生物反应器
阅读：53发布：2020-05-12
专利汇可以提供生物反应器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了用于培养细胞的 生物 反应器 。适合作为细胞生长 支架 的筛网可包含交叉 纤维 。筛网可以松散地容纳在筛网支架中，筛网支架又可以包含在 歧管 组件内。下歧管、筛网支架和上歧管可具有相同或相似的内部开口剖面。液体培养基的流动可以经过筛网阵列向上发生，然后在 气穴 存在下流过堰，进入壕沟和 泵 。筛网支架可以具有缝，其面向外部的联结部是圆形的，并且可以具有凹槽，其面向内部的边缘是圆形的。这些部件可位于适于维持所需环境条件和清洁度的 培养箱 内。，下面是生物反应器专利的具体信息内容。
1.一种生物反应器，包括：
用于容纳液体培养基的储存容器；
管道，其从所述管道的下端到所述管道的上端，在所述储存容器的上端大致垂直方向上提供流动路径；
位于所述管道内的培养结构，所述管道的顶部高于所述培养结构的顶部；和循环系统，用于使所述液体培养基向上流过所述管道，或者经过所述培养结构，其中所述管道的所述上端包括在其外侧由壕沟围绕的溢流壁，所述壕沟的底部位于比所述溢流壁的所述顶部低的高度，所述管道的所述上端与所述壕沟接触口袋区域，所述口袋区域由连接到所述管道的结构界定，所述口袋区域与所述口袋区域的外部流体连通隔离，
其中当所述循环系统运行时，所述液体培养基在所述口袋区域内的所述溢流壁上流动，并且所述液体培养基与包含在所述口袋区域中的气体接触，并且所述液体培养基溢出到所述壕沟中，并从所述壕沟中由所述循环系统移除。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，还包括与所述壕沟流体连通的贮槽，所述贮槽处于比所述壕沟的所述底部低的高度，所述循环系统与所述贮槽流体连通，以便从所述贮槽抽出液体培养基。
3.根据权利要求1所述的生物反应器，其中从所述管道的所述下端到所述培养结构的下边界存在下部流动长度，并且从所述培养结构的所述上边界到所述管道的所述上端存在上部流动长度，其中所述上部流动长度短于所述下部流动长度。
4.根据权利要求1所述的生物反应器，其中所述管道具有两对平行壁，所述储存容器具有两对平行壁，所述管道的一对平行壁平行于所述储存容器的一对平行壁，并且所述管道位于所述储存容器的所述成对平行壁中一对的中间。
5.根据权利要求1所述的生物反应器，还包括包围所述储存容器和所述管道的培养箱，并且还包括泵，所述泵从所述储存容器的气体空间区域移除气体，并将所述气体排出到所述培养箱外。
6.一种生物反应器，包括：
用于容纳液体培养基的储存容器；
歧管组件，所述歧管组件包括上歧管和下歧管，所述下歧管具有延伸到所述储存容器中的下端；
筛网支架，所述筛网支架保持多个适合作为细胞支架的筛网；和
循环系统，用于使所述液体培养基流过所述歧管组件，并经过所述筛网支架，其中所述歧管组件和所述筛网支架提供经过所述下歧管和所述筛网支架和所述上歧管的流动路径，
其中所述筛网支架包含在所述歧管组件内，并且
其中所述筛网包含在所述筛网支架内，但具有至少一些能够在至少一个方向上相对于所述筛网支架移动的能力。
7.根据权利要求6所述的生物反应器，其中，当所述筛网支架在所述歧管组件内就位时，所述筛网支架相对于所述下歧管具有至少一个运动自由度。
8.根据权利要求6所述的生物反应器，其中所述上歧管和所述下歧管以及所述筛网支架具有各自的内部剖面流动区域，所述内部剖面流动面积彼此基本相同或彼此在10％差异之内。
9.根据权利要求6所述的生物反应器，其中包括所述筛网中的单个筛网和所述筛网支架之间的间隙的泄漏路径的剖面流动面积，小于经过所述筛网中的单个筛网的所有通道的总流动面积的10％。
10.根据权利要求6所述的生物反应器，其中所述筛网包括多个纤维，所述纤维形成第一层，所述第一层具有彼此平行并沿第一方向取向的纤维，并且包括具有多个彼此平行并且以沿垂直于所述第一方向的第二方向取向的纤维的第二层，所述第二层中的所述纤维与所述第一层中的所述纤维连接。
11.根据权利要求6所述的生物反应器，其中至少一些所述筛网包括多个纤维，并且在所述筛网的单独一个筛网内，所述纤维依次排列在至少第一、第二、第三和第四层中，所述纤维每个所述层中的每个层大致彼此平行，其中所述第一层中的纤维通常平行于所述第三层中的纤维，并且所述第二层中的纤维大致平行于所述第四层中的纤维，并且其中当垂直于所述所述筛网的平坦表面观察时，所述第三层的纤维与所述第一层的纤维不对齐，所述第四层的纤维与所述第二层的纤维不对齐。
12.根据权利要求6所述的生物反应器，还包括在所述下歧管和所述上歧管之间的可压缩密封件，其中所述上歧管的表面在所述密封件附近抵靠所述下歧管的表面。
13.根据权利要求6所述的生物反应器，还包括包围所述储存容器和所述歧管组件的培养箱，其中所述培养箱适于维持温度、湿度、氧气浓度、二氧化碳浓度和气体组分中的至少一个的所需值。
14.根据权利要求13所述的生物反应器，其中所述循环系统包括位于所述培养箱外部的蠕动泵。
15.一种生物反应器，包括：
用于容纳液体培养基的储存容器；
歧管组件，所述歧管组件包括上歧管和下歧管，所述下歧管具有延伸到所述储存容器中的下端；
筛网支架，所述筛网支架保持多个适合作为细胞支架的筛网；所述筛网支架能够容纳在所述歧管组件内；和
循环系统，用于使所述液体培养基流过所述歧管组件，并经过所述筛网支架，其中所述歧管组件和所述筛网支架提供经过所述下歧管和所述筛网支架和所述上歧管的流动路径，
其中所述筛网支架在其内表面上具有凹槽，并且具有穿过其外表面的缝，并且其中所述凹槽和所述缝配置成使得所述筛网能够经过所述缝插入并且由所述凹槽和缝中的至少一个支撑。
16.根据权利要求15所述的生物反应器，其中所述凹槽和所述缝围绕所述筛网支架的周边形成连续路径。
17.根据权利要求15所述的生物反应器，其中所述缝包括在外表面上的圆形边缘。
18.根据权利要求17所述的生物反应器，其中所述凹槽包括在内表面上的圆形边缘，所述内表面与所述缝相对。
19.根据权利要求15所述的生物反应器，其中所述筛网支架的包含凹槽的表面具有穿过其中的开口，以允许推动器定位所述筛网。
20.根据权利要求15所述的生物反应器，其中所述筛网支架的包含缝的表面具有穿过其中的开口，以允许推动器定位所述筛网。
21.根据权利要求15所述的生物反应器，其中所述筛网支架在其内侧或外侧或两者上具有圆角的矩形剖面形状。
生物反应器
技术领域
背景技术
[0003] 生物反应器用于扩增细胞群，例如干细胞或其他贴壁依赖性细胞。然而，仍然需要改进，例如关于易用性、自动化和程序的再现性。还需要培养以产生大量细胞(例如如果可能的话，数十亿细胞)。
发明内容
[0004] 在本发明的一个实施例中，可提供一种生物反应器，包括：用于容纳液体培养基的储存容器；管道，从管道容器的下端到管道的上端，从储存容器向上提供大致垂直方向的流动路径；位于管道内的培养结构，管道顶部位于比培养结构顶部高的位置；以及一种循环系统，用于使液体培养基向上流过管道通过或经过培养结构，其中管道的上端包括一个在其外侧被壕沟环绕的溢流壁，该壕沟的高度低于溢流壁的顶部，管道的上端和壕沟与口袋区域接触，口袋区域由连接到管道的结构界定，口袋区域与口袋区域外部流体连通隔离。其中当循环系统运行时，液体培养基在口袋区域内的溢流壁上流动，并且液体培养基与容纳在口袋区域中的气体接触，并且液体培养基溢出到壕沟中并且由循环系统从壕沟中移除。
[0005] 在本发明的一个实施例中，可提供一种生物反应器，包括：用于容纳液体培养基的储存容器；歧管组件，歧管组件包括上歧管和下歧管，下歧管具有延伸到储存容器中的下端；筛网支架，筛网支架保持多个适合作为用于细胞支架的筛网；以及循环系统，用于使液体培养基流过歧管组件并经过筛网支架，其中歧管组件和筛网支架提供通过下歧管和筛网支架以及上歧管的流动路径，其中筛网支架包含在歧管组件内，并且其中筛网包含在筛网支架内但具有至少一些能够在至少一个方向上相对于筛网支架移动的能力。
[0006] 在本发明的一个实施例中，可提供一种生物反应器，包括：用于容纳液体培养基的储存容器；歧管组件，歧管组件包括上歧管和下歧管，下歧管具有延伸到储存容器中的下端；筛网支架，筛网支架保持多个适合作为用于细胞支架的筛网；筛网支架可以包含在歧管组件内；用于使液体培养基流过歧管组件并经过筛网支架的循环系统，其中歧管组件和筛网支架提供经过下歧管和筛网支架以及上歧管的流动路径，其中筛网支架具有在其内表面上的凹槽，并且具有穿过其外表面的缝，并且其中凹槽和缝配置成使得筛网能够经过缝插入，并且由凹槽和缝中的至少一个支撑。
[0007] 在本发明的一个实施例中，可以提供一种筛网，其中至少一些筛网包括多个纤维，并且在单独的一个筛网内，纤维按顺序排列在至少第一、第二、第三和第四层中，每层内的纤维通常彼此平行，其中第一层中的纤维通常与第三层中的纤维平行，第二层中的纤维通常与第四层中的纤维平行，当垂直于筛网的平面观察时，第三层的纤维与第一层的纤维不对齐，第四层的纤维与第二层的纤维不对齐。
[0008] 在本发明的一个实施例中，可以提供具有转子的生物反应器，所述转子在细胞生长方案期间可以采取多于一个的角度取向。转子可以保持细胞生长的筛网。根据转子和筛网的方向，可以使液体培养基流过筛网或大致平行于筛网流动。
[0009] 在本发明的一个实施例中，可以提供具有储存容器的生物反应器，所述储存容器的底部具有有助于尽可能多地使用液体培养基的特征。这些特征可以包括在管道从储存容器向上抽吸流体的位置附近的贮槽，以及可以将液体培养基推向管道的旋转杆。附图说明
[0010] 进一步描述了本发明的实施例，但决不受以下说明的限制。
[0011] 图1A示出了本发明实施例的生物反应器的一些主要组件的总体布局。
[0012] 图1B以剖面示出了图1A的部件。
[0013] 图2A以剖面示出了组件，其包括下歧管和上歧管。
[0014] 图2B示出了与图2A相同的组件，其中上歧管突出显示。
[0015] 图2C示出了与图2A相同的组件，其中下歧管突出显示。
[0016] 图3A示出了没有筛网的筛网支架的三维视图。
[0017] 图3B是示出了图3A的筛网支架的分解的三维视图。
[0018] 图3C是示出其中具有筛网的筛网支架的三维视图。为了清楚说明，筛网支架的一部分与另一部分的颜色不同。
[0019] 图3D是示出图3C的筛网支架的三维视图，其中筛网支架的一部分缺失以便更好地显示筛网。
[0020] 图3E是示出图3D的筛网支架的三维视图，其中一些筛网缺失。
[0021] 图4A是筛网支架的封闭件的视图，示出了筛网支架中的缝的圆形入口。
[0022] 图4B是从不同视角看的筛网支架的封闭件的另一视图。
[0023] 图4C是封闭件的局部区域的视图。
[0024] 图5A示出了根据本发明的实施例制造的筛网。
[0025] 图5B示出了类似筛网的近视图。
[0026] 图5C示出了筛网的间隔参数，例如图5A和5B中的筛网。
[0027] 图5D更具体地示出了纤维在筛网内的放置以及它们的交错。
[0028] 图6A示出了可能的泄漏流动路径。
[0029] 图6B示出了在系统的典型操作期间存在液体培养基的位置。
[0030] 图7A示出了作为筛网支架的一部分的三面件，以便示出定位缝。
[0031] 图7B是示出图7A的三面件以及推动器附件的剖视图。
[0032] 图7C示出了推动器附件。
[0033] 图7D示出了用于使筛网支架与上歧管接合的凹部和凸台。
[0034] 图8示出了密封件的细节。
[0035] 图9示出了本发明实施例的两个生物反应器在培养箱内的放置。
[0036] 图10A示出了包括进出培养箱以及进出储存容器和歧管组件的各种气体和液体的流动路径。
[0037] 图10B示出了连接到储存容器的喷头。
[0038] 图11显示了本发明另一个实施例的生物反应器的总体布局。
[0039] 图12显示了生物反应器内的总体流体流动路径。
[0040] 图13示出了包括若干凹部的储存容器基底。
[0041] 图14示出了立管和附近的部件。
[0042] 图15示出了转子室和转子的分解图。
[0043] 图16A-16C示出了转子的各种视图。
[0044] 图17显示了与生物反应器中液体表面水平有关的细节。
[0045] 图18显示了立管内的填料结构。
[0046] 图19A示出了在第一液体流速下整个系统的计算流体动力学建模的结果。
[0047] 图19B示出了在第二液体流速下整个系统的计算流体动力学建模的结果。
[0048] 图19C示出了在第三液体流速下整个系统的计算流体动力学建模的结果。
[0049] 图20示出了在各个筛网附近的计算流体动力学建模的结果。
具体实施方式
[0050] 在细胞培养中的一个重要现象是在细胞和组织的生长和维持期间，营养物和废物的扩散距离限制。生物体内的组织自身组织在一起，使得细胞永远不会与血管或运输路径分开超过一定距离。细胞远离诸如血管的运输容器的最大距离约为几百微米。在生物反应器的设计中，一个重要的考虑因素是提供一种几何形状，其中细胞永远不会与液体培养基分开大于几百微米的距离。
[0051] 与被液体包围的分离细胞相关的另一现象是细胞通过液体的运动。液体培养基的物理性质(密度、粘度)通常类似于水的物理性质。在液体培养基中松散的细胞比围绕它们的液体培养基的密度稍微密集，这导致细胞在重力的影响下下落或下沉。如果一个细胞认为是一个在粘性液体中移动的球体，那么用斯托克斯定律描述这种情况。在这种情况下，沉降速率由下式给出
[0052] V＝(ρcell-ρfluid)*g*D^2/(18*μ)
[0054] 细胞培养中的另一个考虑因素是在培养箱中提供气态气氛。这导致溶解的气体进入细胞培养基，含有足够的分别为约20％和5％的所需浓度氧气和二氧化碳，并具有所需的相对湿度(例如约95％)。另一个考虑因素是提供所需的温度，例如近似正常的人体温度，例如37.0℃。
[0055] 细胞培养中的另一个考虑因素是由于液体可能流过附着于或正在附着于基底或细胞培养支架的细胞而产生的剪切应力。希望这种剪切应力不超过一定值，不使得细胞从培养基或支架中脱开。当细胞仍处于形成与基底或支架的附着的过程中时，认为在生物反应器中细胞接种的早期阶段，小剪切应力是特别重要的。对于间充质干细胞，认为希望将局部剪切应力保持在0.1Pa以下。
[0056] 在本文中，描述了本发明的第一实施例，其中将细胞静态接种到筛网形式的支架上，然后将筛网安装在生物反应器内，其中液体培养基大致垂直于筛网经过筛网而灌注。
[0057] 现在参考图1A和1B，示出了本发明实施例的生物反应器10。生物反应器10可包括适于容纳所需量的液体培养基的储存容器60。生物反应器10还可以包括对应于储存容器60的储存容器盖62。储存容器盖62可以通过卡扣或其他合适的紧固件或附件连接到储存容器60。储存容器盖62可具有穿过其中的开口64，开口64适于接收延伸经过开口64的、并适于在储存容器60中的液体培养基表面下方延伸的流动结构。如图所示，流动结构可包括装配在一起的各种部件，并且可以接收或包围筛网支架200。筛网支架200又可以保持筛网300，细胞在筛网300上驻留并生长。筛网阵列300可以称为培养结构。
[0058] 上歧管和下歧管
[0059] 更具体地参考图2A、2B和2C，流动结构可包括歧管组件，该歧管组件包括下歧管82和上歧管86。下歧管82和上歧管86可彼此配合在一起，并且组合起来可以围绕并包围筛网支架200。下歧管82可以向下充分延伸到储存容器60中，使得下歧管82的底端可以延伸到储存在储存容器60中的期望水平的液体培养基之下。
[0060] 下歧管82的内部可以相对于筛网支架200的外部大致紧密配合。下歧管82可以具有凸缘84。筛网支架200可以搁置在凸缘84上，但是筛网支架也可以能够在垂直方向上略微向上移动。
[0061] 上歧管86可以适合于与下歧管82配合在一起。上歧管86可以限定穿过其中的内部通道，该内部通道与下歧管82的内部流体连通，并且如果筛网支架200在下歧管82内，该内部通道与筛网支架200的内部流体连通。上歧管86可以具有与下歧管82的内部形状相似的内部。上歧管86的内部和筛网支架200的内部可以具有相似或相同的形状和尺寸，使得当流动经过下歧管82然后经过筛网支架200然后经过上歧管86时，剖面流动面积的变化和流动方向的变化很小或不存在。
[0062] 上歧管86可以在其与下歧管82接合的位置上方具有上端，该上端是堰或溢流壁112。堰112可以是大致水平的边缘，其限定经过上歧管86的通道的周边。当液体存在并且在上歧管86的上部中具有空气空间的系统中流动时，堰112可以在上歧管86和相关部件内限定液体液位。堰112的外部可以是壕沟116，壕沟116底部可以比堰112的顶部低。壕沟116可以适合于接收和容纳溢出堰112的液体。壕沟116可以进一步具有贮槽118，贮槽118可以是比壕沟116小并且比壕沟116的其他部分高度低的局部凹陷。还可以提供与贮槽118流体连通的出口通道，液体培养基可以经过该出口通道离开到其他流体回路部分。
[0063] 上歧管86可以以可滑动的方式与下歧管82接合，所述可滑动的方式由上歧管86的特征引导，相对于下歧管82的相应特征，所述上歧管86的特征是与之平行、形状相似、并且具有相似的尺寸，但允许足够的运动松动。如图所示，相对于下歧管82的特征，上歧管86的特征向外定位。上歧管86可具有与下歧管82的接触，该下歧管82限制上歧管86朝向下歧管82的运动，形成一个止动约束。或者，当上歧管86的适当表面(可以是平坦的)与筛网支架
200的上表面接触时，并且相应地筛网支架200的下表面与下歧管82的适当表面(可以是平坦的)接触时，可以停止上歧管86和下歧管82朝向彼此的运动。
200的上表面接触时，并且相应地筛网支架200的下表面与下歧管82的适当表面(可以是平坦的)接触时，可以停止上歧管86和下歧管82朝向彼此的运动。
[0064] 还可以提供覆盖上歧管86顶部的顶盖130。顶盖130可以至少近似为平板。如果需要，顶盖130可具有加强肋。顶盖130可以永久地连接到上歧管86，并且还可以在顶盖130和上歧管86之间提供密封件。如果需要，也可以提供连接顶盖130和上歧管86的某种形式的紧固件。
[0065] 如图所示，经过储存容器盖62的开口64可以具有围绕其的凸起的边缘或唇缘68，并且下歧管82可以在其外部具有围绕下歧管82的凸缘83。凸缘83可以搁置在凸起的边缘或唇缘68上，以限定下歧管82和储存容器盖62之间的空间关系。可以提供凸起的边缘或唇缘68，如果液体水的任何冷凝发生在储存容器盖62上，并且如果这样的冷凝物不是无菌的，则可以防止这种冷凝物滴入储存容器60中。这种冷凝物可以限制在储存容器盖62的顶部(外部)表面上。这种唇缘的各种设计是可能的。
[0066] 密封件和夹具
[0067] 下歧管82可具有下歧管密封凹槽92，其适于容纳可压缩密封件94，用于在下歧管82和上歧管86之间形成密封。该可压缩密封件94示出为在一个表面上具有可变形三角形指状物的矩形剖面形状。当然，其他剖面形状也是可能的。上歧管86和下歧管82之间的预加载可以通过夹持装置产生，夹持装置可以是偏心型夹持装置。示出了两个这样的夹持装置
97A、97B。当基于上歧管86和下歧管82相对于彼此的位置达到所描述的止动情况时，可压缩密封件94可以占据压缩构造。
97A、97B。当基于上歧管86和下歧管82相对于彼此的位置达到所描述的止动情况时，可压缩密封件94可以占据压缩构造。
[0068] 上歧管86可具有上歧管密封凹槽96，其适于保持可压缩密封构件98，以在上歧管86和顶盖130之间形成密封。该可压缩密封构件98示出为典型的O形环。顶盖130和上歧管86之间的预加载可以通过按扣(未示出)、夹具(未示出)或任何其他适当的设计特征来产生。
另一种可能性是顶盖130可以例如通过粘合剂永久地连接到上歧管86。
另一种可能性是顶盖130可以例如通过粘合剂永久地连接到上歧管86。
[0069] 筛网支架
[0070] 在本发明的一个实施例中，筛网300可以由筛网支架200保持。筛网支架200在图3A-3E和图4A-4C中示出。筛网支架200可以在所需的间隔位置和方向上保持所需数量的筛网。图3A-3E和图4A-4C中所示的筛网支架200保持15个筛网300。可能希望筛网的数量不大于大约15，以避免在生物反应器的操作期间产生液体培养基中的氧浓度梯度。
[0071] 通常，筛网支架200可以围绕中空的内部空间，并且可以是各种形状中的任何一种，例如圆形、矩形等。如图所示，筛网支架200具有(在其内部和外部都具有)圆角矩形的通用形状。图示的筛网支架200保持的筛网300是矩形的。为了便于描述，这里使用诸如正面和背面、侧面以及水平和垂直的方向指示来描述筛网支架200，其通常对应于它们在组装的生物反应器10中所示的取向或位置。然而应当理解，这些方向指定某种程度上是任意的。
[0072] 当筛网300在筛网支架200中就位时，在筛网300与其最近的相邻筛网之间的垂直方向上可能存在所需的空间量。在如图所示的生物反应器10中，液体培养基的流动通常可垂直于筛网300的平坦表面，流过筛网300中的开放空间。
[0073] 细胞培养区域可包含例如约15个这样的筛网300，所述筛网300彼此间隔足够的距离，使得筛网彼此不接触，并且如果需要，液体培养基的一些侧向流动是可能的。
[0074] 筛网支架200可以是中空的简单形状，其中一些形成完整的周边，其形状是诸如圆形或矩形(可能具有圆角)的形状。通常，筛网支架200可以制成单件，例如通过增材制造工艺。然而，更典型地，筛网支架200可以由两个部件制成，例如两个模制塑料件，它们彼此连接在一起。示出了筛网支架200由两个相互接合的部件制成。筛网支架200可包括三面件220和可与三面件220接合的封闭件240。三面件220可依次包括第一侧段222A、后段222B、与第一侧段222A相对的第二侧段222C。封闭件240可包括至少一个区段，可视为前段242B。如图所示，封闭件240可另外包括第一侧段242A和第二侧段242C。因此，依次地，存在第一侧段242A、前段242B和第二侧段242C。第一侧段242A可以与第一侧段222A接合，第二侧段242C可以与第二侧段222C接合。然而，封闭件240也可以仅包括前段242B。如图所示，前段242B和后段222B基本上彼此平行，并且第一侧段222A和第二侧段222C基本上彼此平行，并且第一侧段242A和第二侧段242C基本上彼此平行。然而，其他空间关系也是可能的。
[0075] 接合特征可以包括可变形凸片800，并且还可以包括第一侧段222A中的开口224A和第二侧段222C中的类似开口224C，开口224A和224C适当地设计成与凸片800接合。凸片800可以在如图所示的接合位置和释放位置之间弹性变形，在该释放位置，可变形凸片800向内弯曲到足以产生脱离。凸片800可以包括活动铰链，并且封闭件240中的其他地方的弹性还可以有助于尺寸或形状的改变，以允许或有助于实现脱离。
[0076] 筛网支架200可以具有上边缘和下边缘，其可以是平坦的，并且可以彼此平行。
[0077] 筛网支架中的缝和凹槽，以及缝和凹槽附近的圆形边缘
[0078] 筛网支架200可包括限定筛网300的位置的各种凹槽和缝，并为筛网300提供机械支撑。如图所示，筛网支架200能够保持筛网300中的15个，但当然其他数量的筛网300也是可能的。筛网300之间的间隔距离可以从诸如筛网300之间的流体流动模式和生物反应器10的细胞培养区域中的细胞的所需总填充密度的考虑因素的组合中选择。
[0079] 如果筛网支架200制成单件(类似于图示的但是三面件220和封闭件240连接在一起)，则可以将筛网200插入筛网支架200或从筛网支架200移除筛网200。这可以从侧面方向完成。
[0080] 在如所描述和图示的筛网支架200中，当三面件220和封闭件240已经彼此组装时，可以将筛网300插入到筛网支架200中或从筛网支架200移除筛网300，而无需彼此拆卸这些部件。这可以从侧面方向完成。如图所示，第一侧段222A具有凹槽170，第二侧段222C具有凹槽170。后段222B具有凹槽170。前段242B具有缝，筛网300可以经过该缝而不需要拆卸筛网支架200。凹槽170可以彼此基本上共面，并且在垂直方向上可以具有彼此相似或相同的尺寸。缝180可以与凹槽170中的至少一些平行或共面。缝180的垂直尺寸和高度可以与凹槽170的垂直尺寸和高度相同，但是如果垂直尺寸和高度简单地彼此大致相同就足够了。这些各种特征可以组合和相互作用，使得当组装筛网支架200时，筛网300可以通过缝180滑入到位并由凹槽170以及缝180支撑。筛网300之间的期望间隔或间隔由靠近凹槽170的筛网支架
200的材料保持，并且由保持在缝180之间的筛网支架200的材料(联结部)保持。
200的材料保持，并且由保持在缝180之间的筛网支架200的材料(联结部)保持。
[0081] 如图所示，封闭件240具有三个侧面，其中两个侧面242A、242C是短的。筛网支架200的一个侧壁包括第一侧段222A和第一侧段242A，并且类似地，另一个侧壁包括第二侧段
222C和第二侧段242C。如图所示，甚至凸片800包含与相应的相邻侧段的凹槽170连续的凹槽。然而，可以理解，各种其他设计也是可能的。
222C和第二侧段242C。如图所示，甚至凸片800包含与相应的相邻侧段的凹槽170连续的凹槽。然而，可以理解，各种其他设计也是可能的。
[0082] 如图所示，第一侧段222A和第一侧段242A中的凹槽170基本上是锋利的边缘。对于第二侧段222C和第二侧段242C中的凹槽170也是如此。然而，可以理解，其他几何形状也是可能的。
[0083] 在筛网支架200的前部，其余材料的分隔件或联结部可以使得在筛网支架200的大致外部具有圆形边缘。这可以有助于在初始期间将筛网300引导到缝180中。将筛网300插入缝180中。圆形边缘可以是半圆柱形的。如果发生任何筛网300不是完全平面，例如在平面外略微翘曲，则这种圆形边缘也可以有助于将筛网300引导到缝180中。
[0084] 在筛网支架200的后部，各个筛网300之间的分隔件可以使得圆形边缘面朝向筛网支架200的内部。当筛网300插入筛网支架200中，例如在插入过程快结束时，这有助于将筛网300引导到所需的位置。圆形边缘可以是半圆柱形的。圆形边缘可以是半圆柱形的。如果发生任何筛网300不是完全平面的，例如在平面外稍微弯曲，则这种圆形边缘也可以有助于将筛网300引导到凹槽170中。
[0085] 筛网支架200的前部处的分隔件可以限定筛网300可以穿过的缝。筛网支架200的后部处的分隔件可以限定筛网300可以进入的凹槽，但是筛网300不可能穿过该凹槽。
[0086] 在缝180的圆形边缘和凹槽170的圆形边缘的情况下，半圆柱形曲率仅是各种可能的曲率中的一种。具有一些其他所需半径的圆角也是可能的。这种半径可以小于或大于半圆柱的半径。其他形状的曲线也是可能的。沿着缝180或凹槽170的长度的曲率变化也是可能的。
[0087] 筛网设计
[0088] 在本发明的实施例中，并且现在参见图5A-5D，生物反应器10可以在培养区域内具有筛网300的阵列，其用作细胞(例如贴壁依赖性细胞)于其上生长的组织支架。各个筛网300本身可包括多层纤维400，纤维400具有垂直于相邻层中纤维取向的取向。在本发明的特定实施例中，单个筛网300中的这种纤维400的层数可以是例如四层或五层或六层。
[0089] 这种筛网300的典型尺寸参数可以是150微米的纤维直径和200微米的纤维间距(如图5C中所定义)，该尺寸指的是从一根纤维的边缘到同一平面内最近纤维的最近边缘的距离。一层中的纤维400可以相对于与它们平行的纤维400交错并且位于筛网300的不同层中，或者可选地，不必是交错的。纤维400可以彼此间隔开适当的距离，使得在初始细胞接种期间，细胞沉积在纤维400上并且不接触相邻纤维400上的细胞。然而，纤维400的间隔可以是，使得在一定数量的细胞增殖后，在附近的纤维400上生长的细胞可以彼此接触或生长抵靠(称为汇合的情况)。
[0090] 更具体地，纤维400可以存在于两个相互垂直的方向上，并且可以在这两个相互垂直的方向上交错。这在图5D中进一步说明。每个筛网可包括形成第一层的多个纤维，所述第一层具有沿第一方向取向的平行纤维，并且可包括具有沿垂直于第一方向的第二方向取向的多个平行纤维的第二层，第二层中的纤维层与第一层中的纤维连接。至少一些筛网包括多个纤维，并且在单独的一个筛网内，纤维依次排列在至少第一、第二、第三和第四层中，每层中的纤维通常平行于彼此，其中第一层中的纤维通常平行于第三层中的纤维，第二层中的纤维通常平行于第四层中的纤维，并且其中当垂直于筛网的平坦表面观察时，第三层纤维与第一层的纤维不对齐，第四层的纤维与第二层的纤维不对齐。更具体地，对于该观察方向，纤维可以位于未对齐的平行纤维之间的中间。这样的构造可以帮助防止细胞经过筛网下落，特别是在初始播种期间，同时仍然为液体培养基提供占据和流过的空间，并且当细胞增殖时为细胞提供生长空间。
[0091] 筛网300可具有特定数量的层，例如四层，其中在四层构建体的两个表面处可获得用于接触细胞的培养基，以及也可在层之间存在的开口中获得培养基。据信，这种情况的所有特征更类似于天然组织中发生的特征(称为三维环境)。相信本发明实施例的三维环境比二维环境更有利于细胞增殖和扩增。但是，不希望受限于此解释。
[0092] 可以通过加热的聚合物长丝的程序化沉积来形成筛网300，类似于共同拥有的美国专利8,463,418中所描述的。聚合物可以是合适的生物相容性聚合物，例如聚苯乙烯。所描述的筛网300是无纺的。或者，如果需要，可以纺织筛网300。筛网300的整体形状可以是平坦的和矩形的。
[0093] 在一些现有技术的细胞培养技术如培养皿中，细胞层在平坦表面上生长并且经历基本上二维的环境。即使在这种情况下有足够的营养供应和废物去除，这种二维环境本质上不同于细胞自然生长的环境(三维环境)。
[0094] 在本发明的实施例中，细胞通过附着到筛网的各个纤维上而接种。筛网的纤维-纤维尺寸可以足够大，使得当分离的细胞初始附着到纤维时，至少一些细胞大致不接触其他细胞。在细胞繁殖之后，并且可能产生了几层细胞，其中初始只有一层细胞附着到纤维上，最外层的细胞可能仍然独立于下一个纤维，或者一些新细胞可能是可以接触附着于其他纤维的其他细胞，即可能发生一些纤维桥接(称为汇合)。在本发明的实施例中，筛网可以具有特定数量的纤维层，例如四层。在四层构建体的两个表面上都有可用于接触细胞的培养基。无论如何，据信这种情况的所有特征更类似于天然组织中发生的特征(三维环境)。相信本发明实施例的三维环境比二维环境更有利于细胞增殖和扩增。但是，不希望受限于此解释。
[0095] 细胞培养区域可包含例如约10至15个这样的支架，所述支架彼此间隔足够的距离，使得筛网不会彼此接触并且液体可在支架之间流动。
[0096] 就生物参数而言，与本发明的实施例一起使用的筛网可具有约7000平方毫米的面积(长度尺寸*宽度尺寸)，并且暴露于灌注物的筛网的部分(不包括在凹槽或缝中的边缘)可具有约6300平方毫米的面积。该筛网可以由四层纤维形成，这些层在如本文其他地方所述的方向上交替。在这样的筛网上，可以沉积约800,000个细胞的初始接种，因此如果使用12个筛网，则接种细胞的群体是960万个细胞。在培养结束时，该细胞群已扩大至约2.5亿个细胞。对于动态培养，基于筛网中的空置空间的液体培养基的流动速率可以是大约2cm/min。据信，基于液体经过筛网的空置空间，1.6mm/sec的流速将在筛网中的纤维边缘产生
0.1Pa的最大剪切应力，并且据信，对于间充质干细胞，剪切应力应保持低于该值。
0.1Pa的最大剪切应力，并且据信，对于间充质干细胞，剪切应力应保持低于该值。
[0097] 影响流动的尺寸考虑因素
[0098] 在本发明的实施例中，液体培养基的大致流动方向可垂直于并穿过筛网300，如图所示方向是垂直向上的。
[0099] 在本发明的实施例中，细胞通过附着到筛网300的单个纤维400上而接种。筛网300的纤维-纤维尺寸可以足够大，使得当分离的细胞初始附着到纤维400时，它们大致不碰其他细胞。在细胞增殖之后，并且可能产生了附着到纤维400的几层细胞，其中最初只有一层细胞附着到纤维400上，最外面的细胞可能仍然与附着于最近邻纤维400的细胞不接触，或者一些新细胞可能接触附着于其他纤维400的其他细胞，即可能发生纤维之间的一些桥接(汇合)。即使没有发生汇合，在其他的细胞生长之后，液体培养基的通道经过筛网的开放空间小于培养开始时的开放空间。
[0100] 在本发明的实施例中，筛网300可以略微松弛地装配在筛网支架200的凹槽170或缝180内。这使得筛网300可以容易地插入凹槽170和缝180中或从凹槽170和缝180中移除。例如，筛网300的总高度可以是600微米，而凹槽170或缝180的垂直尺寸可以是1毫米。这在筛网300与凹槽170或缝180之间在垂直方向上留下间隙。在水平方向上，在左右方向上，筛网300的尺寸可以略小于由筛网支架200的一侧上的凹槽170的基部限定到筛网支架200的另一侧上的凹槽170的基部的水平尺寸。在水平方向上，在前后方向上，筛网300的位置可以通过两个限制结构来确定，在这两个限制结构之间，筛网300可以适度地具有轻微的松弛度。这些结构中的一个可以是下歧管82的内壁。另一个结构可以是凸台216的面向内的末端。在前后方向上，筛网可以略微小于(至少在凸台216位置处)凸台216与下歧管82的相对的内表面之间的距离。或者，筛网支架200的一些特征也可能涉及确定筛网300的位置。
[0101] 在流过筛网期间，以下力可作用在水平取向的筛网上：当浸没在液体培养基中时单个筛网的重量；以及由液体培养基流动引起的阻力(可以近似为筛网支架上的压力差除以筛网数)。该力平衡将确定筛网是否位于凹槽的下边缘，或者是向上推动并钉在凹槽的上边缘上，还是在其他两个位置之间稍微不稳定地浮动。这些量中的至少一个，即压降，可以在培养过程中变化，因为筛网变得更加拥挤细胞。
[0102] 同时，期望大部分液体培养基流经过筛网300中的开口。
[0103] 在所描述的筛网300的叠层中并且在所描述的筛网支架200内，存在液体培养基的各种可能的局部流动路径。在筛网300的大部分中，在纤维400之间存在开放空间，液体培养基可以经过该开放空间流动。在将细胞接种到筛网300上之前，纤维400之间的特定开口的最小流动面积的尺寸可以近似为纤维间间隔距离乘以纤维间间隔距离。而且，在接种细胞之前，当筛网安装到筛网支架200中时，在筛网300的边缘处存在可能的流动路径。这种流动路径在图6A中示出。这种流动路径中的流动可能受到局部尺寸的影响，例如纤维间间隔距离、以及筛网300和筛网支架200之间的水平方向上的间隙、以及筛网300和筛网支架200之间的垂直方向上的间隙。然而，为了简化讨论，可以假设对于纤维400之间的一个空间，泄漏流动的面积是纤维间间隔距离乘以纤维间间隔距离。
[0104] 将所需流速与泄漏流速进行比较可能是有意义的，其形式为这两个量的比率。如果为简单起见假设筛网外部尺寸为边长为L的正方形，则沿周边的细胞数量将为4*L/delta，其中delta是纤维间间隔距离。然后，所有这些泄漏路径的总流动面积将是(4*L/delta)*delta^2，或4*L*delta。在相同的情况下，对于期望的流量，通过筛网的总流量面积是L^2*delta^2。期望流动面积与泄漏流动面积的比率是L^2*delta^2/(4*L*delta)、或L/(4*delta)、或0.25*(L/delta)。为了使大部分流动通过筛网300中的开口而不是通过泄漏路径的理想目标，这激励了在假定方形形状的侧面的长度内具有许多细胞的筛网300。例如，该系统可以设计成使得包括所述筛网中的单个筛网和所述筛网支架之间的间隙的泄漏路径，具有小于经过所述单个筛网的所有通道的总流动面积的10％或2％的剖面流动面积。
[0105] 进一步的细节是假设随着时间的推移和细胞群增加，筛网300的主要部分中的开放空间变小。可以假设它们具有可称为delta拥挤度(deltacrowded)的值。然后有必要对筛网300边缘处的开放空间做出假设。可以假设边缘处的开放空间不改变它们的尺寸，并且它们的尺寸保持在可称为delta边缘(deltaedge)的尺寸。然后，上述流动面积比率变为L^2*deltacrowded^2/(4*L*deltaedge)，或0.25*L*deltacrowded^2/deltaedge。这当然受制于特别关于边缘处的开放尺寸(即deltaedge)的假设，但是通常随着deltacrowded变小，所需灌注流动的流动面积除以泄漏流动的流动面积的比率可以变得小于用于空置筛网300的比率。
[0106] 影响生物反应器设计的另一个考虑因素可以是筛网300抗弯曲的刚度。当筛网300在生物反应器中并由筛网支架200支撑时，它们受到重力(根据液体培养基是否存在而具有或不具有浮力效应)，并且如果液体培养基正在移动，它们也受到流动力的作用。任何这样的力都可能使筛网300在平面外变形。理想的是，筛网300不会变形太多以至于它们彼此接触或从筛网支架200上松开。筛网300的刚度可以通过其在简单弯曲几何形状中的弯曲变形来表征，其中两个相对的边缘作为简单的支撑件而受支撑，其他两个边缘不受支撑。对于所述筛网，其沿弯曲方向的尺寸为约100mm，横向尺寸为约60mm，在跨度中心施加的14.5克的重量导致3.1mm的偏转。筛网可以设计成至少与刚刚描述的弯曲刚度一样弯曲。当筛网在四个边缘而不是刚刚描述的两个边缘处受支撑时，它将比刚刚描述的测量中的偏转更小。
[0107] 启动程序
[0108] 在本发明的一个实施例中，启动程序可以如这里所述。在系统开始使用时，储存容器60可以包含多达所需液位的液体培养基。液位可以高于下歧管82的底部的高度，并且所包含的液体量可以足以用于所需的操作。然后可以操作泵140以便从壕沟116抽出流体。泵140可以是正排量泵，例如蠕动泵，能够移动液体或气体或其组合。最初，泵将从包括上歧管
86的区域移除空气。这种空气的移除将导致液体培养基的水平在下歧管82中升高，进入筛网支架300，然后进入上歧管86。最终液位将达到堰水平，然后液体将流过堰112，进壕沟
116。液体将随后流入贮槽118。泵140从贮槽118中抽出流体。在启动期间的某些时刻，泵140可能会抽出来自贮槽118的液体和气体混合物，但这是正常的。最终将达到稳定状态，其中在上歧管86和壕沟116上方的区域中保留基本恒定体积的气体。只要泵140继续运行，将存在液体流量，从堰(溢流壁)112上进入壕沟116和贮槽118中并朝向泵140。据信，壕沟116中液体水平将相当接近壕沟116的底部。这在图6B中示出。液体在图6B中用虚线阴影图案表示。
86的区域移除空气。这种空气的移除将导致液体培养基的水平在下歧管82中升高，进入筛网支架300，然后进入上歧管86。最终液位将达到堰水平，然后液体将流过堰112，进壕沟
116。液体将随后流入贮槽118。泵140从贮槽118中抽出流体。在启动期间的某些时刻，泵140可能会抽出来自贮槽118的液体和气体混合物，但这是正常的。最终将达到稳定状态，其中在上歧管86和壕沟116上方的区域中保留基本恒定体积的气体。只要泵140继续运行，将存在液体流量，从堰(溢流壁)112上进入壕沟116和贮槽118中并朝向泵140。据信，壕沟116中液体水平将相当接近壕沟116的底部。这在图6B中示出。液体在图6B中用虚线阴影图案表示。
[0109] 推动器附件和筛网定位缝
[0110] 现在参照图7，在本发明的实施例中，如本文所述，筛网支架200可包括定位缝390，其可用于将筛网300推入所需位置或用于限定筛网300的位置。这种定位缝390可以相对于筛网支架200和生物反应器10的整体方向大致垂直。定位缝390可以与设置在筛网支架200中的其他缝和凹槽相交。
[0111] 推动器400也可以作为附件提供(用于在实际培养之前或之后使用)。推动器400可以用在筛网支架200的一侧上，以便将筛网300推入筛网支架200，直到它们接触诸如凹槽170的基底之类的止动件。推动器400也可以在筛网支架200的相对侧上使用，以便将筛网
300推出筛网支架200，例如当完成培养或者希望移除筛网300时。筛网支架200的一侧上的定位缝390可具有与筛网支架200的另一侧上的定位缝390相同或相似的尺寸和间隔，这将使单个推动器400能够用于在两个方向上推动。
300推出筛网支架200，例如当完成培养或者希望移除筛网300时。筛网支架200的一侧上的定位缝390可具有与筛网支架200的另一侧上的定位缝390相同或相似的尺寸和间隔，这将使单个推动器400能够用于在两个方向上推动。
[0112] 为了便于所描述的推动，推动器400可以具有与筛网支架200的适当特征的某些尺寸关系。推动器400上的凸台420可以尺寸化，并且可以相对于彼此适当地间隔开，使得它们可以配合到筛网支架200的定位缝390中。推动器400上的凸台420的高度可以足够大，使得筛网300可以推动到所需的程度。
[0113] 影响筛网支架和下歧管之间接合的特征
[0114] 还可能的是，可以提供约束或引导筛网支架200和下歧管82之间的相互接合的相互接合特征。这些特征可以称为键和键槽。如图所示，筛网支架200具有凹部210，并且下歧管82具有凸台216。当然，也可以是相反的，即筛网支架200上有凸台和下歧管82上有凹部。如果筛网支架200具有一定程度的对称性，例如具有矩形剖面形状，键和键槽可以限制筛网支架200和下歧管82可以组装在一起的方式的数量。当筛网支架200与生物反应器10的其余部分组装在一起时，这种布置可用于控制筛网300的定位。
[0115] 关于将筛网支架200插入下歧管82存在一些尺寸考虑。例如，凸台216的宽度(在水平方向上)可以小于凹部210的宽度。
[0116] 如果需要，在筛网支架200插入下部歧管82时，凸台216或凹部210的部分或两者最初彼此接合，可在其一端(在下歧管82特征的顶部或筛网支架200特征的底部或两者)处设置有圆形特征，以引导筛网支架200和下歧管82之间的初始接合。也可以是圆形特征，其设置在筛网支架200的底部的其他位置处、或者设置在下歧管82的顶部、或两者，以便引导筛网支架200和下歧管82之间的初始接合。
[0117] 培养箱
[0118] 现在参考图9，生物反应器10可包括培养箱950。培养箱950可在其自身内维持有助于细胞生长的条件。培养箱950可以保持接近生理温度的所需值的温度。培养箱950还可以保持具有所需组分的气氛。该组分可具有约20％的氧浓度和约5％的二氧化碳浓度。培养箱950还可以保持培养箱950内的大气的所需相对湿度。培养箱950可以具有前门，该前门提供进入培养箱950内部的入口，用于安装或移除主要部件。培养箱950还可以具有经过其各种壁的穿透或通过。这里针对特定设计描述了这种通过和穿透，但是可以理解，其他这样的布置也是可能的。
[0119] 在培养箱外部的位置处可以存在用于循环或控制液体培养基流动的泵140。泵140可以是正排量泵，例如蠕动泵。可以存在适当的通过或穿透以使这些液体进出培养箱950并进出泵140。将泵140定位在培养箱外部可以用于某些特定目的。一个这样的目的是泵140中的电子器件可能对它们可以暴露的湿度具有限制，其可能低于通常保持在培养箱950内部的相对潮湿的条件。将泵140定位在培养箱外部950消除了这种担忧。另外，如果泵140位于培养箱950内部，则其在运行时可能产生热量，并且该热量可能影响培养箱950内的温度控制。可以为培养箱950提供适当的控制，并且如果需要，还可以提供泵和相关系统的自动化。
[0120] 刚刚描述的部件可以适合放置在可以称为培养箱950的受控环境室内。培养箱950可以具有控制以在其内部保持所需的温度、所需的气氛组分、所需的氧浓度、所望的二氧化碳浓度、所需的湿度、任何其他环境特性的所需值、或这些的任何组合。培养箱950可以具有允许这些组件通过的门，并且门可以是可关闭和可密封的。培养箱950还可以具有穿过培养箱壁或边界的通道，其可以与门分开。这种通道可以允许液体进出培养箱950的内部。培养箱950可以进一步具有连接，经过该连接可以将氧气或二氧化碳供应到培养箱950的内部。用于循环液体培养基的泵140可以位于培养箱950外部。培养箱可以适合于在所述部件(例如歧管82、86的组件和储存容器60)处和附近保持无菌或至少清洁。
[0121] 出口接头可以连接到溢流壕沟116。出口接头可以离开壕沟，使得在接头的内部开放空间的一部分处于或低于壕沟116的基底水平。从出口接头，可以有管道或类似的流体携带装置前往泵140的入口。管道可能能够将来自壕沟116的流体(液体或气体)导入泵。泵140显示为位于培养箱1950外部。该泵位置是可选的，尽管其优点在本文其他地方讨论。
[0122] 在泵140的下游，流动可以返回到培养箱950和喷头186中。喷头186可以位于储存容器60顶部的培养箱950内。喷头186可以以液滴形式分配液体培养基，液滴落入储存容器60中。培养箱950内的气氛可具有所需的氧浓度和所需的二氧化碳浓度，并且还可以是温度控制的。在液体培养基从喷头186经过储存容器60内的气氛的过程中，液滴可以与储存容器
60内的气氛交换气体，例如从储存容器60内的气氛吸收二氧化碳。如果需要，液滴也可以与储存容器60内的气氛热平衡。然后液滴可以收集在储存容器60的液体区域中。
60内的气氛交换气体，例如从储存容器60内的气氛吸收二氧化碳。如果需要，液滴也可以与储存容器60内的气氛热平衡。然后液滴可以收集在储存容器60的液体区域中。
[0123] 然后可以重复流过整个所述流动路径的流体。
[0124] 现在参考图10，其示出了通过培养箱950和储存容器60的边界的各种连接。生物反应器10可包括用于泵140的连接，以抽出液体培养基并重新引入液体培养基。这提供了液体培养基的动态循环或灌注。如果泵140位于培养箱950的外部，则液体培养基可从生物反应器10中排出，经过培养箱950的边界，经过泵140，再次经过培养箱950的边界，并重新进入生物反应器10。更具体地，液体培养基可以从连接到壕沟116的贮槽118中排出，并且可以经过喷头186重新进入储存容器60。可以以几种方式管理培养箱950和贮存容器60内的气氛。可以从培养箱950外部的来源供应CO2，并且如图所示，CO2穿过作为培养箱950的永久部分的通道，显示为在培养箱950的后部。空气可以经过在培养箱950的左侧示出的通道，从培养箱950的外部进入培养箱950的内部。该进入的空气可以经过过滤器960，过滤器960可以位于培养箱950的外部。因此，培养箱950内的气氛可以是空气和二氧化碳混合物。储存容器60的气体空间可以具有空气提取连接，通过该空气提取连接，来自储存容器60的气体空间的气体被从储存容器60中拉出，经过穿过培养箱950的边界的通道，并且输出到气流泵150。气流泵150可以是蠕动泵，其可以位于培养箱950外部。来自培养箱950内的气氛的气体经过端口
940上的过滤器(未示出)进入储存容器60。在储存容器60内，喷头186夹带一些那种气体，喷头186引起通气并使液体培养基暴露于CO2和氧气。细胞从液体培养基中获得CO2和氧气用于其代谢和ATP循环以进行能量转移。如图所示的喷头186具有不均匀的孔尺寸分布，以便形成具有所需特性和分布的喷雾。液体从靠近孔阵列中心的喷头186上方进入。更向外定位的孔的尺寸大于液体进入处附近的孔的尺寸。
940上的过滤器(未示出)进入储存容器60。在储存容器60内，喷头186夹带一些那种气体，喷头186引起通气并使液体培养基暴露于CO2和氧气。细胞从液体培养基中获得CO2和氧气用于其代谢和ATP循环以进行能量转移。如图所示的喷头186具有不均匀的孔尺寸分布，以便形成具有所需特性和分布的喷雾。液体从靠近孔阵列中心的喷头186上方进入。更向外定位的孔的尺寸大于液体进入处附近的孔的尺寸。
[0125] 如图所示，经过培养箱950的左壁的两个通道用于液体培养基进出培养箱。还有一个通道经过培养箱的壁，可以是蠕动泵的气流泵经过该通道，将气氛从储存容器60的气体空间中拉出。还有一个通道，来自培养箱950外部的空气经过该通道进入培养箱内部，经过过滤器960。
[0126] 包括转子和两种不同的流动方向的实施例
[0127] 通常，在生物反应器中存在至少两种可能的平面支架几何形状和流动。前述实施例涉及大致垂直于筛网平面的经过筛网的流动。另一种可能的几何形状涉及液体在大致平行于筛网的方向上的流动。每个方向各有利弊。
[0128] 在本发明的该下一个实施例中，生物反应器1010可具有如图11中所示的整体部件和布置。
[0130] 流动路径
[0131] 现在参考图12，对于本发明的实施例，示出了用于生物反应器1010的流体流动布置。如图所示，经过细胞培养支架的液体流动方向可以相对于重力，在大致向上的方向上。流动可以在循环流动路径中流动。在本发明的一个实施例中，液体培养基能够在来自储存容器的循环路径中流动，向上流过支架、流过泵、流过喷头、并返回到储存容器。
[0132] 泵1140能够通过最初通过泵泵送气体来自吸，以便将液体从下部储存容器向上吸入细胞培养区域。此后，泵1140可以在需要时移动液体，并且无论何种速率都希望使液体循环经过培养区域。泵1140可以是正排量泵，例如蠕动泵。
[0133] 该设备可包括储存容器1060，其通常可位于低于设备的各种其他部件的高度的高度处。储存容器1060的底部可以至少部分地由储存容器基底1400形成，储存容器基底1400通常是平坦的并且水平的，具有储存容器基底上表面1410。储存容器1060还可以由储存容器侧壁和储存容器盖限定。此外，储存容器基底1400可具有凹陷在储存容器基底上表面1410下方的一些特征。
[0134] 储存容器1060可以在其中具有搅拌器，例如磁力搅拌棒(未示出)，其可以通过旋转外部施加的磁场旋转。搅拌棒可以比液体的密度更致密，使得搅拌棒可以由于重力而下沉并且停留在储存容器基底的表面上，更具体地是搅拌器凹部1420的底表面。其它搅拌器布置也是可能的，例如旋转杆和桨。
[0135] 搅拌棒可以以适当的旋转速率旋转，以使细胞悬浮在液体中，使得吸入支架的液体含有适当的细胞。
[0136] 储存容器基底
[0137] 储存容器1060可以部分地由储存容器基底1400限定。参见图13，储存容器基底400可以是大致平坦的和水平的，但可以具有凹入其中的凹部图案。
[0138] 对应于搅拌棒，可以存在凹入储存容器基底1400中的搅拌器凹部1420。搅拌器凹部1420在其水平尺寸上可以大于由搅拌器棒扫出的路径。搅拌器凹部1420中的至少一些可以是大致圆柱形的并且可以具有平坦且水平的底部。如果需要，搅拌器凹部1420的深度可以小于搅拌棒的垂直尺寸。
[0139] 可以进一步提供通道凹部1430，其可以在长度方向上大致笔直。还可以设置储存容器凹部1440。通道凹部1430可以与搅拌器凹部1420相交，并且可以与储存容器贮槽凹部1440相交。
[0140] 所有这些凹部(搅拌器凹部1420、通道凹部1430、储存容器贮槽凹部1440)的底板可以是平面的并且可以彼此共面并且可以是大致水平的。各个凹部(搅拌器凹部1420、通道凹部1430、储存容器凹槽凹部1440)彼此相交的位置可设置有圆角以改善流体流动的平滑性。在与凹部相关联的各个位置处，还可以设置圆形的内角。
[0141] 还可以提供排水凹部1450，排水凹部1450可以与通道凹部1430流体连通，并且可以延伸到比通道凹部1430更低的高度。通过从上方将管放入排水凹部中并抽出流体，可以从储存容器1060移除流体。
[0142] 现在参照图14-16C，还可以提供立管导管500，其可以限定沿向上方向离开储存容器1060的流动路径。立管导管1500示出为具有矩形剖面，但是可以理解，其他剖面形状也是可能的。立管导管1500可以具有平坦且水平的立管导管下边缘1510。首先，立管导管1500可以定位成使得立管导管下边缘1510处于比储存容器1060中的液位高度低的高度。更具体地，立管导管1500可以定位成使得立管导管下边缘1510位于高于储存容器贮槽凹部1440的底板的高度处，但是低于储存容器基底1400的上表面1410。还可以提供储存容器贮槽凹部1440，其具有大于立管导管1500并在立管导管1500周边之外的边界。这种尺寸关系的组合可以提供流入模式，用于从储存容器1060到立管导管的流动，该流入模式大致围绕立管导管1500的整个周边分布。这种流动模式保持对储存容器1060中的大部分液体的接入，同时在流体流动中不产生具有过高局部流体速率或局部剪切速率的“夹点”。
[0143] 沿着立管导管1500的大致方向向上继续，可以存在通常包含在转子室1600内的转子室1600和转子1700。关于转子1700的更多细节在本文其他地方提供。
[0144] 转子室1600可以具有由下通道开口1610和上通道开口1620限定的垂直通道。下通道开口1610和上通道开口1620可以具有基本相同的内部剖面面积和尺寸。下通道开口1610和上通道开口1620的内部剖面面积和尺寸可以至少近似地与立管导管1500的内部和经过转子1700的通道(在本文其他地方描述)的内部横截面积和尺寸匹配。
[0145] 转子室1600可搁置在或可安装在储存容器1060的盖板上。
[0146] 在转子室1600的顶部附近，接触液体的转子室壁可以在平坦和水平的顶部边缘1630处终止。顶部边缘1630可以充当用于液体在其上流动的堰。壁的外部可以是溢流壕沟
1640。溢流壕沟1640和附近特征的设计可以使得转子室1640中的流体必须向上流动，然后流过转子室壁的顶部边缘1630上方，然后向下流入壕沟1640。壕沟1640可以围绕转子室
1600的整个周边延伸。在系统操作期间，气袋可以存在于顶部边缘1630上方。
1640。溢流壕沟1640和附近特征的设计可以使得转子室1640中的流体必须向上流动，然后流过转子室壁的顶部边缘1630上方，然后向下流入壕沟1640。壕沟1640可以围绕转子室
1600的整个周边延伸。在系统操作期间，气袋可以存在于顶部边缘1630上方。
[0147] 转子室1600可以由转子室盖1660顶起，转子室盖1660可以是可拆卸的。在顶部边缘1630和转子室盖子660之间可能存在间隙。间隙可以适合于流动经过间隙，并且因此流动可以进入溢流壕沟1640并被收集。据信，尽管不希望受限于这种解释，使用溢流壕沟1640可有助于改善经过细胞培养区和组织支架的流动的均匀性。如本文的另一个实施例，可以存在溢流壕沟1640，以及相应的贮槽和喷头。
[0148] 转子和细胞培养支架
[0149] 在转子室1600内，可以提供转子1700。转子1700可以能够相对于转子室1600围绕旋转轴线旋转。旋转轴线可以是水平的，并且可以大致垂直于立管导管1500的方向。转子1700可以紧密配合在转子室600内，同时仍然可以自由旋转。
[0150] 转子1700的一端可具有或可附接有轴以引导转子1700的角位置。轴又可由马达操作。马达可以位于培养箱1950内部，或者可以位于培养箱1950外部，轴穿透经过培养箱1950的壁。马达可以由计算机或自动化系统控制。
[0151] 转子1700可以能够通过各种旋转位置旋转。转子的一个位置可以对应于用于流过转子内部和组织支架的全开流动路径。转子1700的另一个位置可以使得流动路径被转子1700的大致实心部分阻挡。
[0152] 继续参考图14-16C，示出了转子1700和一些相关部件。除了不存在如本文所述的材料之外，转子1700可以是大致圆柱形的。转子可以具有两个相对的转子开口1710、1712，其限定经过转子1700的通道，并且转子可以具有两个其他的相对侧面1714、1716，它们大部分是实心的。围绕转子1700的周边前进，可以有开放空间；其外部可以是圆柱形的大致实心的部分；开放空间；和另一个其外部可以是圆柱形的大致实心的部分。在外部，大致圆柱形形状可以对应于转子室1600内的内部圆柱形空间。当转子1700在适当的角度位置时，大部分实心侧面的尺寸可以完全阻挡立管导管1500(孔1790除外)。转子端部可以具有面向内部的凹槽1720。转子1700中的凹槽1720可以适当地尺寸化，以接收和支撑支架或筛网的边缘。
[0153] 转子开口1710中的一个可具有跨越转子开口的桥1740。转子开口1712中的另一个可具有跨越转子开口的可移除夹子1760。桥1740和夹子1760可以尺寸化，使得它们仅占据转子1700的总长度的一小部分，从而不会对液体流动产生实质性的干扰。桥1740和夹子1760可以具有对应于转子1700的端部处的内部凹槽1720的内部凹槽。组合地，转子1700的一端处的凹槽、转子1700的另一端处的凹槽、桥1740中的凹槽和夹子1760中的凹槽可以全部彼此对齐，并且可以彼此配合以支撑筛网。
[0154] 在转子1700的开放空间内，可以提供细胞生长支架，例如本文其他地方描述的筛网1300，并且流动可以流过或经过细胞生长支架(例如筛网1300)。
[0155] 在具有大致圆柱形外部的转子1700的实心部分中，可以在两个相对侧中的每一个上设置从中穿过的一个或多个孔1790。孔1790可以彼此对齐。在支架处于水平取向的期间，孔1790可以允许转子1700的支架区域内部中的液体与储存容器中的液体之间的质量传递。即使当支架(筛网)是水平的时，也可能没有液体的大量流动，即使仅通过扩散或某种形式的自然对流，孔1790仍将允许一些质量传递。
[0156] 穿过转子1700的开放空间可以在尺寸和剖面面积上大致对应于立管导管1500的内部尺寸和剖面面积。例如，从转子1700的一个大致实心部分内部的尺寸到转子1700的另一个大致实心部分的尺寸可以与立管导管1500的相同方向的内部尺寸相同或近似相同。转子的空置空间的末端-末端尺寸与立管导管1500的相同方向的内部尺寸相同或大致相同。
[0157] 经过转子1700的开放空间可以是旨在由细胞培养支架1300阵列占据的空间。转子1700的内面朝向开放空间的端部可以包括凹槽1720或类似的界面以保持多个细胞培养支架。如图所示，转子1700的端部各自具有用于10个单独筛网1300的凹槽1720。可替代的设计可以根据需要具有用于一些其他数量的筛网1300的凹槽。凹槽1720可以在筛网1300的边缘处支撑或引导或定位筛网1300的末端。凹槽1720可以针对每个支架或筛网1300的厚度和支架或筛网1300之间的预期间隔，适当地尺寸化。在诸如转子1700的两端之间的中间的附加位置处，可以提供小的辅助支撑件，其也包含凹槽1720以在其边缘处支撑或引导或定位筛网或支架1300。例如，可以设置桥1740，其可以连接到转子1700，转子1700可以包含凹槽
1720。可以提供可拆卸的夹子1760，其可以附接到转子1700并且可以从转子1700拆卸，并且还可以包含凹槽1720。
1720。可以提供可拆卸的夹子1760，其可以附接到转子1700并且可以从转子1700拆卸，并且还可以包含凹槽1720。
[0158] 支架和筛网的设计可以如本文其他地方所讨论的，结合另一个实施例。
[0159] 如图所示，转子1700包含适于保持支架1300的凹槽1720，以便在平行于支架1300的表面的方向上流动。或者，可以提供转子1700，其将支架1300保持在流动经过支架的位置(垂直于支架的表面)。该装置可以设计成能够接受各种不同的转子1700，其中不同的转子1700具有不同的设计，就支架1300的放置或取向而言。对于不同的可互换的转子，一个转子可以提供大致平行于支架表面的流动，而另一个不同的转子可以提供经过支架的流动(即大致垂直于支架)。
[0160] 与细胞和培养基的体积和有效使用相关的考虑因素
[0161] 现在参考图17，可以在装置的设计和操作中建立各种考虑因素以帮助有效使用培养基(可以是昂贵的材料)，并且有效地使用细胞(其倾向于在重力的影响下下沉)。立管导管1500的下边缘1510可以延伸浸没在储存容器1060中的液体表面下方，或者具体地可以在操作之前以及在操作期间的任何时间，延伸到浸没在储存容器贮槽凹部1440中的液体表面下方。这可能有助于向上吸入流体的能力。为了能够将液体向上吸入到立管导管1500中，优选避免在立管导管1500的下边缘1510下方有任何空气行进。
[0162] 储存容器1060的可用体积可以定义为储存容器1060中存在的液体体积，与液体水平低于喷头并且低于填充口中的塞子的要求一致，并且与当设备平衡且不操作时，立管导管中的液位与立管导管1500外部的储存容器1060中的液位相同。储存容器1060的可用体积可以是足够的，使得当储存容器1060包含小于储存容器1060的可用几何体积的适当量的液体时，即使转子室1600、壕沟1640和各种管道充满液体，储存容器1060仍然不是空的，或者至少储存容器贮槽凹部1440不是空的。更具体地，在这些条件下，储存容器1060或储存容器贮槽凹部1440中的液位仍然处于比立管导管1500的下边缘1510更高的高度。
[0163] 在转子1700中不存在筛网的情况下，储存容器1060的容积可足以用液体填充所述这些刚描述的所有空间。或者，可计算各种组分的体积，并且可以针对细胞培养支架的筛网所占据的空间量进行校正，当存在支架时，储存容器的体积可足以填充所有这些刚描述的空间。可以足够精确地测量实际装载到储存容器1060中的液体的体积，使得当诸如立管导管1500、转子室1600、壕沟1640和各种管道的空的空间充满液体时，液体足以到达壁1630的顶部，或至少用液体覆盖支架，储存容器1060中的液位可位于储存容器凹部1440中但高于立管导管1500的下端1510。
[0164] 已经示出，储存容器基底1400的上表面1410是平坦的和水平的。或者，可以提供一些轻微的斜面或漏斗形状以帮助排出液体或帮助液体到达储存容器贮槽凹部1440。
[0165] 可以注意到，泵1140(例如蠕动泵)，位于细胞培养室的下游，即转子室1600。这意味着在支架接种期间，细胞可以直接从储存容器1060到达支架，无需经过泵。细胞经过泵的通道可能会不期望地损坏细胞。然而，预计在接种期间，占据细胞支架区域的大多数细胞将自身沉积在支架上。预计只有一小部分细胞不能接种并将离开转子室1600，并经过泵1140。如果在经过泵1140时，那些未能附着于支架的细胞受损。无论如何，这些细胞的数量应该很少，因此对于那些未附着细胞的可能损害，在使用细胞的效率方面不应该具有太多的总体意义。
[0166] 搅拌棒的旋转方向可以是使得它促使通道凹部1430中的液体流向立管导管1500。这样，特别是当储存容器1060中的液位低时，它将提供一些除了搅拌动作之外的有用的泵状动作。
[0167] 立管内的填充结构
[0168] 现在参考图18，在本发明的实施例中，可以在立管导管1500内提供填充结构1100。
[0169] 填充结构1100可以有用地占据立管导管1500内部的一部分体积，使得该部分体积不必被培养基液体占据。因为培养基液体是昂贵的，并且立管中的液体培养基对细胞接种或培养没有贡献，所以填充结构1100可以减少不能用于有用目的的这种培养基量。
[0170] 填充结构1100可以具有流线型形状，以便接收在立管贮槽处进入立管底部的培养基流动，并将该流动向上引导并分配到细胞培养区域。因此，填充结构1100的上端可以是指向的，指向垂直向上。填充结构1100的下端可以是使得接收具有来自储存容器贮槽凹部1440的水平速率分量的流动，并且重新引导该流动向上。
[0171] 在本发明的其他实施例中，还可以使用类似填充结构1100的填充结构。即使不是为了节省液体培养基的量，也可以有益于改善流动模式，例如改善流动进入筛网阵列的流速的均匀性。
[0172] 在培养箱1950外部可以有多个流体容器。这种流体容器可包括废液瓶；回收瓶；培养基存储瓶；PBS(磷酸盐缓冲盐水)瓶；和tryp-LE E瓶。可以存在适当的通过或穿透以使这些液体进出培养箱950。还可以提供适当的阀门来控制这种液体的流动。如本文其他地方所述，在该位置，或大致在任何需要的位置，还可以提供能够旋转细胞培养组份的马达(如转子)。
[0173] 冲击器
[0174] 在本发明的实施例中，还可以提供致动器或冲击器(未示出)，其可以适合于在培养箱1950内部引导运动或向培养箱1950内的装置传递冲击，例如转子室的外部。由冲击器撞击细胞培养筛网附近的部件引起的振动可以脱开细胞，并且可以在扩增后帮助收获细胞。在所示的实施例中，冲击器可以位于培养箱1950的后部。对于冲击器，可以存在适当的通过或穿透。这种冲击可以与化学处理(例如将细胞群暴露于胰蛋白酶)结合进行。
[0175] 该装置还可以包括适合于操作所述部件的自动控制。
[0176] 操作方法
[0177] 在本发明的实施例中，支架上的细胞接种和生长可以通过各种方案进行。
[0178] 在接种期间，储存容器1060中的液体可包含待接种的细胞。在细胞扩增期间，储存容器1060中的液体不必包含细胞，但它可含有有助于细胞生长和增殖的营养物。
[0179] 预期在接种阶段期间，细胞/培养基混合物将基本上不通过泵1140。在自动接种过程开始时，细胞和培养基在储存容器1060中。此时的培养基体积足以填满立管和细胞培养区域，但不会多于此。当泵1140启动时，该细胞/培养基混合物将被吸入细胞培养区域。仅需要抽吸足够的培养基以用液体覆盖细胞培养支架(筛网)。不需要用液体填充壕沟1640，并且不需要将液体抽吸足够远得使液体进入从壕沟1640到泵1140的管中。可以执行该操作，使得当转子室1600充满细胞/培养基混合物时，泵1140将止动。例如，使用蠕动泵，如果蠕动泵的转子停止旋转，则不会有进一步的流动，也不会有回流。因此，可以简单地关闭泵1140并且可以允许液体保持在那时的位置(包括培养区域中的液位)。有可能已经足够精确地计算和测量了液体体积，使得在那时储存容器1060几乎是空的。事实上，储存容器1060中的液位可能已经下降到储存容器贮槽凹部1440中的某处。如果液位在储存容器贮槽凹槽1440中，则低于储存容器基底1400的上表面40但是高于立管导管1500的底端，立管导管1500和细胞培养区域内的液体将保持在稳定位置，因为没有气泡进入液柱以允许液体下落。通过在细胞培养区域上方的降低的气体压力(可以略微低于大气压)，细胞/培养基将保持在立管柱1500和细胞培养区域内，即使泵1140在那时停止。诸如蠕动泵或通常是正排量泵的泵可以保持这种情况。阀门也可以使用。
[0180] 在接种过程中，可以通过抽吸将含有细胞的培养基提升到转子1700和细胞培养支架的区域中。对于液体的初始流入，筛网1300的位置可以是大致垂直的。然后可以通过旋转转子1700开始接种过程，使得筛网1300占据水平位置。这允许悬浮在筛网1300之间的液体中的细胞通过重力向下沉降到相邻的筛网1300上。当发生这种情况时，支架(筛网)1300可以保持静止状态一段时间。在所需的时间，转子1700也可以再次旋转。例如，转子1700可以旋转180度，使得由于重力方向的改变，可能仅仅未附着地置于在一个筛网1300的顶部上的细胞可能漂浮，并沉降和附着到附近的筛网1300。转子1700可以周期性地旋转以在筛网或支架上产生均匀的细胞分布。该过程可持续长达一至两天(由实验确定)。
[0181] 当接种完成时，预期所有(或大多数)细胞将附着于支架(筛网)1300。后续步骤可涉及更连续的培养基流动并且可称为动态的培养。可以将另外的培养基添加到储存容器1060中。该另外的培养基不必包含细胞。可以打开泵1140以允许通过培养基循环进行动态培养。如果需要，流动可以经过支架连续地围绕流动系统流动。可以将流速调节到足够低以将细胞位置处的剪切速率保持在期望的小幅度。此时，可能存在一些细胞未附着到支架上并且流过泵管。希望在接种过程中实现至少80％的接种效率。
[0182] 关于马达的操作和支架筛网的定位的程序可以如下：
[0183] ·向储存容器1060中加入含有待培养和扩增的细胞的液体。
[0184] ·对于用液体初始填充培养区域，垂直放置筛网。
[0185] ·在用液体初始填充培养区域之后，将筛网(支架)1300水平放置，使得在筛网之间悬浮的细胞可以从悬浮液中沉降到筛网上。
[0186] ·每隔一段时间，将筛网旋转180度，使面向上的筛网表面成为面向下的筛网表面，反之亦然。间隔例如可以是一小时。
[0187] ·继续这样做足够长的时间，使大部分细胞附着在筛网1300上。预计这一步骤可能需要大约一到两天。
[0188] ·细胞良好接种后，根据动态培养需要，将筛网(支架)1300旋转至垂直位置或旋转至水平位置。
[0189] ·在动态培养期间，根据需要，将筛网(支架)1300保持在垂直位置或水平位置。在动态培养期间，将营养物置于培养基中，并使培养基缓慢流过筛网(支架)1300。根据需要，流动将向上并且大致平行于或穿过(垂直于)筛网1300的平坦表面。
[0190] ·经过足够的时间后，收获细胞。
[0191] 通常，可以在接种和细胞培养过程的特定阶段执行转子和支架的任何所需位置组合。在动态培养期间，筛网可以在培养期间处于垂直或水平位置(无论哪个是所需的)，并且流动可以平行于或穿过(垂直于)筛网。
[0192] 收获细胞
[0193] 在本发明的实施例中，可以实施某些技术用于在细胞生长后从支架1300收获细胞。已知tryp-LE E可用于从支架收获细胞。在本发明的实施例中，为了收获细胞，将支架用PBS洗涤三次，然后加入适量的tryp-LE E约30分钟。通过冲击器的作用可以进一步帮助细胞的收获，所述冲击器冲击结构上连接到筛网(或支架)的细胞的细胞骨架。这种冲击可以通过冲击的机械力脱开细胞。
[0194] 计算流体动力学
[0195] 现在参考图19A-20，示出了本发明实施例的流动几何形状的计算流体动力学建模的结果。图19A示出了在30毫升/分钟的流速下的局部速率分布(在进入的通道中的剖面面积约为6200平方毫米)。图19B示出了40毫升/分钟的流速的速率分布。图19C示出了60毫升/分钟的流速的速率分布。图20显示了如本文所述构造的筛网之间的压力分布和流动流线。
[0196] 进一步评论
[0197] 通常，本文描述的公开特征、部件和方法的任何组合都是可能的。可以以物理上可能的任何顺序执行方法的步骤。
[0198] 所有引用的参考文献均以引用方式并入本文。
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