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用于蛋白生产的脂质代谢的调节

阅读:78发布:2020-08-15

专利汇可以提供用于蛋白生产的脂质代谢的调节专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本公开内容涉及用于调节脂质代谢以实现改善重组产品(如新一代 生物 制品)的产量和 质量 的方法和组合物。如本 申请 所述的调节脂质代谢包括例如向细胞或无细胞系统引入本申请所述的脂质代谢调节剂。本公开内容还包括具有改进的生产能 力 和改进的产品质量的经工程化改造的细胞,用于对此类细胞进行工程化改造的方法,以及包含来自此类细胞的产品的制品和混合物。,下面是用于蛋白生产的脂质代谢的调节专利的具体信息内容。

1.一种用于通过细胞生产产品,例如,多肽,如重组多肽的方法,所述方法包括:
i)提供含有调节脂质代谢的修饰的细胞,以及
ii)培养所述细胞,例如,在适于通过所述修饰调节脂质代谢的条件下,
从而生产所述产品,例如,多肽,例如重组多肽。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞包含编码所述多肽,例如,选自表2或表3的多肽的外源性核酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中与不具有所述修饰的细胞相比,所述修饰为所述多肽提供了增加的产量或改善的质量
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法,包括在所述细胞中形成编码脂质代谢调节剂(LMM)的外源性核酸或外源性LMM,以及任选地其中形成包括引入编码脂质代谢调节剂的外源性核酸,例如,其增加编码LMM的内源性核酸的表达。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,包括调节脂质代谢的第二修饰并且其中所述第二修饰包含编码第二LMM,例如,与所述第一修饰的所述LMM不同的LMM的第二外源性核酸。
6.根据权利要求5所述的方法,其中:
i)将所述第二外源性核酸和所述第一外源性核酸置于同一核酸分子上,或者
ii)将所述第二外源性核酸和所述第一外源性核酸置于不同核酸分子上。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其中与不具有所述第二修饰的细胞相比,所述第二修饰为所述产品提供了增加的产量或改善的质量。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法,包括在所述细胞中形成编码第二LMM的第二外源性核酸或第二外源性LMM,以及任选地其中形成包括引入编码第二LMM的所述第二外源性核酸,例如,其增加编码LMM的内源性核酸的表达。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法,其中调节脂质代谢包括,例如,导致改变以下一种或多种(例如,与不具有修饰的细胞相比):
i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
vii)饱和脂质或不饱和脂质,例如,单不饱和脂质的量;
viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
xii)产品分泌的量或速率;
xiii)增殖能,例如,增殖速率;
xiv)培养活力或细胞存活;
xv)膜受体活化;
xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
xvii)产品的产率或生产速率;
xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配(scrambling));和/或
xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法,其中:
i)例如,与无所述脂质代谢修饰的细胞生产的产品平或量相比,所述产品,例如,重组多肽的产量增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍,或者
ii)例如,与无所述脂质代谢修饰的细胞生产的产品质量相比,所述产品,例如,重组多肽的质量增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法,其中:
i)所述修饰导致调节,例如,增加脂质代谢基因产物,例如,选自表1的脂质代谢基因产物的表达或活性,
ii)所述修饰上调转录调控因子,例如,转录因子,其调节脂质代谢基因产物的表达,例如选自表1的脂质代谢基因产物的表达或活性,或者
iii)(i)和(ii)两者。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法,其中所述脂质代谢调节剂包括:
i)转录调控因子,例如转录因子,其调节,例如,上调脂质代谢基因产物的表达,例如选自表1的脂质代谢基因产物;SREBF1;或SREBF2,或任何其功能性片段或类似物,或者ii)SCD1或其功能性片段。
13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法,其中所述调节导致调节,例如,增加下述中的一种或多种:从头脂肪生成、脂肪酸再酯化、脂肪酸饱和或去饱和、脂肪酸延伸和磷脂生物合成。
14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法,其中所述LMM包括酶,其调节,例如,增加饱和脂质向不饱和,例如,单不饱和脂质的转化,以及任选地其中所述酶包含SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD1,或者其功能性片段或类似物。
15.根据权利要求11所述的方法,其中所述修饰包含:
i)脂质代谢基因产物,例如,选自表1的脂质代谢基因产物或其功能性片段或类似物,或者
ii)顺式或反式调控元件,其增加编码脂质代谢基因产物的核酸的表达,例如选自表1的脂质代谢基因产物。
16.根据权利要求11所述的方法,其中所述LMM包括来自下述的一种或多种基因产物或者其功能性片段或类似物:
i)脂质生物合成(脂质生成)途径,例如选自表1的基因产物,
ii)脂肪酸再酯化途径,例如选自表1的基因产物,
iii)脂质生物合成途径,例如选自表1的基因产物,或者
iv)脂肪酸饱和或不饱和途径,例如选自表1的基因产物。
17.根据权利要求11所述的方法,其中所述脂质代谢调节剂包含:
i)与SREBF1,例如,SEQ ID NO:1或34或其功能性片段,例如,SEQ ID NO:26、27或36的基酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性;或与SREBF1,例如,SEQ ID NO:1或34或其功能性片段,例如,SEQ ID NO:26、27或36的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸的差异,或者
ii)与SCD1,例如,SEQ ID NO:3或其功能性片段的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、
95、98、99或100%同一性;或与SCD1,例如,SEQ ID NO:3或其功能性片段的氨基酸序列具有
1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸的差异。
18.根据权利要求11所述的方法,其中编码所述脂质代谢调节剂的所述核酸包含与选自SEQ ID NO:2、4或32的任意核酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性的核酸序列。
19.根据权利要求11-18中任意一项所述的方法,其中编码所述脂质代谢调节剂的所述核酸包含质粒或载体,以及任选地其中通过转染或转导将编码所述脂质代谢调节剂的所述核酸引入所述细胞。
20.根据权利要求11-19中任意一项所述的方法,其中将编码所述脂质代谢调节剂的所述核酸:
i)整合至所述细胞的染色体基因组,以及任选地其中所述LMM被稳定表达,或者ii)不整合至所述细胞的染色体基因组,以及任选地其中所述LMM被瞬时表达。
21.根据权利要求1-20中任意一项所述的方法,还包括将编码所述产品,例如多肽,例如重组多肽的外源性核酸引入所述细胞,其中:
i)在步骤i)或步骤ii)之后引入了编码所述重组多肽的所述外源性核酸,或者
ii)在步骤i)或步骤ii)之前引入了编码所述重组多肽的所述外源性核酸。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述重组多肽是:
i)治疗性多肽,
ii)抗体分子,例如抗体或其抗体片段,单克隆抗体或双特异性分子,或者
iii)选自表2或表3。
23.根据权利要求21或22所述的方法,其中将编码所述重组多肽的所述外源性核酸:
i)整合至所述细胞的所述染色体基因组,或者
ii)不整合至所述细胞的所述染色体基因组。
24.根据权利要求1-23中任意一项所述的方法,其中所述细胞是:
i)真核细胞,例如动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、啮齿动物细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞,或者
ii)原核细胞。
25.根据权利要求1-24中任意一项所述的方法,其中所述细胞选自HeLa、HEK293、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、EB66、C127、L细胞、COS(例如,COS1和COS7)、QC1-3、CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。
26.根据权利要求1-25中任意一项所述的方法,其中所述方法还包括向所述细胞引入修饰,所述修饰改善ER加工能力(ER扩张)或分泌,任选地其中改善ER加工能力(ER扩张)包括引入编码PD1、BiP、ERO或XBP1的核酸,以及任选地其中改善分泌包括调节SNARE机制,例如引入编码SNARE组分的核酸。
27.根据权利要求1-26中任意一项所述的方法,还包括下述中的一项或多项:
i)从所述细胞或所述细胞的后代获得所述多肽,
ii)从所述细胞或所述细胞的后代条件化的培养基获得所述多肽,
iii)从至少一种细胞或培养基成分分离所述多肽,或者
iv)分析所述多肽,例如分析活性或结构部分的存在情况。
28.一种工程化改造使细胞具有增加的生产能力和/或改善的生产质量的方法,所述方法包括将编码脂质代谢调节剂的外源性核酸引入所述细胞,从而工程化改造使细胞具有增加的生产能力和/或改善的生产质量。
29.根据权利要求28所述的方法,其中通过转染,转导、例如病毒转导,电穿孔,核转染或脂质转染将编码脂质代谢调节剂的所述外源性核酸引入所述细胞,以及任选地其中将编码脂质代谢调节剂的所述外源性核酸整合至所述细胞的所述染色体基因组。
30.根据权利要求28或29所述的方法,还包括将编码重组多肽的外源性核酸引入所述细胞,其中将编码重组多肽的所述外源性核酸引入:
i)在编码所述LMM的所述外源性核酸引入之前,或者
ii)在编码所述LMM的所述外源性核酸引入之后。
31.根据权利要求28-30中任意一项所述的方法,其中:
i)例如,与无所述脂质代谢修饰的细胞的生产能力相比,所述生产能力,例如,重组多肽的产量增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍,
ii)例如,与无所述脂质代谢修饰的细胞的生产质量相比,所述生产质量,例如,重组多肽的质量增加例如1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、
60%、70%、75%、80%、85%、90%、85%或100%或者更多,或者
iii)(i)和(ii)两者。
32.根据权利要求28-31中任意一项所述的方法,其中所述LMM选自下组:SREBF1、SREBF2、SCD1、SCD2、SCD3、SCD4、SCD5,以及其中所述细胞生产产品,例如,多肽,例如表2或表3中提供的重组多肽或其功能性片段。
33.一种由权利要求28-32中任意一项生产的细胞。
34.一种细胞,所述细胞包含编码脂质代谢调剂(LMM)的外源性核酸,任选地其中将编码脂质代谢调节剂的所述外源性核酸整合至所述细胞的所述染色体基因组。
35.根据权利要求34所述的细胞,其中所述细胞是真核细胞,例如CHO细胞或人细胞。
36.根据权利要求34或35所述的细胞,其中所述细胞选自下组:CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。
37.根据权利要求34所述的细胞,其中所述LMM调节产品的表达,例如本申请所述的新一代生物制品(NGB),例如双特异性抗体、融合蛋白或糖基化蛋白。
38.根据权利要求37所述的经工程化改造的细胞,其中所述LMM选自下组:SREBF1、SREBF2、SCD1、SCD2、SCD3、SCD4和SCD5,或其功能性片段。
39.根据权利要求37所述的经工程化改造的细胞,其中所述LMM改变所述细胞选自下组的一种或多种性质:
i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
vii)饱和脂质或不饱和脂质,例如,单不饱和脂质的量;
viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
xii)产品分泌的量或速率;
xiii)增殖能力,例如,增殖速率;
xiv)培养活力或细胞存活;
xv)膜受体活化;
xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
xvii)产品的产率或生产速率;
xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配);和/或
xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
40.根据权利要求37-39中任意一项所述的经工程化改造的细胞,其中所述细胞选自下组:
i)真核细胞,例如选自下组的CHO细胞:CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞,
ii)原核细胞,
iii)昆虫细胞,
iv)植物细胞,
v)酵母细胞,或者
vi)藻类细胞。
41.一种经工程化改造以表达脂质代谢调节剂(LMM)的CHO细胞,其中所述LMM调节所述CHO细胞的一种或多种性质,其中基于对选自下组的一种或多种性质的调节选择所述经工程化改造的CHO细胞:
i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
vii)饱和脂质或不饱和脂质,例如,单不饱和脂质的量;
viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
xii)产品分泌的量或速率;
xiii)增殖能力,例如,增殖速率;
xiv)培养活力或细胞存活;
xv)膜受体活化;
xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
xvii产率或生产速率(例如,产品的表达水平,例如新一代生物制品(NGB),例如双特异性抗体;融合蛋白;或糖基化蛋白);
xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配);和/或
xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
42.根据权利要求41所述的经工程化改造的CHO细胞,其中所述LMM选自下组:SREBF1、SREBF2、SCD1、SCD2、SCD3、SCD4和SCD5,或其功能性片段。
43.根据权利要求41所述的经工程化改造的CHO细胞,其中所述产品,例如,NGB选自下组:双特异性抗体分子、融合蛋白和糖基化蛋白。
44.根据权利要求41所述的经工程化改造的CHO细胞,其中所述CHO细胞选自下组:CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S,CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。

说明书全文

用于蛋白生产的脂质代谢的调节

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2016年5月3日提交的美国临时申请序号62/330973的优先权,其全部内容通过引用整体并入本申请。

技术领域

[0003] 本公开内容涉及用于调节细胞的脂质代谢途径的方法和组合物,以及用于生产产品(例如,重组蛋白)的经工程化改造的细胞和细胞系。

背景技术

[0004] 重组治疗性蛋白通常在细胞表达系统(例如,哺乳动物细胞表达系统)中表达。在2014年,批准上市的生物药品总数为212个,FDA批准上市的治疗性产品中有56%是在哺乳动物细胞系中生产的。然而,与生产相关的高成本促使了总体健康成本的增加。
[0005] 此外,诸如新一代融合蛋白、多聚体糖蛋白或新一代抗体的新一代蛋白生物制品(NGB)通常具有复杂的和/或非天然的结构,并且已证明其比诸如单克隆抗体的分子更加难以表达。目前宿主细胞系尚未进化出有效合成和分泌NGB的途径,导致生长显著减少、生产较低以及通常导致生产出质量较差的产品。因而,认为这些NGB难以表达,其生产力和产品质量难以满足临床和市场需求。
[0006] 因此,越来越需要快速、有效和经济地开发和生产重组生物治疗剂,同时保持最终产品的质量。发明内容
[0007] 本公开内容部分地基于以下发现:通过过表达一个或多个脂质代谢途径的组分调节脂质代谢途径提高生产重组多肽产品的细胞的生产力和产品质量。这里,证明了可以将调节脂质代谢(例如,通过调节一个或多个脂质代谢途径)用于工程化改造生产具有更高产率的产品和具有改善的质量的产品的细胞和无细胞系统。重要的是,本公开内容的特征在于通过使用调节与脂质代谢相关的一个以上过程或途径的总体调控因子对脂质代谢进行总体调控,从而产生多种下游效应以实现改善的产品产量和质量。本申请所述的方法和组合物对于改善重组产品或新一代生物制品(例如,融合蛋白、双特异性或多形式抗体分子、多聚体蛋白和糖基化蛋白)的生产,以及用于生产此类产品的更有效系统(例如,细胞系或无细胞系统)的开发特别有用。
[0008] 在一个方面中,本公开内容涉及一种用于在细胞中生产本申请所述的产品的方法。在一个实施方式中,所述产品是多肽,例如重组多肽。在一个实施方式中,所述方法包括提供包含调节脂质代谢的修饰的细胞,并且培养所述细胞(例如,在适于通过所述修饰调节脂质代谢的条件下),从而生产所述产品。
[0009] 在另一个方面中,本公开内容涉及一种用于在无细胞系统中生产产品(例如,多肽,例如重组多肽)的方法,所述方法包括:提供包含调节脂质代谢的修饰的无细胞系统(例如,来自包含调节脂质代谢的修饰的细胞或细胞系的无细胞系统),并将所述无细胞系统置于适于生产所述产品的条件下;从而生产所述产品(例如,多肽,例如重组多肽)。在一个实施方式中,所述无细胞系统来自包含调节脂质代谢的修饰的细胞或细胞系。在一个实施方式中,所述无细胞系统包含来自含有调节脂质代谢的修饰的细胞或细胞系的一个或多个组分(例如,细胞器或细胞器的一部分)。在一些实施方式中,所述修饰包含编码脂质代谢调节剂(LMM)的外源性核酸以及其中所述细胞或细胞系表达LMM(例如,选自下组的LMM:SREBF1、SREBF2、SCD1、SCD2、SCD3、SCD4、SCD5)或其功能性片段。在一些实施方式中,LMM改变选自下组的无细胞系统的一个或多个特征:增肌所述产品(例如多肽,例如所生产的重组多肽(NGB))的生产(例如,产量和生产速率);以及增加所述产品的质量(例如,减少聚集、降低糖基化异质性、减少片段化和增加正确折叠与错折叠或未折叠产品的比例)。
[0010] 能够使用本申请所述的任何方法或组合物生产的产品的实例包括重组产品或者其中至少一部分或部分(moiety)是基因工程结果的产品。可以将本申请所述的重组产品用于诊断或治疗目的。在一个实施方式中,产品包括多肽,如抗体分子(例如,双特异性或多形式抗体分子)、融合蛋白或蛋白缀合物;核酸分子(例如,DNA或RNA分子);或者包封脂质的颗粒(例如,外来体或病毒样颗粒)。可以将本申请所述的方法和组合物特别地用于难以生产的产品,例如用于市售或治疗用途的较大量或足够品质,如新一代生物制品(例如,融合蛋白、双特异性或多形式抗体分子、多聚体蛋白和糖基化蛋白)。在一个实施方式中,如本申请所述的细胞(例如,用于生产所述产品都)表达所述产品。在一个实施方式中,所述细胞包含编码本申请所述产品(例如,选自表2或表3的多肽)的外源性核酸。在标题为“产品”的章节中描述了产品的其他实例。
[0011] 调节脂质代谢的本申请所述的修饰包括增加或减少脂质代谢调节剂(LMM)的表达或者增加或减少脂质代谢途径的组分的表达或活性的试剂或分子。在一个实施方式中,所述修饰是核酸(例如,编码LMM的核酸)或者抑制或减少LMM表达的抑制性核酸。
[0012] 在一个实施方式中,所述修饰增加LMM的表达,并且包含编码LMM的外源性核酸。在一个实施方式中,所述方法包括在细胞中形成编码LMM的外源性核酸或外源性LMM。在一个实施方式中,所述形成包括引入编码脂质代谢调节剂的外源性核酸。在一个实施方式中,所述形成包括引入外源性核酸,所述核酸增加编码LMM的内源性核酸的表达。在标题为“脂质代谢的调节”和“脂质代谢调节剂”的章节中进一步描述了适用于本申请所述的方法和组合物的LMM的实例。
[0013] 在一个实施方式中,所述细胞包含一个或多个修饰。在一个实施方式中,所述细胞包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。在一些实施方式中,所述细胞包含一个以上修饰。在一些实施方式中,所述细胞包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。在一个实施方式中,所述细胞包含调节脂质代谢的一个或多个第二修饰。在一个实施方式中,所述第二修饰包含编码第二LMM(例如,与第一修饰的LMM不同的LMM)的第二外源性核酸。在一个实施方式中,所述第二外源性核酸和所述第一外源性核酸置于同一核酸分子上。在一个实施方式中,所述第二外源性核酸和所述第一外源性核酸置于不同核酸分子上。在一个实施方式中,与不具有所述第二修饰的细胞相比,所述第二修饰为所述产品提供了增加的产量或改善的质量。在一个实施方式中,所述方法包括在细胞中形成编码第二LMM的第二外源性核酸或第二外源性LMM。在一个实施方式中,所述形成包括引入编码第二LMM的第二外源性核酸。在一个实施方式中,所述形成包括引入第二外源性核酸,所述核酸增加编码LMM的内源性核酸的表达。
[0014] 通过本申请所述的任何方法或组合物调节脂质代谢包括(例如,导致)改变(例如,增加或减少)以下一种或多种:
[0015] i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
[0016] ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
[0017] iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
[0018] iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
[0019] v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
[0020] vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
[0021] vii)饱和脂质或不饱和脂质(例如,单不饱和脂质)的量;
[0022] viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
[0023] ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
[0024] x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
[0025] xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
[0026] xii)产品分泌的量或速率;
[0027] xiii)增殖能力(例如,增殖速率);
[0028] xiv)培养活力或细胞存活;
[0029] xv)膜受体活化;
[0030] xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
[0031] xvii)产品的产率或生产速率;
[0032] xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配(scrambling));和/或
[0033] xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
[0034] 在此类实施方式中,可以通过与不具有修饰的细胞进行比较,确定所述细胞的任何上述特征的增加或减少。
[0035] 与不具有所述修饰的细胞相比,本申请所述的方法和组合物导致所述产品生产的增加。可以将生产的增加表征为由所述细胞生产的产品的量、产率或质量增加和/或生产速率增加,其中所述生产速率等于产品的量随时间的变化情况。在一个实施方式中,例如与不具有脂质代谢修饰的细胞的生产相比,所述产品(例如,重组多肽)的生产增加1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、
90%、85%或100%或者更多;或者与不具有脂质代谢修饰的细胞的生产相比,增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
[0036] 与不具有修饰的细胞相比,本申请所述的方法和组合物还能够导致所述产品质量的改善(即,产品质量)。可以通过以下一种或多种表征产品质量的改善(即,产品质量):聚集(例如,聚集物或聚集减少);正确折叠或组装(例如,错配或未折叠产品或者部分组装或未组装产品减少);翻译后修饰(例如,糖基化异质性的增加或减少,所需或预先确定的翻译后修饰的百分比增加);片段化(例如,片段化减少);二硫键错配(例如,由于二硫键错配导致的不需要的同种型或结构减少)。在一个实施方式中,例如与不具有脂质代谢修饰的细胞的生产相比,所述产品(例如,重组多肽)的质量增加例如1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、85%或100%,或者例如与不具有脂质代谢修饰的细胞所生产产品的质量相比,增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、
50倍、100倍。
[0037] 在实施方式中,用于生产如本申请所述产品的方法可以包括一个或多个附加步骤,其包括但不限于:向细胞引入改善ER加工能力(ER扩张)或分泌的修饰;从所述细胞或所述细胞的后代,或者从由所述细胞或所述细胞的后代条件化的培养基获得所述产品;将所述产品与至少一种细胞或培养基组分分离;和/或分析所述产品(例如,针对活性或针对结构部分的存在情况)。在一个实施方式中,所述方法还包括通过引入编码PDI、BiP、ERO或XBP1的核酸改善ER加工能力(或ER扩张)的步骤。在一个实施方式中,所述方法还包括用于通过调节SNARE机制或参与分泌途径的其他机制(例如,通过引入编码SNARE组分的核酸)改善分泌能力或分泌速率的附加步骤。
[0038] 脂质代谢的调节
[0039] 本公开内容涉及用于调节脂质代谢的方法和组合物。在一个实施方式中,所述修饰导致调节(例如,增加)一种或多种脂质代谢途径,其包括但不限于:从头脂肪生成、脂肪酸再酯化、脂肪酸饱和或去饱和、脂肪酸延伸和磷脂生物合成。
[0040] 适于调节脂质代谢的本申请所述的修饰包括引入增加或减少脂质代谢途径的组分或LMM、LMM多肽或增加或减少脂质代谢途径的表达或活性的其他分子的表达或活性的外源性核酸。本公开内容涉及使用脂质代谢调节剂调节脂质代谢,例如通过增加或减少与脂质代谢相关的组分的表达或活性。在一个实施方式中,LMM是本申请所述的总体调控因子。
[0041] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致脂质代谢的总体调控,例如通过增加或减少总体调控因子的表达或活性。此类总体调控因子是充分地在一个或多个途径上游的分子,以使得其能够影响多种下游效应,例如增加一个以上(例如,2、3、4、5个或更多个)不同脂质代谢过程或途径的组分的表达或活性。脂质代谢过程或途径的组分包括但不限于酶、辅因子或者参与脂质分子的合成、降解、延伸或结构构象的其他分子。
[0042] 在一个实施方式中,本申请所述的总体调控因子是上调(例如,增加)脂质代谢的组分(例如,选自表1的脂质代谢基因产物)的表达的转录因子。举例来说,总体调控因子增加两种或多种脂质相关基因产物(例如,参与脂质生物合成的酶和参与脂质分子饱和平的酶)的表达。
[0043] 在本申请所述的任意方法或组合物中,LMM包括下述中的任意一种:脂质代谢的总体调控因子,例如上调脂质代谢基因或在下述过程中起作用的组分(例如,酶、辅因子或分子)的转录因子:从头脂肪生成、脂肪酸再酯化、脂肪酸饱和或去饱和、脂肪酸延伸和磷脂生物合成途径。
[0044] 在一个实施方式中,脂质代谢调节剂包括转录调控因子(例如,转录因子),其介导(例如,上调)脂质代谢基因产物的表达。脂质代谢基因产物的实例包括但不限于表1脂质代谢的总体调控因子中提供的那些,例如上调脂质代谢基因的转录因子。
[0045] 在一个实施方式中,LMM包含SREBF1或SREBF2或者其功能性片段或类似物。在一个实施方式中,脂质代谢调节剂包含与SREBF1(例如,SEQ ID NO:1或34)或其功能性片段(例如,SEQ ID NO:26、27或36)的基酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性;或与SREBF1(例如,SEQ ID NO:1或34)或其功能性片段(例如,SEQ ID NO:26、27或36)的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸的差异。在一个实施方式中,编码脂质代谢调节剂的核酸包含与选自SEQ ID NO:2或32的任意核酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性,或者编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:36的核酸。
[0046] 在一个实施方式中,LMM包含SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD5,或者其功能性片段或类似物。在一个实施方式中,脂质代谢调节剂包含与SCD1(例如,SEQ ID NO:3)或其功能性片段的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性;或与SCD1(例如,SEQ ID NO:3)或其功能性片段的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸的差异。在一个实施方式中,编码脂质代谢调节剂的核酸包含与选自SEQ ID NO:4的任意核酸序列具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性。
[0047] 在一个实施方式中,LMM包含表1中提供的任何组分或其功能性片段。在一个实施方式中,LMM包含与表1中提供的任何组分的氨基酸序列或其功能性片段具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性;或者与表1中提供的任何组分的氨基酸序列或其功能性片段具有1、2或3个或者更多个氨基酸残基但是不超过50、40、30、20、15个或10个氨基酸残基的差异。在一个实施方式中,编码脂质代谢调节剂的核酸包含与编码表1中提供的任何组分的核酸序列或其功能性片段具有至少60、70、80、90、95、98、99或100%同一性。
[0048] 在一个实施方式中,修饰包含顺式或反式调控元件,其增加编码脂质代谢基因产物(例如,选自表1的脂质代谢基因产物)的核酸的表达。
[0049] 在一个实施方式中,编码脂质代谢调节剂的核酸包含质粒或载体。
[0050] 在一个实施方式中,通过转染(例如,电穿孔)、转导或者本申请所述的任意其他递送方法将编码脂质代谢调节剂的核酸引入细胞。
[0051] 在一个实施方式中,将编码脂质代谢调节剂的核酸整合至细胞的染色体基因组。在一个实施方式中,LMM是稳定表达的。
[0052] 在一个实施方式中,编码脂质代谢调节剂的核酸未整合至细胞的染色体基因组。在一个实施方式中,LMM是瞬时表达的。
[0053] 产品
[0054] 本申请所述的产品包括多肽(例如,重组蛋白);核酸分子(例如,DNA或RNA分子);多聚体蛋白或复合物;包封脂质的颗粒(例如,病毒样颗粒、囊泡或外来体);或者其他分子(例如,脂质)。在一个实施方式中,产品是多肽(例如,重组多肽)。例如,重组多肽可以是难于表达的蛋白或具有复杂的和/或非天然结构的蛋白,如新一代生物制品,例如双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白。
[0055] 在本申请所述的任何方法中,用于生产产品的方法还包括向细胞引入编码产品(例如多肽,例如重组多肽)的外源性核酸。
[0056] 在一个实施方式中,在提供包含调节脂质代谢的修饰的细胞之后,引入编码重组多肽的外源性核酸。在另一个实施方式中,在培养细胞(例如,在适于通过修饰调节脂质代谢的条件下)之后,引入编码重组多肽的外源性核酸。
[0057] 在一个实施方式中,在提供包含调节脂质代谢的修饰的细胞之前,引入编码产品(例如,重组多肽)的外源性核酸。在另一个实施方式中,在培养细胞(例如,在适于通过修饰调节脂质代谢的条件下)之前,引入编码重组多肽的外源性核酸。
[0058] 在本申请所述的任何组合物、制品或方法中,产品(例如,重组多肽)是治疗性多肽或抗体分子(例如,抗体或其抗体片段)。在一个实施方式中,抗体分子式单克隆抗体。在一个实施方式中,抗体分子是双特异性抗体分子,例如BiTE(双特异性T细胞衔接器(Engager))、DART(双亲和性再靶向或再定向T细胞)。
[0059] 在一个实施方式中,产品(例如,重组多肽)选自表2或表3。
[0060] 在实施方式中,产品是由细胞稳定表达的。在一个实施方式中,将编码产品(例如,重组多肽)的外源性核酸整合至细胞的染色体基因组中。或者,产品是由细胞瞬时表达的。在一个实施方式中,未将编码产品(例如,重组多肽)的外源性核酸整合至细胞的染色体基因组中。
[0061] 宿主细胞
[0062] 本申请提供了用于生产本申请所述产品的细胞和工程化改造此类细胞的方法。
[0063] 在本申请所述的任何组合物、制品或方法中,细胞是真核细胞。在一个实施方式中,细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞或植物细胞。在一个实施方式中,细胞是啮齿动物细胞。在一个实施方式中,细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞的实例包括但不限于CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。
[0064] 在本申请所述的任何组合物、制品或方法中,细胞选自下组:HeLa、HEK293、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、EB66、C127、L细胞、COS(例如,COS1和COS7)、QC1-3、CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN。
[0065] 在一个实施方式中,细胞是哺乳动物细胞以外的真核细胞,例如昆虫、植物、酵母或藻类细胞。在一个实施方式中,细胞是原核细胞。
[0066] 在一个方面中,本公开内容涉及一种工程化改造细胞的方法,所述细胞具有增加的生产能力和/或改善的生产质量(例如,生产具有一种或多种改善的产品质量的产品),所述方法包括将编码脂质代谢调节剂的外源性核酸引入细胞或在细胞中形成,从而对细胞进行工程化改造,使其具有增加的生产能力和/或改善的生产质量。在一个实施方式中,通过转染、转导(例如,病毒转导)、电穿孔、核转染或脂质转染将编码脂质代谢调剂的外源性核酸引入细胞。在一个实施方式中,将编码脂质代谢调节剂的外源性核酸整合至细胞的染色体基因组。在一个实施方式中,所述方法还包括将编码重组多肽的外源性核酸引入细胞。在一个实施方式中,在引入编码LMM的外源性核酸之前,引入编码重组多肽的外源性核酸。在一个实施方式中,在引入编码LMM的外源性核酸之后,引入编码重组多肽的外源性核酸。
[0067] 在一个方面中,本公开内容涉及通过提供细胞并向细胞引入本申请所述的LMM(例如,引入编码LMM的外源性核酸)而产生的细胞。
[0068] 在一个方面中,本公开内容涉及包含编码本申请所述的LMM的外源性核酸的细胞。
[0069] 在一个方面中,本公开内容涉及一种经工程化改造以生产LMM的细胞,其中所述LMM调节产品(例如,本申请所述的新一代生物制品(NGB))的表达。在一个实施方式中,细胞是CHO细胞。
[0070] 在一个方面中,本公开内容涉及一种经工程化改造以生产LMM的CHO细胞,其中所述LMM调节产品(例如,本申请所述的新一代生物制品(NGB))的表达。
[0071] 在一个方面中,本公开内容涉及一种经工程化改造以表达LMM和NGB的CHO细胞,其中已选择高水平表达NGB的群体。
[0072] 在一个方面中,本公开内容涉及一种经工程化改造以表达LMM的CHOu细胞,其中所述LMM调节CHO细胞的一种或多种性质,其中基于对选自下组的一种或多种性质的调节选择经工程化改造的CHO细胞:
[0073] i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
[0074] ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
[0075] iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
[0076] iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
[0077] v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
[0078] vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
[0079] vii)饱和脂质或不饱和脂质(例如,单不饱和脂质)的量;
[0080] viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
[0081] ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
[0082] x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
[0083] xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
[0084] xii)产品分泌的量或速率;
[0085] xiii)增殖能力(例如,增殖速率);
[0086] xiv)培养活力或细胞存活;
[0087] xv)膜受体活化;
[0088] xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
[0089] xvii)产品的产率或生产速率;
[0090] xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配);和/或
[0091] xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
[0092] 在本申请所述的任何方法或细胞(例如,经工程化改造的细胞)中,细胞表达或包含LMM,所述LMM选自下组:SREBF1、SREBF2、SCD1、SCD2、SCD3、SCD4和SCD5,或其功能性片段。
[0093] 在本申请所述的任何方法或细胞(例如,经工程化改造的细胞)中,细胞表达或包含产品,例如重组产品,例如选自下组的新一代生物制品:双特异性抗体、融合蛋白或糖基化蛋白。
[0094] 在本申请所述的任何方法或细胞(例如,经工程化改造的细胞)中,细胞是选自下组的CHO细胞:CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。
[0095] 组合物和制品
[0096] 在一个方面中,本公开内容还涉及由本申请所述的方法制备的本申请所述产品的制品。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中至少70、80、90、95、98或99%的产品正确折叠或组装。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的产品聚集。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中少于50%、
40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的产品是产品片段。
[0097] 在一些实施方式中,本公开内容涉及由本申请所述方法制备的多肽(例如,表2或表3的多肽)的制品。在一些实施方式中,在所述方法中使用的细胞是选自下组的CHO细胞:CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO-来源的细胞。
[0098] 在一个方面中,本公开内容涉及一种混合物,所述混合物包含本申请所述的细胞(例如,含有调节脂质代谢的修饰的细胞)和由所述细胞生产的产品。在一个实施方式中,所述混合物含有较高浓度的产品,例如以重量或数量计比不具有修饰时产品的浓度至少高1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%或30%。在一个实施方式中,以重量或数量计,混合物中至少70%、80%、90%、95%、98%或99%的产品正确折叠或组装。在一个实施方式中,以重量或数量计,混合物中少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的产品聚集。在一个实施方式中,以重量或数量计,混合物中少于50%、40%、30%、25%、
20%、15%、10%或5%的产品是产品片段。在一些实施方式中,产品是重组多肽,例如表2或表3中的重组多肽。
[0099] 在一个方面中,本公开内容涉及一种通过本申请所述细胞的培养物条件化的培养基制品,其中所述细胞包含调节脂质代谢的修饰。在一个实施方式中,在所述制品中存在较高浓度的产品,例如以重量或数量计比不具有修饰时产品的浓度至少高1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%或30%。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中至少70%、80%、90%、95%、98%或99%的产品正确折叠或组装。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的产品聚集。在一个实施方式中,以重量或数量计,制品中少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的产品是产品片段。在一些实施方式中,产品是重组多肽,例如表2或表3中的重组多肽。
[0100] 除非另有定义,否则在本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管与本申请所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施或测试,但是下文中描述了适宜的方法和材料。本申请提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容均通过引入并入本申请。此外,材料、方法和实例均仅是说明性的并且并非旨在限制。标题、小标题或编号或字母元素(例如,(a)、(b)、(i)等)仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用的标题或数字或字母元素不要求步骤或元素按照字母顺序进行,或者步骤或元素必须彼此分离。本发明的其他特征、目的和优点将是从说明书附图以及从权利要求书中显而易见的。

附图说明

[0101] 图1是从Flp-In CHO经工程化改造的细胞库获得的一系列免疫荧光图像,所述细胞库分别被对照表达载体(Ctrl),或者编码在其C末端与V5表位标签融合的SCD1(SCD1-V5)或编码在其C末端与V5表位标签融合的SREBF1(SREBF1-V5)的表达载体转染。使用抗-V5一抗和二抗抗-小鼠FITC抗体(中间图像)以及DAPI(左侧图像)对细胞库成像并且将左侧图像和中间图像重叠显示(右侧一列)。使用Leica共聚焦显微镜产生图像。
[0102] 图2显示了从CHOK1SV谷氨酰胺合成酶敲除(GS-KO)细胞库获得的一系列免疫荧光图像,所述细胞库分别被对照表达载体(Ctrl),或者编码SCD1-V5或SREBF1-V5的表达载体转染。使用抗-V5一抗和二抗抗-小鼠TRITC抗体(中间图像)以及DAPI(左侧图像)对细胞库成像并且将左侧图像和中间图像重叠显示(右侧一列)。使用Leica共聚焦显微镜产生图像。
[0103] 图3A、3B和3C显示了确定使用编码难以表达的重组Fc融合蛋白(也称为Fc融合蛋TM白或FP)(图3A)或eGFP(图3B)的质粒瞬时转染后在CHO Flp-In 细胞库中表达的外源性SCD1-V5和SREBF1-V5。图3C显示了确定在未转染的稳定表达CHO Flp-InTM细胞库中表达的外源性V5-标记的SCD1和SREBF1。对使用Fc融合蛋白进行电穿孔后96小时获得的细胞裂解物进行Western印迹分析,以及细胞库仅表达所示的V5-标记的脂质代谢调节剂(LMM)SCD1或SREBF1。使用抗-V5一抗和抗-小鼠HRP偶联的二抗检测V5-标记的LMM和抗-β-肌动蛋白或抗L7a(如所示的),随后将分别暴露于抗-小鼠和抗-家兔HRP偶联的二抗作为LMM检测的上样对照。
[0104] 图4显示了使用ViCell细胞计数器确定的经工程化改造以稳定表达LMM SCD1-V5和SREBF1-V5并且随后使用含有eGFP的构建体JB3.3转染的CHO Flp-In细胞库中的活细胞浓度(n=2)。
[0105] 图5A和5B显示了使用含eGFP的质粒转染对照、SCD1-V5、SREBF1-V5和SREBF410-V5过表达的CHOK1SV GS-KO细胞库后24、48、72和96小时时细胞培养物的浓度和培养物的活力。图5A显示了细胞浓度。下面的柱子表示活细胞浓度,而整个柱子表示细胞总浓度;下面的误差线表示活细胞的标准偏差,而上面的误差线表示总浓度的标准偏差。图5B表示基于图5A中数据确定的培养物活力。误差线表示标准偏差。使用双尾T检验与特定时间点的对照值进行比较计算统计学显著性:*使用双尾T检验确定的活细胞浓度的显著性[p<0.05]。+使用双尾T检验确定的总细胞浓度的显著性[p<0.05](n=3)。
[0106] 图6A、6B和6C显示了使用FACSCalibur仪器(BD Biosciences)产生的流式细胞术数据。使用含eGFP的质粒转染后24、48、72和96小时采集中位数(图6A)、几何平均数(图6B)和算数平均数(图6C)的值,其中样品来自对照、SCD1-V5或SREBF1-V5过表达Flp-In CHO细胞库(n=2)。
[0107] 图7A、7B和7C显示了使用FACSCalibur仪器(BD Biosciences)产生的流式细胞术数据。使用含eGFP的质粒转染后24、48、72和96小时采集中位数(图7A)、几何平均数(图7B)和算数平均数(图7C)的值,其中样品来自对照、SCD1-V5、SREBF1-V5或SREBF410-V5过表达的来源于CHOK1SV GS-KO的细胞。图7C显示了每ml培养物的总荧光,根据所测得的算数平均6
荧光乘以总细胞浓度(x10/ml)计算得到。误差线表示标准偏差。使用双尾T检验与特定时间点的对照值进行比较计算统计学显著性(n=3)。*表示具有统计学显著性的值[p<0.05]。
使用FACSCalibur(BD Biosciences)产生数据。
[0108] 图8A和8B显示了使用编码抗体A重链和轻链的核酸构建体瞬时转染后在稳定过表达SCD1-V5和SREBF1-V5的CHO Flp-In细胞中抗体A的产生情况。图8A是使用抗-重链一抗和抗-家兔HRP偶联的二抗检测的显示与抗体A对应的条带的western印迹。图8B显示了使用蛋白A HPLC确定的与由对照细胞库产生的值进行比较的在经LMM工程化改造的细胞库中抗体产生情况的平均变化倍数。
[0109] 图9A和9B显示了使用编码融合蛋白的核酸构建体瞬时转染后在稳定过表达SCD1-V5和SREBF1-V5的CHO Flp-In细胞库中Fc融合蛋白的产生情况。图9A是使用抗-重链一抗和抗-家兔HRP偶联的二抗检测的显示代表性Fc融合蛋白条带的western印迹。图9B显示了使用蛋白A HPLC确定的与由对照细胞库产生的值进行比较的在经LMM工程化改造的细胞库中Fc融合蛋白产生情况的平均变化倍数。
[0110] 图10A和10B显示了在使用编码抗体A重链和轻链的核酸构建体瞬时转染转染后48、72和96h的稳定过表达SCD1-V5、SREBF1-V5和SREBF410-V5的CHO GSKO细胞库中和在对照Null CHOK1SV GS-KO细胞库(使用仅表达选择GS基因,不表达LMM试剂的空质粒产生的对照细胞库)中良好表达的抗体A的产生情况。图10A是使用抗-重链一抗和抗-家兔HRP偶联二抗检测的显示代表性抗体A条带的western印迹。图10B显示了使用蛋白A HPLC确定的与由对照细胞库产生的值进行比较的在经LMM工程化改造的细胞库中抗体产生情况的平均变化倍数。
[0111] 图11A和11B显示了使用编码Fc融合蛋白的核酸构建体瞬时转染后在稳定过表达SCD1-V5和SREBF1-V5的CHOK1SV GS-KO细胞库中或在对照细胞库中难以表达的Fc融合蛋白的相对产生情况。图11A显示了通过使用抗-重链一抗然后暴露于抗-家兔HRP偶联的二抗检测的瞬时产生的融合蛋白的western印迹。图11B显示了使用蛋白A HPLC确定的与由对照细胞库产生的值进行比较的在经LMM工程化改造的细胞库中Fc融合蛋白产生情况的平均变化倍数。
[0112] 图12A和12B显示了对CHO细胞系稳定表达抗体A 48和72小时后收集的上清液中抗体A产生情况的分析,已使用含有对照(空)、SCD1-V5、SREBF1-V5或SREBF410-V5基因的质粒构建体对所述细胞进行瞬时转染。图12A显示了来自细胞的上清液的western印迹;使用抗-重链一抗然后暴露于抗-家兔HRP偶联的二抗对抗体A进行检测。图12B显示了Coomassie分析的结果,其中的条带表示在转染后168小时的上清液中存在的抗体A的相对水平。
[0113] 图13显示了对CHO细胞系稳定表达抗体A 48、72、96和144小时后收集的上清液中抗体A产生情况的分析,已使用含有对照(空)、SCD1-V5、SREBF1-V5或SREBF410-V5基因的质粒构建体对所述细胞进行瞬时转染,其中使用蛋白A Octet分析确定抗体的体积浓度(n=2)。
[0114] 图14显示了对CHO细胞系稳定表达抗体A 48、72、96和144小时后收集的上清液样品中的Fc融合蛋白的分析,已使用含有对照(空)、SCD1-V5、SREBF1-V5或SREBF410-V5基因的质粒构建体对所述细胞进行瞬时转染,其中使用活细胞数和蛋白A滴度测量结果确定Fc融合蛋白的比生产力,误差线表示标准偏差(n=3)。
[0115] 图15A和15B显示了对使用含有对照SCD1-V5或SREBF1-V5的载体稳定整合随后使用抗体A构建体稳定整合的CHO细胞库培养48、72、96和144小时后收集的上清液样品中抗体A产生情况的分析。图15A显示了抗体的体积浓度,而图15B显示了抗体A的比生产力。误差线表示标准偏差(n=3)。
[0116] 图16A和16B显示了对使用含有对照SCD1-V5或SREBF1-V5的载体稳定整合随后使用Fc融合蛋白构建体稳定整合的CHO细胞库培养48、72、96和144小时后收集的上清液样品中Fc融合蛋白产生情况的分析。图16A显示了FC融合蛋白的体积浓度,而图16B显示了FC融合蛋白的比生产力。误差线表示标准偏差(n=3)。
[0117] 图17A显示了对使用编码适于表达免疫细胞因子的基因以及无LMM(对照)、SCD1、SREBF1或SREB411基因的核酸构建体瞬时转染转染后48和96h的CHO GSKO细胞的免疫细胞因子表达情况的western分析。对上清液样品进行还原,条带表示使用抗重链一抗随后暴露于抗-家兔HRP偶联的二抗检测到的条带。下面的条带表示天然的重链抗体,而上面的条带表示与细胞因子融合的重链分子。图17B显示了转染后96小时获得的样品的相对免疫细胞因子丰度。

具体实施方式

[0118] 随着目前和新一代的生物制品在患者中持续获得治疗效用,需要大量具有高质量的用于治疗用途的新一代生物制品,以及用于生产和有效开发生产细胞系的有效手段将升级。而且,很多新一代生物制品使用本领域公知的常规表达技术难以在常规细胞系中表达和生产。目前的方法不足以大量的和以临床用途所需的高品质生产这些产品。因此,本公开内容涉及用于获得与目前生产方法所获得的产率和质量相比具有改善的质量以及更高产率的产品(例如,新一代生物制品)的方法和组合物。本申请所述的方法和组合物用于工程化改造细胞或细胞系,使其具有与目前用于生产重组产品的细胞表达系统相比具有改善的生产力、产品质量、耐用性和/或培养活力。
[0119] 定义
[0120] 除非另有定义,否则在本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管与本申请所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施和/或测试,但是本申请描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时,将根据所定义的方式使用下述术语,其中提供了所述术语的定义。
[0121] 还应当理解的是,本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的,并且并非旨在进行限制。
[0122] 在本申请中使用的冠词“一个”和“一种”指该冠词的一个或多于一个(即,至少一个)语法对象。举例来说,“一个细胞”可以指一个或多于一个细胞。
[0123] 如在本申请中所使用的,“脂质代谢途径的组分”指直接地或间接地合成脂质、降解脂质、将脂质由一种脂质转化为另一种脂质或修饰脂质的分子、多肽或酶。在一个实施方式中,组分可以是酶底物、酶反应产物或酶辅因子。在一个实施方式中,脂质代谢途径的组分是LMM。在一个实施方式中,脂质代谢途径的组分如表1中所示。
[0124] 如在本申请中所使用的,术语“内源性的”指来自生物体、细胞、组织或系统或者由其内部天然产生的任何物质。
[0125] 如在本申请中所使用的,术语“外源性的”指引入生物体、细胞、组织或系统或者在其外部产生的任何物质。因此,“外源性核酸”指引入生物体、细胞、组织或系统或者在其外部产生的核酸。在一个实施方式中,外源性核酸的序列不是外源性核酸所引入的生物体、细胞、组织或系统天然产生的,也不是能够在其中发现的。在实施方式中,非天然存在的产品或含有非天然存在部分的产品相对于本申请所述的宿主细胞是外源性物质。
[0126] 如在本申请中所使用的,“形成”指导致核酸编码LMM或外源性LMM位于细胞内的引入细胞、在细胞内合成或任何其他过程。
[0127] 如在本申请中所使用的,术语“异源的”指当引入来自不同物种的生物体、细胞、组织或系统时的来自一个物种的任何物质。在实施方式中,异源性物质还包括含有来自一个或多个物种的部分或非天然存在的部分的物质。举例来说,在一个实施方式中,核酸编码融合蛋白,其中融合蛋白的部分是人,融合蛋白的部分是细菌和融合蛋白的部分是非天然存在的,并将所述核酸引入人细胞,所述核酸是异源性核酸。
[0128] 如在本申请中所使用的,“脂质代谢途径”指与脂质或脂质相关分子的合成,脂质或脂质相关分子的延伸,脂质或脂质相关分子的降解,脂质或脂质相关分子掺入膜,脂质或脂质相关分子的饱和状态(例如,饱和或去饱和),或者脂质或脂质相关分子的化学结构的转化或修饰(例如,再脂化)相关的过程。在一个实施方式中,脂质代谢途径导致脂质合成、脂质延伸、脂质降解、膜组分或流动性变化、脂筏的形成或调节或者脂质的修饰或转化(例如,脂质的饱和或去饱和,或者脂质的再脂化)。脂质代谢途径的实例包括但不限于:从头脂肪生成、脂肪酸再酯化、脂肪酸饱和、脂肪酸去饱和、脂肪酸延伸、磷脂生物合成和未折叠蛋白应答。
[0129] 如在本申请中所使用的,“脂质代谢调节剂”或“LMM”指调节(例如,增加或减少)下述一项或多项的分子、基因产物、多肽或酶:参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录或翻译);参与脂质代谢途径的组分(例如,基因产物)的活性;在细胞中存在的脂质的水平或量;脂筏的水平或量或者脂筏形成速率;细胞膜(例如,质膜或细胞器膜)的流动性、渗透性或厚度;饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;细胞中饱和脂质或不饱和脂质(例如,单不饱和脂质)的水平或量;脂质组成,以获得对ER活性具有有利影响的有利脂质的组成;扩张ER;扩张高尔基体;分泌囊泡的水平或量或者分泌囊泡的形成;分泌的水平或速率;膜受体的活化或失活(例如,ATR(参见例如,The increase of cell-membranous phosphatidylcholines containing polyunsaturated fatty acid residues induces phosphorylation of p53 through activation of ATR.Zhang XH,Zhao C,Ma ZA.J Cell Sci.2007 Dec1;120(Pt 23):4134-43 PMID:18032786;ATR(ataxia telangiectasia mutated-and Rad3-related kinase)is activated by mild 
hypothermia in mammalian cells and subsequently activates p53.Roobol A,Roobol J,Carden MJ,Bastide A,Willis AE,Dunn WB,Goodacre R,Smales CM.Biochem J.2011 Apr 15;435(2):499-508.doi:10.1042/BJ20101303.PMID:21284603)和SREPB(参见例如,Int J Biol Sci.2016Mar 21;12(5):569-79.doi:10.7150/ijbs.14027.eCollection 
2016.Dysregulation of the Low-Density Lipoprotein Receptor Pathway Is 
Involved in Lipid Disorder-Mediated Organ Injury.Zhang Y,Ma KL,Ruan XZ,Liu BC);以及其他受体(参见例如,Biochim Biophys Acta.2016 Mar 17.pii:S1388-1981(16)
30071-3.doi:10.1016/j.bbalip.2016.03.019));和/或未折叠蛋白应答(UPR)。在一个实施方式中,LMM包括多肽。在一个实施方式中,LMM包括转录调控因子,例如转录因子。在一个实施方式中,LMM包括SREBF1或其功能性片段(例如,SREBF-410)。在一个实施方式中,LMM包括酶。在一个实施方式中,LMM包括SCD1或其功能性片段。
[0130] 如在本申请中所使用的,“修饰”在“调节脂质代谢的修饰”的表述中指能够实现本申请所述的脂质代谢途径的组分(例如,基因产物)的表达或活性增加或减少的试剂。在实施方式中,修饰导致脂质代谢途径的组分的表达或活性增加,例如与缺乏修饰的组分的表达或活性相比,例如脂质代谢途径的组分的表达或活性增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、99%、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多。在实施方式中,修饰导致脂质代谢途径的组分的表达或活性减少,例如与缺乏修饰的组分的表达或活性相比,例如脂质代谢途径的组分的表达或活性减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、
45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、1倍、2倍、5倍、10倍、
20倍、50倍或100倍或者更多。在其中脂质代谢途径的组分的表达或活性减少的一些实施方式中,所述组分是脂质代谢途径的负向调控因子。在一个实施方式中,修饰包含编码脂质代谢调节剂的异源性或外源性核酸序列。在一个实施方式中,修饰是外源性脂质代谢调节剂(例如,小分子或多肽),可以将其引入细胞(例如,通过在存在分子或多肽的条件下培养细胞),以调节细胞的脂质代谢。
[0131] 本申请中的术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可以互换使用,指脱核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或者其DNA或RNA的组合,以及其单链、双链或三链形式的聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因、cDNA或mRNA。在一个实施方式中,核酸分子是合成的(例如,化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限制,否则该术语包括含有与参照核酸具有相似的结合性质并且以与天然或非天然存在的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸类似物或衍生物的分子。除非另有说明,否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。特别地,简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现(Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);
Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);以及Rossolini等,Mol.Cell.Probes 8:
91-98(1994))。
[0132] 本申请中的术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可以互换使用,指通过肽键或肽键以外的其他方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸,并且对可包含蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。在一个实施方式中,蛋白可以含有一个以上(例如,2、3、4、5个或更多个)多肽,其中每个多肽彼此之间通过共价或非共价键/相互作用结合。多肽包括含有彼此之间通过肽键或肽键以外的其他方式连接的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白。如在本申请中所使用的,该术语指多种类型的短链(例如,在本领域中通常还将其称为肽、寡肽和寡聚物)和更长的链(在本领域中通常将其称为蛋白)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。
[0133] “重组产品”指能够由细胞或无细胞系统生产的产品。产品可以是分子、核酸、多肽或其任意杂合体。重组产品指所述产品的至少一个组分或控制所述产品生产或表达的序列的至少一个核苷酸是基因工程改造形成的产品。如本申请所述的产生重组产品或编码重组产品的构建体的基因工程改造包括本领域公知的重组DNA表达技术(例如,如在Current Protocols in Molecular Biology中所述的;位点定向、扫描或随机诱变;使用基于CRISPR策略的基因组修饰策略;以及基于锌指核酸酶(ZFN)的策略)。举例来说,在其中重组产品是核酸的实施方式中,重组核酸的至少一个核苷酸,或控制重组核酸产生(例如,转录)的序列的至少一个核苷酸是由基因工程改造形成的。在一个实施方式中,重组产品是重组多肽。在一个实施方式中,重组产品是天然存在的产品。在一个实施方式中,重组产品是非天然存在的产品(例如,合成产品)。在一个实施方式中,重组产品的一部分是天然存在的,而重组产品的另一部分是非天然存在的。在另一个实施方式中,重组产品的第一部分是一个天然存在的分子,而重组产品的另一部分是不同于第一部分的另一个天然存在的分子。
[0134] “重组多肽”指能够由本申请所述的细胞生产的多肽。重组多肽是其编码多肽的序列的至少一个核苷酸或控制多肽表达的序列的至少一个核苷酸由(细胞或前体细胞的)基因工程改造或操纵形成的多肽。例如,改变至少一个核苷酸,例如将其引入细胞或其是基因工程改造重排的产品。在一个实施方式中,重组多肽的序列与天然存在的多肽或蛋白的同种型没有区别。在一个实施方式中,重组多肽的氨基酸序列不同于天然存在的多肽或蛋白的同种型的序列。在一个实施方式中,重组多肽和细胞来自相同的物种。在一个实施方式中,重组多肽的氨基酸序列与由细胞内源性基因组编码的多肽相同或基本上相同或差别不超过1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。在一个实施方式中,重组多肽和细胞来自相同的物种,例如重组多肽是人多肽和细胞是人细胞。在一个实施方式中,重组多肽与细胞来自不同物种,例如重组多肽是人多肽,细胞是非人源的,例如啮齿类动物,例如CHO,其他哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、病毒细胞或细菌细胞。在一个实施方式中,重组多肽对细胞而言是外源性的,换言之,细胞来自第一物种,而重组多肽来自第二物种。在一个实施方式中,多肽是合成多肽。在一个实施方式中,多肽来自非天然存在的来源。
在一个实施方式中,重组多肽是人多肽或蛋白,其与天然存在的人多肽或蛋白的同种型的氨基酸序列不存在差异。在一个实施方式中,重组多肽的不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基与天然存在的人多肽或蛋白的同种型不同。在一个实施方式中,重组多肽的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15%的氨基酸残基与天然存在的人多肽的同种型不同。在其中重组多肽的一部分包含来自天然或非天然存在的人多肽同种型的一部分的序列的实施方式中,重组多肽的一部分与天然或非天然存在的同种型的相应部分具有不超过1、2、3、4、5、
10、15或20个氨基酸残基或者其氨基酸残基的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、
10%或15%的差异。
[0135] 如在本申请中所使用的“同源性”、“同一性”或“相似性”指两个聚合物分子之间(例如,两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间,或两个多肽分子之间)的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置被相同单体亚基占据时(例如,如果两个DNA分子的每一个中的位置均被腺嘌呤占据时),则其在该位置上是同源的或相同的。两条序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数;例如,如果在两条序列中一半(例如,在长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)的位置是同源的,则两条序列具有50%同源性;如果90%的位置(例如,10个中的9个)是匹配或同源的,则两条序列具有90%的同源性。
[0136] 如在本申请中所使用的,术语“新一代生物制品”或“NGB”指包含细胞或由细胞产生的组分的生物组合物。生物组合物选自下组:具有至少一个天然组分的组合物、具有至少一个天然组分和至少一个非天然组分的组合物、具有至少一个天然组分和至少一个天然结构的组合物、具有至少一个天然组分和至少一个非天然结构的组合物或者其任意组合。新一代生物制品通常包含复合物和/或非天然结构。新一代生物制品的实例包括但不限于融合蛋白,酶或重组酶,蛋白或重组蛋白,具有延长的半衰期的重组因子,具有长效治疗的生长激素,多聚体糖蛋白,新一代抗体、抗体片段或抗体样蛋白(ALP),囊泡、外来体、脂质体、病毒和病毒样颗粒,粘蛋白,纳米颗粒,细胞提取物和作为试剂的细胞。
[0137] 在本申请中引用的每件专利、专利申请和出版物的公开内容的全部内容均通过引用并入本申请。尽管已参考特定方面公开了本发明,但是显而易见的是,在不脱离本发明真实精神和范围的前提下,本领域技术人员可以设计出本发明的其他方面和变体。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变化。
[0138] 脂质代谢的调节
[0139] 本公开内容涉及用于在细胞或无细胞系统中调节脂质代谢的方法和组合物,例如,通过向细胞或无细胞系统引入导致脂质代谢调节的修饰。在实施方式中,本公开内容涉及使用影响参与脂质代谢的途径或过程的多个方面的总体调控因子,例如从头脂肪合成、脂肪酸再脂化、脂肪酸饱和或去饱和、脂肪酸延伸和磷脂生物合成途径。举例来说,总体调控因子在一个或多个脂质代谢途径或过程的上游,以使得总体调控因子影响脂质代谢的若干(例如,两个或更多个)下游过程或下游组分。在一个实施方式中,总体调控因子是能够活化参与不同脂质代谢过程或途径的一个以上(例如,两个或更多个)靶基因表达的转录因子。因此,不希望受到任何理论的束缚,使用本申请所述的总体调控因子能够导致与使用仅调节单一靶点或脂质代谢的其他组分的下游效应物相比生产能力、耐用性和细胞存活极大地增加。尽管不希望受到任何理论的束缚,但是据信对多条脂质代谢途径总体或更广泛的调节通过影响参与改善生产能力、产品质量或细胞耐用性的更多过程增加细胞的生产能力。
[0140] 本申请所述的脂质代谢途径涉及脂质或脂质相关分子的合成、降解、转化或修饰。脂质分子包括但不限于脂肪酸、甘油糖脂、甘油磷脂、看i内酯、糖脂、鞘脂和甾醇脂质,例如胆固醇和聚化合物。脂质代谢途径的实例包括但不限于:从头脂肪合成、脂肪酸再脂化、脂肪酸饱和或去饱和、脂肪酸延伸和磷脂生物合成途径。在一个实施方式中,本申请所述的方法提供了包含调节脂质代谢的修饰的细胞。调节脂质代谢的修饰可以是增加或减少参与脂质代谢的组分的表达的试剂。在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰包含编码脂质代谢调节剂(LMM)的外源性核酸。在此类实施方式中,通过本申请所述的任何核酸递送方法或技术(例如,转导或转染)将编码LMM的外源性核酸引入细胞。
[0141] 在一个实施方式中,本申请所述的方法提供了包含调节脂质代谢的一个或多个(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)修饰的细胞。在其中细胞包含调节脂质代谢的两个或多个修饰的实施方式中,调节脂质代谢的每个修饰均包含编码LMM的外源性核酸。在一个实施方式中,编码LMM的两个或多个外源性核酸的每一个可以位于同一核酸分子中,或者在两个或多个不同核酸分子上。在其中细胞包含编码LMM的两个或多个核酸序列的此类实施方式中,LMM彼此之间是不同的,例如编码不同多肽序列或具有不同功能。
[0142] 在实施方式中,在细胞中调节脂质代谢(例如,通过引入和表达编码本申请所述LMM的外源性核酸)改变(例如,增加或减少)下述中的一项或多项:
[0143] i)参与脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录和/或翻译);
[0144] ii)参与脂质代谢途径的组分的活性(例如,酶活性);
[0145] iii)在细胞中存在的脂质(例如,磷脂或胆固醇)的量;
[0146] iv)脂筏的量或脂筏形成速率;
[0147] v)细胞膜(例如,质膜、囊泡膜或细胞器膜)的流动性、渗透性和/或厚度;
[0148] vi)饱和脂质向不饱和脂质的转化或不饱和脂质向饱和脂质的转化;
[0149] vii)饱和脂质或不饱和脂质(例如,单不饱和脂质)的量;
[0150] viii)细胞中的脂质组成,以获得对增加ER活性有利的组成;
[0151] ix)扩张ER(例如,ER的尺寸、ER膜表面或者构成和/或驻留在ER内的蛋白和脂质的量);
[0152] x)扩张高尔基体(例如,高尔基体的数目和尺寸、高尔基体表面或者驻留在高尔基体内的蛋白和分子的数目或量);
[0153] xi)分泌囊泡的量或分泌囊泡的形成;
[0154] xii)产品分泌的量或速率;
[0155] xiii)增殖能力(例如,增殖速率);
[0156] xiv)培养活力或细胞存活;
[0157] xv)膜受体活化;
[0158] xvi)未折叠蛋白应答(UPR);
[0159] xvii)产品的产率或生产速率;
[0160] xviii)产品质量(例如,聚集、糖基化、异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配);和/或
[0161] xix)细胞生长/增殖或细胞特异性生长速率。
[0162] 在一个实施方式中,脂质代谢的修饰导致上文中列出的任何性质的增加,例如与不具有脂质修饰的细胞相比,上文中列出的任何性质增加1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或者更多,或者至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、
10倍、20倍、50倍或100倍或者更多。在一个实施方式中,脂质代谢的修饰导致上文中列出的任何性质的减少,例如与不具有脂质修饰的细胞相比,上文中列出的任何性质减少1%、
2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或者更多,或者至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多。
[0163] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰增加或减少参与一个或多个脂质代谢途径的组分的表达或活性。在其中调节脂质代谢的修饰导致脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录或翻译)增加或活性增加的实施方式中,组分是脂质代谢途径的正向调控因子。在其中调节脂质代谢的修饰导致脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录或翻译)减少或活性减少的实施方式中,组分是脂质代谢途径的负向调控因子。用于对脂质代谢途径的基因的表达(例如,转录和/或翻译)进行定量的测定是本领域公知的,并且包括对编码基因的mRNA进行定量;或对基因产物或多肽的量进行定量;基于PCR的测定(例如,定量实时PCR);Northern印迹或者微阵列。用于对脂质代谢途径的组分(例如,脂质代谢途径中的酶)的活性进行定量的测定对脂质代谢途径的特定组分将具有特异性。
[0164] 在其中细胞的脂质代谢调节导致细胞中脂质的水平或量增加的实施方式中,细胞中脂质的总体水平或总量能够增加。在另一个实施方式中,细胞中一种或多种脂质物质(例如,磷脂或胆固醇)的水平或量能够增加。细胞中脂质(例如,总体或选定的脂质物质)的水平或量的增加包括调节脂质代谢后与不包括调节脂质代谢的修饰的细胞相比细胞(例如,活细胞)中脂质的水平或量增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多、或者1倍、2倍、3倍、
4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。用于对细胞中脂质的水平或量进行定量的测定是本领域公知的,并且包括酶测定和氧化测定以及采用质谱对特定隔室中(例如,细胞器)或来自整个细胞的脂质组分的测量。
[0165] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致细胞存活增加。例如,可以通过对细胞凋亡进行确定或定量测量细胞存活,例如已经被杀死或死亡的细胞数目或细胞量。细胞存活增加包括调节脂质代谢后与不包括调节脂质代谢的修饰的细胞相比细胞(例如,活细胞)的数目增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多、或者1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。或者,细胞存活的增加包括调节脂质代谢后例如与不包括调节脂质代谢的修饰的细胞相比细胞凋亡的数目减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、
40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多。
检测细胞存活或凋亡的方法是本领域公知的(例如,Annexin V测定),并且在本申请的实施例中对其进行了描述。
[0166] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致培养物活力增加。例如,可以通过对活细胞(例如,在培养物活细胞群中的活细胞)的数目或量,或者具有与存活相关特征(例如,增殖标记物、完整DNA或未显示出凋亡标记物)的细胞进行测定或定量测量培养物活力。培养物活力增加包括调节脂质代谢后例如与不包括调节脂质代谢的修饰的细胞相比细胞(例如,活细胞)数增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、
55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多、或者1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。用于确定培养物活力的方法是本领域公知的,并且在本申请的实施例3中对其进行了描述。用于评估培养物活力的其他方法包括但不限于台盼蓝拒染法,随后使用血细胞计数器或Vi-CELL(Beckman-Coulter)进行计数。用于确定活生物质的其他方法包括使用射频阻抗或电容的方法(例如,Carvell和Dowd,2006,Cytotechnology,
50:35-48)或使用拉曼光谱法(例如,Moretto等,2011,American Pharmaceutical Review,Vol.14)。
[0167] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致细胞增殖增加。例如,可以通过定量或计数细胞数、细胞倍增或细胞生长速率测量细胞增殖的能力。或者,可以通过分析细胞基因组含量(例如,复制DNA)(例如,通过流式细胞术分析)或增殖标记物(例如,Ki67,参与细胞周期的磷酸化细胞周期蛋白-CDK复合物)的存在情况鉴定增殖细胞。增殖能力的增加包括调节脂质代谢后细胞数或者表达增殖标记物的细胞数增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。或者,增殖能力的增加包括调节脂质代谢后细胞倍增或细胞生长速率增加1%、2%、5%、
10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。可以使用细胞计数器或通过使用血球计数器进行细胞计数。
[0168] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致生产能力(例如,所生产产品的量、数量或产量,或者生产速率)增加。所生产产品的量、数量或产量增加包括(例如,与由未对脂质代谢进行调节的细胞生产的产品的量、数量或产率相比)调节脂质代谢后所生产产品的量、数量或产率增加1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、
10倍、20倍、50倍或100倍或更多。生产速率的增加包括(例如,与由未对脂质代谢进行调节的细胞的生产速率相比)调节脂质代谢后所生产产品的量、数量或产率增加1%、2%、5%、
10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。在一个实施方式中,通过确定在特定时间单位内生产的产品的量、数量或产率确定生产速率。
[0169] 在一个实施方式中,调节脂质代谢的修饰导致产品质量(例如,聚集、糖基化状态或异质性、片段化、正确折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配)的增加。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后非聚集产品的量或数量增加,非聚集产品与聚集产品之比增加或聚集产品的量或数量减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后正确折叠或组装产品的量或数量增加,正确折叠或组装产品与错折叠、未折叠、部分组装或未组装产品之比增加或错折叠、未折叠、部分组装或未组装产品的量减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、
65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、
50倍或100倍或更多。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后非片段化或全长产品的量或数量增加,或者片段化产品的量或数量减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、
60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、
20倍、50倍或100倍或更多。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后功能性产品的量或数量增加,或者非功能性或功能障碍产品的量或数量减少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后聚糖异质性增加或减少1%、2%、5%、
10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。产品质量的增加包括(例如,与在未对脂质代谢进行调节的细胞中观察到的情况相比)调节脂质代谢后功能性产品的量或数量增加,或者非功能性或功能障碍产品的量或数量减少1%、
2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更多,或者1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多。
[0170] 脂质代谢调节剂
[0171] 如在本申请中所使用的,可以通过表达或引入LMM,或者通过改变LMM的调控实现脂质代谢的调节。在一个实施方式中,LMM在细胞中过表达,例如通过引入编码LMM的外源性核酸或通过经由引入启动子元件或其他调控转录元件增加表达。在另一个实施方式中,LMM的表达或活性被抑制或降低,例如通过引入LMM抑制剂或外源性抑制性核酸,例如RNA干扰剂。抑制剂核酸的实例包括靶向LMM的短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA),例如编码LMM的mRNA。在一个实施方式中,通过改变调控LMM活性或表达的翻译后修饰或其他内源性调控机制增加或减少LMM的活性或表达。通过翻译后修饰的调控包括但不限于能够增加或减少LMM的表达或活性的磷酸化、SUMO化、泛素化、乙酰化、甲基化或糖基化。举例来说,可以通过对修饰LMM的酶或分子进行修饰或者通过对LMM进行修饰以使得翻译后修饰不出现或出现的更加频繁或以组成型出现实现翻译后修饰的调控。LMM的调控还可以包括调节能够增加或降低LMM的表达或活性的内源性调控机制,例如增加或降低下述中的一种或多种:miRNA调控、蛋白裂解、特定同种型的表达、选择性剪接和降解。
[0172] 在一个实施方式中,LMM调节(例如,增加或减少)脂质代谢途径的组分的表达(例如,转录)或活性。在另一个实施方式中,LMM调节(例如,增加或减少)脂质或脂质相关分子的合成、降解、延伸或结构构象(例如,饱和或去饱和,或者酯化)。列出了脂质代谢途径的示例性LMM和/或组分,但不限于表1中所列的那些。
[0173] 表1:脂质代谢途径及其组分/基因产物
[0174]
[0175]
[0176] 在一个实施方式中,LMM与参与(例如,表1中提供的)脂质代谢途径的组分(例如,基因产物)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性或同源性;或者与参与(例如,表1中提供的)脂质代谢途径的组分(例如,基因产物)的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过
50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。
[0177] 在一个实施方式中,LMM包含参与(例如,表1中提供的)脂质代谢途径的组分的功能性片段。如本申请所述的LMM的功能性片段可以包含LMM的一个或多个功能性结构域。举例来说,作为转录因子的LMM的功能性片段包含DNA结合结构域和反式激活结构域。举例来说,作为酶的LMM的功能性片段包含酶促活性结构域。如本申请所述的LMM的功能性片段保留了全长LMM功能活性的例如至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。LMM的功能性片段可以由本领域技术人员通过实验确定,或者可以使用基于功能性结构域序列同源性的算法预测。下文中进一步描述了示例性LMM。
[0178] 在本申请所述方法的任何实施方式中,LMM是转录调控因子。在一个实施方式中,LMM是转录因子或转录激活因子,其与DNA结合或与同DNA结合的复合物结合,并且在复合物中募集或结合,所述复合物募集用于参与脂质代谢的一种或多种基因产物转录的RNA聚合酶。在一个实施方式中,LMM与固醇结合元件和/或E-box启动子序列结合。在一个实施方式中,LMM包含固醇调控元件结合因子1(SREBF1)或固醇调控元件结合因子2
[0179] (SREBF2)或者其功能性片段或同种型。
[0180] 在一个实施方式中,LMM包含总体转录激活因子或转录因子。在一个实施方式中,LMM能够调节(例如,表1中提供的)脂质代谢途径的一个或多个(例如,2、3、4、5、6个或更多个)组分的转录。在另一个实施方式中,LMM能够调节两个或多个脂质代谢途径中的一个或多个(例如,1、2、3、4或5个或者更多个)组分(例如,表1中提供的组分和途径)的转录。
[0181] 固醇调控元件结合因子1(SREBF1)是一种总体转录激活因子,其通过与靶基因启动子区存在的固醇调控元件(SRE)和E-box启动子序列(Hagen,Rodriguez-Cuenca等,2010)的结合上调参与脂肪生成、脂肪酸再酯化、脂肪酸去饱和延伸以及磷脂生物合成的基因的转录。SREBF1基因本身的转录受到基因启动子区域中其他转录调控元件中固醇调控元件(SRE)的存在的内源性调控。除此之外,大量的翻译后调控机制,包括磷酸化、泛素化、SUMO化、乙酰化、脂肪酸介导的修饰和蛋白水解加工,使得在SREBF1周围固定了严格控制但适应性强的稳态系统成为可能。
[0182] 全长SREBF1主要在内质网(ER)合成和定位。膜整合SREBF1与SREBF裂解激活蛋白(SCAP)形成复合物,后者能够促进SREBF1进入高尔基体。然而,当存在高固醇水平(特别是胆固醇)时,诱导SCAP的构象变化,这有助于与膜整合蛋白insig(胰岛素诱导基因)结合,从而抑制这种复合物的迁移。在不存在固醇的情况下,insig不与SCAP结合,从而使得COPII能够介导囊泡形成,以及随后将SREBF:SCAP复合物迁移至高尔基体。由位点-1蛋白酶(S1P)和位点2蛋白酶(S2P)蛋白介导的顺序蛋白水解裂解发生在高尔基体中,释放出SREBF1N-末端碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链(bHLHlz),其立即存在于胞质中,但是迁移到细胞核中。存在于裂解的SREBF1上的赖氨酸残基被泛素化并被26S蛋白酶体降解,但是能够通过赖氨酸残基的乙酰化抑制这种泛素化,这使得裂解的SREBF1能够迁移至细胞核。最后,核SREBF1能够与负责从头脂肪生成(脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰coA羧化酶(ACC))、脂肪酸再酯化(甘油二酯酰基转移酶(DGAT)、甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和脂蛋白脂酶(LPL))、磷脂生物合成(CTP:磷酸胆碱胞苷酰转移酶(CCT))、脂肪酸去饱和(硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(SCD1))的若干基因上游的固醇调控元件(SRE)序列结合。核SREBF1也能够激活全长SREBF1基因本身的转录,但是其还依赖于也位于该基因上游的肝脏X受体(LXR)启动子序列的活化(Brown,Goldstein 1997-BROWN,M.S.and GOLDSTEIN,J.L.,1997.The SREBP Pathway:Regulation of Cholesterol Metabolism by Proteolysis of a Membrane-Bound Transcription Factor.Cell,89(3),pp.331-340)(Hagen,Rodriguez-Cuenca-HAGEN,R.M.,RODRIGUEZ-CUENCA,S.and VIDAL-PUIG,A.,2010.An allostatic control of membrane lipid composition by SREBP1.FEBS letters,584(12),pp.2689-2698)。
[0183] 在一个实施方式中,LMM包含SREBF1,其同种型或功能性片段。SREBF1的氨基酸序列如下所示:
[0184] MDELAFGEAALEQTLAEMCELDTAVLNDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGGETGDTGPSSPGANSPESFSSASLASSLEAFLGGPKVTPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGMKPEVVETLTPPPSDAGSPSQSSPLSFGSRASSSGGSDSEPDSPAFEDSQVKAQRLPSHSRGMLDRSRLALCVLAFLCLTCNPLASLFGWGILTPSDATGTHRSSGRSMLEAESRDGSNWTQWLLPPLVWLANGLLVLACLALLFVYGEPVTRPHSGPAVHFWRHRKQADLDLARGDFPQAAQQLWLALQALGRPLPTSNLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGQAGGLLRDRGLRKDARASARDAAVVYHKLHQLHAMGKYTGGHLAASNLALSALNLAECAGDAISMATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPLAMQWLCHPVGHRFFVDGDWAVHGAPPESLYSVAGNPVDPLAQVTRLFREHLLERALNCIAQPSPGAADGDREFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPACSFSVSSSMAATTGPDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLYPLVEHIPQVLQDTERPLPRAALYSFKAARALLDHRKVESSPASLAICEKASGYLRDSLASTPTGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSLWQRQQSPASVQVAHGTSNGPQASALELRGFQHDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTHQLLDRSLRRRAGSSGKGGTTAELEPRPTWREHTEALLLASCYLPPAFLSAPGQRMSMLAEAARTVEKLGDHRLLLDCQQMLLRLGGGTTVTSS(SEQ ID NO:1)。
[0185] SREBF1的核苷酸序列如下所示:
[0186] atggacgagctggccttcggtgaggcggctctggaacagacactggccgagatgtgcgaactggacacagcggttttgaacgacatcgaagacatgctccagctcatcaacaaccaagacagtgacttcccgggcctgtttgacgccccctatgctgggggtgagacaggggacacaggccccagcagcccaggtgccaactctcctgagagcttctcttctgcttctctggcctcctctctggaagccttcctgggaggacccaaggtgacacctgcacccttgtcccctccaccatcggcacccgctgctttaaagatgtacccgtccgtgtcccccttttcccctgggcctgggatcaaagaggagccagtgccactcaccatcctacagcctgcagcgccacagccgtcaccggggaccctcctgcctccgagcttccccgcaccacccgtacagctcagccctgcgcccgtgctgggttactcgagcctgccttcaggcttctcagggacccttccaggaaacactcagcagccaccatctagcctgccgctggcccctgcaccaggagtcttgcccacccctgccctgcacacccaggtccaaagcttggcctcccagcagccgctgccagcctcagcagcccctagaacaaacactgtgacctcacaggtccagcaggtcccagttgtactgcagccacacttcatcaaggcagactcactgctgctgacagctgtgaagacagatgcaggagccaccgtgaagactgcaggcatcagcaccctggctcctggcacagccgtgcaggcaggtcccctgcagaccctggtgagtggagggaccatcttggccacagtacctttggttgtggacacagacaaactgcccatccaccgactcgcagctggcagcaaggccctaggctcagctcagagccgtggtgagaagcgcacagcccacaatgccattgagaagcgctaccggtcttctatcaatgacaagattgtggagctcaaagacctggtggtgggcactgaagcaaagctgaataaatctgctgtcttgcgcaaggccatcgactacatccgcttcttgcagcacagcaaccagaagctcaagcaggagaacctgaccctacgaagtgcacacaaaagcaaatcactgaaggacctggtgtcagcttgtggcagtggaggaggcacagatgtgtctatggagggcatgaaacccgaagtggtggagacgcttacccctccaccctcagacgccggctcaccctcccagagtagccccttgtcttttggcagcagagctagcagcagtggtggtagtgactctgagcccgacagtccagcctttgaggatagccaggtcaaagcccagcggctgccttcacacagccgaggcatgctggaccgctcccgcctggccctgtgtgtactggcctttctgtgtctgacctgcaatcctttggcctcgcttttcggctggggcattctcactccctctgatgctacgggtacacaccgtagttctgggcgcagcatgctggaggcagagagcagagatggctctaattggacccagtggttgctgccacccctagtctggctggccaatggactactagtgttggcctgcttggctcttctctttgtctatggggaacctgtgactaggccacactctggcccggctgtacacttctggagacatcgcaaacaagctgacctggatttggcccggggagatttcccccaggctgctcaacagctgtggctggccctgcaagcgctgggccggcccctgcccacctcaaacctggatctggcctgcagtctgctttggaacctcatccgccacctgctccagcgtctctgggtgggccgctggctggcaggccaggccgggggcctgctgagggaccgtgggctgaggaaggatgcccgtgccagtgcccgggatgcggctgttgtctaccataagctgcaccagctgcatgccatgggcaagtacacaggaggacatcttgctgcttctaacctggcactaagtgccctcaacctggctgagtgcgcaggagatgctatctccatggcaacactggcagagatctatgtggcagcggccctgagggtcaaaaccagcctcccaagagccctgcacttcttgacacgtttcttcctgagcagcgcccgccaggcctgcctagcacagagcggctcggtgcctcttgccatgcagtggctctgccaccctgtaggtcaccgtttctttgtggacggggactgggccgtgcacggtgcccccccggagagcctgtacagcgtggctgggaacccagtggatccgctggcccaggtgacccggctattccgtgaacatctcctagagcgagcgttgaactgtattgctcagcccagcccaggggcagctgacggagacagggagttctcagatgcccttggatatctgcagttgctaaatagctgttctgatgctgccggggctcctgcttgcagtttctctgtcagctccagcatggctgccaccactggcccagacccagtggccaagtggtgggcctcactgacagctgtggtgatccactggctgaggcgggatgaagaggcagctgagcgcttgtacccactggtagagcatatcccccaggtgctgcaggacactgagagacccctgcccagggcagctctgtactccttcaaggctgcccgggctctgctggaccacagaaaggtggaatctagcccagccagcctggccatctgtgagaaggccagtgggtacctgcgggacagcttagcctctacaccaactggcagttccattgacaaggccatgcagctgctcctgtgtgatctacttcttgtggcccgtaccagtctgtggcagcggcagcagtcaccagcttcagtccaggtagctcacggtaccagcaatggaccccaggcctctgctctggagctgcgtggtttccaacatgacctgagcagcctgcggcggttggcacagagcttccggcctgctatgaggagggtattcctacatgaggccacagctcggctgatggcaggagcaagtcctgcccggacacaccagctcctggatcgcagtctgaggaggagggcaggttccagtggcaaaggaggcactacagctgagctggagccacggcccacatggcgggagcacaccgaggccctgctgttggcatcctgctatctgccccctgccttcctgtcggctcctgggcagcgaatgagcatgctggccgaggcggcacgcaccgtagagaagcttggcgatcaccggctactgctggactgccagcagatgctcctgcgcctgggcggcggaaccaccgtcacttccagctag(SEQ ID NO:2)。
[0187] 在一个实施方式中,LMM包含与SREBF1的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:1)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性,或者与SREBF1的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:1)具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。
[0188] SREBF1的同种型是本领域公知的,并且包括同种型a和同种型b,以及物种或细胞特异性(例如,CHO细胞特异性)同种型,如同种型c。SREBF1同种型a(GenBank登录号NP_001005291.2)的氨基酸序列如下所述。
[0189] MDEPPFSEAALEQALGEPCDLDAALLTDIEGEVGAGRGRANGLDAPRAGADRGAMDCTFEDMLQLINNQDSDFPGLFDPPYAGSGAGGTDPASPDTSSPGSLSPPPATLSSSLEAFLSGPQAAPSPLSPPQPAPTPLKMYPSMPAFSPGPGIKEESVPLSILQTPTPQPLPGALLPQSFPAPAPPQFSSTPVLGYPSPPGGFSTGSPPGNTQQPLPGLPLASPPGVPPVSLHTQVQSVVPQQLLTVTAAPTAAPVTTTVTSQIQQVPVLLQPHFIKADSLLLTAMKTDGATVKAAGLSPLVSGTTVQTGPLPTLVSGGTILATVPLVVDAEKLPINRLAAGSKAPASAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIIELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLSLRTAVHKSKSLKDLVSACGSGGNTDVLMEGVKTEVEDTLTPPPSDAGSPFQSSPLSLGSRGSGSGGSGSDSEPDSPVFEDSKAKPEQRPSLHSRGMLDRSRLALCTLVFLCLSCNPLASLLGARGLPSPSDTTSVYHSPGRNVLGTESRDGPGWAQWLLPPVVWLLNGLLVLVSLVLLFVYGEPVTRPHSGPAVYFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALRALGRPLPTSHLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLQQDCALRVDASASARDAALVYHKLHQLHTMGKHTGGHLTATNLALSALNLAECAGDAVSVATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPPAMQWLCHPVGHRFFVDGDWSVLSTPWESLYSLAGNPVDPLAQVTQLFREHLLERALNCVTQPNPSPGSADGDKEFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPAYSFSISSSMATTTGVDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLCPLVEHLPRVLQESERPLPRAALHSFKAARALLGCAKAESGPASLTICEKASGYLQDSLATTPASSSIDKAVQLFLCDLLLVVRTSLWRQQQPPAPAPAAQGTSSRPQASALELRGFQRDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPTRTHQLLDRSLRRRAGPGGKGGAVAELEPRPTRREHAEALLLASCYLPPGFLSAPGQRVGMLAEAARTLEKLGDRRLLHDCQQMLMRLGGGTTVTSS(SEQ ID NO:28)
[0190] SREBF1同种型a(GenBank登录号NM_001005291.2)的核酸序列或mRNA序列如下所述。
[0191] AGCAGAGCTGCGGCCGGGGGAACCCAGTTTCCGAGGAACTTTTCGCCGGCGCCGGGCCGCCTCTGAGGCCAGGGCAGGACACGAACGCGCGGAGCGGCGGCGGCGACTGAGAGCCGGGGCCGCGGCGGCGCTCCCTAGGAAGGGCCGTACGAGGCGGCGGGCCCGGCGGGCCTCCCGGAGGAGGCGGCTGCGCCATGGACGAGCCACCCTTCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAGGCGCTGGGCGAGCCGTGCGATCTGGACGCGGCGCTGCTGACCGACATCGAAGGTGAAGTCGGCGCGGGGAGGGGTAGGGCCAACGGCCTGGACGCCCCAAGGGCGGGCGCAGATCGCGGAGCCATGGATTGCACTTTCGAAGACATGCTTCAGCTTATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTATTTGACCCACCCTATGCTGGGAGTGGGGCAGGGGGCACAGACCCTGCCAGCCCCGATACCAGCTCCCCAGGCAGCTTGTCTCCACCTCCTGCCACATTGAGCTCCTCTCTTGAAGCCTTCCTGAGCGGGCCGCAGGCAGCGCCCTCACCCCTGTCCCCTCCCCAGCCTGCACCCACTCCATTGAAGATGTACCCGTCCATGCCCGCTTTCTCCCCTGGGCCTGGTATCAAGGAAGAGTCAGTGCCACTGAGCATCCTGCAGACCCCCACCCCACAGCCCCTGCCAGGGGCCCTCCTGCCACAGAGCTTCCCAGCCCCAGCCCCACCGCAGTTCAGCTCCACCCCTGTGTTAGGCTACCCCAGCCCTCCGGGAGGCTTCTCTACAGGAAGCCCTCCCGGGAACACCCAGCAGCCGCTGCCTGGCCTGCCACTGGCTTCCCCGCCAGGGGTCCCGCCCGTCTCCTTGCACACCCAGGTCCAGAGTGTGGTCCCCCAGCAGCTACTGACAGTCACAGCTGCCCCCACGGCAGCCCCTGTAACGACCACTGTGACCTCGCAGATCCAGCAGGTCCCGGTCCTGCTGCAGCCCCACTTCATCAAGGCAGACTCGCTGCTTCTGACAGCCATGAAGACAGACGGAGCCACTGTGAAGGCGGCAGGTCTCAGTCCCCTGGTCTCTGGCACCACTGTGCAGACAGGGCCTTTGCCGACCCTGGTGAGTGGCGGAACCATCTTGGCAACAGTCCCACTGGTCGTAGATGCGGAGAAGCTGCCTATCAACCGGCTCGCAGCTGGCAGCAAGGCCCCGGCCTCTGCCCAGAGCCGTGGAGAGAAGCGCACAGCCCACAACGCCATTGAGAAGCGCTACCGCTCCTCCATCAATGACAAAATCATTGAGCTCAAGGATCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCTGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATTCGCTTTCTGCAACACAGCAACCAGAAACTCAAGCAGGAGAACCTAAGTCTGCGCACTGCTGTCCACAAAAGCAAATCTCTGAAGGATCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGGAGGGAACACAGACGTGCTCATGGAGGGCGTGAAGACTGAGGTGGAGGACACACTGACCCCACCCCCCTCGGATGCTGGCTCACCTTTCCAGAGCAGCCCCTTGTCCCTTGGCAGCAGGGGCAGTGGCAGCGGTGGCAGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGACAGCAAGGCAAAGCCAGAGCAGCGGCCGTCTCTGCACAGCCGGGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGCCCTGTGCACGCTCGTCTTCCTCTGCCTGTCCTGCAACCCCTTGGCCTCCTTGCTGGGGGCCCGGGGGCTTCCCAGCCCCTCAGATACCACCAGCGTCTACCATAGCCCTGGGCGCAACGTGCTGGGCACCGAGAGCAGAGATGGCCCTGGCTGGGCCCAGTGGCTGCTGCCCCCAGTGGTCTGGCTGCTCAATGGGCTGTTGGTGCTCGTCTCCTTGGTGCTTCTCTTTGTCTACGGTGAGCCAGTCACACGGCCCCACTCAGGCCCCGCCGTGTACTTCTGGAGGCATCGCAAGCAGGCTGACCTGGACCTGGCCCGGGGAGACTTTGCCCAGGCTGCCCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCGGGCACTGGGCCGGCCCCTGCCCACCTCCCACCTGGACCTGGCTTGTAGCCTCCTCTGGAACCTCATCCGTCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTGGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCAGGGGGCCTGCAGCAGGACTGTGCTCTGCGAGTGGATGCTAGCGCCAGCGCCCGAGACGCAGCCCTGGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCACACCATGGGGAAGCACACAGGCGGGCACCTCACTGCCACCAACCTGGCGCTGAGTGCCCTGAACCTGGCAGAGTGTGCAGGGGATGCCGTGTCTGTGGCGACGCTGGCCGAGATCTATGTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAGACCAGTCTCCCACGGGCCTTGCATTTTCTGACACGCTTCTTCCTGAGCAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCCTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCCGTGGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGTCCGTGCTCAGTACCCCATGGGAGAGCCTGTACAGCTTGGCCGGGAACCCAGTGGACCCCCTGGCCCAGGTGACTCAGCTATTCCGGGAACATCTCTTAGAGCGAGCACTGAACTGTGTGACCCAGCCCAACCCCAGCCCTGGGTCAGCTGATGGGGACAAGGAATTCTCGGATGCCCTCGGGTACCTGCAGCTGCTGAACAGCTGTTCTGATGCTGCGGGGGCTCCTGCCTACAGCTTCTCCATCAGTTCCAGCATGGCCACCACCACCGGCGTAGACCCGGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCTCTGACAGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAGGAGGCGGCTGAGCGGCTGTGCCCGCTGGTGGAGCACCTGCCCCGGGTGCTGCAGGAGTCTGAGAGACCCCTGCCCAGGGCAGCTCTGCACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCCCTGCTGGGCTGTGCCAAGGCAGAGTCTGGTCCAGCCAGCCTGACCATCTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCAGGACAGCCTGGCTACCACACCAGCCAGCAGCTCCATTGACAAGGCCGTGCAGCTGTTCCTGTGTGACCTGCTTCTTGTGGTGCGCACCAGCCTGTGGCGGCAGCAGCAGCCCCCGGCCCCGGCCCCAGCAGCCCAGGGCACCAGCAGCAGGCCCCAGGCTTCCGCCCTTGAGCTGCGTGGCTTCCAACGGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGGCTGGCACAGAGCTTCCGGCCCGCCATGCGGAGGGTGTTCCTACATGAGGCCACGGCCCGGCTGATGGCGGGGGCCAGCCCCACACGGACACACCAGCTCCTCGACCGCAGTCTGAGGCGGCGGGCAGGCCCCGGTGGCAAAGGAGGCGCGGTGGCGGAGCTGGAGCCGCGGCCCACGCGGCGGGAGCACGCGGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTACCTGCCCCCCGGCTTCCTGTCGGCGCCCGGGCAGCGCGTGGGCATGCTGGCTGAGGCGGCGCGCACACTCGAGAAGCTTGGCGATCGCCGGCTGCTGCACGACTGTCAGCAGATGCTCATGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAGACCCCGTGTCCCCGGCCTCAGCACCCCTGTCTCTAGCCACTTTGGTCCCGTGCAGCTTCTGTCCTGCGTCGAAGCTTTGAAGGCCGAAGGCAGTGCAAGAGACTCTGGCCTCCACAGTTCGACCTGCGGCTGCTGTGTGCCTTCGCGGTGGAAGGCCCGAGGGGCGCGATCTTGACCCTAAGACCGGCGGCCATGATGGTGCTGACCTCTGGTGGCCGATCGGGGCACTGCAGGGGCCGAGCCATTTTGGGGGGCCCCCCTCCTTGCTCTGCAGGCACCTTAGTGGCTTTTTTCCTCCTGTGTACAGGGAAGAGAGGGGTACATTTCCCTGTGCTGACGGAAGCCAACTTGGCTTTCCCGGACTGCAAGCAGGGCTCTGCCCCAGAGGCCTCTCTCTCCGTCGTGGGAGAGAGACGTGTACATAGTGTAGGTCAGCGTGCTTAGCCTCCTGACCTGAGGCTCCTGTGCTACTTTGCCTTTTGCAAACTTTATTTTCATAGATTGAGAAGTTTTGTACAGAGAATTAAAAATGAAATTATTTATAATCTGGGTTTTGTGTCTTCAGCTGATGGATGTGCTGACTAGTGAGAGTGCTTGGGCCCTCCCCCAGCACCTAGGGAAAGGCTTCCCCTCCCCCTCCGGCCACAAGGTACACAACTTTTAACTTAGCTCTTCCCGATGTTTGTTTGTTAGTGGGAGGAGTGGGGAGGGCTGGCTGTATGGCCTCCAGCCTACCTGTTCCCCCTGCTCCCAGGGCACATGGTTGGGCTGTGTCAACCCTTAGGGCCTCCATGGGGTCAGTTGTCCCTTCTCACCTCCCAGCTCTGTCCCCATCAGGTCCCTGGGTGGCACGGGAGGATGGACTGACTTCCAGGACCTGTTGTGTGACAGGAGCTACAGCTTGGGTCTCCCTGCAAGAAGTCTGGCACGTCTCACCTCCCCCATCCCGGCCCCTGGTCATCTCACAGCAAAGAAGCCTCCTCCCTCCCGACCTGCCGCCACACTGGAGAGGGGGCACAGGGGCGGGGGAGGTTTCCTGTTCTGTGAAAGGCCGACTCCCTGACTCCATTCATGCCCCCCCCCCCAGCCCCTCCCTTCATTCCCATTCCCCAACCTAAAGCCTGGCCCGGCTCCCAGCTGAATCTGGTCGGAATCCACGGGCTGCAGATTTTCCAAAACAATCGTTGTATCTTTATTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGAATGCAATGACTGTTTTTTACTCTTAAGGAAAATAAACATCTTTTAGAAACAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:29)
[0192] SREBF1同种型b的氨基酸序列(GenBank登录号NP_004167.3)如下所述。
[0193] MDEPPFSEAALEQALGEPCDLDAALLTDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDPPYAGSGAGGTDPASPDTSSPGSLSPPPATLSSSLEAFLSGPQAAPSPLSPPQPAPTPLKMYPSMPAFSPGPGIKEESVPLSILQTPTPQPLPGALLPQSFPAPAPPQFSSTPVLGYPSPPGGFSTGSPPGNTQQPLPGLPLASPPGVPPVSLHTQVQSVVPQQLLTVTAAPTAAPVTTTVTSQIQQVPVLLQPHFIKADSLLLTAMKTDGATVKAAGLSPLVSGTTVQTGPLPTLVSGGTILATVPLVVDAEKLPINRLAAGSKAPASAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIIELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLSLRTAVHKSKSLKDLVSACGSGGNTDVLMEGVKTEVEDTLTPPPSDAGSPFQSSPLSLGSRGSGSGGSGSDSEPDSPVFEDSKAKPEQRPSLHSRGMLDRSRLALCTLVFLCLSCNPLASLLGARGLPSPSDTTSVYHSPGRNVLGTESRDGPGWAQWLLPPVVWLLNGLLVLVSLVLLFVYGEPVTRPHSGPAVYFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALRALGRPLPTSHLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLQQDCALRVDASASARDAALVYHKLHQLHTMGKHTGGHLTATNLALSALNLAECAGDAVSVATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPPAMQWLCHPVGHRFFVDGDWSVLSTPWESLYSLAGNPVDPLAQVTQLFREHLLERALNCVTQPNPSPGSADGDKEFSDALGYLQLLNSCSDAAGAPAYSFSISSSMATTTGVDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLCPLVEHLPRVLQESERPLPRAALHSFKAARALLGCAKAESGPASLTICEKASGYLQDSLATTPASSSIDKAVQLFLCDLLLVVRTSLWRQQQPPAPAPAAQGTSSRPQASALELRGFQRDLSSLRRLAQSFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPTRTHQLLDRSLRRRAGPGGKGGAVAELEPRPTRREHAEALLLASCYLPPGFLSAPGQRVGMLAEAARTLEKLGDRRLLHDCQQMLMRLGGGTTVTSS(SEQ ID NO:30)
[0194] SREBF1同种型b(GenBank登录号NM_004176.4)的核酸序列或mRNA序列如下所述。
[0195] AGCAGAGCTGCGGCCGGGGGAACCCAGTTTCCGAGGAACTTTTCGCCGGCGCCGGGCCGCCTCTGAGGCCAGGGCAGGACACGAACGCGCGGAGCGGCGGCGGCGACTGAGAGCCGGGGCCGCGGCGGCGCTCCCTAGGAAGGGCCGTACGAGGCGGCGGGCCCGGCGGGCCTCCCGGAGGAGGCGGCTGCGCCATGGACGAGCCACCCTTCAGCGAGGCGGCTTTGGAGCAGGCGCTGGGCGAGCCGTGCGATCTGGACGCGGCGCTGCTGACCGACATCGAAGACATGCTTCAGCTTATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTATTTGACCCACCCTATGCTGGGAGTGGGGCAGGGGGCACAGACCCTGCCAGCCCCGATACCAGCTCCCCAGGCAGCTTGTCTCCACCTCCTGCCACATTGAGCTCCTCTCTTGAAGCCTTCCTGAGCGGGCCGCAGGCAGCGCCCTCACCCCTGTCCCCTCCCCAGCCTGCACCCACTCCATTGAAGATGTACCCGTCCATGCCCGCTTTCTCCCCTGGGCCTGGTATCAAGGAAGAGTCAGTGCCACTGAGCATCCTGCAGACCCCCACCCCACAGCCCCTGCCAGGGGCCCTCCTGCCACAGAGCTTCCCAGCCCCAGCCCCACCGCAGTTCAGCTCCACCCCTGTGTTAGGCTACCCCAGCCCTCCGGGAGGCTTCTCTACAGGAAGCCCTCCCGGGAACACCCAGCAGCCGCTGCCTGGCCTGCCACTGGCTTCCCCGCCAGGGGTCCCGCCCGTCTCCTTGCACACCCAGGTCCAGAGTGTGGTCCCCCAGCAGCTACTGACAGTCACAGCTGCCCCCACGGCAGCCCCTGTAACGACCACTGTGACCTCGCAGATCCAGCAGGTCCCGGTCCTGCTGCAGCCCCACTTCATCAAGGCAGACTCGCTGCTTCTGACAGCCATGAAGACAGACGGAGCCACTGTGAAGGCGGCAGGTCTCAGTCCCCTGGTCTCTGGCACCACTGTGCAGACAGGGCCTTTGCCGACCCTGGTGAGTGGCGGAACCATCTTGGCAACAGTCCCACTGGTCGTAGATGCGGAGAAGCTGCCTATCAACCGGCTCGCAGCTGGCAGCAAGGCCCCGGCCTCTGCCCAGAGCCGTGGAGAGAAGCGCACAGCCCACAACGCCATTGAGAAGCGCTACCGCTCCTCCATCAATGACAAAATCATTGAGCTCAAGGATCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCTGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTACATTCGCTTTCTGCAACACAGCAACCAGAAACTCAAGCAGGAGAACCTAAGTCTGCGCACTGCTGTCCACAAAAGCAAATCTCTGAAGGATCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGGAGGGAACACAGACGTGCTCATGGAGGGCGTGAAGACTGAGGTGGAGGACACACTGACCCCACCCCCCTCGGATGCTGGCTCACCTTTCCAGAGCAGCCCCTTGTCCCTTGGCAGCAGGGGCAGTGGCAGCGGTGGCAGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGACAGCAAGGCAAAGCCAGAGCAGCGGCCGTCTCTGCACAGCCGGGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTGGCCCTGTGCACGCTCGTCTTCCTCTGCCTGTCCTGCAACCCCTTGGCCTCCTTGCTGGGGGCCCGGGGGCTTCCCAGCCCCTCAGATACCACCAGCGTCTACCATAGCCCTGGGCGCAACGTGCTGGGCACCGAGAGCAGAGATGGCCCTGGCTGGGCCCAGTGGCTGCTGCCCCCAGTGGTCTGGCTGCTCAATGGGCTGTTGGTGCTCGTCTCCTTGGTGCTTCTCTTTGTCTACGGTGAGCCAGTCACACGGCCCCACTCAGGCCCCGCCGTGTACTTCTGGAGGCATCGCAAGCAGGCTGACCTGGACCTGGCCCGGGGAGACTTTGCCCAGGCTGCCCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCGGGCACTGGGCCGGCCCCTGCCCACCTCCCACCTGGACCTGGCTTGTAGCCTCCTCTGGAACCTCATCCGTCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTGGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCAGGGGGCCTGCAGCAGGACTGTGCTCTGCGAGTGGATGCTAGCGCCAGCGCCCGAGACGCAGCCCTGGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCACACCATGGGGAAGCACACAGGCGGGCACCTCACTGCCACCAACCTGGCGCTGAGTGCCCTGAACCTGGCAGAGTGTGCAGGGGATGCCGTGTCTGTGGCGACGCTGGCCGAGATCTATGTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAGACCAGTCTCCCACGGGCCTTGCATTTTCTGACACGCTTCTTCCTGAGCAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCCTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCCGTGGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGTCCGTGCTCAGTACCCCATGGGAGAGCCTGTACAGCTTGGCCGGGAACCCAGTGGACCCCCTGGCCCAGGTGACTCAGCTATTCCGGGAACATCTCTTAGAGCGAGCACTGAACTGTGTGACCCAGCCCAACCCCAGCCCTGGGTCAGCTGATGGGGACAAGGAATTCTCGGATGCCCTCGGGTACCTGCAGCTGCTGAACAGCTGTTCTGATGCTGCGGGGGCTCCTGCCTACAGCTTCTCCATCAGTTCCAGCATGGCCACCACCACCGGCGTAGACCCGGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCTCTGACAGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAGGAGGCGGCTGAGCGGCTGTGCCCGCTGGTGGAGCACCTGCCCCGGGTGCTGCAGGAGTCTGAGAGACCCCTGCCCAGGGCAGCTCTGCACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCCCTGCTGGGCTGTGCCAAGGCAGAGTCTGGTCCAGCCAGCCTGACCATCTGTGAGAAGGCCAGTGGGTACCTGCAGGACAGCCTGGCTACCACACCAGCCAGCAGCTCCATTGACAAGGCCGTGCAGCTGTTCCTGTGTGACCTGCTTCTTGTGGTGCGCACCAGCCTGTGGCGGCAGCAGCAGCCCCCGGCCCCGGCCCCAGCAGCCCAGGGCACCAGCAGCAGGCCCCAGGCTTCCGCCCTTGAGCTGCGTGGCTTCCAACGGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGGCTGGCACAGAGCTTCCGGCCCGCCATGCGGAGGGTGTTCCTACATGAGGCCACGGCCCGGCTGATGGCGGGGGCCAGCCCCACACGGACACACCAGCTCCTCGACCGCAGTCTGAGGCGGCGGGCAGGCCCCGGTGGCAAAGGAGGCGCGGTGGCGGAGCTGGAGCCGCGGCCCACGCGGCGGGAGCACGCGGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTACCTGCCCCCCGGCTTCCTGTCGGCGCCCGGGCAGCGCGTGGGCATGCTGGCTGAGGCGGCGCGCACACTCGAGAAGCTTGGCGATCGCCGGCTGCTGCACGACTGTCAGCAGATGCTCATGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAGACCCCGTGTCCCCGGCCTCAGCACCCCTGTCTCTAGCCACTTTGGTCCCGTGCAGCTTCTGTCCTGCGTCGAAGCTTTGAAGGCCGAAGGCAGTGCAAGAGACTCTGGCCTCCACAGTTCGACCTGCGGCTGCTGTGTGCCTTCGCGGTGGAAGGCCCGAGGGGCGCGATCTTGACCCTAAGACCGGCGGCCATGATGGTGCTGACCTCTGGTGGCCGATCGGGGCACTGCAGGGGCCGAGCCATTTTGGGGGGCCCCCCTCCTTGCTCTGCAGGCACCTTAGTGGCTTTTTTCCTCCTGTGTACAGGGAAGAGAGGGGTACATTTCCCTGTGCTGACGGAAGCCAACTTGGCTTTCCCGGACTGCAAGCAGGGCTCTGCCCCAGAGGCCTCTCTCTCCGTCGTGGGAGAGAGACGTGTACATAGTGTAGGTCAGCGTGCTTAGCCTCCTGACCTGAGGCTCCTGTGCTACTTTGCCTTTTGCAAACTTTATTTTCATAGATTGAGAAGTTTTGTACAGAGAATTAAAAATGAAATTATTTATAATCTGGGTTTTGTGTCTTCAGCTGATGGATGTGCTGACTAGTGAGAGTGCTTGGGCCCTCCCCCAGCACCTAGGGAAAGGCTTCCCCTCCCCCTCCGGCCACAAGGTACACAACTTTTAACTTAGCTCTTCCCGATGTTTGTTTGTTAGTGGGAGGAGTGGGGAGGGCTGGCTGTATGGCCTCCAGCCTACCTGTTCCCCCTGCTCCCAGGGCACATGGTTGGGCTGTGTCAACCCTTAGGGCCTCCATGGGGTCAGTTGTCCCTTCTCACCTCCCAGCTCTGTCCCCATCAGGTCCCTGGGTGGCACGGGAGGATGGACTGACTTCCAGGACCTGTTGTGTGACAGGAGCTACAGCTTGGGTCTCCCTGCAAGAAGTCTGGCACGTCTCACCTCCCCCATCCCGGCCCCTGGTCATCTCACAGCAAAGAAGCCTCCTCCCTCCCGACCTGCCGCCACACTGGAGAGGGGGCACAGGGGCGGGGGAGGTTTCCTGTTCTGTGAAAGGCCGACTCCCTGACTCCATTCATGCCCCCCCCCCCAGCCCCTCCCTTCATTCCCATTCCCCAACCTAAAGCCTGGCCCGGCTCCCAGCTGAATCTGGTCGGAATCCACGGGCTGCAGATTTTCCAAAACAATCGTTGTATCTTTATTGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGAATGCAATGACTGTTTTTTACTCTTAAGGAAAATAAACATCTTTTAGAAACAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:31)
[0196] SREBF1同种型c(GenBank登录号NM_001244003)的核酸序列或CDS如下所示。
[0197] ATGGACGAGCTGCCTTTCGGTGAGGCGGCTGTGGAACAGGCGCTGGACGAGCTGGGCGAACTGGACGCCGCACTGCTGACCGACATCCAAGACATGCTTCAGCTCATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTGTTTGATTCCCCCTATGCAGGGGGCGGGGCAGGAGACACAGAGCCCACCAGCCCTGGTGCCAACTCTCCTGAGAGCTTGTCTTCTCCTGCTTCCCTGGGTTCCTCTCTGGAAGCCTTCCTGGGGGAACCCAAGGCAACACCTGCATCCTTGTCCCCTGTGCCGTCTGCATCCACTGCTTTAAAGATGTACCCGTCTGTGCCCCCCTTCTCCCCTGGGCCTGGAATCAAAGAAGAGCCAGTGCCACTCACCATCCTGCAGCCCCCAGCAGCACAGCCATCACCAGGGACCCTCCTGCCTCCGAGTTTCCCTCCACCACCCCTGCAGCTCAGCCCGGCTCCTGTGCTGGGGTATTCTAGCCTTCCTTCAGGCTTCTCAGGGACCCTTCCTGGAAATACCCAACAGCCACCATCTAGCCTGTCACTGGCCTCTGCACCAGGAGTCTCGCCCATCTCTTTACACACCCAGGTCCAGAGCTCAGCCTCCCAGCAGCCACTGCCAGCCTCAACAGCCCCTAGAACAACCACTGTGACCTCACAGATCCAGCGGGTCCCAGTCGTACTGCAGCCACATTTCATCAAGGCAGATTCACTGCTACTGACAACTGTAAAAACAGATACAGGAGCCACGATGAAGACGGCTGGCATCAGTACCTTAGCCCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGGCCCCTTGCAGACCCTGGTGAGTGGTGGGACCATCCTGGCCACAGTACCATTGGTTGTGGATACAGACAAACTGCCCATCCATCGACTGGCAGCTGGCAGCAAGGCCCTGGGCTCAGCTCAGAGCCGTGGTGAGAAGCGCACAGCCCACAATGCCATTGAGAAGCGCTACCGTTCCTCTATCAATGACAAGATTGTGGAGCTCAAAGACCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCCGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTATATCCGCTTCTTACAGCACAGCAACCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGGCCCTGCGAAATGCCGCTCACAAAAGCAAATCCCTGAAGGACCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGCAGGAGGCACAGATGTGGCTATGGAGGGTGTGAAGCCTGAGGTGGTGGATACGCTGACCCCTCCACCCTCAGACGCTGGCTCGCCCTCCCAGAGTAGCCCCTTGTCCCTCGGCAGCAGAGGTAGCAGCAGTGGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGATAGCCAGGTGAAAGCCCAACGGCTGCACAGTCATGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTAGCCCTGTGTGCGCTGGTCTTCCTGTGTCTGACCTGCAACCCCTTGGCATCACTGTTTGGCTGGGGCATCCCCGGTCCCTCCAGTGCCTCTGGTGCACACCACAGCTCTGGGCGTAGCATGCTGGAGGCCGAGAGCAGAGATGGCTCTAATTGGACCCAGTGGTTGCTGCCACCCCTAGTCTGGCTGGCCAATGGACTACTAGTGTTGGCCTGCCTGGCTCTTCTCTTTGTCTATGGGGAACCTGTGACCCGGCCACACACTAGCCCAGCTGTACACTTCTGGAGACATCGCAAACAGGCTGACCTGGACTTGGCTCGGGGAGATTTTGCCCAGGCTGCTCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCAGGCATTGGGACGGCCCCTGCCCACCTCGAACCTAGACTTGGCCTGCAGCCTGCTTTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTTGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCTGGGGGCTTGCGGAGAGACTGTGGACTGAGAATGGATGCACGTGCCAGTGCTCGAGATGCGGCTCTCGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCATGCCATGGGCAAATACACAGGAGGGCACCTCATTGCTTCTAACCTGGCACTGAGTGCCCTGAACCTGGCCGAGTGCGCAGGAGATGCTGTATCCATGGCAACGCTGGCAGAGATCTATGTGGCTGCTGCCCTGAGGGTCAAGACCAGTCTCCCAAGAGCCTTGCACTTTTTGACACGTTTCTTCCTGAGTAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTAGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGGCTGTGCATGGTGCCCCACAGGAGAGCCTGTACAGCGTGGCTGGGAACCCAGTGGATCCCCTCGCCCAGGTGACTCGACTATTCTGCGAACATCTCTTGGAGAGAGCACTGAACTGTATTGCTCAACCCAGCCCGGGGACAGCTGATGGAGACAGGGAGTTCTCTGACGCACTTGGATACCTGCAGTTGCTAAATCGCTGCTCTGATGCTGTCGGGACTCCTGCCTGCAGCTTCTCTGTCAGCTCCAGCATGGCTTCCACCACCGGCACAGACCCAGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCACTGACGGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAAGAGGCAGCTGAGCGCCTATACCCGCTGGTAGAGCGTATGCCCCACGTGCTGCAGGAGACTGAGAGACCCCTGCCCAAGGCAGCTCTGTACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCTCTGCTGGACCACAGAAAAGTGGAGTCTGGCCCAGCCAGCCTGGCCATCTGTGAGAAGGCCAGCGGGTACTTGCGGGACAGCTTAGCCGCTCCACCAACTGGCAGCTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGATCTACTTCTTGTGGCCCGCACTAGTATGTGGCAGCGCCAGCAGTCACCAGCCTCAGCCCAGGTAGCTCACAGTGCCAGCAATGGATCTCAGGCCTCCGCTTTGGAGCTTCGAGGTTTCCAACAGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGCTTGGCACAGAACTTCCGGCCTGCTATGAGGAGAGTGTTCCTACACGAGGCCACAGCTCGGCTGATGGCAGGGGCAAGTCCTGCCCGGACACACCAGCTCCTGGACCGAAGTCTGCGGAGGCGGGCCGGCTCCAGTGGCAAAGGAGGCACTGTAGCTGAGCTGGAGCCTCGACCCACATGGCGGGAGCACACAGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTATCTGCCACCTGCCTTCCTGTCGGCCCCTGGACAGCAAATGAGCATGTTGGCTGAGGCAGCACGCACTGTAGAGAAGCTTGGTGATCATCGGCTACTGCTTGACTGCCAGCAGATGCTTCTGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAA(SEQ ID NO:32)
[0198] SREBF1同种型c(GenBank登录号NM_001244003)的核酸序列或mRNA序列如下所示。
[0199] CTCCTGCGAAGCCTGGCGGGCGCCGCCGCCATGGACGAGCTGCCTTTCGGTGAGGCGGCTGTGGAACAGGCGCTGGACGAGCTGGGCGAACTGGACGCCGCACTGCTGACCGACATCCAAGACATGCTTCAGCTCATCAACAACCAAGACAGTGACTTCCCTGGCCTGTTTGATTCCCCCTATGCAGGGGGCGGGGCAGGAGACACAGAGCCCACCAGCCCTGGTGCCAACTCTCCTGAGAGCTTGTCTTCTCCTGCTTCCCTGGGTTCCTCTCTGGAAGCCTTCCTGGGGGAACCCAAGGCAACACCTGCATCCTTGTCCCCTGTGCCGTCTGCATCCACTGCTTTAAAGATGTACCCGTCTGTGCCCCCCTTCTCCCCTGGGCCTGGAATCAAAGAAGAGCCAGTGCCACTCACCATCCTGCAGCCCCCAGCAGCACAGCCATCACCAGGGACCCTCCTGCCTCCGAGTTTCCCTCCACCACCCCTGCAGCTCAGCCCGGCTCCTGTGCTGGGGTATTCTAGCCTTCCTTCAGGCTTCTCAGGGACCCTTCCTGGAAATACCCAACAGCCACCATCTAGCCTGTCACTGGCCTCTGCACCAGGAGTCTCGCCCATCTCTTTACACACCCAGGTCCAGAGCTCAGCCTCCCAGCAGCCACTGCCAGCCTCAACAGCCCCTAGAACAACCACTGTGACCTCACAGATCCAGCGGGTCCCAGTCGTACTGCAGCCACATTTCATCAAGGCAGATTCACTGCTACTGACAACTGTAAAAACAGATACAGGAGCCACGATGAAGACGGCTGGCATCAGTACCTTAGCCCCTGGCACAGCCGTGCAGGCAGGCCCCTTGCAGACCCTGGTGAGTGGTGGGACCATCCTGGCCACAGTACCATTGGTTGTGGATACAGACAAACTGCCCATCCATCGACTGGCAGCTGGCAGCAAGGCCCTGGGCTCAGCTCAGAGCCGTGGTGAGAAGCGCACAGCCCACAATGCCATTGAGAAGCGCTACCGTTCCTCTATCAATGACAAGATTGTGGAGCTCAAAGACCTGGTGGTGGGCACTGAGGCAAAGCTGAATAAATCTGCCGTCTTGCGCAAGGCCATCGACTATATCCGCTTCTTACAGCACAGCAACCAGAAGCTCAAGCAGGAGAACCTGGCCCTGCGAAATGCCGCTCACAAAAGCAAATCCCTGAAGGACCTGGTGTCGGCCTGTGGCAGTGCAGGAGGCACAGATGTGGCTATGGAGGGTGTGAAGCCTGAGGTGGTGGATACGCTGACCCCTCCACCCTCAGACGCTGGCTCGCCCTCCCAGAGTAGCCCCTTGTCCCTCGGCAGCAGAGGTAGCAGCAGTGGTGGCAGTGACTCGGAGCCTGACAGCCCAGTCTTTGAGGATAGCCAGGTGAAAGCCCAACGGCTGCACAGTCATGGCATGCTGGACCGCTCCCGCCTAGCCCTGTGTGCGCTGGTCTTCCTGTGTCTGACCTGCAACCCCTTGGCATCACTGTTTGGCTGGGGCATCCCCGGTCCCTCCAGTGCCTCTGGTGCACACCACAGCTCTGGGCGTAGCATGCTGGAGGCCGAGAGCAGAGATGGCTCTAATTGGACCCAGTGGTTGCTGCCACCCCTAGTCTGGCTGGCCAATGGACTACTAGTGTTGGCCTGCCTGGCTCTTCTCTTTGTCTATGGGGAACCTGTGACCCGGCCACACACTAGCCCAGCTGTACACTTCTGGAGACATCGCAAACAGGCTGACCTGGACTTGGCTCGGGGAGATTTTGCCCAGGCTGCTCAGCAGCTGTGGCTGGCCCTGCAGGCATTGGGACGGCCCCTGCCCACCTCGAACCTAGACTTGGCCTGCAGCCTGCTTTGGAACCTCATCCGCCACCTGCTGCAGCGTCTCTGGGTTGGCCGCTGGCTGGCAGGCCGGGCTGGGGGCTTGCGGAGAGACTGTGGACTGAGAATGGATGCACGTGCCAGTGCTCGAGATGCGGCTCTCGTCTACCATAAGCTGCACCAGCTGCATGCCATGGGCAAATACACAGGAGGGCACCTCATTGCTTCTAACCTGGCACTGAGTGCCCTGAACCTGGCCGAGTGCGCAGGAGATGCTGTATCCATGGCAACGCTGGCAGAGATCTATGTGGCTGCTGCCCTGAGGGTCAAGACCAGTCTCCCAAGAGCCTTGCACTTTTTGACACGTTTCTTCCTGAGTAGTGCCCGCCAGGCCTGCCTGGCACAGAGTGGCTCAGTGCCTCTTGCCATGCAGTGGCTCTGCCACCCTGTAGGCCACCGTTTCTTCGTGGATGGGGACTGGGCTGTGCATGGTGCCCCACAGGAGAGCCTGTACAGCGTGGCTGGGAACCCAGTGGATCCCCTCGCCCAGGTGACTCGACTATTCTGCGAACATCTCTTGGAGAGAGCACTGAACTGTATTGCTCAACCCAGCCCGGGGACAGCTGATGGAGACAGGGAGTTCTCTGACGCACTTGGATACCTGCAGTTGCTAAATCGCTGCTCTGATGCTGTCGGGACTCCTGCCTGCAGCTTCTCTGTCAGCTCCAGCATGGCTTCCACCACCGGCACAGACCCAGTGGCCAAGTGGTGGGCCTCACTGACGGCTGTGGTGATCCACTGGCTGCGGCGGGATGAAGAGGCAGCTGAGCGCCTATACCCGCTGGTAGAGCGTATGCCCCACGTGCTGCAGGAGACTGAGAGACCCCTGCCCAAGGCAGCTCTGTACTCCTTCAAGGCTGCCCGGGCTCTGCTGGACCACAGAAAAGTGGAGTCTGGCCCAGCCAGCCTGGCCATCTGTGAGAAGGCCAGCGGGTACTTGCGGGACAGCTTAGCCGCTCCACCAACTGGCAGCTCCATTGACAAGGCCATGCAGCTGCTCCTGTGTGATCTACTTCTTGTGGCCCGCACTAGTATGTGGCAGCGCCAGCAGTCACCAGCCTCAGCCCAGGTAGCTCACAGTGCCAGCAATGGATCTCAGGCCTCCGCTTTGGAGCTTCGAGGTTTCCAACAGGACCTGAGCAGCCTGAGGCGCTTGGCACAGAACTTCCGGCCTGCTATGAGGAGAGTGTTCCTACACGAGGCCACAGCTCGGCTGATGGCAGGGGCAAGTCCTGCCCGGACACACCAGCTCCTGGACCGAAGTCTGCGGAGGCGGGCCGGCTCCAGTGGCAAAGGAGGCACTGTAGCTGAGCTGGAGCCTCGACCCACATGGCGGGAGCACACAGAGGCCTTGCTGCTGGCCTCCTGCTATCTGCCACCTGCCTTCCTGTCGGCCCCTGGACAGCAAATGAGCATGTTGGCTGAGGCAGCACGCACTGTAGAGAAGCTTGGTGATCATCGGCTACTGCTTGACTGCCAGCAGATGCTTCTGCGCCTGGGCGGTGGGACCACTGTCACTTCCAGCTAAACCTTGGATGGTCTCCCCAGTATTAGAGGCCCTTAAGGACCTTTGTCACTGGCTGTGGTCGTCCAGAGAGGGTGAGCCTGACAAGCAATCAGGATCATGCCGACCTCTAGTGACAAATCTAGAAATTGCAGAGGCTGCACTGGCCCAATGCCACCCTCTTGCTCTGTAGGCACCTTTTTCCTGTCCTATGGAAAGGAACCTTTCCCCTAGCTGAGGGCCACCCTGTCCTGAGGCTCTCACCCACTCCTGGAAGACTTGTATATAGTGTAGATCCAGCTGAGCCAGTTTCCTGTGCAGGCTCATGTACTACTTTAACTTTTGCAAACTTTATTTTCATAGGTTGAGAAATTTTGTACAGAAAATTAAAAAGTGAAATTATTTATA(SEQ ID NO:33)
[0200] SREBF1同种型c(GenBank登录号NM_001244003)的氨基酸序列如下所示。
[0201] MDELPFGEAAVEQALDELGELDAALLTDIQDMLQLINNQDSDFPGLFDSPYAGGGAGDTEPTSPGANSPESLSSPASLGSSLEAFLGEPKATPASLSPVPSASTALKMYPSVPPFSPGPGIKEEPVPLTILQPPAAQPSPGTLLPPSFPPPPLQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLSLASAPGVSPISLHTQVQSSASQQPLPASTAPRTTTVTSQIQRVPVVLQPHFIKADSLLLTTVKTDTGATMKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLALRNAAHKSKSLKDLVSACGSAGGTDVAMEGVKPEVVDTLTPPPSDAGSPSQSSPLSLGSRGSSSGGSDSEPDSPVFEDSQVKAQRLHSHGMLDRSRLALCALVFLCLTCNPLASLFGWGIPGPSSASGAHHSSGRSMLEAESRDGSNWTQWLLPPLVWLANGLLVLACLALLFVYGEPVTRPHTSPAVHFWRHRKQADLDLARGDFAQAAQQLWLALQALGRPLPTSNLDLACSLLWNLIRHLLQRLWVGRWLAGRAGGLRRDCGLRMDARASARDAALVYHKLHQLHAMGKYTGGHLIASNLALSALNLAECAGDAVSMATLAEIYVAAALRVKTSLPRALHFLTRFFLSSARQACLAQSGSVPLAMQWLCHPVGHRFFVDGDWAVHGAPQESLYSVAGNPVDPLAQVTRLFCEHLLERALNCIAQPSPGTADGDREFSDALGYLQLLNRCSDAVGTPACSFSVSSSMASTTGTDPVAKWWASLTAVVIHWLRRDEEAAERLYPLVERMPHVLQETERPLPKAALYSFKAARALLDHRKVESGPASLAICEKASGYLRDSLAAPPTGSSIDKAMQLLLCDLLLVARTSMWQRQQSPASAQVAHSASNGSQASALELRGFQQDLSSLRRLAQNFRPAMRRVFLHEATARLMAGASPARTHQLLDRSLRRRAGSSGKGGTVAELEPRPTWREHTEALLLASCYLPPAFLSAPGQQMSMLAEAARTVEKLGDHRLLLDCQQMLLRLGGGTTVTSS(SEQ ID NO:34)
[0202] 截短的SREBF1同种型c(GenBank登录号NM_001244003)(例如,SREB411)的核酸序列或mRNA序列如下所示。
[0203] atggacgagctgcctttcggtgaggcggctgtggaacaggcgctggacgagctgggcgaactggacgccgcactgctgaccgacatccaagacatgcttcagctcatcaacaaccaagacagtgacttccctggcctgtttgattccccctatgcagggggcggggcaggagacacagagcccaccagccctggtgccaactctcctgagagcttgtcttctcctgcttccctgggttcctctctggaagccttcctgggggaacccaaggcaacacctgcatccttgtcccctgtgccgtctgcatccactgctttaaagatgtacccgtctgtgccccccttctcccctgggcctggaatcaaagaagagccagtgccactcaccatcctgcagcccccagcagcacagccatcaccagggaccctcctgcctccgagtttccctccaccacccctgcagctcagcccggctcctgtgctggggtattctagccttccttcaggcttctcagggacccttcctggaaatacccaacagccaccatctagcctgtcactggcctctgcaccaggagtctcgcccatctctttacacacccaggtccagagctcagcctcccagcagccactgccagcctcaacagcccctagaacaaccactgtgacctcacagatccagcgggtcccagtcgtactgcagccacatttcatcaaggcagattcactgctactgacaactgtaaaaacagatacaggagccacgatgaagacggctggcatcagtaccttagcccctggcacagccgtgcaggcaggccccttgcagaccctggtgagtggtgggaccatcctggccacagtaccattggttgtggatacagacaaactgcccatccatcgactggcagctggcagcaaggccctgggctcagctcagagccgtggtgagaagcgcacagcccacaatgccattgagaagcgctaccgttcctctatcaatgacaagattgtggagctcaaagacctggtggtgggcactgaggcaaagctgaataaatctgccgtcttgcgcaaggccatcgactatatccgcttcttacagcacagcaaccagaagctcaagcaggagaacctggccctgcgaaatgccgctcacaaaagcaaatccctgaaggacctggtgtcggcctgtggcagtgcaggaggcacagatgtggctatggagggtgtg(SEQ ID NO:35)
[0204] 截短的SREBF1同种型c(GenBank登录号NM_001244003)(例如,SREB411)的氨基酸序列如下所示。
[0205] MDELPFGEAAVEQALDELGELDAALLTDIQDMLQLINNQDSDFPGLFDSPYAGGGAGDTEPTSPGANSPESLSSPASLGSSLEAFLGEPKATPASLSPVPSASTALKMYPSVPPFSPGPGIKEEPVPLTILQPPAAQPSPGTLLPPSFPPPPLQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLSLASAPGVSPISLHTQVQSSASQQPLPASTAPRTTTVTSQIQRVPVVLQPHFIKADSLLLTTVKTDTGATMKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLALRNAAHKSKSLKDLVSACGSAGGTDVAMEGV(SEQ ID NO:36)
[0206] 在一个实施方式中,LMM包含与SREBF1同种型的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:28、30、34或36)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%同一性,或者与SREBF1同种型的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:28、
30、34或36)具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。
[0207] 在一个实施方式中,LMM包含与SREBF1的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:34)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性,或者与SREBF1的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:34)具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。
[0208] 在另一个实施方式中,LMM包含SREBF1或其同种型的功能性片段,例如截短的SREBF1。在一个实施方式中,LMM包含SREBF1的功能性片段(例如,SEQ ID NO:1或34的功能性片段)或者SREBF1同种型的功能性片段(例如,SEQ ID NO:28、30或36)。在一个实施方式中,LMM包含SREBF1的功能性结构域,例如SREBF1的反式激活结构域。在一个实施方式中,LMM包含SREBF1的螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。在一个实施方式中,LMM包含能够转位进入细胞核和/或能够启动SREBF1靶基因转录的SREBF1的功能性片段。
[0209] 在一个实施方式中,LMM包含SREBF1的N-末端410个氨基酸(在本申请中也称为SREBF410),例如SEQ ID NO:1的氨基酸1-410。SREBF1的N-末端410个氨基酸的氨基酸序列如下所示:
[0210] MDELAFGEAALEQTLAEMCELDTAVLNDIEDMLQLINNQDSDFPGLFDAPYAGGETGDTGPSSPGANSPESFSSASLASSLEAFLGGPKVTPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGM(SEQ ID NO:26)
[0211] 在一个实施方式中,LMM包含与SREBF1的N-末端410个氨基酸的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:26)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性,或者与SREBF1的N-末端410个氨基酸的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:26)具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。
[0212] 在另一个实施方式中,LMM包含SREBF1的氨基酸91-410,例如SEQ ID NO:1的氨基酸91-410。SREBF1的91-410位氨基酸的氨基酸序列如下所示:MPAPLSPPPSAPAALKMYPSVSPFSPGPGIKEEPVPLTILQPAAPQPSPGTLLPPSFPAPPVQLSPAPVLGYSSLPSGFSGTLPGNTQQPPSSLPLAPAPGVLPTPALHTQVQSLASQQPLPASAAPRTNTVTSQVQQVPVVLQPHFIKADSLLLTAVKTDAGATVKTAGISTLAPGTAVQAGPLQTLVSGGTILATVPLVVDTDKLPIHRLAAGSKALGSAQSRGEKRTAHNAIEKRYRSSINDKIVELKDLVVGTEAKLNKSAVLRKAIDYIRFLQHSNQKLKQENLTLRSAHKSKSLKDLVSACGSGGGTDVSMEGM(SEQ ID NO:27)
[0213] 在一个实施方式中,LMM包含与SREBF1的91-410位氨基酸的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:27)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性,或者与SREBF1的91-410位氨基酸的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:27)具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。在一个实施方式中,LMM包含与编码SREBF1或其功能性片段的核酸序列(例如,编码氨基酸序列SEQ ID NO:1或其功能性片段)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在一个实施方式中,LMM包含与SEQ ID NO:2所示的核酸具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%同一性。
[0214] 在另一个实施方式中,LMM包含与SREBF2或其功能性片段具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性;或者与SREBF2或其功能性片段具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或
10个氨基酸残基的差异。
[0215] 在一个实施方式中,LMM包含酶。在一个实施方式中,LMM包含将饱和的脂肪酸转化为不饱和的脂肪酸的酶。在一个实施方式中,LMM包含将饱和的脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸(例如,具有一个双键的脂肪酸)的酶。在一个实施方式中,LMM包含将饱和的脂肪酸转化为多不饱和脂肪酸(例如,具有2、3、4、5个或更多个双键的脂肪酸)的酶。在一个实施方式中,LMM包含硬脂酰CoA去饱和酶1(SCD1)、硬脂酰CoA去饱和酶2(SCD2)、硬脂酰CoA去饱和酶3(SCD3)、硬脂酰CoA去饱和酶4(SCD4)、硬脂酰CoA去饱和酶5(SCD5)、其同种型或其功能性片段。
[0216] SCD1是负责将饱和的脂肪酸(SFA)转化为单不饱和脂肪酸(MUFA)的限速酶。由于研究将该基因的表达与细胞存活增加、增殖和肿瘤发生性质联系在一起,因而近年来SCD1受到越来越多的关注(Angelucci,Maulucci等,2015)(Igal 2011)。还证明了SCD1在细胞代谢率控制和整体脂肪生成中发挥关键作用。后者通过与主要生物合成途径调控因子乙酰-CoA羧化酶(ACC)的直接相互作用以及SFA向MUFA的转化来控制,由于已知SFA抑制ACC,因此促进酶的功能性以增加脂质生物合成(Igal 2010)。对SCD1的主要调控是通过转录激活实现的,其中转录因子(如SREBF1)与基因启动子区域中的SRE序列结合。内源性SCD1作为膜整合蛋白位于ER,在此处SCD1发挥其催化SFA向MUFA转化的酶功能。其将SFA转化为MUFA的作用(例如,上调MUFA与SFA的比值)能够调控脂筏结构域减少,这反而又能够增加膜的流动性。膜流动性和膜脂质组成的这种变化也可能在囊泡形成以及由此导致的细胞通讯和ER尺寸或形态(例如,ER扩张)方面具有影响。还证明了SCD1基因的敲减上调未折叠蛋白应答(Ariyama,Kono等,2010)。而且,SCD1负向调控细胞棕榈酸,其反过来又是ACC的强负向调控因子。SCD1还控制AMP活化蛋白激酶(AMPK)的磷酸化状态,从而降低其磷酸化的能力,并因此抑制ACC;ACC是脂质合成过程中的一种限速酶。最后,SFA去饱和阻止其聚集,这能够导致细胞死亡。因此,SCD1的调节导致脂质生物合成、细胞存活和增殖速率增加。(Hagen,Rodriguez-Cuenca等),(Scaglia,Chisholm等,2009)。
[0217] 在一个实施方式中,LMM包含SCD1。SCD1的氨基酸序列如下所述:MPAHMLQEISSSYTTTTTITAPPSGNEREKVKTVPLHLEEDIRPEMKEDIHDPTYQDEEGPPPKLEYVWRNIILMVLLHLGGLYGIILVPSCKLYTCLFGIFYYMTSALGITAGAHRLWSHRTYKARLPLRIFLIIANTMAFQNDVYEWARDHRAHHKFSETHADPHNSRRGFFFSHVGWLLVRKHPAVKEKGGKLDMSDLKAEKLVMFQRRYYKPGLLLMCFILPTLVPWYCWGETFVNSLFVSTFLRYTLVLNATWLVNSAAHLYGYRPYDKNIQSRENILVSLGAVGEGFHNYHHTFPFDYSASEYRWHINFTTFFIDCMAALGLAYDRKKVSKATVLARIKRTGDGSHKSS(SEQ ID NO:3)
[0218] SCD1的核苷酸序列如下所述:
[0219] atgccggcccacatgctccaagagatctccagttcttacacgaccaccaccaccatcactgcacctccctccggaaatgaacgagagaaggtgaagacggtgcccctccacctggaagaagacatccgtcctgaaatgaaagaagatattcacgaccccacctatcaggatgaggagggacccccgcccaagctggagtacgtctggaggaacatcattctcatggtcctgctgcacttgggaggcctgtacgggatcatactggttccctcctgcaagctctacacctgcctcttcgggattttctactacatgaccagcgctctgggcatcacagccggggctcatcgcctctggagccacagaacttacaaggcacggctgcccctgcggatcttccttatcattgccaacaccatggcgttccagaatgacgtgtacgaatgggcccgagatcaccgcgcccaccacaagttctcagaaacacacgccgaccctcacaattcccgccgtggcttcttcttctctcacgtgggttggctgcttgtgcgcaaacacccggctgtcaaagagaagggcggaaaactggacatgtctgacctgaaagccgagaagctggtgatgttccagaggaggtactacaagcccggcctcctgctgatgtgcttcatcctgcccacgctggtgccctggtactgctggggcgagacttttgtaaacagcctgttcgttagcaccttcttgcgatacactctggtgctcaacgccacctggctggtgaacagtgccgcgcatctctatggatatcgcccctacgacaagaacattcaatcccgggagaatatcctggtttccctgggtgccgtgggcgagggcttccacaactaccaccacaccttccccttcgactactctgccagtgagtaccgctggcacatcaacttcaccacgttcttcatcgactgcatggctgccctgggcctggcttacgaccggaagaaagtttctaaggctactgtcttagccaggattaagagaactggagacgg gagtcacaagagtagctga(SEQ ID NO:4)
[0220] 在一个实施方式中,LMM包含与SCD1(例如,SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性;或者与SCD1(例如,SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。在一个实施方式中,LMM包含SCD1的功能性片段,例如SEQ ID NO:3的功能性片段。
[0221] 在一个实施方式中,LMM包含与编码SCD1或其功能性片段的核酸序列(例如,编码氨基酸序列SEQ ID NO:3或其功能性片段)具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在一个实施方式中,LMM包含与SEQ ID NO:4的核酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
[0222] 在另一个实施方式中,LMM包含与SCD2、SCD3、SCD4、SCD5或其功能性片段的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性;或者与SCD2、SCD3、SCD4、SCD5或其功能性片段的氨基酸序列具有1、2或3个或更多个氨基酸残基但不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基的差异。在另一个实施方式中,LMM包含至少
[0223] 在另一个实施方式中,LMM包含SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD5的功能性片段,例如截短的SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD5。在一个实施方式中,LMM包含SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD5的功能性片段,例如SEQ ID NO:3的功能性片段。在一个实施方式中,LMM包含SCD1、SCD2、SCD3、SCD4或SCD5的功能性结构域,例如具有将饱和的脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的酶活性的结构域。
[0224] 在两条或更多条氨基酸或核酸序列背景下的同一性百分比指相同的两条或更多条序列。当通过使用下述序列比较算法或通过人工比对和目测检查进行测量,在比较窗或指定区域针对最大对应进行比较和比对时,在指定区域或当未指定时在整个序列,如果两条序列具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(例如,60%同一性,任选地70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、
86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性),则两条序列是“基本上相同的”。在一些实施方式中,比对可以导致空位或插入序列,其中可以针对空位或插入序列翼侧的特定区域确定序列相似性,或者可以跨过包含空位或插入序列的区域确定序列相似性。任选地,同一性存在于长度至少约50个氨基酸或核苷酸、
100个氨基酸或核苷酸、150个氨基酸或核苷酸的区域内。更优选地,同一性存在于长度约
200个或更多个氨基酸或核苷酸,或者约500个或1000个或更多个氨基酸或核苷酸的区域内。
[0225] 为了进行序列比较,通常将一条序列作为参照序列,将其与一条或多条待测序列进行比较。当使用序列比较算法时,将待测序列和对照序列输入计算机,如有必要,指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数,也可以指定替代参数。然后,序列比较算法基于程序参数计算待测序列相对于参照序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法,通过Needleman和Wunsch,(1970)
J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’
l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性检索方法,通过计算机化实施这些算法(威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)或者通过人工比对或目测检查(参见例如,Brent等,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)进行用于比较的最佳序列比对。可以通过诸如
ClustalW、Clustal Omega和MAFFT的算法进行多重序列比对。用于比较两条或更多条序列之间关系的其他算法包括隐尔科夫(Hidden Markov)模型。隐马尔科夫模型是描述特定核苷酸(或氨基酸)类型跟随另一个(概率路径被隐藏)的概率的模型。其实际上是一个概率模型而不是算法。算法(或实现算法的程序)的实例可以是HMMER(http://hmmer.org/)。
[0226] 适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法,分别在Altschul等,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402;和Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中对其进行了描述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。
[0227] 产品
[0228] 本申请提供了用于工程化或制备能够生产高产率的产品和/或改善产品质量的细胞或无细胞表达系统的方法和组合物。本申请所述的产品包括多肽,例如重组蛋白;核酸分子,例如DNA或RNA分子;多聚体蛋白或复合物;包封脂质的颗粒,例如病毒样颗粒、囊泡或外来体;或其他分子,例如脂质。在一个实施方式中,产品是多肽,例如重组多肽。在一个实施方式中,产品是外来体。例如,重组多肽可以是难于表达的蛋白或具有复杂的和/或非天然结构的蛋白,如新一代生物制品,例如双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白。
[0229] 在实施方式中,由本申请所述的方法或组合物产生的细胞或细胞系生产可用于治疗医学病况、病症或疾病的产品(例如,重组多肽)。医学病况、病症或疾病的实例包括但不限于代谢疾病或病症(例如,代谢酶缺乏)、内分泌病症(例如,激素缺乏)、止血失调、血栓形成、造血障碍、病、胃肠道病症、自身免疫性疾病、免疫失调(例如,免疫缺陷)、不孕症、移植、癌症和感染性疾病。
[0230] 在实施方式中,产品是外源性蛋白,例如不是由细胞天然表达的蛋白。在一个实施方式中,蛋白来自一个物种,而细胞来自不同物种。在另一个实施方式中,蛋白是非天然存在的蛋白。
[0231] 在其他实施方式中,产品是由细胞内源性表达的蛋白。在一个实施方式中,产品是由细胞以内源性或天然水平内源性表达的蛋白。本申请所述的方法和组合物用于增加内源性产品(例如,由细胞天然产生的天然存在的产品)的生产和质量。在另一个实施方式中,将编码产品(例如,蛋白)的外源性核酸引入细胞并由细胞表达。在另一个实施方式中,将外源性核酸引入细胞,所述外源性核酸增加由细胞内源性表达的产品的表达。举例来说,外源性核酸包含活化控制细胞内源性产品表达的启动子(例如,SRF启动子序列,参见例如The transcription factor Ap-1 regulates monkey 20α-hydroxysteroid dehydrogenase promoter activity in CHO cells.Nanjidsuren T,Min KS.BMC Biotechnol.2014Jul 30;14:71.doi:10.1186/1472-6750-14-71.PMID:25073972)的序列。
[0232] 重组产品可以是治疗性产品或诊断性产品,例如用于药物筛选。治疗性或诊断性产品可以包括但不限于抗体分子,例如抗体或抗体片段、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、受体蛋白、治疗性肽或者这些中任意一个的结构和/或功能片段或杂合体。在其他实施方式中,治疗性或诊断性产品是合成多肽,例如其中整个多肽或其部分不衍生自或与任何天然存在的多肽(例如,上文所述的天然存在的多肽)具有任何序列或结构相似性。
[0233] 在一个实施方式中,重组产品是抗体分子。在一个实施方式中,重组产品是治疗性抗体分子。在另一个实施方式中,重组产品是诊断性抗体分子,例如用于成像技术或诊断检测的单克隆抗体。
[0234] 如在本申请中所使用的,抗体分子是来自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。在一个实施方式中,抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白可以是多克隆或单克隆、多链或单链或者完整的免疫球蛋白,并且其可以来自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方式中,抗体是单克隆抗体。抗体可以是人源或人源化抗体。在一个实施方式中,抗体是IgA、IgG、IgD或IgE抗体。在一个实施方式中,抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
[0235] “抗体片段”指完整抗体的至少一部分或者其重组变体,以及指抗原结合结构域(例如,完整抗体的抗原决定可变区),其足以赋予抗体片段与靶点(如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体(如包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段)以及抗体分离的CDR或其他表位结合片段。还可以将抗原结合片段引入单域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双体、三体、四体、v-NAR和双-scFv(参见例如,Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植入基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号:6,703,199,其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。
[0236] 可以使用本申请所述的方法生产的示例性重组产品包括但不限于下表中提供的那些。
[0237] 表2:示例性重组产品
[0238]
[0239]
[0240] 表3:附加的示例性重组产品:双特异性形式
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246] 在一个实施方式中,产品有不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基不同于表2或表3中的多肽。在另一个实施方式中,产品有不超过1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或15%的其氨基酸残基不同于表2或表3中的多肽。
[0247] 在一个实施方式中,产品是核酸分子,例如DNA或RNA分子或者其杂合体。在一个实施方式中,产品是折纸(origami)核酸分子,例如折纸DNA,其中核酸分子具有预先确定的二级、三级或四级结构。在一个实施方式中,折纸核酸分子具有功能性活性。在一个实施方式中,产品包含包封在质膜中的折纸核酸分子。在一个实施方式中,质膜包含来自产生其的宿主细胞的细胞膜或细胞膜的组分。在一个实施方式中,脂质包封的DNA是如在“Cloaked DNA nanodevices survive pilot mission”中所述的,2014年04月22日,见哈佛大学怀斯生物启发工程研究所网站
[0248] 其他重组产品包括非抗体支架或者替代蛋白支架,例如但不限于:DARPin、亲和体和adnectin。
[0249] 其他示例性治疗性或诊断性蛋白包括但不限于Leader等,“Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39的表1-10中所述的和Walsh,“Biopharmaceutical 
benchmarks 2014”,Nature Biotechnology,2014,32:992-1000所述的(分别通过引用并入本申请)任何蛋白;或者本申请所述重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能性片段。
[0250] 核酸
[0251] 本申请还提供了编码本申请所述的脂质代谢调节剂和重组产品的核酸(例如,外源性核酸)。可以使用本领域公知的重组方法获得编码所需LMM或重组产品(例如,重组多肽)的核酸序列,例如使用标准技术筛选来自表达所需核酸序列(例如,基因)的细胞的文库,从已知含有其的载体衍生核酸序列,或者从含有其的细胞和组织直接分离。或者,可以合成而非克隆生产编码LMM或重组多肽的核酸。重组DNA技术是非常先进的并且在本领域中已很好地建立。因此,具有本申请所述重组多肽的氨基酸序列知识的普通技术人员能够容易地设想或得出将编码LMM或重组多肽的核酸序列。
[0252] 编码LMM SREBF1和SCD1的示例性核酸序列在本申请中分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0253] 所需多肽(例如,LMM或重组多肽)的表达通常通过将编码所需多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接,并将构建体引入表达载体实现。载体能够适于复制和整合至真核细胞或原核细胞。典型的克隆载体含有其他调控元件,如用于调控或鉴定所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列、启动子、选择标记物或标签。
[0254] 可以将编码LMM或重组多肽的核酸序列克隆进入多种类型的载体。例如,可以将核酸序列克隆进入包括但不限于下述的载体:质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。在实施方式中,可以以病毒载体形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且参见例如Sambrook等,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY,以及其他病毒学和分子生物学手册。作为载体使用的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。在通常情况下,适宜的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制原点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一种或多种选择性标记物(例如,WO 01/96584;WO 01/29058;以及美国专利号6,326,193)。来自病毒的载体是实现长期基因转移的适宜工具,因为其能够在子代细胞中长期、稳定地整合转基因以及繁殖。
[0255] 在本申请所述的任何实施方式中,载体还可以包含下述中的一种或多种:促进分泌的信号序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止子(例如,来自生长激素(BGH)基因)、能够使得进行游离型复制和在原核细胞中复制的元件(例如,SV40原点和ColE1或本领域公知的其他元件)和/或能够进行选择的元件(例如,选择标记物或报告基因)。
[0256] 在一个实施方式中,包含编码多肽(例如,LMM或重组多肽)的核酸序列的载体还包含负责募集聚合酶以使得多肽(例如,LMM或重组多肽)的表达能够转录起始的启动子序列。在一个实施方式中,适于本申请所述方法的启动子序列通常与增强子结合以驱动更大量的转录并因此递送更多个拷贝的靶外源性mRNA。在一个实施方式中,启动子包括巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(Xia,Bringmann等,2006)和SV40启动子(Chernajovsky,
Moryetal.1984),其均来自其同名病毒或来源于其的启动子。在引入表达载体后,一些不太常见的病毒启动子也成功驱动了转录,所述启动子包括劳氏肉瘤病毒长末端重复序列(RSV-LTR)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)
[0257] (Papadakis,Nicklinetal.2004)。在另一个实施方式中,可以使用特定内源性哺乳动物启动子以驱动目标基因的组成型转录(Pontiller,Grossetal.2008)。替代基于病毒的序列的CHO特异性中国仓鼠延伸因子1-α(CHEF1α)启动子提供了较高的产率(Deer,Allison2004)。
[0258] 适于在非哺乳动物细胞(例如,真菌、昆虫和植物细胞)中表达的其他启动子也是本领域公知的。用于在真菌或酵母宿主细胞中指引转录的适宜启动子的实例包括但不限于来自下述真菌基因的启动子:里氏木霉甲醇诱导的醇氧化酶(AOX启动子)、构巢曲霉色氨酸生物合成(trpC启动子)、黑曲霉泡盛变种葡糖淀粉酶(glaA)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、乳酸克鲁维酵母Plac4-PBI启动子,或者在PCT公开号WO 2005/100573中描述的那些。用于在昆虫细胞中指引转录的适宜启动子的实例包括但不限于T7lac启动子和多体蛋白启动子。用于在植物细胞中指引转录的适宜启动子的实例包括但不限于花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S。在原核宿主细胞(例如,细菌细胞)中指引本发明的核酸构建体转录的适宜启动子的实例是来自大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌tac启动子(杂合启动子,DeBoer等,PNAS,1983,80:21-25)、大肠杆菌recA、大肠杆菌araBAD、大肠杆菌tetA和原核β-内酰胺酶的启动子。适宜启动子的其他实例包括病毒启动子,如来自噬菌体的启动子,包括T7启动子、T5启动子、T3启动子、M13启动子和SP6启动子。
[0259] 除了启动子以外,本申请所述的载体还可以包含上文所述的增强子;靠近核心启动子的一个特定核苷酸基序区,该区域能够募集转录因子以上调转录速率(Riethoven 2010)。与启动子序列类似,这些区域通常来自病毒并且包含在启动子序列内,如hCMV和SV40增强子序列,或者可以附加地包括如来源于腺病毒的序列(Gaillet,Gilbert等,
2007)。
[0260] 在一个实施方式中,包含编码本申请所述的多肽(例如,LMM或重组产品)的核酸序列的载体还含有选择标记物的核酸序列。在一个实施方式中,选择性标记物包括谷氨酰胺合成酶(GS);二氢叶酸还原酶(DHFR),例如赋予对甲氨蝶呤(MTX)抗性的酶;或抗生素标记物,例如赋予对诸如潮霉素、新霉素(G418)、博来霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素的抗生素抗性的酶。
[0261] 在一个实施方式中,包含编码本申请所述的重组产品的核酸序列的载体含有选择标记物以用于鉴定含有编码本申请所述的重组产品的核酸的细胞。在另一个实施方式中,选择标记用于鉴定或选择如本申请所述的包含将编码重组产品的核酸序列整合至基因组的细胞。可以将对已整合了编码重组蛋白的核酸序列的细胞的鉴定用于选择和工程化改造稳定表达产品的细胞。
[0262] 在一个实施方式中,包含编码本申请所述LMM的核酸序列的载体含有编码LMM的核酸序列的位点特异性整合机制。例如,载体与Flp-InTM系统相容并且包含两个FRT位点(含有特定核苷酸序列),其在Flp重组酶存在的情况下,指示所需序列(例如,编码LMM的核酸序列)在Flp-In细胞(例如,Flp-In CHO细胞)基因组中存在的所需位点(例如,在两个FRT位点之间)的重组和随后的整合。用于编码所需产品的核酸位点特异性整合的其他系统是本领域公知的,例如Cre-lox重组酶系统,或CRISPR/CAS-介导的策略。
[0263] 供使用的适宜载体是市售的,并且包括与GS表达系统TM、GS XceedTM基因表达系统或可从Lonza Biologics,Inc获得的 CHOK1SV技术相关的载体,例如pCon载体。其他载体包括但不限于其他市售的载体,如pcDNA3.1/Zeo、pcDNA3.1/CAT、
pcDNA3.3TOPO(Thermo Fisher此前为Invitrogen);pTarget,HaloTag(Promega);pUC57(GenScript);pFLAG-CMV(Sigma-Aldrich);pCMV6(Origene);或pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B(Stratagene)。
[0264] 细胞和细胞培养
[0265] 在一个方面中,本公开内容涉及用于工程化或制备生产产品(例如,如本申请所述的重组多肽)的细胞或细胞系的方法和组合物。在另一个方面中,本公开内容涉及用于工程化或制备改善的(例如,具有增加的生产力和产品质量)细胞或细胞系的方法和组合物。例如,在本申请的“脂质代谢的调节”章节中描述了与改善的生产力和产品质量相关的特征。
[0266] 在实施方式中,细胞是哺乳动物或非哺乳动物细胞,例如昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、古细菌细胞(例如,来自古细菌物种的细胞)或细菌细胞。在一个实施方式中,细胞来自人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、犬、鸭、鹦鹉、貂、鱼或猫。在一个实施方式中,细胞是动物细胞。在实施方式中,细胞是哺乳动物细胞,例如人细胞或啮齿动物细胞,例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在一个实施方式中,细胞是原核细胞,例如细菌细胞。在一个实施方式中,细胞是一种放线菌(例如,结核分枝杆菌)细胞。
[0267] 在一个实施方式中,细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中,细胞是CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GS-KO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO来源的细胞。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1 SV(Lonza Biologics,Inc.)。
[0268] 在另一个实施方式中,细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS(例如,COS1和COS7)、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV(FUT8-KO)、CHO GSKO、Exceed(CHOK1SV GS-KO)、CHO-S、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN或CHO来源的细胞或者来源于其的任何细胞。在一个实施方式中,细胞是干细胞。在一个实施方式中,细胞是由本申请所述的任何细胞分化的。在一个实施方式中,细胞是来自培养的任何原代细胞的细胞。
[0269] 在一个实施方式中,细胞是生产产品(例如,本申请所述的产品)的本申请所述的任意一种细胞。在一个实施方式中,细胞是本申请所述的任意一种细胞,所述细胞包含编码重组多肽(例如,表达重组多肽,例如选自表2或3的重组多肽)的外源性核酸。
[0270] 在一个实施方式中,细胞培养是以批量培养、加料批量培养、抽吸和填充培养或连续培养的形式进行的。在一个实施方式中细胞是贴壁培养。在一个实施方式中,细胞培养是悬浮培养。在一个实施方式中,将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽,例如置于模型生物或人类对象中。
[0271] 在一个实施方式中,培养基不含血清。
[0272] 针对哺乳动物细胞系的其他适宜培养基和培养方法是本领域熟知的,例如如在美国专利号5,633,162中所描述的。用于实验室培养瓶或低密度细胞培养并适于特定细胞类型需求的标准细胞培养基的实例例如:Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre,G.,The Journal of the American Medical Association,199,p.519f.1967)、L-15培养基(Leibovitz,A.等,Amer.J.of Hygiene,78,1p.173ff,1963)、经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Eagle最低必需培养基(MEM)、Ham F12培养基(Ham,R.等,Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288 ff.1965)或缺乏白蛋白、转蛋白和卵磷脂的经Iscoves改良的DMEM(Iscoves等,J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如,专为培养CHO细胞而设计的Ham F10或F12培养基。在EP-481 791中描述了特别适于CHO细胞培养的其他培养基。其他适宜的培养方法是本领域技术人员公知的并且其可能取决于重组多肽产品和所使用的宿主细胞。本领域普通技术人员能够确定或优化适于由细胞表达的产品(例如,重组多肽)的表达和生产的适宜条件。
[0273] 工程化改造细胞和生产产品的方法
[0274] 可以将本申请所述的方法和组合物用于工程化改造细胞或细胞系,以使其具有改善的生产力和改进的产品质量。在实施方式中,对细胞进行修饰,以使得对细胞的脂质代谢进行调节。例如,将编码LMM的外源性核酸引入细胞。随后在适于LMM表达以及LMM介导的脂质代谢调节的条件下培养细胞。例如,在本申请的“脂质代谢的调节”章节中描述了其脂质代谢被调节的细胞的性质。
[0275] 在一些实施方式中,细胞还包含编码产品(例如,重组多肽)的外源性核酸。在另一个实施方式中,细胞还包含增加内源性产品表达的外源性核酸。在任意此类实施方式中,在调节脂质代谢(例如,引入编码本申请所述LMM的外源性核酸)之前,引入编码产品或增加内源性产品表达的外源性核酸。或者,在其他实施方式中,在调节脂质代谢(例如,引入编码本申请所述LMM的外源性核酸)之后,引入编码产品或增加内源性产品表达的外源性核酸。在任意实施方式中,产品是治疗性或诊断性蛋白。在任意实施方式中,产品选自表2或表3。
[0276] 用于基因修饰或工程化改造细胞以表达所需多肽或蛋白(例如,本申请所述的LMM或本申请所述的产品)的方法是本领域熟知的,并且包括例如转染、转导(例如,病毒转导)或电穿孔。
[0277] 用于将核酸(例如,本申请所述的外源性核酸或载体)导入宿主细胞的物理方法包括磷酸沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于生产包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如,Sambrook等,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。
[0278] 用于将核酸(例如,本申请所述的外源性核酸或载体)导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统,如大分子复合物、纳米囊、微球、小珠和基于脂质的系统,包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如,人工膜囊泡)。可以使用现有技术中靶向递送核酸的其他方法,如使用靶向的纳米粒子或其他适宜的亚微米级递送系统递送多核苷酸。
[0279] 将含有所需多肽(例如,本申请所述的LMM和/或产品)序列的核酸递送进入细胞并且能够通过重组将其整合至其基因组。然后,所得到的重组细胞能够稳定表达所需多肽(例如,本申请所述的LMM和/或产品),从而能够长时间地一致和有效地进行蛋白生产。伴随目标基因稳定整合的若干优点包括这样的事实:仅需要单一DNA递送过程诱导延长的表达,因为目标基因与宿主染色体同时复制;这意味着基因从一代转移到下一代,而无需额外的机械装置。理论上,这在发酵的不同批次之间产生更一致的产品和产率。与此一致,与无调节本申请所述脂质代谢的修饰(例如,引入编码LMM的外源性核酸)产生的那些相比,稳定表达的方法能够产生较高的产品产率。
[0280] 建立稳定过表达所需多肽(例如,本申请所述的LMM和/或产品)的重组细胞系的方案通常涉及通过随机重组在随机位点将线形化DNA(通常是基于质粒)整合至宿主基因组。还开发并实施了位点特异性方案,其促进在宿主基因组的特定区域整合表达盒(O'Gorman,Fox等,1991)。这些方案通常利用能够进行位点特异性重组的重组酶,包括但不限于Flp-TM
In 系统(例如,Flp-In CHO细胞)、CHOK1SV Flp细胞系(Lonza)(如在Zhang L等,(2015).Biotechnol.Prog.31:1645-5中所述的;其全部内容通过引用并入本申请)或Cre-lox系统。
[0281] 如上文所述,在一些实施方式中,含有编码产品和/或LMM的核酸的载体还包含选择标记物,以便于从转染池中选择成功表达的细胞(Browne,Al-Rubeai 2007)。尽管多种选择方法是市售的,但是这些中最常用的是甲氨蝶呤(MTX)和Lonza谷氨酰胺合成酶(GS)系统(Bebbington,Renner等,1992,Lai,Yang等,2013)。二氢叶酸还原酶(DHFR)是一种负责将叶酸转化为四氢叶酸的蛋白,是产生甘氨酸、嘌呤和胸苷酸所必需的基本生物合成途径。MTX能够用于抑制DHFR活性并且因此在稳定转染培养物中含有DHFR能够用于选择稳定整合的细胞;只有那些成功表达足够的重组DHFR的细胞才能在使用MTX的选择中存活(Cacciatore,Chasin等,2010)。所使用的另一种常用的选择方法是使用GS;这是一种负责从谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶,由于谷氨酰胺对于哺乳动物细胞的存活至关重要,因而缺乏足量GS的细胞在培养物中将不能存活。初始时,加入GS抑制剂甲硫氨酸亚砜(MSX)以确保在CHOK1SV细胞中存在的内源性GS不足以维持细胞存活,因此在选择过程中仅有通过重组构建体的稳定整合表达附加GS的细胞才能够存活。Lonza等人目前建立了CHO宿主细胞系,其中内源性GS基因已被敲减/敲除,以使得在培养基中不存在外源性谷氨酰胺的条件下,所有细胞均不能成功整合目标构建体(Fan,Kadura等,2012)。很多其他选择方法是可用的,其激发对特定选择剂的抗性,以使得携带抗性基因的细胞将在选择过程中存活;这些包括潮霉素、新霉素、杀稻瘟素和博来霉素(Browne,Al-Rubeai 2007)。在实施方式中,含有编码LMM的外源性核酸的载体以及含有编码产品(例如,本申请所述的重组多肽)的外源性核酸的载体还包含不同的选择标记物。
[0282] 成功回收稳定表达细胞库后,从单一细胞来源分离单个克隆有助于选择能够以较高产品产率和质量生产的细胞系,或者具有最高产品产率和产品质量的细胞系。细胞性质的差异可能与在细胞中观察到的异质性和重组DNA整合位点的数量和特异性相关。因此,已开发出克隆筛选性质以快速评估多个克隆并随后选择高表达细胞。荧光激活细胞分选(FACS)是一种能够基于荧光强度快速分选细胞的方法,因此可以将其用于选择高表达克隆。已建立了若干方案,其涉及目标蛋白的荧光标记(Powell,Weaver 1990)、与重组基因共表达的细胞表面分子的荧光标记(Holmes,Al-Rubeai 1999)以及基于与目标基因共表达的eGFP的表达情况检测荧光强度(Meng,Liang等,2000)。使用这些方法观察到的高荧光强度表明产生了高水平的重组蛋白,因此可以优选地从重组细胞库中选择这些细胞。用于分离高表达重组克隆的基于FACS的选择方法更适于仍与细胞结合的重组产品,因为哺乳动物表达的生物治疗重组蛋白产品是分泌的,所以已开发了更适于针对分泌的重组蛋白选择克隆的方法。例如,ClonePix是一种自动化菌落选择方法,其基于分泌至培养基周围菌落的重组产品并与异硫氰酸荧光素(FITC)结合从而在菌落周围形成荧光晕选择在半固体培养基上生长的克隆(Lee,Ly等,2006)。根据菌落周围晕圈的荧光强度选择克隆。已建立了很多其他克隆选择方案,其基于所需生物学性质(特别感兴趣的是生产力)迅速分离重组细胞,并在Browne和Al-Rubeai(Browne,Al-Rubeai 2007)中进行了综述。对如本申请所述的所选择克隆的扩增导致细胞系的生产。
[0283] 在一个实施方式中,本申请所述的方法生产具有改善的生产力的细胞。细胞改善的生产力或生产能力包括所生产产品更高的产率或产量,和/或增加的生产速率(由单位时间内所生产产品的产率或产量确定)。在一个实施方式中,细胞的生产力(例如,生产产品的能力)改善,导致例如与脂质代谢途径未被调节的细胞生产的产品的量、水平或数量相比,所生产产品的量、水平或数量增加,例如增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或
99%,或者增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多倍。在一个实施方式中,细胞的生产力(例如,产品的生产速率)改善,导致例如与脂质代谢途径未被调节的细胞生产产品的生产速率相比,产品的生产速率增加,例如增加1%、
2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、
70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%;或者增加1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多倍。
[0284] 本申请所述的用于工程化改造细胞的方法生产高产细胞或高产细胞系。与参照细胞或者未经本申请所述的方法选择或工程化改造的细胞相比,高产细胞或细胞系能够以更高产率生产重组多肽产婆。在一个实施方式中,高产细胞系能够生产100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、
5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、
70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L或100g/L或者更多产品,例如重组多肽产品。在一个实施方式中,高产细胞系生产100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、
700mg/L、800mg/L、900mg/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、
95g/L或100g/L或者更多产品,例如重组多肽产婆。所生产的产品的量可以根据细胞类型(例如,物种)和待表达的产品(例如,重组多肽)而改变。举例来说,表达单克隆抗体的高产CHO细胞可能能够生产至少1g/L、2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L或25g/L单克隆抗体。
[0285] 本申请所述的方法和组合物可以特别地用于表达使用本领域目前已知的常规方法难以在细胞或无细胞系统中表达或产生的产品。因此,生产这种难以表达产品(例如,本申请所述的新一代生物制品)的生产细胞系可以生产至少1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、
75mg/L、80mg/L、85mg/L、90mg/L、95mg/L或100mg/L或者更多。与不具有如本申请所述的调节脂质代谢的修饰的细胞或系统的生产能力相比,通过本申请所述的方法和组合物使难以表达的蛋白的生产能力(例如,产品的产率、量或数量或者产品的生产速率)能够增加5%、
10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多,或者1倍、2倍、3倍、
4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多。
[0286] 用于量化所生产或分泌(例如,分泌至培养基中)产品的量、水平或数量的测定包括蛋白定量测定,如Bradford蛋白测定、SDS-PAGE分析、免疫印迹(例如,western印迹)和自动化方法(例如,使用nanodrop装置)。用于测量增加的蛋白产量的其他方法是本领域技术人员所熟知的。例如,通过ELISA测量组织培养基中的浓度,可以小规模地确定重组蛋白质产量的增加(Smales等,2004Biotechnology Bioengineering 88:474-488)。还可以通过ForteBio Octet定量测定,例如高通量测定培养基中重组单克隆抗体(mAb)的浓度(Mason等,2012Biotechnology Progress 28:846-855),或者通过蛋白A HPLC大规模测定(Stansfield等,2007 Biotechnology Bioengineering 97:410-424)。用于确定产品(例如,本申请所述的重组多肽)产量的其他方法可以指产品(特别是细胞中的重组多肽)的特定生产速率(qP)和/或活细胞浓度(IVC)的时间积分。在一个实施方式中,用于确定生产的方法包括确定qP和IVC的组合。根据在培养基中多肽的浓度定义的重组多肽的生产或生产力是根据Porter等(Porter等,2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455)计算的这两种参数(qP和IVC)的函数。还在本申请提供的实施例中进一步详细描述了用于测量蛋白生产的方法。
[0287] 在一个实施方式中,本申请所述的方法生产具有改善的产品质量的细胞。在一个实施方式中,产品质量的改善导致与例如未调节脂质代谢通路的细胞生产产品的量、水平或数量相比,产品质量增加,例如1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或者更多;或者1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或者更多。产品质量的这种提高可以例如通过以下一种或多种来举例说明:
[0288] i)非聚集产品的量或数量增加(或者聚集产品的量或数量减少);
[0289] ii)正确折叠或组装的产品的量或数量增加(或者错折叠、未折叠、部分组装或未组装产品的量或数量减少),或者正确折叠或组装产品与未折叠、错折叠、部分组装或未组装产品之比增加;
[0290] iii)全长产品的量或数量增加(或者产品的片段化减少);
[0291] iv)所需的翻译后修饰增加(或者未经修饰或不正确修饰的产品减少);
[0292] v)聚糖异质性增加或减少(例如,针对糖基化产品);
[0293] vi)功能性产品的量或数量增加(或者非功能性或功能障碍产品的量或数量减少),或者功能性与非功能性或功能障碍产品之比增加;和/或
[0294] vii)二硫键错配增加或减少(例如,由二硫键错配增加或减少导致的所需同种型或结构的增加或减少,例如针对抗体分子产品)。
[0295] 用于测量如本申请所述生产的细胞或细胞系的产品质量(例如,产品质量的改善)的方法是本领域公知的。在一个实施方式中,用于确定表达的重组多肽产品一级序列保真度的方法是本领域公知的,例如质谱法。可以通过原二色性或评估表达的重组多肽的固有荧光确定正确折叠产品(例如,表达的重组多肽)的量或浓度的增加情况。可以使用各种功能性测定对功能性产品的量或浓度的增加情况进行检测,其取决于重组产品(例如,重组多肽)的性质。例如,可以通过ELISA或其他免疫亲和性测定对抗体进行检测。可以通过体积排阻色谱、高效液相色谱、动态光散射(DLS)法和蛋白电泳(PAGE)法评价用于确定产品质量增加的其他方法,例如确定聚集、翻译后修饰、二硫键错配。
[0296] 在一个实施方式中,用于生产产品(例如,如本申请所述的)的方法包括提供经工程化改造以包含如本申请所述的调节脂质代谢的修饰的细胞。在一个实施方式中,含有调节脂质代谢的修饰的细胞还包含编码产品(例如,如本申请所述的重组多肽)的外源性核酸。在一个实施方式中,将编码产品(例如,本申请所述的重组多肽)的外源性核酸引入含有调节脂质代谢的修饰的经工程化改造的细胞。在另一个实施方式中,在将编码如本申请所述的LMM的外源性核酸引入之前,将编码产品(例如,本申请所述的重组多肽)的外源性核酸引入细胞。编码产品的外源性核酸还包含选择标记物,用于有效选择能够稳定表达(例如,过表达)如本申请所述产品的细胞。
[0297] 在一些实施方式中,可以进行附加步骤以改善产品的表达(例如,产品的转录、翻译和/或分泌,或者产品的质量,例如一级序列的正确折叠和/或保真度)。此类附加步骤包括引入改善产品表达或产品质量的试剂。在一个实施方式中,改善产品表达或产品质量的试剂可以是小分子、多肽或者编码改善蛋白折叠多肽(例如,伴侣蛋白)的核酸。在一个实施方式中,辅助蛋白折叠的试剂包含编码伴侣蛋白(例如,BiP、PD1或ERO1)的核酸(Chakravarthi&Bulleid 2004;Borth等,2005;Davis等,2000)。改善产品的产率和质量的其他附加步骤包括过表达转录因子(如XBP1和ATF6)(Tigges&Fussenegger 2006;Cain等,
2013;Ku等2008)以及凝集素结合伴侣蛋白(如钙联接蛋白和钙网蛋白)(Chung等,2004)。通过引入编码试剂的外源性核酸能够实现辅助或改善蛋白折叠和产品质量以及本申请所述的蛋白产率的试剂的过表达。在另一个实施方式中,改善产品表达或产品质量的试剂是能够加入细胞培养中以增加产品表达或产品质量的小分子(例如,DMSO)。在一个实施方式中,在比细胞正常生长的温度更低的温度下(例如,低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃)培养细胞以改善生产力。
[0298] 本申请所述的任何方法还可以包括用于鉴定具有较高生产率或生产高质量产品的细胞的附加选择步骤。例如,可以使用FACS选择法选择和分离具有所需特征(例如,折叠蛋白(例如,伴侣蛋白)具有更高的蛋白表达;或者产品具有改善的表达)的特定细胞。
[0299] 在一个方面中,本公开内容提供了包括回收或取回重组多肽产品步骤的方法。在重组多肽是从细胞分泌的实施方式中,所述方法可以包括从细胞、细胞群或在其中培养细胞的培养基中回收、收集或分离重组多肽的步骤。在重组多肽是在细胞内的实施方式中,重组多肽产品的纯化包括将由细胞生产的重组多肽与下述任意一种或多种物质分离:宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其他碎片。
[0300] 在实施方式中,本申请所述的过程提供了基本上纯的蛋白产品。如在本申请中所使用的,“基本上纯的”指基本上不含热源物质、基本上不含核酸和/或基本上不含内源性细胞蛋白酶和宿主细胞的成分,如聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白。基本上纯的蛋白产品含有例如少于25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的来自宿主细胞的污染性内源性蛋白、核酸或其他大分子。
[0301] 用于回收和纯化产品(例如,重组多肽)的方法在本领域中已经很好地建立。对于回收重组多肽产品而言,使用物理或化学或者物理-化学方法。物理或化学或者物理-化学方法可以是过滤法、离心法、超速离心法、提取法、冻干法、沉淀法、结晶法、层析法或者上述两种或多种方法的组合。在一个实施方式中,层析法包括体积排阻色谱(或凝胶过滤)、离子交换色谱(例如,阴离子或阳离子交换色谱)、亲和层析、疏水性相互作用层析和/或多元层析中的一种或多种。
[0302] 实施例
[0303] 通过参考下述实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另有说明,否则提供这些实施例仅用于说明目的并且其并非旨在限制。因此,绝对不应将本发明解释为限于下述实施例,而是应将其解释为包含由本申请所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
[0304] 无需进行进一步描述,相信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和下述说明性实施例制备和利用本发明的化合物并且实施所要求保护的方法。下述工作实施例具体地指出了本发明的各个方面,并且不应将其解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
[0305] 实施例1:过表达脂质代谢调节剂的稳定细胞的产生
[0306] 为了研究两种脂质代谢调节剂SCD1和SREBF1在CHO细胞中过表达的影响,使用位点定向方法将这些基因成功克隆和稳定整合至贴壁CHO Flp-In细胞,并且使用随机整合法引入悬浮GS敲除(GSKO)CHO细胞。
[0307] 含SCD1和SREBF1的FRT载体的分子克隆
[0308] 进行分子克隆以产生基于FRT的载体,其有助于在每种蛋白的C-末端具有和不具有V5/His标签的SCD1和SREBF1蛋白的表达。使用这些载体以及从Thermo Fisher购买得到的Flp-In宿主CHO细胞库能够将目标基因位点特异性整合以产生稳定的CHO贴壁细胞库。在基于 聚合酶的PCR反应中使用表4中所示的引物以扩增这些基因,以产生翼侧为也在表4中详述的限制性位点的双链DNA片段。分别使用来源于小鼠P19的cDNA和Origene小鼠cDNA克隆(NCBI登录号NM_011480)扩增SCD1和SREBF1基因。
[0309] 成功扩增靶基因后,使用适当的限制性酶对FRT-V5载体以及此前产生的目的基因的PCR产物进行双重限制性消化。将连接物孵育过夜,然后进行转化并且对所得到的菌落进行小量制备纯化。
[0310] SCD1和SREBF1过表达贴壁Flp-In CHO细胞的产生
[0311] 使用前述基于FRT的构建体以及从Thermo Fisher购买得到的贴壁Flp-In CHO细胞产生稳定的细胞库。将含有目标基因的FRT载体和空FRT构建体(用于产生对照细胞库)与含有重组酶的pOG44载体共转染至Flp-In细胞。在FRT载体和Flp-In CHO基因组中存在的重组酶位点启动位点特异性重组并且使用潮霉素作为选择试剂能够分离成功的克隆。根据生产厂商的说明书,例如如Thermo Fisher Flp-In手册中所述的,例如可以从Thermo Fisher参考资料和方案网站获得,以位点特异性方式产生稳定表达的重组CHO贴壁细胞池。将该方法用于生产和回收对照SCD1-V5和SREBF1-V5Flp-In CHO多克隆细胞库。
[0312] 将SCD1和SREBF1分子克隆至pcDNA3.1载体
[0313] 产生表达载体以便将SCD1、SREBF1或截短的SREBF1基因之一稳定整合并因此在工业上相关的CHO悬浮细胞中过表达。pcDNA3.1V5-His/TOPO载体由适宜的CMV启动子和下游多克隆位点构成,以便于目标基因的表达,同时还含有能够表达新霉素基因的元件,能够将其用于在DNA整合至基因组之后选择成功的克隆。
[0314] 首先,使用 PCR方案,利用表4中所示的引物扩增SCD1、SREBF1和SREBF1截短,进行设计以使得在所得到的PCR产物的翼侧同时加入限制性位点。使用此前产生的SCD1-FRT载体作为模板扩增SCD1基因,使用Origene小鼠cDNA(NCBI登录号NM_011480)扩增SREBF1及其截短形式。从而将SREBF1截短称为SREB410,其编码410个氨基酸长的多肽序列,包含SREBF1的螺旋-环-螺旋(HLH)结构域。如前所述,将该结构域内源性地从全长蛋白裂解后,该片段能够迁移至细胞核并且随后基因转录激活。设计引物以扩增该区域,其目的是表达直接定位在细胞核中的蛋白(由该序列编码),从而在不需要内源性加工的情况下就能实现其作为转录激活因子的功能。
[0315] 酌情(见表4)对纯化的PCR产物和pcDNA3.1/V5-His/TOPO进行双限制性消化,其中引物扩增的基因无终止密码子,以使得能够读入框架内编码V5和His标签的序列。将所得到的DNA片段连接以产生含有带有V5-His标签的SCD1、SREBF1或SREB410基因的载体。将这些反应物转化并且对多个所得到的菌落进行微量制备。进行限制性消化并将所得到的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳以确定哪些样品是成功的。
[0316] SCD1和SREBF1过表达悬浮GSKO CHO细胞的产生
[0317] 在化学成分确定的,无蛋白且无血清的培养基上培养悬浮CHOK1SV GS-KO细胞库,使用此前合成的pcDNA3.1V5-His/TOPO来源的构建体稳定转染,以考察插入基因在工业上相关细胞系中组成型表达的影响。为了实现这一目的,使用Lonza CHOK1SV GS-KO宿主细胞系进行稳定整合。首先,使用PvuI限制性酶(NEB)消化过夜将SCD1-V5、SREBF1-V5、SREB410-V5和对照(空pcDNA3.1V5-His/TOPO)构建体线形化。线形化后,使用乙醇沉淀纯化DNA,并使用20μg DNA电穿孔CHOK1SV GS-KO细胞,随后立即在37℃下将1x 107个活细胞转移至含CD-CHO培养基(Thermo Fisher)的T75培养瓶中,以使其终体积为20mL。将培养瓶置于37℃下含5%CO2的空气氛的湿润静态培养箱中24小时。使用CD-CHO培养基稀释G418(Melford)选择剂的原液,将5mL该原液加入T75培养瓶并轻柔混合以产生在25mL总体积中的终浓度750μg/mL。每3-4天进行一次细胞计数以确定生长情况和培养物活力,约每6天通过离心和重悬更换一次含750μg/ml G418的CD-CHO培养基。一旦细胞达到2x 105个活细胞/mL的浓度,将细胞转移至125mL锥形瓶并进行常规悬浮细胞培养。
[0318] 表4:引物序列总结
[0319]
[0320] 实施例2:在过表达LMM的稳定细胞中LMM的表达分析
[0321] 在使用对照(空pcDNA5FRT)、SCD1-V5或SREBF1V5稳定整合的稳定Flp-In CHO细胞库建立后,进行免疫荧光检测以确证这两种稳定外源性整合基因的表达以及所表达蛋白在细胞内的位置。以每孔2x 105个活细胞将对照、SCD1-V5和SREBF1-V5细胞系接种在含补充了10%FBS的Ham营养物混合F12培养基的24孔板中。使用甲醇固定样品并将其依次暴露于抗-V5抗体(在小鼠中产生的-Sigma V8012)和抗-小鼠FITC二抗缀合物(在山羊中产生-Sigma F0257)。而且,将细胞暴露于DAPI染料(10μg/mL工作原液),以将细胞DNA染色,从而突出显示细胞核。所得到的免疫荧光图像如图1中所示。
[0322] 在SCD1-V5和SREBF1-V5细胞系中存在FITC染色表明已成功表达了外源性/重组基因,此外SCD1-V5和SREBF1-V5蛋白的细胞定位是明显的。组成型表达的SCD1-V5蛋白在整个细胞中丰富地存在,并且图像显示了其定位于胞质和ER中。相反地,SREBF1-V5蛋白的表达量要低得多,但是其非常显著的位于核周围,在细胞核周围形成环。考虑将V5表位序列加入基因的3’末端是重要的,并且由于SREBF1的天然调控,特定结构域在细胞内裂解和重新定位。成熟、裂解的bHLH(碱性螺旋环螺旋)区域是特别重要的,因为其负责对脂质生物合成和构象具有影响的很多基因的转录激活。由于该区域在基因的5’末端编码,使用3’V5标签染色后将无法检测到这一区域,因而不可能确定翻译蛋白的任何组成型表达的裂解部分是否存在于成像细胞中。
[0323] 进行细胞内V5-标记稳定蛋白的染色以确定在工程化改造的CHOK1SV GS-KO悬浮细胞系中存在SCD1-V5和SREBF1-V5。为了使这些细胞粘附在24孔板中的盖玻片上,首先使5
用多聚-L-赖氨酸处理盖玻片,以每孔2x 10 个细胞接种细胞,并将其放置在37℃下含5%CO2环境中的静态湿润培养箱中培养过夜。在甲醇固定和透化后,将抗-V5(在小鼠中生产-Sigma V8012)与抗-小鼠TRITC(在山羊中生产-T5393)二抗缀合。所得到的图像如图2中所示。
[0324] 使用抗-V5抗体、抗-小鼠HRP缀合的二抗以及适宜检测系统进行Western印迹,用于进一步确证带有V5标签的脂质构建体的表达。将等量总蛋白(使用Bradford法确定)上样进行SDS-PAGE,随后在硝酸纤维素上进行western印迹。所得到的印迹如图3A、3B和3C中所示,仅在表达SCD1构建体的那些细胞中检测到了V5标签。然而,用SREBF1构建体实现的低水平表达可以解释在表达该构建体的细胞系中缺乏对V5的检测。
[0325] 实施例3:过表达LMM的稳定细胞的生长特征
[0326] 在这个实施例中,在工程化改造以过表达LMM的两个不同细胞系CHO Flp-InTM和CHOK1SV GS-KO(Lonza Biologics)细胞系中评估了生长特征,如活细胞计数、细胞数和培养物活力。如实施例1中所述产生LMM工程化改造的细胞系。对对照细胞系进行工程化改造以表达空V5标记的表达载体。通过电穿孔将编码eGFP的表达载体转染至LMM工程化改造的细胞系。使用1x 107个活LMM-工程化改造的Flp-In CHO细胞或CHOK1SV GS-KO细胞以及20μg质粒DNA(编码eGFP的表达载体)进行电穿孔并使用Ham营养物混合F12培养基将这些细胞稀释至终体积约20或32mL。使用ViCell细胞计数仪确定活细胞浓度并在转染后24、48、72和96小时记录编码eGFP的表达载体。
[0327] 对Flp-InTM细胞进行工程化改造以表达SCD1和SREBF1的结果如图4中所示。在所有时间点,与对照细胞相比,过表达SCD1和SREBF1的细胞通常在活细胞浓度方面显示出一些增加。
[0328] 对CHOK1SV GS-KO细胞进行工程化改造以表达SCD1、SREBF1和SREBF410的结果如图5A和5B中所示。对活细胞浓度和总细胞浓度进行比较的结果如图5A中所示,活细胞浓度以下面的柱子表示,整个柱子表达计数的细胞总数。如图5A中所示,LMM(SCD1和SREBF1)的表达导致所有时间点的存活细胞数和总细胞数的总体增加。在48、72和96小时,活细胞和总细胞浓度在SCD1和SREBF1工程化改造的细胞中显著更高。在96小时,SCD1和SREBF1工程化改造细胞的活细胞计数比对照细胞高1x 106个细胞/mL。还计算了培养物活力,结果如图5B中所示。与对照细胞相比,LMM工程化改造的细胞通常显示出增加的培养物活力。
[0329] 实施例4:在过表达LMM的稳定细胞中eGFP诱导的荧光增加
[0330] 在这个实施例中,在CHO-Flp-InTM和CHOK1SV GS-KO细胞系中评估了生产重组蛋白的生产能力,如实施例1中所述,对细胞进行了工程化改造以稳定表达LMM。如实施例3中所述,使用编码eGFP的表达载体转染LMM工程化改造的细胞,并通过利用流式细胞术在转染后24、48、72和96小时测得的所产生的eGFP的量评估生产能力。使用FACSCalibur(BD Biosciences)仪器测量eGFP介导的细胞荧光并产生此处显示的数据。
[0331] 在工程化改造以表达V5-标记SCD1和SREBF1的Flp-In细胞中测量eGFP的产生情况。图6A、6B和6C分别显示了使用流式细胞术在特定时间点记录的LMM工程化改造的Flp-In细胞的中位荧光、几何平均荧光和算数平均荧光。对于中位荧光、几何平均荧光和算数平均荧光而言,这些值在SCD1过表达细胞中增加,从而表明稳定表达SCD1的细胞与对照细胞相比能够产生更多的eGFP。
[0332] 在工程化改造以表达V5-标记SCD1、SREBF1和SREBF410的CHOK1SV GS-KO细胞中测量了eGFP的产生情况。中位荧光如图7A中所示和几何平均荧光如图7B中所示。对于所有工程化改造以过表达SREBF1的细胞均观察到了中位荧光和几何平均荧光的增加。
[0333] 为了解释在CHOK1SV GS-KO来源的细胞系中观察到的细胞浓度和增殖性质的差6
异,通过测得的算数平均荧光乘以总细胞浓度(x10 每mL)计算得到了每mL培养物的总荧光,计算得到的值如图7C中所示。如图7C中所示,转染后24小时与对照细胞相比SCD1过表达细胞重组蛋白(eGFP)的量产生了显著增加。在所检测的所有时间点,与对照细胞相比,SREBF1过表达细胞通常产生eGFP的量增加,并且在转染后72和96小时其量显著增加。
[0334] 总的来说,这些数据表明工程化改造细胞使其表达LMM(如SCD1和SREBF1)增加瞬时表达重组蛋白(如eGFP)的生产能力。而且,如所测得的荧光所示,与不具有调节脂质代谢的修饰的细胞相比,细胞产生的正确折叠和功能性eGFP增加,从而证明了调节脂质代谢增加生产的产率和质量。
[0335] 实施例5:在过表达LMM的稳定细胞中改善的生产力
[0336] 与实施例4中所述的实验类似,评估了稳定表达LMM的细胞系对不同产品的生产能力,如模型IgG4抗体分子(在本申请中称为抗体A)和融合蛋白(在本申请中称为Fc融合蛋白或FP)。
[0337] 使用编码抗体A或Fc融合蛋白的表达载体对稳定表达V5-标记SCD1和SREBF1的Flp-In细胞(如实施例1中所述进行工程化改造)进行电穿孔。电穿孔后,在电穿孔后24、48、72和96小时通过western印迹确定培养物上清中重组抗体A和FP的量。使用抗-重链一抗、抗-家兔-HRP缀合的二抗和适宜检测试剂检测抗体A(图8A)和Fc融合蛋白(图9A)。通过蛋白A HPLC确定抗体A和Fc融合蛋白生产情况的平均变化倍数,结果分别如图8B和9B中所示。表达外源性SCD1的细胞系针对这两种重组蛋白与对照细胞系相比均显示出增加的生产力。而且,在所分析的24、48、72和96小时时间点这种影响是一致的。
[0338] 使用两种重组蛋白模型IgG4(抗体A)和Fc融合蛋白瞬时转染稳定表达SCD1、SREBF1和SREBF410构建体的Lonza CHOK1SV GS-KO(XceedTM)细胞(如实施例1中所述进行工程化改造)。电穿孔后,使用抗-重链一抗、抗-家兔-HRP缀合的二抗和适宜检测试剂通过western印迹每24小时确定一次培养物上清中重组抗体A和FP的量直至96小时(图10A和
11A)。通过蛋白A HPLC确定抗体A和Fc融合蛋白生产情况的平均变化倍数,结果分别如图
10B和11B中所示。表达外源性SCD1、SREBF1和SREBF410的CHOK1SV GS-KO细胞系针对这两种重组蛋白与对照细胞系相比均显示出增加的生产力(图10B和11B)。而且,在所分析的24、
48、72和96小时时间点这种影响是一致的。
[0339] 使用两种重组蛋白模型IgG4(抗体A)和Fc融合蛋白稳定转染稳定表达SCD1、SREBF1和SREBF410构建体的Lonza CHOK1SV GS-KO(XceedTM)细胞(如实施例1中所述进行工程化改造)。图15A和16A分别显示了初始接种0.2x 106个活细胞/ml后在48、96、144和192小时抗体A和FC融合蛋白的体积生产力。结果表明SCD1过表达细胞库改善两种重组分子的绝对产率。而且,在计算包括细胞数后,两种重组分子的比生产力在SCD1过表达细胞库中也极大地增加(图15B和16B)。
[0340] 总的来说,这些结果表明工程化改造细胞以表达LMM(如SCD1、SREBF1和SREBF1的功能性片段(SREBF410))增加瞬时表达蛋白(如抗体分子和融合蛋白)的生产能力。
[0341] 实施例6:改良已建立的生产细胞系
[0342] 实施例4和5表明,当瞬时表达重组产品(如GFP、抗体分子或融合蛋白)时,稳定表达LMM的细胞系具有改善的生产。在这个实施例中,进行分析以确定LMM对在已建立细胞系中重组产品的现有稳定产率的影响。
[0343] 使用此前已工程化改造以稳定表达模型IgG4抗体分子(抗体A)的CHO121细胞。在抗体A-稳定表达细胞中瞬时表达编码V5-标记的SCD1、SREBF1和截短的SREBF1(SREBF410)的构建体。使用空V5标记载体转染对照细胞。在48、72和168小时收集细胞的上清液。通过使用抗-重链一抗(Sigma 19764),随后使用抗-家兔HRP缀合的二抗(Sigma A6154)进行Western印迹分析以确定所产生的抗体A的量,结果如图12A中所示。如图中所示,在LMM引入后48和72小时,与对照相比,LMM SCD1和SREBF410的表达导致由细胞产生的抗体A的量增加。对细胞上清液进行考马斯分析以显示LMM引入后168小时产生的抗体A的量,结果表明LMM瞬时表达(SCD1和SREBF410)导致重组蛋白的生产改善(图12B)。图13显示了使用蛋白A HPLC对抗体A进行定量分析的结果,突出显示了使用含有SCD1和SREB410的质粒瞬时转染后在转染后48、72、96和144小时平均产品滴度显著增加。图14显示了对FC融合蛋白进行定量分析的结果,使用蛋白A分析确定产品滴度,测定活细胞数已确定比生产力。该数据表明使用含有LMM元件的载体瞬时转染的细胞的平均比生产力增加,并且含有SREBF1的构建体产生了最高的平均值。
[0344] 这些结果表明在已建立的细胞系中进行脂质代谢调节与已确立的产率相比能够进一步改善生产能力。
[0345] 实施例7:通过同时引入重组基因和LMM改善生产力
[0346] 产生质粒/构建体,其包含正确表达示例性免疫细胞因子和对照(无LMM)、SCD1、SREBF1或SREB411(来源于SREBF1的序列是CHO特异性的;NM_001244003,SEQ ID NO:34和36)的基因。然后,将这些构建体用于瞬时转染Lonza CHOK1SV GS-KO细胞。图17A显示了在转染后48和96小时收集的上清液的western分析结果。对所使用的上清液样品进行还原,通过使用抗-重链一抗和HRP缀合的抗-家兔二抗作为探针对瞬时产品进行检测,以显示天然重链(下面的条带)和与细胞因子融合的重链(上面的条带)。在转染构建体中含有SCD1、SREBF1和SREB411基因导致转染后48和96小时的条带强度增加。而且,图17B显示了使用蛋白A分析在转染后96小时获得的对样品进行定量分析的结果。免疫细胞因子的相对丰度支持了western分析中存在的数据(图17A)。
[0347] 这些数据表明同时含有LMM(如SCD1、SREBF1和SREBF1的功能性片段(SREBF411))以及重组产品的基因能够改善生产能力。
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