源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法
阅读：644发布：2020-05-25
专利汇可以提供源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种源自真核 生物 的中药及中药材的PCR鉴定方法，其用根据真核生物基因组SINE序列设计的物种特异性引物，对中药材及中药尤其是深度加工型中药提取的DNA样品进行PCR扩增获得扩增产物，通过对扩增产物分析判断深度加工型中药含有哪些真核生物物种，进而判断检测的样品的真伪，该PCR鉴定方法适用于中药及中药材，特别适合于加工型中药，尤其是因深度加工而导致DNA含量极少、 片段 极短的中药，操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定中药及中药材的真伪。，下面是源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法专利的具体信息内容。
1.一种源自真核生物的中药的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从所述中药中提取得到DNA样品，所述中药是胶类中药；
b)用根据所述真核生物和/或其它真核生物的基因组SINE序列设计的物种特异性引物对所述DNA样品进行PCR扩增，获得扩增产物；
c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA样品是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA样品扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自所述阳性扩增条带对应的真核生物；如果所述DNA样品没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药不是源自所述阳性扩增条带对应的真核生物。
2.根据权利要求1所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述胶类中药是因深度加工而导致DNA含量极少，片段破坏极其严重的中药。
3.根据权利要求2所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述胶类中药包括由动物皮和/或骨熬制而成的胶类中药。
4.根据权利要求3所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述胶类中药包括阿胶和黄明胶。
5.根据权利要求1所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述真核生物是动物。
6.根据权利要求5所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述动物是马科动物，所述基因组SINE序列是ERE-1序列，用于检测驴源性成分。
7.根据权利要求5所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述动物是反刍亚目动物，所述基因组SINE序列是Bov-A2序列，用于检测牛源性成分。
8.根据权利要求5所述的PCR鉴定方法，其特征在于，所述动物是猪科动物，所述基因组SINE序列是PRE-1序列，用于检测猪源性成分。
源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及中药及中药材鉴定技术领域，更具体地，涉及源自真核生物的中药及中药材的鉴定技术领域，特别是指源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法，非常适合于深度加工型中药，尤其是由动物皮、骨熬炼，精制而成的胶类中药以及中药复方中的单味药、出土中药材等，可用于产品检验部门对市场假冒伪劣的该种中草药的灵敏快速鉴定。 背景技术
[0002] 我国传统中药博大精深，可用作中药的物质种类繁多，其中有一类是利用动物皮、骨熬制而成的胶类中药，包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶等。这些胶类中药往往十分名贵，是滋阴潜阳、增强体质的上乘佳品。
[0003] 阿胶作为一种传统名贵中药，有着2000多年的历史。早在东汉时期的著名医药著作《神农本草经》中就被列为“上品”，并记载“久服益气轻身”。魏晋时期的药物学集成《名医别录》中记载阿胶“出东平郡，东阿县”。南北朝梁武帝时期陶弘景在《本草经集注》中记载，“阿胶出东阿，故名阿胶”。阿胶性甘，平，其功能主要补血滋阴，润燥、止血。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，这些功能在《本草纲目》中有详细记载。据2005年版的中国药典记载，阿胶本品为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。无论是古代还是现代，阿胶都享有很高的声誉。
[0005] 据2005年版中国药典记载，龟甲胶及鹿角胶等名贵中药分别是用龟甲及鹿角经水煎煮浓缩制成的固体胶。其中龟甲胶性咸、甘、凉，能够滋阴，养血，止血，用于阴虚潮热，骨蒸盗汗，腰膝酸软，血虚萎黄，崩漏带下；而鹿角胶性甘、咸、温，能够温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足所致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳羸瘦，崩漏下血，便血尿血，阴疽肿痛。 [0006] 由此可见，胶类中药主要用于调节身体机能，滋阴潜阳，增强体质，并且对肾虚，贫血病人具有很好的疗效。因此，该类中药在整个中药市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。
[0007] 然而，随着胶类中药市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格的上涨，一些不法分子趁虚而入，制造假冒伪劣产品来迷惑消费者，扰乱市场的正常秩序。以阿胶为例，国家药典规定正品阿胶应该由驴皮熬制而成，然而不法分子则变相压低成本，在制备阿胶过程中，部分或全部掺入其他的动物皮，例如牛皮、猪皮或其它动物杂皮进行熬制。通过这种方式熬制而成的‘伪品阿胶’在外观及质地上都与正品阿胶极其相似，并且价格低廉，因此，这类‘伪品’对消费者而言很具有迷惑性。但是，从功用上来看，它们则没有显著的疗效，并且还很可能对人体有害。因此，它们的存在对整个阿胶中药市场的危害是相当大的，不仅损害了消费者的利益，还败坏了传统中药的名声。再例如黄明胶、龟甲胶等，也存在这种类似的情况。总而言之，这些伪劣产品严重破坏了我国传统中药的形象，损害了消费者的健康，不利于我国中药事业的健康发展。因此，为了保护我国的传统胶类中药以至于整个中药产业，我们急需建立一种高效、可靠的针对这种深度加工的胶类中药的鉴定方法，将市场上的假冒伪劣产品与正品进行区分。
[0008] 早期现存的胶类中药的鉴定手段仅仅依靠对产品的感官认识，包括质地、色泽、气味等，受主观因素干扰非常严重，从而其误判率较大，难以成为行业标准在实际的胶类中药鉴定过程中应用。另一方面，随着造假者手段的千变万化，人们在感官上已经很难将伪品与正品进行区分。因此，这种传统的鉴别方法在实际应用中很难有效的打击胶类中药市场上的假冒产品。
[0009] 胶类物质的生产源自各种动物皮、壳、甲等，实质上属于一种生物制品，胶类物质鉴定的实质即生物制品的鉴定。利用生物分类学以及生物遗传学的分析工具“分子标记”，就能够达到鉴定目的。在实际应用中，“分子标记”也已被广泛应用于司法鉴定、食品饲料检测、进出口检验等领域，可靠、便捷。随着生物技术的不断发展以及生物学理论的不断完善，这种遗传分类学方法也不断走向成熟。
[0010] 近年来，随着分子生物学技术的不断发展，以生物大分子的多态性为基础的“第三代分子遗传标记”应运而生。这里的生物大分子主要包括核酸以及蛋白质。这一类方法基于分子水平，在不失方法可靠性的同时，相对于细胞学标记而言，其应用范围更加广泛。 [0011] 在遗传学分析领域，基于核酸水平的“分子标记”有很多，包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增片段长度多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、 微卫星(Microsatellite)等。这一技术已经被广泛应用于遗传图谱构建、基因型判别、亲子鉴定等，准确性高，重复性好。然而，对于深度加工型中药而言，其DNA破坏严重，含量极少，片段极短，人们不可能得到完整的用于遗传学分析的基因组DNA，因此这些方法在实际产品检测领域的应用十分有限。
[0012] 事实上，在物种鉴定领域，还存在一些基于DNA水平的，具有较高的保守性、拷贝数高，以及较好的物种间特异性的核酸序列。选择这些具有物种特异性的核酸序列中的某段，进行PCR扩增，就能够将该物种区分出来。这种方法就能够克服样品DNA不完整以及含量有限的不足。基于该原理的检测方法应用十分广泛，例如生物物种的分类、饲料中各种肉源性成分的检测、真假肉类罐头的检测等。
[0013] 传统的用于物种分析鉴定的核酸序列有编码核糖体RNA的rDNA序列，线粒体mtDNA序列。rDNA序列在不同的生物基因组中都具有各自的保守区，这些保守区序列具有较好的种属特异性。rDNA与mtDNA在单个细胞中大约仅有几千份，当样品的DNA含量丰富，保持较为完整的情况下，利用这些序列构建检测方法是非常简便有效的，然而，胶类物质是一种深度加工产品，其DNA破坏极其严重，含量极少，片段极短，对因深度加工而导致DNA破坏严重，含量极低的胶类中药而言，依靠这2种序列建立PCR方法，是很难从质量级差的胶类中药DNA提取液中扩增出清晰条带的，实际试验结果表明，如依据mtDNA设计引物，的确很难从胶类物质DNA中扩增得到清晰的条带，它们并不适用于深度加工型中药的检测。因此，仅仅依靠这2种在物种分析上常用的序列，也无法满足实际应用中胶类物质检测的需要。
[0014] 那么寻找到能够用于物种鉴定的，特异性良好，拷贝数高，尤其是能够针对深度加工胶类中药DNA含量极少、片段极短特点的核酸序列是整个胶类中药鉴定方法构建的最大挑战。
[0015] 在真核生物基因组中存在一些短的高度重复序列SINE，是一种反转录转座子。大6
小适中，约70-500bp，其拷贝数在每个单倍体基因组中超过10，远远高于rDNA和mtDNA。大量的研究表明，真核动物基因组中存在种属特异性SINE序列的插入。由于该序列具有种属特异性良好并且拷贝数极高的特点，近些年来，已经有研究人员将它们应用于实际肉类制品真伪及掺杂的检验。很显然，对于深度加工型中药的检测，该序列也是相当适用的，因为一方面它具有较好的种属特异性，能够满足鉴别需要，另一方面，它拷贝数极高，在实际PCR检测过程中，完全能够弥补模板质量极差的缺陷而使得目标条带得到正常扩增。 发明内容
小适中，约70-500bp，其拷贝数在每个单倍体基因组中超过10，远远高于rDNA和mtDNA。大量的研究表明，真核动物基因组中存在种属特异性SINE序列的插入。由于该序列具有种属特异性良好并且拷贝数极高的特点，近些年来，已经有研究人员将它们应用于实际肉类制品真伪及掺杂的检验。很显然，对于深度加工型中药的检测，该序列也是相当适用的，因为一方面它具有较好的种属特异性，能够满足鉴别需要，另一方面，它拷贝数极高，在实际PCR检测过程中，完全能够弥补模板质量极差的缺陷而使得目标条带得到正常扩增。 发明内容
[0016] 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定源自真核生物的中药及中药材的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型中药的真伪。
[0017] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0018] 一种源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法，其特点是，包括下列步骤： [0019] a)从所述中药或所述中药材中提取得到DNA样品；
[0020] b)用根据所述真核生物和/或其它真核生物的基因组SINE序列设计的物种特异性引物对所述DNA样品进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0021] c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA样品是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA样品扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药或所述中药材源自所述阳性扩增条带对应的真核生物；如果所述DNA样品没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药或所述中药材不是源自所述阳性扩增条带对应的真核生物。
[0022] 如果声称源自某(些)真核生物的中药或中药材经本发明的PCR鉴定方法鉴定后发现，其不源自该(些)真核生物或虽源自该(些)真核生物但还源自其它真核生物，即与正品不同，则该中药或中药材为假冒伪劣产品，否则，该中药或中药材为正品。 [0023] 对中药材进行加工就成为了中药。所述中药包括深度加工型中药。 [0024] 所述深度加工型中药是因深度加工而导致DNA含量极少，片段破坏极其严重的中药。
[0025] 所述深度加工型中药包括由动物皮和/或骨熬制而成的胶类物质，以及中药复方中的单味药、出土中药材。
[0026] 所述胶类物质包括阿胶和黄明胶。
[0027] 所述真核生物是动物。
[0028] 所述动物是马科动物，所述基因组SINE序列是ERE-1序列，用于检测驴源性成分。 [0029] 所述动物是反刍亚目动物，所述基因组SINE序列是Bov-A2序列，用于检测牛源性成分。
[0030] 所述动物是猪科动物，所述基因组SINE序列是PRE-1序列，用于检测猪源性成分。 [0031] 所述阳性扩增条带的长度在100bp以下。
[0032] 采用本发明的方法，能够快速检测中药及中药材的物种来源，从而分辨真伪，且 由于其采用基于种属特异性的SINE序列设计种属特异性引物，对所要鉴定的DNA样品进行PCR扩增，因SINE序列是真核细胞基因组中存在的短分散重复序列，不同SINE在各个真核细胞基因组中具有种属特异性的特点，大小适中，相对于rDNA，mtDNA而言，SINE最大的优势在于其在基因组中拷贝数极高，基于SINE所建立的PCR检测方法更适用于DNA破坏严重的样品，因此，尽管深度加工的中药特别是各种动物皮、骨熬制而成的胶类中药，其DNA含量极少，破坏极其严重，但是，本发明的基于SINE序列的PCR检测方法完全能够达到检测目的，并且本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测，操作简单、成本低、灵敏快速、能有效鉴定中药材、中药尤其是加工型中药的真伪，所以本发明同样适用于鉴定中药复方中的单味药、年代久远的出土中药材等。附图说明
[0033] 图1是采用基于马科动物SINE序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测阿胶中的驴源性成分。其中1.DNA Marker，2.驴肉基因组DNA，3.马肉基因组DNA，4.牛肉基因组DNA，5.猪肉基因组DNA，6.阿胶DNA，7.黄明胶DNA，8.猪皮胶DNA，9.空白对照。
[0034] 图2是采用基于反刍动物SINE序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测牛皮胶中的牛源性成分。其中1.DNA Marker，2.驴肉基因组DNA，3.马肉基因组DNA，4.牛肉基因组DNA，5.猪肉基因组DNA，6.阿胶DNA，7.黄明胶DNA，8.猪皮胶DNA，9.空白对照。
[0035] 图3是采用基于猪科动物SINE序列设计的种属特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测猪皮胶中的猪源性成分。其中1.DNA Marker，2.驴肉基因组DNA，3.马肉基因组DNA，4.牛肉基因组DNA，5.猪肉基因组DNA，6.阿胶DNA，7.黄明胶DNA，8.猪皮胶DNA，9.空白对照。
具体实施方式
[0036] 本发明以鉴定阿胶为例，为了检测阿胶中驴源性成分，以及杂皮胶中可能混有的牛源性成分，猪源性成分，分别基于马科动物SINE序列ERE-1(GenBank Accession NO.D26565)，反刍亚目动物SINE序列Bov-A2(GenBank Accession NO.AF327250)以及猪科动物SINE序列PRE-1(GenBank Accession NO.Y00104)进行优化设计引物如下： [0037] 根据马科动物SINE序列ERE-1设计引物，理论目标条带大小89bp，用于检测胶类物质中驴源性成分。其序列如下：
[0038] 上游引物Ass up：具体序列见SEQ ID NO：1
[0039] 下游引物Ass down：具体序列见SEQ ID NO：2
[0040] 根据反刍亚目动物SINE序列Bov-A2设计引物，理论目标条带大小83bp，用于检测胶类物质中牛源性成分。其序列如下：
[0041] 上游引物Rum up：具体序列见SEQ ID NO：3
[0042] 下游引物Rum down：具体序列见SEQ ID NO：4
[0043] 根据猪科动物SINE序列PRE-1设计引物，理论目标条带大小88bp，用于检测胶类物质中猪源性成分。其序列如下：
[0044] 上游引物Pig up：具体序列见SEQ ID NO：5
[0045] 下游引物Pig down：具体序列见SEQ ID NO：6
[0046] 提取胶类中药的DNA的具体步骤如下：
[0047] 1、胶类中药的预处理：将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心管中，并向其中加入消化缓冲液，该缓冲液pH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％SDS构成，然后将离心管置于50℃-60℃水浴中保温，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1小时，其间不时轻微摇匀。对于含脂肪较多的样品，如猪皮胶，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液中加入除油脂试剂进行萃取，除去样品中含有的大量油脂。 [0048] 2、胶类中药DNA的提取：向上述阿胶预处理液中加入PN缓冲液，混匀，分若干次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入PE缓冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用热的pH 8.0的TE缓冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于-20℃保存。提取得到的DNA可用紫外分光光度法定量。
[0049] 上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)，包括PN缓冲液(Cat.No.19071)、PE缓冲液(Cat.No.19065)、硅吸附柱(Cat.No.28304)。 [0050] 用上述方法提取得到各个胶类制品DNA样之后，利用上述引物进行常规的PCR操作，将产物加于2％-3％的添加了荧光染料的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下观察，根据是否出现阳性扩增条带判断待检测样品中是否含有某种动物源性成分，从而完成对这些样品的检测。
[0051] 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。 [0052] 实施例1检测胶类中药中所含有的驴源性成分
[0053] 1材料和试剂
[0054] 材料：阿胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；黄明胶(山东东阿股份有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；猪皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用猪皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；用作阳性对照的驴、马、牛、猪的基因组DNA提取液(1ng/μL)。
[0055] 试剂：PCR预混 酶Premix Taq (Ex TaqTM Version)：(购 于TAKARA，Cat.TMNo.DRR033A)；DNA 荧 光 染 料10000×GelRed ：DNA荧 光 染 料(购 于 Biotium，Cat.No.41000)。
[0056] 2检测方法
[0057] 取各种胶DNA提取液(10ng/μL)以及各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据马科动物SINE序列ERE-1所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10μM备用。25μL反应体系的具体加样情况如下：
[0058] 针对胶：Premix Ex-Taq 12.5μL，引物Ass up 1μL，引物Ass down 1μL，胶DNA提取液5μL，无菌双蒸水5.5μL；
[0059] 针对肉基因组：针对肉基因组DNA：Premix Ex-Taq 12.5μL，引物Ass up 1μL，引物Ass down 1μL，基因组DNA提取液0.1μL，无菌双蒸水10.4μL；
[0060] (在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4μM，阳性对照肉类DNA模板量0.1ng，待检测胶类DNA模板量50ng。)
[0061] 扩增条件：94℃4min；94℃30s，50℃30s，72℃30s(40循环)；72℃7min；4℃∞。 [0062] PCR操作结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混TM入荧光染料GelRed 。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
[0063] 结果见图1，由于引物根据马科动物SINE序列设计，马和驴同属马科动物，所以泳道2和3均具有阳性条带，泳道6为阿胶，采用驴皮熬制，也具有阳性条带，可见尽 管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对马科动物SINE序列设计的种属特异性引物，通过PCR依然能够检测出阿胶(泳道6)中含有的驴源性成分，而在其它样品中没有扩增出阳性条带，因此利用该马科动物SINE序列ERE-1设计引物进行鉴定时尽管不能区分马和驴基因组，但完全能够区分出牛及猪基因组。
[0064] 实施例2检测胶类中药中所含有的牛源性成分
[0065] 1材料和试剂
[0066] 材料：阿胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；黄明胶(山东东阿股份有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；猪皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用猪皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；用作阳性对照的驴、马、牛、猪的基因组DNA提取液(1ng/μL)。
[0067] 试剂：PCR预混 酶Premix Taq (Ex TaqTM Version)：(购 于TAKARA，Cat.TMNo.DRR033A)；DNA 荧 光 染 料10000×GelRed ：DNA荧 光 染 料(购 于 Biotium，Cat.No.41000)。
[0068] 2检测方法
[0069] 取各种胶DNA提取液(1ng/μL)以及各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据反刍亚目动物SINE序列Bov-A2所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10μM备用。25μL反应体系的具体加样情况如下：
[0070] 针对胶：Premix Taq 12.5μL，引物Ass up 1μL，引物Ass down 1μL，模板2μL，无菌双蒸水8.5μL；
[0071] 针对肉基因组：Premix Taq 12.5μL，引物Rum up 1μL，引物Rum down 1μL，模板1μL，无菌双蒸水9.5μL；
[0072] (在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4μM，阳性对照肉类DNA模板量1ng，待检测胶类DNA模板量2ng。)
[0073] 扩增条件：94℃4min；94℃30s，50℃30s，72℃30s(30循环)；72℃7min；4℃∞。 [0074] PCR操作结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混TM入荧光染料GelRed 。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束 后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
[0075] 结果见图2，由于引物根据反刍亚目动物SINE序列设计，所以泳道4具有阳性条带，泳道7为黄明胶，牛皮熬制，所以也具有阳性条带，可见尽管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对反刍亚目动物SINE序列设计的引物，通过PCR能够检测出胶类制品中混有的牛源性成分，而在其它样品中没有扩增出阳性条带，说明阿胶中没有混杂牛皮。由于该对引物是根据反刍亚目动物SINE序列设计的，因此利用这种方法同样也能检测出胶类制品中是否混杂有其他反刍动物源性成分如羊等。实施例3检测胶类中药中所含有的猪源性成分
[0076] 1材料和试剂
[0077] 材料：阿胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；黄明胶(山东东阿股份有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；猪皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用猪皮熬制)DNA提取液(稀释成10ng/μL及1ng/μL备用)；用作阳性对照的驴、马、牛、猪的基因组DNA提取液(1ng/μL)。
[0078] 试剂：PCR预混 酶Premix Taq (Ex TaqTM Version)：(购 于TAKARA，Cat.TMNo.DRR033A)；DNA 荧 光 染 料10000×GelRed ：DNA荧 光 染 料(购 于 Biotium，Cat.No.41000)。
[0079] 2检测方法
[0080] 取各种胶DNA提取液(1ng/μL)以及各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据猪科动物SINE序列PRE-1所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10μM备用。25μL反应体系的具体加样情况如下：
[0081] 针对胶：Premix Taq 12.5μL，引物Pig up 1μL，引物Pig down 1μL，模板2μL，无菌双蒸水8.5μL；
[0082] 针对肉基因组：Premix Taq 12.5μL，引物Ass up 1μL，引物Ass down 1μL，模板0.1μL，无菌双蒸水10.4μL；
[0083] (在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4μM，阳性对照肉类DNA模板量0.1ng，待检测胶类DNA模板量2ng。)
[0084] 扩增条件：94℃4min；94℃1min，50℃1min，72℃30s(30循环)；72℃7min；4℃∞。
[0085] PCR操作结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混TM入荧光染料GelRed 。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。
[0086] 结果见图3，由于引物根据猪科动物SINE序列设计，所以泳道5具有阳性条带，泳道8为猪皮胶，猪皮熬制，所以也具有阳性条带，可见尽管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对猪科动物SINE序列设计的引物，通过PCR完全能够检测出胶类制品中混有的猪源性成分。而在其它样品中没有扩增出阳性条带，说明阿胶中没有混杂猪皮。 [0087] 上述试验结果表明，针对真核动物基因组SINE序列设计引物，以胶类物质DNA提取液作模板，确实能够得到清晰的条带。因此，利用真核动物种属特异性的SINE序列就可以达到中药材及中药特别是深度加工胶类中药的检测目的。
[0088] SINE序列相对rDNA及mtDNA而言，拷贝数高，特异性好。所以，本发明对待检测样品的初始DNA模板质量要求较低，尽管从深度加工胶类中药中提取得到的DNA浓度极低，破坏极其严重，但是，利用本发明进行检测，依然能够得到较为理想的结果。本发明的基于SINE的PCR检测方法能够适用于深度加工的中草药包括各种动物皮熬制而成的胶类中药以及中药复方中的单味药、或破坏严重的中药材，如年代久远的出土中药材等的检测。这也是本发明最大的特点和优势。并且该法并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测。
[0089] 因此，这种基于SINE序列构建的深度加工型产品检测方法是整个深度加工型中药鉴定方法的关键。这一点在利用分子生物学技术鉴别深度加工型中药的领域意义重大。目前利用SINE序列来进行中药的分子鉴别技术国内外尚未见报道。
[0090] 综上所述，本发明的源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定源自真核生物的中药及中药材的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型中药的真伪。
[0091] 需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。 [0092] 序列表
[0093] <110>华东理工大学
[0094] <120>源自真核生物的中药及中药材的PCR鉴定方法
[0095] <130>P2-081027C
[0096] <140>200810034058.2
[0097] <141>2008-02-29
[0098] <160>6
[0099] <210>1
[0100] <211>18
[0101] <212>DNA
[0102] <213>人工序列
[0103] <220>
[0104] <221>misc_feature
[0105] <222>(1)...(18)
[0106] <223>根据马科动物SINE序列ERE-1设计的上游引物
[0107] <400>1
[0108] cagtgtttcg ttggttcg 18
[0109] <210>2
[0110] <211>21
[0111] <212>DNA
[0112] <213>人工序列
[0113] <220>
[0114] <221>misc_feature
[0115] <222>(1)...(21)
[0116] <223>根据马科动物SINE序列ERE-1设计的下游引物
[0117] <400>2
[0118] tctagttgtg gcatgtggga c 21
[0119] <210>3
[0120] <211>20
[0121] <212>DNA
[0122] <213>人工序列
[0123] <220>
[0124] <221>misc_feature
[0125] <222>(1)...(20)
[0126] <223>根据反刍亚目动物SINE序列Bov-A2设计的上游引物
[0127] <400>3
[0128] gtactcttgc ctggaaaatc 20
[0129] <210>4
[0130] <211>19
[0131] <212>DNA
[0132] <213>人工序列
[0133] <220>
[0134] <221>misc_feature
[0135] <222>(1)...(19)
[0136] <223>根据反刍亚目动物SINE序列Bov-A2设计的下游引物
[0137] <400>4
[0138] tcagtcatgt ccgactcct 19
[0139] <210>5
[0140] <211>19
[0141] <212>DNA
[0142] <213>人工序列
[0143] <220>
[0144] <221>misc_feature
[0145] <222>(1)...(19)
[0146] <223>根据猪科动物SINE序列PRE-1设计的上游引物
[0147] <400>5
[0148] cgaatccgac taggaacca 19
[0149] <210>6
[0150] <211>19
[0151] <212>DNA
[0152] <213>人工序列
[0153] <220>
[0154] <221>misc_feature
[0155] <222>(1)...(19)
[0156] <223>根据猪科动物SINE序列PRE-1设计的下游引物
[0157] <400>6
[0158] accacatctc acggctacg 19
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