示具有氨苄青霉素的LB琼脂板上没有DH5α细胞(阴性对照)的集落形成。
[0022] 图8显示定点诱变后的pCVAf的测序结果(顶线)与理论DNA(底线)序列的比较。加框部分显示已发生诱变的位点。
[0023] 图9显示描绘pET-11a载体上的pCV-AfFtn-AA和pCVc-AfFtn-AA在BL21(DE3)Codon Plus-RIL细胞中的基因过表达的生长曲线的线图。
[0025] 图11显示比较用于动态光散射分析(DLS)的较大和较小粒子的光散射背后的理论的示意图。
[0026] 图12显示描绘批次1过表达后的结果的SDS-PAGE凝胶的图像。A：具有IPTG的pCVAf-pET11a/BL21B：具有IPTG的pCVcAf-pET11a/BL21C：pCVAf-pET11a/BL21D：pCVcAf-pET11a/BL21。
[0027] 图13显示代表BSA标准曲线的线图。
[0028] 图14显示描绘批次1上清液的热稳定性测试的结果的SDS-PAGE凝胶的图像。
[0029] 图15显示描绘批次2样品的热稳定性测试的结果的SDS-PAGE凝胶的图像。
[0030] 图16显示示出具有0.5M硫酸铵的7mL CVAf的疏水相互作用色谱(HIC)的色谱图的图(A)和描绘具有0.5M硫酸铵的7mL CVAf的相应SDS-PAGE结果的图像(B)。
[0031] 图17显示示出具有0.5M硫酸铵的8mL CVcAf的疏水相互作用色谱(HIC)的色谱图的图(A)和描绘具有0.5M硫酸铵的8mL CVcAf的相应SDS-PAGE结果的图像(B)。
[0032] 图18显示示出具有0.5M硫酸铵的13mL CVAf的疏水相互作用色谱(HIC)的色谱图的图(A)和描绘具有0.5M硫酸铵的13mL CVAf的相应SDS-PAGE结果的图像(B)。
[0033] 图19显示示出具有1M硫酸铵的15mL CVcAf的HIC结果的图(A)和描绘具有1M硫酸铵的15mL CVcAf的相应SDS-PAGE结果的图像(B)。
[0034] 图20显示描绘如使用动态光散射(DLS)确定的纯化的CVAf的大小分布的图。
[0035] 图21显示描绘如使用动态光散射(DLS)确定的纯化的CVcAf的大小分布的图。
[0036] 图22显示pCVAf-pET-11a的序列比对比较。
[0037] 图23显示pCVcAf-pET-11a的序列比对比较。
[0038] 图24显示本文所用的序列的概图。
[0039] 定义
[0040] 如本文所用的术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括诸如氨基酸的分子的化学活性表面基团、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗原的被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，抗体被认为特异性结合抗原。
[0041] 如本文所用的术语“纳米胶囊”是指具有包围形成芯的空间的壳体的囊状体系或中空粒子，其可用于在纳米级水平上运输有效载荷。纳米胶囊还可以是纳米大小形式的容器。纳米胶囊的有效载荷可以是但不限于药物、药剂、药物组合物、化学组合物、治疗组合物、生物大分子、染料、生物材料、免疫组合物、营养组合物、维生素、蛋白质、核酸、抗体和疫苗。各种材料可用于生产此类纳米胶囊。如本文所用的术语“纳米笼”是指如下纳米胶囊，其中外壳不是如针对纳米胶囊所述的实心的，而是在其壳体中具有多个洞或孔，从而使得纳米笼核心内的有效载荷与周围的环境接触成为可能。这些洞或孔在粒子表面上的形状和/或间隔可以是规则的或不规则的。
[0042] 如本文所用的术语“蛋白质”或“多肽”是指其中单体是通过酰胺键接合在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可使用L-旋光异构体或D-旋光异构体，性质上优选L-异构体。如本文所用的术语多肽或蛋白质涵盖任何氨基酸序列，并且包括但不限于经修饰的序列，例如糖蛋白。术语“多肽”特别意在涵盖天然存在的蛋白质，以及重组或合成产生的蛋白质。如本文所用的基本纯化的多肽是指基本上不含与其天然缔合的其他蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料的多肽。
[0043] 提供功能相似氨基酸的保守氨基酸替换表是本领域普通技术人员所熟知的。以下六组是被认为是供彼此保守替换的氨基酸的示例：
[0044] 1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
[0045] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0046] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0047] 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
[0048] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
[0049] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0050] 非保守氨基酸替换可由以下的变化引起：(a)替换区域中氨基酸骨架的结构；(b)氨基酸的电荷或疏水性；或(c)大部分氨基酸侧链。通常预计产生蛋白质性质最大变化的替换是如下的那些：(a)亲水性残基被(或由)疏水性残基替换；(b)脯氨酸被(或由)任何其他残基替换；(c)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)被(或由)不具有侧链的残基(例如甘氨酸)替换；或(d)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)被(或由)负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)替换。
[0052] 如本文所用的术语“融合蛋白质”是指与异源蛋白质或肽融合的蛋白质或结构域(例如可溶性细胞外结构域)。此类融合蛋白质的示例包括表达为与一部分免疫球蛋白分子的融合物的蛋白质、表达为具有拉链部分的融合蛋白质的蛋白质，以及新的多功能蛋白质，例如细胞因子和生长因子的融合蛋白质(即GM-CSF和IL-3，MGF和IL-3)。
[0053] 如本文所使用的术语“自组装”是指如下过程，其中预先存在的组分的无序体系在没有外部引导的情况下由于组分本身之间的特定的局部相互作用而形成有组织的结构或图案。当组成型组分为分子时，该过程被称为分子自组装。自组装可分为静态或动态。在静态自组装中，当系统接近平衡时，形成有序状态，从而了降低了其自由能。然而，在动态自组装中，通过特定的局部相互作用而组织的预先存在的组分的图案在本领域内通常不被描述为自组装的，而是被更好地描述为“自组织的”。
[0054] 如本文所用的术语“共有序列”是指在DNA或RNA的相当区域中(例如在不同基因的启动子区(操纵子)中)发现的核苷酸序列，其中某些碱基以显著大于通过偶然预计的频率出现。尽管此类序列可根据情况而变化，但是可能推导出总体上最可能的序列。原核生物启动子的普里布诺框(Pribnow box)中的共有序列的一个示例。术语“共有序列”也适用于多肽中的氨基酸序列。
[0055] 如本文所用的术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列或氨基酸序列在比较窗口内相同(即基于核苷酸对核苷酸或残基对残基或基于蛋白质对蛋白质)的概念。通过以下方式计算术语“序列同一性百分比”：在比较窗口内比较两个最佳比对序列，确定在其上相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基存在于两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。如本文所用的术语“大致同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中所述多核苷酸或氨基酸包含在至少30个核苷酸(10个氨基酸)位置的比较窗口内，通常在至少24到60个核苷酸(8到18个氨基酸)位置的窗口内，与参考序列相比具有至少85％序列同一性、或至少90％到95％序列同一性的序列、或至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗口内比较参考序列与可能包括占参考序列总共20％或更少的缺失或添加的序列来计算。参考序列可以是较大序列的子集。
[0056] 如本文所用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”是指可用于在受试者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已被接种抗原之后，疫苗相对于未接种疫苗的受试者预防、延迟或减轻暴露于同一抗原或相关抗原的受试者中疾病发展的严重性。由疫苗提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导的)免疫或细胞免疫，或两者兼有。疫苗接种可例如消除或降低病原体或受感染细胞的负载，或产生任何其他可测量的感染缓解。疫苗接种还可降低受免疫(接种疫苗)受试者的肿瘤负荷。疫苗可含有产生除抗原以外或代替抗原的抗原的任何一种或多种组分(例如，载体)。术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意指可将核酸序列(例如外源基因)引入宿主细胞中以转化所述宿主并促进引入的抗原序列的表达(例如，转录和/或翻译)的载体。载体包括质粒、噬菌体和病毒(例如RNA病毒，例如逆转录病毒和慢病毒)。
[0057] 如本文所用的术语“突变”或“变体”是指核酸或多肽序列中的变化。该术语还可以包括对基本相似序列的指代。通常，本发明的核酸序列突变编码保持与“非变体”或“野生型”核酸序列编码的多肽共同的定性生物活性和/或功能的多肽。通常，本发明的多肽序列突变还具有与“非变体”多肽共同的定性生物活性和/或功能。此外，这些突变的多肽序列可与“野生型”多肽具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。可使用例如本领域所熟知的蛋白质工程和定点诱变的方法来制备突变体。
[0058] 除了突变体或变体氨基酸序列之间的序列同一性的差异之外，变体氨基酸序列应保持非变体氨基酸序列的预定功能。
[0059] 如本文所用的术语“免疫显性”是指抗原中优先被T细胞识别的表位，使得对那些表位特异性的T细胞来支配免疫应答。因此，免疫显性是仅针对所产生的许多抗原肽中的几种抗原肽产生免疫应答的免疫现象。也就是说，尽管存在例如主要组织相容性复合体(MHC)分子和呈递于抗原呈递细胞上的其他多种肽的多种等位基因变异，但是免疫应答倾向于仅对这两者的特定组合作出应答。抗体介导的免疫和细胞介导的免疫这两者的免疫显性是显而易见的。在免疫应答期间未被靶向或靶向较低程度的表位被称为亚显性表位。免疫显性的影响是其中免疫显性表位削弱针对非显性表位的免疫应答的免疫优势(immunodomination)。抗原呈递细胞，例如树突细胞，可具有最多达六种不同类型的MHC分子用于抗原呈递。存在从病原体的蛋白质产生数百到数千种不同肽的潜力。然而，对病原体具有反应性的效应细胞群体由仅识别某一类别的主要组织相容性复合体(MHC)的细胞占优势，所述类别仅结合到由该MHC类别呈递的某些病原体来源肽。来自特定病原体的抗原可具有可变的免疫原性，其中刺激最强应答的抗原是免疫显性的抗原。抗原之间的不同免疫原性水平形成了称为优势层级的概念。
[0060] 如本文所用的术语“异种亚型免疫”是指由除了导致原发性感染的病毒以外的病毒的感染而产生的交叉保护。例如，当被用于原发性感染的A型流感病毒之外的另一A型流感病毒感染时，A型流感病毒血清型可赋予受试者以交叉保护。因此，异种亚型免疫描述了其中一种病毒的感染能够诱导针对该病毒的不相关的亚株的免疫的情况。
具体实施方式
[0061] 基孔肯亚病毒是一种人类病原体，并且是非洲、印度和东南亚部分地区蚊媒性关节痛的主要原因之一。其症状包括发热、发疹、关节痛和头痛。由于这些症状与登革热非常相似，因此基孔肯亚经常被误诊为登革热。尽管基孔肯亚在正常情况下并不导致致命的病例，但关节痛可能持续数周到数月的延长时期，并且可能成为慢性衰弱性疼痛和扭曲姿势的原因。由于缺乏针对这种疾病的特定治疗和经许可的疫苗，因此迫切需要开发有效的疫苗。使用蛋白质笼作为载体以在受试者中获得更好的抗原呈递和免疫刺激。
[0062] 本发明的基本构思是通过遗传整合所选表位的核酸序列与蛋白质笼的核酸序列、之后在表达系统例如大肠杆菌(Escherichia coli)过表达系统中表达重组核酸序列(DNA)来进行疫苗开发的方法。使用蛋白质笼作为表位载体的优点包括保护表位免受由先天免疫引起的过早降解、控制药物代谢动力学以及改善细胞内渗透。因此，本发明公开了一种新的递送疫苗的方式，所述疫苗在铁蛋白蛋白质笼上展示病毒表位(例如基孔肯亚表位)。因此，在一个示例中，本公开描述了包含病毒蛋白质或其片段的组合物，其中所述病毒蛋白质或其片段被包封在纳米胶囊内。在一个示例中，对于10个氨基酸的较短病毒蛋白质，已形成了纳米胶囊结构，而对于18个氨基酸的较长病毒蛋白质，亚单位可能不形成正确的蛋白质笼，而是可聚集成更大的直径并需要更多的表征。因此，在一个示例中，病毒蛋白质长1至18个氨基酸。在另一示例中，病毒蛋白质的长度可以是但不限于约2个氨基酸、约3个氨基酸、约4个氨基酸、约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个约氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸或约17个氨基酸。在一个示例中，病毒蛋白质长约6个氨基酸。在另一示例中，病毒蛋白质长约18个氨基酸。
[0063] 以上组合物可与来自不同病毒的不同表位一起使用。例如，披膜病毒科是具有单链、正义RNA基因组的病毒科。披膜病毒科也属于巴尔的摩病毒分类第IV组。该病毒科进一步分为两个属，即甲病毒属(alphavirus)和风疹病毒属(rubivirus)，两者之间的区别在于前者的基因组是分段的或多部分的，后者的基因组是单部分的，这意味着具有单个核酸分子或核酸链。此外，后一属目前包含一个代表，即风疹病毒。因此，在另一示例中，所述组合物包含来自披膜病毒科的病毒的病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，病毒蛋白质或其片段可以是但不限于甲病毒属。在再一示例中，病毒蛋白质或其片段可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒。在另一示例中，病毒蛋白质或其片段可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒。在再一示例中，病毒蛋白质或其片段来自基孔肯亚病毒。
[0064] 如本文所述，通过在包含支架蛋白质(例如铁蛋白)的蛋白质纳米笼上展示来自例如基孔肯亚病毒的病毒表位来设计新型疫苗平台。这些病毒表位可以是但不限于免疫原性病毒蛋白质，来自例如但不限于以下的病毒：奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒、基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒，它们全部是披膜病毒科甲病毒属的代表。在另一示例中，病毒表位可以来自但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒。在一个示例中，本公开涉及例如基孔肯亚病毒的免疫显性的线性B细胞表位在施用后即接种疫苗后的受试者中诱导中和抗体的产生的用途。本公开进一步描述了用于在疫苗制剂中呈递免疫显性肽的纳米胶囊的开发。此外，还涵盖用于治疗基孔肯亚病毒感染以及其他甲病毒感染的预防剂的制备。
[0065] 表位是抗原的一部分，其识别导致受所述病原体感染的宿主或受试者的免疫系统的免疫应答。因此，当设计被设计成诱发免疫应答的疫苗或组合物时，应当选择能够尽可能广泛地诱发免疫应答的表位，以便使所述疫苗或组合物的免疫潜力最大化。例如，通过使用在基孔肯亚感染患者的早期恢复期获得的血浆，证明控制所述应答的早期中和性IgG3抗体对单一的线形表位大多是特异性的。这些早期中和性IgG3抗体的该表位被称为“E2EP3”(SEQ ID NO:1)，并且位于E2病毒糖蛋白的N末端，如图2中所示。基于进一步的实验数据，证明E2EP3的核心结合区(SEQ ID NO:6)包含氨基酸3到10。还已经证实，用E2EP3肽接种的小鼠在病毒攻击后显示出降低的病毒血症和仅有轻微的关节炎症，为针对基孔肯亚病毒的有效疫苗的设计提供了进一步的基础。为此，在弗氏佐剂存在下，用匙孔血蓝蛋白(KLH)共价连接的E2EP3接种C57BL/6小鼠。在21天的时期内，用免疫原(首先用不完全[CFA]乳化，然后用不完全弗氏佐剂[IFA]乳化)对小鼠初免并加强两次。在第一次加强后接种后19天检测到显著的抗E2EP3滴度(数据未显示)，并且在接种后第27天第二次加强后进一步增加(数据未显示)。重要的是，在接种后27天获得的血清能体外中和CHIKV感染。与接种PBS的对照组相比，感染性降低了大约40％(数据未显示)。此外，在接种后30天，小鼠中的病毒攻击指示通过E2EP3进行的部分保护，因为病毒血症在攻击后2天从4500pfu/ml降低到2000pfu/ml。病毒滴度的这一降低也反映在用于监测病毒诱导的炎症的临床症状中(数据未显示)。PBS接种组中最大的足垫肿胀是E2EP3接种组的两倍以上(数据未显示)。
[0066] 由于基孔肯亚病毒是披膜病毒科的甲病毒属的代表，因此存在可能与甲病毒属和风疹病毒属的其余成员发生异种亚型免疫的可能性。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段是甲病毒属和/或风疹病毒属。在另一示例中，所述组合物如本文所述，其中甲病毒属可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒。在另一示例中，所述组合物如本文所述，其中甲病毒属可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒。在另一示例中，甲病毒属是基孔肯亚病毒。
[0067] 例如，基孔肯亚病毒表位已经从受感染的人血浆样品中被分离出来，并且被证明在性质上是线性的。证明将若干表位(例如但不限于E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:4))遗传融合到蛋白质纳米笼平台上并不影响蛋白质纳米笼的自组装性质和形态。蛋白质纳米笼的对称转换性质允许对所展示的表位进行进一步的空间控制。
[0068] 如本文所述，E2EP3的全序列(SEQ ID NO:1)和E2EP3的核心结合序列(SEQ ID NO:6)均被用作基孔肯亚病毒表位。本发明中还利用例如蛋白质E2EP4(SEQ ID NO:3)和E2EP5(SEQ ID NO:4)。为了实现在大肠杆菌过表达系统中更好的蛋白质生产，E2EP3的核酸序列被优化为如表2中所示随后与支架蛋白质(例如铁蛋白)遗传融合。
[0069]
[0070] 表2.E2EP3表位和核心E2EP3表位的优化核酸序列
[0071] 简单地说，在一个示例中，基孔肯亚病毒表位E2EP3是由于其已证实的诱发广泛的免疫应答的能力而被选择的。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段是基孔肯亚病毒的表位。
[0072] 在另一示例中，完全表位(E2EP3；SEQ ID NO:1)和E2EP3的核心结合序列(E2EP3CV；SEQ ID NO:6)以及蛋白质E2EP4(SEQ ID NO:3)和E2EP5(SEQ ID NO:4)被用于本公开中。共有序列也可被用于本发明中，因为这些共有序列根据定义与靶表位的序列相似，并且借助于它们的定义而被认为是足够相似的，从而在被提供给受试者时也诱发免疫应答。因此，在一个示例中，所述组合物包含病毒蛋白质或其片段，其中所述病毒蛋白质或其片段是针对但不限于E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:4)和E2EP3CV(SEQ ID NO:6)的序列的共有序列。
[0073] 此外，已知具有与靶表位的同一性相似同一性的蛋白质也能够在受试者中诱发免疫应答，这与靶表位的准确序列的相似。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段具有所述病毒蛋白质或片段的至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性。在另一示例中，病毒蛋白质或其片段具有所述病毒蛋白质或片段的100％的同一性。在一个示例中，使用核酸序列确定如本文所公开的同一性。在另一示例中，使用氨基酸序列确定如本文所述的同一性。
[0074] 鉴于以上情况，与总序列的百分比相反，蛋白质之间的差异还可被描述为序列的微小变化。这适用于所讨论的核酸以及蛋白质序列两者。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段与病毒蛋白质或其片段相差至少1个、至少2个或至少3个氨基酸。在另一示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段可以是但不限于E2EP3(SEQ ID NO:1)、E2EP3突变体(SEQ ID NO:2)、E2EP4(SEQ ID NO:3)、E2EP5(SEQ ID NO:4)、E2EP5突变体(SEQ ID NO:5)和E2EP3CV(SEQ ID NO:6)的核酸序列。在再一示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段可以是但不限于E2EP3(SEQ ID NO:7)、E2EP3突变体(SEQ ID NO:8)、E2EP4(SEQ ID NO:9)、E2EP5(SEQ ID NO:10)、E2EP5突变体(SEQ ID NO:11)和E2EP3CV(SEQ ID NO:12)的蛋白质序列。在再一示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段可以是但不限于E2EP3(SEQ ID NO:7)、E2EP4(SEQ ID NO:9)、E2EP5(SEQ ID NO:10)、E2EP3CV(SEQ ID NO:12)的蛋白质序列。
[0075] 如本领域已知的，包含免疫原性蛋白质或其片段的疫苗和/或组合物还可包含超过一种的免疫原性蛋白质。疫苗可包含一种特定抗原或一种特定表位，而一些包含整个失活的病毒，其中由失活的病毒呈递的抗原可具有不同的表位，并且不一定限于一种特定类型的蛋白质或表位。因此，本公开还涵盖在如本文所述的组合物中使用超过一种的病毒蛋白质。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中纳米胶囊包含仅一种类型的病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，纳米胶囊包含至少1种、2种、3种、4种、5种或更多种病毒蛋白质。在另一示例中，纳米胶囊包含2种病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，纳米胶囊包含3种病毒蛋白质或其片段。在再一示例中，纳米胶囊包含4种或更多种病毒蛋白质或其片段。
[0076] 疫苗生产领域中现有的广泛使用的技术由单独产生并随后偶联在一起的表位和载体蛋白质组成。然而，如本文所述的本发明的这种方法是生产整个疫苗或组合物的单步方法。这通过在核酸水平上整合表位与蛋白质笼来完成。这意味着所述表位的核酸序列与构成纳米胶囊的蛋白质亚单位的核酸序列融合。该核酸序列的表达产生在一个构建体中包含蛋白质表位和纳米胶囊蛋白质的融合蛋白质。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中病毒蛋白质或其片段连接到支架蛋白质。因此，在一个方面，本公开描述了生产如本文所述的组合物的方法，所述方法包括分离由如本文所述的载体表达的蛋白质，和添加足以催化纳米胶囊形成的量的催化剂。
[0077] 接头序列可在病毒蛋白质或其片段和支架蛋白质之间插入。此类接头序列的插入可对所得蛋白质具有结构和/或物理作用，例如降低蛋白质之间的潜在静电排斥或改善所得蛋白质链中的任何可能的空间效应。因此，在一个示例中，病毒蛋白质或其片段通过接头序列连接到支架蛋白质。接头序列的长度取决于其功能。如果意在阻止所得蛋白质中产生的任何空间效应，则取决于待阻止的期望效应，将需要长或短的接头序列。例如，接头序列可包含单个氨基酸。接头序列还可包含2个或3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或15个或更多个氨基酸。接头序列还可包含2到20个氨基酸。在一个示例中，接头序列包含7个氨基酸。在另一示例中，接头序列包含3个氨基酸。用于构成接头的氨基酸可以全部为天然氨基酸，或全部为非天然氨基酸，或其组合。在一个示例中，通常使用的接头是遵循(BxJy)z形式的接头，其中x、y、z是表示相应氨基酸的重复数的任何整数或其组合，并且其中B和J代表任何天然或非天然的氨基酸。在另一示例中，接头序列可遵循(GxSy)z形式，其中G是甘氨酸并且S是丝氨酸。在另一示例中，G和S在形式(GxSy)z中的位置可以互换。在一个示例中，x、y和z可独立地为1到20的整数。在一个示例中，x、y和z可独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在另一示例中，x可以是1或2或3。在再一示例中，z可以是1或2或3。在另一示例中，y可以是1或2或3。在另一示例中，x可以是1，并且y可以是3。在再一示例中，x可以是1，y可以是3，并且z可以是1。在另一示例中，x可以是3，并且y可以是1。在再一示例中，X可以是1，并且y可以是2。在再一示例中，x可以是1，y可以是2，并且z可以是2。在一个示例中，接头序列包含氨基酸GSSS。在另一示例中，接头序列包含氨基酸GGGS。在又一示例中，接头序列包含氨基酸GSSGSSG。在另一示例中，接头序列包含氨基酸SGG。在再一示例中，接头序列如本文所述，并且插入在病毒表位和作为支架蛋白质的示例的铁蛋白之间。
在另一示例中，接头序列包含氨基酸SGG并插入在病毒表位和作为支架蛋白质的示例的铁蛋白之间。
在另一示例中，接头序列包含氨基酸SGG并插入在病毒表位和作为支架蛋白质的示例的铁蛋白之间。
[0078] 在本公开中，用于产生病毒蛋白质构建体的方法是通过核酸序列在微生物例如大肠杆菌(E.coli)中的基因过表达，其中用重组质粒转化所述微生物的细胞，所述重组质粒包含例如病毒蛋白质(例如基孔肯亚表位或其片段)的核酸序列和通过接头连接到所述表位的支架蛋白质(例如铁蛋白)。使用本领域已知的方法，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)作为表征工具，在一个示例中证明所表达的蛋白质被转化的大肠杆菌细胞成功地产生，并且通过如本领域已知的疏水相互作用色谱对所述蛋白质进行的纯化是成功的。使用如本领域已知的动态光散射技术对蛋白质笼的表征证明构建体之一形成了蛋白质笼。由于病毒蛋白质或表位整合到形成纳米胶囊所需的支架蛋白质，因此其被展示在每个纳米胶囊亚单位的N末端上。本发明不是单独地表达期望的病毒蛋白质和支架蛋白质并随后用期望的病毒蛋白质填充所得纳米胶囊，或将支架蛋白质直接融合到病毒蛋白质，而是表达载体，其中例如支架蛋白质通过接头序列融合到病毒蛋白质，由此表达蛋白质构建体，所述蛋白质构建体由于支架蛋白质的存在而将在催化剂存在下自组装成纳米胶囊。
[0079] 携带肽序列的纳米胶囊可在本发明中用于肽疫苗呈递和递送。纳米胶囊可展示多个基孔肯亚病毒表位和/或来自具有限定的空间布置的其他病毒或亚株的表位。可以通过蛋白质笼的对称转换来调节空间布置。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中纳米胶囊是纳米笼。在另一示例中，所述组合物如本文所述，其中纳米胶囊自组装。
[0080] 纳米胶囊由以受控方式自组装的多个亚单位组成。每个亚单位可连接到单个表位，使得与亚单位数目一样多的多个表位展示于纳米胶囊上。纳米胶囊亚单位在痕量金属(例如铁)存在下或高离子浓度的情况下自组装。因此，在一个示例中，催化剂是金属。在一个示例中，催化剂是铁或铂。在另一示例中，催化剂是二价金属。在再一示例中，催化剂是但2+ 2+ 2+ 3+ 2+ 3+ 2+
不限于Mn 、Mg 、Co 、Pt、Fe 或Fe 。在另一示例中，催化剂是Fe 或Fe 。通过利用纳米胶囊的自组装性质，除了展示相同类型的多个表位之外，还可能展示不同类型的多个表位。这意味着连接到一种类型的表位(例如A)的亚单位可与连接到其他类型的表位(例如B)的其他亚单位混合。因此，当添加痕量金属后，纳米胶囊自组装并因此在其表面上展示A和B两者。因此，纳米胶囊的组装可使用多个亚单位进行，其中每个亚单位可能包含彼此不同的表位，或者所有亚单位都包含相同的亚单位。还可能在纳米胶囊的形成中使用至少1种、2种、3种、4种或更多种表位之间的任何种的比率。因此，在一个示例中，纳米胶囊展示一种类型的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示不同的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示至少两种不同的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示三种或更多种不同的表位。能够被展示的表位的类型与构成纳米胶囊的亚单位的数目一样多，导致多个表位的展示。例如，在铁存在下，铁蛋白是24聚体构建体，因此由24个亚单位组成。这意味着在一个示例中，铁蛋白纳米笼能够展示24种不同的表位。因此，在一个示例中，纳米胶囊展示24种不同的表位。
不限于Mn 、Mg 、Co 、Pt、Fe 或Fe 。在另一示例中，催化剂是Fe 或Fe 。通过利用纳米胶囊的自组装性质，除了展示相同类型的多个表位之外，还可能展示不同类型的多个表位。这意味着连接到一种类型的表位(例如A)的亚单位可与连接到其他类型的表位(例如B)的其他亚单位混合。因此，当添加痕量金属后，纳米胶囊自组装并因此在其表面上展示A和B两者。因此，纳米胶囊的组装可使用多个亚单位进行，其中每个亚单位可能包含彼此不同的表位，或者所有亚单位都包含相同的亚单位。还可能在纳米胶囊的形成中使用至少1种、2种、3种、4种或更多种表位之间的任何种的比率。因此，在一个示例中，纳米胶囊展示一种类型的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示不同的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示至少两种不同的表位。在另一示例中，纳米胶囊展示三种或更多种不同的表位。能够被展示的表位的类型与构成纳米胶囊的亚单位的数目一样多，导致多个表位的展示。例如，在铁存在下，铁蛋白是24聚体构建体，因此由24个亚单位组成。这意味着在一个示例中，铁蛋白纳米笼能够展示24种不同的表位。因此，在一个示例中，纳米胶囊展示24种不同的表位。
[0081] 铁蛋白是由几乎所有活生物体产生的普遍存在的蛋白质。它具有在铁的存在下自组装成24聚体的性质。闪烁古生球菌野生型铁蛋白(AfFtn；SEQ ID NO:15或16)由于其超热稳定性、其如图3中所示的独特结构和与人铁蛋白的高度结构相似性而可被选择作为本文所用的特定类型的铁蛋白。脱铁铁蛋白是不结合铁的铁蛋白。因此，在一个示例中，所述组合物如本文所述，其中由支架蛋白质形成的纳米胶囊可以是但不限于由铁蛋白、脱铁铁蛋白和细菌铁蛋白组成的组。在另一示例中，支架蛋白质是脱铁铁蛋白。在另一示例中，支架蛋白质是铁蛋白。在再一示例中，支架蛋白质是人铁蛋白，在另一示例中，支架蛋白质是细菌铁蛋白。在一个示例中，所述组合物如本文所公开的，其中支架蛋白质是针对SEQ ID NO:13(DNA)或SEQ ID NO:14(蛋白质)的野生型铁蛋白的序列的共有序列。在另一示例中，支架蛋白质是突变的铁蛋白蛋白质，其中至少1个、至少2个、至少3个或更多个氨基酸与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的野生型铁蛋白不同。在再一示例中，突变的铁蛋白具有根据SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的序列。在一个示例中，如本文所公开的支架蛋白质是重组支架蛋白质。在另一示例中，从闪烁古生球菌(AfFtn)中分离如本文所公开的支架蛋白质。本领域技术人员将知道可从哪些其他生物体分离铁蛋白。
[0082] 野生型铁蛋白(AfFtn；SEQ ID NO:15或16)和突变体铁蛋白(AfFtn-AA；SEQ ID NO:13或14)铁蛋白两者均被用作如本文所公开的纳米笼。野生型铁蛋白(AfFtn)具有每6个亚单位具有1个三角形开口(直径约为 )的独特的二十四聚体结构，而突变形式的铁蛋白(AfFtn-AA)是来自所述野生型的突变蛋白质，其中150位的氨基酸残基赖氨酸和151位的氨基酸残基精氨酸均被丙氨酸替代。作为突变的结果，突变的铁蛋白(AfFtn-AA)具有如图3中所示的闭合的球形结构。可使用定点突变或本领域已知的其他机制在野生型序列中进行突变。突变可以是沉默突变，或者可以是导致所得蛋白质的更高稳定性或导致所得多肽的不同空间布置的突变。突变通常在核酸水平上进行，它们产生的变化在蛋白质水平上是可见的。
[0083] 例如铁蛋白(AfFtn)的独特结构也提供了平台来研究在不同形状的蛋白质笼上展示表位的不同方式。利用两种类型的表位和两种类型的铁蛋白，在本公开中存在4种类型的最终构建体，如表3中所示。
[0084]
[0085] 表3.四种类型的构建体
[0086] 因此，在本公开中，在一个示例中，所述组合物包含纳米胶囊和从甲病毒属分离的病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，所述组合物包含纳米笼和从甲病毒属分离的病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，所述组合物包含如本文所述的纳米胶囊和来自甲病毒属的病毒蛋白质或其片段，其中所述甲病毒属是基孔肯亚病毒。在再一示例中，所述组合物包含纳米笼和从甲病毒属分离的病毒蛋白质或其片段。在又一示例中，所述组合物包含纳米笼和从基孔肯亚病毒分离的病毒蛋白质或片段。在一个示例中，所述组合物包含含有支架蛋白质铁蛋白的纳米胶囊和从甲病毒属分离的病毒蛋白质或其片段。在另一示例中，所述组合物包含含有支架蛋白质铁蛋白的纳米笼和从甲病毒属分离的病毒蛋白质或其片段。
[0087] 如本文所公开的本发明还包含病毒蛋白质或其片段过表达所需的核酸序列和用于组装纳米胶囊的支架蛋白质。因此，在一个示例中，本公开描述了包含如本文所述的核酸序列的载体。在另一示例中，如本文所述的组合物包含含有编码如本文所述的病毒蛋白质或其片段、如本文所述的接头序列和如本文所述的支架蛋白质的基因的载体。然后将如上所述的载体转化到用于过表达期望蛋白质的细胞中，例如转化到大肠杆菌细胞中。因此，本公开涉及包含如本文所公开的载体的分离的宿主细胞。
[0088] 本公开还提供了所述组合物在受试者中诱发免疫应答的方法的形式的用途。因此，在一个示例中，本公开涉及在受试者中诱发免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的组合物。在另一示例中，提供了用于预防由甲病毒属引起的感染的疫苗。或者，在另一示例中，公开了用于预防由病原引起的感染的疫苗，其中所述病原可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒，所述疫苗包含如本文所述的组合物。在再一示例中，提供了用于预防由病原引起的感染的疫苗，其中所述病原可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒，所述疫苗包含如本文所述的组合物。在本文所述的另一示例中是预防或改善由甲病毒属引起的感染的方法。在一个示例中，甲病毒属可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒。在另一示例中，甲病毒属可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒，所述方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。在另一示例中，本文描述了如本文所述的组合物用于在受试者中诱发免疫应答的用途。本文还描述了如本文所述的组合物用于预防或改善由甲病毒属引起的感染的用途。在一个示例中，如本文所述的组合物的用途是用于预防或改善由但不限于以下引起的感染：基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、博吉河病毒、卡巴斯欧病毒、东方马脑脊髓炎病毒、沼泽病毒、摩根堡病毒、盖塔病毒、高地J病毒、Kyzykagach病毒、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、莫斯达斯佩德拉斯病毒、穆坎博病毒、恩杜茂病毒、奥克尔布病毒、帕拉马纳病毒、皮克孙纳甲病毒、里奥内格罗病毒、图那特病毒、特罗卡拉病毒、鹭山病毒、睡眠病病毒、鲑鱼胰腺病病毒、南方象海豹病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、西马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒和罗斯河病毒。本文还描述了如本文所述的组合物用于预防或改善由病原引起的感染的用途，其中所述病原可以是但不限于基孔肯亚病毒、奥-奈氏病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒和罗斯河病毒。
[0089] 在本公开中，纳米胶囊技术被用于开发针对病毒例如基孔肯亚病毒的基于肽的疫苗。如本文所述的生产包含肽的纳米胶囊的方法还将允许设计新的治疗剂。
[0090] 本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未明确公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下被合适地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地解读并且没有限制。另外，本文所采用的术语和表达是以描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认识到可在所要求保持的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然已经通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采用本文所公开的优选实施方案和任选特征中所体现的本发明的修改和变更，并且认为此类修改和变更在本发明范围内。
[0091] 本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开的每个较窄的类和次一般的组合也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去的内容是否在本文中明确述及。
[0093] 实验部分
[0094] 用于生产如本文所述的组合物的实验程序可被分类为七个阶段，如图6中的流程图中所示。
[0095] 在第一阶段中，构建质粒pCVAf-pET11a、pCVcAf-pET11a、pCVAfAA-pET11a、pCVcAfAA-pET11a，并将其转化到用于长期储存的大肠杆菌DH5α细胞和用于基因过表达的大肠杆菌BL21-DE3(C+)RIL细胞中。在阶段2和3中，通过基因过表达产生蛋白质，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行表征。在阶段4中，确定最佳热处理条件，包括温度和持续时间。在阶段5中，通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化蛋白质。在阶段5中，纯化的蛋白质亚单位经历铁加载以形成蛋白质笼。最后，使用动态光散射(DLS)或如本领域已知的相似方法测量蛋白质笼的流体动力学直径，而通过透射电子显微镜检查(TEM)或如本领域已知的相似方法使形状和外观显现。对于核酸构建体设计，将目标基因插入用于大肠杆菌系统中的基因过表达的pET-11a中。CHIKV疫苗的DNA组成示于图1中。酶限制位点NdeI和BamHI被设计成在开始和结束处，使得目标基因可连接到pET-11a中。Nhe1被插入接头和铁蛋白之间，使得铁蛋白可根据需要被自由切除。
[0096] 完整的质粒构建体
[0097] 目标基因CVAf和CVcAf的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示。不包括野生型铁蛋白(AfFtn)的前3个氨基酸(甲硫氨酸、丙氨酸、丝氨酸)，因为甲硫氨酸由起始密码子编码，而丙氨酸和丝氨酸与包含Nhe1限制位点的氨基酸相同。CVAf(SEQ ID NO:
19)和CVcAf(SEQ ID NO:20)的近似分子量分别为22.5kDa和21.6kDa。
19)和CVcAf(SEQ ID NO:20)的近似分子量分别为22.5kDa和21.6kDa。
[0098] 成功生产的随后正确组装以形成24聚体的亚单位应当展示来自如图5中所突出显示的每个亚单位的N末端的表位。
[0099] 在75℃将蛋白质处理15min后，使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)、疏水相互作用色谱(HIC)进行蛋白质纯化。在如图16(A)和16(B)中所示用不同柱和不同的低离液序列的盐浓度进行FPLC的多次尝试后，确定用于CVAf的最佳纯化方案是使用Hitrap(high sub)Phenyl FF 1mL,0.5M硫酸铵，而具有1M硫酸铵的HiPrep Phenyl FF(high sub)16/10应当被用于CVcAf，如图19(A)和19(B)中所示。
[0100] 将FeSO4以每笼500个Fe2+离子的量加载到蛋白质中用于24聚体的形成。随后通过动态光散射(DLS)测量笼的流体动力学直径。以体积计的大小分布结果示于图20和图21中。野生型铁蛋白(AfFtn)具有约12nm的外径，因此可以推断，对于CVcAf(约18nm)，已形成24聚体，而对于CVAf(约58nm)，已形成更大的聚集体。还确定了75℃的温度和15分钟的持续时间是用于CVAf和CVcAf的最佳热处理条件。
[0101] pCVAf-pET-11a和pCVcAf-pET-11a质粒的构建-转化到DH5α中
[0102] 具有野生型铁蛋白(AfFtn)作为蛋白质笼的两种商业质粒被命名为pCVAf-IDT和pCVcAf-IDT。在将质粒稀释到80ng/μL后，向DH5α感受态细胞进行转化，用于质粒的长期储存。
[0103] 将1.5μL质粒pCVAf-IDT添加到100μL解冻的感受态细胞中。然后将混合物在冰上孵育30min。在42℃热激45s后，将混合物在冰上孵育2min。将900μL的Luria-Bertani(LB)液体培养基添加到混合物中，用于在37℃孵育45min。孵育后，将75μL转化体平铺到具有氨苄青霉素(100ng/ml)的作为选择培养基的LB琼脂板上，以去除未吸收氨苄青霉素抗性质粒的细胞。对pCVcAf-IDT质粒重复相同的步骤。还将未转化的感受态细胞平铺到琼脂板上，所述琼脂板分别是用作阳性对照的无抗生素的琼脂板和用作阴性对照的有抗生素的琼脂板。将琼脂板在37℃孵育过夜，随后储存在4℃冰箱中。
[0104] 如图7(A)和7(B)中所示，集落是不同的。关于对照(C)和(D)，可以看出，无抗生素的板中生长的集落都连接在一起，因为在生长环境中没有障碍，而在含有未转化的DH5α细胞的氨苄青霉素阳性板上没有可见的集落，因为这些细胞不具有抗生素抗性。
[0105] 质粒小量制备
[0106] 对于pCVAf-IDT/DH5α/氨苄青霉素和pCVcAf-IDT/DH5α/氨苄青霉素构建体，挑取来自所述板的一个单集落，并接种在具有5mL氨苄青霉素的5mL Luria-Bertani液体培养基中于37℃过夜培养。用900μL Luria-Bertani培养物和600μL 50％甘油制成pCVAf-IDT/DH5α和pCVcAf-IDT/DH5α的甘油储备液，随后将其储存在-80℃冰箱中。
[0108] pCVAf-IDT：118.5ng/μL；pCVcAf-IDT：90.1ng/μL；和pET-11a：115.6ng/μL。
[0109] 双重消化
[0110] 在制备所需的所有质粒后，下一步是构建用于在大肠杆菌系统中基因过表达的pCVAf-pET-11a和pCVcAf-pET-11a。然后从pCVAf-IDT质粒和pCVcAf-IDT质粒切下目标基因，并将其相应地连接到pET-11a中。使用快速消化酶和缓冲液进行双重消化，详细反应混合物示于下表4中。
[0111]
[0112] 表4.用于双重消化的20μL反应混合物
[0113] 酶作为最后组分添加以增强它们的活性。然后将混合物在37℃孵育1小时。随后，对所有三种样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳以基于它们的重量分离DNA片段。在施加95V的电场32min后，如通过已迁移到凝胶的3/4位置的黄色带所示的完成电泳。将凝胶取出并浸入溴化乙锭(EtBr)中1小时用于DNA染色，随后通过UV光显现。对于来自pCVAf-IDT和pCVcAf-IDT质粒的样品，每个构建体有大约为2000bp和600bp的两个条带，其分别为pIDTSmart载体和目标基因，即组合的病毒表位和铁蛋白。对于pET-11a构建体，仅有一个5500bp的条带，其代表无NdeI和BamHI限制位点之间的DNA片段的pET-11a载体。NdeI和BamHI限制位点之间的DNA片段不存在于凝胶上，因为其大小仅为约40bp，而对于
ThermoScientific GeneRuler 1kb梯形物(Ladder)，待存在于凝胶上的最小尺寸为250bp。
ThermoScientific GeneRuler 1kb梯形物(Ladder)，待存在于凝胶上的最小尺寸为250bp。
[0114] 凝胶提取
[0115] 使用锐刀片切下pCVAf-IDT和pCVcAf-IDT质粒的600bp条带以及pET-11a质粒的5500bp条带。然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit)进行凝胶提取，以从凝胶中提取DNA。三个DNA片段的最终浓度分别为CVAf(插入物)：4.9ng/μL、CVcAf(插入物)：7.7ng/μL和pET-11a(载体)：6.6ng/μL。
[0116] 连接
[0117] 在凝胶提取后进行以下步骤：通过在插入物的一个寡核苷酸的3'羟基与载体的5'磷酸之间产生磷酸二酯键将插入物连接到载体。本公开中基因过表达所需的构建体是pCVAf-pET-11a和pCVcAf-pET-11a。因此，将进行两个连接反应“CVAf插入物+pET-11a载体”和“CVcAf插入物+pET-11a载体”。为了实现提高的连接效率，按如下计算插入物和载体的最佳量。(c-浓度，v-体积，vi-插入物的体积，vv-载体的体积)
[0118]
[0119] 对于pCVAf-pET11a：
[0120] 对于pCVcAf-pET11a：
[0121] 随后，如表5中所示添加所有反应成分。
[0122]
[0123] 表5.用于连接的10μL反应混合物
[0124] 然后将反应混合物在室温保持过夜反应，以确保充足的用于连接的时间。第二天，将连接物转化到DH5α细胞中，并且平铺在氨苄青霉素琼脂板上用于细菌选择。在将琼脂板过夜孵育后，挑取来自每个板的一个单集落，并在具有5μL氨苄青霉素的5μL LB液体培养基中培养过夜。然后，制成pCVAf-pET-11a/DH5α和pCVcAf-pET-11a/DH5α的甘油储备液并将其储存在-80℃冰箱中。
[0125] 为了确认连接质粒的DNA序列的正确性，对pCVAf-pET11a/DH5α和pCVcAf-pET11a/DH5α进行质粒小量制备(mini-prep)。测量pCVAf-pET11a的质粒浓度为38.4 ng/μL，并且测量pCVcAf-pET11a的质粒浓度为64.1 ng/μL。然后将纯化的质粒送到第一基站用于DNA测序。在DNA测序结果与理论DNA序列之间进行比较，并将其示于图22和图23中，显示连接成功。
[0126] 构建体pCVAfAA-pET-11a和pCVcAfAA-pET-11a
[0127] 定点诱变是本项目中被采用来构建pCVAfAA-pET-11a和pCVcAfAA-pET-11a的方法。用于PCR的模板是pCVAf-IDT和pCVcAf-IDT。首先用去离子水将本文提及的引物稀释到80ng/μL，然后通过混合5μL正向引物，5μL反向引物和15μL去离子水制成用于PCR的引物混合物。如表6中所示制备用于PCR的反应混合物。
[0128] 为了将野生型铁蛋白(AfFtn；SEQ ID NO:15)突变为突变形式的铁蛋白(AfFtn-AA、K150A、R151 A(31bp) ；SEQ I D NO:13) ，使 用诱变 引物5 'gattggagaggacGCGGCGgctttgcttttc 3'(正向；SEQ ID NO:17)和5'
gaaaagcaaagcCGCCGCgtcctctccaatc 3'(反向；SEQ ID NO:18)(解链温度：67.3℃，GC含量百分比：58.1％)用丙氨酸(密码子GCG)替代氨基酸150和氨基酸151处的赖氨酸和精氨酸。
该合成引物含有期望的突变GCGGCG，并且与突变位点周围的模板核酸序列互补，由此能够与变性模板核酸序列杂交并引发合成。在合成单链突变体后，反义引物与突变位点周围的突变体结合并引发互补链的合成，从而形成突变的双链DNA。基本反应方案示于图4中。
gaaaagcaaagcCGCCGCgtcctctccaatc 3'(反向；SEQ ID NO:18)(解链温度：67.3℃，GC含量百分比：58.1％)用丙氨酸(密码子GCG)替代氨基酸150和氨基酸151处的赖氨酸和精氨酸。
该合成引物含有期望的突变GCGGCG，并且与突变位点周围的模板核酸序列互补，由此能够与变性模板核酸序列杂交并引发合成。在合成单链突变体后，反义引物与突变位点周围的突变体结合并引发互补链的合成，从而形成突变的双链DNA。基本反应方案示于图4中。
[0129]
[0130] 表6.用于PCR的50μL反应混合物
[0131] 用于定点诱变的程序化PCR方案是：
[0132] 加热盖：100℃；预热盖：关；暂停：关闭
[0133] 初始变性95℃：1分钟-初始变性；热启动：关闭；循环：30
[0134] 片段化95℃：30s-变性
[0135] 52℃：30s-退火
[0136] 54℃：30s-退火
[0137] 56℃：30s-退火
[0138] 58℃：30s-退火
[0139] 72℃：3分钟-延伸(1000bp/min)
[0140] 最终延伸72℃：5分钟-最终延伸
[0141] 最终保持：4℃-最终保持
[0142] 由于最佳退火温度未知，因此上述PCR程序包括四个退火温度以提高退火速率。
[0143] 在PCR反应后，进行Dpn1消化以去除模板质粒。由于模板质粒是从大肠杆菌中提取出来的，因此质粒的胞嘧啶或腺嘌呤核苷酸被甲基化，而突变质粒未被甲基化，因为它们是通过PCR合成的。酶Dpn1在甲基化位点处切割，从而从反应中去除所有模板质粒并保存期望的PCR产物。
[0144] 将1μL的Dpn1酶和5μL的CutSmart缓冲液添加到4μL PCR产物中，并用40μL去离子水填满到总体积为50μL。然后将混合物在37℃孵育10min。随后，将Dpn1消化的混合物转化到DH5α感受态细胞中，然后将转化体平铺到氨苄青霉素琼脂板上用于细菌选择。第二天，从氨苄青霉素琼脂板中挑出一个单集落，用于在具有5μg氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中过夜培养。
[0145] 此后，进行质粒小量制备，并将纯化的质粒送出测序以确认突变质粒的正确性。从测序结果可以推断，pCVcAf-IDT不被突变，而pCVAf-IDT被成功地突变，如图8中所示，在序列中发现了额外的核苷酸。
[0146] 混合额外核苷酸的同一性，其中一些部分似乎来自所用的引物。因此，引物可能由于多种不同的退火温度而已与模板退火多次。
[0147] 基因过表达
[0148] 用pCVAf-pET11a或pCVcAf-pET11a质粒转化感受态BL2(DE3)1C+RIL大肠杆菌细胞，并将其平铺在以氨苄青霉素和氯霉素作为选择剂的琼脂板上。添加氯霉素以确认tRNA编码质粒的存在，使得只有适于蛋白质产生的细胞才会存活。在将琼脂板过夜孵育后，挑取一个单集落，并且将其添加到具有氨苄青霉素和氯霉素的5ml LB液体培养基中用于过夜培养。
[0149] 对于基因过表达，制备了四个烧瓶的100mL高压灭菌的Luria-Bertani(LB)液体培养基。将1mL的夜间培养物添加高压灭菌的100ml LB液体培养基中用于在37℃培养。3小时后，将1mL培养物从烧瓶转移到比色杯，用于通过紫外-可见分光光度计进行600nm波长下的光密度(OD)测量，以监测大肠杆菌的生长条件。当OD达到0.6-0.8时，将异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加到培养物中以诱导基因过表达。再过1小时(总共培养4小时)后，当pCVAf-pET11a/BL21的OD达到0.586，并且pCVcAf-pET11a/BL21的OD达到0.648时，将IPTG添加到两个烧瓶中至1mM的最终浓度，并且再培养3小时。生长曲线绘制在图9中。
[0150] 如图7中所示，在添加诱导剂IPTG后，与含有未添加所述诱导剂的细胞的烧瓶相比，大肠杆菌的生长更慢。大肠杆菌细胞生长的这种减速意味着正在产生期望的融合蛋白质。然后通过以8,000g离心15分钟收获培养物，将沉淀物保持在-20℃。
[0151] 蛋白质亚单位表征-蛋白质提取
[0152] 为了从细胞中提取蛋白质，通过涡旋将沉淀物悬浮于25mM HEPES、50mM氯化钠缓冲液(pH7.5)(缓冲液A)中。在将悬浮液在冰上保持10分钟以使细胞解冻后，通过以35％振幅与10s脉冲开启和5s脉冲关闭的超声处理来进行细胞破碎，直到观察到溶液澄清。
[0153] 由于铁蛋白具有优异的热稳定性，因此在85℃下进行10分钟热处理以使其他大肠杆菌蛋白质变性。在热处理后观察到大量的白色沉淀。然后通过在4℃下以12,000g离心1小时从溶液中去除细胞碎片和沉淀的蛋白质。最后，将上清液转移到清洁的管中并保持在4℃。在该过程期间，取出来自每个步骤(悬浮后、细胞破碎后、热处理后和离心后的上清液)500μL的样品用于进一步表征。
[0154] 使用下面描述的SDS-PAGE实验或本领域已知的类似方法，可能验证靶蛋白质(分子量＝21.6kDa和22.5kDa)的存在以及在85℃热处理10min的效率。结果示于图12中。如图12中所示，根据所述分子量标记，所有样品在20kDa和25kDa之间都存在条带，证实靶蛋白的成功产生。CVAf比CVcAf略重一些，因此它略高于以黄色矩形加框的CVcAf条带。此外，对于热处理后的样品组，仅存在一个条带，表明通过热处理成功地去除了所有大肠杆菌蛋白质。
[0155] 此外，可以观察到在有IPTG或没有IPTG的情况下基因过表达实际上没有差异。可能的原因可能是抗生素。氨苄青霉素和氯霉素两者的存在可能抑制蛋白质的产生，因为细菌抵抗抗生素是非常耗能的。因此，在有IPTG或没有IPTG的情况下没有太多差异，因为两组的表达均被抑制。最重要的是，4组样品只有一个20kDa到25kDa的条带，表明通过热处理成功去除所有其他蛋白质。
[0156] 关于蛋白质浓度测量，绘制的牛血清白蛋白(BSA)标准曲线示于图13中。从导出的方程，计算两个样品的浓度和产量并将其示于表9中。
[0157]蛋白质 浓度(ug/mL) 100mL培养物的产量(mg)
CVAF 586 5.86
CVcAf 651 6.51
CVAF 586 5.86
CVcAf 651 6.51
[0158] 表9.批次1蛋白质的浓度和产量
[0159] 十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
[0160] 为了验证靶蛋白质的存在，进行SDS-PAGE。然而，可能使用如本领域已知的其他适合方法来确定靶蛋白质的存在。通过混合7.5μL上清液以及包含1份β-巯基乙醇和19份2×laemmli样品缓冲液的7.5μL缓冲液制备样品。缓冲液的功能是对蛋白质进行逆向地加电荷并掩盖所述蛋白质的原有电荷，从而使每种蛋白质都能够在电泳场中以与其分子量成比例的距离迁移，并通过破坏任何二硫键来确保所述蛋白质作为单体存在。然后将混合物在95℃热处理10分钟，并以10,000g离心5分钟。
[0161] 随后，将样品以每孔7.5μL加载到15孔凝胶中。在120V运行40分钟后，小心地取出凝胶，用去离子水洗涤三次，并且将其浸入考马斯蓝中用于染色。在生物摇床上染色1小时后，将凝胶洗涤3次并浸入去离子水中用于过夜脱色。在热处理后，使凝胶在紫外光下显现，以检查靶蛋白的存在和其纯度。
[0162] 二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定
[0163] 为了测量从过表达诱导的细胞提取的上清液的蛋白质浓度，进行二辛可宁酸测定(BCA)，由此使用Thermo Scientific Pierce BCA蛋白测定试剂盒确定样品的总蛋白质含量。
[0164] 蛋白质热稳定性测试
[0165] 为了研究这种过表达的融合蛋白质的最佳热处理温度和持续时间，使用先前获得的上清液进行第一轮热稳定性测试。所测试的不同温度和持续时间示于表7中。
[0166]
[0167] 表7.批次1上清液的热稳定性测试
[0168] 在热处理后，观察到所有样品中均存在白色沉淀。在以12,000g离心分钟以从溶液中去除沉淀后，将上清液移出并转移到另一管中，同时将沉淀物重悬浮于200μL缓冲液A(25mM HEPES，50mM氯化钠缓冲液，pH7.5)中并涡旋直到其均匀分布在溶液中。随后进行进一步的SDS-PAGE以确定沉淀物或上清液中靶蛋白质的存在。在本实验的所有时间不使用样品时，将其保持在冰上，以确保其稳定性。
[0169] 为了进一步探索靶蛋白质在更宽范围的温度内的热稳定性，进行了另一批次的基因过表达。从板中挑取pCVcAf-pET11a/BL21和pCVcAf-pET11a/BL21的单集落并培养过夜。第二天早上，将1mL的过夜培养物添加到200mL LB液体培养基中，并以与先前所述相同的方式培养。此时，向两个烧瓶中都添加1mM IPTG用于基因过表达。
[0170] 对于细胞破碎，将细胞沉淀物悬浮于15mL缓冲液A(25mM HEPES，50mM氯化钠缓冲液，pH7.5)中，并在37％振幅、10s开启和20s关闭下进行超声处理，直到溶解产物澄清。然后，将溶解产物以8,000g旋转10分钟以去除不溶性组分和细胞碎片。
[0171] 使用5mL上清液进行热稳定性测试，而将剩余的10mL储存用于进一步的实验用途。用表8中所示的以下条件进行热处理，以找到最佳温度和持续时间以去除不想要的蛋白质，同时保持大部分靶蛋白质。
[0172]
[0173] 表8.超声处理后的批次2溶解产物的热稳定性测试
[0174] 热处理后，将所有样品以12,000g离心10分钟以从溶液中去除变性蛋白质。移出上清液并将其转移到另一管中，而将沉淀物重悬浮于100μL缓冲液A(25mM HEPES，50mM氯化钠缓冲液，pH7.5)中并涡旋。随后，对所有样品进行SDS-PAGE。
[0175] 对批次1上清液的热稳定性测试
[0176] 样品CVAf的测试结果与CVcAf相同，因此CVAf可被视为两者的代表。上清液(S)和沉淀物(P)的SDS-PAGE结果示于图14中。可以看出，对于所有持续时间的85℃热处理，靶蛋白质存在于沉淀物和上清液两者中，而对于所有持续时间的95℃热处理，其仅存在于沉淀物中。因此，可以推断，部分靶蛋白质在85℃将变性，而所有靶蛋白质在95℃都将变性。因此，95℃太高而不能用作热处理温度是非常明确的。
[0177] 对批次2蛋白质的热稳定性测试
[0178] 为了进一步探索可保留大部分靶蛋白同时去除大肠杆菌蛋白质的最佳热处理条件，使用已经超声处理但尚未经历热处理的新批料进行温度为75℃、80℃和85℃的另一测试。如在图15中可以看出，根据条带强度在75℃处理时，靶蛋白质大致相等地存在于上清液和沉淀物中。在80℃和85℃时，大部分靶蛋白质存在于沉淀物中。因此，温度75℃是用于热处理的最佳温度。另外，为了确保在热处理期间所有大肠杆菌蛋白质均被去除，15分钟的持续时间被选择为最佳。总之，75℃、15分钟的条件被测试为用于蛋白质CVAf和CVcAf的标准热处理方案。
[0179] 蛋白质纯化
[0180] 被选择用于蛋白质纯化的方法被称为疏水相互作用色谱(HIC)。该纯化方法依赖于生物分子根据它们的疏水性而可逆地吸附到柱中。在低离液序列的盐(例如硫酸铵)的存在下，生物分子的疏水组分被诱导而展示在其表面上，导致疏水性的总体增加。然后疏水性生物分子结合到纯化柱中的配体，而非疏水性生物分子被洗脱出来，因为它们不具有为结合而必要的疏水性。因此，疏水性生物分子保留在柱上，如图10中所示。随后，不含盐的缓冲液A被供给到柱中，导致结合的生物分子的疏水性降低。因此，先前保留的生物分子从配体中释放并被洗脱出来。
[0181] 在本公开中，靶蛋白质应当是在热处理后不变性且适当折叠的唯一蛋白质。因此，在硫酸铵的影响下，折叠的靶蛋白质的疏水性组分展示在靶蛋白质的表面上。其他变性的蛋白质或氨基酸残基由于三级结构的破坏而不能以相同的方式表现。因此，可将靶蛋白质与其他变性蛋白质或肽分离。
[0182] 在实验前，将来自先前实验的剩余溶解产物用从热稳定性测试确定的最佳条件进行热处理。在将溶解产物以40,000g旋转沉降1小时以去除变性的蛋白质后，样品准备用于纯化。在实验之前，将硫酸铵添加到样品中至0.5M的最终浓度。硫酸铵的低离液序列的性质将促进疏水相互作用，并稍后提高HIC的吸附能力。
[0183] 将柱HitRap(high sub)Phenyl FF 1mL安装在GE 上，并用10mL 25mM HEPES、50mM氯化钠、0.5M硫酸铵(pH7.5)(缓冲液B)平衡。然后将7mL的CVAf蛋白质以1mL/min的流速施加到柱上。级分体积为2mL，而梯度长度为10mL。对8mL CVcAf蛋白质重复所述所述程序。
[0184] 在HIC后，收集流过物和洗脱液的级分，并用SDS-PAGE表征，以检查靶蛋白质的存在。
[0185] 如上所述，预计未结合的蛋白质存在于第一峰的级分中，而靶蛋白质应当存在于第二峰的级分中。
[0186] 对于具有0.5M硫酸铵的7mL CVAf，HIC和SDS-PAGE结果示于图16中。从FPLC图可以看出，第一峰的级分(流过物)为A2-A6，而第二峰的级分(洗脱液)为B1-B7。从来自这些级分的SDS-PAGE结果可以看出，所有流过物级分均不存在条带，而在级分B2、B3、B5、B6和B7中存在靶蛋白质的条带。因此，可以推断，该纯化方法已成功地使靶蛋白质与无法显示在SDS-PAGE上的诸如肽片段的杂质分离。
[0187] 如图17中对于样品CVcAf的结果所示，洗脱液峰相较于CVAF样品略高，表明洗脱液中含有更大量的蛋白质。
[0188] 收集第一个峰的级分A2-A7和第二个峰的级分A11-B8用于SDS-PAGE表征。在凝胶图片上，可以观察到A3、A4、A5、A6在25kDa左右的条带。参考用于热稳定性测试的SDS-PAGE表征的图15，仅可观察到20-25kDa的条带。因此，可以推断所述条带的这一错误位置归因于不均匀的凝胶，它们实际上是靶蛋白质。同时，洗脱液级分A12-B7存在20kDa到25kDa的条带。因此，可以推断，一部分靶蛋白质存在于流过物中，表明并非所有靶蛋白质都与柱结合。这可能是由蛋白质对小柱体积的过载引起的。
[0189] 随后将洗脱液的各级分汇集用于进一步的实验用途，并且通过Thermo Scientific Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。对于CVAf的洗脱液，测定浓度为0.158mg/mL，而CVcAf的洗脱液的浓度为0.212mg/mL。这符合CVcAf的峰值高于CVAf的事实。
[0190] 由于柱Hitrap(high sub)Phenyl FF 1mL对于CVcAf来说似乎太小，因此产生另一批蛋白质(200mL培养物)，以便使用更大的柱-20mL HiPrep Phenyl FF(high sub)16/10柱进行HIC。以这种方式，可以确定更大体积的柱是否可以保留洗脱液中的所有靶蛋白质。对于所述实验，将级分体积设定为5mL，并且此时使用阶梯函数代替梯度。
[0191] 对于CVAF，供应13mL的样品体积，并且使用具有0.5M硫酸铵的缓冲液B作为起始缓冲液。然而，如图19中所示，洗脱液没有明显的峰，因此收集所有流过物级分用于SDS-PAGE以检查靶蛋白的存在。如SDS-PAGE结果所示，流过物中的所有级分都不存在条带。蛋白质可能存在于洗脱液中，但由于浓度极低而峰不明显。
[0192] 对于CVcAf样品，将硫酸铵浓度改变为1M，以观察所述改变是否产生差异。如图16中的HIC结果所示，在洗脱缓冲液供应之后存在两个峰B5-B6和B10-C3。通过SDS-PAGE对级分的进一步表征证实所有靶蛋白质均存在于第二洗脱峰B10-C3。
[0193] 从使用1mL柱和20mL柱的两组FPLC实验可以推断，用于CVAF纯化的最佳方案是使用具有0.5M硫酸铵的Hitrap(high sub)Phenyl FF 1mL，而用于CVcAf纯化的最佳方案是使用具有1M硫酸铵的HiPrep Phenyl FF(high sub)16/10柱。
[0194] 蛋白质笼的形成-铁加载
[0195] 在铁存在下由24个铁蛋白亚单位形成铁蛋白蛋白质笼。在本公开中，为每个笼加载500个Fe2+离子。计算所需体积的FeSO4溶液，将其从用于每个样品的0.1M FeSO4的储备溶液中取出，并相应地添加到纯化的蛋白质中。对于蛋白质笼的形成，将样品在添加铁离子后在室温保持2小时，然后在4℃冰箱中保持至少另外12小时。
[0196] 对于使用Hitrap(high sub)Phenyl FF 1mL纯化后的汇集的洗脱液样品，进行铁加载和缓冲液交换用于蛋白质笼形成和脱盐。对于样品体积和测量的浓度，进行以下计算以获得应当添加的FeSO4的量。对于CVAf，每笼的分子量为：22.5kDa×24个亚单位≈540kDa[0197] 将1mg/mL转换为摩尔：(1÷540,000)M＝1.85μM
[0198] 0.158mg/mL CVAF为：0.158×1.85μM＝0.292μM
[0199] 0.292μM×500＝146.22μM所需的铁
[0200] 稀释度为：100,000μM÷146.22μM＝684
[0201] 样品体积为10mL，因此所需FeSO4的体积为10mL÷684＝14.62μL
[0202] 对浓度为0.212mg/mL且体积为14mL的CVcAf重复相同计算。
[0203] 缓冲液交换
[0204] 对先前加载铁的样品进行缓冲液交换，以去除任何未结合的铁离子。该程序还去除了尚未形成蛋白质笼的任何肽；并且还去除了已在快速蛋白质液相色谱(FPLC)之前添加的任何残留的硫酸铵盐。将样品转移到100kDa浓缩器中，并在20℃以45000g离心30秒。在完成离心后，丢弃流过物，并使用移液管使残留的溶液重悬浮。为了进一步浓缩样品，将缓冲液A(25mM HEPES，50mM氯化钠缓冲液，pH7.5)倾倒到浓缩器中用于第二轮纯化。重复相同的程序3次。然后将最终保留的溶液转移到另一管中，并增加到1mL的总体积。将该溶液以12,000g离心10分钟，以在进一步实验使用之前来自去除溶液的任何污染物。
[0205] 蛋白质笼表征-动态光散射
[0206] 对来自前一部分的样品进行动态光散射分析(DLS)，以测量蛋白质笼的流体动力学直径。当光击中粒子时，只要粒径在240nm范围，它就在所有方向上散射。由于布朗运动，因此预计散射强度随时间而波动。粒子越大，波动越慢，如图11中所示。因此，可基于与波动率的这一相关性推导出粒子流体动力学直径。
[0207] 将1mL溶液中的700μL转移到比色杯中，然后将比色杯置于Zetasizer机中用于测量。使用Zetasizer软件获得流体动力学直径相对于强度和体积的分布。预计期望的蛋白质笼大小略大于12nm。如图20中所示，最小尺寸为约58nm。关于样品CVcAf，如图20中所加框的最小尺寸为约18nm，其与AfFtn的外径相比在可接受的范围内。确定了CVAf和CVcAf两者的58nm粒子的存在。
[0208] 透射电子显微镜检查(TEM)
[0209] 由于闪烁古生球菌铁蛋白具有大约8nm到12nm的内径和外径，因此在其表面上展示期望表位的蛋白质笼的外径应当略大于12nm。选择透射电子显微镜检查(TEM)作为用于可视化的方法，因为它能够以纳米级大小对样品进行成像。将样品稀释到0.1mg/mL。在用乙酸铀酰进行负染后，将一滴样品置于400目涂碳格栅上，并保持吸收最少3分钟。将格栅置于一滴50ul的1.5％乙酸铀酰上，使含样品的表面面向乙酸铀酰溶液。然后将格栅干燥并储存在干燥器中，然后在透射电子显微镜下对其进行观察。在动态光散射(DLS)后对批次2样品进行透射电子显微镜检查(TEM)，并且不能观察到任何东西。这最有可能是由蛋白质的过早降解引起的，因为在铁加载后超过10天才进行透射电子显微镜检查(TEM)。它还可能归因于蛋白质在缓冲液交换后的极低浓度。建议蛋白质纯化、笼形成和TEM在一周内进行，以避免不想要的蛋白质变化。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于治疗糖尿病并发症的药用组合物 | 2020-05-23 | 915 |
| 微生物细胞、产生其的方法以及其用途 | 2020-05-27 | 904 |
| 经改良的模块化抗原转运分子及其在动物中的用途 | 2020-05-17 | 81 |
| 体外胚胎的生殖和选择 | 2020-05-14 | 583 |
| 江东皮胶和皮膏 | 2020-05-19 | 793 |
| 重组型马科动物促卵泡激素的活性 | 2020-05-11 | 125 |
| 利用分离的带X－染色体和带Y－染色体的精子群的综合兽群管理系统 | 2020-05-23 | 393 |
| 抗肿瘤组合物 | 2020-05-25 | 912 |
| 用于防止马的啮槽吸气或咽气癖的设备 | 2020-05-17 | 295 |
| 一种非洲马瘟检测试剂盒和检测方法 | 2020-05-18 | 272 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
马科动物热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈