包含双极性反式类胡萝卜素的组合物及其应用
阅读：5发布：2020-08-19
专利汇可以提供包含双极性反式类胡萝卜素的组合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含双极性反式类胡萝卜素的组合物及其应用，所述组合物包含：i)双极性反式类胡萝卜素，ii)环糊精，和iii)包衣。本发明还涉及所述组合物在制备用于 治疗 患有代谢综合征的 哺乳动物 的药物中的应用，在制备用于治疗患有癌症的哺乳动物的药物中的应用，以及在制备用于治疗患有神经变性 疾病 的哺乳动物的药物中的应用。，下面是包含双极性反式类胡萝卜素的组合物及其应用专利的具体信息内容。
1.包含双极性反式类胡萝卜素的药物组合物在制备用于治疗患有代谢综合征的哺乳动物的药物中的应用，其中，对所述哺乳动物施用治疗有效量的所述药物，而且，所述药物组合物包含：
i)双极性反式类胡萝卜素，所述双极性反式类胡萝卜素具有下式的结构：
YZ-TCRO-ZY
其中：
Y＝相同或不同的阳离子；
Z＝与阳离子相连的极性基团，Z相同或不同；和
TCRO＝反式类胡萝卜素骨架，其具有共轭的碳-碳双键和单键，并具有侧基X，其中侧基X相同或不同，并且是：(1)具有10个以下碳原子的线性或支化烃基；或(2)卤素；
ii)环糊精，和
iii)包衣，所述包衣避免所述双极性反式类胡萝卜素在哺乳动物胃部的酸性条件下转化为顺式异构体。
2.基本上由双极性反式类胡萝卜素构成的药物组合物在制备用于治疗患有癌症的哺乳动物的药物中的应用，其中，对所述哺乳动物施用治疗有效量的所述药物并且不对所述哺乳动物使用辐射，并且药物组合物基本上由下述成分构成：
i)双极性反式类胡萝卜素，所述双极性反式类胡萝卜素具有下式的结构：
YZ-TCRO-ZY
其中：
Y＝相同或不同的阳离子；
Z＝与阳离子相连的极性基团，Z相同或不同；和
TCRO＝反式类胡萝卜素骨架，其具有共轭的碳-碳双键和单键，并具有侧基X，其中侧基X相同或不同，并且是：(1)具有10个以下碳原子的线性或支化烃基；或(2)卤素；
ii)环糊精，和
iii)包衣，所述包衣避免所述双极性反式类胡萝卜素在哺乳动物胃部的酸性条件下转化为顺式异构体。
3.包含双极性反式类胡萝卜素的药物组合物在制备用于治疗患有神经变性疾病的哺乳动物的药物中的应用，其中，所述神经变性疾病选自由帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化、弗里德希氏共济失调、亨廷顿舞蹈症、路易体病和脊髓性肌萎缩组成的组，并且对所述哺乳动物施用治疗有效量的所述药物，其中，所述药物组合物包含：
i)双极性反式类胡萝卜素，所述双极性反式类胡萝卜素具有下式的结构：
YZ-TCRO-ZY
其中：
Y＝相同或不同的阳离子；
Z＝与阳离子相连的极性基团，Z相同或不同；和
TCRO＝反式类胡萝卜素骨架，其具有共轭的碳-碳双键和单键，并具有侧基X，其中侧基X相同或不同，并且是：(1)具有10个以下碳原子的线性或支化烃基；或(2)卤素；
ii)环糊精，和
iii)包衣，所述包衣避免所述双极性反式类胡萝卜素在哺乳动物胃部的酸性条件下转化为顺式异构体。
4.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述双极性反式类胡萝卜素是盐。
5.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述双极性反式类胡萝卜素是TSC。
6.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述包衣是肠溶包衣。
7.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述包衣是在肠道内将释放所述双极性反式类胡萝卜素的包衣。
8.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述包衣是丙烯酸酯聚合物。
9.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述环糊精选自由α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精组成的组。
10.如权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述组合物为片剂、丸剂或胶囊的形式。
包含双极性反式类胡萝卜素的组合物及其应用
[0001] 本申请是申请日为2011年06月02日的PCT国际申请PCT/US2011/000997的分案申请，原申请为发明专利申请，进入国家阶段的申请号为201180033875.6，名称为“双极性反式类胡萝卜素的口服制剂”。
[0002] 本申请要求2010年6月2日递交的美国临时专利申请第61/350,804号的优先权，并通过引用将该临时申请的全部内容并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及扩散促进化合物的制剂。本发明的组合物通常包含双极性反式类胡萝卜素、环糊精和包衣。所包含的组合物用口服递送的pH响应型化合物进行肠溶包衣。
背景技术
[0004] 通常认为经口服递送疗法是对患者进行药物递送的最为常用的方法，这是因为这一途径通常增大了患者的依从性，减少与注射有关的副作用数量，并为使用者提供便利。这种施用途径非常有利于对慢性病患者给药。
[0007] 美国专利申请第10/647,132号涉及用于制造双极性反式类胡萝卜素盐(BTC)的合成方法以及它们的使用方法。
[0008] 美国专利申请第11/361,054号涉及改进的BTC合成法以及BTC的新用途。
[0010] 美国专利申请第12/289,713号涉及一类促进小分子扩散的新疗法。
[0011] 美国临时申请第61/213,575号涉及扩散促进化合物与溶栓药一起应用。
[0012] 已经公开了多种双极性反式类胡萝卜素制剂。参见共同拥有的美国专利申请第10/647,132号和美国专利申请第11/361,054号。
发明内容
[0013] 本发明的药物组合物包含扩散促进化合物、环糊精和包衣。本发明还涉及用于口服递送双极性反式类胡萝卜素的药物组合物的形成方法，所述方法包括使双极性反式类胡萝卜素与环糊精混合、将所述混合物添加至胶囊中或制成片剂、并添加包衣(有利的是肠溶包衣)。本发明中还包括哺乳动物体内氧的扩散性的提高方法，和患有以缺氧为特征的疾病或病况的哺乳动物的治疗方法，所述以缺氧为特征的疾病或病况例如包括缺血、癌症、创伤性脑损伤、呼吸道疾病、出血性休克、心血管病、多器官衰竭、动脉硬化症、PAD、PVD、心肌梗塞、肺气肿、哮喘、ALI、ARDS、COPD、高血压、脑水肿、乳头状瘤、脊髓损伤、中枢神经系统的病况(特别是以神经变性为特征的疾病)和代谢综合征及其并发症。附图说明
[0015] 图2示出了在实施例4中γ-环糊精对大鼠空肠内的TSC吸收的影响(γ-环糊精对TSC的血液吸收的影响)。
[0016] 图3示出了在实施例4中TSC原位施用至小肠后的pk曲线，即TSC血浆浓度(μg/mL)与施用后时间(分钟)的关系。
[0017] 图4示出了在实施例5中，TSC-γ-环糊精混合物中TSC剂量对Cmax的影响，即TSC剂量对于环糊精促进效果的影响。
[0018] 图5示出了在实施例6中，在使大鼠口服施用包含在明胶胶囊(包含相同量的TSC，约4mg)中的干粉后7个小时的时间内血流中的浓度。
[0019] 图6示出了在实施例6中，采用未包衣的胶囊以及具有Eudragits包衣的胶囊所获得的吸收百分比的改善(与仅有TSC相比)。
[0021] 图8示出了在实施例7中，大鼠的帕金森氏症模型中10μg 6-OHDA预治疗对神经元死亡的影响。
[0022] 图9示出了在实施例7中，大鼠的帕金森氏症模型中5μg 6-OHDA预治疗对神经元死亡的影响。
[0023] 图10示出了在实施例7中，注射5μg 6-OHDA后黑质未治疗部分中活神经元的个数。
[0024] 图11示出了在实施例8中，C57B小鼠肺中第18天的B-16肿瘤计数的结果(中值数)。
[0025] 图12示出了在实施例8中，C57B小鼠肺中第18天的B-16肿瘤计数的结果(平均值±标准方差)。
具体实施方式
[0026] 尽管反式藏花酸钠(TSC)等双极性反式类胡萝卜素(BTC)是类胡萝卜素属化合物中的一员，但其却不能按照与以胶囊或丸剂形式销售的其他类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素或维生素A)类似的方式那样口服给药。在开发BTC化合物的口服制剂时必须要考虑的两个因素是pH和溶解度，这两个因素是与其他类胡萝卜素化合物完全不同的。用于配制其他类胡萝卜素化合物的方法完全不能应用于TSC等化合物。
[0027] TSC在酸性条件(例如，在胃中存在的那些条件)下沉淀。这种固体物质在胃的酸性环境中实际上是不溶的。TSC在酸性条件下不稳定，并且将转化为能够沉淀的顺式异构体。已经设计出在胃苛刻的酸性环境中保护TSC，并在更为有利的pH区域内释放TSC的系统。小肠内确实存在更为有利的pH。原位闭环研究显示，与施用至胃部相比，当将TSC直接施用至小肠时生物利用度增大。参见以下的实施例。据认为TSC的有效性依赖于体内得到的TSC浓度水平。通过口服施用TSC能够延长TSC的有效性。
[0028] 双极性反式类胡萝卜素的片剂包含通常用于制造片剂的赋形剂。有利的是，片剂还具有位于其上的肠溶包衣，因而片剂将在pH更高(>5.5)的消化道区域而非酸性胃部中溶解。
[0029] 本发明的组合物
[0030] 本发明的组合物均制成为药用级，即，药物组合物。这样的制剂可包含本领域的技术人员熟知的药学上可接受的载体和其他的治疗剂。有利的是，所述制剂不包含抑制扩散促进化合物改善扩散性能力的化合物。
[0032] A.扩散促进化合物
[0033] 本发明的扩散促进化合物包括美国专利申请第10/647,132号、美国专利申请第11/361,054号、美国专利申请第12/081,236号和美国专利申请第12/289,713号中描述的那些化合物，在此通过引用将各篇文献全文并入。
[0034] 本发明的扩散促进化合物是反式类胡萝卜素，包括反式类胡萝卜素的二酯、二醇、二酮和二酸，双极性反式类胡萝卜素(BTC)和双极性反式类胡萝卜盐(BTCS)。所包括的双极性反式类胡萝卜素化合物具有下式：
[0035] YZ-TCRO-ZY
[0036] 其中：
[0037] Y＝阳离子
[0038] Z＝与阳离子相连的极性基团，和
[0039] TCRO＝反式类胡萝卜素骨架，
[0040] 例如TSC。
[0041] 更具体而言：
[0042] Y(在两端可以相同或不同)＝H或非氢阳离子，优选Na+或K+或Li+。Y有利的是+ +一价金属离子。Y还可以是有机阳离子，例如R4N、R3S，其中R是H或CnH2n+1，其中n为1～
10，有利的是1～6。例如，R可以是甲基、乙基、丙基或丁基。
10，有利的是1～6。例如，R可以是甲基、乙基、丙基或丁基。
[0043] Z(在两端可以相同或不同)＝与H或阳离子相连的极性基团。可选地包括类胡萝-卜素(或类胡萝卜素相关化合物)上的末端碳，该基团可以是羧基(COO)或CO基团(例如，- -
酯基、醛基或酮基)或羟基。该基团还可以是硫酸基(OSO3)或单磷酸基(OPO3)、(OP(OH)-
O2)、二磷酸基、三磷酸基或其组合。该基团还可以是COOR的酯基，其中R为CnH2n+1。
酯基、醛基或酮基)或羟基。该基团还可以是硫酸基(OSO3)或单磷酸基(OPO3)、(OP(OH)-
O2)、二磷酸基、三磷酸基或其组合。该基团还可以是COOR的酯基，其中R为CnH2n+1。
[0044] TCRO＝反式类胡萝卜素或类胡萝卜素相关的骨架(有利的是少于100个碳)，该骨架是线性的，具有侧基(在下文定义)且通常包含“共轭的”或交替的碳-碳双键和单键(在一个实施方式中，如在番茄红素中那样，TCRO未完全共轭)。侧基(X)通常为甲基，但也可以是下述其它基团。在一个有利的实施方案中，该骨架单元的连接方式使得其排列在分子的中心翻转。环绕碳-碳双键的4个单键都位于同一平面。如果侧基位于碳-碳双键的同一侧，则该基团被称为顺式(也称为“Z”)；如果侧基位于该碳-碳双键的异侧，则该基团被称为反式(也称为“E”)。在本案中，异构体将被称为顺式和反式。
[0045] 本发明的化合物是反式的。顺式异构体通常是有害的并导致扩散性不会增加。在一个实施方案中，顺式异构体可以在骨架保持线性时使用。侧基的位置可以相对于分子的中心点对称，也可以不对称，使得分子的左侧看上去与分子的右侧在侧基类型或其相对于中心碳的空间关系上并不相同。
[0046] 侧基X(可以相同或不同)是氢(H)原子、具有10个以下碳(有利的是4个以下，-并可选地包含卤素)的线性或支化烃基或卤素。X还可以是酯基(COO)或乙氧/甲氧基。
X的实例是甲基(CH3)、乙基(C2H5)、苯基或环上具有或不具有侧基的单芳香环结构、诸如CH2Cl等含卤素的烷基(C1-C10)、如Cl或Br等卤素或甲氧基(OCH3)或乙氧基(OCH2CH3)。
侧基可以相同或不同，但所用侧基必须使骨架保持线性。
X的实例是甲基(CH3)、乙基(C2H5)、苯基或环上具有或不具有侧基的单芳香环结构、诸如CH2Cl等含卤素的烷基(C1-C10)、如Cl或Br等卤素或甲氧基(OCH3)或乙氧基(OCH2CH3)。
侧基可以相同或不同，但所用侧基必须使骨架保持线性。
[0047] 虽然存在许多天然的类胡萝卜素，但并不存在类胡萝卜素盐。共同拥有的美国专利第6,060,511号涉及反式藏花酸钠(TSC)，在此通过引用的方式并入其整体。通过使天然存在的藏红花与氢氧化钠反应，随后进行主要选择反式异构体的提取而制得TSC。
[0048] 类胡萝卜素或类胡萝卜素盐的顺式异构体和反式异构体的存在可以通过观察溶于水溶液中的类胡萝卜素样品的紫外-可见光谱来确定。给定光谱后，在380nm～470nm可见光的波长范围内出现最高峰的吸光度(该数值取决于所用溶剂和BTC或BTCS的链长)。侧基的加入或链长的不同都会改变该峰值吸光度，但本领域技术人员将认识到，可见光范围内存在的吸光度峰对应于这些分子的共轭骨架结构，上述波长范围内的峰值吸光度除以UV波长范围220nm～300nm内出现的峰的吸光度可以用来确定反式异构体的纯度水平。当反式类胡萝卜素二酯(TCD)或BTCS溶于水时，可见光波长范围的最高峰将位于380nm～470nm(取决于确切的化学结构、骨架长度和侧基)，UV波长范围的峰将位于220nm～300nm。 根 据M.Craw和 C.Lambert,Photochemistry and Photobiology,Vol.38(2),241-243(1983)(在此通过引用并入其全部内容)，计算结果(在分析藏花酸时)为3.1，纯化后提高到6.6。
[0049] 对美国专利申请第10/647,132号和美国专利申请第11/361,054号中描述的合成TSC进行Craw和Lambert分析，该比值为大于7.0(例如，7.0～8.5)，有利的是大于7.5(例如，7.5～8.5)，最有利的是大于8。合成的材料是“更纯的”或高度纯化的反式异构体。
[0050] 有利的是，所述反式类胡萝卜素是藏花酸、藏花素、双极性反式类胡萝卜素(BTC)盐如TSC，或是类胡萝卜素的二酯、醇或酸。
[0051] B.环糊精
[0052] 已经提出了许多赋形剂来增加药物在胃肠道的生物利用度，所述赋形剂例如包括表面活性剂、螯合剂、二醇类、聚乙二醇等；不过，环糊精与双极性反式类胡萝卜素一起配合极好。
[0053] 在共同拥有的申请美国申请第11/361,054号中可见环糊精与双极性反式类胡萝卜素组合的详细描述，在此通过引用并入其全部内容。
[0054] 有利的是，双极性反式类胡萝卜素是包含反式类胡萝卜素和环糊精(例如，α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精)的组合物的形式。所述环糊精可以是羟基丙基-β-环糊精或2-羟基丙基-γ-环糊精。在另一实施方式中，所述组合物还包含甘露醇或盐水。在又一实施方式中，所述组合物还包含诸如碳酸氢盐或甘氨酸等调节pH的化合物。
[0055] 有利的是，双极性反式类胡萝卜与环糊精的比率不超过1:10。有利的是，不超过1:4，例如，2:1、1:1或1:4。
[0056] C.包衣
[0057] 肠溶包衣是对口服药物施加的屏障，用来控制在消化系统内吸收的位置。肠溶性指的是小肠，因此肠溶包衣阻止药物在达到小肠前释放。多数肠溶包衣通过在胃中的高酸性pH下显示出稳定表面，而该表面在弱酸性(相对偏碱性)pH下迅速分解而起作用。例如，肠溶包衣将不溶解在胃的酸性汁液(pH为1～3)中，但将溶解在小肠内存在的较高pH(超过pH 5.5)下。用于肠溶包衣的材料包括脂肪酸、蜡和虫胶以及塑料。
[0058] 双极性反式类胡萝卜素在酸性条件下沉淀。对于该类型的药物，可以在制剂上添加肠溶包衣以保护活性物质免于接触胃酸，而将活性物递送至其更容易溶解的碱性pH环境(肠内的pH 5.5及以上)中，并能够提供其所需的作用。
[0059] 据认为TSC的有效性依赖于体内得到的TSC浓度水平。通过口服施用TSC能够延长TSC的有效性。由于TSC在酸性条件下沉淀，因此本发明的组合物可在胃苛刻的酸性环境中保护TSC，并在肠道内更为适宜的pH区域中释放TSC。
[0060] 肠溶包衣应用于口服剂型制剂以保护活性物质免于溶解在胃内的胃液中。使用肠溶包衣最常用的原因如下：
[0061] ●保护活性物质免受胃酶或胃液酸度的影响
[0062] ●掩盖目标(task)或气味
[0063] ●防止包括恶心和呕吐在内的胃部刺激
[0064] ●缓释以控制吸收
[0065] ●将活性物质递送至更有利于全身性吸收的消化道内特定位置
[0066] 另一实施方式包括使用响应于更宽的pH值范围的肠溶包衣，从而允许TSC等双极性反式类胡萝卜素在肠道更多部分进行吸收，从而增大吸收的表面积。
[0067] 包衣的组成
[0068] 有许多可获得的材料可以用于肠溶包衣材料。大多数是通过缓慢侵蚀包衣材料(巴西棕榈蜡、角蛋白、谷朊等)或通过pH响应型包衣来发挥作用。依赖于侵蚀机制的材料取决于胃的排空时间。第二类(即，pH响应型包衣)在低pH条件下是疏水性的且不溶于水，在较高的pH下则可溶。因此，所述包衣在胃苛刻的酸性环境中是不溶的，而在肠道较高的pH范围则发生溶解。可获得多种pH敏感型聚合物，其根据应当发生分解的特定pH来选择。下表列出了一些最为常用的pH敏感型聚合物。
[0069] 用于肠溶包衣的常用pH敏感型聚合物
[0070]
[0072]
[0073] Eudragit L30D-55：在pH为5.5以上时发生溶解，靶向释放区域在十二指肠。
[0074]
[0075] Eudragit L100：在pH超过6.0时发生溶解，靶向释放区域在空肠。
[0076]
[0077] Eudragit FS30D：在pH超过7.0时发生溶解，靶向释放区域在结肠。
[0078] D.其他成分
[0079] 可以添加试剂来缓冲扩散促进化合物。可以添加其他的试剂来影响渗透压度，或者作为口服制剂所需的配合剂。具体的缓冲剂包括甘氨酸、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸镁和氢氧化铝。影响渗透压度的具体实例包括甘露醇和多糖。
[0080] 其他可以添加的试剂包括：
[0082] Crospovidone XL 90是交联性聚乙烯吡咯烷酮，在压片时其用作滚圆助剂或用来替代微晶纤维素。滚圆、整丸(marmumerization)、制粒和微粒化的含义相同：制造小球状产品用于制药及相关行业。通过这些过程制造的所有产品均可称为球状体、球体、微球体、丸粒、微丸粒或药物丸粒。所有这些术语的含义均相同。尺寸范围通常为约0.8mm～1.5mm(直径)，不过可能更小和更大。相反，术语造粒通常指的是在一个批次中具有较大尺寸范围的不规则形状颗粒。经造粒的材料一般都不太致密。
[0083] 硬脂酸镁(也被称为十八烷酸的镁盐)是在室温时为固体的白色物质。其化学式为C36H70MgO4。其是含有两个当量的硬脂酸根(硬脂酸的阴离子)和一个当量的镁阳离子2+
(Mg )的盐。硬脂酸镁在约88℃时熔融，不溶于水，通常认为其可供人安全食用。因为它被广泛认为是无害的，因此常常用作医疗片剂和胶囊制造时的填充剂。从这点来看，该物质也是有用的，因为其具有润滑性，在将化学粉末挤压为固体片剂时能够防止成分与制造设备粘连。
(Mg )的盐。硬脂酸镁在约88℃时熔融，不溶于水，通常认为其可供人安全食用。因为它被广泛认为是无害的，因此常常用作医疗片剂和胶囊制造时的填充剂。从这点来看，该物质也是有用的，因为其具有润滑性，在将化学粉末挤压为固体片剂时能够防止成分与制造设备粘连。
[0084] 科利当(kollidon)是分子量可变的聚乙烯基聚合物；用作悬浮分散剂和药用载体。
[0085] 配制方法
[0086] 本发明适于口服的制剂可以作为独立单元存在，如丸剂、胶囊、扁囊剂或片剂，可以为粉末或颗粒，或者为溶液、悬浮液或乳液。适于口服施用的制剂还包括锭剂和软锭剂。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，也可以通过制药领域中已知的方法来制备。所述制剂可用于速释、缓释或控释扩散促进化合物。缓释系统(也称为延时释放、控释等)的优点在于，与同一药物的其他制剂相比给药频率能够得到降低，并且全身性的药物浓度能够在较长的时间内更为稳定。
[0087] 本发明组合物的适宜剂量将取决于给定化合物的代谢，以及接受治疗的病况的严重程度。关于“治疗有效的”剂量，其必须具有所需的效果，即，其必须减轻所针对的适应症的症状。治疗有效的剂量将取决于所治疗的病况、病况的严重程度、所应对的各哺乳动物患者的阶段和个体特征和扩散促进效果的清除性。
[0088] 通常，本发明的组合物通过混合双极性反式类胡萝卜素和选定的环糊精以不超过1:10的混合比来制备。通过任何药学上可接受的方法进行混合。混合物随后装入胶囊容器中，或者压成片剂(其也可以包含前文提到的成分以促进脱模等)。胶囊或片剂随后以形成连续包衣的方式包覆pH敏感型聚合物(如Eudragit)。
[0089] 在本发明的一个实施方式中，将多种类型的肠溶包衣珠粒放在口服递送的胶囊或其他体系中。所述珠粒由具有第一包衣的第一部分或第一组珠粒和具有第二包衣的第二部分或第二组珠粒构成。也可以加入具有不同包衣的其他组珠粒。一个实例是包含具有三种不同类型的Eudragit包衣的珠粒的胶囊，这些珠粒在不同的pH值下释放，并且与仅包含一种类型珠粒的胶囊相比能够在更长的时间内释放。
[0090] 治疗用途和施用模式
[0091] 本发明的组合物在治疗患有组织经历低氧水平(缺氧)的哺乳动物或在与中枢神经系统有关的多种病况中具有治疗用途。
[0092] 本发明的组合物的用途包括在共同拥有的美国专利第6,060,511号、美国专利申请第10/647,132号、美国专利申请第11/361,054号、美国专利申请第12/081,236号和美国临时专利申请第61/213,575号中公开的那些用途，在此通过引用并入上述各文献的全部内容。
[0093] 本发明的口服组合物可用于治疗以下疾病：
[0094] 出血性休克，
[0095] 呼吸道疾病、哮喘、肺气肿、ALI、ARDS、COPD，
[0096] 缺血，
[0097] 心血管病、动脉硬化症、心肌梗塞、高血压、心室纤颤，
[0098] 中风、创伤性脑损伤、脑水肿，
[0099] 中枢神经系统的病况(阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和其他神经变性疾病)；神经变性是神经元的结构或功能逐渐丧失(包括神经元的死亡)的涵盖性术语；变性神经疾病的实例包括：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德希氏共济失调、亨廷顿舞蹈症、路易体病和脊髓性肌萎缩；参见实施例7；
[0100] 关节炎，
[0101] 贫血(早产儿贫血、范可尼贫血、溶血性贫血、小红细胞性贫血、正常红色素贫血、巨红细胞性贫血、遗传性球形红细胞性贫血、镰状细胞性贫血、温性自体免疫性溶血性贫血、冷凝集素溶血性贫血)，
[0102] 慢性肾功能衰竭、高血压，
[0103] 乳头状瘤、脊椎损伤，
[0104] 癌症(有利的是作为以下的辅助剂：i)放射治疗，包括外束放射、伽马刀、近距离放射治疗、螺旋断层放疗以及质子束，包括分割3D适形放射治疗、腔内放射和调强放射治疗(IMRT)，和/或ii)化学疗法，包括替莫唑胺)。
[0105] 糖尿病、糖尿病性视网膜病变，
[0107] 器官获氧不足的疾病，例如韦格氏肉芽肿病。
[0108] 本发明组合物还用作预治疗物或治疗有患上述疾病/病况风险的哺乳动物。
[0109] 本发明的组合物还可用于神经保护，即，用于预防或延迟与神经变性紊乱如帕金森病或阿尔茨海默病相关的并发症。通过在手术之前、期间或之后施用所述组合物，这些组合物还可用于减少哺乳动物的因手术所导致的出血量。
[0110] 所述组合物还可用于当呼吸/用力增加或加强时提高性能，增加有氧代谢，以及在诸如跑步、步行或负重等体力活动期间增大耐力。
[0111] 对于以下用途，所述扩散促进化合物通过任何合适的途径来施用，包括口服、鼻腔或吸入、局部、胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、透皮和骨内)、阴道或直肠。优选的施用途径取决于具体情况。吸入途径，或静脉内或肌内注射对于需要扩散促进化合物极为快速进入血流的紧急情况治疗是有利的。在一个实施方式中，可以通过肌内(IM)或者通过静脉内(IV)注射溶解在无菌水中的环糊精与双极性反式类胡萝卜素的组合物。因而，制剂包含那些适合于通过这些途径来施用的物质(待雾化的液体或粉末)。应当理解，优选的途径可以不同，例如，随患者的病况和年龄而不同。
[0112] 严重肢体缺血，
[0113] 帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、弗里德希氏共济失调、亨廷顿舞蹈症、路易体病和脊髓性肌萎缩，
[0114] 多发性硬化，
[0115] 代谢综合征，
[0116] 周围神经病变，
[0117] 大脑性麻痹，
[0118] 癌症—双极性反式类胡萝卜素盐(如TSC)是用于造成许多种类的癌变肿瘤衰退的化学疗法，也就是说，不使用辐射或其他化学疗法。实施例8涉及用TSC治疗癌变肿瘤。TSC并不通过杀死癌细胞来发挥作用，而是(不希望受到理论的限制)据认为通过使细胞恢复为更成熟的(因而也更接近于正常的)细胞来发挥作用。本发明不包括类维生素A(例如所有的反式视黄酸)或其盐治疗癌症的用途。可以治疗的癌症/肿瘤类型的实例包括皮肤、肺、乳、脑、膀胱、前列腺和结肠的癌症/肿瘤。
[0119] 在一个实施方式中，施用了多于一种的扩散促进化合物。作为选择，可以一同服用血红蛋白或碳氟化合物与扩散促进化合物。
[0120] 以下的实施例是描述性的，而非限制本发明的组合物和方法。对于本领域技术人员显而易见的是，对常见的各种条件和参数的其它合适的修饰和改变也包含在本发明的实质和范围之内。
[0121] 实施例
[0122] 实施例1
[0123] 片剂组合物(无环糊精)
[0124] 制备了由以下成分构成的两种制剂：
[0125] 65％的共混物
[0126] 65.0％ TSC
[0127] 26.0％ Prosolv 90
[0128] 2.9％ Crospovidone XL 90
[0129] 1.5％ 硬脂酸镁
[0130] 4.6％ 科利当
[0131] 60％的共混物
[0132] 60.4％ TSC
[0133] 30.1％ Prosolv 90
[0134] 3.8％ Crospovidone XL 90
[0135] 1.4％ 硬脂酸镁
[0136] 4.3％ 科利当
[0137] TSC片剂按照三(3)步制造：
[0138] 步骤1：含有70％TSC、25％Prosolv 90和5％科利当25的混合物在袋中混合5分钟，然后使用Vector辊式压实机进行辊压。辊式压实机的条件如下：辊压＝800psi，螺杆速度＝10rpm，辊速＝0.95rpm。由此制得称为TSC共混物I的共混物。
[0139] 步骤2：使用Crospovidone XL 10和硬脂酸镁对来自步骤1的TSC共混物I进行辊压。百分比如下：TSC共混物I为97.5％，Crospovidone XL 10为2％，硬脂酸镁为0.5％。该步骤的产物被称为TSC颗粒II。
[0140] 步骤3：来自步骤2的带状物用手粉碎，然后通过20目的筛进行筛分。使得到的颗粒与赋形剂(见下)混合，从而获得最终的共混物，其包含65％的TSC和60％的TSC。
[0141]
[0142] 步骤4：片剂用CAP(邻苯二甲酸乙酸纤维素)包覆。
[0143] 为了说明胃内和肠内吸收的差异，进行了下列研究。
[0144] 实施例2
[0145] TSC溶液的吸收
[0146] 使体重为约300克～400克的雄性Sprague-Dawley(SD)和Wistar大鼠各自禁食24小时，然后用于各项试验。随意饮水，使用带有金属网底的笼子来防止食粪。用异氟烷诱发麻醉并维持该状态。使颈动脉露出，并用PE-50管进行插管。使用丝缝线来固定套管，并对伤口施用2％的利多卡因。
[0147] 在插管之后，使大鼠分置于两组中的一组：TSC剂型制剂直接施用至1)胃内(通过管饲法)，或2)离体肠段。关于给药至离体肠段，形成前端体中线(front midline)，露出腹部和肠段。在该研究中，回肠离体，并用PE-50管进行插管，然后用37℃生理盐水洗涤直至洗涤液清澈为止。使肠段复位，钳住腹部，让大鼠稳定1小时。随后将TSC制剂引入离体肠段内。使肠道复位，用缝合线使腹部闭合。在施用TSC后以不连续的时间间隔由颈动脉获取约0.3mL血样。使用少量肝素钠作为抗凝血剂。对血样进行离心分离，使得到的血浆与3倍体积的甲醇混合，然后使其涡旋。血浆混合物随后进行离心分离，上清液用HPLC分析从而确定TSC水平。
[0148] 该研究中施用的TSC剂型制剂由静脉注射制剂(20mg/mL TSC、8％γ-环糊精、50mM甘氨酸和2.3％甘露醇)构成。如图1显示，与施用至胃部相比，TSC直接施用至小肠时生物利用度增大。
[0149] 实施例3
[0150] 肠溶包衣片剂(无环糊精)
[0151] TSC在胃苛刻的酸性环境中沉淀，几乎是不溶的。必须保护TSC使其免受胃的苛刻环境影响，并使其在小肠内更为有利的高pH范围下释放。为了本研究，制得TSC片剂(表1)，并用Eudragit L100或者邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)进行肠溶包衣。在USP溶解研究中确认两种类型的保护性包衣的完整性，在该研究中，首先将肠溶包衣片剂放在包含人工胃液(SGF)的溶解槽中，然后将其转移至包含人工肠液(SIF)的另一个槽中。包衣和片剂在SGF中保持完好，而在SIF中则发生溶解。根据USP方案进行该研究。
[0152] 表1. TSC片剂制剂
[0153]
[0154] 使用本领域的技术人员已知的压片技术制造这些片剂。
[0155] 然后，为了检验肠溶包衣型TSC所发生的状况，包覆有CAP并含有300mg TSC(使用65％共混物)的片剂对狗进行口服使用。发现血浆TSC浓度极低，这表明该制剂对于临床应用而言生物利用度过低。
[0156] 实施例4
[0157] TSC的肠吸收和环糊精的作用
[0158] 为了确定TSC添加γ-环糊精后对全身性吸收的影响，还进行了额外的研究。
[0159] 使体重为约300克～400克的雄性Sprague-Dawley(SD)和Wistar大鼠各自禁食24小时，然后用于各项试验。随意饮水，使用带有金属网底的笼子来防止食粪。用异氟烷诱发麻醉并维持该状态。使颈动脉露出，并用PE-50管进行插管。使用丝缝线来固定套管，并对伤口施用2％的利多卡因。
[0160] 在插管之后，形成前端体中线，露出腹部和肠段。在该研究中，空肠离体，然后将TSC制剂施用至近端空肠。以0.5:1～4:1的多种γ-环糊精比率(TSC重量：γ-环糊精重量)施用约60mg/kg TSC。TSC在肠段内的移动并不限于施用部位的远端。使肠道复位，用缝合线使腹部闭合。在施用TSC后以不连续的时间间隔由颈动脉获取约0.3mL血样。使用少量肝素钠作为抗凝血剂。对血样进行离心分离，使得到的血浆与3倍体积的甲醇混合，然后使其涡旋。血浆混合物随后进行离心分离，上清液用HPLC分析从而确定TSC水平。
[0161] 如图2所示，γ-环糊精极大地促进了TSC的吸收。
[0162] 图3是TSC原位施用至小肠后的pk曲线。曲线显示，环糊精显著地增大了TSC的肠吸收。
[0163] 图3是TSC血浆浓度(μg/mL)与施用后时间(分钟)的关系。
[0164] 实施例5
[0165] Cmax的可扩展性
[0166] 已经发现，γ-环糊精极大地促进了TSC在胃肠道内的全身性吸收。以上研究中所用的TSC剂量很大，因此，为了确定全身性吸收(以Cmax计)相对于TSC给药量的可扩展性，以γ-环糊精的比率为1:1(TSC重量：γ-环糊精重量)施用了其他剂量的TSC。关于以下研究，TSC以下述剂量施用至空肠肠段：2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和60mg/kg。
[0167] 关于该研究，使体重为约300克～400克的雄性Sprague-Dawley(SD)和Wistar大鼠各自禁食24小时，然后用于各项试验。随意饮水，使用带有金属网底的笼子来防止食粪。用异氟烷诱发麻醉并维持该状态。使颈动脉露出，并用PE-50管进行插管。使用丝缝线来固定套管，并对伤口施用2％的利多卡因。
[0168] 在插管之后，形成前端体中线，露出腹部和肠段。在该研究中，空肠离体，然后将TSC制剂施用至近端空肠。TSC在肠段内的移动并不限于施用部位的远端。使肠道复位，用缝合线使腹部闭合。在施用TSC后以不连续的时间间隔由颈动脉获取约0.3mL血样。使用少量肝素钠作为抗凝血剂。对血样进行离心分离，使得到的血浆与3倍体积的甲醇混合，然后使其涡旋。血浆混合物随后进行离心分离，上清液用HPLC分析从而确定TSC水平。
[0169] 结果显示在图4中。图4中的线为数据的线性回归，显示出获得了优异的拟合。这表明包含有γ-环糊精时获得的数据可以扩展到其他的TSC剂量。
[0170] 实施例6
[0171] 具有和不具有肠溶包衣时的肠吸收
[0172] 为了调查经口服递送时包含TSC和γ-环糊精的益处，进行了额外的研究。关于该研究，将TSC和γ-环糊精以1:4(TSC重量：γ-环糊精重量)的比率填装在9号明胶胶囊中，然后：1)不进行包覆，2)用Eudragit L30D-55(本文也称为LS30D55)进行肠溶包衣(应当在pH大于5.5时分解的包衣)，或者3)用FS30D进行肠溶包衣(应当在pH大于7时分解的包衣)。还施用了仅含有TSC的未包衣胶囊(不含环糊精)。
[0173] 关于该研究，使体重为约300克～400克的雄性Sprague-Dawley(SD)和Wistar大鼠各自禁食24小时，然后用于各项试验。随意饮水，使用带有金属网底的笼子来防止食粪。用异氟烷诱发麻醉并维持该状态。使颈动脉露出，并用PE-50管进行插管。使用丝缝线来固定套管，并对伤口施用2％的利多卡因。
[0174] 在插管之后，将包含药物产物的明胶胶囊经给药注射器(Torpac,Fairfield NJ)施用至胃部，然后经管饲法向胃内施用0.3mL无菌水。在施用TSC后以不连续的时间间隔由颈动脉获取约0.3mL血样。使用少量肝素钠作为抗凝血剂。对血样进行离心分离，使得到的血浆与3倍体积的甲醇混合，然后使其涡旋。血浆混合物随后进行离心分离，上清液用HPLC分析从而确定TSC水平。
[0175] 图5显示了在使大鼠口服施用包含在明胶胶囊中的干粉后7个小时的时间内血流中的浓度，所有的胶囊均包含相同量的TSC(约4mg)。
[0176] 仅有TSC表示胶囊中仅含有TSC；
[0177] TSC:CD(1:4)未包衣，其表示由TSC与环糊精的1:4混合物制成的胶囊，不过该明胶胶囊不具有包衣；
[0178] LS30D55，其表示具有Eudragit LS30D55包衣(应当在pH大于5.5时分解的包衣)的相同1:4胶囊；
[0179] FS30D，其表示具有Eudragit FS30D包衣(应当在pH大于7时分解的包衣)的相同1:4胶囊。
[0180] 图6的柱状图显示了采用未包衣的胶囊以及具有Eudragits包衣的胶囊所获得的吸收百分比的改善(与仅有TSC相比)。
[0181] 实施例7
[0182] 神经变性疾病
[0183] 如上所述，任何神经变性疾病的主要方面均是神经元的死亡。已经进行了多个研究来探查不同的动物模型中TSC对神经元死亡的作用。
[0184] 以此为目的的第一项研究是使用出血性中风的大鼠模型进行的研究。关于该研究，将胶原酶通过颅骨中的钻孔注射至右侧基底神经节，由此导致一部分脑血管破裂并出血。随后在施用胶原酶后3个小时开始注射TSC，在施用胶原酶后48小时杀死大鼠。
[0185] 大脑出血时，血液汇集并形成血肿。血肿的周围神经元细胞死亡。不过，已经发现，用TSC处理则会使神经元的死亡减少约20％。使用染色剂(fluorojade)使技术人员能够对在给定的大脑脑切片中“死亡”的神经元的个数进行计数。在出血性中风大鼠模型中形成的血肿周围的区域进行上述计数。发现用TSC治疗的大鼠中神经元的死亡减少了约30％，如图7所示。
[0186] 用来检验TSC对神经元存活率的影响的另一模型是帕金森氏症的大鼠模型。在该模型中，钻孔穿透颅骨，进入黑质区域。通过在大脑中注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱发帕金森样病况。在该模型中常常注射10□g量的6-OHDA，然后用于第一项研究。
[0187] 采用该模型的第一项研究的目的在于模拟在参考文献中的研究，该参考文献中发现用藏花酸进行的预治疗对于注射10□g 6-OHDA之后的神经元死亡具有有益效果。在研究中，在注射6-OHDA之前以0.1mg/kg的剂量注射TSC 7天(与在藏花酸的研究中进行的给药方案相同)。在注射6-OHDA之后，在随后的4周内不再进行其他的治疗。
[0188] 然后杀死大鼠，取出大脑并送至查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)来计数活神经元。由此对大脑右侧(已经注射了6-OHDA)以及大脑的未经治疗的左侧进行计数。从而能够比较已经用盐水进行预治疗的对照组与使用TSC进行预治疗的大鼠的细胞死亡(治疗侧的计数/未治疗侧的计数)。图8显示了这些结果。
[0189] 可以看出，该治疗后活神经元的百分比几乎翻倍。还应注意到，这是非常严重的神经元死亡模型，因为对照组中大约85％的神经元死亡。
[0190] 更为关注的是后治疗对于注射6-OHDA后神经元死亡的影响。为研究该影响，如前文那样将5□g 6-OHDA再次注射到黑质中，不同的是在该注射后开始治疗。大鼠随后被每日注射TSC(0.25mg/kg)，注射4周，然后将其杀死。取出大脑，送至查尔斯河实验室进行神经元计数。
[0191] 可以看出，用TSC进行治疗有更多活神经元(大约多20％)，这些数据具有统计学显著差异(p<0.05)。
[0192] 该研究受关注的结果是大脑的无6-OHDA侧的脑切片不管在注射盐水或TSC时均显示出几乎相同数量的活神经元，正如图10所示。这表明TSC对于活神经元的存活率没有影响。
[0193] 这些结果与出血性中风模型中发现的那些结果相结合表明TSC在大脑中发挥了神经保护作用。
[0194] 实施例8
[0195] 采用TSC的化学疗法
[0196] 肺转移小鼠模型是广泛使用的用于评估肿瘤治疗的模型。采用B16(小鼠黑色素瘤)细胞，在尾静脉内进行静脉内细胞注射时基本上所有的细胞均开始“接种”，并优先在肺部形成肿瘤。因此，虽然广泛使用了术语肺转移，但是每个生成的肺部结节从技术上讲都是独立的“原发性”肿瘤而非真实的转移。
[0197] 由于B16细胞中的黑色素不会像其余的肺部组织那样变白，因此在费克特溶液(Fekete’s solution)中对提取的肺部进行漂白后肿瘤结节易于可视化。然而总是有一小部分结节是不含黑色素的(“白色”)，这就需要仔细的计数以致不会低估肿瘤负荷。
[0198] 关于该课题研究，从查尔斯河实验室获得八周龄的雌性C57BL/6小鼠。小鼠圈养在5个以下的组中，随意接受食物和饮水。
[0199] 采用标准方案，B16细胞由弗吉尼亚大学细胞信号转导中心(Center for Cell Signaling of the University of Virginia)培养。细胞在接收时处于指数增长阶段。细5
胞在Hank缓冲盐溶液(HBSS)中以5×10细胞/mL的浓度供应。
胞在Hank缓冲盐溶液(HBSS)中以5×10细胞/mL的浓度供应。
[0200] 收到细胞后立即进行注射，并将注射当天指定为第0天。在第0天，所有的小鼠均5
在尾静脉内经静脉注射0.1mL细胞悬浮液，这表明各小鼠均接受了0.5×10个细胞。小鼠随后被单独留置直到第4天。
在尾静脉内经静脉注射0.1mL细胞悬浮液，这表明各小鼠均接受了0.5×10个细胞。小鼠随后被单独留置直到第4天。
[0201] 在第4天，将小鼠分成两组：组A，包括5只小鼠，尾静脉内经静脉注射接受0.05mL盐水。组B，包括7只小鼠，尾静脉内经静脉注射接受0.05mL TSC溶液，TSC的剂量为0.142mg/kg/天。在第5～8天和第11～15天重复相同的注射。在第18天，使用二氧化碳杀死小鼠。切除肺部，漂洗，并放在费克特溶液中，然后于室温保存。
[0202] 随后，以随机的盲序目视评估肺部，以获得肿瘤个数的可视计数。结果发现存在小肿瘤与中型肿瘤及大肿瘤的混合物。因此，分两个不同的组(小肿瘤和中/大肿瘤)目视计数肿瘤。尽管多数肿瘤是黑色的，但仍有一部分是白色肿瘤。
[0203] 肿瘤计数的结果显示在下表2中以及图11和12中。下表2显示了各类型肿瘤组的中值(med.)数以及平均值±标准方差。图11显示了中值，图12显示了平均值。由于标准方差较大导致这些组不具有统计学差异。
[0204] 表2
[0205]
[0206] 对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明的化合物和组合物以及相关方法进行多种修饰和追加，而不脱离所公开的本发明。
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