a)发明领域

本发明涉及新颖的甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关肽的类似 物、它们的固相合成和重组技术、以及它们在哺乳动物中增加骨质的 用途。

b)相关技术领域的描述

骨质疏松症是最常见的代谢性骨疾病形式，而且可以认为是骨 丧失(骨质减少)的有症状的、断裂阶段。尽管骨质疏松症可以继发于 许多原发性疾病出现，但是90％的病例是自发性的。绝经后的妇女 尤其容易得自发性的骨质疏松症(绝经后或Ⅰ型骨质疏松症)。另一 个自发性骨质疏松症的高发病组是高龄人(男性或女性)(老年性或 Ⅱ型骨质疏松症)。已发现，骨质疏松症与下列情况有关：使用皮质类 固醇、制动术或长期卧床休息、酗酒、糖尿病、对性腺有毒性的(go- nadotoxic)的化疗、血催乳素过多、神经性厌食症、原发性和继发性 闭经、和卵巢切除。

在各种形式的骨质疏松症中，经常发生骨折，这是骨丧失达到机 械性衰竭点所造成的结果。绝经后骨质疏松症的特征是腕部和脊柱 的骨折，而股骨颈的骨折似乎是老年性骨质疏松症的主要特征。

骨质疏松症中骨丧失的机制认为是涉及骨骼自我更新过程的失 调。该更新过程被称为骨重塑过程。该过程在一系列的各种活性袋 中进行。这些袋似乎是作为骨吸收部位自发性地位于骨质中和一定 的骨表面上。破骨细胞(骨溶解或吸收细胞)负责吸收一般恒定大小 部分的骨质。该吸收过程之后是出现成骨细胞(骨形成细胞)，然后由 新的骨质重新填满破骨细胞留下的孔隙。

在健康的成年人中，破骨细胞和成骨细胞的形成速度是使骨形 成和骨吸收的过程处于平衡状态。然而，在骨质疏松症中由于骨重塑 过程的不平衡导致骨丧失的速度快于骨形成速度。尽管在大多数人 中随年龄增大都可能存在某种程度的失衡，但是在绝经后骨质疏松 症或在卵巢切除后这种失衡严重得多，而且出现的年龄更小。

已经有许多治疗骨质疏松症方面的尝试以减慢进一步的骨丧失 或者更合乎需要地使骨质有净增长。某些药剂，如雌激素和二磷酸 盐，可以减缓骨质疏松症中骨质的进一步丧失。由于骨吸收和骨形成 的时期不同，所以减缓骨丧失的药剂似乎可以增加骨质(约3- 7％)。但是，这种表观增长受时间的限制，不是渐进的，而且是由于 “重塑空间”的减少而造成的。此外，因为骨吸收和形成之间紧密相 关，阻止骨吸收的治疗最终也会阻止骨形成。

已有人提出，用甲状旁腺激素(PTH)治疗可以促进骨周转并导 致正钙平衡。但是，人体临床试验表明，小梁骨的任何增加被皮层骨 (cortical bone)的减少所抵销，因此没有总骨质的净增长。

Hefti,et al．在Clinical Science 62,389-396(1982)中报道， 给于正常的和患骨质疏松症的成年雌性大鼠每天皮下剂量的bPTH (1-84)或hPTH(1-34)可以增加全身的钙质和各种骨的灰重。

Liu,et al．在J.Bone Miner.Res.6:10,1071-1080(1991) 中指出，成年雌性大鼠切除卵巢后会诱发近胫骨干骺端小梁骨丧失 47％，同时伴有成骨细胞和小梁破骨细胞数目的明显增加。每天皮下 注射hPTH(1-34)能够完全逆转小梁骨的丧失从而导致小梁骨的 数量超过模拟操作的对照组。成骨细胞的数目增加而破骨细胞的数 目下降。

Hock et al．在J.Bone Min.Res.7:1,65-71(1992)中报 道，对健康雄性大鼠每天皮下注射hPTH(1-34)12天，导致小梁和 皮层骨钙质和干重的增加。总骨质、小梁骨体积、小梁厚度和数目以 及成骨细胞表面都增加了。

哺乳动物甲状旁腺激素，如人的(hPTH)、牛的(bPTH)和猪的 (pTTH)，是具有84个氨基酸残基的单一多肽链，分子量约为9500。 生物活性于N-末端部分有关，其中残基(1-34)明显是所需的最小 长度。

人PTH的N-末端片段与牛和猪的激素的N-末端片段的不同 之处分别只有3个和2个氨基酸残基： hPTH(1-34) Ser   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Leu   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu 1                       5                             10                            15 Asn   Ser   Met   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg    Lys   Lys   Leu   Gln  Asp

                    20                            25                            30 Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:1)； bPTH(1-34): Ala   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Phe   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu 1                       5                             10                            15 Ser   Ser   Met   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg   Lys   Lys   Leu   Gln   Asp

                    20                            25                            30 Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:2)； pPTH(1-34) : Ser   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Leu   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu 1                       5                             10                            15 Ser   Ser   Leu   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg   Lys   Lys   Leu   Gln   Asp

                    20                            25                            30 Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:3)．

PTH的主要功能是引发适应性的变化，以维持胞外液中Ca2+的恒定浓度。PTH作用于肾脏，增加肾小管对尿中Ca2+的重吸收， 并且刺激25-羟胆骨化醇转变成1,25-二羟胆骨化醇。该化合物负责 Ca2+的小肠吸收。一个显著效果是促进骨中Ca2+的移动。PTH作用 于骨时，增加Ca2+和磷酸盐的吸收。PTH刺激破骨细胞的骨吸收速 度，增加间质细胞向破骨细胞的分化速度，以及延长破骨细胞的半衰 期。由于PTH的延长作用，骨形成的成骨细胞的数目也增加；因此， 提高了骨周转和重塑的速度。但是，各个成骨细胞的活性似乎低于正 常细胞。

Rosenblatt,et al．在U.S．专利No.4,423,037,4,968,669 和5,001,223中公开了通过缺失N-末端(1-6)氨基酸和选择性地 置换Phe7,Met8,18，和Gly12而获得的PTH拮抗剂。据报道， Tyr34-NH2可以增加这些化合物的活性和稳定性。

甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)，一种140多个氨基酸的蛋白质 及其片段可模拟PTH的主要生物功能。PTHrp可以通过许多人和 动物的肿瘤以及其他组织合成，它可在恶性高钙血症中发挥作用。 hPTHrp(1-34)的序列如下： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Phe  Phe  Leu  His  His  Leu  Ile  Ala  Glu

           20                            25                       30 Ile  His  Thr  Ala (SEQ ID NO:4)．

hPTH和hPTHrp之间的序列同源性主要局限于13个N-末端 残基，其中8个是相同的；在hPTH的受体结合区域(25-34)中10 个氨基酸中只有1个氨基酸在hPTHrp中是保守的。构象相似性可 能是具有共同活性的原因。Cohen,et al．在J.Biol.Chem.266:3, 1997-2004(1991)中指出，PTH(1-34)和PTHrp(1-34)的大部 分序列，尤其是区域(5-18)和(21-34)，呈现α-螺旋构象。同时他 还指出，该构象是否普遍存在于生理条件下羧基端还有疑问。这种二 级结构对于脂类相互作用、受体相互作用和/或结构稳定性是至关重 要的。

我们已经合成了PTH和PTHrp的类似物以便开发出改良的、 用于包括患骨质疏松症的哺乳动物中恢复骨质的治疗剂。

                  发明概述

本发明提供甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽 (PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物 的合成多肽类似物及其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α- 螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(hy- drophilic amino acids,Haa)和亲脂氨基酸(lipophilic amino acids, Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa

当该序列类型的具体阐述性例子插入PTH,PTHrp，以及 PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物时，获得的多肽 是有效的骨重塑剂。

一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有 生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基(22 -31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)的序列选自： a)Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa6 Xaa9 Xaa10其中  1                   5                       10 Xaa1和Xaa4各自独立地为Glu,Glu(OCH3),His，或Phe；Xaa2是 Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自独立地为Leu或 Ile；Xaa8是Ala,Arg，或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO: 26)； b)Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Arg Leu Leu Xaa8 Arg Leu其中   1                  5                    10 Xaa1和Xaa4各自独立地为Glu,Glu(OCH3),His，或Phe；Xaa2是 Leu或Phe；Xaa8是Glu,Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是 分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO： 27)； c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10 d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10 e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)．

1                   5                        10

另一方面，本发明提供具有下式结构的PTH、PTHrp、以及 PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其 盐： Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Term, 其中： Xaa1缺失或是Ala； Xaa2缺失或是Val； Xaa3缺失或是Ser； Xaa4缺失或是Glu或Glu(OCH3)； Xaa5缺失或是His或Ala； Xaa6缺失或是Gln； Xaa7缺失或是Leu； Xaa10和Xaa17各自独立地为Asp或Asp(OCH3)； Xaa11是Lys,Arg，或Leu； Xaa13是Lys,Arg,Tyr,Cys,Leu,Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生 物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)，或 Lys(二氢肉桂酰基)；     Xaa20是Arg或Leu； Xaa19和Xaa21各自独立地为Lys,Ala，或Arg； Xaa22-31选自(SEQ ID NOS:26,27,28,29，或30)；Xaa32是His, Pro，或Lys； Xaa33缺失，或是Pro,Thr,Glu，或Ala； Xaa34缺失，或是Pro,Arg,Met,Ala,hSer,hSer内酯，Tyr,Leu, 或1,4-二氨基丁酰内酰胺； Xaa35缺失或是Pro,Glu,Ser,Ala，或Gly； Xaa36缺失或是Ala,Arg，或Ile； Xaa37缺失或是Arg,Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala； Xaa38缺失或是Ala或hSer或Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp； 和Term是OR或NR2其中每个R各自独立地为H,(C1-C4)烷 基或苯基(C1-C4)烷基；及其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具 有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基 (22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自： a)  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Xaa  Lys  Leu其中

1                   5                        10 Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO:26)； b)  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Xaa  Arg  Leu其中

1                    5                       10 Xaa29是Glu,Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量为100 -10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)； c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10 d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10 e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)．

1                   5                        10

还提供了用于预防或治疗骨质减少状况的药物组合物，它包括 与药学上可接受的载体以及骨质增加有效量的甲状旁腺激素 (PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生 理活性的短同系物和类似物的多肽类似物及其盐，其中氨基酸残基 (22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列 的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa．

还提供了制备药物组合物的方法，它包括将上述化合物与药学 上可接受的载体相混合。

另外，本发明还提供了用于治疗哺乳动物骨质减少状况的方法， 该方法包括向需要的哺乳动物施用骨质增加有效量的PTH、PTHrp 以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类 似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基 (22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸 (Laa)：

             Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa

更具体地，本发明提供了用于治疗哺乳动物骨质减少状况的方 法，该方法包括向需要的哺乳动物施用骨质增加有效量的PTH、 PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的 多肽类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋， 该残基(22-31)序列选自：SEQ ID NO:26,27,28,29，和30。

本发明还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活 性的短同系物和类似物的多肽类似物，或多肽类似物的盐的固相合 成方法，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22- 31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa， 该方法包括按次序将被保护的氨基酸偶连于合适的树脂载体，去除 侧链和Nα-保护基团，以及将多肽从树脂上分开。

本发明还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活 性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐的固相合成方法，其中 氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选 自：SEQ ID NO:26,27,28,29，和30。该方法包括按次序将被保 护的氨基酸偶连于合适的树脂载体，去除侧链和Nα-保护基团，以及 将多肽从树脂上分开。

还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短 同系物和类似物的多肽类似物或其盐的的重组合成方法，其中氨基 酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序 列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa

本发明还包括用于重组合成这种多肽类似物的DNA序列、载 体和质粒。具体地，本发明提供了用于重组合成PTH、PTHrp以及 PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或 其盐的DNA序列、载体和质粒，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲 性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：SEQ ID NO:26,27,28,29, 和30。

                      附图简述

图1为编码本发明的PTHrp(1-34)类似物的合成基因的 DNA序列和限制性酶切位点(hPTH PCR扩增图)。

图2概括了整合有PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的制备 (Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1构建图)。

图3概括了整合有两个拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒 的制备(Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2构建图)。

图4概括了整合有4个拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒 的制备(Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4构建图)。

                    发明详述

缩写和定义

对于各种常见核苷酸碱基和氨基酸的单字符和三字符缩写按 Pure Appl.Chem.31,639-645(1972)和40,277-290(1974) 中所建议的而且符合37 CFR§1.822(55FR 18245,1990年5月1 日)和PCT规则(WIPO Standard ST.23:Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences in Patent APPlications and in Published Patent Documents)。单字符 和三字符缩写如下：氨基酸缩写

       氨基酸             三字符    单字符

       丙氨酸              Ala         A

       精氨酸              Arg         R

       门冬酰胺            Asn         N

       门冬氨酸            Asp         D

       Asn+Asp             Asx         B

       半胱氨酸            Cys         C

       谷氨酰胺            Gln         Q

       谷氨酸              Glu         E

       Gln+Glu             Glx         Z

       甘氨酸              Gly         G

组氨酸             His           H

异亮氨酸           Ile           I

亮氨酸             Leu           L

赖氨酸             Lys           K

甲硫氨酸           Met           M

苯丙氨酸           Phe           F

脯氨酸             Pro           P

丝氨酸             Ser           S

苏氨酸             Thr           T

色氨酸             Trp           W

酪氨酸             Tyr           Y

缬氨酸             Val           V 缩写代表L-氨基酸，除非另外用D-或D,L-标明。某些天然和非天然 氨基酸如甘氨酸是非手性的。所有肽序列的表示方法都是N-端氨基 酸位于左边和C-端氨基酸位于右边。

此处所用的其他氨基酸和化合物的缩写如下：

hSer        高丝氨酸

hSerlac     高丝氨酸内酯

Nle         正亮氨酸

PEG2        二乙二醇甲基醚的残基，又称甲氧基二(乙烯氧

           基)，CH3O(CH2CH2O)2-，(分子量=119)

PEG5000     聚(乙二醇甲基醚)的残基，又称甲氧基聚(乙烯

           氧基)，CH3O(CH2CH2O)110-，(平均分子量

           =5000)

PEGX        聚(乙二醇甲基醚)的残基，CH3O

           (CH2CH2O)n-9,n=2-225，(平均分子量

           =100-10,000)

“亲水氨基酸(Haa)”指除了形成肽键所需的基团之外，具有至 少一个亲水官能团的氨基酸，例如精氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨 酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、及其同系物。

“亲脂氨基酸(Laa)”指不带电荷的、脂族或芳族氨基酸，例如异 亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、及其 同系物。

在本发明中，丙氨酸被归为“两性氨基酸”，即它既可以用作亲水 氨基酸也可以用作亲脂氨基酸。

“PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物”指具有小 于在PTH或PTHrp发现的全长的氨基酸对应序列、但是能够引发 类似的生理应答的多肽。截短的PTH或PTHrp不必与PTH或 PTHrp完全同源才能引发类似的生理应答。PTH(1-34)和PTHrp (1-34)是该组别中的优选例子但不排除其他例子。

“两亲性α-螺旋”指氨基酸采取α-螺旋构型的某些多肽所表现 的二级结构，其中沿着螺旋的长轴具有相对的极性和非极性面。在感 兴趣的多肽中存在α-螺旋结构的可能性在某种程度上可以通过构 建具有合适螺距的“Schiffer-Edmundson轮”(M.Schiffer和A. B.Edmundson,Biophys.J.7,121(1967))，和观察亲水和亲脂残 基是否分开位于与螺旋外切的圆柱体的相对面而进行探测。或者，也 可通过获得的经验证据例如园二色性或X射线衍射数据表明在给 定的多肽中存在α-螺旋区域。理想的α-螺旋每圈具有3.6个氨基 酸，其中相邻侧链分开100度。Eisenberg et al．在Nature 299:371 -374(1982)和Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81:140-144(1984) 中将疏水性数值和螺旋结合，以定量确定两亲性螺旋的概念。平均疏 水矩被定义为构成螺旋的各组成氨基酸疏水性的矢量和。Eisen- berg(1984)将下列氨基酸的疏水性作为“一致性”的标度： Ile 0.73；    Phe 0.61；    Val 0.54；    Leu 0.53；    Trp 0.37； Met 0.26；    Ala 0.25；    Gly 0.16；    Cys 0.04；    Tyr 0.02； Pro-0.07；    Thr-0.18；    Ser-0.26；    His-0.40；    Glu-0.62； Asn-0.64；    Gln-0.69；    Asp-0.72；    Lys-1.10；    Arg-1.76。

对于每圈具有3.6个残基(即侧链间隔100弧度=(360°/3.6)) 的理想α-螺旋的疏水矩μH，可以用下式进行计算：

μH=[(ΣHNsinδ(N-1))2+(ΣHNcosδ(N-1))2]1/2， 其中，HN是Nth氨基酸的疏水性值，而和为在频率δ=100°的序列中 N个氨基酸的和。疏水矩可以用μH除以N而获得的商<μH>表示 为每个残基的平均疏水矩。在100°±20°范围内<μH>值为约0.20 或更大就表示存在两亲性螺旋。对于hPTHrp(22-31)和hPTH (22-31),100°的<μH>值分别为0.19和0.37。

Cornett,et al.，在J.Mol.Biol.,195:659-685(1987)中进 一步扩展了两亲性α-螺旋的研究，引入了作为两亲性预报因子的 “两亲性指数”。他们得出结论，约有一半所有已知的α-螺旋是两亲 性的，而且主要频率为97.5°而不是100°，每圈的残基数目更接近 3.7而不是3.6。尽管这种精确程度在科学上是令人感兴趣的，但是 Eisenberg等人的基本方法已经足够用于确定给定的序列是否是两 亲性的，尤其当人们从头开始设计序列以形成两亲性α-螺旋时。

取代的两亲性α-螺旋氨基酸序列可以不与天然存在的多肽的 给定片段序列同源，但是在生理状态下应具有类似的二级结构，即具 有相对的极性和非极性面的α-螺旋。用其他序列置换天然存在的氨 基酸序列对于改变的母体多肽的生理活性、稳定性或其他性能可能 产生有利的影响。在J.L.Krstenansky,et al.,FEBS Letters 242: 2,409-413(1989)，和J.P.Segrest,et al.Proteins:Structure, Function，和Genetics 8:103-117(1990)等中有设计和选择这种 序列方面的指导。

本发明的10个氨基酸的两亲性α-螺旋具有下式：

           Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 其中，Haa选自如上所述亲水氨基酸，而Laa选自上述亲脂氨基酸。 假定理想的α-螺旋，残基1,4,5,8，和9分布于螺旋的一个面(A) 上，相互之间约140°之内，而残基2,3,6,7，和10则占据螺旋的另 一面(B)的140°。较佳地，位于同一面的所有残基都是相同极性的， 而位于另一面的所有残基都是相反极性的，即如果A面都是亲水性 的，那么B面都是亲脂性的，反之亦然。熟练技术人员知道，尽管本 发明的螺旋是用

             Haa(Laa Laa Haa Haa)2 Laa 表示的，但是相反序列

             Laa(Haa Haa Laa Laa)2 Haa 也符合残基分布标准，因此是本发明的螺旋的另一种等同的描述方 式。

丙氨酸可以取代亲水氨基酸或亲脂氨基酸，因为丙氨酸可以毫 无困难地位于两亲性α-螺旋的任何一面，尽管Ala10不能形成两亲性 α-螺旋。一般情况下，不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；在序列中它 们的存在和其他随机错误是可以容忍的，例如在亲脂面存在亲水残 基，只要片段中的其余氨基酸基本上符合亲水-亲脂面的划分。用于 确定某一序列是否具有足够的两亲性从而可成为本发明的序列的简 便方法是如上所述计算其平均疏水矩。如果在100°±20°范围中每个 残基的平均矩峰值超过约0.20，那么该序列会形成两亲性螺旋即为 本发明的序列。

例如，对于SEQ ID NO:26,Xaa=Glu,100°处每个残基的平 均疏水矩的计算如下： A.A.HN         δ(N-1)  H sinδ(N-1)    H cosδ(N-1) E    -.62   0      0       -.62 L    .53    100    .52     -.17 L    .53    200    -.18    -.50 E    -.62   300    .34     -.31 K    -1.1   400    -.70    -.85 L    .53    500    .34     -.41 L    .53    600    -.46    -.27 E    -.62   700    .21     -.58 K    -1.1   800    -1.08   -.19 L    .53    900    0       -.53

              ∑=0.81 Σ=-4.43

μH=[(0.81)2+(-4.43)2]1/2=4.50

    <μH>=4.50/10=0.45

对于该序列，平均疏水矩的峰值出现在92°，其值为0.48。

将此概念应用于甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关肽时，可以 假设区域(7-16)和(22-31)中的一个区域或两个区域是具有α-螺 旋二级结构的，并且可以用具有类似结构倾向的非同源序列置换而 不会丧失生物活性或诱导免疫反应的性能。 优选例子

一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有 生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基(22 -31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自： a)  Xaa1 Xaa2 Leu Xaa4 Xaa5 Leu Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10其中

1                  5                       10 Xaa1和Xaa4各自独立地为Glu,Glu(OCH3),His，或Phe；Xaa2是 Leu或Phe；Xaa5是Lys或His；Xaa7和Xaa10各自独立地为Leu或 Ile；Xaa8是Ala,Arg，或Glu；和Xaa9是Lys或Glu(SEQ ID NO: 26)； b)  Xaa1  Xaa2  Leu  Xaa4  Arg  Leu  Leu  Xaa8  Arg  Leu    其中

1                      5                         10 Xaa1和Xaa4各自独立地为Glu,Glu(OCH3),His，或Phe；Xaa2是 Leu或 Phe；Xaa8是Glu,Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量 为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)； c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10 d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

 1                  5                        10 e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30).

1                   5                        10

另一方面，本发明提供具有下式结构的PTH、PTHrp、以及 PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其 盐： Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Leu His Xaa10 Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Xaa17 Leu Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34 Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 Term， 其中： Xaa1缺失或是Ala； Xaa2缺失或是Val； Xaa3缺失或是Ser； Xaa4缺失或是Glu或Glu(OCH3)； Xaa5缺失或是His或Ala； Xaa6缺失或是Gln； Xaa7缺失或是Leu； Xaa10和Xaa17各自独立地为Asp或Asp(OCH3)； Xaa11是Lys,Arg，或Leu； Xaa13是Lys,Arg,Tyr,Cys,Leu,Cys(CH2CONH(CH2)2NH(生 物素基))，Lys(7-二 甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)，或Lys(二氢肉桂酰基)； Xaa20是Arg或Leu； Xaa19和Xaa21各自独立地为Lys,Ala，或Arg； Xaa22-31选自(SEQ ID NOS:26,27,28,29，或30)；Xaa32是His, Pro，或Lys； Xaa33缺失，或是Pro,Thr,Glu，或Ala； Xaa34缺失，或是Pro,Arg,Met,Ala,hSer,hSer内酯，Tyr,Leu， 或 1,4-二氨基丁酰内酰胺； Xaa35缺失或是Pro,Glu,Ser,Ala，或Gly； Xaa36缺失或是Ala,Arg，或Ile； Xaa37缺失或是Arg,Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala； Xaa38缺失或是Ala或hSer或Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp； 和Term是OR或NR2其中各R各自独立地为H,(C1-C4)烷基 或 苯基(C1-C4)烷基；及其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明包括如式(Ⅰ)所示的、具有生理活性的 hPTHrp(1-34)短同系物的多肽类似物： Ala  Val  Ser  Glu  Xaa5  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Xaa11  Gly  Xaa13  Ser  Ile Gln  Asp  Leu  Xaa19  Arg  Xaa21  Xaa22-31  Xaa32  Xaa33  Xaa34  Term，其 中： Xaa5是His或Ala；     Xaa11和Xaa13各自独立地为Lys,Arg，或Leu； Xaa19和Xaa21各自独立地为Ala或Arg； Xaa22-31选自： a)  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Xaa  Lys  Leu其中

1                   5                        10 Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO:26)； b)  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Xaa  Arg  Leu其中

1                   5                        10 Xaa是Glu,Lys，或Lys(COCH2PEGX)和PEGX是分子量为100 -10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)； c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10 d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10 e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)；

1                   5                        10 Xaa32是His或Lys； Xaa33是Thr,Glu，或Ala； Xaa34是Ala,hSer,Tyr，或Leu； 和Term是Gly Arg Arg，内酯，OH或NR2，其中各R是H或(C1 -C4)烷基；及其药学上可接受的盐(式Ⅰ)。

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:26)的 式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μH>超过0.45。本发明的一个更 具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:26)、Xaa11和Xaa13都是Lys、 和Xaa19和Xaa21都是Arg的式(Ⅰ)多肽。

代表性的多肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Arg  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  OH   (SEQ ID NO:5); Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:6)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:7)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  hSer  NH2  (SEQ ID NO:8)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  hSerlac      (SEQ ID NO:9)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  Gly  Arg  Arg  OH  (SEQ ID NO:10)；和 35 Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  lle 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                    25                    30 Leu  Lys  Glu  Leu  NH2  (SEQ ID NO:11).

本发明的又一个方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:26)、Xaa11 和Xaa13都是Lys、以及Xaa19和Xaa21中一个为Arg而另一个为Ala 的式(Ⅰ)多肽。该亚类的代表性的多肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Ala  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:12)和 Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Ala  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:13).

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:26)、 Xaa11和Xaa13中一个为Leu而另一个为Lys、和Xaa19和Xaa21都是 Arg的式(Ⅰ)多肽。该亚类的代表性的多肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  Ala  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Leu  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Ala  Leu  OH  (SEQ ID NO:14).

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:27)的 式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μH>超过0.50。本发明的进一步方 面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:27)、Xaa11和Xaa13都是Lys或都是 Arg、和Xaa19和Xaa21都是Arg的式(Ⅰ)多肽。该亚类代表性的多肽 包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Glu  Arg

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:15)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Glu  Arg

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:16)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Lys  Arg

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:17)； Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu

                20                       25 Lys(COCH:PEG2)      Arg  Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:18);和

                30 Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu

                20                       25 Lys(COCH:PEG5000)        Arg  Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:19).

                     30

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:28)的 式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μH>约为0.25。该亚类代表性的多 肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15  Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:20).

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:29)的 式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μH>约为0.28。该亚类代表性的多 肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH  (SEQ ID NO:21).

本发明的另一个具体方面包括Xaa22-31是(SEQ ID NO:30)的 式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μH>约为0.29。该亚类代表性的 多肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile 1                   5                        10                       15 Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:22).

本发明的又一个方面包括如式(Ⅱ)所示的、具有生理活性的 bPTH(1-34)短同系物的多肽类似物： Xaa1 Val Ser Glu Ile Gln Xaa7 Xaa8 His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa15 Ser Xaa18 Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 His Asn Xaa34 Term，其中： Xaa1是Ser或Ala； Xaa7是Leu或Phe； Xaa8是Met或Nle； Xaa16是Asn或Ser； Xaa18是Leu,Met，或Nle； Xaa19是Glu或Arg； Xaa21是Val或Arg； Xaa22-31选自(SEQ ID NO:26,27,28,29，和30)； Xaa34是Phe或Tyr； Term是OH或NR2，其中每个R是H或(C1-C4)烷基；及其药学 上可接受的盐(式Ⅱ)。 代表性的多肽包括，但并不限于： Ala  Val  Ser  Glu  Ile  Gln  Phe  Nle  His  Asn  Leu  Gly  Lys  His  Leu 1                   5                        10                       15 Ser  Ser  Nle  Glu  Arg  Val  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Asn  Tyr  NHz  (SEQ ID NO:23)和 Ala  Val  Ser  Glu  Ile  Gln  Phe  Nle  His  Asn  Leu  Gly  Lys  His  Leu 1                   5                        10                       15 Ser  Ser  Nle  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30 Leu  His  Asn  Tyr  NH2  (SEQ ID NO:24).

在本发明的又一方面，惊奇地发现，少于34个氨基酸的PTH 和PTHrp的同系物和类似物也是有效的骨重塑剂。这些化合物具 有下列通式： Ala Val Ser Glu Xaa5 Gln Leu Leu His Asp Xaa11 Gly Xaa13 Ser Ile Gln Asp Leu Xaa19 Arg Xaa21 Xaa22-31 Xaa32 Xaa33 Xaa34Term， 代表性的多肽包括，但并不限于： 化合物41:AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2(SEQ ID NO:55) 物理数据 m.p.142.8-166.1℃[α]25D-53.80(c 0.38,H2O) FAB(C173H295N55O9):[M+H]+3929 AAA:AsX2.0(2)Glx5.7(6)Ser1.8(2)

His3.0(3)Gly1.1(1)Ala0.9(1)

Arg2.8(3)Val1.2(1)Ile0.9(1)

Leu7.4(8)Lys4.4(4)Pro0.9(1) 化合物42:AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP- NH2(SEQ ID NO:56) 物理数据 m.p.161.0-177.0℃[α]25D-61.97(c 0.19,H2O) FAB(C167H88N52O48):[M+H]+3792.0 AAA:Asx2.2(2)Glx5.9(6)Serl.9(2)

His2.1(2)Gly1.1(1)Ala1.0(1)

Arg3.0(3)Val1.1(1)Ile1.0(1)

Leu7.9(8)Lys4.3(4)Pro0.9(1)

熟练技术人员知道，可以合成大量多肽类似物的改变形式。这些 改变形式具有此处所述的类似物的有用性能，只要将在100°±20°范 围内每个残基的平均疏水矩大于约0.20的氨基酸序列插入位置(22 -31)。 多肽的经典合成

本发明的多肽可以用例如下列方法合成：J.M.Stewart和 J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinois(1 984)和J.Meienhofer,Hor- monal Proteins and Peptides,Vol.2,Academic Press,New York,(1973)等的固相合成以及E.Schroder和K.Lubke,The Peptides,Vol.l,Academic Press,New York,(1965)等的溶液合 成。

一般，这些方法涉及向合成中的肽链依次添加被保护的氨基酸。 通常，第一个氨基酸的氨基或羧基以及所有反应性的侧链都被保护。 接着将保护的氨基酸连于惰性固体载体，或者用于溶液，然后在适合 形成酰胺键的条件下加入被适当保护的序列中的下一个氨基酸。在 所有所需的氨基酸都以适当的序列相连之后，除去保护基团和固体 载体从而得到粗多肽。该多肽经脱盐和纯化(最好是通过色谱法)，从 而获得最终产品。

一种制备小于约40个氨基酸的、具有生理活性的短多肽的优选 方法是固相多肽合成。在该方法中，α-氨基酸(Nα)官能团和任何反应 性的侧链都用酸敏或碱敏(acid-or base-sensitive)基团保护。保护基 团在形成肽键的条件下应是稳定的，同时又能被毫无困难地除去而 不影响已形成的多肽链。合适的α-氨基保护基团包括，但并不限于： 叔-丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、邻-氯苄氧基羰基、二苯 基异丙氧基羰基、叔-戊氧基羰基(Amoc)、异冰片氧基(isoborny- loxy)羰基、α,α-二甲基-3、5-二甲氧基苄氧基-羰基、邻-硝基苯基亚 磺酰基(nitrophenylsulfenyl)、2-氰基-叔-丁氧基羰基、9-芴基甲氧 基羰基(Fmoc)等，优选叔-丁氧基羰基(Boc)。合适的侧链保护基团 包括，但并不限于：乙酰基、苄基(Bzl)、苄氧基甲基(Bom)、邻-溴苄 氧基羰基、叔-丁基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基(Cl-z)、2, 6-二氯苄基、环己基、环戊基、异丙基、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、 甲苯磺酰基(Tos)、三甲基甲硅烷基、和三苯甲基。

在固相合成中，C-末端氨基酸被首先连于合适的树脂载体。合 适的树脂载体是那些对逐步的缩合反应和去保护反应中的试剂和反 应条件呈惰性、而且不溶于所用介质。可商购的树脂的例子包括用活 性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂，例如氯甲基化的共聚(苯乙 烯-二乙烯基苯)、羟甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。优选苄 基化的、羟甲基化的苯基乙酰胺甲基(PAM)树脂。当化合物的C末 端为酰胺时，优选的树脂是对-甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二 乙烯基苯)树脂。

可以通过在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中作为铵 盐、铯盐、三乙基铵盐、1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-5-烯，四甲基 铵盐或类似盐(最好是位于DMF中的铯盐)的Na保护的氨基酸，优 选Boc-氨基酸，与树脂在高温如约40-60℃，较佳为约50℃下反应 约12-72小时，较佳约48小时，而将其连于PAM树脂。

可以在如二氯甲烷或二甲基甲酰胺，较佳为二氯甲烷之类的溶 剂中，通过如N,N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/l-羟基苯并三唑 (HOBt)介导的偶连反应，在约10-50℃，较佳为约25℃，反应约2 -24小时，较佳为约2小时而将Na-Boc-氨基酸连于二苯甲基胺树 脂。

随后的受保护氨基酸的连续偶连可以用本领域熟知的方法进 行，典型地是通过自动肽合成仪。在用三乙胺或类似的碱中和之后， 较佳地是加入约1.5-2.5倍摩尔过量的每种保护氨基酸，并且偶连 反应是在惰性的、非水性的、极性溶剂如二氯甲烷、DMF或其化合 物(优选二氯甲烷)中于室温下进行。代表性的偶连剂是N,N′-二环 己基碳化二亚胺(DCC)、N,N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或其他 碳化二亚胺，它们可以单独使用或者在1-羟基苯并三唑(HOBt)、O- 酰基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代三(吡咯烷基)-鏻(PyBop)、 N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟存在下使用。也可以使 用受保护的氨基酸的活性酯(例如对-硝基苯基，五氟苯基等)或对称 的酸酐。

在固相合成的最后，将全保护的肽从树脂上除去。当与树脂载体 相连的键是苄酯类型时，对于具有烷基酰胺C-末端的肽，可以用烷 基胺或氟代烷基胺进行氨解反应而达到裂解；对于具有未取代的酰 胺C-末端的肽，可以用例如氨/甲醇或氨/乙醇进行氨解反应而达到 裂解，这些反应可以在约-10℃和50℃之间，较佳为约25℃下进行 约12-24小时，较佳为约18℃。具有羟基C-末端的肽可以用HF裂 解切断或用其他强酸性去保护方式或者通过皂化反应而裂解。或者， 可以通过转酯化从树脂上除去肽，例如用甲醇进行转酯化，然后再通 过氨解或皂化而进行。被保护的肽可以通过硅胶色谱法纯化。

可以使用下列方法将侧链保护基团从肽上去除：用例如无水液 态氟化氢在苯甲醚或其他碳鎓离子清除剂存在下处理氨解产物，用 氟化氢/吡啶复合物进行处理，用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸进行 处理，用氢气和碳上的钯或聚乙烯基吡咯烷酮进行还原，或者用液态 氨中的钠进行还原，最好是用液态氟化氢和苯甲醚处理。这些反应是 在约-10℃和10℃之间，较佳约0℃进行约15分钟至2小时，较佳 为约1.5小时。

对于在二苯甲基胺树脂上的肽，从树脂上裂解反应和去保护步 骤可以用上述的液态氟化氢和苯甲醚合并为一个步骤。

溶液可以脱盐(例如用BioRad AG-3_阴离子交换树脂)，而肽 可以用下列方法中一种或几种进行一系列的色谱步骤而得以纯化： 在弱碱性乙酸盐形式树脂上进行离子交换；在非衍生型的共聚(苯乙 烯-二乙烯基苯)例如Amberlite_XAD上进行疏水吸附色谱；硅胶 吸附色谱；在羧甲基纤维素上进行离子交换色谱；在例如Sephadex_ G-25上进行分配色谱；逆流分配；或高效液相色谱(HPLC)，尤其 是在辛基-或十八烷基甲硅烷基氧化硅(ODS)键合相柱上的反向高 效液相色谱。

因此，本发明另一方面涉及制备多肽及其药学上可接受的盐的 方法，这些方法包括在合适的树脂载体上依次缩合保护的氨基酸，去 除保护基团和树脂载体，以及纯化产物从而获得PTH和PTHrp具 有生理活性的短同系物和类似物、尤其是H(1-34)和PTHrp(1-34) 的类似物，其中位于位置(22-31)的氨基酸形成如上所述的两亲性 α-螺旋肽序列。 多肽的重组合成

另外，本发明的多肽的制备也可以通过对所需多肽的编码基因 进行克隆和表达。在该方法中，制备含有所需DNA序列的质粒，然 后将其插入合适的宿主微生物，典型地为细菌如大肠杆菌，或酵母如 酿酒酵母。诱导宿主微生物产生多拷贝的质粒以及多拷贝的本发明 多肽类似物的编码cDNA。

首先，设计选定PTH or PTHrp的合成基因编码，用简便的限 制性酶切位点来协助随后的改变。可以使用Mullis在U.S.专利 No.4,683,195 and 4,683,202中所述的聚合酶链反应(PCR)来扩 展序列。

然后分离扩展的合成基因并将其连于合适的质粒，例如Trp LE 质粒，在该质粒中可以串联式地插入4个拷贝的基因。Trp LE质粒 的制备在美国专利No.4,738,921以及欧洲专利出版物No. 0212532中有描述。Trp LE质粒通常比Trp E质粒产生8-10多倍 的蛋白质。然后多拷贝基因可以在合适的宿主中如大肠杆菌或酿酒 酵母中进行表达。

在此处使用的具体表达载体是含有下列单元的Trp LE18 Prot (Ile3,Pro5)：含有氨苄青霉素抗性基因和复制质粒起点的pBR322 片段(EcoRⅠ-BamHⅠ)；含有trp启动子和trpE基因的EcoRⅠ-SacⅡ 片段；HIV蛋白酶(Ile3,Pro5)基因片段(SacⅡ-HindⅢ)；bGRF基 因片段(HindⅢ-BamHⅠ)；和来自大肠杆菌rpoc基因的转录终止子。 HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是至关重要的，如果需要可以被其 他编码序列替换。

表达的融合蛋白多聚体在细胞内稳定的包涵体中积聚，可以通 过离心将其与其他细胞蛋白质分开。分离的然后蛋白质被转变成单 体PTH or PTHrp类似物，并且可以用阳离子交换和/或反向 HPLC进行纯化。

对于熟练的技术人员而言，其他的克隆、扩展、表达和纯化方法 是显而易见的。代表性的方法公开于Maniatis,et al.,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中。 应用和施用

本发明的多肽能用于预防和治疗各种哺乳动物骨质丧失症状。 尤其，已表明本发明的化合物能用于预防和作为治疗剂治疗人的骨 质疏松症和骨质减少。

通常，本发明的多肽或其盐的施用量为每天约0.002-1微克/ 千克体重，较佳为每天约0.04-0.2微克/千克体重。对于一个50千 克体重的女性，每天的活性成分剂量为约0.1-50微克，较佳为约 2.0-10微克。对于其他的哺乳动物，例如马、狗、和牛，需要更高的 剂量。该剂量可以以常规的药物组合物形式，按需要通过单次施用、 通过多次施用或者通过控释形式而供药从而达到最佳的药效，其中 较佳的是每天注射一次或多次。

确切剂量和组合物以及最佳给药方案的选择受许多因素的影 响，特别是：选定多肽的药理性质、待治疗的病症的性质和严重程度 以及病人的身体状况和精神敏度(mental acuity)。

代表性的给药方案包括：口服、胃肠外给药(包括皮下、肌内和静 脉注射)、直肠给药、口腔给药(包括舌下给药)、肺部给药、经皮和鼻 内给药。

药学上可接受的盐保留了原多肽的有用的生物活性而不产生毒 副作用。这种盐的例子是：(a)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、 硝酸等形成的酸加成盐；与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马 来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双 羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的 盐；(b)与多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等， 或与N,N′-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成 盐；或(c)(a)和(b)的结合形式如单宁酸锌盐等。

本发明的另一方面涉及药物组合物，它们含有本发明的多肽、或 其药学上可接受的盐作为活性组份以及药学上可接受的、无毒的载 体。如上所述，制备的此组合物可以用于胃肠外给药(皮下、肌内和静 脉注射)，尤其是以液态溶液或混悬液形式；用于口服或口腔给药，尤 其是以片剂或胶囊剂聚形式；用于肺和鼻内给药，尤其是以粉剂、滴 鼻剂或气雾剂形式；以及用于直肠或经皮给药。

组合物可以方便地以单元剂量形式施用，而且可以用制药领域 中任何熟知的方法进行制备，例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA., (1985)中所述的方法。对于胃肠外给药的处方，可以含有无菌水或生 理盐水、亚烷基二醇(alkylene glycols)如丙二醇、聚亚烷二醇如聚乙 二醇、植物油、氢化萘等作为赋形剂。对于口服给药，处方可以通过添 加胆盐或酰基肉碱增加药效。用于鼻内给药的制剂可以是固体的并 且含有赋形剂例如乳糖或葡聚糖，或者可以是水性或油性溶液以滴 鼻剂或计量喷雾剂的形式施用。对于口腔给药，典型的赋形剂包括 糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶凝淀粉等。

当为鼻内给药进行配制时，可以通过添加酸性表面活性剂例如 谷氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、乙胆酸(ethocholic acid)、脱氧胆酸、鹅脱 氧胆酸、脱氢胆酸、谷氨脱氧胆酸、环糊精等增加鼻粘膜吸收，添加量 约为0.2-15重量百分比，较佳为约0.5-4重量百分比，最佳为约 2重量百分比。

通过含有足够量有效成分的控释系统(对于所需释放时期而言) 单次给药，可以在长时间内例如一周至一年中将本发明的化合物供 给服药者。各种控释系统例如单层或储库型微囊、储库型植入剂、渗 透泵、囊泡、胶囊、脂质体、透皮贴剂，离子电渗器以及其他注射剂型 都可以用于该目的。将施用局限于需要活性组份的部位是某些控释 给药器的另一特征，对于治疗某些疾病这是有利的。

一种控释制剂是将多肽或其盐分散或包裹于缓慢降解的、无毒 的、非抗原性的聚合物如共聚(乳酸/乙醇酸)中，如在Kent,Lewis, Sanders，和Tice的美国专利4,675,189中开创性的工作中所述的 那样。也可以将化合物或更佳其相对不溶的盐配制入胆固醇或其他 脂类基质小丸中，或硅塑料基质植入剂中。其他的缓释剂、储库型植 入剂或可注射制剂是熟练技术人员所熟知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978，和R.W.Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents,John Wiley＆ Sons,New York,1987。

下列的具体实施例是用于阐述本发明代表性化合物的合成和测 试，它们并不用于限制本发明的范围。在实施例中，“m.p.”表示熔 点，“[α]25D”是在25℃时，在所示溶剂、给定浓度下的旋光度，“FAB” 是快原子轰击质谱，和“AAA”是氨基酸分析，其中在测量值后括号 中的是预期值。氨基酸分析在Hewlett-Packard AminoQuant Ana- lyzer上按照制造商建议的方案进行。一级氨基酸用邻苯二醛进行衍 生，二级氨基酸用Fmoc进行衍生。对衍生氨基酸进行荧光检测定量 分析。被保护的氨基酸得自Applied Biosystems Inc.(Foster City, CA)。

实施例Ⅰ 采用固相合成方法，在4-甲基二苯甲基胺树脂上，用Applied Biosystems Model 430A肽自动合成仪合成0.5mmol左右的化合 物1(SEQ ID NO:7)。α-氨基用叔丁基羰基(Boc)保护。侧链保护基 团如下：对Asp,Glu,and Ser用苄基(Bzl)；对Arg用甲苯磺酰基 (Tos)；对His用苄氧基甲基(Bom)；对Lys用2-氯苄基(Cl-z)。按 Stewart和Young(出处如上)的方法，用N,N-二环己基碳化二亚 胺(DCC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)将这些氨基酸依次相连。将每个 氨基酸偶连之后，用乙酸酐和二异丙基乙胺在N-甲基吡咯烷酮中的 混合物使肽乙酰化。用无水HF(25mL)在苯甲醚存在下，在-10℃ 处理30分钟和0℃处理60分钟，从而将合成的肽从树脂上裂解并 且同时脱去侧链保护基团。真空蒸去HF之后，用无水醚洗涤残留 物，粗肽用10％乙酸进行萃取。将10％乙酸萃取物冻干，得到900毫 克粗产品。用中等压力的ODS反向柱色谱，采用0.1％TFA中22- 45％CH3CN梯度纯化肽。产品被洗脱出3个部分，浓缩和冻干后， 得到130毫克，纯度＞98％的白色固体。

                        化合物1

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO:7) 物理数据： m.p.150-159℃[α]25D-34.88*(c0.16,H2O) FAB(C175H300N56O51):[M+H]+4005.5 AAA:Asp,1.9(2)；Glu,5.6(6)；Ser,1.6(2)；His,2.7(3)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.8(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.3(8)；Lys,4.0(4).

类似地，制备化合物2,5-18，和21-70，并确定这些化合物的 特性。其中对于合成末端为羟基的多肽，按需要替换PAM树脂。

                     化合物2

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO:6) 物理数据： m.p.154-170℃    [α]25D-49.35°(c0.46,H2O) FAB(C175H301N57O50):[M+H]+4005.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Glyl.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.2(4).

                         化合物5

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO:15) 物理数据： m.p.147-165℃[α]25D49.17°(c0.66,H2O) FAB(C175H299N59O52):[M+H]+4061 AAA:Asp,2.1(2)；Gly,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,5.0(5)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.7(8)；Lys,1.9(2).

                         化合物6

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO:16) 物理数据： m.p.150-170℃    [α]25D-48.65°(c0.54,H2O) FAB(C175H299N63O52):[M+H]+4118.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.2(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,6.9(7)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8).

                         化合物7

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO:17) 物理数据： m.p.177-182℃    [α]25D-46.17°(c0.14,H2O) FAB(C176H304N60O50):[M+H]+4117 AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,6.7(7)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Lys,7.7(8)；Lys,0.9(1).

                          化合物8

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO:5) 物理数据： m.p.147-165℃    [α]25D-49.17°(c0.66,H2O) FAB(C176H305N59O49):[M+H]+4033.0 AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.8(2)；His,2.7(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.9(4)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.9(8)；Lys,4.0(4).

                            化合物9

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OHSEQ ID NO:10) 物理数据： m.p.158-160℃    [α]25D-44.76°(c0.1,H2O) FAB(C189H326N64O55):[M]+4375.0 AAA:Asp,2.0(2)；Glu,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,2.3(2)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,5.0(5)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.3(4).

                         化合物10

AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO:14) 物理数据： m.p.170-175℃    [α]25D-31.59°(c0.54,H2O) FAB(C174H300N52O51):[M+H]+3936.0 AAA:Asp,2.0(2)；Glu,6.0(6)；Ser,1.8(2)；His,2.0(2)；Gly,1.2(1)；Ala,3.0(3)；

Arg,2.8(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.9(10)；Lys,3.0(3).

                        化合物11

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH2(SEQ ID NO:11) 物理数据： m.p.172-174℃    [α]25D-43.29°(c0.2,H2O) FAB(C179H311N55O52):[M+H]+4065.8 AAA:Asp,2.2(2)；Glu,7.7(7)；Ser,1.7(2)；His,2.0(2)；Gly,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.3(9)；Lys,5.1(5).

                     化合物12  AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH2(X=Nle,SEQ ID NO:23) 物理数据： m.p.178℃    [α]25D-36.88°(c0.4,H2O) FAB(C182H295N50O51):[M+H]+4001.6 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.5(6)；Ser,2.7(3)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,1.0(1)；Tyr,0.8(1)；Val,2.0(2)；Phe,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu+Nle,

8.5(7+2)；Lys,3.1(3).

                               化合物13  AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH2(X=Nle,SEQ ID NO:24) 物理数据： m.p.260℃    [α]25D-37.02°(c0.2,H2O) FAB(C184H304N56O49):[M+H]+4084 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.5(5)；Ser,2.6(3)；His,3.1(3)；Ala,1.0(1)；Gly,1.1(1)；

Arg,3.2(3)；Tyr,1.0(1)；Val,1.0(1)；Phe,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.0(9)；

Lys,3.0(3).

                        化合物14

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH2(SEQ ID NO:20) 物理数据： m.p.190-225℃    [α]25D-56.58°(c0.36,H2O) FAB(C161H272N54O49):[M+H]+3747.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,4.9(5)；Ser,1.7(2)；His,2.6(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)； Ala,7.6(7)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,6.6(6)；Lys,1.9(2).

                              化合物15

AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO:12) 物理数据： m.p.170-180℃    [α]25D-48.19°(c0.2,H2O) FAB(C172H293N53O51):[M+H]+3919.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.0(3)；Arg,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.4(4).

                              化合物16

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO:13) 物理数据： m.p.190-195℃    [α]25D-50.50°(c0.4,H2O) FAB(C172H293N53O51):[M+H]+3919.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.0(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.0(3)；Arg,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.2(4).

                        化合物17

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH2(SEQ ID NO:21) 物理数据： m.p.195-204℃    [α]25D-67.11°(c0.3,H2O) FAB(C163H280N54O50):[M+H]+3796.0 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,2.9(3)；Ser,6.8(7)；His,3.1(3)；Gly,1.2(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,2.0(2).

                           化合物18

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH2(SEQ ID NO:22) 物理数据： m.p.200-207℃    [α]25D-60.26°(c0.6,H2O) FAB(C174H284N56O50):[M+H]+3960.0 AAA:Asp,2.9(3),Glu,3.5(4)；Ser,1.4(2)；His,2.6(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,4.0(4)；Arg,3.0(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.9(2)；Phe,1.1(1)；Ile,0.9(1)；

Leu,3.6(4)；Lys,4.1(4).

                         化合物21

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH2(SEQ ID NO:35) 物理数据： m.p.148-155℃    [α]25D-45.97(c0.26,H2O) FAB(C184H304N56O49):[M+H]+4084 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.0(5)；Ser,2.7(3)；His,3.0(3)；Gly,1.0(1)；Ala,0.9(1)；

Arg,3.1(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Phe,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu 9.3(9)；

Lys,3.2(3).

                          化合物22

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO:36)

                          (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.69.4-128℃    [α]25D-43.93(c0.15,H2O) FAB(C179H302N56O49):[M+H]+4022.9 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,4.9(5)；Ser,2.6(3)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Phe,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.8(9)；Lys,3.4(3)；

                            化合物23

AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH2(SEQ ID NO:37)

                        (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.87.1-142.1℃    [α]25D-52.14(c0.41,H2O) FAB(C179H303N57O49):[M+H]+4038  AAA:Asx,2.1(2)；Glx,4.9(5)；Ser,2.7(3)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；

hSer,1.0(1)；Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Phe,0.9(1)；

Ile,0.9(1)；Leu,7.9(8)；Lys,3.7(4).

                      化合物24

AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:38) 物理数据： m.p.175-182℃    [α]25D-49.99(c0.47,H2O) FAB(C175H299N49O51):[M+H]+3906.5 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.5(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.1(9)；Lys,6.5(6).

                           化合物25

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH2(SEQ ID NO:39) 物理数据： m.p.136.5-153.5℃    [α]25D-32.57(c0.13,H2O) FAB(C175H300N60O51):[M+H]+4060.8 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,5.2(5)；Val,1.1(1)；Ile,1.1(1)；Leu,8.4(8)；Lys,2.2(2).

                         化合物26

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO:40) 物理数据： m.p.125.8-127.2℃    [α]25D-54.62(c0.23,H2O) FAB(C180H306N60O53):[M+H]+4158.0 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.8(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,5.1(5)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,2.1(2)；

Pro,1.1(1).

                        化合物27  AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO:41) 物理数据： m.p.106-137.3℃    [α]25D-39.55(c0.67,H2O) FAB(C189H326N68O55):[M+H]+4430.5 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.6(2)；His,2.7(3)；Gly,2.2(2)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.8(2)；Arg,7.3(7)；Val,0.8(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,2.1(2).

                         化合物28  AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH2(SEQ ID NO:42)

                          (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.80℃    [α]25D-48.64(c0.09,H2O) FAB(C193H334N70O56):[M+H]+4530.0 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.1(6)；Ser,1.7(2)；His,3.0(3)；Gly,1.9(2)；

hSer,1.0(1)；Thr,1.0(1)；Ala,2.1(2)；Arg,7.2(7)；Val,0.8(1)；

Ile,1.0(1)；Leu,8.4(8)；Lys,2.1(2).

                   化合物29

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH2(SEQ ID NO:43) 物理数据: m.p.160-172℃    [α]25D-49.85(c0.34,H2O) FAB(C181H304N56O52):[M+H]+4096.9 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.7(8)；

Lys,4.4(4).

                         化合物30

AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:44) 物理数据: m.p.130-171℃    [α]25D-40.65(c0.34,H2O) FAB(C178H297N55O52):[M+H]+4039.4 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,1.8(2)；His,3.4(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,2.9(3)；Tyr,0.8(1)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.9(8)；

Lys,3.4(3).

                       化合物31

AVSEHQLLHD KG℃SIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:45) 物理数据： m.p.140-160℃    [α]25D-44.48(c0.25,H2O) FAB(C172H293N55O51S1):[M+H]+3979 AAA:Asx+Cys,3.0(2+1)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,3.0(3)；Gly,1.0(1)；

Thr,0.9(1)；Ala,1.9(2)；Arg,2.5(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；

Lys,3.3(3).

                     化合物32

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:46)

           (X=Cys(CH2ONH(CH2)2NH(生物素基))) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D(未测出) FAB(C186H316N59O54S2):[M+H]+4306.6 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.8(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.3(3)；Lys,3.3(3),

                          化合物33

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:47)

(X=Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1｜苯并吡喃-4-乙酰基)) 物理数据： m.p.135-205℃    1][α]25D-26.92(c 0.104,50％HOAc水溶液) FAB(C188H311N57O54):[M+H]+4233 AAA:Asx,1.9(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.7(2)；His,3.2(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.1(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.2(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.2(8)；Lys,4.5(4).

                        化合物34

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO:48) 物理数据： m.p.92.1-146.6℃    [α]25D-40.76(c0.34,H2O) FAB(C177Hc302N56O53):[M+H]+4062.0 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；Gly,2.2(2)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.2(4).

                     化合物35

AVSXHQLLHZ KGKSIQZLRR RXLLXKLLXK LHA-OH(SEQ ID NO:49)

               (X=Glu(OCH3)；Z=Asp(OCH3)) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D-21.96(c0.132,H2O) FAB(C181H311N55O52):[M+H]+4089.0 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.8(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.2(4).

                    化合物36

AVSXHQLLHZ KGKSIQZLRR RXLLXKLLXK LHA-OCH3(SEQ ID NO:50)

(X=Glu(OCH3)；Z=Asp(OZCH3)) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D-46.80(c0.07,H2O) FAB(C182H313N55O52):[M+H]+4103 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.4(2)；His,3.0(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.1(1)；

Ala,1.7(2)；Arg,3.2(3)；Val,0.6(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.1(4).

                        化合物37

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO:51)

                      (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D(未测出) FAB(C176H301N55O53):[M+H]+4035.1 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,2.0(2)；His,3.1(3)；Gly,0.8(1)；

hSer,0.8(1)；Thr,1.0(1)；Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.3(1)；

Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.8(4).

                  化合物38  

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO:52) 物理数据： m.p.152.1-186.5℃    [α]25D-55.91(c0.33,H2O) FAB(C180H306N56O53):[M+H]+4102.6 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.9(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.7(8)；Lys,4.3(4).

                    化合物39

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO:53) 物理数据： m.p.120-148.2℃    [α]25D-52.78(c0.47,H2O) FAB(C177H301N55O52):[M+H]+4031.0 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,1.8(2)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,2.9(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,3.6(3)；

Pro,0.9(1).

                       化合物40

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH2(SEQ ID NO:54) 物理数据： m.p.133.9-155.1℃    [α]25D-54.22(c0.37,H2O) FAB(C177H302N56O51):[M+H]+4030.7 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.9(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.1(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.2(4)；

Pro,0.9(1).

                            化合物41

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH2(SEQ ID NO:55) 物理数据： m.p.142.8-166.1℃    [α]25D-53.80(c0.38,H2O) FAB(C173H295N55O49):[M+H]+3929 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；Gly,1.1(1)；Ala,0.9(1)；

Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8)；Lys,4.4(4)；Pro,0.9(1).

                    化合物42

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQ ID NO:56) 物理数据： m.p.161.0-177.0℃    [α]25D-61.97(c0.19,H2O) FAB(C167H288N52O48):[M+H]+3792.0 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.9(2)；His,2.1(2)；Gly,1.1(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.9(8)；Lys,4.3(4)；Pro,0.9(1).

                    化合物43  AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO:57) 物理数据： m.p.181-202℃    [α]25D-45.14(c0.19,H2O) FAB(C195H326N62O56):[M+H]+4435.2 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.8(6)；Ser,2.8(3)；His,2.8(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,3.7(4)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.3(4)；Trp,0.9(1).

                      化合物44

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQID NO:58) 物理数据： m.p.130-132.2℃    [α]25D-46.66(c0.195,H2O) FAB(C216H365N81O62):[M+H]+5088.8 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.0(6)；Ser,2.7(3)；His,3.0(3)；Gly,2.2(2)；Thr,2.1

(2)；Ala,3.0(3)；Arg,10.5(10)；Val,0.9(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Trp,

1.0(1).

                          化合物45

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH2(SEQ ID NO:59) 物理数据： m.p.158-174℃    [α]25D-43.57(c0.53,H2O) FAB(C216H365N82O61):[M+H]+5087.4 AAA:Asx,1.9(2)；Glx,5.6(6)；Ser,2.6(3)；His,3.3(3)；Gly,2.1(2)；Thr,2.0(2)；

Ala,2.9(3)；Arg,10.1(10)；Val,0.9(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.3(8)；Trp1.1(1).

                    化合物46

AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO:60)

                      (X=Lys(二氢肉桂酰基)) 物理数据： m.p.165.4-175.2℃    [α]25D-40.43(c0.20,H2O) FAB(C225H374N80O62):[M+H]+5191 AAA:Asx,2.1(2),Glx,6.3(6)；Ser,2.8(3)；His,3.2(3)；Gly,2.1(2),Thr,2.0

(2)；Ala,3.2(3)；Arg,9.9(9)；Val,1.0(1),Ile,0.9(1)；Leu,8.6(8)；Lys,1.1

(1)；Trp,1.1(1).

                    化合物47

AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH2(SEQ ID NO:61)

                    (X=正亮氨酸) 物理数据： m.p.140-160℃    [α]25D-56.88(c0.16,H2O) FAB(C180H287N56O58)；[M+H]+3989.8 AAA:Asx,3.0(3)；Glx,2.9(3)；Ser,3.7(4)；His,2.8(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.0(2)；Tyr,1.0(1)；Val,1.7(2)；Phe,0.9(1)；Ile,0.9(1)；

Leu+Nle5.8(2+4)；Lys,3.4(3)；Trp,1.1(1).

                    化合物48

AVSEHQLLHD KGKSJQDLRR RELLSEKLLEK LHTMA-NH2(SEQ ID NO:62) 物理数据： m.p.140-210℃    [α]25D-47.75(c0.178,H2O) FAB(C180H309N57O52S1):[M+H]+4135.0 AAA:Asx,2.3(2)；Glx,6.6(6)；Ser,1.4(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,0.9(1)；Met,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.8(8)；

Lys,4.4(4).

                          化合物49

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX(SEQ ID NO:63)

                    (X=1,4-二氨基丁内酰胺) 物理数据： m.p.161-181℃    [α]25D-48.38(c0.25,H2O) FAB(C176H300N56O51):[M+H]+4016.8 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.7(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,2.9(3)；Val,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,3.8(4)

                      化合物50

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:64) 物理数据： m.p.136.5-156.8℃    [α]25D-49.89(c0.24,H2O) FAB(C182H300N56O49):[M+H]+4056.0 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,5.0(5)；Ser,1.9(2)；His,3.3(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.0(1)；Phe,2.0(2)；Ile,0.9(1)；Leu,7.2(7)；

Lys,3.5(4).

                          化合物51

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:65) 物理数据： m.p.80.7-141.0℃    [α]25D-55.38(c0.23,H2O) FAB(C176H300N58O49):[M+H]+4012.8 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,4.9(5)；Ser,1.8(2)；His,4.3(4)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)：

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.9(4).

                    化合物52

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:66) 物理数据： m.p.134.3-157.9℃    [α]25D-50.72(c0.45,H2O) FAB(C175H295N57O51):[M+H]+4012.8 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.8(2)；His,4.2(4)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.1(3).

                            化合物53

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH2(SEQ ID NO:67) 物理数据： m.p.142.7-159.8℃    [α]25D-54.01(c0.21,H2O) FAB(C173H298N56O49):[M+H]+3946.0 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,4.9(5)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.1(3)；Arg,3.1(3):Val,1.0(1)；Ile,1.9(2)；Leu,7.0(7)；Lys,4.3(4).

                      化合物54

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE 1HTA-NH2(SEQ ID NO:68) 物理数据： m.p.138-185℃    [α]25D-50.17(c0.14,H2O) FAB(C174H295N55O53):[M+H]+4005 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,7.1(7)；Ser,1.7(2)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.7(2)；Leu,7.1(7)；Lys,2.7(3).

                    化合物55 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH3(SEQ ID NO:69)

                    (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D(未测出) FAB(C178H306N56O52):[M+H]+4063.0 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.8(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1);

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.4(8)；Lys,3.7(4)；

hSer,0.9(1).

                         化合物56

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH2CH2C6H5(SEQID NO:70)

                    (X=高丝氨酸) 物理数据： m.p.(未测出)    [α]25D(未测出) FAB(C184H310N56O52):[M+H]+4138.8 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.1(4)；

hSer,0.9(1).

                      化合物57 物理数据： m.p.142.5-163.5℃    [α]25D-34.31(c0.17,H2O) FAB(C175H298N56O50):[M+H]+3986.4 AAA:Asx,1.9(2)；Glx,5.9(6)；Ser.1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.0(3)；Thr,1.0(1):Val,1.1(1)；1le,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.0(4).

                  化合物58 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH2(SEQ ID NO:72) 物理数据： m.p.158-163℃    [α]25D-46.06(c0.17,H2O) FAB(C195H327N63O55):[M+H]+4434.8 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,2.7(3)；His,3.1(3)；Gly,1.0(1)；Ala,1.8(2)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,3.9

(4)；Trp,1.0(1).

                  化合物59 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO:73)

            (X=Nal(2)=3-(2-萘基)-L-丙氨酸) 物理数据： m.p.156-162℃    [α]25D-44.44(c0.189,H2O) FAB(C197H328N62O55):[M+H]+4445.6 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.5(6)；Ser,2.8(3)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1);Ala,2.0(2)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu.7.5(8)；Lys,4.2(4)；

Nal,1.1(1).

                    化合物60 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO:74) 物理数据： m.p.159-164℃    [α]25D-50.94(c0.29,H2O) FAB(C192H320N60O55):[M+H]+4349.0 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,2.7(3)；His,3.2(3)；Gly,1.0(1)；Ala,3.1(3)；

Arg,2.8(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.6(8)；Lys,4.0(4)；

Trp,1.0(1).

                        化合物61 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH(SEQ ID NO:75) 物理数据： m.p.155-210℃    [α]25D-46.15(c0.12,H2O) FAB(C195H334N62O58):[M+H]+4475.8 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.9(7)；Ser,1.7(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Ala,3.1(3)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.9(2)；Leu,8.1(8)；Lys,4.1(4).

                      化合物62

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO:76) 物理数据： m.p.186-218℃    [α]25D-52.73(c0.265,H2O) FAB(C192H329N61O57):[M+H]+4404.4 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,6.6(7)；Ser,1.9(2)；His,3.4(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.8(4)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.7(2)；Leu,7.9(8)；Lys,4.0(4).

                         化合物63 AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO:77) 物理数据： m.p.169-205℃    [α]25D-50.78(c0.51,H2O) FAB(C186H317N57O56):[M+H]+4248.0 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.8(7)；Ser,1.8(2)；His,3.3(3):Gly,1.0(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.0(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.0(1)；Ile,1.8(2)；Leu,7.8(8)；Lys,3.6(4).

                   化合物64

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO:78) 物理数据： m.p.199-205℃    [α]25D-52.47(c0.41,H2O) FAB(C180H306N56O55):[M+H]+4135.0 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,6.6(7)；Ser,1.9(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,2.9(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,3.8(4).

                      化合物65

AVSEIQFX1HN KGKHLSSX1ER VEWLRKKLQD VHNX2(SEQ ID NO:79)

               (X1=L-正亮氨酸；X2=高丝氧酸内酯) 物理数据： m.p.166-176℃    [α]25D-52.22(c0.25,H2O) FAB(C180H288N54O50):[M+H]+4008.6 AAA:Asx,3.1(3)；Glx,4.8(5)；Ser,2.9(3)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Ala,1.1(1)；

Arg,2.0(2)；Val,2.7(3)；Phe,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu+Nle 5.9(4+2)；

Lys,2.8(3).

                      化合物66

SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:80) 物理数据： m.p.134.2℃    [α]25D-48.12(c0.36,H2O) FAB(C167H286N54O49):[M+H]+3834.4 AAA；Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,2.8(3)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8)；Lys,4.3(4).

                     化合物67

LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:81) 物理数据： m.p.128.5-184.5℃    [α]25D-6.53(c0.69,MeOH) FAB(C148H259N47O41):[M+H]+3353 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,4.1(4)；Ser,0.9(1)；His,2.1(2)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,4.2(4).

                     化合物68

LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH2(SEQ ID NO:82) 物理数据： m.p.165-210℃    [α]25D-36.05(c0.12,H2O) FAB(C142H248N46O40):[M+H]+3239.0 AAA:Asx,2.0(2)；Glx,3.9(4)；Ser,0.9(1)；His,1.9(2)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,2.9(3)；Ile,0.9(1)；Leu,6.8(7)；Lys,4.2(4).

                        化合物69  SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO:83) 物理数据： m.p.150-210℃    [α]25D-18.0(c0.64,H2O) FAB(C208H351N79O60):[M+H]+4918.6 AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.2(6)；Ser,2.8(3)；His,3.1(3)；Gly,2.2(2)；Thr,2.2

(2)；Ala,2.2(2)；Arg,10.4(10)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Trp,1.1(1).

                    化合物70

LLHDRGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRT RSAW-OH(SEQ ID NO:84) 物理数据： m.p.150-210℃    [α]25D-41.70(c0.36,H2O) FAB(C189H324N72O52):[M+H]+4437.14 AAA:Asx,2.1(2)；Glx,4.1(4)；Ser,1.9(2)；His,2.0(2)；Gly,2.1(2)；Thr,2.0(2)；

Ala,2.1(2)；Arg,9.7(10)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8).

                   实施例Ⅱ

按照实施例Ⅰ的步骤制备和纯化[Met34,Ala35]化合物1, AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH2, (SEQ ID NO:25)。并用如下方法将该多肽转变成高丝氨酸内酯。将 纯化的肽(160毫克)溶解于44％甲酸(4毫升)中。将该溶液于0℃与 预先混合的、溴化氰(700毫克)和苯酚(1.6毫克)在44％甲酸(4毫 升)的溶液合并。溶液在0℃搅拌2小时,然后在室温下搅拌2小时。 产物的形成用HPLC(Vydac_C-18,300埃，4.6×250mm，流速 1.2mL/min,0.1％TFA中梯度为25-45％乙腈，10分钟)监测。 反应在4小时内完成。一半样品被浓缩并且用制备性RP-HPLC (Vydac_C-18,0.1％TFA中梯度为25-45％乙腈)。收集高丝氨 酸内酯肽部分并冻干，得到28毫克纯度＞95％的白色固体，即化合 物4。

                          化合物4

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK LLEKLHTX(X=hSerlac,SEQ ID NO:9) 物理数据： m.p.138-142℃    [α]25D-50.66°(c0.1,H2O) FAB(C176H299N55O52):[M+H]+4017.61 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；

Thr,1.1(1)；Ala,1.1(1)；Arg,2.7(3)；Val,1.0(1)；Ile,

1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,3.8(4)；Gly1.09(1)；hSer,

1.09(1).

                   实施例Ⅲ

为了制备高丝氨酸酰胺，浓缩粗高丝氨酸内酯(hSerlac)类似物 化合物4，然后用25毫升饱和NH3的甲醇溶液处理。溶液在0℃搅 拌2小时，然后在室温下搅拌16小时。反应用HPLC(Vydac_C- 18,300埃，4.6×250mm，流速1.2mL/min,0.1％TFA中梯度 为20-45％乙腈)监测，并且在18小时内完成。溶液浓缩并用制备 性RP-HPLC(Vydac_C-18,0.1％TFA中梯度为20-45％乙 腈)纯化。收集高丝氨酸酰胺肽部分并冻干，得到30毫克纯度＞98％ 的白色固体，即化合物3。

                     化合物3 AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH2(X=hSer,SEQ ID NO:8) 物理数据： m.p.138-142℃    [α]25D-45.97°(c0.25,H2O) FAB(C176H302N56O52):[M+H]+4033.9 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.6(2)；His,2.8(3)；

Gly,0.97(1)；hSer,0.97(1)；Thi,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,2.9(3)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.6(8)；Lys,

3.9(4).

                   实施例Ⅳ

按照实施例Ⅰ的方法，制备0.35mmol左右的被保护的肽-树 脂BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S (Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK (Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM。所有的Na基团用叔丁 氧基羰基(Boc)保护；侧链保护基团已标出。在合成结束之后，用50 毫升20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)在室温下处理肽树脂30分 钟，从而除去赖氨酸上的芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团。随后依 次用DMF,MeOH，和CH2Cl2洗涤树脂，并干燥，得到1.6克部分 保护的肽。于20毫升DMF中，在0.16g(0.3mmol)六氟磷酸苯并 三唑基-三(吡咯烷基)磷鎓盐和0.067g(0.525mmol)二异丙基乙 胺(DIEA)存在下，用0.44克(0.3mmol)甲氧基二(乙烯氧基)乙 酸[PEG(2)CH2COOH]使0.8g(0.175mmol)部分保护的肽在赖 氨酸处进行乙酰化反应5小时。5小时后，过滤树脂，然后依次用 DMF,MeOH和CH2Cl2洗涤。重复乙酰化步骤两次，直至在树脂上 获得阴性茚三酮结果。将最终的肽从树脂上裂解，并且如实施例Ⅰ那 样移去侧链保护基团和进行纯化。获得100毫克化合物19。

                   化合物19 物理数据： m.p.145-195℃    [α]25D-44.60°(c0.2,

H2O) FAB(C183H316N64O54):[M+H]+4276.2 AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.0(5)；Ser,1.6(2)；His,2.9(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.9

(2)；Arg,7.1(7)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,0.9(1).

                      实施例Ⅴ

按实施例Ⅳ那样合成、切取和纯化肽,除了使用2-甲氧基聚 (乙烯氧基)乙酸[PEG(5000)CH2CO2H]作为乙酰化剂。用0.8g (0.175mmol)部分保护的肽获得300毫克纯化合物20.

                  化合物20 物理数据： m.p.105℃    [α]25D-22.95°(c0.1l,50％HOAc水溶液) AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.6(2)；His,2.6(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.1

(1)；Arg,7.3(7)；Val,0.8(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.3(8)；Lys,1.1(1)；Ala,

1.8(2)．

                    实施例Ⅵ

             合成hPTHrp(1-34)类似物基因

设计编码hPTHrp(1-34)类似物化合物4(SEQ ID NO:9)的 合成基因,它具有如图1所示的核苷酸序列和限制性酶切位点。必需 寡核苷酸用DNA合成仪(Milligen/Biosearch),并采用Sinha,et al.,Nucleic Acid Research 12,4539-4557(1984)的氨基磷酸酯 (phosphoramidite)法制备。去保护后，粗寡核苷酸在制备性15％聚 丙烯酰胺凝胶上通过凝胶电泳而纯化。用UV照射确定寡核苷酸的 位置，然后将其从凝胶中切取出来，在Waters c18 Sep-pak_柱上脱 盐，接着冻干。

通过聚合酶链反应的扩增反应是在Perkin-Elmer Cetus热循 环仪上进行，条件为：94℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，共25个 循环，其中使用包括Taq聚合酶在内的″GeneAmp″DNA扩增试剂 盒(Perkin-Elmer Cetus)。

制备两种重迭的寡核苷酸，即88聚物(2微克)的PTH3和反义 的、90聚物(2微克)的PTH4作为hPTHrp(1-34)类似物基因的 模板DNA序列。 PTH3,(SEQ ID NO:31): CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45

                        Met Ala Val Ser Glu His Gln

                            1               5 CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT C

                                                    88 Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg

        10                  15                  20 PTH4(SEQ ID NO:32): CCTCGAAGCT   TATGCATCAT   TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46

                               Met Thr His Leu Lys Glu

                                               30 AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88 Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile

        25              20                      15 CG 90, 采用两侧引物PTHPCRl: CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG(SEQ ID NO:33) 和PTHPCR2:CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC(SEQ ID NO:34)，通过PCR扩增整个基因。扩增的DNA在4％NuSieve_ 琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳纯化。从凝胶中切取含有合成的约150 碱基的hPTHrp(1-34)类似物基因的条带，用Elu-Quik_玻璃凝 胶DNA萃取法(Schleicher＆Schuell,Keene,NH)分离出约 200ng DNA。

                   实施例Ⅶ

hPTHrp(1-34)1类似物基因的分子克隆

为了亚克隆实施例Ⅵ的hPTHrp(1-34)类似物基因，分离 200ng扩增的DNA，然后用限制性内切酶HinDⅢ和SacⅡ进行 酶切。如图2所示，DNA被连于2微克的用HinDⅢ和SacⅡ酶切 过的TrpLE 18 Prot(Ile3,Pro5)质粒。

产生的质粒TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1含有单拷贝的 hPTHrp(1-34)类似物基因，将该质粒转入活性大肠杆菌HB 101 细胞(CLONTECH,Palo Alto,CA)。转化子经PCR分析以证实插 入情况。选择转化细胞克隆，在200微升水中煮沸5分钟；用位于插 入件两侧的两个引物对2微升样品进行PCR。然后在1％琼脂糖凝 胶上分析PCR产物以确定存在单拷贝的hPTHrp(1-34)基因插 入件。然后在DNA自动测序仪(Applied Biosystems Model 373A, Foster City,CA)上，使用供应商的Dye Deoxy Terminator测序试 剂盒，通过DNA测序而证实TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1构建物。

                         实施例Ⅷ 构建含有多拷贝hPTHrp(1-34)类似物基因的Trp LE 18载体

在hPTHrp(1-34)类似物基因序列的开头和末端附近具有唯 一的Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ限制性位点。可以使用这两个识别不同序列但 产生相同单链粘性末端的位点在Trp LE 18载体构建多拷贝 hPTHrp(1-34)基因。

在图3中概括了构建串联式排列的多重hPTHrp(1-34)序列 的方案。在各反应中，用Bam HⅠ+NheⅠ和XbaⅠ+Bam HⅠ消化 5微克含有单拷贝基因的Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1质粒。从各 消化物中，分离出约300ng含有hPTHrp(1-34)类似物基因的片 段。混合两种片段并连接，从而形成Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2质 粒。用该质粒转化活性大肠杆菌HB 101细胞。利用转化的PCR产 物在1％琼脂糖凝胶上的大小来确定存在两个拷贝的hPTHrp(1- 34)基因插入件。然后通过DNA测序确认含有两个拷贝基因的Tr- pLE 18 hPTHrp(1-34)2。两个hPTHrp(1-34)基因的正确融合会 在接头处消除NheⅠ和XbaⅠ位点。这使得XbaⅠ和NheⅠ在串联 式排列的基因两侧仍是唯一的。

通过重复该程序，构建含有4个拷贝hPTHrp(1-34)基因的最 终质粒Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4，如图4所示。通过DNA序列 分析发现Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4序列是正确的。

                 实施例Ⅸ

Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4的表达和纯化

诱导Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4

将含有50微克/毫升氨苄青霉素和100微克/毫升色氨酸的50 毫升LB培养基起始培养物(J.H.Miller,Experiments in Molecu- lar Genetics,″p.431(1972)，在此引用作为参考)用含有Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4质粒的大肠杆菌细胞进行接种，然后在37℃剧烈 摇动生长过夜，至A550为约6。将2升用于生产的LB培养基预热至 37℃，然后用20毫升起始培养物进行接种，得到的A550为约0.06。然 后培养物在剧烈摇动下生长至A550为约0.6-0.8，加入2毫升含10 mg/mL吲哚丙烯酸(IAA)的溶液。继续在通气良好的条件下生长 16小时直至终A550为约6(典型地，为4-10)。通过离心浓缩细胞，然 后再悬浮于500mL 50mM Tris-HCl,pH7.5,0.1mM EDTA缓 冲液中(Tris缓冲液)。

悬浮液用Heat Systems-Ultrasonics,Inc．的220F型超声波 仪(装有3/4″扬声器)，在50％满负荷(为了避免过热)下进行超声波 处理。

为了确定诱导的程度，用SDS-PAGE分析整个细胞。观察到从 TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4构建物衍生而得的基因产物为预计约 17,000道尔顿分子量的主条带。该条带对应于约10％的细胞总蛋白 质。

分离融合蛋白

在约3600×g下离心细胞Ⅰ裂解液15分钟，使Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白沉积；弃去上清液。将沉积物重新悬浮于 100毫升Tris缓冲液中(典型地为40-80A550/mL)

                   实施例Ⅹ

融合蛋白的加工和高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽的纯化

用CNBr将位于hPTHrp(1-34)多聚体融合蛋白一侧的甲硫 氨酸切下，释放出所需的高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)多肽，然后 按下列方法进行纯化。 用CNBr处理融合蛋白

将洗涤过的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白沉积物通过 轻轻地搅拌重新悬浮于60mL 70％甲酸中(约20mg/mL总蛋白；典 型地将来自1000 A500单位细胞的原料溶于3毫升中)。加入数滴辛 醇，用N2吹洗溶液20分钟，然后加入5.5g CNBr。接着，于25℃反 应6小时，将等体积的50∶50 MeOH∶H2O与样品混合，随后通过旋 转蒸发而除去。重复该过程2-4次，使甲酸和CNBr基本上被去除。 然后蒸发样品至干燥，重新溶解于200毫升水中，冻干储存。 高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)的纯化

将CNBr裂解的上清液在有所改变的50mM KH2PO4pH6.5 中透析24小时。在透析中，pH维持在6.5。透析后，高速离心除去沉 淀物。上清液通过Gelman0.45μ过滤装置(Acrodisc 4184)澄清化。 阳离子交换色谱

最初的纯化通过在Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC柱(21.5× 150mm)上的阳离子交换色谱而完成。对应于流速为8mL/min和约 12毫克高纯度高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽产量的色谱条件如 下：

1．用50mM KH2PO4,pH 6.5平衡柱

2．装10mL澄清的上清液(约1.5升培养液或2.4g包涵体)。

3．用含有50mM NaCl的50mM KH2PO4,pH6.5洗涤柱直 至基线稳定

4．用含有90mM NaCl的50mM KH2PO4,pH6.5洗脱柱。 收集馏分约45分钟。

5．用C18 HPLC分析90mM NaCl馏分中高丝氨酸内酯 hPTHrp(1-34)含量，然后收集储存。 反向HPLC色谱

用反相Poros R/H 4.6 × 100 mm柱(Perseptive Biosystems, Cambridge,MA)进行最后的纯化步骤。该色谱条件如下： 流动相A:0.1％三氟乙酸(TFA)/水

B:0.1％三氟乙酸(TFA)/CH3CN

   时间        流速       ％B

   0min        4ml/min    15

   5.0min      4ml/min    40

   5.2min      4ml/min    100

   6.8min      4ml/min    100

   7.0min      4ml/min    15

高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)，化合物4的保留时间约为 2.943分钟。纯化的肽用质谱法测定纯度为约98％。

实施例Ⅺ

在切除卵巢的大鼠上，大体按照Gunness-Hey和Hock, Metab.Bone Dis.5:177 181(1984)的方法评估本发明的化合物对 骨质的作用。

使成年Sprague-Dawley雌性大鼠适应环境，按重量分组(n= 9,10 or 12)，然后进行两侧卵巢切除(OVX)或模拟手术。在手术后 17天给药，持续20天。每天用2％鼠血清/盐水介质皮下施用测试化 合物。

20天后，杀死鼠，取出右股骨。将股骨切成两半，远端的一半股 骨(DHF)进一步通过钻出小梁而分成小梁骨(TB)和皮骨(CB)。萃 取出钙，通过Calcette钙分析仪进行测定，以平均骨钙表示，单位为 mg/DHF/100g体重。

使用两样品t-检验来比较OVX和模拟组。用单向ANOVA 比 较OVX组，随后用Fisher的LSD多重比较法将各组与介质进行比 较。

卵巢切除会导致严重的总骨质丧失，主要是小梁骨的骨质丧失。 与模拟手术的对照组相比，总骨钙质低47-54％。

通过统计表明，80微克/kg/天bPTH(1-34)和hPTHrp(1- 34)能够使处理过的OVX鼠的总骨钙质明显增加，分别为53- 95％和18-40％；但是皮骨钙质没有明显增加。

本发明的化合物，按80微克/kg/天给药时，会增加总骨钙质约 66-138％，增加小梁骨钙质87-128％。对于未处理的OVX对照 组，皮骨钙质、小梁厚度和骨体积也明显增加。

在该分析中，测试了下列化合物： 化合物             n          小梁骨钙质      总骨钙质 编号          (测试数目#)   (％增加，OVX)(％增加，OVX) 化合物1             6         101-128％     88-138％ 化合物2             3         87-102％      66-114％ 化合物4             3           -           88-114％

在类似的研究中，按40微克/kg/天给切除卵巢的大鼠给药5， 10和20天，得到下列结果： 化合物              n         给药天数      总骨钙质 编号           (测试数目#)      (d)       (％增加，OVX) 化合物1             3           20d         73-109％ 化合物4             5           20d         79-105％ 化合物4             1           10d           79％ 化合物49           1         10d          93％ 化合物4            1         5d           55％ 化合物42           1         5d           60％

                           实施例Ⅻ

                              毒性

在上面的实施例Ⅺ中，对于本发明的化合物没有观察到毒性 作用。

                      发明背景