哺乳动物表达系统
阅读：256发布：2020-05-12
专利汇可以提供哺乳动物表达系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及具有改良产率的 哺乳动物 表达系统及使用这些系统产生期望 蛋白质 的方法。在一个 实施例 中，本发明的表达系统包括在含有有效量肝素或肝素样分子的培养基中培养的基因工程哺乳动物宿主细胞。肝素或肝素样分子的存在可大大地增加所述培养细胞产生的蛋白质。本发明还涉及FGFR－I－介导的 信号 转导途径的组成型活性组份在改善经培养哺乳动物细胞产生蛋白质方面的用途。此组份与相关蛋白质的共表达可明显地提高所述相关蛋白质的产率。，下面是哺乳动物表达系统专利的具体信息内容。
1.一种包括在培养基中培养的哺乳动物宿主细胞的表达系统，其中所述细胞各 自包含编码相关蛋白质的重组表达盒，且所述相关蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素 蛋白多糖相互作用以引发所述蛋白质的细胞内在化，且其中所述培养基包含有效量的 肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖以增加所述细胞产生的所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是选自由下列组成的群 组：胰岛素、生长激素、生长因子、红细胞生成素蛋白、促滤泡激素、干扰素、白细 胞介素、细胞因子、集落刺激因子、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、甲状旁 腺激素、骨形成蛋白、角质化细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白质C、分泌型卷曲基因相关 蛋白、选择蛋白、金属蛋白酶、dickkopf蛋白、及抗体。
3.如权利要求1所述的表达系统，其中所述培养基包含自约1至约1,000微克/ 毫升的肝素。
4.如权利要求1所述的表达系统，其中所述培养基包含自约10至约200微克/ 毫升的肝素。
5.如权利要求1所述的表达系统，其中所述培养基是不含血清的培养基，其包 含有效量的FGF-2以增加所述细胞产生的所述蛋白质。
6.如权利要求1所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是参与骨发育的蛋白质。
7.如权利要求6所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是选自由骨形成蛋白、 分泌型卷曲基因相关蛋白、金属蛋白酶及dickkopf蛋白组成的群组。
8.一种包含由如权利要求1所述表达系统产生的相关蛋白质的医药组合物。
9.一种包含基因工程哺乳动物细胞的表达系统，所述基因工程哺乳动物细胞各 自包含一个或多个编码相关蛋白质及FGFR-1-介导信号转导途径的组成型活性组份的 重组表达盒。
10.如权利要求9所述的表达系统，其中所述组份是组成型活性FGFR-1蛋白质。
11.如权利要求10所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是选自由下列组成的 群组：胰岛素、生长激素、生长因子、红细胞生成素蛋白、促滤泡激素、干扰素、白 细胞介素、细胞因子、集落刺激因子、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、甲状 旁腺激素、骨形成蛋白、角质化细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白质C、分泌型卷曲基因相 关蛋白、选择蛋白、金属蛋白酶、dickkopf蛋白、及抗体。
12.如权利要求10所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是参与骨发育的蛋白 质。
13.如权利要求10所述的表达系统，其中所述相关蛋白质是选自由骨形成蛋白、 分泌型卷曲基因相关蛋白、金属蛋白酶及dickkopf蛋白组成的群组。
14.一种包含在培养基中培养的哺乳动物宿主细胞的表达系统，其中所述细胞各 自包含编码相关蛋白质的重组表达盒，且所述相关蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素 蛋白多糖相互作用以引发所述蛋白质的细胞内在化，且其中所述培养基包含有效量的 FGFR-1活化剂以增加所述细胞产生的所述蛋白质。
15.如权利要求14所述的表达系统，其中所述培养基是不含血清的培养基且所 述FGFR-1活化剂包括：
肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖；及
纤维母细胞生长因子-2。
16.一种包含在培养基中培养的哺乳动物宿主细胞的表达系统，其中所述细胞各 自包含编码相关蛋白质的重组表达盒，且所述培养基包含有效量的β-木糖苷以增加所 述细胞产生的所述蛋白质。
17.如权利要求16所述的表达系统，其中所述培养基包含约50微克/毫升至约 100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。
18.一种用于增进重组表达蛋白表达的方法，所述方法包括如下步骤：
培养包含编码所述蛋白质的信使RNA的哺乳动物细胞；及
活化FGFR-1，
其中FGFR-1的活化可增进所述蛋白质转译，且其中所述蛋白质本身不为FGFR-1 的活化剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白质不为病毒蛋白。
20.如权利要求18所述的方法，其中活化FGFR-1包括在包含有效量肝素或硫酸 肝素葡糖胺聚糖的培养基中培养所述细胞以增进所述蛋白质转译。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基包含10-200微克/毫升的肝素。
22.如权利要求21所述的方法，其中每个细胞包含包括信使RNA的重组表达盒 的瞬时导入表达载体并在将所述表达载体瞬时导入所述细胞中后至少24小时向所述 培养基中添加肝素。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基是不含血清的培养基，其进一 步包含有效量的FGF-2以增进所述蛋白质转译。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述培养基进一步包含血清。
25.如权利要求18所述的方法，其中活化FGFR-1包括在包含有效量β-木糖苷 的培养基中培养所述细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述培养基是不含血清的培养基，其进一 步包含FGF-2。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述培养基进一步包含血清。
28.如权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。
29.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素蛋 白多糖相互作用以引发所述蛋白质的细胞内在化。
30.如权利要求18所述的方法，所述方法进一步包含如下步骤：自所述细胞或 所述培养基分离所述蛋白质。
31.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白质是选自由下列组成的群组：胰 岛素、生长激素、生长因子、红细胞生成素蛋白、促滤泡激素、干扰素、白细胞介素、 细胞因子、集落刺激因子、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、甲状旁腺激素、 骨形成蛋白、角质化细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激 因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白质C、分泌型卷曲基因相关蛋白、选 择蛋白、金属蛋白酶、dickkopf蛋白、及抗体。
32.一种包含按照如权利要求18所述方法产生的相关蛋白质的医药组合物。
33.一种用于产生蛋白质的方法，其包括：
在培养基中培养哺乳动物细胞，所述细胞各自包含一个或多个编码所述蛋白质及 FGFR-1-介导信号转导途径的组成型活性组份的重组表达盒；
在所述细胞中表达所述蛋白质及所述组份；及
自所述细胞或培养基分离所述蛋白质。
技术领域
本发明涉及哺乳动物表达系统及使用所述哺乳动物表达系统产生期望蛋白质的 方法。
背景技术
近来，随着基因组学及蛋白质组学的进步，大量地克隆及表达重组蛋白质的能力 变得越来越重要。纯化高水平蛋白质的能力在用于产生诸如胰岛素等蛋白质医药的人 类制药学及生物技术配置方面以及在用以(例如)结晶蛋白质以确定其三维结构的基 础研究配置方面十分重要。另外难以大量获得的蛋白质可能会在宿主细胞中超表达且 随后分离并纯化之。
细菌表达系统已成为一种重组蛋白表达及纯化的方法。然而，许多真核多肽及(尤 其是)哺乳动物蛋白质在细菌细胞中的表达经常会产生令人失望及不满意的结果，这 是因为所述宿主细胞的条件及环境不利于矫正所述真核蛋白的折叠及修饰。
酵母菌表达系统可为某些真核蛋白的产生提供某些优势，这是因为所述酵母菌表 达系统具有分泌途径并能够实施某些受限的转译后修饰。然而，酵母菌系统通常会导 致二硫键链接的蛋白质不适当地折叠并可产生低糖基化。
哺乳动物细胞在蛋白质的产生中的使用具有如下重要的优点：提供适度的蛋白质 折叠以及适当的转译后修饰，例如，糖基化。然而，许多哺乳动物表达系统不可产生 大量的期望蛋白质。
细菌表达系统已成为一种重组蛋白表达及纯化的方法。然而，许多真核多肽及(尤 其是)哺乳动物蛋白质在细菌细胞中的表达经常会产生令人失望及不满意的结果，这 是因为所述宿主细胞的条件及环境不利于矫正所述真核蛋白的折叠及修饰。
酵母菌表达系统可为某些真核蛋白的产生提供某些优势，这是因为所述酵母菌表 达系统具有分泌途径并能够实施某些受限的转译后修饰。然而，酵母菌系统通常会导 致二硫键链接的蛋白质不适当地折叠并可产生低糖基化。
哺乳动物细胞在蛋白质的产生中的使用具有如下重要的优点：提供适度的蛋白质 折叠以及适当的转译后修饰，例如，糖基化。然而，许多哺乳动物表达系统不可产生 大量的期望蛋白质。
发明内容
本发明涉及肝素、肝素样分子或纤维母细胞生长因子受体(FGFR)促效剂在增加哺 乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用途。本发明还涉及组成型活性FGFR或其下游效 应子在刺激哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用途。
一方面，本发明提供具有改良蛋白质产率的哺乳动物表达系统。这些表达系统包 括在含有有效量肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的培养基中培养的基因工程哺乳动物细 胞。所述基因工程宿主细胞各自包含编码相关蛋白质的重组表达盒。肝素或硫酸肝素 葡糖胺聚糖在培养基中的存在可大大地增加所述相关蛋白质的产率。
本发明所用肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的数量可为任一有效地促进培养宿主细 胞产生蛋白质的数量。在一个实施例中，本发明所用培养基包括自约1至约1,000微 克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。在另一实施例中，本发明所用培养基包括自约 10至约200微克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖(例如，约10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100微克/毫升)。
在又一实施例中，本发明所用培养基是用于增加培养宿主细胞产生蛋白质的不含 血清培养基，其包含有效量的纤维母细胞生长因子2(FGF-2)或其它FGF与肝素或硫 酸肝素葡糖胺聚糖的组合。在许多实例中，所述培养基包括但不限于自约10至约500 纳克/毫升的FGF-2(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、 400或500纳克/毫升)。
在另一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括在含有有效量FGFR-1活化剂的 培养基中培养的基因工程哺乳动物细胞。这些基因工程细胞各自包含编码相关蛋白质 的重组表达盒。FGFR-1活化剂在所述培养基中的存在可显著地增加相关蛋白质的产 率。适用于本发明的FGFR-1活化剂的实例包括但不限于FGF、肝素、硫酸肝素葡糖 胺聚糖、或其它肝素样分子。也可以使用能够活化其它FGFR的药剂。在一个实施例 中，本发明所用FGFR-1活化剂包括肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖及FGF-2二者。
在再一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括基因工程哺乳动物细胞，其各自 包含一个或多个编码FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份及相关蛋白质的 重组表达盒。在一个实例中，FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份是组成 型活性FGFR-1蛋白质。
本发明还涉及β-木糖苷或其它葡糖胺聚糖生物合成诱导剂在改良哺乳动物细胞 产生蛋白质方面的使用。适用于此目的的β-木糖苷的非限制性实例包括4-甲基伞形酮 基-β-D-木糖苷、p-硝基苯基-β-D-木糖苷及苄基-β-D-木糖苷。在一个实例中，哺乳动物 宿主细胞是在包含自约50或约100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷的培养基 中培养。β-木糖苷的使用可大大地增加哺乳动物宿主细胞的蛋白质产率。
使用本发明的哺乳动物表达系统可产生任何相关蛋白质。这些蛋白质的非限制性 实例包括胰岛素、生长激素、生长因子、红细胞生成素蛋白、促滤泡激素、干扰素、 白细胞介素、细胞因子、集落刺激因子、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、甲 状旁腺激素、骨形成蛋白、角质化细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白质C、分泌型卷曲基因 相关蛋白、选择蛋白、抗体、或病毒蛋白。这些蛋白质可为分泌、胞质、或膜结合蛋 白质。其可用于治疗、预防、诊断或其它医疗目的。在许多实例中，本发明所产生的 蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以引发这些蛋白质的细胞内在 化。
本发明进一步涉及包含由本发明哺乳动物表达系统产生的蛋白质的医药组合物。
另外，本发明涉及用于产生期望蛋白质的方法。一方面，本发明的方法包括在培 养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中每个宿主细胞包含编码相关蛋白质的重组表达盒， 且所述培养基含有有效量的肝素、硫酸肝素葡糖胺聚糖、或FGFR-1活化剂以增加所 述宿主细胞产生的相关蛋白质；并自所述宿主细胞或所述培养基分离所述相关蛋白质。
在一个实施例中，所述重组表达盒是由瞬时导入宿主细胞中的表达载体携带。在 将所述表达载体瞬时导入所述宿主细胞中后至少24小时，向培养基中添加肝素或硫酸 肝素葡糖胺聚糖。在另一实施例中，在将所述表达载体瞬时导入所述宿主细胞中后至 少48小时，向培养基中添加肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。
在另一方面中，本发明的方法包括在培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中每个 宿主细胞包含一个或多个重组表达盒，其编码相关蛋白质及FGFR-1-介导的信号转导 途径的组成型活性组份；表达相关蛋白质及宿主细胞的组份；并自所述宿主细胞或所 述培养基分离所述相关蛋白质。
在一个实施例中，所述组成型活性组份是组成型活性FGFR-1蛋白质。在许多情 况下，使用本发明方法产生的蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以 引发这些蛋白质的细胞内在化。
本发明的其它特征、目标及优点在下列具体实施方式中明示。然而，应了解，所 述具体实施方式尽管指出本发明的较佳实施例，但仅出于说明目的而非限制本发明。 属于本发明范围的各种变化形式及修饰形式为那些熟习此项技术者根据具体实施方式 所知。
附图说明
附图仅出于说明目的而非限制本发明提供。
图1绘示本发明所用表达载体的限制酶切谱图。
图2阐明肝素对培养HEK293细胞中产生蛋白质的增进作用。
图3表明用于增加培养HEK293-EBNA细胞产生蛋白质的最佳肝素浓度是约25 微克/毫升。
图4显示肝素可增加分泌型卷曲基因相关蛋白质1(sFRP-1)在稳定HEK293细胞 系中的生产。
图5是一阐明肝素不会增加sFRP-1 mRNA水平的北方印迹图。
图6是一表明肝素对细胞内蛋白质合成的刺激作用的西方印迹图。
图7表明在没有肝素时纯化sFRP-1具有活性并稳定。图片A是来自传染293细 胞条件培养基的一对蛋白质在经过Nickel NTA管柱之后的洗脱特征曲线。使用尺寸排 除型管柱Superdex 200进一步纯化经镍纯化的材料。图片B是纯化sFRP-l-his6的考马 斯蓝(Coomassie blue)沾染凝胶。借助SDS-PAGE在还原(泳道1和3)或非还原(泳道 2和4)条件下分析经过Nickel NTA或Superdex 200后的蛋白质试样。图片C代表使用 经TCF-荧光素酶转染的U2OS细胞的纯化sFRP-1的Wnt-3拮抗活性荧光素酶分析。
图8是一表明肝素可刺激缺乏糖基化的CHO细胞系Lec.3.2.8.1中产生sFRP-1的 西方印迹图。在DNA转染后48小时用50微克/毫升肝素对经sFRP-1转染的Lec.3.2.8.1 细胞进行模拟处理或处理。在不同的时间点收集条件培养基并借助抗-his4抗体的免疫 印迹进行分析。
图9是一阐明经修饰肝素的作用的西方印迹图。经sFRP-1-转染的293细胞未受 到处理(-)或用肝素、N-脱硫酸化肝素、N-乙酰化肝素(dN-肝素)、或2-O-脱硫酸化肝素 (dO-肝素)(所有均以50微克/毫升)培育72小时。还可用指定浓度的4-甲基伞形酮 基7-β-D-木糖苷(Xyloside)处理所述细胞。收集培养基试样并借助抗-his4抗体的免疫印 迹进行分析。
图10表明纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)可大大地改善肝素在不含血清培养基中 的作用。
图11显示阻断纤维母细胞生长因子受体-1(FGFR-1)可显著地削弱肝素增进蛋白 质生产的作用。
图12是一阐明肝素在HEK293瞬时表达中可增进人类基质金属蛋白酶23 (MMP-23)生产的西方印迹图。
图13是一阐明肝素在HEK293瞬时表达中可增进人类Dickkopf-1(DKK-1)生产的 西方印迹图。
一方面，本发明提供具有改良蛋白质产率的哺乳动物表达系统。这些表达系统包 括在含有有效量肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的培养基中培养的基因工程哺乳动物细 胞。所述基因工程宿主细胞各自包含编码相关蛋白质的重组表达盒。肝素或硫酸肝素 葡糖胺聚糖在培养基中的存在可大大地增加所述相关蛋白质的产率。
本发明所用肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖的数量可为任一有效地促进培养宿主细 胞产生蛋白质的数量。在一个实施例中，本发明所用培养基包括自约1至约1,000微 克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。在另一实施例中，本发明所用培养基包括自约 10至约200微克/毫升的肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖(例如，约10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100微克/毫升)。
在又一实施例中，本发明所用培养基是用于增加培养宿主细胞产生蛋白质的不含 血清培养基，其包含有效量的纤维母细胞生长因子2(FGF-2)或其它FGF与肝素或硫 酸肝素葡糖胺聚糖的组合。在许多实例中，所述培养基包括但不限于自约10至约500 纳克/毫升的FGF-2(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、 400或500纳克/毫升)。
在另一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括在含有有效量FGFR-1活化剂的 培养基中培养的基因工程哺乳动物细胞。这些基因工程细胞各自包含编码相关蛋白质 的重组表达盒。FGFR-1活化剂在所述培养基中的存在可显著地增加相关蛋白质的产 率。适用于本发明的FGFR-1活化剂的实例包括但不限于FGF、肝素、硫酸肝素葡糖 胺聚糖、或其它肝素样分子。也可以使用能够活化其它FGFR的药剂。在一个实施例 中，本发明所用FGFR-1活化剂包括肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖及FGF-2二者。
在再一方面中，本发明的哺乳动物表达系统包括基因工程哺乳动物细胞，其各自 包含一个或多个编码FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份及相关蛋白质的 重组表达盒。在一个实例中，FGFR-1-介导的信号转导途径的组成型活性组份是组成 型活性FGFR-1蛋白质。
本发明还涉及β-木糖苷或其它葡糖胺聚糖生物合成诱导剂在改良哺乳动物细胞 产生蛋白质方面的使用。适用于此目的的β-木糖苷的非限制性实例包括4-甲基伞形酮 基-β-D-木糖苷、p-硝基苯基-β-D-木糖苷及苄基-β-D-木糖苷。在一个实例中，哺乳动物 宿主细胞是在包含自约50或约100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷的培养基 中培养。β-木糖苷的使用可大大地增加哺乳动物宿主细胞的蛋白质产率。
使用本发明的哺乳动物表达系统可产生任何相关蛋白质。这些蛋白质的非限制性 实例包括胰岛素、生长激素、生长因子、红细胞生成素蛋白、促滤泡激素、干扰素、 白细胞介素、细胞因子、集落刺激因子、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、甲 状旁腺激素、骨形成蛋白、角质化细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子、高血糖素、凝血酶、血小板生成素、蛋白质C、分泌型卷曲基因 相关蛋白、选择蛋白、抗体、或病毒蛋白。这些蛋白质可为分泌、胞质、或膜结合蛋 白质。其可用于治疗、预防、诊断或其它医疗目的。在许多实例中，本发明所产生的 蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以引发这些蛋白质的细胞内在 化。
本发明进一步涉及包含由本发明哺乳动物表达系统产生的蛋白质的医药组合物。
另外，本发明涉及用于产生期望蛋白质的方法。一方面，本发明的方法包括在培 养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中每个宿主细胞包含编码相关蛋白质的重组表达盒， 且所述培养基含有有效量的肝素、硫酸肝素葡糖胺聚糖、或FGFR-1活化剂以增加所 述宿主细胞产生的相关蛋白质；并自所述宿主细胞或所述培养基分离所述相关蛋白质。
在一个实施例中，所述重组表达盒是由瞬时导入宿主细胞中的表达载体携带。在 将所述表达载体瞬时导入所述宿主细胞中后至少24小时，向培养基中添加肝素或硫酸 肝素葡糖胺聚糖。在另一实施例中，在将所述表达载体瞬时导入所述宿主细胞中后至 少48小时，向培养基中添加肝素或硫酸肝素葡糖胺聚糖。
在另一方面中，本发明的方法包括在培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中每个 宿主细胞包含一个或多个重组表达盒，其编码相关蛋白质及FGFR-1-介导的信号转导 途径的组成型活性组份；表达相关蛋白质及宿主细胞的组份；并自所述宿主细胞或所 述培养基分离所述相关蛋白质。
在一个实施例中，所述组成型活性组份是组成型活性FGFR-1蛋白质。在许多情 况下，使用本发明方法产生的蛋白质不能够与细胞表面硫酸肝素蛋白多糖相互作用以 引发这些蛋白质的细胞内在化。
本发明的其它特征、目标及优点在下列具体实施方式中明示。然而，应了解，所 述具体实施方式尽管指出本发明的较佳实施例，但仅出于说明目的而非限制本发明。 属于本发明范围的各种变化形式及修饰形式为那些熟习此项技术者根据具体实施方式 所知。
附图说明
附图仅出于说明目的而非限制本发明提供。
图1绘示本发明所用表达载体的限制酶切谱图。
图2阐明肝素对培养HEK293细胞中产生蛋白质的增进作用。
图3表明用于增加培养HEK293-EBNA细胞产生蛋白质的最佳肝素浓度是约25 微克/毫升。
图4显示肝素可增加分泌型卷曲基因相关蛋白质1(sFRP-1)在稳定HEK293细胞 系中的生产。
图5是一阐明肝素不会增加sFRP-1 mRNA水平的北方印迹图。
图6是一表明肝素对细胞内蛋白质合成的刺激作用的西方印迹图。
图7表明在没有肝素时纯化sFRP-1具有活性并稳定。图片A是来自传染293细 胞条件培养基的一对蛋白质在经过Nickel NTA管柱之后的洗脱特征曲线。使用尺寸排 除型管柱Superdex 200进一步纯化经镍纯化的材料。图片B是纯化sFRP-l-his6的考马 斯蓝(Coomassie blue)沾染凝胶。借助SDS-PAGE在还原(泳道1和3)或非还原(泳道 2和4)条件下分析经过Nickel NTA或Superdex 200后的蛋白质试样。图片C代表使用 经TCF-荧光素酶转染的U2OS细胞的纯化sFRP-1的Wnt-3拮抗活性荧光素酶分析。
图8是一表明肝素可刺激缺乏糖基化的CHO细胞系Lec.3.2.8.1中产生sFRP-1的 西方印迹图。在DNA转染后48小时用50微克/毫升肝素对经sFRP-1转染的Lec.3.2.8.1 细胞进行模拟处理或处理。在不同的时间点收集条件培养基并借助抗-his4抗体的免疫 印迹进行分析。
图9是一阐明经修饰肝素的作用的西方印迹图。经sFRP-1-转染的293细胞未受 到处理(-)或用肝素、N-脱硫酸化肝素、N-乙酰化肝素(dN-肝素)、或2-O-脱硫酸化肝素 (dO-肝素)(所有均以50微克/毫升)培育72小时。还可用指定浓度的4-甲基伞形酮 基7-β-D-木糖苷(Xyloside)处理所述细胞。收集培养基试样并借助抗-his4抗体的免疫印 迹进行分析。
图10表明纤维母细胞生长因子-2(FGF-2)可大大地改善肝素在不含血清培养基中 的作用。
图11显示阻断纤维母细胞生长因子受体-1(FGFR-1)可显著地削弱肝素增进蛋白 质生产的作用。
图12是一阐明肝素在HEK293瞬时表达中可增进人类基质金属蛋白酶23 (MMP-23)生产的西方印迹图。
图13是一阐明肝素在HEK293瞬时表达中可增进人类Dickkopf-1(DKK-1)生产的 西方印迹图。
具体实施方式
本发明涉及具有改良产率的哺乳动物表达系统，其用于产生分泌、胞质、或膜结 合蛋白质。一方面，本发明的表达系统包括在含有有效量肝素或肝素样分子的培养基 中培养的基因工程哺乳动物宿主细胞。每个基因工程哺乳动物宿主细胞包含编码相关 蛋白质的重组表达盒。肝素或肝素样分子在培养基中的存在可大大地增加相关蛋白质 的产率。另一方面，本发明的表达系统采用包含一个或多个编码相关蛋白质及组成型 活性FGFR-1或FGFR-1效应子的重组表达盒的基因工程哺乳动物宿主细胞。.与 FGFR-1或其效应子的共表达可大大地改善所述相关蛋白质的产率。
本发明的各个方面更具体地阐述于下列分段中。分段的使用并非欲限制本发明。 每个分段均可应用于本发明的任何方面。
A.肝素在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的使用
肝素可用于增进基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋白质。肝素是一种硫酸化葡糖 胺聚糖的非均相混合物。存于肝素中的主要糖单元包括α-L-艾杜糖醛酸2-硫酸、2-脱 氧-2-磺胺基-α-D-葡萄糖6-硫酸、α-D-葡糖醛酸、2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-葡萄糖、及α-L- 艾杜糖醛酸。这些糖是由糖苷键连接在一起，形成各种尺寸的聚合物。许多肝素分子 包含大量的二糖单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)，产生经深度O-硫酸化的多糖， 其中艾杜糖醛酸(IdoA)与葡糖醛酸(GlcA)的比例较高。由于其高酸性硫酸基团，肝素通 常在生理pH下会以阴离子形式存在。
本发明涵盖任一类别肝素的使用，所述肝素包括但不限于未经精制的肝素、经精 制的肝素、或低分子量的肝素(LMWH)。未经精制肝素的分子量可介于(但不限于) 自约3,000至约40,000Da，其中平均分子量是约15,000Da(大约40-50个单糖单元)。 许多市售肝素制剂的平均分子量是介于约12,000至约15,000Da之间。未经精制的肝 素可自各种脊椎动物组织(例如，猪肠粘膜、牛肠组织、或牛肺组织)制备。制备过 程通常会涉及对所述组织进行蛋白水解处理，随后实施萃取并与离子配对试剂复合。 可对未经精制的粗制肝素进一步实施分级沉淀、纯化或化学处理以产生细胞培养级别 或医药上可接受的肝素。
通常借助化学水解或酶水解自未经精制的肝素制备LMWH。许多市售LMWH制 剂的分子量可介于(例如)约2,000至9,000Da之间，其中平均分子量为约4,000至 5,000Da。
并非将本发明限制于任一个理论或作用模式，肝素可调节FGF(例如，FGF-2)与 FGFR(例如，FGFR-1)之间的相互作用，进而活化或有助于活化FGFR并且刺激一系 列下游信号而使得蛋白质合成及/或分泌增加。肝素单独也可以活化FGFR。
另外，肝素可与其它生长因子、细胞因子、或趋化因子结合。这些生长因子、细 胞因子、或趋化因子的非限制性实例包括血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因 子(VEGF)、多效生长因子、胎盘生长因子(P1GF)、血小板因子-4(PF-4)、肝素结合EGF- 样生长因子白细胞介素-8(IL-8)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、 转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-g-诱导蛋白-10(IP-10)、干扰素-γ(IFN-γ)、及HIV-Tat 反式活化因子。肝素与这些因子或其受体间的相互作用还可促进培养宿主细胞合成蛋 白质。
已经使用不同实验模型研究对负责其与FGF和FGFR之间相互作用的肝素的结构 要求。所述结果表明尺寸及硫酸化程度对于肝素引发FGF-2-FGFR相互作用的能力而 言十分重要。参见，例如，Ishihara等人(1993)J.Biol.Chem.268：4675-4683；Tyrrell 等人(1993)J.Biol.Chem.268：4684-4689；Guimond等人(1 993)J.Biol.Chem. 268：23906-23914；Avezier等人(1994)J.Biol.Chem.269：114-121；及Walker等人(1994) J.Biol.Chem.269：931-935。人们已经确定存于肝素或硫酸肝素中的最小FGF-2-结合序 列是一种五糖， 其含有二糖单元 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3 或 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。参见，例如，Maccarana等人(1993)J.Biol.Chem. 268：23898-23905。源自肝素的经深度硫酸化八糖或十糖片段还显示可介导FGF与其受 体之间的相互作用。参见，例如，Klagsbrun等人(1991)Cell 67：229-231及Ishihara等 人(见上文)。另外，肝素源四糖至八糖已经显示可与FGF-2结合但在刺激细胞增生 方面不如肝素源十糖及更长寡糖有效。参见Delehedde等人(2002)Biochem.J. 365：235-244。涉及经化学修饰肝素或硫酸肝素制剂的结合研究表明2-O-及N-硫酸基团 对于肝素/硫酸肝素与FGF-2之间的相互作用而言十分重要。另外，人们认为肝素需要 2-O-及N-硫酸基团以及6-O-硫酸基团以促进FGF-2与FGFR-1结合。参见，例如， Guimond等人，见上文。
已经试验性地确定了FGF上的肝素结合区存于所述蛋白质的NH2末端和COOH 末端中，其中碱性胺基酸残基可与肝素的硫酸基团相互作用。除了可促进肝素 -FGF-FGFR复合物形成之外，与肝素的缔合还可稳定FGF并保护其免受蛋白酶降解。 另外，FGFs(例如，FGF-2)可在与不参与任一FGFR相互作用的细胞表面硫酸肝素直 接结合后受到内在化。由此可推断：存于HS-FGF复合物中的HS可用作将FGF转运 到细胞核的穿梭体。
本发明所用培养基可包含有效地促进培养细胞产生蛋白质的任一量肝素。由于酸 性硫酸基团，肝素盐通常可用于细胞培养物。适宜肝素盐的非限制性实例包括肝素钠 盐、肝素钙盐、或肝素锂盐。培养基中肝素的浓度可介于(例如)1微克/毫升至1,000 微克/毫升、5微克/毫升至500微克/毫升、10微克/毫升至200微克/毫升、15微克/毫 升至100微克/毫升、或20微克/毫升至30微克/毫升之间。在一个实施例中，培养基 中肝素的浓度是约10、15、20、25、30、35、40、45或50微克/毫升。本发明所用肝 素可为任一类别，例如，未经精制的肝素、经精制的肝素、或LMWH。
许多类别的培养基可用于本发明。在一个实施例中，本发明所用培养基包括补充 有胎牛血清及有效量肝素或肝素样分子(例如，硫酸肝素葡糖胺聚糖)的基础培养基。 在许多实例中，所述培养基包含至少0.5％、1％、5％、或10％的胎牛血清。也可使用 其它动物血清或组织提取物。适宜基础培养基的实例包括但不限于MEM、MEM-α、 DMEM、RPMI、ISCOVE、Ham F12、HAM F10、M199、L15、6M、IMEM、RPMI-1640、 NCTC109、Fischer培养基、Waymouth培养基、Williams培养基、Madin-Darby牛肾培 养基、Madin-Darby犬肾培养基、或其混合物。按照宿主细胞的需要，这些基础培养 基可富含诸如下列等额外营养因子：例如，糖(例如，葡萄糖)、胺基酸(例如，谷胺酰 胺)、非必需氨基酸的混合剂、必需氨基酸的混合剂、肽、酸性盐(例如，丙酮酸钠)、 EDTA盐、柠檬酸衍生物、醇(例如，乙醇)、氨基醇(例如，乙醇胺)、维他命(例如，维 他命C或维他命E)、抗氧化剂(例如，谷胱甘肽或硒)、具有饱和链或不饱和链的脂肪 酸(例如，亚油酸、花生四烯酸、油酸、硬脂酸、或棕榈酸)、脂质、脂肽、或磷脂(例 如，卵磷脂)。诸如那些基于HEPES或碳酸氢盐者等缓冲溶液可用于某些脆性细胞培 养物或用于产生大量CO2的培养物。在许多情形中，需注意确保培养基的pH对于细 胞生长或蛋白质生产而言保持最佳(例如，介于6与8之间，介于7与8之间，或介于 7.2与7.5之间)且所述培养基保持等渗。
本发明还涉及不含血清或化学成份明确的培养基的使用。.在一个实施例中，本 发明所用不含血清的培养基包括有效量的肝素或肝素样分子及有效量的FGF。所用 FGF的浓度可介于(例如)1纳克至1,000纳克、10纳克至100纳克、或25纳克至 75纳克之间。FGF家族包含至少23个不同的成员。这些蛋白质具有宽广的促有丝分 裂活性及细胞存活活性并参与多个生物过程，包括胚发育、细胞生长、形态发生、组 织修复、肿瘤生长及侵染。相同种族的不同FGF成员的序列同源性相对较低。然而， FGF具有相当大的种族交叉反应性。
在一个实施例中，FGF-2与肝素或肝素样分子组合使用以刺激哺乳动物宿主细胞 产生蛋白质。在一个实例中，所用肝素或肝素样分子的浓度是介于5微克/毫升至200 微克/毫升之间(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200 微克/毫升)且所用FGF-2的浓度是介于10纳克/毫升至500纳克/毫升之间(例如，约10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500纳克/毫升)。据报 道，FGF-2可结合各种FGF受体，包括但不限于FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4 及FGFR-5。还报道：肝素或肝素样分子并非为FGF-2信号传导绝对必需但这些分子 与在其不存在时相比可在更低FGF-2浓度下促进信号传导。参见Padera等人，FASEB J.，13：1677-1687(1999)。
本发明进一步涵盖FGF-2的生物活性片段或变体在促进哺乳动物宿主细胞产生 蛋白质方面的使用。这些生物活性片段或变体保留至少实质部分的初始FGF-2蛋白质 的蛋白质生产增进活性。这些片段或变体可为自然存在的或经故意改造的。可通过氨 基酸取代、删除、插入或其它修饰来容易地制备期望FGF-2片段或变体。使用下文所 述实例中所述方法可容易地评定此片段或变体与肝素或肝素样分子组合使用时的蛋白 质生产增进活性。
适用于本发明的哺乳动物宿主细胞包括但不限于缺乏硫酸肝素葡糖胺聚糖 (HSGAG)合成的细胞或具有低水平的细胞表面HSGAG的细胞。适宜哺乳动物宿主细 胞的非限制性实例HEK293-FT(Invitrogen R700-07)、HEK293-EBNA(Invitrogen R62007)、CHO pgsA-745(美国典型培养物保藏中心或ATCC)、CHO pgsB-650(ATCC)、 CHO pgsD-677(ATCC)、CHO pgsB-61 8(ATCC)、及其它缺少硫酸肝素的CHO突变细 胞，例如那些阐述于Lidholt等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.，89：2267-2271(1992) 中者，所述文献的全文以引用方式并入本文中。也可使用其它哺乳动物宿主细胞，例 如，幼小仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、COS-1细胞、骨髓瘤NSO细胞、HKB细胞、 CV-1细胞、C127细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero cell)、Sp-2细胞、Madin-Darby肾细 胞、Madin-Darby犬肾细胞、及其它可自ATCC或其它商业来源获得的细胞系。另外， 本发明涵盖原代细胞培养物、组织培养物、器官培养物、或转基因哺乳动物在产生相 关蛋白质方面的使用。可通过静脉注射、皮下注射或其它适宜途径将肝素或肝素样分 子递送给转基因哺乳动物。在一个实例中，可使用植入体或导管将肝素或肝素样分子 递送给特定组织位点。
另外，本发明涉及杂合体或融合细胞在产生相关蛋白质方面的用途。可借助融合 一哺乳动物细胞与一癌细胞/永生细胞(例如，骨髓瘤细胞或胚细胞瘤)来形成杂合体细 胞。适用于此目的的方法包括但不限于电融合及化学融合(例如，聚乙二醇融合)。所 述哺乳动物细胞及所述癌细胞/永生细胞可源自相同或不同的种族。在许多实施例中， 所述癌细胞/永生细胞对一种或多种选择药剂敏感。例如，所述癌细胞/永生细胞可能会 对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基(其称作“HAT培养基”) 敏感。所述HAT敏感性癌细胞/永生细胞可与对HAT培养基不敏感的哺乳动物细胞融 合。针对可杀死未经融合细胞的HAT选择杂合体细胞。随后筛选具有期望特征的融合 细胞。
在一个实施例中，本发明所用杂合体细胞是杂交瘤细胞，其产生相关单克隆抗体。 在含有有效量肝素或肝素样分子的培养基中培养所述杂交瘤细胞可大大地增加所述单 克隆抗体的产率。在另一实施例中，本发明所用杂合体细胞包含编码相关蛋白质的重 组表达盒。可在融合事件之前或之后将重组表达盒导入杂合体细胞中。在许多情形中， 用于制备杂合体细胞的哺乳动物细胞或癌细胞/永生细胞缺乏HSGAG合成或具有低水 平的细胞表面HSGAG。
本发明所用每个哺乳动物宿主细胞(包括杂合体细胞)包含编码相关蛋白质的重组 表达盒。所述重组表达盒通常包含以可操作方式链接到表达控制序列的蛋白质编码序 列。编码相关蛋白质的蛋白质编码序列可为任一类别，例如，基因组序列、cDNA、 或其组合。用于指导相关蛋白质表达的适宜表达控制序列的选择是属于普通技术人员 所知领域的例行设计问题。适宜表达控制序列的非限制性实例包括启动子、增强子、 Kozak序列、聚腺苷酸化序列、或其它转录/转译调控序列。这些序列中的许多阐述于 文献中并可通过供应商获得。重组表达盒中所用启动子可为组成型或诱导型。
可通过各种方法将重组表达盒导入哺乳动物宿主细胞中。在一个实施例中，通过 转染或转导将包含所述重组表达盒的表达载体导入哺乳动物宿主细胞。示例性转染技 术包括但不限于磷酸钙介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的、 及电穿孔。转导通常是受重组病毒载体介导。适用于此目的的病毒载体的非限制性实 例包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、阿尔法病毒、星状病 毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘 病毒、或披膜病毒载体。经脂质体包裹的表达载体也可用于将重组表达盒导入哺乳动 物宿主细胞中。可以瞬时或稳定的方式将表达载体导入宿主细胞中。在许多情形中， 所用表达载体包含可选择经所述载体转染或转导的宿主细胞的可选标记。适宜可选标 记的非限制性实例包括新霉素(G418)、潮霉素、嘌呤霉素、zeocin、秋水仙碱(colchine)、 氨甲蝶呤、及甲硫氨酸磺酰亚胺。
也可通过修饰所述细胞的内源基因来将重组表达盒并入宿主细胞中。所述内源基 因编码相关蛋白质。可对所述内源基因的任一部分进行修饰以实现期望表达或调控作 用。例如，可用病毒启动子代替内源基因的启动子以增加所述基因在所述宿主细胞中 的表达水平。
按照本发明可产生任一相关蛋白质。这些蛋白质的非限制性实例包括治疗用、预 防用、或诊断用蛋白质，例如，激素、生长因子、白细胞介素、细胞因子、干扰素、 集落刺激因子、血液因子、抗体、疫苗、胶原、纤维蛋白原、人体血清白蛋白、组织 纤维蛋白溶酶原活化剂、抗凝剂、或用于先天性疾病的替代酶。这些蛋白质的具体实 例包括但不限于胰岛素、人体生长激素、红细胞生成素、人体促滤泡激素、绒毛膜促 性腺素、黄体生成激素、骨形成蛋白2、甲状旁腺激素、α干扰素、β干扰素、γ干扰 素、白细胞介素-1、白细胞介素-1拮抗剂、白细胞介素-2、白细胞介素-10、白细胞介 素-11、白细胞介素-12、角质化细胞生长因子、角质化细胞生长因子-2、人体粒细胞集 落刺激因子、人体粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、奈西立肽(nesiritide)、抗-凝血酶 III、凝血因子IX、凝血因子VIII、凝血因子VIIa、链激酶、尿激酶、葡糖脑苷脂酶、 α-D-半乳糖苷酶、αL-艾杜糖醛酸苷酶、α-1，4-葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶、腺苷脱氨酶、脱氧核糖核酸酶、阿替普酶(alteplase)、髓鞘碱性蛋白、 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶、高血糖素、单克隆抗 体靶向白细胞受体(例如，α4整合素拮抗剂、抗胸腺细胞球蛋白、CD2拮抗剂、CD3 拮抗剂、CD4拮抗剂、CD20拮抗剂、CD22拮抗剂、CD33拮抗剂、及CD52拮抗剂)、 单克隆抗体靶向细胞因子(例如，趋化因子拮抗剂、IL-2拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-5拮 抗剂、IL-6拮抗剂、IL-12拮抗剂、选择蛋白拮抗剂、及TNF-α拮抗剂)、单克隆抗体 靶向癌细胞标记或受体(例如，表皮生长因子拮抗剂、人体表皮生长因子受体2拮抗剂、 MUC-1拮抗剂、及血管内皮生长因子拮抗剂)、及其它单克隆抗体(例如，补体拮抗剂、 C5抑制剂、糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂、IgE拮抗剂、及呼吸道合胞病毒F-蛋白拮抗剂)。
按照本发明还可产生其它类别的抗体或抗体片段。这些抗体或抗体片段的实例包 括但不限于人源化抗体、人体抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂 合体抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、 Fv、scFv、Fd、或dAb。借助体外显示技术或进化策略所选高亲和性粘结体也可按照 本发明来产生。这些高亲和性粘结体包括但不限于肽、抗体、或抗体模拟物，例如， 那些阐述于Binz等人(2004)Nat.Biotechnol.22：575-582或Lipovsek等人(2004)J. Immunol.Methods290：51-67中者。
按照本发明可产生的其它相关蛋白质包括但不限于激酶、磷酸酶、G蛋白偶合受 体、生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞表面抗体(膜结合免疫球蛋白)、 BMP/GDF-受体、神经元受体、离子通道、蛋白酶、转录因子、聚合酶、凝血酶原、 凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、阿糖脑苷酶、伊米苷酶(imiglucerase)、血小板生成素、α-1 蛋白酶抑制剂、降钙素、依降钙素(elcatonin)、戈舍瑞林(goserelin)、那法瑞林 (nafarelin)、布舍瑞林(buserelin)、前胰岛素、胰岛素类似物、糊精、C-肽、生长抑 素、奥曲肽(octreotide)、血管升压素、促胰岛素、人体蛋白质C、囊性纤维化跨膜传 导调节蛋白、胰岛素样生长因子、神经生长因子、分泌型卷曲基因相关蛋白(例如， sFRP-1至5)、或选择蛋白(例如，选择蛋白P、选择蛋白E、或选择蛋白L)。
本发明还涉及病毒蛋白或其免疫原性片段的生产。这些病毒蛋白或片段可用于制 备用于消除针对相应病毒的免疫保护性反应的疫苗。这些病毒蛋白的非限制性实例包 括如下蛋白质：人体免疫缺陷病毒(例如，HIV-1及HIV-2)、流感病毒(例如，A、B 及C型流感病毒)、冠状病毒(例如，人体呼吸道冠状病毒)、肝炎病毒(例如，A型至 G型肝炎病毒)、或疱疹病毒(例如，HSV 1-9)。还可产生其它病毒蛋白质。rabies viru 这些病毒包括但不限于肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、沙粒病毒、淋巴 细胞性脉络丛脑膜炎病毒、静脉病毒(phlebovirus)、汉坦病毒(hantavirus)、环曲病 毒(torovirus)、类埃博拉病毒(Ebola-like virus)、丙型肝炎病毒、黄病毒、单纯病毒、 水痘病毒、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、淋巴隐病毒、索戈托病毒(thogotovirus)、正痘 病毒(orthopoxvirus)、贾恩科痘病毒(avipoxvirus)、粘液瘤亚群病毒(leporipoxvirus)、 慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)、狂犬病病毒属(lyssavirus)、诺拉弹状病毒 (novirhabdovirus)、水泡性病毒(vesiculovirus)、阿尔法病毒、bubivirus、鼻病毒、 口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、假狂犬病病毒、牛疱疹病毒、副粘病毒、新城疫病毒、 呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、细小病毒、乳多空病毒、轮状病毒、胃肠 炎病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒、风疹病毒、猪瘟病毒、或狂犬病病毒。
由本发明产生的相关蛋白质可为(但不限于)分泌蛋白、胞质蛋白、或膜结合蛋 白。相关蛋白质的序列可为天然存在序列或基因工程序列。在一个实施例中，相关蛋 白质是包含多肽标签的融合蛋白质，所述多肽标签有利于所述相关蛋白质的分离、纯 化、检测、固定化、稳定化、折叠、或靶向。适宜多肽标签的非限制性实例包括链霉 抗生素标签、FLAG标签、c-myc标签、多组氨酸标签、流感HA标签、VSV糖蛋白 标签、V5标签、单纯疱疹病毒标签、谷胱甘肽S-转移酶、或Fc片段。在某些情形中， 可借助所选蛋白酶自所述相关蛋白质解离所述多肽标签。
在另一实施例中，相关蛋白质包含有利于哺乳动物宿主细胞分泌所述蛋白质的信 号肽。所述信号肽可为所述相关蛋白质的内源肽或异源肽。信号肽可与信号识别粒子 相互作用并指导核糖体进入ER，其中发生共转译插入。许多信号肽因具有带正电荷的 残基而具有高疏水性。可借助信号肽酶(一种位于ER池表面的蛋白酶)自生长肽链 移除信号序列。因此，在许多情形中，自培养基分离的分泌蛋白并不具有初始信号肽。
在许多实施例中，由本发明产生的分泌蛋白或膜结合蛋白不会与细胞表面 HSGAG结合或相互作用。此可防止或减少所述蛋白质被哺乳动物宿主细胞吸收或内 在化。在一个实例中，由本发明产生的相关蛋白质不为类肝素酶或其基质为硫酸肝素 (HS)的酶。
可借助多种方法分离或纯化由本发明产生的相关蛋白质。适用于蛋白质分离/纯化 的初始材料的非限制性实例包括培养基或细胞裂解物。示例性分离方法包括但不限于 亲和层析(包括免疫亲和层析)、离子交换型层析、疏水作用层析、尺寸排除层析、HPLC、 蛋白质沉淀(包括免疫沉淀)、差示溶解、电泳、离心、结晶、或其组合。
在许多实施例中，所分离相关蛋白质实际上不含其它蛋白质或杂质。举例而言， 与其它蛋白质相比，所分离相关蛋白质的纯度可为至少50％、60％、70％、80％、90％、 95％、99％或100％。在一个实例中，分离蛋白质仅含有微量的会干扰其预期用途的杂 质。可使用标准技术(例如，SDS-PAGE或免疫分析)来检验或评定本发明的分离相 关蛋白质。适用于此目的的免疫分析包括但不限于西方印迹分析、ELISA、RIA、三明 治型或免疫测定分析、乳胶或其它粒子凝集、或蛋白质体芯片。蛋白质测序及质谱分 析还可用于检验或分析分离相关蛋白质。
而且，本发明涵盖肝素或肝素样分子在增加哺乳动物宿主细胞产生减毒病毒方面 的作用。这些减毒病毒可用于制备疫苗调配物。用于此目的的适宜哺乳动物宿主细胞 包括但不限于CHO细胞、BHK细胞、Vero细胞、Madin-Darby肾细胞、或Madin-Darby 犬肾细胞。应用于此目的的肝素或肝素样分子的数量可为任一可有效地改善减毒病毒 产率的数量(例如，自约10微克/毫升至1,000微克/毫升，例如，约10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100微克/毫升)。 当培养基是不含血清的培养基时，FGF-2或其它FGFR促效剂还可与肝素或肝素样分 子组合使用。FGF-2或其它FGF的有效量可介于(但不限于)10纳克/毫升至500纳 克/毫升之间(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 或500纳克/毫升)。另外，可将FGF添加到含有动物血清的培养基中以进一步改善减 毒病毒或其它相关蛋白质的产率。
B.肝素样分子或其它FGFR促效剂在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质方面的使用
本发明还涉及肝素样分子或其它FGFR促效剂在刺激哺乳动物宿主细胞产生蛋白 质方面的使用。肝素样分子的非限制性实例包括硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)，例如硫酸 肝素葡糖胺聚糖(HSGAG)；硫酸化蛋白多糖，例如硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)；或其片 段。适用于本发明的其它肝素样分子包括但不限于肝素寡糖、合成硫酸化聚合物、各 种经硫酸化分子、各种经磺化分子、合成聚芳香族化合物、通过聚合芳香环合成的聚 芳香族化合物、或其组合或片段。也可使用如在Casu(1985)Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 43：51-134中所述的肝素样分子，所述文献以引用方式并入 本文中。所有这些肝素样分子均可刺激哺乳动物宿主细胞(例如，缺乏硫酸肝素的哺乳 动物宿主细胞)产生蛋白质。在许多情形中，本发明所用肝素样分子经高度硫酸化且可 有利于活化培养细胞中FGFR信号传导。
已经确定有至少四个不同的FGFR家族成员一即，FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3及 FGFR-4。各FGFR彼此之间的不同在于其配体亲和性及组织分布。代表性全长FGFR 包含由多个免疫球蛋白样结构域构成的胞外区、单一疏水性跨膜区段、及细胞质酪氨 酸激酶结构域。在一个实施例中，本发明所用肝素样分子可活化或有利于活化培养细 胞中的FGFR-1。
人们认为细胞表面FGFR的活化参与FGF、FGFR及细胞表面HSGAG间的相互 作用。人们已经建议使用至少3个不同的模型来解释FGF及细胞表面HSGAG是如何 协作以引导FGFR活化的。在“生长激素”模型中，单一FGF可二聚化两个FGFR， 其中HSGAG与FGF及FGFR的细胞外结构域结合。在“HS依赖性二聚化”模型中， 所述HS链与两个FGF结合且二聚合配体马上二聚化FGFR。在“二聚体的二聚体” 模型中，FGF及HSGAG的两个独立复合体可达成FGFR二聚合，进而活化其细胞内 激酶结构域。
若干细胞表面GAG链经常会与小蛋白核心连结以形成HSPG。HSPG可通过核心 蛋白的疏水性跨膜结构域或通过共价键结到所述核心蛋白(跨膜HSPG)的糖基-磷脂酰 肌醇(GPI)锚形体锚定于细胞表面上。跨膜HSPG的非限制性实例包括但不限于磷脂酰 肌醇蛋白聚糖、脑蛋白聚糖(cerebroglycan)、β聚糖、基底膜蛋白聚糖、CD44、及共 结合蛋白聚糖家族的各成员(例如，共结合蛋白聚糖1、共结合蛋白聚糖2(纤维蛋白 聚糖)、共结合蛋白聚糖3(N-共结合蛋白聚糖)及共结合蛋白聚糖4(ryudocan)。磷脂酰 肌醇蛋白聚糖及脑蛋白聚糖还可通过共价GPI锚形体与细胞膜偶合。另外，HSPG可 通过与细胞表面大分子(外周膜HSPG)相互作用以非共价方式与细胞表面连结。
在一个实施例中，本发明涉及可溶性HSGAG或HSPG、或其片段在增进培养哺 乳动物细胞产生蛋白质方面的使用。可通过化学消化或酶消化固定或较大HSGAG或 HSPG分子来制备可溶性HSGAG或HSPG或其片段。举例而言，跨膜或GPI锚定HSPG 可通过其核心蛋白的蛋白酶解消化或内源磷脂酶作用自细胞膜释放。同样，HSGAG 链或片段可通过化学消化或酶消化多糖骨架来制备。可将有效量的可溶性HSGAG或 HSPG(或其片段)加入培养基中以刺激培养细胞产生蛋白质。在许多情形中，所用可溶 性HSGAG或HSPG(或其片段)的数量等于约10-200微克/毫升的肝素(例如，约10、 20、30、40、50、60、70、80、90或100微克/毫升的肝素)以产生蛋白质生产增进作 用。
在一个实例中，本发明所用可溶性HSGAG或HSPG(或其片段)包含至少一个二 糖单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。在另一实例中，本 发明所用所述可溶性HSGAG或HSPG(其片段)包含五糖、八糖或十糖，其含有二糖 单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。在又一实例中，本发 明所用可溶性HSGAG或HSPG(或其片段)包含复数个二糖单元 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。
除可呈可溶性形式之外，肝素或肝素样分子还可固定于基质上以刺激哺乳动物宿 主细胞产生蛋白质。在一个实例中，所述基质为培养宿主细胞提供实体支撑(例如，经 肝素-或肝素样分子涂布的培养板)。
另外，可通过增进细胞中HSGAG或HSPG的内源性合成来增加哺乳动物宿主细 胞产生蛋白质。硫酸肝素链的骨架似乎可借助具有葡萄糖苷酸基转移酶及N-乙酰基葡 萄糖胺基转移酶活性的硫酸肝素合酶来合成。所述主链可进一步经一系列磺基转移酶 及碳水化合物修饰酶(包括N-脱乙酰基酶N-磺基转移酶、C-5差向异构酶、2-O磺基 转移酶、6-O磺基转移酶及3-O磺基转移酶)修饰。因此，通过增加这些酶的表达或 活性，可增加细胞表面HSGAG或HSPG进而改善细胞产生蛋白质。为了达成此目的， 可将编码以上酶的表达载体导入哺乳动物宿主细胞中并使其与相关蛋白质共表达。
C.组成型活性FGFR或FGFR效应子在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质中的共表达
组成型活性FGFR或FGFR下游效应子可用于促进培养哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质。在许多人体癌症中已经观测到通过突变、基因融合或其它基因变换产生的组成 型活性FGFR。组成型活性FGFR突变体的实例包括但不限于具有I型致死性畸胎突 变的FGFR(例如，FGFR1或SEQ ID NO：1的Arg250→Cys突变及FGFR3或SEQ ID NO：2的Arg248→Cys突变)及在激酶结构域的活化环中具有错义突变的FGFR(例如， FGFR1或SEQ ID NO：1的Lys656→Glu突变及FGFR3或SEQ ID NO：2的Lys650→Glu 突变)。还可使用其它组成型活性FGFR突变体，例如，那些述于De Moerlooze等 人(1997)Curr.Opin.Genet.Dev.7：378-385，Wang等人(2002) Cancer Res. 62：1898-1903，或Wang等人(2004)Prostate 58：1-12中者，所有这些文献均以引用的 方式并入本文中。另外，本发明涵盖组成型活性嵌合FGFR的使用，例如，那些阐述 于Kudla等人(1998)J.Cell Biol.142：241-250中者，所述文献以引用方式并入本文中。 编码这些组成型活性FGFR的重组表达盒可容易地构建并将其导入哺乳动物宿主细胞 中。与此组成型活性FGFR的共表达可大大地增加相关蛋白质的产率。
本发明还涉及FGFR下游效应子在改善哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用 途。FGFR效应子的非限制性实例包括Crk(v-crk肉瘤病毒CT10致癌基因同系物)、磷 脂酶Cγ、纤维母细胞生长因子受体基质2及SHC(含有Src同源性2结构域)转化蛋白。 所有这些蛋白质是SH2-结构域蛋白质，这是因为这些蛋白质能够在其活化期间与 FGFR的磷酸酪氨酸残基结合。可用于本发明的其它FGFR效应子包括MAPK信号传 导途径中的各种组份，例如GRB2(生长因子受体结合蛋白2)、SOS1(无七子代同系物 1)、RRAS2(相关RAS病毒(r-ras)致癌基因同系物2)、RAF1(v-raf-1鼠科白血病病毒 致癌基因同系物1)、MAP2K1(促细胞分裂原活化的蛋白激酶激酶1)、MAP2K2(促细 胞分裂原活化的蛋白激酶激酶2)、MAPK1(促细胞分裂原活化的蛋白激酶1)、SRF(血 清响应因子或c-fos血清响应要素-结合转录因子)、FOS(v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病毒致 癌基因同系物)、ELK1(ELK1，ETS致癌基因家族的成员)、ELK4(ELK4、ETS-结构 域蛋白或SRF附属蛋白1)、及c-MYC(v-myc髓细胞瘤病病毒致癌基因同系物)。类似 于组成型活性FGFR，可容易地构建编码FGFR下游效应子的重组表达盒并将其导入 哺乳动物宿主细胞中且使其与相关蛋白质共表达。
D.葡糖胺聚糖生物合成诱导剂
本发明进一步涉及β-木糖苷或其它葡糖胺聚糖(GAG)生物合成诱导剂在改良哺乳 动物细胞产生蛋白质方面的用途。硫酸肝素可作为硫酸肝素蛋白多糖的葡糖胺聚糖组 份于体内合成。人们已经证实可通过下列开始GAG生物合成：将木糖残基自UDP-Xyl 转移到核心蛋白上丝氨酸残基的羟基基团，然后添加两个Gal残基及一个GlcA残基 以形成链接四糖GlcAβ1-3Glaβ1-3Galβ1-4Xylβ1。随后使用此链接四糖合成硫酸肝素。 已有报道：向细胞培养基中添加β-木糖苷可延长GAG链。
本发明表明向培养基中添加β-木糖苷可大大地增加培养哺乳动物宿主细胞产生 的蛋白质。适宜β-木糖苷的非限制性实例包括但不限于4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷、 p-硝基苯基-β-D-木糖苷及苄基-β-D-木糖苷。培养基中β-木糖苷的浓度可介于(例如) 10微克/毫升至500微克/毫升、20微克/毫升至200微克/毫升、或50微克/毫升至100 微克/毫升之间。培养基可进一步含有动物血清(例如，1％、5％、或10％的胎牛血清)， 或不含血清。当使用不含血清的培养基时，可补充FGF-2或其它FGF因子以进一步改 善培养哺乳动物宿主细胞的产率。在一个实例中，本发明所用培养基包含自约20至约 200微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。在另一实例中，所述培养基包含自约 50至约100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。本文所述任一相关蛋白质可由 经β-木糖苷或其它GAG生物合成诱导剂增强的哺乳动物表达系统产生。
E.医药组合物
由本发明产生的治疗用或预防用蛋白质可用于制备用于治疗或预防人类疾病的 医药组合物。本发明的医药组合物通常包括治疗或预防有效量的相关蛋白质及药理学 上可接受的载剂。本文所用“医药上可接受的载剂”可为任一溶剂、分散介质、涂布 剂、抗细菌剂或抗真菌剂、等渗或吸收延迟剂、或诸如此类。用于医药活性物质的此 等介质及药剂的使用为此项技术所熟知。还可将补充活性成份纳入本发明的医药组合 物中。
本发明医药组合物可通过任一常规途径投与，只要目标组织能够通过所述途径获 得所述医药组合物。此途径包括经口、鼻、口腔、直肠、阴道、或局部。或者，可通 过正位、皮内、皮下、肌内、腹膜腔内、瘤内、周边、导管插入、或静脉注射进行投 药。
本发明的医药组合物还可通过以非经肠方式或经腹膜腔内投与。可在适当地与表 面活性剂(例如，羟丙基纤维素)混合的水中制备相关蛋白质的溶液。分散液还可在 甘油、液体聚乙二醇、或其混合物中、或在油中制备。在一般储存及使用条件下，这 些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射使用的医药形式包括无菌水性溶液或分散液、或用于即时制备无菌可 注射溶液或分散液的无菌粉剂。在许多情形中，所述医药形式为无菌的且可流动达能 够方便地注射的程度。所述医药形式在生产及储存条件下也是稳定的且必须防止其受 到诸如细菌及真菌等微生物的污染作用。适宜医药载剂包括但不限于溶剂或分散介质， 其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇、及诸如此类)、 或植物油。通过使用(例如)诸如卵磷脂等涂布层、通过保持所需粒径(对于分散剂 而言)或通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。借助各种抗细菌剂或抗真菌剂(例 如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞、或诸如此类)可防止微生 物的作用。在许多情形中，其较佳应包括等渗剂，例如，糖类或氯化钠。可注射组合 物的延长吸收可借助延长吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝及明胶)来达成。
无菌可注射溶液可通过下述来制备：将所需量的治疗用或预防用蛋白质纳入含有 上述各种其它成份(视需要而定)的适宜溶剂中，随后进行无菌过滤。一般而言，分 散液是通过将各种经灭菌活性成份纳入含有基本分散介质及所需其它成份的无菌媒剂 中来制备。在使用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情形中，较佳制备方法为真空干燥 及冷冻干燥技术，其可产生由活性成份及任何所需附加成份(来自其先前经无菌过滤 的溶液)构成的粉末。
对于经口投药而言，可将由本发明产生的治疗用或预防用蛋白质与赋形剂一起纳 入并以非食入的漱口剂及洁牙剂形式使用。将所需量的治疗用或预防用蛋白质纳入例 如硼酸钠溶液(Dobell’s溶液)的适宜溶剂中来制备漱口剂。或者，可将治疗用或预防用 蛋白质纳入含有硼酸钠、甘油及碳酸氢钾的防腐洗剂中。还可将治疗用或预防用蛋白 质分散于洁牙剂、凝胶、糊剂、粉剂或浆液中。
调配后，组合物或溶液可以与剂量调配物相容的方式并以治疗或预防有效量投 与。剂量方案可由主治医师根据诸如下列等各种因素确定：蛋白质的作用、病状的位 点、疾病的严重程度、患者的年龄、性别及饮食、任何炎症的严重程度、投与时间、 及其它临床因素。在一个实例中，以最小有效剂量开始全身或注射投药，且所述剂量 在预选时间过程中会有所增加直至观测到正面效应。接下来，将递增剂量限于在考虑 到可能出现的任何副作用时产生相应增强效应的水平。
可通过标准医药程序在细胞培养物或实验动物模型中确定治疗用或预防用蛋白 质的毒性和治疗效果。举例而言，可借助习知方法确定相关蛋白质的LD50(对50％群 体致死的剂量)及ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比 即为治疗指数且其可表示为比率LD50/ED50。在许多情形中，选择可呈现大治疗指数 的治疗蛋白质。
应理解：上述实施例及下列实例是出于说明目的给出而非对本发明加以限制。那 些业内人员根据本说明书可知属于本发明范围的各种变化形式及修改形式。
F.实例
实例1.细胞培养物及DNA构建体
使哺乳动物细胞系(HEK293-FT、HEK293-EBNA、CHO-DUKX及Lec.3.2.8.1)在 具有5％CO2的湿润培养箱中于37℃下生长及维持。在补充有5％胎牛血清(FBS)的树 状293培养基(Invitrogen)中培养HEK293细胞。使CHO-DUKX稳定细胞系在含有10％ FBS及200 nM氨甲蝶呤(MTX)的α培养基中生长。在含有10％FBS及100nM MTX 的α介质中培养HEK293稳定细胞系。
在50毫升旋转器或1升旋转器中实施瞬时表达。对于50毫升培养体积，将25 微克质粒DNA与400微克聚乙烯亚胺(PEI，25kDa，直线型，用HCl中和达pH 7.0， 1毫克/毫升(Polysciences，Warrington，PA))在2.5毫升不含血清的293培养基中混合。 对于1升培养体积，将500微克DNA与4毫克PEI在50毫升不含血清的293培养基 中混合。然后将所述混合物与50毫升或1升HEK293细胞以0.5×106个细胞/毫升的 细胞密度在旋转器中于具有5％FBS的293培养基中混合。将所述旋转器在37℃下培 育同时使用P2005 Stirrer(Bellco)以170 rpm的转速旋转72-144小时，然后收获。
两载体(pSMED2及pSMEDA)用于DNA构建体。pSMEDA(一种pSMED2的衍 生物)阐述于图1中。将OriP元件插入pSMEDA中以便所述载体能够在含有EBNA-1 病毒抗原的细胞中受到扩增。此载体可使HEK293-EBNA细胞产生的蛋白质增加若干 倍。对于sFRP-1(分泌型卷曲基因相关蛋白1)构建体，在一终止密码子之前，将C端 His6标签及突变VFK312-314LE纳入PCR引物中。用SalI及EcoRI消化PCR产物。 将凝胶纯化DNA片段亚克隆到pSMED2中(产生pWZ1028)，或亚克隆到pSMEDA中 (产生pWZ1049)。
为了建立CHO-DUKX sFRP-1稳定细胞系，将构建体pWZ1028转染至 CHO-DUKX细胞中并持续三周针对50nM、100nM或200nM氨甲蝶呤(MTX)选择转 染瘤。在筛选72个菌落后，分离对200nM MTX具有抗性并具有最高表达水平sFRP-1 的三个克隆(即，200-10、200-11及200-12)。还发现HEK293细胞对100nM及以上浓 度的MTX敏感，但其具有两个二氢叶酸还原酶(DHFR)基因拷贝。为了构建sFRP-1 的HEK293稳定细胞系，将pWZ1028转染至HEK293-EBNA中并持续三周针对100nM 或250nM MTX选择转染瘤。然后分离两个最佳的克隆100-5及100-20。
实例2.肝素增进转染细胞产生sFRP-1
使C端经his6标记的sFRP-1在如实例1所述HEK293-FT细胞中瞬时表达。在 DNA转染期间或之后(“转染后诱导时间”，示于图2中)向所述细胞培养基中加入50 微克/毫升肝素(Sigma Chemical公司)。在不同时间点(“生长时间”，示于图2中)收 获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体(Qiagen) 以0.2微克/毫升实施免疫印迹分析(图2).免疫印迹法是按照Zhong等人(2004)FEBS Lett.562：111-117中所述实施。如图2中所示，肝素大大地增加了转染HEK293细胞产 生的sFRP-1。在DNA转染后48小时将肝素添加到培养基中时观测到最大增加。在其 它实验中，观测到重组表达聚集蛋白聚糖酶-1或聚集蛋白聚糖酶-2蛋白质没有出现此 增加(资料未示出)。
C端经His6标记的sFRP-1还在HEK293-EBNA细胞中瞬时表达。在DNA转染 后48小时时，向细胞培养物中添加不同浓度的肝素(“微克/毫升肝素”，示于图3中)。 在DNA转染后120小时或144小时时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质 试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图3)。图3显示用于增进蛋白质 生产的最佳肝素浓度是约25微克/毫升。
除了瞬时转染细胞之外，sFRP-1的稳定HEK293细胞系(克隆100-5及100-20)也 可用于评定肝素对蛋白质生产的刺激作用。使克隆100-5及100-20细胞在不同浓度胎 牛血清(“FBS”，示于图4中)存在下生长。添加50微克/毫升肝素及新鲜培养基。在 肝素处理后72小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克 隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图4)。肝素大大地增加了克隆100-5及100-20细胞 产生的sFRP-1。sFRP-1产生也随胎牛血清(FBS)浓度增加而增加，此表明FBS包含能 够刺激哺乳动物细胞产生蛋白质的因子。
借助北方印迹分析研究肝素对mRNA水平的作用。使用RNAqueous(Ambion)自 293细胞制备总RNA。借助1.1％琼脂糖/2％甲醛MOPS凝胶电泳解析10微克RNA， 用8×SSC印迹于Nytran Supercharge膜(Schleicher及Schuell)上并在50℃下与地高辛 标记的DNA探针于DIG easy Hyb溶液(Roche)中杂合过夜。在60℃下用0.5× SSC/0.1％SDS及0.2×SSC/0.1％SDS洗涤(GAPDH)后，将所述膜在Blocking试剂(Roche) 中封阻30分钟并用磷酸酶标记的碱性抗-地高辛抗体(Roche)(30分钟)及用Tris盐水 缓冲液/0.3％Tween 20探测。用Supersignal(Pierce)显示信号。借助PCR使用地高辛 标记的核苷酸(Roche)产生探针。如图5中所示，肝素没有增加sFRP-1的mRNA水平， 这是因为在经肝素处理细胞的mRNA数量与经模拟处理细胞的mRNA数量之间没有 明显的区别(泳道1对2、3对4、5对6)。因此，肝素不影响sFRP-1的DNA转录或 mRNA稳定性。其似乎可影响sFRP-1在其蛋白质合成期间的mRNA后过程。
为了评定肝素对细胞内蛋白质合成的影响，使sFRP-1在如上所述HEK293-FT细 胞中瞬时表达。在DNA转染后48小时添加50微克/毫升肝素。在120小时或144小 时时收获条件培养基及细胞沉淀。借助SDS-PAGE分离每一蛋白质试样并对小鼠单克 隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图6)。肝素增加了细胞内及细胞外sFRP-1，此表明 肝素可通过刺激细胞内蛋白质合成来增进哺乳动物细胞产生蛋白质。另外，没有观测 到分泌sFRP-1的细胞吸收。此表明：sFRP-1在培养介质中的聚集不是HSPG′介导的 胞吞作用受添加到所述介质中肝素抑制的结果。
为了查明肝素对sFRP-1的增进作用是否由蛋白质稳定化引起，对由HEK293细 胞产生的sFRP-1实施纯化。如实例1中所述，借助瞬时表达制备1升条件培养基。用 Nickel-NTA(Qiagen)将含有sFRP-l-his6的培养基在4℃下平衡约1小时。将所述树脂 以3,000rpm(SORVALL H-6000A/HBB-6)离心并在连接到HPLC之前填充到管柱 (Pharmacia Biotech)中。在用1M NaC1、25mM Tris-HCl pH7.5及15mM咪唑充分洗 涤后，用1M NaCl、25mM Tris-HCl pH 7.5及200mM咪唑洗脱sFRP-l-his6蛋白。使 用10K MWCO浓缩器(Vivascience)将所述洗脱液浓缩达2毫升。使所述试样再经过 SuperdexTM 200尺寸排除型管柱(SEC)管柱(Pharmacia Biotech)，存于1M NaCl，25mM Tris-HCl pH7.5中。所述蛋白质在经过Nickel-NTA后得到实质纯化(图7A，左平板及 图7B，泳道1和2)，且其在经过Superdex 200后近乎为均质(图7A，右平板及图7B， 泳道3和4)。
通过在280纳米下的吸光率测定蛋白质浓度。在经过Nickel-NTA后的蛋白质产 率为约2.5毫克/升且在经过SEC后的蛋白质产率为约1毫克/升。在SEC分析中， sFRP-1-his6作为单体运行(图7A，右平板)，其与作为38 kDa多肽的sFRP-1在非还原 条件下的迁移一致(图7B，泳道4)。N端测序及质谱分析证实了sFRP-1的身份并显示 所述蛋白质经深度糖基化(资料未示出)。当在室温下培育时，经纯化sFRP-1蛋白质于 不存在肝素时非常稳定(资料未示出)。为了测定经纯化sFRP-1蛋白质是否具有活性， 量测sFRP-1的Wnt3拮抗活性。如图7C中所示，在转染U2OS细胞中，Wnt3可增加 TCF荧光素酶受体基因表达(Bhat等人(2004)Protein Expr.Purif.37：327-335)。 Nickel-NTA纯化sFRP-1或SEC纯化sFRP-1的添加以剂量依赖方式降低Wnt介导的 响应，而缓冲液对Wnt-介导的TCF-荧光素酶受体活化无影响。这些资料清楚地表明： 于不存在肝素时，纯化sFRP-1是稳定的且可起作用。
还在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中观测到肝素对蛋白质产生的刺激作用。野生型 CHO细胞可合成内源肝素样分子，硫酸肝素葡糖胺聚糖(HSGAG)。然而，当使用30mM 氯酸盐(一种硫酸肝素合成抑制剂)将野生型CHO细胞预处理48小时时，所述细胞或 变得对肝素敏感。实验表明：肝素在瞬时表达及稳定表达条件下均能够增进经氯酸盐 处理的CHO细胞产生蛋白质。为了进一步表征对用于sFRP-1分泌的肝素的要求，使 用缺少糖基化的CHO细胞系Lec3.2.8.1，其携带4个糖基化突变(Stanley(1989)Mol. Cell.Biol.9：377-383)。此细胞系表达大多数经明显修饰的碳水化合物结构及严格截短 的N-链接及O-链接碳水化合物。如图8中所示，肝素刺激突变体CHO细胞系分泌 sFRP-1(泳道1-6)。
肝素结合蛋白质与HS之间的相互作用可通过所述序列及HS糖部分的硫酸化水 平来测定(Esko等人(2002)Annu.Rev.Biochem..71：435-471)。为了测试O-硫酸化及N- 硫酸化是否为sFRP-1分泌中肝素活性所需，将sFRP-1转染293细胞与完全经N-脱硫 酸化，随后经N-乙酰化的化学修饰肝素(Sigma Chemical公司)一起培育。还需检查缺 少2-O-硫酸化的经修饰肝素(Sigma)刺激sFRP-1分泌的能力。如图9中所示，2-O-脱 硫酸化肝素完全丧失了其刺激sFRP-1分泌的能力(泳道4)。相反，N-脱硫酸化肝素(泳 道3)与未经修饰肝素同样有效，此表明sFRP-1刺激需要O-硫酸化而非N-硫酸化。而 且，以50及100纳克/毫升添加4-甲基伞形酮基7-β-D-木糖苷(Sigma Chemical公司) (即一种可代替蛋白多糖核心蛋白的线性部分进而可用作葡糖胺聚糖生物合成的可溶 性引物的木糖苷)刺激sFRP-1分泌(泳道5和6)，模拟肝素的作用。
实例3.FGF-2增进转染细胞产生蛋白质
使来自稳定地超表达sFRP-1(克隆100-5)的HEK293细胞系的细胞在6-孔平板中 生长至铺满状态；然后用含有50微克/毫升肝素的新鲜无血清培养基代替所述培养基。 向对应孔的所述介质中加入50纳克/毫升的纤维母细胞生长因子-1(FGF-1，Sigma Chemical公司)或纤维母细胞生长因子-2(FGF-2，Sigma Chemical公司)。在培养基替 换后48小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4 抗体实施免疫印迹分析(图10)。如图10中所表明，FGF-2与肝素的组合可显著增加经 稳定转染HEK293细胞产生的sFRP-1。
因此，FGF-2与肝素可以转录后方式调控蛋白质合成，这是因为北方印迹分析显 示sFRP-1的mRNA水平并不受肝素存在的影响(图5)。不希望受限于理论，肝素可影 响蛋白质转译的过程，这是因为FGF已经显示影响其靶蛋白的转译(Szebenyi等人 (1999)Int.Rev.Cvtol)。FGF还可活化某些其产物可上调转译过程的靶基因。另一种可 能是所述FGF途径可有利于沿分泌途径运输蛋白质。越来越多的证据表明：蛋白质分 泌及表面局域化受一系列信号转导途径(例如，未折叠蛋白质反应)的严密控制 (Schroder等人(2005)Annu.Rev.Biochem.74：739-789)。许多ER伴侣蛋白已经显示可 促进细胞表面局域化及不同客体蛋白的分泌。肝素及FGF-2可活化这些机制并促进重 组蛋白的分泌。
4.刺激FGFR-1可增进转染细胞产生蛋白质
使来自稳定地超表达sFRP-1(克隆100-5)的HEK293细胞系的细胞在6-孔平板中 生长至铺满状态且然后用兔多克隆抗-FGFR-1或抗-FGFR-2抗体(Sigma Chemical公司) 预处理或模拟处理6小时。接下来，用50微克/毫升肝素处理所述细胞。在肝素处理 后48小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4 抗体实施免疫印迹分析(图11)。所述资料表明：用抗-FGFR-1而非用抗-FGFR-2进行 预处理大大地降低了肝素引发的蛋白质增量作用。
实例5. 肝素增进转染细胞产生MMP-23及DKK-1蛋白质
使具有存于pSMEDA中的C端His6标签的金属蛋白酶MMP-23在补充有5％FBS 的培养基中于HEK293-EBNA细胞中瞬时表达。在转染后24小时，转染细胞转变成 具有各种浓度FBS的新鲜介质。向某些反应物中加入50微克/毫升肝素。在96小时时 收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体实施免 疫印迹分析。如图12中所示，肝素大大地增加了所观测得MMP23-his6蛋白质水平。
使具有存于pcDNA3.1中的C端myc标签的人体Dickkopf-1(DKK-1)在补充有5％ FBS的培养基中于HEK293-FT细胞中瞬时表达。在DNA转染后24小时，向所述细 胞培养物中加入50微克/毫升的肝素。在96小时时收获条件培养基(S)及细胞沉淀(P)。 借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-myc抗体实施免疫印迹分析。如图 13中所示，肝素大大地增加了DKK1-myc蛋白质的水平。
本发明的上述说明提供阐释及说明，但并非意欲包罗无遗或将本发明限制于所揭 示具体内容。符合以上教示内容的修饰形式及变化形式可能存在或可自本发明实践获 取。因此，值得注意的是，本发明的范围是由权利要求书及其等效形式界定。
本发明的各个方面更具体地阐述于下列分段中。分段的使用并非欲限制本发明。 每个分段均可应用于本发明的任何方面。
A.肝素在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的使用
肝素可用于增进基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋白质。肝素是一种硫酸化葡糖 胺聚糖的非均相混合物。存于肝素中的主要糖单元包括α-L-艾杜糖醛酸2-硫酸、2-脱 氧-2-磺胺基-α-D-葡萄糖6-硫酸、α-D-葡糖醛酸、2-乙酰胺基-2-脱氧-α-D-葡萄糖、及α-L- 艾杜糖醛酸。这些糖是由糖苷键连接在一起，形成各种尺寸的聚合物。许多肝素分子 包含大量的二糖单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)，产生经深度O-硫酸化的多糖， 其中艾杜糖醛酸(IdoA)与葡糖醛酸(GlcA)的比例较高。由于其高酸性硫酸基团，肝素通 常在生理pH下会以阴离子形式存在。
本发明涵盖任一类别肝素的使用，所述肝素包括但不限于未经精制的肝素、经精 制的肝素、或低分子量的肝素(LMWH)。未经精制肝素的分子量可介于(但不限于) 自约3,000至约40,000Da，其中平均分子量是约15,000Da(大约40-50个单糖单元)。 许多市售肝素制剂的平均分子量是介于约12,000至约15,000Da之间。未经精制的肝 素可自各种脊椎动物组织(例如，猪肠粘膜、牛肠组织、或牛肺组织)制备。制备过 程通常会涉及对所述组织进行蛋白水解处理，随后实施萃取并与离子配对试剂复合。 可对未经精制的粗制肝素进一步实施分级沉淀、纯化或化学处理以产生细胞培养级别 或医药上可接受的肝素。
通常借助化学水解或酶水解自未经精制的肝素制备LMWH。许多市售LMWH制 剂的分子量可介于(例如)约2,000至9,000Da之间，其中平均分子量为约4,000至 5,000Da。
并非将本发明限制于任一个理论或作用模式，肝素可调节FGF(例如，FGF-2)与 FGFR(例如，FGFR-1)之间的相互作用，进而活化或有助于活化FGFR并且刺激一系 列下游信号而使得蛋白质合成及/或分泌增加。肝素单独也可以活化FGFR。
另外，肝素可与其它生长因子、细胞因子、或趋化因子结合。这些生长因子、细 胞因子、或趋化因子的非限制性实例包括血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因 子(VEGF)、多效生长因子、胎盘生长因子(P1GF)、血小板因子-4(PF-4)、肝素结合EGF- 样生长因子白细胞介素-8(IL-8)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1)、 转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-g-诱导蛋白-10(IP-10)、干扰素-γ(IFN-γ)、及HIV-Tat 反式活化因子。肝素与这些因子或其受体间的相互作用还可促进培养宿主细胞合成蛋 白质。
已经使用不同实验模型研究对负责其与FGF和FGFR之间相互作用的肝素的结构 要求。所述结果表明尺寸及硫酸化程度对于肝素引发FGF-2-FGFR相互作用的能力而 言十分重要。参见，例如，Ishihara等人(1993)J.Biol.Chem.268：4675-4683；Tyrrell 等人(1993)J.Biol.Chem.268：4684-4689；Guimond等人(1 993)J.Biol.Chem. 268：23906-23914；Avezier等人(1994)J.Biol.Chem.269：114-121；及Walker等人(1994) J.Biol.Chem.269：931-935。人们已经确定存于肝素或硫酸肝素中的最小FGF-2-结合序 列是一种五糖， 其含有二糖单元 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3 或 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。参见，例如，Maccarana等人(1993)J.Biol.Chem. 268：23898-23905。源自肝素的经深度硫酸化八糖或十糖片段还显示可介导FGF与其受 体之间的相互作用。参见，例如，Klagsbrun等人(1991)Cell 67：229-231及Ishihara等 人(见上文)。另外，肝素源四糖至八糖已经显示可与FGF-2结合但在刺激细胞增生 方面不如肝素源十糖及更长寡糖有效。参见Delehedde等人(2002)Biochem.J. 365：235-244。涉及经化学修饰肝素或硫酸肝素制剂的结合研究表明2-O-及N-硫酸基团 对于肝素/硫酸肝素与FGF-2之间的相互作用而言十分重要。另外，人们认为肝素需要 2-O-及N-硫酸基团以及6-O-硫酸基团以促进FGF-2与FGFR-1结合。参见，例如， Guimond等人，见上文。
已经试验性地确定了FGF上的肝素结合区存于所述蛋白质的NH2末端和COOH 末端中，其中碱性胺基酸残基可与肝素的硫酸基团相互作用。除了可促进肝素 -FGF-FGFR复合物形成之外，与肝素的缔合还可稳定FGF并保护其免受蛋白酶降解。 另外，FGFs(例如，FGF-2)可在与不参与任一FGFR相互作用的细胞表面硫酸肝素直 接结合后受到内在化。由此可推断：存于HS-FGF复合物中的HS可用作将FGF转运 到细胞核的穿梭体。
本发明所用培养基可包含有效地促进培养细胞产生蛋白质的任一量肝素。由于酸 性硫酸基团，肝素盐通常可用于细胞培养物。适宜肝素盐的非限制性实例包括肝素钠 盐、肝素钙盐、或肝素锂盐。培养基中肝素的浓度可介于(例如)1微克/毫升至1,000 微克/毫升、5微克/毫升至500微克/毫升、10微克/毫升至200微克/毫升、15微克/毫 升至100微克/毫升、或20微克/毫升至30微克/毫升之间。在一个实施例中，培养基 中肝素的浓度是约10、15、20、25、30、35、40、45或50微克/毫升。本发明所用肝 素可为任一类别，例如，未经精制的肝素、经精制的肝素、或LMWH。
许多类别的培养基可用于本发明。在一个实施例中，本发明所用培养基包括补充 有胎牛血清及有效量肝素或肝素样分子(例如，硫酸肝素葡糖胺聚糖)的基础培养基。 在许多实例中，所述培养基包含至少0.5％、1％、5％、或10％的胎牛血清。也可使用 其它动物血清或组织提取物。适宜基础培养基的实例包括但不限于MEM、MEM-α、 DMEM、RPMI、ISCOVE、Ham F12、HAM F10、M199、L15、6M、IMEM、RPMI-1640、 NCTC109、Fischer培养基、Waymouth培养基、Williams培养基、Madin-Darby牛肾培 养基、Madin-Darby犬肾培养基、或其混合物。按照宿主细胞的需要，这些基础培养 基可富含诸如下列等额外营养因子：例如，糖(例如，葡萄糖)、胺基酸(例如，谷胺酰 胺)、非必需氨基酸的混合剂、必需氨基酸的混合剂、肽、酸性盐(例如，丙酮酸钠)、 EDTA盐、柠檬酸衍生物、醇(例如，乙醇)、氨基醇(例如，乙醇胺)、维他命(例如，维 他命C或维他命E)、抗氧化剂(例如，谷胱甘肽或硒)、具有饱和链或不饱和链的脂肪 酸(例如，亚油酸、花生四烯酸、油酸、硬脂酸、或棕榈酸)、脂质、脂肽、或磷脂(例 如，卵磷脂)。诸如那些基于HEPES或碳酸氢盐者等缓冲溶液可用于某些脆性细胞培 养物或用于产生大量CO2的培养物。在许多情形中，需注意确保培养基的pH对于细 胞生长或蛋白质生产而言保持最佳(例如，介于6与8之间，介于7与8之间，或介于 7.2与7.5之间)且所述培养基保持等渗。
本发明还涉及不含血清或化学成份明确的培养基的使用。.在一个实施例中，本 发明所用不含血清的培养基包括有效量的肝素或肝素样分子及有效量的FGF。所用 FGF的浓度可介于(例如)1纳克至1,000纳克、10纳克至100纳克、或25纳克至 75纳克之间。FGF家族包含至少23个不同的成员。这些蛋白质具有宽广的促有丝分 裂活性及细胞存活活性并参与多个生物过程，包括胚发育、细胞生长、形态发生、组 织修复、肿瘤生长及侵染。相同种族的不同FGF成员的序列同源性相对较低。然而， FGF具有相当大的种族交叉反应性。
在一个实施例中，FGF-2与肝素或肝素样分子组合使用以刺激哺乳动物宿主细胞 产生蛋白质。在一个实例中，所用肝素或肝素样分子的浓度是介于5微克/毫升至200 微克/毫升之间(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、或200 微克/毫升)且所用FGF-2的浓度是介于10纳克/毫升至500纳克/毫升之间(例如，约10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、或500纳克/毫升)。据报 道，FGF-2可结合各种FGF受体，包括但不限于FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4 及FGFR-5。还报道：肝素或肝素样分子并非为FGF-2信号传导绝对必需但这些分子 与在其不存在时相比可在更低FGF-2浓度下促进信号传导。参见Padera等人，FASEB J.，13：1677-1687(1999)。
本发明进一步涵盖FGF-2的生物活性片段或变体在促进哺乳动物宿主细胞产生 蛋白质方面的使用。这些生物活性片段或变体保留至少实质部分的初始FGF-2蛋白质 的蛋白质生产增进活性。这些片段或变体可为自然存在的或经故意改造的。可通过氨 基酸取代、删除、插入或其它修饰来容易地制备期望FGF-2片段或变体。使用下文所 述实例中所述方法可容易地评定此片段或变体与肝素或肝素样分子组合使用时的蛋白 质生产增进活性。
适用于本发明的哺乳动物宿主细胞包括但不限于缺乏硫酸肝素葡糖胺聚糖 (HSGAG)合成的细胞或具有低水平的细胞表面HSGAG的细胞。适宜哺乳动物宿主细 胞的非限制性实例HEK293-FT(Invitrogen R700-07)、HEK293-EBNA(Invitrogen R62007)、CHO pgsA-745(美国典型培养物保藏中心或ATCC)、CHO pgsB-650(ATCC)、 CHO pgsD-677(ATCC)、CHO pgsB-61 8(ATCC)、及其它缺少硫酸肝素的CHO突变细 胞，例如那些阐述于Lidholt等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.，89：2267-2271(1992) 中者，所述文献的全文以引用方式并入本文中。也可使用其它哺乳动物宿主细胞，例 如，幼小仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞、COS-1细胞、骨髓瘤NSO细胞、HKB细胞、 CV-1细胞、C127细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero cell)、Sp-2细胞、Madin-Darby肾细 胞、Madin-Darby犬肾细胞、及其它可自ATCC或其它商业来源获得的细胞系。另外， 本发明涵盖原代细胞培养物、组织培养物、器官培养物、或转基因哺乳动物在产生相 关蛋白质方面的使用。可通过静脉注射、皮下注射或其它适宜途径将肝素或肝素样分 子递送给转基因哺乳动物。在一个实例中，可使用植入体或导管将肝素或肝素样分子 递送给特定组织位点。
另外，本发明涉及杂合体或融合细胞在产生相关蛋白质方面的用途。可借助融合 一哺乳动物细胞与一癌细胞/永生细胞(例如，骨髓瘤细胞或胚细胞瘤)来形成杂合体细 胞。适用于此目的的方法包括但不限于电融合及化学融合(例如，聚乙二醇融合)。所 述哺乳动物细胞及所述癌细胞/永生细胞可源自相同或不同的种族。在许多实施例中， 所述癌细胞/永生细胞对一种或多种选择药剂敏感。例如，所述癌细胞/永生细胞可能会 对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤及胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基(其称作“HAT培养基”) 敏感。所述HAT敏感性癌细胞/永生细胞可与对HAT培养基不敏感的哺乳动物细胞融 合。针对可杀死未经融合细胞的HAT选择杂合体细胞。随后筛选具有期望特征的融合 细胞。
在一个实施例中，本发明所用杂合体细胞是杂交瘤细胞，其产生相关单克隆抗体。 在含有有效量肝素或肝素样分子的培养基中培养所述杂交瘤细胞可大大地增加所述单 克隆抗体的产率。在另一实施例中，本发明所用杂合体细胞包含编码相关蛋白质的重 组表达盒。可在融合事件之前或之后将重组表达盒导入杂合体细胞中。在许多情形中， 用于制备杂合体细胞的哺乳动物细胞或癌细胞/永生细胞缺乏HSGAG合成或具有低水 平的细胞表面HSGAG。
本发明所用每个哺乳动物宿主细胞(包括杂合体细胞)包含编码相关蛋白质的重组 表达盒。所述重组表达盒通常包含以可操作方式链接到表达控制序列的蛋白质编码序 列。编码相关蛋白质的蛋白质编码序列可为任一类别，例如，基因组序列、cDNA、 或其组合。用于指导相关蛋白质表达的适宜表达控制序列的选择是属于普通技术人员 所知领域的例行设计问题。适宜表达控制序列的非限制性实例包括启动子、增强子、 Kozak序列、聚腺苷酸化序列、或其它转录/转译调控序列。这些序列中的许多阐述于 文献中并可通过供应商获得。重组表达盒中所用启动子可为组成型或诱导型。
可通过各种方法将重组表达盒导入哺乳动物宿主细胞中。在一个实施例中，通过 转染或转导将包含所述重组表达盒的表达载体导入哺乳动物宿主细胞。示例性转染技 术包括但不限于磷酸钙介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的、 及电穿孔。转导通常是受重组病毒载体介导。适用于此目的的病毒载体的非限制性实 例包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、阿尔法病毒、星状病 毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘 病毒、或披膜病毒载体。经脂质体包裹的表达载体也可用于将重组表达盒导入哺乳动 物宿主细胞中。可以瞬时或稳定的方式将表达载体导入宿主细胞中。在许多情形中， 所用表达载体包含可选择经所述载体转染或转导的宿主细胞的可选标记。适宜可选标 记的非限制性实例包括新霉素(G418)、潮霉素、嘌呤霉素、zeocin、秋水仙碱(colchine)、 氨甲蝶呤、及甲硫氨酸磺酰亚胺。
也可通过修饰所述细胞的内源基因来将重组表达盒并入宿主细胞中。所述内源基 因编码相关蛋白质。可对所述内源基因的任一部分进行修饰以实现期望表达或调控作 用。例如，可用病毒启动子代替内源基因的启动子以增加所述基因在所述宿主细胞中 的表达水平。
按照本发明可产生任一相关蛋白质。这些蛋白质的非限制性实例包括治疗用、预 防用、或诊断用蛋白质，例如，激素、生长因子、白细胞介素、细胞因子、干扰素、 集落刺激因子、血液因子、抗体、疫苗、胶原、纤维蛋白原、人体血清白蛋白、组织 纤维蛋白溶酶原活化剂、抗凝剂、或用于先天性疾病的替代酶。这些蛋白质的具体实 例包括但不限于胰岛素、人体生长激素、红细胞生成素、人体促滤泡激素、绒毛膜促 性腺素、黄体生成激素、骨形成蛋白2、甲状旁腺激素、α干扰素、β干扰素、γ干扰 素、白细胞介素-1、白细胞介素-1拮抗剂、白细胞介素-2、白细胞介素-10、白细胞介 素-11、白细胞介素-12、角质化细胞生长因子、角质化细胞生长因子-2、人体粒细胞集 落刺激因子、人体粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、奈西立肽(nesiritide)、抗-凝血酶 III、凝血因子IX、凝血因子VIII、凝血因子VIIa、链激酶、尿激酶、葡糖脑苷脂酶、 α-D-半乳糖苷酶、αL-艾杜糖醛酸苷酶、α-1，4-葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖醛 酸-2-硫酸酯酶、腺苷脱氨酶、脱氧核糖核酸酶、阿替普酶(alteplase)、髓鞘碱性蛋白、 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、酪氨酸羟化酶、多巴脱羧酶、高血糖素、单克隆抗 体靶向白细胞受体(例如，α4整合素拮抗剂、抗胸腺细胞球蛋白、CD2拮抗剂、CD3 拮抗剂、CD4拮抗剂、CD20拮抗剂、CD22拮抗剂、CD33拮抗剂、及CD52拮抗剂)、 单克隆抗体靶向细胞因子(例如，趋化因子拮抗剂、IL-2拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-5拮 抗剂、IL-6拮抗剂、IL-12拮抗剂、选择蛋白拮抗剂、及TNF-α拮抗剂)、单克隆抗体 靶向癌细胞标记或受体(例如，表皮生长因子拮抗剂、人体表皮生长因子受体2拮抗剂、 MUC-1拮抗剂、及血管内皮生长因子拮抗剂)、及其它单克隆抗体(例如，补体拮抗剂、 C5抑制剂、糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂、IgE拮抗剂、及呼吸道合胞病毒F-蛋白拮抗剂)。
按照本发明还可产生其它类别的抗体或抗体片段。这些抗体或抗体片段的实例包 括但不限于人源化抗体、人体抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂 合体抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、 Fv、scFv、Fd、或dAb。借助体外显示技术或进化策略所选高亲和性粘结体也可按照 本发明来产生。这些高亲和性粘结体包括但不限于肽、抗体、或抗体模拟物，例如， 那些阐述于Binz等人(2004)Nat.Biotechnol.22：575-582或Lipovsek等人(2004)J. Immunol.Methods290：51-67中者。
按照本发明可产生的其它相关蛋白质包括但不限于激酶、磷酸酶、G蛋白偶合受 体、生长因子受体、细胞因子受体、趋化因子受体、细胞表面抗体(膜结合免疫球蛋白)、 BMP/GDF-受体、神经元受体、离子通道、蛋白酶、转录因子、聚合酶、凝血酶原、 凝血酶、α-1抗胰蛋白酶、阿糖脑苷酶、伊米苷酶(imiglucerase)、血小板生成素、α-1 蛋白酶抑制剂、降钙素、依降钙素(elcatonin)、戈舍瑞林(goserelin)、那法瑞林 (nafarelin)、布舍瑞林(buserelin)、前胰岛素、胰岛素类似物、糊精、C-肽、生长抑 素、奥曲肽(octreotide)、血管升压素、促胰岛素、人体蛋白质C、囊性纤维化跨膜传 导调节蛋白、胰岛素样生长因子、神经生长因子、分泌型卷曲基因相关蛋白(例如， sFRP-1至5)、或选择蛋白(例如，选择蛋白P、选择蛋白E、或选择蛋白L)。
本发明还涉及病毒蛋白或其免疫原性片段的生产。这些病毒蛋白或片段可用于制 备用于消除针对相应病毒的免疫保护性反应的疫苗。这些病毒蛋白的非限制性实例包 括如下蛋白质：人体免疫缺陷病毒(例如，HIV-1及HIV-2)、流感病毒(例如，A、B 及C型流感病毒)、冠状病毒(例如，人体呼吸道冠状病毒)、肝炎病毒(例如，A型至 G型肝炎病毒)、或疱疹病毒(例如，HSV 1-9)。还可产生其它病毒蛋白质。rabies viru 这些病毒包括但不限于肺炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、沙粒病毒、淋巴 细胞性脉络丛脑膜炎病毒、静脉病毒(phlebovirus)、汉坦病毒(hantavirus)、环曲病 毒(torovirus)、类埃博拉病毒(Ebola-like virus)、丙型肝炎病毒、黄病毒、单纯病毒、 水痘病毒、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、淋巴隐病毒、索戈托病毒(thogotovirus)、正痘 病毒(orthopoxvirus)、贾恩科痘病毒(avipoxvirus)、粘液瘤亚群病毒(leporipoxvirus)、 慢病毒、泡沫病毒(spumavirus)、狂犬病病毒属(lyssavirus)、诺拉弹状病毒 (novirhabdovirus)、水泡性病毒(vesiculovirus)、阿尔法病毒、bubivirus、鼻病毒、 口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、假狂犬病病毒、牛疱疹病毒、副粘病毒、新城疫病毒、 呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、细小病毒、乳多空病毒、轮状病毒、胃肠 炎病毒、蜱传脑炎病毒、黄热病病毒、风疹病毒、猪瘟病毒、或狂犬病病毒。
由本发明产生的相关蛋白质可为(但不限于)分泌蛋白、胞质蛋白、或膜结合蛋 白。相关蛋白质的序列可为天然存在序列或基因工程序列。在一个实施例中，相关蛋 白质是包含多肽标签的融合蛋白质，所述多肽标签有利于所述相关蛋白质的分离、纯 化、检测、固定化、稳定化、折叠、或靶向。适宜多肽标签的非限制性实例包括链霉 抗生素标签、FLAG标签、c-myc标签、多组氨酸标签、流感HA标签、VSV糖蛋白 标签、V5标签、单纯疱疹病毒标签、谷胱甘肽S-转移酶、或Fc片段。在某些情形中， 可借助所选蛋白酶自所述相关蛋白质解离所述多肽标签。
在另一实施例中，相关蛋白质包含有利于哺乳动物宿主细胞分泌所述蛋白质的信 号肽。所述信号肽可为所述相关蛋白质的内源肽或异源肽。信号肽可与信号识别粒子 相互作用并指导核糖体进入ER，其中发生共转译插入。许多信号肽因具有带正电荷的 残基而具有高疏水性。可借助信号肽酶(一种位于ER池表面的蛋白酶)自生长肽链 移除信号序列。因此，在许多情形中，自培养基分离的分泌蛋白并不具有初始信号肽。
在许多实施例中，由本发明产生的分泌蛋白或膜结合蛋白不会与细胞表面 HSGAG结合或相互作用。此可防止或减少所述蛋白质被哺乳动物宿主细胞吸收或内 在化。在一个实例中，由本发明产生的相关蛋白质不为类肝素酶或其基质为硫酸肝素 (HS)的酶。
可借助多种方法分离或纯化由本发明产生的相关蛋白质。适用于蛋白质分离/纯化 的初始材料的非限制性实例包括培养基或细胞裂解物。示例性分离方法包括但不限于 亲和层析(包括免疫亲和层析)、离子交换型层析、疏水作用层析、尺寸排除层析、HPLC、 蛋白质沉淀(包括免疫沉淀)、差示溶解、电泳、离心、结晶、或其组合。
在许多实施例中，所分离相关蛋白质实际上不含其它蛋白质或杂质。举例而言， 与其它蛋白质相比，所分离相关蛋白质的纯度可为至少50％、60％、70％、80％、90％、 95％、99％或100％。在一个实例中，分离蛋白质仅含有微量的会干扰其预期用途的杂 质。可使用标准技术(例如，SDS-PAGE或免疫分析)来检验或评定本发明的分离相 关蛋白质。适用于此目的的免疫分析包括但不限于西方印迹分析、ELISA、RIA、三明 治型或免疫测定分析、乳胶或其它粒子凝集、或蛋白质体芯片。蛋白质测序及质谱分 析还可用于检验或分析分离相关蛋白质。
而且，本发明涵盖肝素或肝素样分子在增加哺乳动物宿主细胞产生减毒病毒方面 的作用。这些减毒病毒可用于制备疫苗调配物。用于此目的的适宜哺乳动物宿主细胞 包括但不限于CHO细胞、BHK细胞、Vero细胞、Madin-Darby肾细胞、或Madin-Darby 犬肾细胞。应用于此目的的肝素或肝素样分子的数量可为任一可有效地改善减毒病毒 产率的数量(例如，自约10微克/毫升至1,000微克/毫升，例如，约10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100微克/毫升)。 当培养基是不含血清的培养基时，FGF-2或其它FGFR促效剂还可与肝素或肝素样分 子组合使用。FGF-2或其它FGF的有效量可介于(但不限于)10纳克/毫升至500纳 克/毫升之间(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 或500纳克/毫升)。另外，可将FGF添加到含有动物血清的培养基中以进一步改善减 毒病毒或其它相关蛋白质的产率。
B.肝素样分子或其它FGFR促效剂在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质方面的使用
本发明还涉及肝素样分子或其它FGFR促效剂在刺激哺乳动物宿主细胞产生蛋白 质方面的使用。肝素样分子的非限制性实例包括硫酸化葡糖胺聚糖(GAG)，例如硫酸 肝素葡糖胺聚糖(HSGAG)；硫酸化蛋白多糖，例如硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)；或其片 段。适用于本发明的其它肝素样分子包括但不限于肝素寡糖、合成硫酸化聚合物、各 种经硫酸化分子、各种经磺化分子、合成聚芳香族化合物、通过聚合芳香环合成的聚 芳香族化合物、或其组合或片段。也可使用如在Casu(1985)Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry 43：51-134中所述的肝素样分子，所述文献以引用方式并入 本文中。所有这些肝素样分子均可刺激哺乳动物宿主细胞(例如，缺乏硫酸肝素的哺乳 动物宿主细胞)产生蛋白质。在许多情形中，本发明所用肝素样分子经高度硫酸化且可 有利于活化培养细胞中FGFR信号传导。
已经确定有至少四个不同的FGFR家族成员一即，FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3及 FGFR-4。各FGFR彼此之间的不同在于其配体亲和性及组织分布。代表性全长FGFR 包含由多个免疫球蛋白样结构域构成的胞外区、单一疏水性跨膜区段、及细胞质酪氨 酸激酶结构域。在一个实施例中，本发明所用肝素样分子可活化或有利于活化培养细 胞中的FGFR-1。
人们认为细胞表面FGFR的活化参与FGF、FGFR及细胞表面HSGAG间的相互 作用。人们已经建议使用至少3个不同的模型来解释FGF及细胞表面HSGAG是如何 协作以引导FGFR活化的。在“生长激素”模型中，单一FGF可二聚化两个FGFR， 其中HSGAG与FGF及FGFR的细胞外结构域结合。在“HS依赖性二聚化”模型中， 所述HS链与两个FGF结合且二聚合配体马上二聚化FGFR。在“二聚体的二聚体” 模型中，FGF及HSGAG的两个独立复合体可达成FGFR二聚合，进而活化其细胞内 激酶结构域。
若干细胞表面GAG链经常会与小蛋白核心连结以形成HSPG。HSPG可通过核心 蛋白的疏水性跨膜结构域或通过共价键结到所述核心蛋白(跨膜HSPG)的糖基-磷脂酰 肌醇(GPI)锚形体锚定于细胞表面上。跨膜HSPG的非限制性实例包括但不限于磷脂酰 肌醇蛋白聚糖、脑蛋白聚糖(cerebroglycan)、β聚糖、基底膜蛋白聚糖、CD44、及共 结合蛋白聚糖家族的各成员(例如，共结合蛋白聚糖1、共结合蛋白聚糖2(纤维蛋白 聚糖)、共结合蛋白聚糖3(N-共结合蛋白聚糖)及共结合蛋白聚糖4(ryudocan)。磷脂酰 肌醇蛋白聚糖及脑蛋白聚糖还可通过共价GPI锚形体与细胞膜偶合。另外，HSPG可 通过与细胞表面大分子(外周膜HSPG)相互作用以非共价方式与细胞表面连结。
在一个实施例中，本发明涉及可溶性HSGAG或HSPG、或其片段在增进培养哺 乳动物细胞产生蛋白质方面的使用。可通过化学消化或酶消化固定或较大HSGAG或 HSPG分子来制备可溶性HSGAG或HSPG或其片段。举例而言，跨膜或GPI锚定HSPG 可通过其核心蛋白的蛋白酶解消化或内源磷脂酶作用自细胞膜释放。同样，HSGAG 链或片段可通过化学消化或酶消化多糖骨架来制备。可将有效量的可溶性HSGAG或 HSPG(或其片段)加入培养基中以刺激培养细胞产生蛋白质。在许多情形中，所用可溶 性HSGAG或HSPG(或其片段)的数量等于约10-200微克/毫升的肝素(例如，约10、 20、30、40、50、60、70、80、90或100微克/毫升的肝素)以产生蛋白质生产增进作 用。
在一个实例中，本发明所用可溶性HSGAG或HSPG(或其片段)包含至少一个二 糖单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。在另一实例中，本 发明所用所述可溶性HSGAG或HSPG(其片段)包含五糖、八糖或十糖，其含有二糖 单元IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。在又一实例中，本发 明所用可溶性HSGAG或HSPG(或其片段)包含复数个二糖单元 IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3或IdoA(2-OSO3)-GlcNSO3(6-OSO3)。
除可呈可溶性形式之外，肝素或肝素样分子还可固定于基质上以刺激哺乳动物宿 主细胞产生蛋白质。在一个实例中，所述基质为培养宿主细胞提供实体支撑(例如，经 肝素-或肝素样分子涂布的培养板)。
另外，可通过增进细胞中HSGAG或HSPG的内源性合成来增加哺乳动物宿主细 胞产生蛋白质。硫酸肝素链的骨架似乎可借助具有葡萄糖苷酸基转移酶及N-乙酰基葡 萄糖胺基转移酶活性的硫酸肝素合酶来合成。所述主链可进一步经一系列磺基转移酶 及碳水化合物修饰酶(包括N-脱乙酰基酶N-磺基转移酶、C-5差向异构酶、2-O磺基 转移酶、6-O磺基转移酶及3-O磺基转移酶)修饰。因此，通过增加这些酶的表达或 活性，可增加细胞表面HSGAG或HSPG进而改善细胞产生蛋白质。为了达成此目的， 可将编码以上酶的表达载体导入哺乳动物宿主细胞中并使其与相关蛋白质共表达。
C.组成型活性FGFR或FGFR效应子在增加基因工程哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质中的共表达
组成型活性FGFR或FGFR下游效应子可用于促进培养哺乳动物宿主细胞产生蛋 白质。在许多人体癌症中已经观测到通过突变、基因融合或其它基因变换产生的组成 型活性FGFR。组成型活性FGFR突变体的实例包括但不限于具有I型致死性畸胎突 变的FGFR(例如，FGFR1或SEQ ID NO：1的Arg250→Cys突变及FGFR3或SEQ ID NO：2的Arg248→Cys突变)及在激酶结构域的活化环中具有错义突变的FGFR(例如， FGFR1或SEQ ID NO：1的Lys656→Glu突变及FGFR3或SEQ ID NO：2的Lys650→Glu 突变)。还可使用其它组成型活性FGFR突变体，例如，那些述于De Moerlooze等 人(1997)Curr.Opin.Genet.Dev.7：378-385，Wang等人(2002) Cancer Res. 62：1898-1903，或Wang等人(2004)Prostate 58：1-12中者，所有这些文献均以引用的 方式并入本文中。另外，本发明涵盖组成型活性嵌合FGFR的使用，例如，那些阐述 于Kudla等人(1998)J.Cell Biol.142：241-250中者，所述文献以引用方式并入本文中。 编码这些组成型活性FGFR的重组表达盒可容易地构建并将其导入哺乳动物宿主细胞 中。与此组成型活性FGFR的共表达可大大地增加相关蛋白质的产率。
本发明还涉及FGFR下游效应子在改善哺乳动物宿主细胞产生蛋白质方面的用 途。FGFR效应子的非限制性实例包括Crk(v-crk肉瘤病毒CT10致癌基因同系物)、磷 脂酶Cγ、纤维母细胞生长因子受体基质2及SHC(含有Src同源性2结构域)转化蛋白。 所有这些蛋白质是SH2-结构域蛋白质，这是因为这些蛋白质能够在其活化期间与 FGFR的磷酸酪氨酸残基结合。可用于本发明的其它FGFR效应子包括MAPK信号传 导途径中的各种组份，例如GRB2(生长因子受体结合蛋白2)、SOS1(无七子代同系物 1)、RRAS2(相关RAS病毒(r-ras)致癌基因同系物2)、RAF1(v-raf-1鼠科白血病病毒 致癌基因同系物1)、MAP2K1(促细胞分裂原活化的蛋白激酶激酶1)、MAP2K2(促细 胞分裂原活化的蛋白激酶激酶2)、MAPK1(促细胞分裂原活化的蛋白激酶1)、SRF(血 清响应因子或c-fos血清响应要素-结合转录因子)、FOS(v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病毒致 癌基因同系物)、ELK1(ELK1，ETS致癌基因家族的成员)、ELK4(ELK4、ETS-结构 域蛋白或SRF附属蛋白1)、及c-MYC(v-myc髓细胞瘤病病毒致癌基因同系物)。类似 于组成型活性FGFR，可容易地构建编码FGFR下游效应子的重组表达盒并将其导入 哺乳动物宿主细胞中且使其与相关蛋白质共表达。
D.葡糖胺聚糖生物合成诱导剂
本发明进一步涉及β-木糖苷或其它葡糖胺聚糖(GAG)生物合成诱导剂在改良哺乳 动物细胞产生蛋白质方面的用途。硫酸肝素可作为硫酸肝素蛋白多糖的葡糖胺聚糖组 份于体内合成。人们已经证实可通过下列开始GAG生物合成：将木糖残基自UDP-Xyl 转移到核心蛋白上丝氨酸残基的羟基基团，然后添加两个Gal残基及一个GlcA残基 以形成链接四糖GlcAβ1-3Glaβ1-3Galβ1-4Xylβ1。随后使用此链接四糖合成硫酸肝素。 已有报道：向细胞培养基中添加β-木糖苷可延长GAG链。
本发明表明向培养基中添加β-木糖苷可大大地增加培养哺乳动物宿主细胞产生 的蛋白质。适宜β-木糖苷的非限制性实例包括但不限于4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷、 p-硝基苯基-β-D-木糖苷及苄基-β-D-木糖苷。培养基中β-木糖苷的浓度可介于(例如) 10微克/毫升至500微克/毫升、20微克/毫升至200微克/毫升、或50微克/毫升至100 微克/毫升之间。培养基可进一步含有动物血清(例如，1％、5％、或10％的胎牛血清)， 或不含血清。当使用不含血清的培养基时，可补充FGF-2或其它FGF因子以进一步改 善培养哺乳动物宿主细胞的产率。在一个实例中，本发明所用培养基包含自约20至约 200微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。在另一实例中，所述培养基包含自约 50至约100微克/毫升的4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。本文所述任一相关蛋白质可由 经β-木糖苷或其它GAG生物合成诱导剂增强的哺乳动物表达系统产生。
E.医药组合物
由本发明产生的治疗用或预防用蛋白质可用于制备用于治疗或预防人类疾病的 医药组合物。本发明的医药组合物通常包括治疗或预防有效量的相关蛋白质及药理学 上可接受的载剂。本文所用“医药上可接受的载剂”可为任一溶剂、分散介质、涂布 剂、抗细菌剂或抗真菌剂、等渗或吸收延迟剂、或诸如此类。用于医药活性物质的此 等介质及药剂的使用为此项技术所熟知。还可将补充活性成份纳入本发明的医药组合 物中。
本发明医药组合物可通过任一常规途径投与，只要目标组织能够通过所述途径获 得所述医药组合物。此途径包括经口、鼻、口腔、直肠、阴道、或局部。或者，可通 过正位、皮内、皮下、肌内、腹膜腔内、瘤内、周边、导管插入、或静脉注射进行投 药。
本发明的医药组合物还可通过以非经肠方式或经腹膜腔内投与。可在适当地与表 面活性剂(例如，羟丙基纤维素)混合的水中制备相关蛋白质的溶液。分散液还可在 甘油、液体聚乙二醇、或其混合物中、或在油中制备。在一般储存及使用条件下，这 些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射使用的医药形式包括无菌水性溶液或分散液、或用于即时制备无菌可 注射溶液或分散液的无菌粉剂。在许多情形中，所述医药形式为无菌的且可流动达能 够方便地注射的程度。所述医药形式在生产及储存条件下也是稳定的且必须防止其受 到诸如细菌及真菌等微生物的污染作用。适宜医药载剂包括但不限于溶剂或分散介质， 其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇、及诸如此类)、 或植物油。通过使用(例如)诸如卵磷脂等涂布层、通过保持所需粒径(对于分散剂 而言)或通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。借助各种抗细菌剂或抗真菌剂(例 如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞、或诸如此类)可防止微生 物的作用。在许多情形中，其较佳应包括等渗剂，例如，糖类或氯化钠。可注射组合 物的延长吸收可借助延长吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝及明胶)来达成。
无菌可注射溶液可通过下述来制备：将所需量的治疗用或预防用蛋白质纳入含有 上述各种其它成份(视需要而定)的适宜溶剂中，随后进行无菌过滤。一般而言，分 散液是通过将各种经灭菌活性成份纳入含有基本分散介质及所需其它成份的无菌媒剂 中来制备。在使用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情形中，较佳制备方法为真空干燥 及冷冻干燥技术，其可产生由活性成份及任何所需附加成份(来自其先前经无菌过滤 的溶液)构成的粉末。
对于经口投药而言，可将由本发明产生的治疗用或预防用蛋白质与赋形剂一起纳 入并以非食入的漱口剂及洁牙剂形式使用。将所需量的治疗用或预防用蛋白质纳入例 如硼酸钠溶液(Dobell’s溶液)的适宜溶剂中来制备漱口剂。或者，可将治疗用或预防用 蛋白质纳入含有硼酸钠、甘油及碳酸氢钾的防腐洗剂中。还可将治疗用或预防用蛋白 质分散于洁牙剂、凝胶、糊剂、粉剂或浆液中。
调配后，组合物或溶液可以与剂量调配物相容的方式并以治疗或预防有效量投 与。剂量方案可由主治医师根据诸如下列等各种因素确定：蛋白质的作用、病状的位 点、疾病的严重程度、患者的年龄、性别及饮食、任何炎症的严重程度、投与时间、 及其它临床因素。在一个实例中，以最小有效剂量开始全身或注射投药，且所述剂量 在预选时间过程中会有所增加直至观测到正面效应。接下来，将递增剂量限于在考虑 到可能出现的任何副作用时产生相应增强效应的水平。
可通过标准医药程序在细胞培养物或实验动物模型中确定治疗用或预防用蛋白 质的毒性和治疗效果。举例而言，可借助习知方法确定相关蛋白质的LD50(对50％群 体致死的剂量)及ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比 即为治疗指数且其可表示为比率LD50/ED50。在许多情形中，选择可呈现大治疗指数 的治疗蛋白质。
应理解：上述实施例及下列实例是出于说明目的给出而非对本发明加以限制。那 些业内人员根据本说明书可知属于本发明范围的各种变化形式及修改形式。
F.实例
实例1.细胞培养物及DNA构建体
使哺乳动物细胞系(HEK293-FT、HEK293-EBNA、CHO-DUKX及Lec.3.2.8.1)在 具有5％CO2的湿润培养箱中于37℃下生长及维持。在补充有5％胎牛血清(FBS)的树 状293培养基(Invitrogen)中培养HEK293细胞。使CHO-DUKX稳定细胞系在含有10％ FBS及200 nM氨甲蝶呤(MTX)的α培养基中生长。在含有10％FBS及100nM MTX 的α介质中培养HEK293稳定细胞系。
在50毫升旋转器或1升旋转器中实施瞬时表达。对于50毫升培养体积，将25 微克质粒DNA与400微克聚乙烯亚胺(PEI，25kDa，直线型，用HCl中和达pH 7.0， 1毫克/毫升(Polysciences，Warrington，PA))在2.5毫升不含血清的293培养基中混合。 对于1升培养体积，将500微克DNA与4毫克PEI在50毫升不含血清的293培养基 中混合。然后将所述混合物与50毫升或1升HEK293细胞以0.5×106个细胞/毫升的 细胞密度在旋转器中于具有5％FBS的293培养基中混合。将所述旋转器在37℃下培 育同时使用P2005 Stirrer(Bellco)以170 rpm的转速旋转72-144小时，然后收获。
两载体(pSMED2及pSMEDA)用于DNA构建体。pSMEDA(一种pSMED2的衍 生物)阐述于图1中。将OriP元件插入pSMEDA中以便所述载体能够在含有EBNA-1 病毒抗原的细胞中受到扩增。此载体可使HEK293-EBNA细胞产生的蛋白质增加若干 倍。对于sFRP-1(分泌型卷曲基因相关蛋白1)构建体，在一终止密码子之前，将C端 His6标签及突变VFK312-314LE纳入PCR引物中。用SalI及EcoRI消化PCR产物。 将凝胶纯化DNA片段亚克隆到pSMED2中(产生pWZ1028)，或亚克隆到pSMEDA中 (产生pWZ1049)。
为了建立CHO-DUKX sFRP-1稳定细胞系，将构建体pWZ1028转染至 CHO-DUKX细胞中并持续三周针对50nM、100nM或200nM氨甲蝶呤(MTX)选择转 染瘤。在筛选72个菌落后，分离对200nM MTX具有抗性并具有最高表达水平sFRP-1 的三个克隆(即，200-10、200-11及200-12)。还发现HEK293细胞对100nM及以上浓 度的MTX敏感，但其具有两个二氢叶酸还原酶(DHFR)基因拷贝。为了构建sFRP-1 的HEK293稳定细胞系，将pWZ1028转染至HEK293-EBNA中并持续三周针对100nM 或250nM MTX选择转染瘤。然后分离两个最佳的克隆100-5及100-20。
实例2.肝素增进转染细胞产生sFRP-1
使C端经his6标记的sFRP-1在如实例1所述HEK293-FT细胞中瞬时表达。在 DNA转染期间或之后(“转染后诱导时间”，示于图2中)向所述细胞培养基中加入50 微克/毫升肝素(Sigma Chemical公司)。在不同时间点(“生长时间”，示于图2中)收 获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体(Qiagen) 以0.2微克/毫升实施免疫印迹分析(图2).免疫印迹法是按照Zhong等人(2004)FEBS Lett.562：111-117中所述实施。如图2中所示，肝素大大地增加了转染HEK293细胞产 生的sFRP-1。在DNA转染后48小时将肝素添加到培养基中时观测到最大增加。在其 它实验中，观测到重组表达聚集蛋白聚糖酶-1或聚集蛋白聚糖酶-2蛋白质没有出现此 增加(资料未示出)。
C端经His6标记的sFRP-1还在HEK293-EBNA细胞中瞬时表达。在DNA转染 后48小时时，向细胞培养物中添加不同浓度的肝素(“微克/毫升肝素”，示于图3中)。 在DNA转染后120小时或144小时时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质 试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图3)。图3显示用于增进蛋白质 生产的最佳肝素浓度是约25微克/毫升。
除了瞬时转染细胞之外，sFRP-1的稳定HEK293细胞系(克隆100-5及100-20)也 可用于评定肝素对蛋白质生产的刺激作用。使克隆100-5及100-20细胞在不同浓度胎 牛血清(“FBS”，示于图4中)存在下生长。添加50微克/毫升肝素及新鲜培养基。在 肝素处理后72小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克 隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图4)。肝素大大地增加了克隆100-5及100-20细胞 产生的sFRP-1。sFRP-1产生也随胎牛血清(FBS)浓度增加而增加，此表明FBS包含能 够刺激哺乳动物细胞产生蛋白质的因子。
借助北方印迹分析研究肝素对mRNA水平的作用。使用RNAqueous(Ambion)自 293细胞制备总RNA。借助1.1％琼脂糖/2％甲醛MOPS凝胶电泳解析10微克RNA， 用8×SSC印迹于Nytran Supercharge膜(Schleicher及Schuell)上并在50℃下与地高辛 标记的DNA探针于DIG easy Hyb溶液(Roche)中杂合过夜。在60℃下用0.5× SSC/0.1％SDS及0.2×SSC/0.1％SDS洗涤(GAPDH)后，将所述膜在Blocking试剂(Roche) 中封阻30分钟并用磷酸酶标记的碱性抗-地高辛抗体(Roche)(30分钟)及用Tris盐水 缓冲液/0.3％Tween 20探测。用Supersignal(Pierce)显示信号。借助PCR使用地高辛 标记的核苷酸(Roche)产生探针。如图5中所示，肝素没有增加sFRP-1的mRNA水平， 这是因为在经肝素处理细胞的mRNA数量与经模拟处理细胞的mRNA数量之间没有 明显的区别(泳道1对2、3对4、5对6)。因此，肝素不影响sFRP-1的DNA转录或 mRNA稳定性。其似乎可影响sFRP-1在其蛋白质合成期间的mRNA后过程。
为了评定肝素对细胞内蛋白质合成的影响，使sFRP-1在如上所述HEK293-FT细 胞中瞬时表达。在DNA转染后48小时添加50微克/毫升肝素。在120小时或144小 时时收获条件培养基及细胞沉淀。借助SDS-PAGE分离每一蛋白质试样并对小鼠单克 隆抗-his4抗体实施免疫印迹分析(图6)。肝素增加了细胞内及细胞外sFRP-1，此表明 肝素可通过刺激细胞内蛋白质合成来增进哺乳动物细胞产生蛋白质。另外，没有观测 到分泌sFRP-1的细胞吸收。此表明：sFRP-1在培养介质中的聚集不是HSPG′介导的 胞吞作用受添加到所述介质中肝素抑制的结果。
为了查明肝素对sFRP-1的增进作用是否由蛋白质稳定化引起，对由HEK293细 胞产生的sFRP-1实施纯化。如实例1中所述，借助瞬时表达制备1升条件培养基。用 Nickel-NTA(Qiagen)将含有sFRP-l-his6的培养基在4℃下平衡约1小时。将所述树脂 以3,000rpm(SORVALL H-6000A/HBB-6)离心并在连接到HPLC之前填充到管柱 (Pharmacia Biotech)中。在用1M NaC1、25mM Tris-HCl pH7.5及15mM咪唑充分洗 涤后，用1M NaCl、25mM Tris-HCl pH 7.5及200mM咪唑洗脱sFRP-l-his6蛋白。使 用10K MWCO浓缩器(Vivascience)将所述洗脱液浓缩达2毫升。使所述试样再经过 SuperdexTM 200尺寸排除型管柱(SEC)管柱(Pharmacia Biotech)，存于1M NaCl，25mM Tris-HCl pH7.5中。所述蛋白质在经过Nickel-NTA后得到实质纯化(图7A，左平板及 图7B，泳道1和2)，且其在经过Superdex 200后近乎为均质(图7A，右平板及图7B， 泳道3和4)。
通过在280纳米下的吸光率测定蛋白质浓度。在经过Nickel-NTA后的蛋白质产 率为约2.5毫克/升且在经过SEC后的蛋白质产率为约1毫克/升。在SEC分析中， sFRP-1-his6作为单体运行(图7A，右平板)，其与作为38 kDa多肽的sFRP-1在非还原 条件下的迁移一致(图7B，泳道4)。N端测序及质谱分析证实了sFRP-1的身份并显示 所述蛋白质经深度糖基化(资料未示出)。当在室温下培育时，经纯化sFRP-1蛋白质于 不存在肝素时非常稳定(资料未示出)。为了测定经纯化sFRP-1蛋白质是否具有活性， 量测sFRP-1的Wnt3拮抗活性。如图7C中所示，在转染U2OS细胞中，Wnt3可增加 TCF荧光素酶受体基因表达(Bhat等人(2004)Protein Expr.Purif.37：327-335)。 Nickel-NTA纯化sFRP-1或SEC纯化sFRP-1的添加以剂量依赖方式降低Wnt介导的 响应，而缓冲液对Wnt-介导的TCF-荧光素酶受体活化无影响。这些资料清楚地表明： 于不存在肝素时，纯化sFRP-1是稳定的且可起作用。
还在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中观测到肝素对蛋白质产生的刺激作用。野生型 CHO细胞可合成内源肝素样分子，硫酸肝素葡糖胺聚糖(HSGAG)。然而，当使用30mM 氯酸盐(一种硫酸肝素合成抑制剂)将野生型CHO细胞预处理48小时时，所述细胞或 变得对肝素敏感。实验表明：肝素在瞬时表达及稳定表达条件下均能够增进经氯酸盐 处理的CHO细胞产生蛋白质。为了进一步表征对用于sFRP-1分泌的肝素的要求，使 用缺少糖基化的CHO细胞系Lec3.2.8.1，其携带4个糖基化突变(Stanley(1989)Mol. Cell.Biol.9：377-383)。此细胞系表达大多数经明显修饰的碳水化合物结构及严格截短 的N-链接及O-链接碳水化合物。如图8中所示，肝素刺激突变体CHO细胞系分泌 sFRP-1(泳道1-6)。
肝素结合蛋白质与HS之间的相互作用可通过所述序列及HS糖部分的硫酸化水 平来测定(Esko等人(2002)Annu.Rev.Biochem..71：435-471)。为了测试O-硫酸化及N- 硫酸化是否为sFRP-1分泌中肝素活性所需，将sFRP-1转染293细胞与完全经N-脱硫 酸化，随后经N-乙酰化的化学修饰肝素(Sigma Chemical公司)一起培育。还需检查缺 少2-O-硫酸化的经修饰肝素(Sigma)刺激sFRP-1分泌的能力。如图9中所示，2-O-脱 硫酸化肝素完全丧失了其刺激sFRP-1分泌的能力(泳道4)。相反，N-脱硫酸化肝素(泳 道3)与未经修饰肝素同样有效，此表明sFRP-1刺激需要O-硫酸化而非N-硫酸化。而 且，以50及100纳克/毫升添加4-甲基伞形酮基7-β-D-木糖苷(Sigma Chemical公司) (即一种可代替蛋白多糖核心蛋白的线性部分进而可用作葡糖胺聚糖生物合成的可溶 性引物的木糖苷)刺激sFRP-1分泌(泳道5和6)，模拟肝素的作用。
实例3.FGF-2增进转染细胞产生蛋白质
使来自稳定地超表达sFRP-1(克隆100-5)的HEK293细胞系的细胞在6-孔平板中 生长至铺满状态；然后用含有50微克/毫升肝素的新鲜无血清培养基代替所述培养基。 向对应孔的所述介质中加入50纳克/毫升的纤维母细胞生长因子-1(FGF-1，Sigma Chemical公司)或纤维母细胞生长因子-2(FGF-2，Sigma Chemical公司)。在培养基替 换后48小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4 抗体实施免疫印迹分析(图10)。如图10中所表明，FGF-2与肝素的组合可显著增加经 稳定转染HEK293细胞产生的sFRP-1。
因此，FGF-2与肝素可以转录后方式调控蛋白质合成，这是因为北方印迹分析显 示sFRP-1的mRNA水平并不受肝素存在的影响(图5)。不希望受限于理论，肝素可影 响蛋白质转译的过程，这是因为FGF已经显示影响其靶蛋白的转译(Szebenyi等人 (1999)Int.Rev.Cvtol)。FGF还可活化某些其产物可上调转译过程的靶基因。另一种可 能是所述FGF途径可有利于沿分泌途径运输蛋白质。越来越多的证据表明：蛋白质分 泌及表面局域化受一系列信号转导途径(例如，未折叠蛋白质反应)的严密控制 (Schroder等人(2005)Annu.Rev.Biochem.74：739-789)。许多ER伴侣蛋白已经显示可 促进细胞表面局域化及不同客体蛋白的分泌。肝素及FGF-2可活化这些机制并促进重 组蛋白的分泌。
4.刺激FGFR-1可增进转染细胞产生蛋白质
使来自稳定地超表达sFRP-1(克隆100-5)的HEK293细胞系的细胞在6-孔平板中 生长至铺满状态且然后用兔多克隆抗-FGFR-1或抗-FGFR-2抗体(Sigma Chemical公司) 预处理或模拟处理6小时。接下来，用50微克/毫升肝素处理所述细胞。在肝素处理 后48小时收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4 抗体实施免疫印迹分析(图11)。所述资料表明：用抗-FGFR-1而非用抗-FGFR-2进行 预处理大大地降低了肝素引发的蛋白质增量作用。
实例5. 肝素增进转染细胞产生MMP-23及DKK-1蛋白质
使具有存于pSMEDA中的C端His6标签的金属蛋白酶MMP-23在补充有5％FBS 的培养基中于HEK293-EBNA细胞中瞬时表达。在转染后24小时，转染细胞转变成 具有各种浓度FBS的新鲜介质。向某些反应物中加入50微克/毫升肝素。在96小时时 收获条件培养基。借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-his4抗体实施免 疫印迹分析。如图12中所示，肝素大大地增加了所观测得MMP23-his6蛋白质水平。
使具有存于pcDNA3.1中的C端myc标签的人体Dickkopf-1(DKK-1)在补充有5％ FBS的培养基中于HEK293-FT细胞中瞬时表达。在DNA转染后24小时，向所述细 胞培养物中加入50微克/毫升的肝素。在96小时时收获条件培养基(S)及细胞沉淀(P)。 借助SDS-PAGE分离蛋白质试样并对小鼠单克隆抗-myc抗体实施免疫印迹分析。如图 13中所示，肝素大大地增加了DKK1-myc蛋白质的水平。
本发明的上述说明提供阐释及说明，但并非意欲包罗无遗或将本发明限制于所揭 示具体内容。符合以上教示内容的修饰形式及变化形式可能存在或可自本发明实践获 取。因此，值得注意的是，本发明的范围是由权利要求书及其等效形式界定。
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