真核生物能合成具有商业和治疗用途的寡糖结构或糖偶联物，如糖脂或糖蛋白。 可用重组真核糖基转移酶体外合成寡糖或糖偶联物。产生用于寡糖合成的重组真核 糖基转移酶的最有效方法是在细菌中表达该蛋白质。然而在细菌中，许多真核糖基 转移酶表达为细菌包含体中的不溶性蛋白质，从包含体中得到活性蛋白质的产率可 能非常低。因此，需要在细菌中产生真核糖基转移酶的改进方法。本发明解决了这 个需要和其它需要。
发明概述
本发明提供了重折叠包含麦芽糖结合蛋白结构域(MBD)的不溶性、重组、真核 糖基转移酶的方法。将此不溶性、重组、真核糖基转移酶溶解于增溶缓冲液中，然 后与含有氧化还原对的重折叠缓冲液接触，该重折叠真核糖基转移酶能催化使糖基 从供体物质转移到受体物质上。在一个实施方式中，截短该真核糖基转移酶以去除 该蛋白的全部或部分主干区。在另一实施方式中，用非半胱氨酸氨基酸取代去除真 核糖基转移酶中未配对的半胱氨酸，在另一实施方式中，用非半胱氨酸氨基酸取代 去除真核糖基转移酶中未配对的半胱氨酸和截短真核糖基转移酶以去除该蛋白的全 部或部分主干区。
在一个实施方式中，该真核糖基转移酶选自GnT1、GalT1、StIII Gal3、St3GalI、 St6 GalNAcTI、Core GalITI、GalNAcT2。
在一个实施方式中，该真核糖基转移酶还包含纯化结构域，如淀粉结合域(SBD)、 硫氧还蛋白结构域、SUMO结构域、聚His结构域、myc表位结构域和谷胱甘肽-S- 转移酶结构域。
在一个实施方式中，该真核糖基转移酶还包含自身切割结构域。
在一个实施方式中，该真核糖基转移酶在细菌宿主细胞中表达为不溶性包含体。
在一个实施方式中，用第一种真核糖基转移酶重折叠第二种不溶性重组真核糖 基转移酶。在又一实施方式中，用第一种真核糖基转移酶和第二种真核糖基转移酶 重折叠第三种不溶性重组真核糖基转移酶。还可根据用户需要加入不溶性重组真核 糖基转移酶一起重折叠如，使4、5、6、7、8、9或10种糖基转移酶一起重折叠。
在一个实施方式中，所述氧化还原对选自还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱甘肽 (GSH/GSSG)和半胱氨酸/胱胺。
在一个实施方式中，受体物质选自蛋白质、肽、糖蛋白和糖肽。
在一个实施方式中，该真核糖基转移酶是唾液酸转移酶。唾液酸转移酶可包括 例如：StIII Gal3、St3GalI、St6 GalNAcTI。在另一方面，供体底物是CMP-唾液酸 PEG分子，受体底物选自蛋白质、肽、糖蛋白和糖肽。
本发明也提供重组真核糖基转移酶，其中该蛋白缺失主干锚定区和跨膜结构域， 其中糖基转移酶在阅读框中与麦芽糖结合蛋白(MBP)结构域融合。在一个实施方式 中，该重组真核糖基转移酶和MBP结构域的融合体在细菌如大肠杆菌(E.Coli)中表 达为不溶性包含体。
在一个实施方式中，该重组真核糖基转移酶的全部或部分主干区缺失。在另一 实施方式中，用非半胱氨酸氨基酸取代去除重组真核糖基转移酶中未配对的半胱氨 酸。
在又一实施方式中，该重组真核糖基转移酶是以下的一种：GnT1蛋白、GalT1 蛋白质、StIII GaB蛋白、St3 GalI蛋白、St6 GalNAcTI蛋白、Core GalITI蛋白或 GalNAcT2蛋白。
在一个实施方式中，该重组真核糖基转移酶是GnT1蛋白，在一个方面，GnT1 蛋白是截短的人GnT1蛋白，选自GnT1Δ35和GnT1Δ103。在另一方面，GnT1蛋白 是包含选自CYS121ALA、CYS121ASP和ARG120ALA、CYS121HIS的未配对半胱 氨酸取代的人GnT1蛋白。在另一方面，GnT1蛋白是截短的和通过取代突变去除了 未配对的半胱氨酸残基。
在一个实施方式中，该重组真核糖基转移酶是GalT1蛋白。在一个方面，GalT1 蛋白是截短的牛GalT1蛋白，选自GalT1Δ70和GalT1Δ129。在另一方面，GalT1蛋 白是包含未配对半胱氨酸取代CYS342THR的牛GalT1蛋白。在另一方面，GalT1 蛋白是截短的和通过取代突变去除了未配对的半胱氨酸残基。
在一个实施方式中，该重组真核糖基转移酶是ST3GalIII蛋白，在一个方面， ST3GalIII蛋白是截短的大鼠ST3GalIII蛋白，选自ST3GalIIIΔ28、ST3GalIIIΔ73、 ST3GalIIIΔ85和ST3GalIIIΔ86。在另一方面，ST3GalIII蛋白包含未配对半胱氨酸残 基的氨基酸取代，在另一方面，ST3GalIII蛋白是截短的和通过取代突变去除了未配 对的半胱氨酸残基。
在一个实施方式中，如权利要求15所述的重组真核糖基转移酶中的糖基转移酶 是Corel GalT1蛋白，在一个方面，Corel GalT1蛋白是截短的果蝇蛋白或截短的人蛋 白，在另一方面，果蝇或人Corel GalT1蛋白包含未配对半胱氨酸残基的氨基酸取代， 在另一方面，果蝇或人Corel GalT1蛋白是截短的和通过取代突变去除了未配对的半 胱氨酸残基。
在一个实施方式中，重组真核糖基转移酶是ST3Gal1蛋白。在一个方面，ST3Gal1 蛋白是截短的人蛋白，选自ST3Gal1Δ29、ST3Gal1Δ45和ST3Gal1Δ56。在另一方面， ST3Gal1蛋白包含未配对半胱氨酸残基的氨基酸取代，在另一方面，ST3Gal1蛋白是 截短的和通过取代突变去除了未配对的半胱氨酸残基。
在一个实施方式中，重组真核糖基转移酶是ST6GalNAc1蛋白。在一个方面， ST6GalNAc1蛋白是截短的小鼠蛋白、截短的鸡蛋白或截短的人蛋白，如表14所列 截短蛋白之一。在另一方面，小鼠、鸡或人ST6GalNAc1蛋白包含未配对半胱氨酸 残基的氨基酸取代。在另一方面，小鼠、鸡或人ST6GalNAc1蛋白是截短的和通过 取代突变去除了未配对的半胱氨酸残基。
在一个实施方式中，如权利要求15所述的重组真核糖基转移酶中的糖基转移酶 是GalNAcT2蛋白，在一个方面，GalNAcT2蛋白是截短的人蛋白，选自 GalNAcT2Δ40、GalNAcT2Δ51、GalNAcT2Δ74和GalNAcT2Δ95。在另一方面，人 GalNAcT2蛋白包含未配对半胱氨酸残基的氨基酸取代。在另一方面，人GalNAcT2 蛋白是截短的和通过取代突变去除了未配对的半胱氨酸残基。
本发明也提供了用上述重组真核糖基转移酶在重折叠蛋白质后具有酶活后的蛋 白质、肽、糖蛋白或糖肽的方法。
本发明提供了将不溶性真核糖基转移酶重折叠成活性形式的改进方法，也提供 了具有增强的重折叠性能的糖基转移酶，如N-乙酰葡糖胺鸡转移酶I(GnTI)。
在一个方面，本发明提供了重组真核N-乙酰葡糖胺鸡转移酶I(GnTI)，该酶经突 变用能促进不溶性沉淀如细菌包含体中此酶重折叠的氨基酸，取代了未配对半胱氨 酸残基。GnTI酶至少包含GnTI酶的催化结构域。GnTI酶有生物学活性，即能够能 催化使供体底物转移到受体底物。
在一个实施方式中，GnTI酶是人蛋白。人GnT1中CYS121残基的一些突变可 促进重折叠。这些突变体包括例如：CYS121SER突变、CYS121ALA突变、CYS121ASP 突变，和双突变ARG120ALA、CYS121HIS。GnT1突变体的代表性序列见图7-11。 在其它真核生物中，例如，未配对半胱氨酸残基CYS123的类似突变促进了GnT1酶 的重折叠。
在另一实施方式中，GnTI酶也包括氨基酸标记，如麦芽糖结合蛋白(MBP)、聚 组氨酸标记、谷胱甘肽S转移酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)和myc表位。
在另一方面，本发明提供编码重组真核GnTI酶的核酸，该酶经突变用能促进不 溶性沉淀如细菌包含体中此酶重折叠的氨基酸，取代了未配对半胱氨酸残基。如上 所述，编码的GnT1酶至少包括GnTI酶的催化结构域，而且有生物学活性，即能够 能催化使供体底物转移到受体底物。
在一个实施方式中，所述核酸编码人GnTI酶。人GnT1中CYS121残基的一些 突变能促进重折叠。这些突变体包括例如：CYS121SER突变、CYS121ALA突变、 CYS121ASP突变，和双突变ARG120ALA、CYS121HIS。GnT1突变蛋白和核酸的 代表性核酸序列见图7-11。在其它真核生物中，例如，未配对半胱氨酸残基CYS123 的类似突变促进了GnT1酶的重折叠。
在另一实施方式中，编码的GnTI酶也包括氨基酸标记，如麦芽糖结合蛋白 (MBP)、聚组氨酸标记、谷胱甘肽转移酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)和myc表位。
本发明也包括含有突变的GnT1核酸的表达载体、包含GnT1表达载体的宿主细 胞和用该宿主/表达载体系统产生突变的GnT1酶的方法。
在另一实施方式中，本发明提供了通过使受体分子与活化的N-乙酰葡糖胺分子 接触将N-乙酰葡糖胺残基加在具有末端甘露糖残基的受体分子上以促进其重折叠来 突变真核GnTI酶的方法。受体分子可以是(例如)多糖、寡糖、糖脂或糖蛋白。
在另一方面，本发明提供在一个容器中通过使糖基转移酶与含有氧化还原对的 重折叠缓冲液接触，来重折叠至少两种不溶性重组真核糖基转移酶蛋白的方法。重 折叠后，至少两种重折叠的糖基转移酶具有生物学活性，如能够能催化使供体底物 转移到受体底物。
所述重折叠缓冲液也可包含去污剂、离液剂、精氨酸或PEG。在一些实施方式 中，重折叠缓冲液的pH为6.0-10.0。在一个实施方式中，重折叠缓冲液的pH为6.5-8.0。 在另一实施方式中，重折叠缓冲液的pH为8.0-9.0。
在另一实施方式中，所述糖基转移酶包括氨基酸标记，如麦芽糖结合蛋白 (MBP)、聚组氨酸标记、谷胱甘肽转移酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)和myc表位。
在一个实施方式中，将N-连接的聚糖生物合成途径的一种以上糖基转移酶一起 重折叠。
在一个实施方式中，用本发明方法将唾液酸转移酶与另一种糖基转移酶一起重 折叠。
在一个实施方式中，用本发明方法将N-乙酰葡糖胺基转移酶与另一种糖基转移 酶一起重折叠。
在一个实施方式中，用本发明方法将半乳糖基转移酶与另一种糖基转移酶一起 重折叠。
在另一实施方式中，用本发明方法在一个容器中将唾液酸转移酶、N-乙酰葡糖 胺基转移酶和半乳糖基转移酶一起重折叠。
在一个实施方式中，将O-连接的聚糖生物合成途径的一种以上糖基转移酶一起 重折叠。在另一实施方式中，第一种酶是N-乙酰半乳糖胺基转移酶。在优选实施方 式中，第一种酶是N-乙酰葡糖胺基转移酶2(GalNAcT2)。
本发明也提供包含重组真核GnTI酶和可在同一容器中重折叠的至少一种其它 糖基转移酶的反应混合物，该重组真核GnTI酶经突变用能促进来自不溶性沉淀如细 菌包含体的酶重折叠的氨基酸取代了未配对的半胱氨酸残基。第二种糖基转移酶可 以是(例如)唾液酸转移酶或半乳糖基转移酶。在一个实施方式中，该反应混合物包括 突变的真核GnT1酶、唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶。该反应混合物可与含有供体 糖的受体分子一起使用，以产生(例如)多糖、寡糖、糖脂或糖蛋白。
在另一方面，本发明提供重折叠不溶性重组真核唾液酸转移酶的方法，即(a)溶 解唾液酸转移酶；然后(b)使可溶性唾液酸转移酶与含氧化还原对的重折叠缓冲液接 触。此种重折叠的唾液酸转移酶具有生物学活性能催化使唾液酸从供体底物转移到 受体底物。在一个实施方式中，透析或渗滤该重折叠唾液酸转移酶。
重折叠缓冲液也可包含去污剂、离液剂或精氨酸。在一些实施方式中，重折叠 缓冲液的pH为6.0-10.0。在一个实施方式中，重折叠缓冲液的pH为6.5-8.0。在另 一实施方式中，重折叠缓冲液的pH为8.0-9.0。在另一实施方式中，重折叠缓冲液的 pH为7.5-8.5。
在一个实施方式中，重折叠缓冲液中的氧化还原对是还原性谷胱甘肽/氧化性谷 胱甘肽(GSH/GSSG)对。在另一实施方式中，GSH/GSSG的摩尔比为100∶1-1∶10。在 优选实施方式中，GSH/GSSG的摩尔比为10∶1。在又一实施方式中，重折叠缓冲液 含约0.02-10mM GSH、0.005-10mM GSSG、0.005-10mM十二烷基麦芽糖苷、50-250 mM NaCl、2-10mM KCl、0.01-0.05％PEG 3350和150-550mM L-精氨酸。
在另一实施方式中，唾液酸转移酶含有氨基酸标记，如麦芽糖结合蛋白(MBP)、 聚组氨酸标记、谷胱甘肽转移酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)和myc表位。在另一实 施方式中，利用能结合氨基酸标记的标记结合分子来纯化唾液酸转移酶。例如，所 述氨基酸标记可以是MBP，标记结合分子可以是直链淀粉、麦芽糖或环式糊精。
在另一实施方式中，重折叠的唾液酸转移酶能催化使唾液酸从CMP-唾液酸转移 到糖蛋白。
在另一实施方式中，重折叠唾液酸转移酶能催化使10K PEG或20K PEG从 CMP-SA-PEG(10kDa)或CMP-SA-PEG(20kDa)转移到糖蛋白。
在另一实施方式中，唾液酸转移酶是大鼠肝ST3GalIII。
在另一方面，本发明提供了通过使含有CMP-唾液酸的糖蛋白与用本文所述方法 重折叠的重折叠哺乳动物唾液酸转移酶接触，将唾液酸分子加到该糖蛋白上的方法。
在另一方面，本发明提供将PEG分子加到糖蛋白上的方法，该方法包括使糖蛋 白与CMP-SA-PEG(10kDa)或CMP-SA-PEG(20kDa)和用本文所述方法重折叠的重折 叠哺乳动物唾液酸转移酶相接触。
在另一方面，本发明提供了重折叠不溶性重组真核N-乙酰半乳糖胺基转移酶 2(GalNAcT2)的方法，即将GalNAcT2溶解于增溶缓冲液中；然后使可溶性GalNAcT2 与含氧化还原对的重折叠缓冲液接触来重折叠GalNAcT2。重折叠后，该重折叠的 GalNAcT2能催化使N-乙酰半乳糖胺从供体底物转移到受体底物。该方法可任选地 包括透析或渗滤重折叠的GalNAcT2或进一步纯化重折叠GalNAcT2的步骤。
在一些实施方式中，重折叠缓冲液的氧化还原对是还原性谷胱甘肽/氧化性谷胱 甘肽(GSH/GSSG)对或半胱氨酸/胱胺对。重折叠缓冲液也可包含以下物质：去污剂、 离液剂或精氨酸。在一些实施方式中，重折叠缓冲液的pH为6.0-10.0。在一个优选 实施方式中，重折叠缓冲液的pH约为8.0。
在优选实施方式中，增溶缓冲液的pH为6.0-10.0。在更优选的实施方式中，增 溶缓冲液的pH约为8.0。
重组表达的GalNAcT2可包含氨基酸标记。所述氨基酸标记可以是(例如)麦芽糖 结合蛋白(MBP)、聚组氨酸标记、谷胱甘肽转移酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)或myc 表位。可利用标记结合分子来纯化重折叠的GalNAcT2。当氨基酸标记是MBP时， 标记结合分子通常为以下物质之一：直链淀粉、麦芽糖或环式糊精。
在优选实施方式中，重折叠GalNAcT2能催化使N-乙酰半乳糖胺从供体底物转 移到肽、蛋白质、糖肽或糖蛋白。
附图简要说明
图1提供了重折叠细菌包含体的MBP-ST3GalIII的经测试的缓冲液条件。也提 供了重折叠酶的活性。
图2提供了重折叠的经透析的MBP-ST3GalIII从直链淀粉柱上的洗脱图。
图3提供了直链淀粉柱洗脱组分的ST3GalIII活性。
图4提供了用纯化的重折叠MBP-ST3GalIII使转铁蛋白糖基PEG化的试验结果。 各泳道如下：(1)MW标记[250、148、98、64、50kD]；(2)无酶的脱唾液酸转铁蛋白 对照，用实线箭头表示；(3)用组分#5产生的转铁蛋白-SA-PEG(20kDa)，用箭头表示 产物；(4)用组分#6产生的转铁蛋白-SA-PEG(20kDa)，用箭头表示产物；(5)纯化的 重折叠MBP-ST3GalIII组分#6，用虚线箭头表示；(6)MW标记；(7)与2相同；(8) 用组分#4产生的转铁蛋白-SA-PEG(10kDa)，用括号表示产物；和(9)用组分#5产生 的转铁蛋白-SA-PEG(10kDa)，用括号表示产物。
图5提供了用重折叠的SuperGlycoMix糖基PEG化EPO的试验结果。各泳道如 下：(1)MW标记，SeeBlue2 Invitrogen(250、148、98、64、50、36、22、16、6kD)； (2)含有EPO、+NSO表达的GalT1、BV GnT1、曲霉ST3GalIII和含糖核苷酸的阳性 对照；(3)阴性对照，与2相同但没有UDP-GIcNAc；(4)EPO、纯化并分别重折叠的 MBP-GalT1(Δ129)C342T、重折叠的MBP-GnT1(Δ103)和黑曲霉(Aspergillus niger)表 达的ST3GalIII；(5)EPO，SuperGlycoMix(MBP-ST3GalIII、MBP-GalT1(Δ129)C342T、 MBP-GnT1(Δ103)C123A和含糖核苷酸的混合物)。
图6提供了人GnT1氨基酸序列(上面一行，NP_002397)和兔GnT1氨基酸序列(下 面一行，P27115)的比对。保守的未配对半胱氨酸用下划线和粗体表示。
图7提供了GnT1 Cys121Ser突变体的氨基酸序列和编码该突变GnT1蛋白的核 酸序列。所述氨基酸序列从全长人蛋白的氨基酸残基104开始，代表哺乳动物GnT1 蛋白，具有以下未配对的半胱氨酸突变：...stvrrsldkllh....，其中粗体残基是野生型半 胱氨酸的突变残基。
图8提供了GnT1 Cys121Asp突变体的氨基酸序列和编码该突变GnT1蛋白的核 酸序列。所述氨基酸序列从全长人蛋白的氨基酸残基104开始，代表哺乳动物GnT1 蛋白，具有以下未配对的半胱氨酸突变：...stvrrdldkllh...，其中粗体残基是野生型半 胱氨酸的突变残基。
图9提供了GnT1 Cys121Thr突变体的氨基酸序列和编码该突变GnT1蛋白的核 酸序列。所述氨基酸序列从全长人蛋白的氨基酸残基104开始，代表哺乳动物GnT1 蛋白，具有以下未配对的半胱氨酸突变：...stvrrtldkllh...，其中粗体残基是野生型半 胱氨酸的突变残基。
图10提供了GnT1 Cys121Ala突变体的氨基酸序列和编码该突变GnT1蛋白的 核酸序列。所述氨基酸序列从全长人蛋白的氨基酸残基104开始，代表哺乳动物GnT1 蛋白，具有以下未配对的半胱氨酸突变：...stvrraldkllh...，其中粗体残基是野生型半 胱氨酸的突变残基。
图11提供了GnT1 Arg120Ala、Cys121His突变体的氨基酸序列和编码该突变 GnT1蛋白的核酸序列。所述氨基酸序列从全长人蛋白的氨基酸残基104开始，代表 哺乳动物GnT1蛋白，具有以下未配对的半胱氨酸突变：...stvrahldkllh...，其中粗体 残基是野生型半胱氨酸的突变残基。
图12提供了大鼠肝ST3GalIII的氨基酸序列。下划线和斜体序列的缺失产生了 Δ28缺失。
图13A和13B提供了UDP-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(GalNAcT2)的全长核酸 和氨基酸序列。此核酸和蛋白质的登录号为NM004481。
图14A和14B提供了Δ51GalNAcT2的核酸和氨基酸序列。编号根据图13A和 B所示全长氨基酸和核酸序列。
图15提供了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后测定的重折 叠MBP-GalNAcT2(D51)蛋白浓度。测定的pH值表示为溶解pH-重折叠pH。重折叠 后(浅灰色柱)、透析后(深灰色柱)和浓缩后(白色柱)立即测定的蛋白浓度。
图16提供了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后测定的重折 叠MBP-GalNAcT2(D51)的酶活性。测定的pH值表示为溶解pH-重折叠pH。透析后 (浅灰色柱)和浓缩后(深灰色柱)测定活性。
图17提供了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后测定的重折 叠MBP-GalNAcT2(D51)的特异性活性。测定的pH值表示为溶解pH-重折叠pH。透 析后(白色柱)和浓缩后(深灰色柱)测定特异性活性。
图18A和18B提供了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后用 重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)重建重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)的结果。图18A 显示了用纯化的MBP-GalNAcT2(D51)对照、缺少底物的阴性对照或在pH 6.5溶解和 在pH 6.5重折叠的细菌表达的MBP-GalNAcT2(D51)得到的结果。图18B显示了试验 结果。
图19提供了重折叠MBP-GalNAcT2(D51)蛋白从Q琼脂糖XL(QXL)柱 (Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上的洗脱图。该图上方显示了说明 MBP-GalNAcT2(D51)从QXL柱上洗脱的色谱图。X轴表示组分编号，Y轴表示各组 分的相对吸光度。该图下方显示所观察的诸洗脱组分的两种凝胶电泳图像。凝胶上 各泳道的内容见图中所述。
图20提供了图19所示得自QXL柱的特定柱组分的GalNAcT2活性。将活性最 高的组分施加到I型羟基磷灰石(80μm)(BioRad，Hercules，CA)柱上。
图21提供了重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)蛋白从I型HA柱上的洗脱图。该 图上方显示了说明MBP-GalNAcT2(D51)从I型HA柱上洗脱的色谱图。X轴表示组 分编号，Y轴表示各组分的相对吸光度。该图下方显示所观察的诸洗脱组分的凝胶 电泳图像。凝胶上各泳道的内容见图中所述。
图22提供了I型HA洗脱组分的GalNAcT2活性。
图23提供了融合于MBP标记或MBP-SBD标记的ST3Gal3蛋白的纯化和活性 比较。
图24提供了MBP-ST3Gal1融合蛋白(A)和MBP-SBD-ST3Gal1融合蛋白(B)的氨 基酸序列。
图25提供了MBP-ST3Gal3融合蛋白和MBP-SBD-ST3Gal3融合蛋白的唾液酸 转移酶活性，也显示了阳性和阴性对照。
图26提供了融合于MBP的小鼠和人ST6GalNAcI蛋白的氨基酸序列。A部分 显示了小鼠截短融合物MBP-mST6GalNAcI S127的序列。B部分显示了人截短融合 物MBP-hST6GalNAcI K36的序列。
图27提供了O-连接的糖基转移酶的SDS-PAGE凝胶(图像)：(A)同时重折叠后 的浓度，(B)同时重折叠后酶试验的结果。MBP-GalNAcT2和MBP-ST3GalI一起同时 重折叠。加入CoreI GalT1酶后测定的酶活性。底物是IFα-2b和20K-Peg-CMP-NAN。
图28提供了显示用IPTG诱导前后大肠杆菌(E.coli)中天然SiaA蛋白表达的 SDS-PAGE凝胶(图像)。
图29提供了显示用IPTG诱导前后大肠杆菌中MBP-SiaA融合蛋白表达的 SDS-PAGE凝胶(图像)。
图30提供了全长牛GalT1蛋白的氨基酸序列。
图31是GalT1突变体以及对照蛋白GalT1(40)(S96A+C342T)的示意图。
图32提供了重折叠和纯化的MBP-GalT1(D70)蛋白的酶试验结果。该试验用 UDP-Gal(尿苷5′-二磷酸半乳糖)作为供体底物测定了LNT2(乳糖-N-丙糖-2)转变为 LNnT(乳糖-N-新丁糖)。
图33提供了MBP-GalT1(D70)和对照蛋白GalT1(40)(S96A+C342T)(也称为 Qasba′s GalT1)的RNA酶B重建试验。
图34提供了用重折叠和纯化的MBP-GalT1(D70)蛋白或在哺乳动物细胞体系中 表达的牛GalT1蛋白的可溶形式NSO GalT1糖基化RNA酶B的动力学。
图35提供了MBP-GnT1融合蛋白的示意图，描述了截短蛋白，如Δ103或Δ35， 以及Cys121Ser突变(上方)。该图下方提供了全长人GnT1蛋白。
图36右侧提供了显示重折叠的MBP-GnT1融合蛋白MBP-GnT1(D35)C121A、 MBP-GnT1(D103)R120A+C121H和MBP-GnT1(D103)C121A的SDS-PAGE凝胶(图 像)。左侧显示两批(A1和A2)不同的重折叠MBP-GnT1(D35)C121A在不同时间点的 GnT1活性。
图37提供了猪ST3Gal1的全长序列。
图38提供了A)人ST6GalNAcI和B)鸡ST6GalNAcI的全长氨基酸序列，以及 C)始于天然小鼠蛋白残基32的小鼠ST6GalNAcI蛋白的序列。
图39提供了许多优选的人ST6GalNAcI截短突变体的示意图。
图40显示了包含人ST6GalNAcI截短突变体的MBP融合蛋白的示意图。
图41提供了人Core 1 GalT1蛋白的全长序列。
图42提供了两种果蝇Core 1 GalT1蛋白的序列。
图43提供了可融合于糖基转移酶以促进重折叠的示范性细菌MBP蛋白的序列。 A.耶尔森氏菌(Yersinia)MBP；B.大肠杆菌MBP；C.激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)MBP；D.嗜热球菌(Thermococcus litoralis)MBP；E.海栖热袍菌(Thermatoga maritime)MBP；和F.霍乱弧菌(Vibrio cholerae)MBP。
图44提供了人GalNAcT1和GalNAcT2蛋白的比对。因为该排列比对程序考虑 了序列中的插入或缺失，所以半胱氨酸残基的编号与上文和公开序列不同。在 hGalNAc-T2半胱氨酸227(公开)对应于比对序列的位置235时，半胱氨酸229(公开) 是该比对序列中的237。hGalNAc-T1半胱氨酸是212(公开)(对应于半胱氨酸235(比 对序列))和214(公开)(对应于半胱氨酸237(比对序列))。用较大字体表示相关的半胱 氨酸残基。
图45显示了人ST6GalNAcI蛋白中配对和未配对半胱氨酸残基的位置。也显示 了单个半胱氨酸取代和两个半胱氨酸取代，如C280S、C362S、C362T、(C280S+C362S) 和(C280S+C362T)。
定义
本发明重组糖基转移酶蛋白可用于将糖从供体底物转移到受体底物。该加成反 应通常发生在生物分子的寡糖或糖部分的非还原末端。本文所述生物分子包括但不 限于生物学重要的分子如糖、蛋白质(如糖蛋白)和脂质(如糖脂、磷脂、鞘脂和神经 节苷脂)。
本文中使用了以下缩写：
Ara＝阿拉伯糖基；
Fru＝果糖基；
Fuc＝岩藻糖基；
Gal＝半乳糖基；
GalNAc＝N-乙酰半乳糖基氨基；
Glc＝葡糖基；
GlcNAc＝N-乙酰葡糖基氨基；
Man＝甘露糖基；和
NeuAc＝唾液酸基(N-乙酰神经胺基)
FT或FucT＝岩藻糖基转移酶*
ST＝唾液酸基转移酶*
GaIT＝半乳糖基转移酶*
根据本领域所用命名惯例，阿拉伯数字或罗马数字可互换使用说明同一特异性 糖基转移酶(如FTVII和FT7指相同的岩藻糖基转移酶)。
认为寡糖具有还原末端和非还原末端，无论该糖的还原末端是否是还原糖。根 据接受的命名法，本文所述的寡糖的非还原末端在左、还原末端在右。
本文所述所有的寡糖用非还原性糖的名称或缩写表示(如Gal)、然后是糖苷键(α 或β)构型、环键、涉及该键的还原糖的环位置、然后是还原糖的名称或缩写(如 GlcNAc)。两个糖之间的连接可表示为(例如)2，3、2→3或(2，3)。糖各自是吡喃糖或呋 喃糖。
术语“唾液酸”指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族中最常见的成员是 N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-双脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1- 酸，常常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。第二个家族成员是N-乙醇酰基-神经氨 酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基是羟化的。第三个唾液酸家族成员 是2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557； Kmamori等，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。也包括9-取代的唾液酸如 9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac样9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟 -Neu5Ac和9-叠氮-9-脱氧-Neu5Ac。唾液酸家族的综述参见例如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；唾液酸：化学、代谢和功能(Sialic Acid：Chemistry，Metabolism and Function)，R.Schauer编(Springer-Verlag，New York(1992))。1992年10月1日公开 的国际申请WO 92/16640中描述了唾液酸化过程中唾液酸化合物的合成和应用。
糖基转移酶的“受体底物”是可用作特定糖基转移酶的受体的寡糖部分。当受 体底物与相应的糖基转移酶和糖供体底物，以及其它必需的反应混合物组分接触， 培育反应混合物足够的时间时，糖基转移酶将糖残基从糖供体底物转移到受体底物。 不同类型的特定糖基转移酶的受体底物常常不同。例如，哺乳动物半乳糖苷2-L-岩 藻糖基转移酶(α1，2-岩藻糖基转移酶)的受体底物包括寡糖的非还原末端上的Galβ1、 4-GlcNAc-R；岩藻糖基转移酶通过α1，2连接将岩藻糖残基连接于Gal。末端的 Galβ1，4-GlcNAc-R和Galβ1，3-GlcNAc-R及其唾液酸化类似物分别是α1，3和α1，4-岩藻 糖基转移酶的受体底物。然而，这些酶将岩藻糖残基连接于受体底物的GlcNAc残基。 因此，术语“受体底物”是根据具体应用中感兴趣的具体糖基转移酶选择的。本文 描述了其它糖基转移酶的受体底物。受体底物还包括(例如)肽、蛋白质、糖肽和糖蛋 白。
糖基转移酶的“供体底物”是活化的核苷酸糖。所述活化糖通常由糖的单磷酸 尿苷、鸟苷和胞苷衍生物(分别为UMP、GMP和CMP)或糖的二磷酸尿苷、鸟苷和胞 苷衍生物(分别为UDP、GDP和CDP)组成，其中单磷酸核苷或二磷酸核苷作用是离 去基团。例如，岩藻糖基转移酶的供体底物是GDP-岩藻糖。唾液酸转移酶的供体底 物(例如)是含所需唾液酸的活化糖核苷酸。例如，以NeuAc为例，其活化糖是 CMP-NeuAc。其它供体底物包括例如：GDP甘露糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰半 乳糖胺、CMP-NeuAc-PEG(也称为CMP-唾液酸-PEG)、UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP- 葡萄糖、UDP-葡糖醛酸(glucorionic acid)和UDP-木糖。糖包括例如：NeuAc、甘露糖、 半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、葡糖醛酸和木糖。细菌、植物 和真菌体系有时可利用其它活化的核苷酸糖。
本文所用“重建蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽的方法”指用糖基转移酶将糖残基 加在蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽上。在优选实施方式中，该糖残基与PEG分子共价 连接。
本文所用“真核糖基转移酶”指一种酶，它衍生自真核生物能催化使糖残基从 供体底物即活化的核苷酸糖转移到受体底物，如寡糖、糖脂、肽、蛋白质、糖肽或 糖蛋白上，在优选实施方式中，真核糖基转移酶可将糖从供体底物转移到肽、蛋白 质、糖肽或糖蛋白，在另一优选实施方式中，真核糖基转移酶是II型跨膜糖基转移 酶。真核糖基转移酶可衍生自真核生物，如多细胞真核生物、植物、无脊椎动物如 果蝇或秀丽隐杆线虫(C.elegans)、脊椎动物、两栖动物或爬行动物，哺乳动物、啮齿 动物、灵长动物、人、兔、大鼠、小鼠、牛、猪等。
本文所用“真核N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI或GNTI)”指分离自真核生物的 β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶I。该酶能催化使N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)从UDP-GlcNAc 供体转移到含有甘露糖的受体分子。如其它真核糖基转移酶那样，GnTI具有跨膜结 构域、主干区和催化结构域。真核GnT1蛋白包括例如人，登录号NP_002397；中国 仓鼠，登录号AAK61868；兔，登录号AAA31493；大鼠，登录号NP_110488；金黄 田鼠，登录号AAD04130；小鼠，登录号P27808；斑马鱼，登录号AAH58297；爪 蟾(Xenopus)，登录号CAC51119；果蝇，登录号NP_525117；疟蚊(Anopheles)，登录 号XP_315359；秀丽隐杆线虫，登录号NP_497719；小立碗藓(Physcomitrella patens)， 登录号CAD22107；马铃薯(Solanum tuberosum)，登录号CAC80697；烟草(Nicotiana tabacum)，登录号CAC80702；水稻(Oryza sativa)，登录号CAD30022；本塞姆氏烟 草(Nicotiana benthamiana)，登录号CAC82507；和拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登 录号NP_195537，各自纳入本文作为参考。
本文所用“真核N-乙酰半乳糖胺基转移酶(GalNAcT)”指分离自真核生物的N- 乙酰半乳糖胺基转移酶。该酶能催化使N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)从UDP-GalNAc供 体转移到受体分子。如其它真核糖基转移酶那样，GalNAcT酶具有跨膜结构域、主 干区和催化结构域。已经分离并表征了许多GalNAcT酶，例如：GalNAcT1，登录号 X85018；GalNAcT2，登录号X85019(均参见White等，J.Biol.Chem.270： 24156-24165(1995))；和GalNAcT3，登录号X92689(参见Bennett等，J.Biol.Chem. 271：17006-17012(1996)，各自纳入本文作为参考)。
本文所用“真核β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT1)指分离自真核生物的β-1，4-半乳糖 基转移酶。该酶能催化使半乳糖从UDP-Gal供体转移到受体分子。如其它真核糖基 转移酶那样，GalT1酶具有跨膜结构域、主干区和催化结构域。已经分离并表征了许 多GalT1酶，例如：全长牛序列，D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989)， 登录号CAA32695，各自纳入本文作为参考。
本文所用“真核α(2，3)唾液酸转移酶(ST3Gal3)”指分离自真核生物的α(2，3)唾液 酸转移酶。该酶能催化使唾液酸转移到Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3GalNAc或 Galβ1，4GlcNAc苷的Gal(参见例如，Wen等(1992)J.Biol.Chem.267：21011；Van den Eijnden等(1991)J.Biol.Chem.256：3159)。通过在两个糖之间形成α-连接将唾液酸 连接于Gal。这两个糖之间的键(连接)是在NeuAc的2位和Gal的3位之间。如其它 真核糖基转移酶那样，ST3GalIII酶具有跨膜结构域、主干区和催化结构域。可从大 鼠肝中分离此酶(Weinstein等(1982)J.Biol.Chem.257：13845)；人cDNA(Sasaki等 (1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa和Paulson(1994)J.Biol.Chem.269： 1394-1401)和基因组(Kitagawa等(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)DNA序列是已知 的，这有助于重组表达生产此酶。已克隆了大鼠ST3GalIII，其序列已知。参见例如， Wen等，J.Biol.Chem.267:21011-21019(1992)，登录号M97754，各自纳入本文作为 参考。
本文所用“真核α-N-乙酰氨基半乳糖苷α-2，6-唾液酸转移酶I(ST6GalNAcT1)” 指分离自真核生物的α(2，6)唾液酸转移酶。该酶能催化使唾液酸从CMP-唾液酸供体 转移到受体分子。此种转移是使α2，6-连接于N-乙酰半乳糖胺-O-Thr/Ser。如其它真 核糖基转移酶那样，ST6GalNAcT1酶具有跨膜结构域、主干区和催化结构域。已经 分离并表征了许多ST6GalNAcT1酶，如全长小鼠序列，Kurosawa等，J.Biochem. 127：845-854(2000)，登录号JC7248，各自纳入本文作为参考。其它示范性 ST6GalNAcT1氨基酸序列见图38。
本文所用“真核galβ1，3GalNAc α2，3-唾液酸转移酶(ST3GalI)”指分离自真核生 物的galβ1，3GalNAcα2，3-唾液酸转移酶。该酶能催化使唾液酸从CMP-唾液酸供体转 移到受体分子。此种转移是使α2，3-连接于N-乙酰半乳糖胺-O-Thr/Ser。如其它真核 糖基转移酶那样，ST3GalI酶具有跨膜结构域、主干区和催化结构域。已经分离并表 征了许多ST3GalI酶，如全长猪序列，Gillespie等，J.Biol.Chem.267：21004-21010 (1992)，登录号A45073，各自纳入本文作为参考。
本文所用“真核Core I半乳糖基转移酶(Core 1 GalT1)”指具有Core 1 β1，3-半乳 糖基转移酶活性的蛋白。如其它真核糖基转移酶那样，Core 1 GalT1酶具有跨膜结构 域、主干区和催化结构域。已经分离并表征了许多Core 1 GalT1酶，如图41和42 的果蝇序列和人序列。Ju等，J.Biol.Chem.277(1)，178-186(2002)中表征了该人蛋 白，将其纳入本文作为参考用于所有目的。
本文所用“未配对的半胱氨酸残基”指正确折叠的蛋白质(即具有生物学活性的 蛋白)中的半胱氨酸残基不与另一半胱氨酸残基形成二硫键。
“不溶性糖基转移酶”指在细菌包含体中表达的糖基转移酶。一般用(例如)去污 剂或离液剂或一些组合溶解或变性不溶性糖基转移酶。“重折叠”指将具有生物学 活性的糖基转移酶的结构恢复为溶解或复性糖基转移酶的过程。因此，重折叠缓冲 液指能促进或加速糖基转移酶的重折叠的缓冲液。
“氧化还原对”指还原性和氧化性硫醇试剂的混合物，包括还原性和氧化性谷 胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱胺、DTT/GSSG和DTE/GSSG(参 见例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。
本文中术语“接触”可与以下术语互换使用：组合、加入、混合、通过、孵育、 流过等。
术语“PEG”指聚(乙二醇)。PEG是能偶联于肽的示范性聚合物。用PEG衍生 肽治疗已被证明能降低肽的免疫原性并延长肽在循环系统的清除时间。例如，美国 专利号4,179,337(Davis等)关于非免疫原性肽，如偶联于聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇 的酶和肽激素。每摩尔肽采用10-100摩尔聚合物，保持了至少15％的生理活性。
本文术语“特异性活性”指酶如本发明的重组糖基转移酶融合蛋白的催化活性， 可用活性单位表示。在本文中，1个活性单位催化在给定温度(如37℃)和pH值(如 pH 7.5)下每分钟催化形成1μmol产物。因此，10单位酶是在温度如37℃和pH值如 7.5下在1分钟内将10μmol底物转化为10μmol产物的酶催化量。
“N-连接的”寡糖是经天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺连接键通过天冬酰胺连接于肽主 链的寡糖。N-连接的寡糖也称为“N-聚糖”。所有N-连接的寡糖都具有共同的五糖 核心Man3GlcNAc2。它们的不同之处在于外周糖(如N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰 半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸)分支(也称为天线)的存在和数量。此结构也可任选地包 含核心岩藻糖分子和/或木糖分子。
“O连接的”寡糖是寡糖通过苏氨酸、丝氨酸、羟基脯氨酸、酪氨酸或其它含 羟基氨基酸连接于肽主链的寡糖。
当提到糖蛋白种类时，“基本均一的糖形式”或“基本均一的糖基化模式”指由感 兴趣的糖基转移酶(如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体底物的百分比。本领域技术人员 将理解，原材料可含有糖基化的受体底物。因此，糖基化的计算量将包括用本发明 方法糖基化的受体底物，以及在原材料中已经糖基化的受体底物。
术语“生物学活性”指蛋白质的酶活。例如，唾液酸转移酶的生物学活性指将 唾液酸部分从供体分子转移到受体分子的活性。GalNAcT2的生物学活性指将N-乙 酰半乳糖胺部分从供体分子转移到受体分子的活性。对于GalNAcT2蛋白而言，受 体分子可以是蛋白质、肽、糖蛋白或糖肽。GnT1蛋白的生物学活性指将N-乙酰葡糖 胺部分从供体分子转移到受体分子的活性。半乳糖基转移酶的生物学活性指将半乳 糖部分从供体分子转移到受体分子的活性。
“商品化规模”指在一个反应中产生克级的产物糖。在优选实施方式中，商品 化规模指约50、75、80、90或100、125、150、175或200克以上的产量。
在上述定义术语“基本均一”中的“基本”通常指用具体糖基转移酶糖基化的受 体底物占至少约60％、至少约70％、至少约80％、或更优选至少约90％、更优选至 少约95％。
术语“氨基酸”指天然产生的氨基酸和合成氨基酸，以及作用方式类似于天然产 生的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是由遗传密码子编 码的氨基酸，以及后来修饰的氨基酸，如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即α 碳结合于氢、羧基、氨基和R基团的化合物，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚 砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链， 但保留了与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构不同于氨 基酸的通用化学结构，但作用方式类似于天然产生的氨基酸的化合物。
“蛋白质”、“多肽”或“肽”指氨基酸单体通过酰胺键连接在一起形成的聚合物， 也称为多肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可采用其L-光学异构体或D-光学异构体。此 外，也包括非天然氨基酸，如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。本发明中可采用不 是由基因编码的氨基酸。而且，经修饰而含有反应基团的氨基酸也可用于本发明。 本发明所用的所有氨基酸可以是D-异构体或L-异构体。通常优选L-异构体。此外， 其它肽模拟物也可用于本发明。全面的综述可参见Spatola，A.F.，《氨基酸、肽和 蛋白质的化学和生物化学》(CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein编，Marcel Dekker，New York，267页(1983)。
提及细胞时所用的术语“重组”指该细胞复制了异源核酸，或表达了异源核酸编 码的肽或蛋白质。重组细胞可含有在该细胞的天然(非重组)形式中没发现的基因。重 组细胞也可含有在该细胞的天然形式中发现的、通过人工手段修饰并将其重新引入 该细胞的基因。该术语也包括含有不除去细胞核酸的修饰的内源性核酸的细胞；这 些修饰包括通过基因置换、定点突变和相关技术获得的修饰。“重组蛋白”是重组细胞 产生的蛋白。在优选实施方式中，重组真核糖基转移酶由重组细菌细胞产生。
“融合蛋白”指包含有加入的、替代的、少于和/或不同于编码原先或天然全长蛋 白或其子序列的氨基酸序列的蛋白质。
融合蛋白的组分包括“辅酶”和/或“纯化标记”。“辅酶”本文指参与催化(例 如)形成糖基转移酶底物的反应的酶。辅酶可以(例如)催化形成被糖基转移酶用作供 体部分的核苷酸糖。辅酶也可以是用于产生形成核苷酸糖所必需的三磷酸核苷或产 生将糖掺入核苷酸糖中的酶。可构建本发明的重组融合蛋白并表达为一端含有分子 “纯化标记”的融合蛋白，该标记有助于蛋白质的纯化。此种标记也可用于在糖基 化反应期间固定感兴趣的蛋白质。合适的标记包括“表位标记”，它是抗体特异性 识别的蛋白序列。通常将表位标记掺入融合蛋白中以使得能够用易于得到的抗体明 确地检测或分离该融合蛋白。“FLAG标记”是一种常用的表位标记，为单克隆抗 FLAG抗体特异性识别，它由序列AspTyrLysAspAspAspAspLys或其基本相同的变体 组成。其它合适标记是本领域技术人员已知的，包括例如：亲和标记如六组氨酸肽， 它能结合金属离子如镍或钴离子。可用能结合该纯化标记的结合伴侣，如针对该纯 化标记的抗体、镍或钴离子或树脂以及直链淀粉、麦芽糖或环式糊精纯化含有该纯 化标记的蛋白。纯化标记还包括淀粉结合域、大肠杆菌硫氧还蛋白结构域(例如，Santa Cruz Biotechnology，Inc.和Alpha Diagnostic International，Inc.出售的载体和抗体)和 SUMO蛋白的羧基末端一半(例如，Life Sensors Inc.出售的载体和抗体)。优选采用麦 芽糖结合域，因为它们能够促进不溶性真核糖基转移酶的重折叠，但它们也可用于 帮助纯化融合蛋白。麦芽糖结合域蛋白的纯化(方法)是本领域技术人员已知的。WO 99/15636中描述了淀粉结合域，将其纳入本文作为参考。2003年5月5日提交的USSN 60/468,374中描述了用β环式糊精(BCD)-衍生的树脂亲和纯化包含淀粉结合域的融 合蛋白，将其全文纳入本文作为参考。
提及糖基转移酶的结构域时，术语“功能域”指能赋予或调节酶活性，如受体底 物特异性、催化活性、结合亲和力、在高尔基体内的定位、锚定细胞膜或其它生物 学或生物化学活性的糖基转移酶的结构域。糖基转移酶功能域的例子包括但不限于： 催化结构域、主干区和信号锚定结构域。
提及蛋白质时，术语“表达水平”指细胞产生的蛋白质量。可用本文所述或本领 域技术人员已知的试验和活性单位衡量细胞产生的蛋白质量。本领域技术人员知道 如何用各种试验和单位分别测定和描述细胞产生的蛋白质量。因此，蛋白质如糖基 转移酶的表达水平的定量和定量描述不限于用于测定活性的试验或用于描述活性的 单位。可用已知的标准试验，例如Bradford(1976)蛋白质试验、Pierce(Rockford，Illinois) 的二辛可宁酸蛋白质试验试剂盒或如美国专利号5,641,668所述测定细胞产生的蛋白 质量。
术语“酶活性”指酶的活性，可通过本文所述或本领域技术人员已知的试验和单 位测定。糖基转移酶活性的例子包括但不限于：与该酶功能域相关的活性，如受体 底物特异性、催化活性、结合亲和力、在高尔基体中的定位、锚定于细胞膜或其它 生物学或生物化学活性。
提及糖基转移酶时，“主干区”指在天然糖基转移酶中位于跨膜结构域附近的蛋 白结构域或其子序列，据报道，其功能是将糖基转移酶保留在高尔基体中的保留信 号和作为蛋白水解切割的位点。主干区通常始于第一个亲水性氨基酸，然后是疏水 性跨膜结构域，终止于催化结构域，或者在一些情况下，第一个半胱氨酸残基后面 是跨膜结构域。示范性主干区包括但不限于：岩藻糖基转移酶VI主干区，氨基酸残 基40-54；哺乳动物GnT1主干区，氨基酸残基约36-103(参见例如，人酶)；哺乳动 物GalT1主干区，氨基酸残基约71-129(参见例如，牛酶)；哺乳动物ST3GalIII主干 区，氨基酸残基约29-84(参见例如，大鼠酶)；无脊椎动物Core 1 GalT1的主干区， 氨基酸残基约36-102(参见例如，果蝇酶)；哺乳动物Core 1 GalT1主干区，氨基酸残 基约32-90(参见例如，人酶)；哺乳动物ST3Gal1主干区，氨基酸残基约28-61(参见 例如，猪酶)或人酶的氨基酸残基约18-58；哺乳动物ST6GalNAcI主干区，氨基酸残 基约30-207(参见例如，鼠酶)，人酶的氨基酸35-278或鸡酶的氨基酸37-253；哺乳 动物GalNAcT2主干区，氨基酸残基约71-129(参见例如，大鼠酶)。
“催化结构域”指能催化该酶进行酶反应的蛋白结构域或其子序列。例如，唾液 酸转移酶的催化结构域包括足以使唾液酸残基从供体转移到受体糖的唾液酸转移酶 子序列。催化结构域可包括整个酶、其子序列，或可包括在天然状态下未连接于该 酶的其它氨基酸序列或其子序列。示范性催化区是(但不限于)岩藻糖基转移酶VII催 化结构域，氨基酸残基39-342；哺乳动物GnT1催化结构域，氨基酸残基约104-445(参 见例如，人酶)；哺乳动物GalT1催化结构域，氨基酸残基约130-402(参见例如，牛 酶)；和哺乳动物ST3GalIII催化结构域，氨基酸残基约85-374(参见例如，大鼠酶)。 2004年6月3日提交的USSN 60/576,530中描述了GalNAcT2蛋白的催化结构域和 截短突变体；2004年8月3日提交的美国临时专利申请律师案卷号 040853-01-5149-P1；将它们纳入本文作为参考用于所有目的。也可通过与已知的糖 基转移酶进行比对来鉴定催化结构域。
“子序列”指分别包含较长的核酸或氨基酸(如蛋白质)序列的一部分的核酸或氨 基酸序列。
“糖基转移酶截短物”或“截短的糖基转移酶”或语法上的变体指比天然产生 的糖基转移酶少几个氨基酸残基、但保持了酶活的糖基转移酶。截短的糖基转移酶 包括例如：截短的GnT1酶、截短的GalT1酶、截短的ST3GalIII酶、截短的GalNAcT2 酶、截短的CorelGalT1酶、氨基酸残基约32-90(参见例如、人酶)；截短的ST3Gal1 酶、截短的ST6GalNAcI酶和截短的GalNAcT2酶。可缺失任意数量的氨基酸残基， 只要酶保持活性。在一些实施方式中，可缺失诸结构域或部分结构域，如可缺失信 号锚定结构域使截短物含有主干区和催化结构域；可缺失信号锚定结构域和一部分 主干区使截短物含有剩余的主干区和催化结构域；或可缺失信号锚定结构域和主干 区使截短物含有催化结构域。
术语“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另 有限制，“核酸”包括能以类似于天然产生的核酸的方式与核酸杂交的已知的天然 核苷酸类似物。除非另有说明，具体核酸序列包括其互补序列。
“重组表达盒”或简称“表达盒”是用重组或合成方法产生的核酸构建物，它含有 能影响结构基因在与所述序列相容性宿主中表达的核酸元件。表达盒至少包括启动 子和任选的转录终止信号。重组表达盒一般包括待转录核酸(如编码所需多肽的核酸) 和启动子。对影响表达是必需的或有帮助的其它因素也可用于本发明。例如，表达 盒也可包括编码能指导宿主细胞分泌表达蛋白质的信号序列的核苷酸序列。表达盒 也可包括能影响基因表达的转录终止信号、增强子和其它核酸序列。在优选实施方 式中，在细菌宿主细胞中表达编码包含真核糖基转移酶的氨基酸序列的重组表达盒。
本文所用“异源序列”或“异源核酸”是来源于特定宿主细胞以外的，或者，如果 来自相同来源，是对其原来形式进行修饰的核酸。因此，真核宿主细胞中的异源糖 蛋白基因包括经修饰的特定宿主细胞的内源性糖蛋白编码基因。可(例如)通过用限制 性酶处理DNA产生能够操作性连接于启动子的DNA片段修饰异源序列。例如定点 诱变等技术也可用于修饰异源序列。
术语“分离”指基本不含干扰酶活性组分的材料。对于本发明的糖、蛋白质或核 酸而言，术语“分离”指此材料基本不含在天然状态下通常伴随该材料的组分。经银染 凝胶上条带的强度或测定纯度的其它方法测定，本发明的分离的糖、蛋白质或核酸 纯度一般至少约80％，通常至少约90％，优选至少约95％。可用本领域熟知的多种 方法测定纯度或均一性。例如，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品中的蛋白质或核 酸，然后可通过染色观察蛋白质或核酸。对于某些目的，可能需要高分辨分析蛋白 质或核酸，可采用HPLC或类似的纯化方法。
术语“操作性连接”指核酸表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位 点)和第二种核酸序列之间的功能性连接，其中使表达控制序列能影响对应于第二种 序列核酸的转录和/或翻译。
在提及两个或多个核酸或蛋白质序列时，术语“相同性”或“相同性”百分数指当 比较和比对最大一致性时，经以下序列比较算法之一测定或目测，两个或多个序列 或子序列相同的氨基酸残基或核苷酸的具体百分数。
在提及两种核酸或蛋白质时，术语“基本相同”指当比较和比对最大一致性时， 经以下序列比较算法之一测定或目测，两个或多个序列或子序列至少大于约60％的 核酸或氨基酸序列相同，65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸或氨基酸残基相同。优选地，；两序 列在至少长约50个残基的区域，更优选至少长约100个残基的区域上基本相同，最 优选在至少约150个残基的区域两序列基本相同。在最优选的实施方式中，两序列 在整个编码区长度上基本相同。
对于序列比较，一般将一个序列作为参比序列，将测试序列与其作比较。进行 序列比较算法时，将测试和参比序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标 (coordinate)，并设定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据设定的程序参数计 算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。
可通过以下方法对比较序列进行最佳比对，例如：Smith & Waterman， Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman & Wunsch， J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源比对算法，Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad. Sci USA 85：2444(1988)的搜索相似性方法，以下算法的计算机执行(Wisconsin遗 传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group， 575 Science Dr.Madison，WI)或目测(通常可参见《新编分子生物学实验指南》 (Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols， Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资公司(1995增 刊)(Ausubel))。
适合测定序列相同性百分数和序列相似性算法的例子是BLAST和BLAST 2.0 算法，它们的描述分别参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschuel 等(1977)Nuclear Acids Res.25：3389-3402。公众可通过国家生物技术信息中心 (www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。此算法包括，首先通过鉴定查 询序列中长度W的短字鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字 比对时，查询序列匹配或满足一些正评价的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值 (Altschul等，同上)。这些起始邻近字命中(word hit)用作启动搜索寻找含有它们的更 长HSP的种子。然后沿各序列的两个方向上延伸字命中，以尽量增加累积对比评分。 对于核苷酸序列，用参数M(匹配残基对的奖励分数；总是＞0)和N(错配残基的罚分； 总是＜0)计算累积评分。对于氨基酸序列，用评分矩阵计算累积分数。当：累积对比 评分通过来自其最大获得值参数X降低时；由于一种或多种负得分残基对比使累积 分数达到零或零以下；或达到各序列的末端时，停止延伸各方向上的字命中。BLAST 算法的参数W、T和X确定了对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列) 采用的默认设置为字长(W)11、期望值(E)10、截断值100、M＝5、N＝-4和两条链的 比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认设置为字长(W)3、期望值(E)10， 和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89： 10915(1989))。
除了计算序列相同性百分数之外，BLAST算法也对两序列之间的相似性进行统 计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90： 5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种测量相似性的方法是最小秩和概率(P(N))， 提供了对两种核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率说明。例如，如果在测 试核酸和参比核酸的比较中最小秩和概率低于约0.1、更优选低于约0.01、最优选低 于约0.001，则认为核酸与参比序列相似。
另外，能说明两个核酸序列或蛋白质基本相同的是，第一种核酸编码的蛋白质 与第二种核酸编码的蛋白质在免疫学上能交叉反应，见如下所述。因此，(例如)当二 肽的区别仅在于保守取代时，第一种蛋白一般与第二种蛋白基本相同。另外能说明 两个核酸序列基本相同的是这两种分子在严谨条件下能互相杂交，见如下所述。
术语“特异性杂交”指一序列存在于复杂混合物(如全细胞)DNA或RNA中时，在 严谨条件下该分子仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
术语“严谨条件”指探针与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交的条件。严谨条 件是序列依赖的，在不同情况下不同。较长序列在较高温度下能特异性杂交。通常 选择的严谨条件比在确定的离子强度和pH下特定序列的热解链点(Tm)低约15℃。 Tm是与靶序列互补的50％探针与靶序列杂交达到平衡时的温度(在确定的离子强度、 pH和核酸浓度下)。(由于通常靶序列过量，在Tm下，达到平衡时50％探针与靶序 列杂交)。严谨条件一般是盐浓度低于约1.0M Na离子，一般约0.01-1.0M Na离子 浓度(或其它盐)，pH 7.0-8.3，对于短探针(如10-50个核苷酸)温度至少约30℃和对于 长探针(如多于50个核苷酸)温度至少约60℃的条件。也可通过加入去稳定剂如甲酰 胺获得严谨条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号一般至少是背景的两倍，优 选为背景杂交的10倍。示范性严谨杂交条件如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS， 42℃孵育，或者5×SSC、1％SDS，65℃孵育，用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃洗 涤。对于PCR，低严谨扩增的温度一般约为36℃，但退火温度根据引物长度在32-48℃ 之间变化。就高严谨PCR扩增而言，一般温度约为62℃，但根据引物长度和特异性 高严谨退火温度范围约为50℃-65℃。低严谨和高严谨扩增的循环条件一般包括：变 性阶段90-95℃30-120秒，退火阶段持续30-120秒，延伸阶段约72℃1-2分钟。可 获得低严谨和高严谨的扩增反应的方法和指南，如Innis等，(1990)《PCR方法：方 法和应用指南》(PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications)Academic Press， N.Y所述。
提及抗体时，术语“与蛋白质特异性结合”或“特异性免疫反应”指在蛋白质和其 它生物物质异质群体存在下测定某蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫试 验条件下，特定抗体优选结合特定蛋白质，而不大量结合样品中存在的其它蛋白质。 在这种条件下与蛋白质特异性结合需要选择采用对该特定蛋白质具有特异性的抗 体。可用各种免疫试验方法选择能与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如， 通常用固相ELISA免疫试验来选择能与某蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗 体。参见Harlow和Lane(1988)《抗体，实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor Publication，New York，其中描述了可用于测定特异性免疫反应 性的免疫试验方法和条件。
具体多核苷酸序列的“保守性修饰变异”指编码相同或基本相同的氨基酸序列的 多核苷酸，或当该多核苷酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密 码的简并性，许多功能上相同的核酸可编码一个给定的蛋白质。例如，密码子CGU、 CGC、CGA、CGG、AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在由某密码子确定 精氨酸的每个位置上，可将该密码子改变为所述相应密码子中的任何一个，而不会 改变编码的蛋白质。这种核酸变异是“沉默变异”，是“保守性修饰变异”的一种。本 文所述编码蛋白质的每个多核苷酸序列也描述了每一种可能的沉默变异，除非另有 说明。本领域技术人员将认识到，可用标准技术修饰核酸中各密码子(除AUG和UGG 外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，UGG通常是色氨酸的唯一密码子)，而产 生功能相同的分子。因此，所述各序列中暗含编码蛋白质的核酸的各“沉默变异”。
而且，本领域技术人员将认识到，改变、加入或缺失编码序列中的一个氨基酸 或小百分数(一般少于5％，更通常少于1％)氨基酸的单取代、缺失或添加是“保守性 修饰变异”，这些改变导致用化学性质上相似的氨基酸取代某氨基酸。提供功能上相 似的氨基酸保守取代列表是本领域熟知的。
本领域技术人员将理解，蛋白质如糖基转移酶和编码蛋白质的核酸的许多保守 变体能产生基本上相同的产物。例如，由于遗传密码子的简并性，暗示“沉默取代”(即 不导致编码蛋白质改变的核酸序列取代)是每个编码氨基酸的核酸序列的特征。如本 文所述，宜优化用于产生嵌合性糖基转移酶(如酵母、人等)的序列在特定宿主细胞中 表达。相似地，“保守性氨基酸取代”是用具有高度相似性能的不同氨基酸取代氨基酸 序列中一个或几个氨基酸(参见定义章节，同上)，也不难鉴定与特定氨基酸序列或与 编码氨基酸的特定核酸序列高度相似的序列。这种特定序列的保守性取代变体是本 发明的一个特征。也参见Creighton(1984)《蛋白质》(Proteins)，W.H.Freeman and Company。此外，改变、加入或缺失编码序列中的一个氨基酸或小百分数氨基酸的单 取代、缺失或加入也是“保守性修饰变异”。
本发明的实施可包括构建重组核酸和在宿主细胞，优选细菌宿主细胞中表达基 因。实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的。本领域技术人员熟知适合构建 重组核酸如表达载体的各种克隆方法和体外扩增方法。这些技术的例子和足以指导 本领域技术人员进行许多克隆实践的说明见Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南， 酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)，第152 卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；和《新编分子生物学实验指南》 (Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资公司，(1999增 刊)(Ausubel)。本领域技术人员知道可表达重组多肽的合适宿主细胞，包括例如：原 核细胞如大肠杆菌(E.coli)，和真核细胞，包括昆虫、哺乳动物和真菌细胞(如黑曲霉 (Aspergillus niger))。
足以指导本领域技术人员进行体外扩增方法的例子，包括聚合酶链反应(PCR)、 连接酶链反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术见Berger， Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美国专利号4,683,202；《PCR方法， 方法和应用指南》(PCR Protocols A Guide to Methods and Application)(Innis等编)， Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson(1990年10月 1日)C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；(Kwoh等(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87： 1874；Lomell等(1989)J.Clin.Chem.35：1826；Landegren等(1988)Science 241： 1077-1080；Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560；和Barringer等(1990)Gene 89：117。克隆体外扩增的核酸的改进方法见 Wallace等，美国专利号5,426,039。
发明详述
I.导言
本发明提供重折叠在细菌包含体中表达为不溶性蛋白质的真核糖基转移酶的条 件。采用含有氧化还原对的重折叠缓冲液促进不溶性真核糖基转移酶的重折叠。也 可通过将麦芽糖结合域融合于不溶性真核糖基转移酶来促进重折叠。对于一些不溶 性真核糖基转移酶，也可通过定点诱变去除未配对的半胱氨酸来促进重折叠。可提 供的其它重折叠增强方法是截短真核糖基转移酶以去除(例如)信号锚定域、跨膜域和 /或蛋白质的所有或部分主干区。本发明也提供在一个容器中重折叠一种以上糖基转 移酶，从而促进这些蛋白质的重折叠并提高蛋白质生产效率的方法。可利用真核糖 基转移酶的重折叠来产生或重建多糖、寡糖、糖脂、蛋白质、肽、糖肽和糖蛋白。 也可利用重折叠的真核糖基转移酶来糖基PEG化蛋白质、肽、糖肽或糖蛋白，如 PCT/US02/32263所述，将其纳入本文作为参考用于所有目的。
II.重折叠不溶性糖基转移酶
细菌表达的许多重组蛋白质在细菌包含体中表达为不溶性凝聚物。包含体是在 细菌的胞质和周质间隙中发现的蛋白质沉积物。(参见例如，Clark，Cur.Op.Biotech. 12：202-207(2001))。真核糖基转移酶常常在细菌包含体中表达。在只表达蛋白质的催 化结构域时，一些真核糖基转移酶在细菌中可溶，即不产生于包含体中。然而，即 使只表达催化结构域，有许多真核糖基转移酶仍不溶，而表达于细菌包含体中，本 文提供了重折叠这些蛋白质以产生活性糖基转移酶的方法。
A.重折叠活性糖基转移酶的条件
为在细菌细胞中产生活性真核糖基转移酶，先在细菌包含体中表达真核糖基转 移酶，收获、破碎细菌，分离和洗涤包含体。然后溶解包含体中的蛋白质。可用变 性剂，如氯化胍或尿素；极端pH，如酸性或碱性条件；或去污剂进行溶解。
溶解后，去除糖基转移酶混合物中的变性剂有各种方法，包括稀释于重折叠缓 冲液中或缓冲液交换法。缓冲液交换法包括透析、渗滤、凝胶过滤和将蛋白质固定 在固体支持物上。(参见例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001))。可组合上 述方法以去除变性剂。
加入含有氧化还原对的重折叠缓冲液以促进真核糖基转移酶中形成二硫键。氧 化还原对包括还原性和氧化性谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸/胱氨酸、半胱胺/胱 胺、DTT/GSSG和DTE/GSSG。(参见例如，Clark，Cur.Op.Biotech.12：202-207(2001)， 将其纳入本文作为参考用于所有目的)。在一些实施方式中，以特定比率的还原组分： 氧化组分，如1/20、20/1、1/4、4/1、1/10、10/1、1/2、2/1、1/5、5/1或5/5加入氧化 还原对。
可在pH范围(例如)6.0-10.0的缓冲液中进行重折叠。重折叠缓冲液可包括其它 添加剂以促进重折叠，如L-精氨酸(0.4-1M)；PEG；低浓度的变性剂，如尿素(1-2M) 和氯化胍(0.5-1.5M)；和去污剂(如Chaps、SDS、CTAB、十二烷基麦芽糖苷和Triton X-100)。
持续重折叠给定时间，如1-48小时或过夜。可在约4℃-40℃，包括室温下进行 重折叠。
在细菌包含体中表达含有催化结构域的真核糖基转移酶蛋白，然后用上述方法 重折叠。含所有或一部分主干区和催化结构域的真核糖基转移酶也可采用本文所述 方法，如含有融合于MBP蛋白催化结构域的真核糖基转移酶可采用本文所述方法。
本领域技术人员将认识到，当重折叠的某蛋白质具有可检测的生物学活性时， 表明该蛋白质已正确地重折叠。对于糖基转移酶，生物学活性是能催化使供体底物 转移到受体底物，如重折叠的ST3GalIII能将唾液酸转移到受体底物。生物学活性包 括例如：至少为1、2、5、7或10单位活性的特异性活性。单位定义如下：一个活 性单位的酶每分钟在给定温度(如37℃)和pH值(如pH 7.5)时催化形成1μmol产物。 因此，10单位酶是在温度如37℃和pH值如7.5下在1分钟内将10μmol底物转化为 10μmol产物的酶催化量。
在一个实施方式中，使真核ST3GalIII在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化 还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核GnT1在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还 原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核GalT1在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还 原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核St3GalI在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还 原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核St6 GalNAcTI在细菌包含体中表达，溶解，在含有 氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核Core GalITI在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧 化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，使真核GalNAcT2在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧 化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
B.将真核糖基转移酶与麦芽糖结合蛋白结构域融合以促进重折叠
一般将麦芽糖结合蛋白(MBP)结构域融合于蛋白质以提高细胞中该蛋白的溶解 性。参见例如，Kapust和Waugh Pro.Sci.8：1668-1674(1999)。然而，许多真核糖基 转移酶，包括截短的真核糖基转移酶即使融合了MBP结构域在细菌中表达时仍不溶。 然而，本申请公开了MBP结构域可促进(例如)包含体蛋白质溶解后不溶性真核糖基 转移酶的重折叠。各种细菌来源的MBP结构域均可用于本发明，例如耶尔森菌 (Yersinia)、大肠杆菌(E.coli)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、海滨热球菌 (Thermococcus litoralis)、海栖热袍菌(Thermatoga maritime)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，参见例如图43。在优选实施方式中，将大肠杆菌MBP蛋白融合于真核糖 基转移酶。可将氨基酸接头置于MBP结构域和糖基转移酶之间。在另一优选实施方 式中，将MBP结构域融合于糖基转移酶蛋白的氨基末端。上述方法可用于重折叠 MBP糖基转移酶融合蛋白。
在一个实施方式中，将真核ST3GalIII蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含体 中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，将真核GnT1蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含体中表 达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，将真核GalT1蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含体中表 达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，将真核St3GalI蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含体中 表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
在一个实施方式中，将真核St6 GalNAcTI蛋白融合于MBP结构域，在细菌包 含体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重 折叠。
在一个实施方式中，将真核Core GalITI蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含 体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折 叠。
在一个实施方式中，将真核GalNAcT2蛋白融合于MBP结构域，在细菌包含体 中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
可将其它氨基酸标记加入MBP-糖基转移酶融合物中。例如，可加入纯化标记以 促进重折叠蛋白质的纯化。纯化标记包括例如：多聚组氨酸标记、谷胱甘肽S转移 酶(GST)、淀粉结合蛋白(SBP)、大肠杆菌硫氧还蛋白结构域、SUMO蛋白的羧基端 一半、FLAG表位和myc表位。还可利用能结合纯化标记的结合伴侣来纯化重折叠 的糖基转移酶。在优选实施方式中，将MBP标记融合于真核糖基转移酶以促进其重 折叠。可将纯化标记融合于MBP糖基转移酶融合蛋白，包括例如：GnT1、GalT1、 StIII Gal3、St3 GalI、St6 GalNAcTI、Core GalITI或GalNAcT2。
在另一实施方式中，将MBP结构域加入蛋白质可提高该蛋白的表达。参见例如 实施例12，其中将SiaA蛋白融合于MBP结构域提高了该蛋白的表达。融合于MBP 后表达增强的其它蛋白包括例如：GnT1、GalT1、StIII Gal3、St3GalI、St6 GalNAcTI、 Core GalITI或GalNAcT2。
在另一实施方式中，将可自身切割的蛋白标记如内含肽(intein)位于MPB结构域 和糖基转移酶之间，以帮助在融合蛋白重折叠后去除MBP结构域。内含肽及其应用 试剂盒可购得，如New England Biolabs的产品。
C.诱变糖基转移酶以促进重折叠
也可通过诱变糖基转移酶的氨基酸序列来促进糖基转移酶的重折叠。在一个实 施方式中，鉴定并突变未配对的半胱氨酸残基，以促进糖基转移酶的重折叠。在另 一实施方式中，截短糖基转移酶的氨基末端以去除跨膜结构域，或去除该蛋白的跨 膜结构域和所有或一部分主干区。在又一实施方式中，突变糖基转移酶，以去除至 少一个未配对的半胱氨酸残基并截短该蛋白的氨基末端，以去除跨膜结构域，或去 除该蛋白的跨膜结构域和所有或一部分主干区。一旦分离得到糖基转移酶核酸序列 后，可用标准分子生物学方法以本文所述方式改变其核酸序列和编码的氨基酸序列。
1.诱变糖基转移酶中未配对的半胱氨酸以促进重折叠
发生重折叠时，变性蛋白质中的半胱氨酸残基可形成有助于再生活性蛋白结构 的二硫键。而半胱氨酸残基的不正确配对可导致蛋白质错误折叠。含有未配对的半 胱氨酸残基的蛋白质易于错误折叠，因为通常未配对的半胱氨酸可与正常配对的半 胱氨酸形成二硫键，从而使得不可能形成正确的半胱氨酸配对和蛋白质重折叠。因 此，促进特定糖基转移酶重折叠的一种方法是鉴定出未配对的半胱氨酸残基并去除 它们。
可通过测定感兴趣糖基转移酶的结构来鉴定未配对的半胱氨酸残基。可根据该 感兴趣糖基转移酶的实际数据，如圆二色谱、NMR和X线晶体图确定蛋白质结构。 也可用计算机建模确定蛋白结构。计算机建模是可用来根据同源分子的已知三维结 构建立相关结构模型的技术。可购得其标准软件。(参见例如，从www.accelrys.com 可获得多种进行计算机建模的软件)。鉴定到未配对半胱氨酸残基后，可用标准的分 子生物学技术突变编码感兴趣糖基转移酶的DNA，通过缺失或用另一氨基酸残基取 代来去除未配对的半胱氨酸。再用计算机建模选择大小、形状和电荷相适合的取代 氨基酸。也可通过肽图确定未配对的半胱氨酸。突变感兴趣的糖基转移酶后，在细 菌包含体中表达该蛋白，测定其重折叠能力。正确重折叠的糖基转移酶将具有生物 学活性。
在优选实施方式中，可用以下氨基酸残基取代真核糖基转移酶中的未配对半胱 氨酸残基以促进重折叠：Ala、Ser、Thr、Asp、Ile或Val。如果未配对的半胱氨酸不 在螺旋结构中，也可用Gly。
人N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI，登录号NP_002397)是诱变未配对的半胱氨 酸后显示重折叠增强的糖基转移酶的例子。(参见例如，实施例2，见下)。人GNTI 与以下多种生物的真核GNTI蛋白密切相关，如中国仓鼠，登录号AAK61868；兔， 登录号AAA31493；大鼠，登录号NP_110488；金黄地鼠，登录号AAD04130；小鼠， 登录号P27808；斑马鱼，登录号AAH58297；爪蟾，登录号CAC51119；果蝇，登 录号NP_525117；疟蚊，登录号XP_315359；秀丽新小杆线虫(C.elegans)，登录号 NP_497719；小立碗藓(Physcomitrella patens)，登录号CAD22107；马铃薯(Solanum tuberosum)，登录号CAC80697；烟草(Nicotiana tabacum)，登录号CAC80702；水稻 (Oryza sativa)，登录号CAD30022；本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)，登录号 CAC82507；和拟南芥(Arabidopsis thaliana)，登录号NP_195537。
已测定了兔N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI)蛋白的结构，显示CYS123未配对。 (氨基酸残基编号指全长蛋白质序列，即使GNTI蛋白被截短)。用基于兔GnTI的计 算机建模测定了人GnTI蛋白的结构。它们的比对见图6。在人GnTI蛋白中，CYS121 未配对。在人GnTI中进行了CYS121取代。CYS121SER突变体和CYS121ALA突 变体有活性。相反，没有检测到CYS121THR突变体的活性，而CYS121ASP突变体 活性低。根据秀丽新小杆线虫GNT1蛋白的预测结构构建了双突变体ARG120ALA、 CYS121HIS，它们有活性。
可根据计算机建模利用上述真核GnTI蛋白的氨基酸序列测定蛋白质结构，兔 GnTI蛋白的CYS123和人GnTI蛋白的CYS121功能保守。据此分析，残基123是 以下蛋白中的未配对半胱氨酸：中国仓鼠GnTI、兔GnTI、大鼠GnTI、金黄地鼠GnTI 和小鼠GnTI。因此，可在各种GnTI酶中将CYS123突变为丝氨酸、丙氨酸或精氨 酸，以产生重折叠活性增强的活性蛋白质。上述蛋白的以下双突变体ARG122ALA CYS123HIS也显示重折叠增强。
在一个实施方式中，突变上述真核GnT1蛋白之一以去除未配对的半胱氨酸残 基，如CYS121SER、CYS121ALA、CYS121ASP或双突变ARG120ALA CYS121HIS， 在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺/半胱氨酸的缓 冲液中重折叠。
突变未配对的半胱氨酸后显示重折叠增强的另一糖基转移酶是GalT1。将牛 GalT1中的半胱氨酸342突变为苏氨酸残基，突变的酶溶解后显示重折叠增强。参见 例如，Ramakrishnan等，J.Biol.Chem.276：37666-37671(2001)。令人感兴趣的是， GnTI酶中未配对的半胱氨酸突变为苏氨酸会消除其活性。
在一个实施方式中，突变GalT1蛋白质以去除未配对的半胱氨酸残基，如 CYS342THR，在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺 /半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
突变未配对的半胱氨酸后显示重折叠增强的另一糖基转移酶是GalNAc T2。 GalNAc T2蛋白与GalNAc T1蛋白之间共有许多相同的氨基酸残基。当COS细胞表 达时，两个半胱氨酸残基CYS212和CYS214突变后，人GalNAc T1蛋白保持活性。 参见例如，Tenno等，Eur.J.Biochem.269：4308-4316(2002)。活性突变包括 CYS212ALA、CYS214ALA、CYS212SER、CYS214SER和双突变CYS212SER CYS214SER。人GalNAc T1蛋白中的半胱氨酸残基CYS212和CYS214残基在人 GalNAc T2蛋白中保守，即残基CYS227和CYS229。参见例如图44。因此，可用含 有以下突变之一的GalNAc T2蛋白来促进不溶性蛋白质的重折叠：CYS227ALA、 CYS229ALA、CYS227SER、CYS229SER和双突变CYS227SER CYS229SER。残基 编号指人GalNAc T2蛋白，但可在其它真核GalNAc T2蛋白如小鼠、大鼠、兔、猪 中鉴定到保守性半胱氨酸残基CYS227和CYS229，将其突变以促进重折叠。
在一个实施方式中，突变GalNAc T2蛋白以去除未配对的半胱氨酸残基，如 CYS227ALA、CYS229ALA、CYS227SER、CYS229SER或双突变CYS227SER  CYS229SER，在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG或胱胺 /半胱氨酸的缓冲液中重折叠。
突变未配对的半胱氨酸后显示重折叠增强的另一糖基转移酶是Corel GalT1。在 一个实施方式中，突变果蝇Corel GalT1。在另一实施方式中，突变人Corel  GalT1。果蝇Corel GalT1蛋白含有7个半胱氨酸残基。将各半胱氨酸残基分别突变 为丝氨酸或丙氨酸。在大肠杆菌包含体中表达该突变的果蝇Corel GalT1蛋白，溶解， 重折叠。测定重折叠果蝇Corel GalT1突变体的酶活，与野生型重折叠果蝇Corel GalT1的活性作比较。与野生型蛋白相比，突变的果蝇Corel GalT1的酶活提高表明 重折叠增强。
在一个实施方式中，突变Corel GalT1蛋白以去除未配对的半胱氨酸残基，如 果蝇蛋白或人蛋白，在细菌包含体中表达，溶解，在含有氧化还原对如GSH/GSSG 或胱胺/半胱氨酸的缓冲液中重折叠。果蝇Corel GalT1中优选进行取代的半胱氨酸 残基是C103、C127、C208、C246、C261、C315和C316。
2.截短糖基转移酶以促进重折叠
真核糖基转移酶通常包括以下结构域：催化结构域、主干区、跨膜结构域和信 号锚定结构域。在细菌中表达时，信号锚定结构域和跨膜结构域一般缺失。用于本 发明方法的真核糖基转移酶可包括所有或一部分主干区和催化结构域。在一些实施 方式中，该真核糖基转移酶仅包含催化结构域。
可鉴定糖基转移酶结构域以进行缺失诱变。例如，本领域技术人员可鉴定真核 糖基转移酶中的主干区，并一个一个地去除主干区氨基酸以鉴定重折叠后具有高活 性的截短的真核糖基转移酶蛋白。
本申请中的缺失突变体以两种方式表示：Δ或D，后面是天然全长氨基酸序列 氨基末端缺失的残基数目，或从天然全长氨基酸序列翻译的第一个氨基酸残基的符 号和残基编号。例如，ST6GalNAcIΔ或D35和ST6GalNAcI K36，都指人ST6GalNAcI 蛋白的同一截短物。
例如，大鼠ST3GalIII蛋白含有主干区的氨基酸残基29-84。该蛋白的催化结构 域含有氨基酸残基85-374。因此，截短的大鼠ST3GalIII蛋白在氨基末端可缺失约(例 如)29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84或85个残基。
也可在GnT1蛋白中进行缺失突变。例如，人GnT1蛋白含有主干区氨基酸残基 31-112。因此，截短的人GnT1蛋白在氨基末端可缺失约(例如)30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、 107、108、109、110或111个残基。
也可在GalT1蛋白中进行缺失突变。例如，牛GalT1蛋白含有主干区氨基酸残 基71-129。因此，截短的牛GalT1蛋白在氨基末端可缺失约(例如)70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、017、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、 123、124、125、126、127或128个残基。
也可在Corel GalT1蛋白中进行缺失突变。例如，果蝇Corel GalT1蛋白含有主 干区氨基酸残基36-102。因此，截短的果蝇Corel GalT1蛋白在氨基末端可缺失约(例 如)35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101或102个残基。作为另一个 例子，人Corel GalT1蛋白含有主干区氨基酸残基32-90。因此，截短的人Corel GalT1 蛋白在氨基末端可缺失约(例如)32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89或90个残基。
也可在ST3Gal1蛋白中进行缺失突变。例如，人ST3Gal1蛋白含有主干区氨基 酸残基18-58。因此，截短的人ST3Gal1蛋白在氨基末端可缺失约(例如)18、19、20、 21、22、23、24、25、26、  27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57或 58个残基。作为另一个例子，猪ST3Gal1蛋白含有主干区氨基酸残基28-61。因此， 截短的猪ST3Gal1蛋白在氨基末端可缺失约(例如)28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、  52、  53、 54、56、57、58、59、60或61个残基。
也可在GalNAcT2蛋白中进行缺失突变。例如，大鼠GalNAcT2蛋白含有主干 区氨基酸残基40-95。因此，截短的大鼠GalNAcT2蛋白在氨基末端可缺失约(例如)40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95个 残基。
也可在ST6GalNAcI蛋白中进行缺失突变。例如，小鼠ST6GalNAcI蛋白含有主 干区氨基酸残基30-207。因此，截短的小鼠ST6GalNAcI蛋白在氨基末端可缺失约(例 如)30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、017、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、 118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、 148、149、150、151、152、153、154、156、157、158、159、160、161、162、163、 164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、 179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207个残 基。作为另一个例子，人ST6GalNAcI蛋白含有主干区氨基酸残基35-278。因此，截 短的人ST6GalNAcI蛋白在氨基末端可缺失约(例如)34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、017、108、109、110、111、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、156、157、 158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、 173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、 188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、 218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、 233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、 248、249、250、251、252、253、254、256、257、258、259、260、261、262、263、 264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277或278 个残基。作为另一个例子，鸡ST6GalNAcI蛋白含有主干区氨基酸残基37-253。因此， 截短的鸡ST6GalNAcI蛋白在氨基末端可缺失约(例如)36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、101、102、103、104、105、106、017、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、 128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、156、157、158、 159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、 204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、 234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252或253个残基。
D.糖基转移酶的单罐(one pot)重折叠
本发明的这些实施方式基于以下惊人的发现：可在一个容器中重折叠细菌包含 体中表达的多种真核糖基转移酶，即单罐法。用此方法，可一起折叠至少两种糖基 转移酶，从而节约了时间和材料。重折叠条件如上所述。优化了糖基转移酶混合物 重折叠条件，因此，对于混合物中的特定酶来说，条件可能不是最优的。然而，因 为优化了糖基转移酶组合的重折叠，在最终产物中可检测到重折叠糖基转移酶各自 的生物学活性。生物学活性指重折叠酶的酶活，可表示为特异性活性。生物学活性 包括例如，至少0.1、0.5、1、2、5、7或10单位活性的特异性活性。单位定义如下： 一个活性单位的酶每分钟在给定温度(如37℃)和pH值(如pH 7.5)可催化形成1μmol 产物。因此，10单位酶是在温度如37℃和pH值如7.5下在1分钟内能将10μmol 底物转化为10μmol产物的酶催化量。然后，可用含有重折叠糖基转移酶的反应混合 物来合成寡糖、合成糖脂、重建糖蛋白和糖基PEG化糖蛋白。
在一些实施方式中，将包含体的糖基转移酶分别溶解，然后在适合重折叠的条 件下混合。在其它实施方式中，将含有糖基转移酶的包含体混合、溶解，然后在合 适条件下重折叠。
重折叠缓冲液一般含有氧化还原对。可在pH范围(例如)6.0-10.0的缓冲液中进 行重折叠。重折叠缓冲液可包括其它添加剂以促进重折叠，如L-精氨酸(0.4-1M)； PEG；低浓度的变性剂，如尿素(1-2M)和氯化胍(0.5-1.5M)：和去污剂(如Chaps、SDS、 CTAB和Triton X-100)。
在一些实施方式中，在静置容器中，即不混合、不搅拌、不振荡也不移动反应 混合物的情况下进行重折叠。
重折叠酶的组合可包括构建具有特定寡糖结构的酶。一旦鉴定到所需终产物， 本领域技术人员能鉴定到适合于包含在混合物中的糖基转移酶。
重折叠酶的反应混合物可包含经突变增强了重折叠的糖基转移酶，如上述GnTI 酶。
在优选实施方式中，使进行N-连接的糖基化步骤的酶在一个容器中一起重折叠。 例如，可在细菌包含体中表达N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI)、β-1，4半乳糖基转移 酶I(Gal TI)和N-乙酰氨基乳糖苷(N-acetyllactosaminide)α-2，3-唾液酸转移酶 (ST3GalIII)，溶解，在一个容器中一起重折叠。终产物具有所有三种蛋白的活性，表 明它们都正确地重折叠。也可以在GnTI和Gal TI一起重折叠时使ST3GalIII不重折 叠。实施例3中详细描述了这些试验。
在另一优选实施方式中，用本发明公开的细菌表达的重折叠糖基转移酶来完成 肽或蛋白质的O-连接糖基化。例如，可用重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)酶将GalNAc 加到多肽上。例如，实施例4证明了可用重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)将GalNAc 加到GCSF蛋白上。可用O-连接的糖基转移酶的组合来重建(例如)蛋白质、肽、糖 蛋白或糖肽。这些组合包括例如：GalNAc-T2和ST6GalNAc1；或GalNAc-T2、corel GalT1和ST3Gal1或ST3GalT2。
III.糖基转移酶
用于实施本发明的糖基转移酶是真核糖基转移酶。这种糖基转移酶的例子包括 但不限于Staudacher，E.(1996)Trends in Glycoscience and Glycotechnology，8： 391-408，afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf.html和www.vei.co.uk/TGN/gt guide.htm 所述的酶。
真核糖基转移酶
一些真核糖基转移酶在其氨基末端具有对催化活性不需要的拓扑结构域(参见 美国专利号5,032,519)。在目前已表征的糖基转移酶中，“胞质结构域”的长度最常为 约1-10个氨基酸，大多数是氨基-末端结构域；称为“信号锚定结构域”的相邻结构域 的长度通常为约10-26个氨基酸；与信号锚定结构域相邻的“主干区”长度通常为约 20-60个氨基酸，已知其功能是将糖基转移酶保持在高尔基体中的保留信号；主干区 的羧基侧是催化结构域。
已克隆并表达了许多哺乳动物的糖基转移酶，就供体和受体底物特异性表征了 这些重组蛋白，也通过尝试确定参与供体或受体底物特异性的残基或结构域的定点 诱变研究了它们(Aoki等(1990)EMBO.J.9：3171-3178；Harduin-Lepers等(1995) Glycobiology 5(8)：741-758；Natsuka和Lowe(1994)Current Opinion in Structural Biology 4：683-691；Zu等(1995)Biochem.Biophys.Res.Comm.206(1)：362-369； Seto等(1995)Eur.J.Biochem.234：323-328；Seto等(1997)J.Biol.Chem.272： 14133-141388)。
在一组实施方式中，本发明重组糖基转移酶蛋白的功能域获自已知的唾液酸转 移酶。适合用于本发明的唾液酸转移酶的例子包括但不限于：ST3GalIII、ST3Gal IV、 ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(本文所用的唾液酸转移酶命名法见Tsuji等(1996)Glycobiology 6：v-xiv)。示范性 α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)能将唾液酸转移到Galβ1→4GlcNAc二糖或糖苷的非 还原末端Gal。参见Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.，256：3159(1981)，Weinstein 等，J.Biol.Chem.，257：13845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.，267：21011(1992)。 另一示范性α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)能将唾液酸转移到Galβ1→3GalNAc二糖 或糖苷的非还原性末端Gal。参见Rearick等，J.Biol.Chem.，254：4444(1979)和 Gillespie等，J.Biol.Chem.，267：21004(1992)。示范性酶还包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6 唾液酸转移酶(参见Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。唾液酸转移 酶命名法见Tsuji，S.等，(1996)Glycobiology 6：v-vii。
用于要求权利的方法的唾液酸转移酶的例子是ST3GalIII，也称为α(2，3)唾液酸 转移酶(EC 2.4.99.6)。该酶能催化使唾液酸转移到Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3GalNAc 或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal(参见例如，Wen等(1992)J.Biol.Chem.267：21011； Van den Eijnden等(1991)J.Biol.Chem.256：3159)。通过在两个糖之间形成α-连接将 唾液酸连接于Gal。两个糖之间的键(连接)是在NeuAc的2位和Gal的3位之间。此 特定酶可从大鼠肝中分离得到(Weinstein等(1982)J.Biol.Chem.257：13845)；人 cDNA(Sasaki等(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J. Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等(1996)J.Biol.Chem.271： 931-938)DNA序列已知，可帮助通过重组表达产生此酶。在优选实施方式中，要求 权利的唾液酸化方法采用大鼠ST3GalIII。已克隆了大鼠ST3GalIII，其序列已知。参 见例如，Wen等，J.Biol.Chem.267：21011-21019(1992)，登录号M97754。
在另一组实施方式中，本发明重组糖基转移酶蛋白的功能域获自岩藻糖基转移 酶。本领域技术人员知道许多岩藻糖基转移酶。简要说，岩藻糖基转移酶包括能将 L-岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到受体糖的羟基位置上的任何一种酶。在一些实施方式 中，例如，受体糖是寡糖糖苷Galβ(1→4)GlcNAc基团中的GlcNAc。适合此反应的 岩藻糖基转移酶包括获自人乳汁的Galβ(1→3，4)GlcNAcα(1→3，4)岩藻糖基转移酶 (FTIII，E.C.号2.4.1.65)(参见Palcic等，Carbohydrate Res.190：1-11(1989)；Prieels等， J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)；和Nunez等，Can.J.Chem.59： 2086-2095(1981))以及在人血清中发现的Galβ(1→4)GlcNAcα(1→3)岩藻糖基转移酶 (FTIV、FTV和FTVI，E.C.号2.4.1.65)和NeuAcα(23)βGal(1→4)βGlcNAcα(1→3)岩 藻糖基转移酶(FTVII)。还可用α1，3岩藻糖基转移酶IX(人和小鼠FTIX的核苷酸序 列)，如Kaneko等(1999)FEBS Lett.452：237-242所述。此外，可用 Galβ(1→3，4)GlcNAcα(1→3，4)岩藻糖基转移酶的重组形式(参见Dumas等，Bioorg. Med.Letters 1：425-428(1991)和Kukowska-Latallo等，Genes and Development 4：1288-1303(1990))。其它示范性岩藻糖基转移酶包括α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.号 2.4.1.69)。可用Mollicone等，Eur.J.Biochem.191：169-176(1990)或美国专利号 5,374,655所述方法进行酶促岩藻糖糖基化。
在另一组实施方式中，本发明重组糖基转移酶蛋白的功能域获自已知的半乳糖 基转移酶。示范性半乳糖基转移酶包括β-1，4半乳糖基转移酶I、α1，3-半乳糖基转移 酶(E.C.号2.4.1.151，参见例如，Dabkowski等，Transplant Proc.25：2921(1993)和 Yamamoto等，Nature 345：229-233(1990)，牛(GenBankj04989，Joziasse等(1989)J.Biol. Chem.264：14290-14297)，小鼠(GenBank m26925；Larsen等(1989)Proc.Nat’l.Acad. Sci.USA 86：8227-8231)，猪(GenBank L36152；Strahan等(1995)Immunogenetics 41：101-105))。另一种合适的α1，3-半乳糖基转移酶是参与合成B血型抗原的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等(1990)J.Biol.Chem.265：1146-1151(人))。适合用于本发明融 合蛋白的还有α1，4-半乳糖基转移酶，包括例如：EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等(1989)Eur.J.Biochem.183：211-217)，人(Masri 等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663)，小鼠(Nakazawa等(1988)J. Biochem.104：165-168)，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45， Stahl等(1994)J.Neurosci.Res.38：234-242)。其他合适的半乳糖基转移酶包括例如： α1，2-半乳糖基转移酶(来自例如非洲粟酒人体酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)， Chapell等(1994)Mol.Biol.Cell 5：519-528)。
可用于本发明重组融合蛋白的其它糖基转移酶已有详述，如唾液酸转移酶、半 乳糖基转移酶和岩藻糖基转移酶。具体说，糖基转移酶也可以是(例如)葡糖基转移酶 如Alg8(Stagljov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5977(1994))或Alg5(Heesen等Eur.J. Biochem.224：71(1994))，N-乙酰半乳糖胺基转移酶如β(1，3)-N-乙酰半乳糖胺基转移 酶、β(1，4)-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(美国专利号5,691,180、Nagata等J.Biol.Chem. 267：12082-12089(1992)和Smith等，J.Biol Chem.269：15162(1994))和N-乙酰半乳糖 胺基转移酶蛋白(Homa等，J.Biol Chem.268：12609(1993))。合适的N-乙酰葡糖胺基 转移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hull等，BBRC 176：608(1991))、GnTII和GnTIII(Ihara 等，J.Biochem.113：692(1993))、GnTV(Shoreiban等，J.Biol.Chem.268：15381 (1993))、O-连接的N-乙酰葡糖胺基转移酶(Bierhuizen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9326(1992))、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(Rajput等，Biochem J.285：985(1992)， 和乙酰透明质酸合酶。感兴趣的还有参与蛋白聚糖合成的酶，例如N-乙酰半乳糖胺 基转移酶I(EC 2.4.1.174)和参与硫酸软骨素合成的酶，如N-乙酰半乳糖胺基转移酶 II(EC 2.4.1.175)。合适的甘露糖基转移酶包括α(1，2)甘露糖基转移酶、α(1，3)甘露糖基 转移酶、β(1，4)甘露糖基转移酶、Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1。木糖基转移酶包 括例如蛋白质木糖基转移酶(EC 2.4.2.26)。
在一些实施方式中，在细菌中表达真核N-乙酰半乳糖胺基转移酶，用本发明公 开的方法重折叠。已分离和表征了许多GalNAcT酶，如GalNAcT1，登录号X85018； GalNAcT2，登录号X85019(均描述于White等，J.Biol.Chem.270：24156-24165 (1995))；和GalNAcT3，登录号X92689(描述于Bennett等，J.Biol.Chem. 271：17006-17012(1996))。
IV.核酸
本领域技术人员知道编码糖基转移酶的核酸和获得这种核酸的方法。可用体外 方法如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)或自身 持续序列复制系统(SSR)来扩增或克隆合适的核酸(如cDNA、基因组或子序列(探 针))。本领域技术人员熟知各种克隆和体外扩增方法。足以指导本领域技术人员进行 许多克隆实践的技术和说明的例子参见Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南，酶 学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)152 Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；Sambrook等(1989)《分子克隆-实验 室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，(Sambrook等)；《新编分子生物 学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资公司， (1994增刊)(Ausubel)；Cashion等，美国专利号5,017,478；和Carr，欧洲专利号 0,246,864。
可用上述合适方法，包括例如：用限制性酶克隆和限制性切割合适序列制备编 码糖基转移酶或其子序列的DNA。在一个优选实施方式中，用常规克隆方法分离得 到编码糖基转移酶的核酸。(例如)GenBank或其它序列数据(如上所述)提供的糖基转 移酶的核苷酸序列可用来提供能特异性杂交基因组DNA样品中的糖基转移酶基因 的探针，或杂交总RNA样品中编码葡糖基转移酶的mRNA(如Southern或Northern 印迹)的的探针。一旦鉴定到编码糖基转移酶的靶核酸后，可按照本领域技术人员已 知的标准方法分离该核酸(参见例如，Sambrook等(1989)，《分子克隆：实验室手册》 (Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory；Berger和Kimmel(1987)《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第152 卷：《分子克隆技术指南》(Guide to Molecular Cloning Techniques)，San Diego：Academic Press，Inc.；或Ausubel等(1987)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in  Molecular Biology)，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York)。而且，可用 限制性酶切割分离的核酸，产生编码全长糖基转移酶，如含有编码至少糖基转移酶 的主干区或催化结构域子序列的核酸或其子序列。然后，可连接编码糖基转移酶或 其子序列的这些限制性酶切片段，(例如)以产生编码重组糖基转移酶融合蛋白的核 酸。
可通过测定表达产物表征编码糖基转移酶或其子序列的核酸。可采用根据所表 达蛋白的物理、化学或免疫学特性的检测试验。例如，可通过该核酸编码的蛋白能 否催化使糖从供体底物转移到受体底物来鉴定克隆的糖基转移酶，包括糖基转移酶 融合蛋白。在优选方法中，用毛细管电泳来检测反应产物。此高度灵敏试验包括采 用荧光素标记的糖或二糖氨基苯基衍生物，如Wakarchuk等(1996)，J.Biol.Chem.271 (45)：28271-276所述。例如，为测定奈瑟球菌lgtC酶，可采用FCHASE-AP-Lac或 FCHASE-AP-Gal，而检测奈瑟球菌lgtB酶，合适的试剂是 FCHASE-AP-GlcNAc(Id.)。
同时，可化学合成编码糖基转移酶或其子序列的核酸。合适方法包括Narang等 (1979)，Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法；Brown等(1979)，Meth.Enzymol.68： 109-151的磷酸二酯法；Beaucage等(1981)，Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚 磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支持物法。化学合成产生的单链寡核苷酸， 可通过与互补序列杂交或用DNA聚合酶以单链为模板聚合转变成双链DNA。本领 域技术人员知道，化学合成DNA的序列长度常常限于约100个碱基，更长的序列可 通过连接较短序列获得。
可用DNA扩增方法如聚合酶链反应(PCR)克隆编码糖基转移酶或其子序列的核 酸。因此，(例如)用含有一个限制性酶切位点(如NdeI)的正义引物和含有另一限制性 酶切位点(如HindIII)的反义引物，进行PCR扩增该核酸序列或子序列。这将产生编 码所需糖基转移酶或子序列并具有末端限制性酶切位点的核酸。然后，此核酸可容 易地连接到含有编码第二种分子并具有合适的相应限制性酶切位点的核酸的载体 中。本领域技术人员可利用GenBank或其它来源提供的序列信息确定合适的PCR引 物。也可通过定点诱变将合适的限制性酶切位点加入到编码糖基转移酶蛋白或蛋白 子序列的核酸中。用合适的限制性核酸内切酶切割含有编码糖基转移酶的核苷酸序 列或子序列的质粒，然后按照标准方法连接到合适的载体中进行扩增和/或表达。足 以指导本领域技术人员进行体外扩增方法的技术的例子见Berger，Sambrook和 Ausubel，以及Mullis等，(1987)美国专利号4,683,202；《PCR方法，方法和应用指 南》(PCR Protocols A Guide to Methods and Application)(Innis等编)Academic Press Inc. San Diego，CA(1990)(Innis)；Amheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47； The Journal Of NIH Research(1991)3：81-94；(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：1173；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874；Lomell等 (1989)J.Clin.Chem.，35：1826；Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080； Van Brunt(1990)Biotechnology 8：291-294；Wu和Wallace(1989)Gene 4：560；和 Barringer等(1990)Gene 89：117。
可将具体核酸表达的克隆的糖基转移酶蛋白，包括糖基转移酶融合蛋白的其它 物理特性与已知的糖基转移酶的特性作比较，以提供另一种方法来鉴定作为受体底 物特异性和/或催化活性决定因素的糖基转移酶的合适序列或结构域。或者，可突变 推定的糖基转移酶基因或重组糖基转移酶基因，通过检测未突变的天然产生糖基转 移酶或对照糖基转移酶正常产生的糖结构中的变异，来确定其是否有糖基转移酶的 作用、重折叠的能力、或具体序列或结构域的作用。
可采用突变或修饰糖基转移酶和测定修饰或突变蛋白的活性如受体底物活性和 /或催化活性的标准方法，来鉴定克隆的糖基转移酶的功能域，如本文所述。可利用 各种糖基转移酶的功能域构建包含一个或多个糖基转移酶功能域的重组糖基转移酶 融合蛋白的编码核酸。然后测定这些融合蛋白所需的受体底物或催化活性。
在克隆重组糖基转移酶融合蛋白的示范性方法中，比对克隆的糖基转移酶的已 知核酸或氨基酸序列，进行比较以确定各种糖基转移酶之间序列相同的量。可利用 此信息根据感兴趣糖基转移酶之间的序列相同的量来鉴定和选择能赋予或调节糖基 转移酶活性如受体底物活性和/或催化活性的蛋白结构域。例如，可利用在感兴趣糖 基转移酶之间具有序列相同性并与已知活性相关的结构域，来构建含有该结构域和 具有与该结构域相关活性(如受体底物特异性和/或催化活性)的重组糖基转移酶融合 蛋白。
V.重组糖基转移酶的表达
可在各种宿主细胞，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞 如COS、CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系中表达重组真核糖基转移酶。宿主细 胞可以是哺乳动物细胞、植物细胞或微生物，例如，酵母细胞、细菌细胞或丝状真 菌细胞。合适的宿主细胞例子包括例如：固氮菌(Azotobacter sp.)(如维涅兰德固氮菌 (A.vinelandii))、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、根瘤菌(Rhizobium sp.)、欧文菌(Erwinia sp.)、埃希菌(Escherichia sp.)(如大肠埃希菌(E.coli))、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌 (Pseudomonas)、变形杆菌(Proteus)、沙门菌(Salmonella)、沙雷菌(Serratia)、志贺杆 菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)、副球菌(Paracoccus)和克雷伯 菌(Klebsiella sp.)等。此类细胞可以是以下几个属中的任何一个，包括酵母(如酿酒酵 母(S.cerevisiae))、假丝酵母(Candida)(如产朊假丝酵母(C.utilis)、近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)、克柔假丝酵母(C.krusei)、易变假丝酵母(C.versatilis)、解脂假丝酵母(C. lipolytica)、诞沫假丝酵母(C.zeylanoides)、季也蒙假丝酵母(C.guilliermondii)、白假 丝酵母(C.albicans)和腐殖假丝酵母(C.humicola))、毕赤酵母(Pichia)(如粉状毕赤酵母 (P.farinosa)和奥默毕赤酵母(P.ohmeri))、球拟酵母(Torulopsis)(如白球拟酵母(T. candida)、球形球拟酵母(T.sphaerica)、木质球拟酵母(T.xylinus)、无名球拟酵母(T. famata)和易变球拟酵母(T.versatilis))，德巴利酵母(Debaryomyces)(如亚球形德巴利酵 母(D.subglobosus)、莰氏德巴利酵母(D.cantarellii)、球形德巴利酵母(D.globosus)、 汉氏德巴利酵母(D.hansenii)和日本德巴利酵母(D.japonicus))，接合酵母 (Zygosaccharomyces)(如鲁氏接合酵母(Z.rouxii)和拜氏接合酵母(Z.bailii))，克鲁维酵 母(Kluyveromyces)(如马克思克鲁维酵母(K.marxianus))，汉森酵母(Hansenula)(如异 常汉森酵母(H.anomala)和翟氏汉森酵母(H.jadinii))和酒香酵母(Brettanomyces)(如B. lambicus和异常酒香酵母(B.anomalus))。有用菌的例子包括但不限于：埃希菌 (Escherichia)、肠杆菌(Enterobacter)、固氮菌(Azotobacter)、欧文菌(Erwinia)、克雷伯 菌(Klebsielia)。
一般将编码融合蛋白的多核苷酸置于在所需宿主细胞中起作用的启动子控制 下。熟知有各种启动子可用于本发明表达载体中，这取决于具体应用。通常，启动 子的选择依赖于启动子在其中具有活性的细胞。也任选包括其它表达控制序列如核 糖体结合位点、转录终止位点等。包括这些控制序列中一个或多个的构建物称为“表 达盒”。因此，本发明提供其中掺入了编码融合蛋白的核酸以在所需宿主细胞中高水 平表达的表达盒。
常常通过克隆能在某特定宿主细胞中表达的基因来获得适用于该细胞的表达控 制序列。常用原核控制序列包括本文中定义的用于启动转录的启动子，和任选地可 包含操纵子，以及核糖体结合位点序列，常用启动子例如有β-内酰胺酶(青霉素酶) 和乳糖(lac)启动子系统(Change等，Nature(1977)198：1056)、色氨酸(trp)启动子系 统(Goeddel等，Nuclear Acids Res.(1980)8：4057)、tac启动子(DeBoer等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.SA.(1983)80：21-25)；和λ-衍生的PL启动子及N-基因核糖体结合位点 (Shimatake等，Nature(1981)292：128)。具体启动子系统对本发明来说并不重要， 可采用在原核细胞中起作用的任何可得到的启动子。
为了在除大肠杆菌以外的原核细胞中表达重组真核糖基转移酶，需要在特定的 原核细胞中起作用的启动子。这种启动子可获自从该物种已克隆的基因，或可采用 杂合启动子。例如，杂合的trp-lac启动子在除大肠杆菌之外的芽孢杆菌中具有功能。
可将核糖体结合位点(RBS)方便地包含在本发明表达盒中。大肠杆菌的RBS(例 如)由位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长3-9个核苷酸的核苷酸序列组成 (Shine和Dalgarno，Nature(1975)254：34；Steitz，《生物学调控和发育：基因表达》 (Biological regulation and development：Gene Expression)(R.F.Goldberger编)，第1卷， 349页，1979，Plenum Publishing，NY)。
为了在酵母中表达重组真核糖基转移酶，方便的启动子包括GAL1-10(Johnson 和Davies(1984)Mol.Cell.Biol.4：1440-1448)、ADH2(Russell等(1983)J.Biol.Chem. 258：2674-2682)、PHO5(EMBO J.(1982)6：675-680)和MFα(Herskowitz和 Oshima(1982)，《酵母的分子生物学》(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)(Strathern、Jones和Broach编)Cold Spring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，N.Y.，181-209页)。另一适用于酵母的启动子是ADH2/GAPDH杂合启动子， 如Cousens等，Gene 61：265-275(1987)所述。对于丝状真菌，如曲霉菌菌株(McKnight 等，美国专利号4,935,349)，有用启动子的例子包括衍生自构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)糖酵解基因的启动子，如ADH3启动子(McKnight等，EMBO J.4：2093-2099 (1985))和tpiA启动子。合适的终止子的例子是ADH3终止子(McKnight等)。
适用于植物的组成性启动子包括例如：花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录启动区 和VI启动子、衍生自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1′-或2′-启 动子和本领域技术人员已知的在植物细胞中具有活性的其它启动子。其它合适的启 动子包括玄参花叶病毒的全长转录启动子、肌动蛋白启动子、组蛋白启动子、微管 蛋白启动子或甘露氨酸合酶启动子(MAS)。其它组成性植物启动子包括衍生自拟南芥 等的各种泛素或聚泛素启动子(Sun和Callis，Plant J.，11(5)：1017-1027(1997))、mas、 Mac或DoubleMac启动子(如美国专利号5,106,739和Comai等，Plant Mol.Biol. 15：373-381(1990)所述)和本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。可 用于植物的启动子也包括获白Ti-或Ri-质粒、植物细胞、植物病毒或发现在植物中 起作用的其它宿主的启动子。在植物中起作用，因此适用于本发明方法的细菌启动 子包括章鱼氨酸合成酶启动子、胭脂氨酸合酶启动子和甘露氨酸合成酶启动子。合 适的内源性植物启动子包括核酮糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚基(ssu)启动子、(α- 大豆聚球蛋白(conglycinin)启动子、菜豆蛋白启动子、ADH启动子和热激启动子。
组成性或调节性启动子可用于本发明。调节性启动子可能有优点，因为在诱导 融合蛋白表达之前宿主细胞可生长到高密度。在一些情况下，高水平表达异源蛋白 会减缓细胞生长。可诱导启动子是指导基因表达时可通过环境或发育因素如温度、 pH、缺氧或有氧条件、光照、转录因子和化学物质来改变基因表达水平的启动子。 在本文中，这种启动子称为″可诱导″启动子，它使人们能够控制参与核苷酸糖合成的 糖基转移酶或酶的表达时间。本领域技术人员已知大肠杆菌和其它细菌宿主细胞的 可诱导启动子。它们包括例如：lac启动子、细菌噬菌体λPL启动子、杂合的trp-lac 启动子(Amann等(1983)Gene 25：167；de Boer等(1983)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 80：21)和细菌噬菌体T7启动子(Studier等(1986)J.Mol.Biol.；Tabor等(1985)Proc. Nat’l.Acad.Sci.USA 82：1074-8)。Sambrook等(同上)中讨论了这些启动子和它们的 用途。特别优选的原核细胞表达可诱导启动子是双启动子，其包含连接于获自编码 参与半乳糖代谢的酶的基因的启动子组件(如UDP半乳糖4-差向异构酶基因(gaIE)的 启动子)的tac启动子组件。在PCT专利申请公开号WO98/20111中描述的双tac-gal 启动子提供的表达水平高于单独一个启动子提供的表达水平。
本领域技术人员知道用于植物的可诱导启动子(参见例如，Kuhlemeier等(1987) Ann.Rev.Plan Physiol.38：221引用的参考文献)，包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的启动子(″ssu″启动子)，它是光诱导的，只在光 合组织中有活性。
本领域技术人员也熟知其它生物的可诱导启动子，包括例如：阿拉伯糖启动子、 lacZ启动子、金属硫蛋白启动子和热激启动子等。
将包含操作性连接于当置于合适宿主细胞中时能驱动某感兴趣多核苷酸表达的 基因表达控制信号的该多核苷酸的构建物称为“表达盒”。常常将编码本发明融合蛋白 的表达盒置于表达载体中以引入宿主细胞。除表达盒外，载体一般包括使该载体能 够在一种或多种选择的宿主细胞中独立复制的核酸序列。通常，此序列是使该载体 能不依赖宿主染色体DNA复制的序列，包括复制源或自主复制序列。熟知各种细菌 中的这种序列。例如，源自质粒pBR322的复制适合于大多数革兰阴性菌。或者，可 使该载体整合入宿主细胞基因组互补区中随该细胞的DNA复制一起复制。用于在细 菌中表达这些酶的优选表达载体是pTGK，它包含双tac-gal启动子，其描述见PCT 专利申请公开号WO98/20111。
也可能需要加入调控序列来调节与宿主细胞生长相关的多肽表达。调控系统的 例子是对化学或物理刺激的反应中，包括调节化合物存在时引起基因表达打开或关 闭的那些系统。原核系统中调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。酵母菌中，可 采用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可采用TAKAα-淀粉酶启动子、黑 曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调控序列。
构建多核苷酸构建物通常需要采用能在细菌中复制的载体。可购得各种纯化细 菌质粒的试剂盒(参见例如，EasyPrepJ，FlexiPrepJ，购自Pharmacia Biotech； StrataCleanJ，Stratagene；和QIAexpress表达系统，Qiagen)。然后，可进一步操作分 离和纯化的质粒以产生其它质粒，用于转染细胞。也可能在链霉菌或芽孢杆菌中克 隆。
常常将选择性标记掺入到表达载体中用于表达本发明多核苷酸。这些基因可编 码在选择性培养基中培养的转化宿主细胞存活或生长所必需的基因产物，如蛋白质。 未转染含有选择基因的载体的宿主细胞不能在该培养基中存活。选择基因一般能编 码产生对抗生素或其它毒素、如氨苄青霉素、新霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素 有抗性的蛋白。或者，选择性标记可编码能补充营养缺陷或提供不能从复合培养基 中获得的必需营养物的蛋白，如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。该载体常含 有一个在(例如)大肠杆菌或其它细胞中起作用的选择性标记，在这些细胞中复制该载 体再引入宿主细胞。本领域技术人员知道许多选择性标记，它们的描述参见例如 Sambrook等，同上。用于细菌细胞的优选选择性标记是卡那霉素抗性标记(Vieira和 Messing，Gene 19：259(1982))。采用卡那霉素选择优于(例如)氨苄青霉素选择，因 为培养基中的β-内酰胺酶能快速降解氨苄青霉素，从而去除了选择压力，使培养基 中不含该载体的细胞过度生长。
构建含有一个或多个上述组分的合适载体可采用标准连接技术，如上面引用的 参考文献所述。将分离的质粒或DNA片段切割、剪裁并以需要的形式再连接产生所 需质粒。为了验证构建质粒的序列正确，可用标准技术如限制性核酸内切酶消化和/ 或用已知方法测序分析质粒。获得这些结果的分子克隆技术是本领域公知的。本领 域技术人员熟知适合构建重组核酸的各种克隆和体外扩增方法。足以指导本领域技 术人员进行许多克隆实践的技术和说明的例子参见Berger和Kimmel，《分子克隆技 术指南，酶学方法》(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology)， 第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(Berger)；和《新编分子生物学实 验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资公司， (1998增刊)(Ausubel)。
适合用作构建本发明表达载体的起始材料的各种常用载体是本领域熟知的。对 于在细菌中克隆而言，常用载体包括pBR322衍生的载体如pBLUESCRIPTTM，和λ- 噬菌体衍生的载体。酵母菌中，载体包括酵母整合质粒(如YIp5)和酵母复制质粒(Yrp 系列质粒)和pGPD-2。可用各种常用质粒，包括pSV2、pBC12BI和p91023，以及裂 解的病毒载体(如牛痘病毒、腺病毒和杆状病毒)，附加型病毒载体(如牛乳头瘤病毒) 和逆转录病毒载体(如小鼠逆转录病毒)实现在哺乳动物细胞中的表达。
将表达载体引入所选择宿主细胞的方法不是特别重要的，本领域技术人员熟知 这些方法。例如，可通过氯化钙转化将表达载体引入原核细胞，包括大肠杆菌，可 通过磷酸钙处理或电穿孔引入真核细胞。其它转化方法也是合适的。
翻译偶联可用于增强表达。该方法采用衍生自翻译系统中天然存在的高表达基 因的短上游开放阅读框(位于启动子下游)和核糖体结合位点，一些氨基酸密码子之后 是终止密码子。在终止密码子前是第二个核糖体结合位点，终止密码子后是启动翻 译的起始密码子。该系统解散了RNA的二级结构，而有效启动了翻译。参见Squires 等(1988)，J.Biol.Chem.263：16297-16302。
也可将本发明重组真核糖基转移酶进一步连接于其它细菌蛋白质。此方法常常 导致高产量，因为由正常的原核控制序列指导转录和翻译。在大肠杆菌中，lacZ融 合蛋白常常用于表达异源蛋白质。不难获得合适的载体，如pUR、pEX和pMR100 系列(参见例如，Sambrook等，同上)。对于某些应用，可能需要在纯化后从融合蛋 白上切除非糖基转移酶和/或辅酶氨基酸。这可通过本领域已知的任何方法，包括溴 化氰、蛋白酶或Xa因子切割来实现(参见例如，Sambrook等，同上；Itakura等，Science (1977)198：1056；Goeddel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76：106；Nagai等， Nature(1984)309：810；Sung等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：561)。可将 切割位点工程改造到融合蛋白基因中所需切割点上。
通过在一种表达载体中置入多种转录盒，或对该克隆方法中所用的各表达载体 采用不同选择性标记，可以在一种宿主细胞中表达一种以上重组真核糖基转移酶。
Miller等Biotechnology 7：698-704(1989)描述了从能保持蛋白质N-末端完整性的 大肠杆菌中获得重组蛋白合适系统。在此系统中，产生的感兴趣基因是与含有肽酶 切割位点的酵母泛素基因前76个残基融合的C末端融合基因。在这两部分连接处切 割可产生具有完整的真正N-末端残基的蛋白质。
可用熟知方法，如对大肠杆菌用氯化钙转化和对哺乳动物细胞用磷酸钙处理或 电穿孔将本发明表达载体转移到选择的宿主细胞中。可利用质粒上所含基因如amp、 gpt、neo和hyg基因赋予的抗生素抗性来选择质粒转化的细胞。
VI.蛋白质和蛋白质纯化
可根据本领域标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等纯化 重组真核糖基转移酶蛋白(通常参见R.Scopes，《蛋白质纯化》(Protein Purification)， Springer-Verlag，N.Y.(1982)，Deutscher，《酶学方法》(Methods in Enzymology)，第 182卷：《蛋白质纯化指南》(Guide to Protein Purification)，Academic Press，Inc。 N.Y.(1990))。在优选实施方式中，在重折叠重组真核糖基转移酶蛋白之后纯化该蛋 白。优选均一性至少约70-90％的基本纯组合物；更优选均一性至少91％、92％、93％、 94％、95％、96％或97％；最优选均一性98-99％或更高。也可将纯化蛋白用作(例如) 产生抗体的免疫原。
为帮助纯化本发明的重组真核糖基转移酶蛋白，编码重组真核糖基转移酶蛋白 的核酸也可包括亲和结合试剂可利用的表位或“标记”，即纯化标记的编码序列。合适 表位的例子包括myc和V-5报道基因；可购得用于重组产生含有这些表位的融合蛋 白的表达载体(如Invitrogen(Carlsbad CA)载体pcDNA3.1/Myc-His和 pcDNA3.1/V5-His适合于在哺乳动物细胞中表达)。本领域技术人员熟知适合将标记 连接于本发明融合蛋白的其它表达载体和相应的检测系统，可购得其中几种(如 FLAG″(Kodak，Rochester NY)。合适标记的另一例子是聚组氨酸序列，它能够结合 金属螯合亲和配体。一般采用六个毗连的组氨酸，但也可采用多于或少于六个组氨 酸。可用作聚组氨酸标记接合部分的合适金属螯合亲和配体包括次氮基-三乙酸 (NTA)(Hochuli，E.(1990)“用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白”(Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents)，《基因工程：原理和方法》 (Genetic Engineering：Principles and Methods)，J.K.Setlow编，Plenum Press，NY； 可购自Qiagen(Santa Clarita，CA))。
纯化标记也包括麦芽糖结合域和淀粉结合域。本领域技术人员了解麦芽糖结合 域蛋白的纯化。纳入本文作参考的WO 99/15636中描述了淀粉结合域。2003年5月 5日提交的USSN 60/468,374中描述了用β环式糊精(BCD)-衍生的树脂亲和纯化含有 淀粉结合域的融合蛋白，以全文纳入本文作参考。
本领域技术人员知道适合用作标记的其它半抗原，参见(例如)《荧光探针和研究 用化学物质手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(第6版， Molecular Probes，Inc.，Eugene OR)的描述。例如，二硝基酚(DNP)、地高辛配基、 巴比妥酸盐(参见例如，美国专利号5,414,085)和几种类型的荧光团以及这些化合物 的衍生物可用作半抗原。可购得将半抗原和其它分子与蛋白质和其它分子连接的试 剂盒。例如，当半抗原包括硫醇时，可用异质双功能接头如SMCC将该标记连接于 捕获试剂上的赖氨酸残基。
本领域技术人员知道，可对糖基转移酶催化结构域或功能域和/或辅酶催化结构 域进行修饰，而不降低其生物学活性。一些修饰能有助于克隆、表达或将催化结构 域掺入融合蛋白中。本领域技术人员熟知这些修饰，包括例如在编码催化结构域的 多核苷酸的末端之一加入密码子，以(例如)在氨基末端加入甲硫氨酸以提供起始位 点，或将氨基酸(如聚组氨酸)加在末端之一以产生方便定位的限制性酶切位点或终止 密码子或纯化序列。
VII.重折叠糖基转移酶的应用
本发明提供了重组真核糖基转移酶蛋白和用重组真核糖基转移酶蛋白来酶促合 成糖蛋白、糖脂和寡糖部分以及糖基PEG化糖蛋白的方法。本发明的糖基转移酶反 应在含有至少一种糖基转移酶、受体底物和供体底物，一般还有可溶性二价金属阳 离子的反应介质中进行。在一些实施方式中，还存在辅酶和辅酶催化部分的底物， 而利用该辅酶可合成糖基转移酶的供体底物。本发明的重组真核糖基转移酶蛋白和 方法依赖于采用重组真核糖基转移酶蛋白来催化使糖加在受体底物上。
已知用糖基转移酶合成具有所需寡糖部分的糖蛋白和糖脂的许多方法。示范性 方法的描述见(例如)WO 96/32491，Ito等(1993)Pure Appl.Chem.65：753和美国专利 5,352,670、5,374,541和5,545,553。
如本文所述制备的重组真核糖基转移酶蛋白可与可能有或可能没有所需重折叠 活性的其它糖基转移酶一起使用。例如，可将重折叠的重组真核糖基转移酶蛋白与 从宿主细胞分离后可能已重折叠或未重折叠的细菌糖基转移酶联用。类似地，重组 真核糖基转移酶可与可能是或可能不是融合蛋白一部分的重组辅酶一起使用。
用上述方法产生的产物无需纯化即可使用。在一些实施方式中，产生寡糖。可 用标准的熟知技术，例如薄层或厚层层析、离子交换层析或膜过滤来回收糖基化的 糖。也可采用(例如)膜过滤、如通常指定的AU专利号735695中所述的纳米滤膜或 反渗透膜。另外的例子是，可用分子量截留值约为1000-10,000的膜进行的膜过滤来 去除蛋白质。另一个例子是，然后可用纳米滤膜或反渗透去除盐。纳米滤膜是一类 能通过一价盐但截留多价盐和约200-1000道尔顿以上不带电溶质(这取决于所用膜) 的反渗透膜。因此，例如，可将本发明组合物和方法产生的寡糖保留在膜中，而让 污染的盐通过膜。
VIII.供体底物/受体底物
本发明的重组糖基转移酶融合蛋白和方法所用的合适供体底物包括但不限于： UDP-Glc、UDP-GlcNAc、UDP-Gal、UDP-GalNAc、GDP-Man、GDP-Fuc、 UDP-GlcUA和CMP-唾液酸。Guo等，Applied Biochem.and Biotech.68：1-20 (1997)。
本发明的重组糖基转移酶融合蛋白和方法所用的合适受体底物包括但不限于： 多糖、寡糖、蛋白质、脂质、神经节苷脂和可用本发明方法修饰的其它生物结构(如 全细胞)。可用本发明方法修饰的示范性结构包括本领域技术人员已知的细胞上的许 多糖脂、糖蛋白和糖结构，如表1所列。
表1
激素和生长因子 受体和嵌合受体 ·G-CSF ·GM-CSF ·TPO ·EPO ·EPO变体 ·α-TNF ·瘦激素 酶和抑制剂 ·t-PA ·t-PA变体 ·脲激酶 ·凝血因子VII、VIII、IX、X ·DNA酶 ·葡糖脑苷脂酶 ·水蛭素 ·α1抗胰蛋白酶 ·抗凝血酶III 细胞因子和嵌合细胞因子 ·白介素-1(IL-1)、1B、2、3、4 ·干扰素-α(IFN-α) ·IFN-α-2b ·IFN-β ·IFN-γ ·嵌合性白喉毒素-IL-2 ·CD4 ·肿瘤坏死因子(TNF)受体 ·α-CD20 ·MAb-CD20 ·MAb-α-CD3 ·MAb-TNF受体 ·MAb-CD4 ·PSGL-1 ·MAb-PSGL-1 ·补体 ·GlyCAM或其嵌合体 ·N-CAM或其嵌合体 ·LFA-3 ·CTLA-IV 单克隆抗体(免疫球蛋白) ·MAb-抗RSV ·MAb-抗IL-2受体 ·MAb-抗CEA ·MAb-抗血小板IIb/IIIa受体 ·MAb-抗EGF ·MAb-抗Her-2受体 细胞 ·红细胞 ·白细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬 细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞等) ·干细胞
Guo等，Applied Biochem. and Biotech.68：1-20(1997)描述了(但不限于)用于岩 藻糖基转移酶催化反应的合适受体底物的例子，和用于唾液酸转移酶催化反应的合 适受体底物的例子。
IX.糖基转移酶反应
将重组真核糖基转移酶蛋白、受体底物、供体底物和其它反应混合物成分在水 性反应介质中混合。培养基的pH值通常约5-8.5。培养基的选择是根据该培养基能 否将pH值维持在所需水平。因此，在一些实施方式中，将该培养基缓冲到pH值约 7.5。如果不用缓冲液，该培养基的pH应维持在约5-8.5，这取决于所用的具体糖基 转移酶。对于岩藻糖基转移酶而言，pH范围优选维持在约6.0-8.0。对于唾液酸转移 酶而言，该范围优选约5.5-7.5。
酶的用量或浓度用活性单位表示，活性单位是催化起始速率的一种衡量。一个 活性单位的酶每分钟在给定温度(如37℃)和pH值(如pH 7.5)下催化形成1μmol产物。 因此，10单位酶是在温度如37℃和pH值如7.5下在1分钟内将10μmol底物转化为 10μmol产物的酶催化量。
反应混合物可包括二价金属阳离子(Mg2+、Mn2+)。反应介质也可包含增溶去污 剂(如Triton或SDS)和有机溶剂如甲醇或乙醇(如果需要)。可在溶液中使用游离形式 的酶或可使酶结合于支持物如聚合物。因此，该反应混合物在开始时基本均一，但 在反应期间可形成一些沉淀。
进行上述过程的温度范围可以是恰好高于冻结温度至大部分敏感酶变性的温 度。该温度范围优选为约0℃-45℃，更优选为约20℃-37℃。
将这样形成的反应混合物保持足够时间以在连接于待糖基化糖蛋白寡糖基团上 获得所需寡糖决定簇的所需高产率。为了大规模制备，该反应常常进行约0.5-240小 时，更通常进行约1-18小时。
一个或多个糖基转移酶反应可以作为糖基转移酶循环的一部分进行。已报道了 糖基转移酶循环的优选条件和描述。美国专利号5,374,541和WO 9425615 A中描述 了许多糖基转移酶循环(如唾液酸转移酶循环、半乳糖基转移酶循环和岩藻糖基转移 酶循环)。其它糖基转移酶循环参见Ichikawa等，J.Am.Chem.Soc.114：9283(1992)， Wong等，J.Org.Chem.57：4343(1992)，DeLuca等，J.Am.Chem.Soc.117：5869-5870 (1995)和Ichikawa等《糖和糖聚合物》(Carbohydrates and Carbohydrate Polymers)， Yaltami编(ATL Press，1993)。
在相似的转移酶循环中可替换的其它糖基转移酶，如岩藻糖基转移酶和唾液酸 转移酶已有详述。具体说，糖基转移酶也可以是(例如)葡糖基转移酶如Alg8(Stagljov 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5977(1994))或Alg5(Heesen等，Eur.J.Biochem. 224：71(1994))，N-乙酰半乳糖胺基转移酶如α(1，3)N-乙酰半乳糖胺基转移酶、β(1，4)N- 乙酰半乳糖胺基转移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等， J.Biol Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(Homa等J.Biol Chem.268：12609(1993))。合适的N-乙酰葡糖胺基转移酶包括GnTI(2.4.1.101，Hull 等，BBRC 176：608(1991))、GnTII和GnTIII(Ihara等J.Biochem.113：692(1993))、 GnTV(Shoreiban等J.Biol.Chem.268：15381(1993))、O-连接的N-乙酰葡糖胺基转 移酶(Bierhuizen等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：9326(1992))、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸 转移酶(Rajput等Biochem J.285：985(1992)和乙酰透明质酸合酶。合适的甘露糖基转 移酶包括α(1，2)甘露糖基转移酶、α(1，3)甘露糖基转移酶、β(1，4)甘露糖基转移酶、 Dol-P-Man合酶、OCh1和Pmt1。
在上述糖基转移酶循环中，用于该过程的各种反应物的浓度或用量取决于许多 因素，包括反应条件如温度和pH值，以及待糖基化的受体糖的选择和用量。因为该 糖基化过程允许再生活化的核苷酸、活化的供体糖并清除在催化量的酶存在下所产 生的PPi，所以上述化学计量底物的浓度或用量限制了该方法。可用于本发明方法的 反应物浓度上限由该反应物的溶解性决定。
所选择的活化核苷酸、磷酸供体、供体糖和酶的优选浓度应使糖基化进行到受 体消耗光为止。以下讨论的唾液酸转移酶内容，通常可应用于其它糖基转移酶循环。
各酶以催化用量存在。具体酶的催化用量视该酶的底物浓度以及反应条件如温 度、时间和pH值而改变。本领域技术人员熟知在预先选择的底物浓度和反应条件下 确定某给定酶催化用量的方法。
X.多酶的寡糖合成
如上所述，在一些实施方式中，可采用两种或多种酶在糖蛋白或糖脂上形成所 需的寡糖决定簇。例如，特定的寡糖决定簇可能需要加入半乳糖、唾液酸和岩藻糖， 才能显示所需活性。因此，本发明提供了用两种或多种酶如葡糖基转移酶、唾液酸 转移酶或磺基转移酶来高产率合成所需的寡糖决定簇的方法。
在特别优选的实施方式中，所用的一种酶是能磺化糖或肽的磺基转移酶。更优 选的用磺基转移酶来制备选择素的配体(Kimura等，Proc Natl Acad Sci USA 96(8)： 4530-5(1999))。
在一些情况下，糖蛋白-或糖脂-连接的寡糖包括用感兴趣的特定糖基转移酶在体 内生物合成糖蛋白或糖脂时的受体底物。可用本发明的重组糖基转移酶融合蛋白和 方法来糖基化这类糖蛋白或糖脂，而无需事先分别修饰该糖蛋白或糖脂的糖基化模 式。然而，在其它情况下，感兴趣的糖蛋白或糖脂将缺少合适的受体底物。在这种 情况下，可用本发明方法来改变该糖蛋白或糖脂的糖基化模式，以使该糖蛋白-或糖 脂-连接的寡糖包括用于糖基转移酶-催化连接预先选择的感兴趣糖单元以形成所需 寡糖部分的受体底物。
首先，可任选地“修整”糖蛋白-或糖脂-连接的寡糖(全部或部分)，以暴露糖基转 移酶的受体底物或可加入一个或多个合适残基以获得合适的受体底物的部分。可利 用酶如糖基转移酶和内切糖苷酶来连接和修整这些反应。例如，可用甘露糖苷酶修 整显示“高甘露糖”型寡糖的糖蛋白，以获得在连接一个或多个预先选择的糖单元后能 形成所需寡糖决定簇的受体底物。
也可用该方法在天然形式的未糖基化蛋白质或脂质上合成所需寡糖部分。可将 相应糖基转移酶的合适受体底物连接于这种蛋白质或脂质，然后用本发明方法糖基 化。参见例如，美国专利号5,272,066中获得具有合适糖基化受体的多肽的方法。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了体外唾液酸化某糖偶联物上糖基团的 方法，首先包括修饰该糖偶联物以产生合适的受体。
XI.将修饰糖偶联于肽
采用合适的酶介导的偶联将修饰糖偶联于糖基化或非糖基化的肽或蛋白质。所 选择的修饰的供体糖、酶和受体肽或蛋白质的浓度，优选能使糖基化进行到受体被 消耗光为止。下述唾液酸转移酶内容，通常可应用于其它糖基转移酶反应。
用糖基转移酶合成所需寡糖结构的许多方法是已知的，它们通常可应用于本发 明。示范性方法的描述参见例如WO 96/32491，Ito等，Pure Appl.Chem.65：753(1993) 和美国专利号5,352,670、5,374,541和5,545,553。
在一些实施方式中，将内切糖苷酶与糖基转移酶一起用于此反应。在将修饰糖 加在肽上之前或之后的任何时间用内切糖苷酶改变该肽的糖结构。
在另一实施方式中，该方法利用一种或多种外切糖苷酶或内切糖苷酶。该糖苷 酶一般是突变体，经工程改造形成糖基键，而非使这些键断开。突变的聚糖酶一般 包括用一种氨基酸残基取代活性位点的酸性氨基酸残基。例如，当内切聚糖酶是内 切-H时，被取代的活性位点残基一般是130位的Asp、132位的Glu或其组合。通 常用丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷胺酰胺进行氨基酸取代。
突变酶能催化该反应，通常是类似于内切聚糖酶水解步骤逆反应的合成步骤。 在这些实施方式中，糖基供体分子(如所需寡糖或单糖结构)含有离去基团，随着该反 应的进行，将供体分子加到该蛋白质的GlcNAc残基上。例如，离去基团可以是卤素 如氟。在其它实施方式中，离去基团是Asn，或Ash-肽部分。在又一实施方式中， 修饰了糖基供体分子上的GlcNAc残基。例如，GlcNAc残基可含有1，2噁唑啉部分。
在优选实施方式中，用于产生本发明偶联物的各酶以催化用量存在。具体酶的 催化用量视该酶的底物浓度以及反应条件如温度、时间和pH值而改变。本领域技术 人员熟知在预先选择的底物浓度和反应条件下测定某给定酶催化用量的方法。
进行上述过程的温度范围可以是恰好高于冻结温度至大部分敏感酶变性的温 度。该温度范围优选为约0℃-55℃，更优选为约20℃-30℃。在另一示范性实施方式 中，采用嗜热性酶在升高温度下进行本方法的一个或多个组分(合成)。
将反应混合物保持足够时间以使受体糖基化、从而形成所需的偶联物。通常， 可在数小时后检测到一些偶联物，而通常在24小时或更短时间内获得可回收量。本 领域技术人员理解，该反应的速率取决于为优化选择系统的许多不同因素(如酶浓度、 供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)。
本发明也提供了工业规模生产的修饰肽。本文所用的工业规模通常产生至少一 克最终纯化偶联物。
在以下讨论中，通过将修饰的唾液酸部分偶联于糖基化肽来说明本发明。用PEG 标记该示范性修饰的唾液酸。以下讨论集中在PEG-修饰的唾液酸和糖基化肽的应用， 这些讨论是为了说明，不意味着将本发明仅限于这对物质的偶联物。本领域技术人 员理解，上述内容通常可用于加入修饰的糖基部分而非唾液酸。而且，上述内容可 同等地应用于用除PEG外的物质包括其它水溶性聚合物、治疗部分和生物分子来修 饰糖基单元。
可用酶学方法将PEG化或PPG化的糖选择性引入肽或糖肽上。该方法采用含有 PEG、PPG或掩蔽了活性功能基团的修饰糖，与合适糖基转移酶或糖合成酶混合。 通过选择产生所需糖连接的糖基转移酶和将修饰糖用作供体底物，而将PEG或PPG 直接引入到肽主链上，引入糖肽中的糖残基上或引入肽中已加有的糖残基上。
唾液酸转移酶的受体存在于将用本发明方法修饰的肽上，该受体是天然产生的 结构或通过重组方法、酶学方法或化学方法安置于此的结构。合适的受体包括例如： 半乳糖基受体如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳糖-N-丁糖、 Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本领域技术人员 熟知的其它受体(参见例如，Paulson等，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。
在一个实施方式中，唾液酸转移酶受体存在于体内合成糖肽时修饰的糖肽上。 可用要求权利的方法唾液酸化这种糖肽，而无需事先改变该糖肽的糖基化模式。或 者，可用本发明方法唾液酸化不包含合适受体的肽；首先用本领域技术人员知道的 方法修饰该肽以使其包含受体。在示范性实施方式中，通过GalNAc转移酶的作用加 入GalNAc残基。
在示范性实施方式中，通过使半乳糖残基与连接该肽的合适受体如GlcNAc相 连接来组装半乳糖基受体。该方法包括孵育该肽，用含有合适量的半乳糖基转移酶(如 galβ1，3或galβ1，4)和合适的半乳糖基供体(如UDP-半乳糖)的反应混合物修饰该肽。 使该反应基本进行完全，或者加入预先选择量的半乳糖残基终止该反应。本领域技 术人员知道组装选择的糖受体的其它方法。
在又一实施方式中，首先“修整”糖肽-连接的寡糖(全部或部分)，以暴露唾液 酸转移酶受体或可加入一个或多个合适残基以获得合适的受体。利用酶如糖基转移 酶和内切糖苷酶(参见例如美国专利号5,716,812)来连接和修整反应。
使修饰糖偶联于肽或蛋白质的方法参见例如：2001年10月10日提交的USSN 60/328,523；2002年6月7日提交的USSN 60/387,292；2002年6月25日提交的 USSN 60/391,777；2002年8月16日提交的USSN 60/404,249；和PCT/US02/32263； 各自纳入本文作为参考用于所有目的。
实施例
实施例1：重折叠在细菌中表达的大鼠肝ST3GalIII。
大鼠肝GST-ST3GalIII融合蛋白的重折叠
将大鼠肝N-乙酰氨基乳糖苷α-2，3-唾液酸转移酶(ST3GalIII)克隆入 pGEX-KT-Ext载体中在大肠杆菌BL21细胞中表达为GST-ST3-GalIII包含体。用 GSH/GSSG氧化还原系统重折叠包含体。重折叠的酶GST-ST3-GalIII有活性，能将 唾液酸转移到LNnT糖底物和脱唾液酸化糖蛋白如转铁蛋白和凝血因子IX。
将ST3GalIII克隆入pGEX-XT-KT载体
用以下引物进行PCR扩增后将大鼠肝ST3-GalIII基因克隆入pGEX-KT-Ext载 体的BamH1和EcoR1位点中：
正义：唾液酸5’Tm    5’-TTTGGATCCAAGCTACACTTACTCCAATGG
反义：唾液酸3’全部  5’-TTTGAATTCTCAGATACCACTGCTTAAGTC
在大肠杆菌BL21细胞中表达GST-ST3GalIII
将含有ST3GalIII GST融合基因的表达载体pGEX-ST3GalIII转化入化学感受态 大肠杆菌BL21细胞中。挑单菌落，接种到5毫升含100μg/ml羧苄青霉素的LB培 养基中，37℃振荡培养过夜。第二天，将1ml过夜培养物转移到1升含100μg/ml 羧苄青霉素的LB培养基中。培养细菌直到OD620为0.7，然后将150μM IPTG(终浓 度)加入培养基中。37℃培养细菌1至2小时以上，然后转移到室温中振荡培养过夜。 离心收获细胞；将细菌沉淀重悬于PBS缓冲液中用French Press裂解。在Sorvall， SS 34转头中10,000 RPM 4℃离心30分钟分离可溶性和不溶性组分。
包含体的纯化
将50ml Novagen洗涤缓冲液(20mM Tris.HCl，pH 7.5，10mM EDTA，1％ Triton X-100)加入不溶性组分，即包含体(IB′s)中。涡旋振荡不溶性组分以使沉淀重 悬。离心悬浮的IB，如上用洗涤缓冲液重悬洗涤至少两次。回收洁净的沉淀物(IB) 贮存在-20℃待用。
重折叠包含体
称取IB(144mg)，溶解于Genotech IBS缓冲液(1.44ml)中。在Eppendorf离心管 中4℃孵育重悬的IB 1小时。在Eppendorf离心机中以最大转速离心去除不溶性物质。 将溶解的IB稀释至4ml终体积。在含有环式糊精、聚乙二醇(PEG)、ND SB-201或 GSH/GSSG氧化还原系统的重折叠缓冲液中测定GST-ST3GalIII的重折叠。通过吸 入重折叠溶液快速稀释1ml溶解的IB，剧烈混合30-40秒，然后在4℃温和地搅拌2 小时。用Pierce Slide-A-lyzers(MWCO：3.5kDa)以冰冷的PBS缓冲液或含有50mM Tris.HCl，pH 7.0；100mM NaCl；和1％甘油的缓冲液透析3ml等份重折叠 GST-ST3GalIII溶液。透析后，用Vivaspin 5K(VivaScience)浓缩器在Jouan离心机中 4℃4,000rpm浓缩GST-ST3GalIII溶液3、6和12倍。
重折叠和透析后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重折叠的GST-ST3GalIII蛋 白。所有重折叠条件下都存在分子量约为63-64kDa的GST-ST3GalIII融合物。(数据 未显示)
用重折叠的GST-ST3 GalIII唾液酸化寡糖
用CE-LIF(毛细管电泳-激光诱导的荧光)进行以寡糖底物的酶学试验。测定了重 折叠的ST3 GalIII酶能否将唾液酸从CMP-NAN(胞苷5-一磷酸-β-D-唾液酸)转移到 LNnT-APTS(乳糖-N-新丁糖-9-氨基芘1-4，6三磺酸)上形成LSTd-APTS(乳糖唾液酸- 四糖-d-APTS)。在96孔微量滴定板中每孔100μl含有20mM MOPS，pH 6.5；0.8mM CMP-NAN；22.1mM LNnT；25μM LNnT-APTS；2.5mM MnCl2的缓冲液中进行反 应。通过加入20μl重折叠ST3 GalIII在30℃孵育30分钟开始反应。用水作1-25倍 稀释终止反应。根据厂商说明书以CE-LIF用N-CHO包被的毛细管分析稀释的反应 物。活性计算为1LNnT-APTS与LSTd-APTS的标准化峰面积之比。比较不同重折叠 条件的结果见表2。用GSH/GSSG系统进行的两次额外试验见表3。
表2.筛选不同折叠系统后GST-ST3-GalIII的活性。无需浓缩，直接测定蛋白。
环式糊精    PEG    ND SB-201    GSH/GSSG
                                       
0           0      0            7.8 U/L*
*这里报告的活性是每L重折叠酶的单位数。
表3.用GSH/GSSG系统进行两次单独的折叠试验后GST-ST3GalIII的活性。
GSH/GSSG       浓缩倍数    活性
重折叠试验1    12x         182U/L*
重折叠试验2    40x         531U/L*
*这里报告的活性是每L重折叠酶的单位数。
用重折叠的GST-ST3 GalIII唾液酸化糖蛋白
将20μL脱唾液酸转铁蛋白(2μg/μL)或脱唾液酸凝血因子IX(2μg/μL)加入到50 μL含有50mM Tris，pH 8.0；和150mM NaCl，以及10μL 100mM的MnCl2；10μL 200mM的CMP-NAN；和0.05％叠氮化钠的缓冲液中。将该反应混合物与30μL重 折叠的GST-ST3GalIII一起30℃250rpm振荡孵育过夜或更长时间。停止反应后， 在pH 7-3 IEF(等电聚焦凝胶，Invitrogen)上分离唾液酸化蛋白质，根据厂商说明书用 考马斯蓝染色。转铁蛋白和凝血因子IX都被GST-ST3GalIII唾液酸化。(数据未显示)
融合于MBP标记的大鼠肝ST3GalIII的重折叠。
将大鼠肝ST3GalIII克隆入pMAL-c2x载体中在大肠杆菌TB1细胞的包含体中 表达为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白MBP-ST3GalIII。重折叠的MBP-ST3GalIII有 活性，能将唾液酸转移到糖底物LNnT和脱唾液酸糖蛋白如脱唾液酸转铁蛋白上。
将ST3GalIII克隆入pMAL-c2x载体中
用以下引物进行PCR扩增后将大鼠肝ST3-GalIII核酸克隆入pMAL-c2x载体中 的BamH1和XbaI位点：
正义：  ST3BAMH1 5’-TAATGGATTCAAGCTACACTTACTCCAATGG
反义：  ST3XBA1  5’-GCGCTCTAGATCAGATACCACTGCTTAAGT
将编码氨基酸28-374如ST3GalIII的主干区和催化结构域的核苷酸与MBP氨基 酸标记融合。
构建ST3GalIII的其它三种截短物并与MBP融合。这三种ST3GalIII(Δ73、Δ85、 Δ86)插入物分别用以下引物通过PCR分离：5’引物(ST3 BamH1Δ73) TGTATCGGATCCCTGGCCACCAAGTACGCTAACTT；(ST3 BamH1Δ85) TGTATCGGATCCTGCAAACCCGGCTACGCTTCAGCCAT；和(ST3 BamH1Δ86) TGTATCGGATCCAAACCCGGCTACGCTTCAGCCAT)，与通用 3’引物 (ST3-Xho1-GGTCTCCTCGAGTCAGATACCACTGCTTAA)配对。用BamHI和Xho1 消化各PCR产物，亚克隆入BamHI-XhoI消化的pCWin2-MBP Kanr载体中，转化入 TB1细胞中，筛选正确的构建物。
在以下条件下进行PCR反应。95℃1分钟一个循环。加入1μl缺口(vent)聚合 酶。进行10轮下面的循环：94℃1分钟；65℃1分钟；72℃1分钟。最后72℃10 分钟，将反应物冷却到4℃。
所有ST3GalIII截短物重折叠后都有活性。用MBP Δ73ST3GalIII截短物进行下 述试验。
在大肠杆菌TB1细胞中表达MBP-ST3GalIII
将pMAL-ST3GalIII质粒转化入化学感受态大肠杆菌TB1细胞中。从LB琼脂平 板上挑出含有TB1/pMAL-ST3GalIII构建物的三个单菌落。在5ml补充有60μg/ml 羧苄青霉素的LB培养基中37℃振荡培养这些菌落，直到液体培养物的OD620达到 0.7。从各培养物中取出两个1ml等份，用于接种含有或不含500μM IPTG(终浓度) 的新鲜培养基。37℃培养该培养物2小时。离心收获细菌细胞。在SDS和DTT存在 下加热细胞沉淀制备全细胞裂解物。IPTG诱导MBP-ST3GalIII表达。(数据未显示)
MBP-ST3GalIII的表达和包含体的纯化：
将1ml等份的TB1/pMAL-ST3GalIII过夜培养物接种入0.5升含有50μg/ml羧 苄青霉素的LB培养基中，培养到OD620为0.7。加入0.5mM IPTG诱导MBP-ST3GalIII 表达，然后室温孵育过夜。第二天，离心收获细菌细胞。将细胞沉淀重悬于含有75mM TrisHCl，pH 7.4；100mM NaCl；和1％甘油的缓冲液中。用French Press裂解细菌 细胞。离心(4℃，10,000rpm，Sorvall，SS34转头)30分钟分离可溶性和不溶性组分。 在Sorvall，SS 34转头中4℃10,000RPM离心30分钟分离可溶性和不溶性组分。
纯化包含体和利用GSH/GSSG重折叠MBP-ST3GalIII
用上述GST-ST3GalIII融合蛋白所用的相同方法和缓冲液纯化和悬浮 MBP-ST3GalIII包含体。用上述GSH/GSSG系统重折叠MBP-ST3GalIII。用Pierce 蛇皮透析袋(MWCO：7kDa)以冰冷的65mM Tris.HCl pH 7.5，100mM NaCl，1％甘 油透析重折叠的MBP-ST3GalIII酶。用Vivaspin 5K(VivaScience)浓缩器在Jouan离 心机中4℃4,000rpm将重折叠和透析的MBP-ST3GalIII浓缩3-14倍。用SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳分析重折叠的MBP-ST3GalIII蛋白。检测到81kDa的 MBP-ST3GalIII。(数据未显示)
MBP-ST3 GalIII的酶活试验
如上所述，测定重折叠MBP-ST3 GalIII酶能否将唾液酸从CMP-NAN转移到 LNnT-APTS而形成LSTd-APTS。重折叠的MBP-ST3 GalIII酶有活性，能将唾液酸 转移到LNnT-APTS上形成LSTd-APTS。(数据未显示)
测定了重折叠的MBP-ST3 GalIII酶将唾液酸从CMP-NAN转移到糖蛋白上的能 力。如上所述测定了GST-ST3-GalIII酶将唾液酸转移到脱唾液酸转铁蛋白上。重折 叠的MBP-ST3 GalIII酶有活性，能将唾液酸转移到脱唾液酸转铁蛋白上。(数据未显 示)虽然重折叠的GST-ST3 GalIII和MBP-ST3 GalIII酶具有相似的活性，能将唾液 酸转移到可溶性寡糖受体分子，但是重折叠的MBP-ST3 GalIII酶将唾液酸转移到糖 蛋白受体分子的活性更高。
重折叠MBP-ST3GalIII条件的附加试验
用图1所示的条件重折叠MBP-ST3GalIII。在加入溶解的IB以启动重折叠反应 之前混合缓冲液、氧化还原对和去污剂(如果使用)。以1/20稀释IB。用不同的氧化 还原对，如摩尔比为1/4、4/1、1/10或5/5的胱胺2 HCl/半胱氨酸也成功地进行了 MBP-ST3GalIII的重折叠。(数据未显示)
ST3 GalIII酶活试验
如上所述，测定重折叠的MBP-ST3 GalIII酶能否将唾液酸从CMP-NAN转移到 LNnT-APTS而形成LSTd-APTS。结果见图1。用条件8、11、13和16观察到重折 叠的MBP-ST3 GalIII活性最高。当重折叠规模扩大到5ml时，用条件8和16重折 叠的MBP-ST3 GalIII蛋白活性最高。(参见例如表4)
表4
条件    U/L折叠蛋白    U/g IB
        70             37.0
16      50             40.5
在直链淀粉柱上纯化MBP-ST3GalIII
混合5ml重折叠制剂中的重折叠MBP-ST3GalIII蛋白，以100mM TrisHCl pH 7.4，100mM NaCl和1％甘油透析。将重折叠的MBP-ST3GalIII蛋白施加到直链淀 粉柱上。大多数重折叠的MBP-ST3GalIII蛋白结合于直链淀粉柱，用10mM麦芽糖 洗脱。洗脱图见图2。用LnNT试验测定MBP-ST3GalIII组分的酶活，见图3。
用重折叠的MBP-ST3GalIII糖基PEG化脱唾液酸转铁蛋白：
在230μl反应物中将脱唾液酸转铁蛋白(2mg/ml)与重折叠的100μl MBP-ST3GalIII的纯化组分一起在CMP-SA-PEG(10kDa，1.6mM)或 CMP-SA-PEG(20kDa，1.06mM)存在下孵育。30℃进行糖基PEG化反应过夜或3 天。从反应物中取出等份，在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析。结果见图4。纯化 的重折叠MBP-ST3GalIII将10或20 K PEG化唾液酸转移到脱唾液酸转铁蛋白上。
大规模MBP-ST3GalIII重折叠
用以下方法制备大规模重折叠的MBP-ST3GalIII。
在15ml培养管中将湿IB(470mg)溶于IB增溶缓冲液(13ml)中。IB增溶缓冲液 包括以下组分：4M盐酸胍；100mM TrisHCl，pH 9；和100mM NaCl。在IB增溶 缓冲液中4℃温和振荡孵育IB约1小时。在1.5mL Eppendorf管中以最大转速4℃离 心30分钟除去任何不溶性物质。将溶解的IB转移到干净的试管中，用280nm吸光 度测定蛋白浓度。
制备以下重折叠溶液，保存在4℃：55mM MES缓冲液，pH 6.5；264mM NaCl；11mM KCl；0.055％PEG550；550mM精氨酸。在加入溶解的IB之前立即 将0.3mM十二烷基麦芽糖苷(LM)；0.1mM氧化性谷胱甘肽(GSSG)；1mM还原性 谷胱甘肽(GSH)加入缓冲液。在50ml无菌培养管中将2ml溶解的IB加入到43ml 重折叠缓冲液中。将该培养管放置在摇杆振荡器(rocker-shaker)上，4℃温和振荡24 小时。在透析管(MWCO：7kD)中以透析缓冲液(100mM Tris HCl，pH 7.5；100mM NaCl；和5％甘油)透析重折叠蛋白两次(以10-20倍体积过量缓冲液)。
分析大规模透析的重折叠MBP-GalIII的ST3GalIII活性，显示约为53.6U/g IB。
实施例2：定占透变人GnTI以促进重折叠。
截短的人N-乙酰葡糖胺基转移酶I(缺失了103个氨基末端氨基酸)在大肠杆菌中 表达为麦芽糖接合融合蛋白(GnTI/MBP)。该融合蛋白不溶，而在包含体中表达。溶 解和重折叠后，GnTI/MBP融合蛋白具有低活性。兔GnTI截短形式(缺失了105个氨 基末端氨基酸)的晶体结构显示在活性位点附近有一个未配对的半胱氨酸残基 (CYS123)。(参见例如，Unligil等，EMBO J.19：5269-5280(2000))。人GnTI中相应 的未配对半胱氨酸鉴定为CYS121，用大小和化学特征相似的一系列氨基酸取代。所 用氨基酸包括丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)。此外，也制 备了双突变体ARG120ALA，CYS121HIS。在大肠杆菌中表达突变的GnTI/MBP融 合蛋白，重折叠，测定对糖蛋白的GnTI活性。
用Stratagene的Quick Change定点诱变试剂盒进行诱变。用一些GnT1突变引 入其它限制性位点。例如将ApaI位点(下划线，GGCC)引入GnT1 ARG120ALA，CYS121HIS突变体，即CGC CTG→CC(粗体表示改变)。用以 下诱变的寡核苷酸产生双突变体：GnT1 R120A，C121H+， 5’CCGCAGCACTGTTCGGCCCTGGACAAGCTGCTG 3’；和GnT1 R120A， C121H-5’CAGCAGCTTGTCCAGGCCGAACAGTGCTGCGG 3’(粗体表示改 变)。将AscI位点(下划线，GGCGC )引入GnT1 CYS121ALA突变体，即CTG →(粗体表示改变)。用以下诱变的寡核苷酸产生GnT1 CYS121ALA突变体： GnT1C123A+5’AGCACTGTTCGGCGCCTGGACAAGCTGCTG 3；和 GnT1C123A-5’CAGCAGCTTGTCCAGCGCCGAACAGTGCT3’。
将大肠杆菌表达的突变蛋白的活性与杆状病毒表达的野生型GnT1的活性作比 较。CYS121SER GNTI突变体在TLC试验中有活性。相反，检测不到CYS121THR 突变体的活性，CYS121ASP突变体具有低活性。CYS121ALA突变体活性很高，基 于秀丽新小杆线虫(C.elegans)GnT1蛋白(Gly14)的氨基酸序列的双突变体 ARG120ALA，CYS121HIS也有活性，包括能将GlcNAc转移到糖蛋白。GnT1突变 体的氨基酸序列和编码核酸序列见图7-11。
制备第二种GnT1截短物并与MBP融合：MBP-GnT1(D35)。图35提供了 MBP-GnT1融合蛋白的示意图，描述了截短物如Δ103或Δ35和Cys121Ser突变(上 方)。此图下方提供了全长人GnT1蛋白。还在MBP-GnT1(D35)蛋白中制作了Cys121 突变。
两种融合蛋白都在大肠杆菌中表达，都具有重建RNA酶B糖蛋白的活性。图 36提供了SDS-PAGE凝胶，右图显示重折叠的MBP-GnT1融合蛋白：MBP-GnT1(D35) C121A、MBP-GnT1(D103)R120A+C121H和MBP-GnT1(D103)C121A。左图显示两 个不同批次(A1和A2)的重折叠MBP-GnT1(D35)C121A在不同时间点重建RNA酶B 糖蛋白的活性。MBP-GnT1(D103)C121A也能重建RNA酶B糖蛋白。数据未显示。
实施例3：GalT1与MPB的融合物。
构建了以下截短的牛GalT1与MBP的融合物：MBP-GalT1(D129)wt，(D70)wt 或(D129 C342T)。(全长牛序列参见例如，D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183： 211-217(1989)和登录号CAA32695)。各构建物重折叠后有活性。全长牛GalT1蛋白 的氨基酸序列见图30。图31为描述这些突变体的示意图，对照蛋白是 GalT1(40)(S96A+C342T)。参见例如，Ramakrishnan等，J.Biol.Chem.276：37666-37671 (2001)。
在大肠杆菌菌株JM109中表达MBP-GalT1(D70)。用IPTG诱导过夜后，用 French Press裂解细胞后分离不溶性沉淀物中的包含体。洗涤IB两次，然后溶于4M GndHCl，100mM NaCl，0.1M TrisHCl pH 9.0中。在pH 6.5用GSSH/GSH(10/1)稀 释成重折叠缓冲液(1/20，0.1-0.2mg/ml蛋白质)进行重折叠，然后4℃孵育过夜，不 振荡。重折叠的蛋白质以50mM TrisHCl pH 8.0透析两次(MWCO：7kD)。将透析的 MBP-GalT1(D70)蛋白加到直链淀粉柱上；洗涤；然后用10mM麦芽糖洗脱。
用寡糖作为受体测定GalT1的活性。用HPLC/PAD(带脉冲安培计检测的高效液 相色谱)进行该酶试验。GalTI酶用UDP-Gal(尿苷5’-二磷酸半乳糖)将LNT2(乳糖-N- 丙糖-2)转变为LNnT(乳糖-N-新丁糖)的过程如下：该反应在含有6mM UDP-Gal、5 mM LNT-2、5mM MnCl2和100μl重折叠酶的100μl50mM Hepes，pH 7缓冲液中 37℃进行60分钟。用水终止该反应(1∶10稀释)，离心通过10,000 MWCO离心滤器。 然后1∶10稀释滤出液。采用Dionex DX-500系统和含有氢氧化钠缓冲液的CarboPac PA1柱作HPLC分析此稀释反应物。将样品产物峰面积与LNnT校正曲线作比较， 根据该反应中每微升酶每分钟产生的LNnT量计算活性。
用可溶性寡糖和糖蛋白(如RNA酶B)作为受体分子时，纯化的MBP-GalT1(D70) 蛋白有活性。结果见图32和33。在RNA酶B重建试验中，将MBP-GalT1(D70)与 对照蛋白GalT1(40)(S96A+C342T)相比较，对照蛋白是也在大肠杆菌中表达并重折叠 的未融合的牛GalT1蛋白截短物。MBP-GalT1(D70)蛋白对RNA酶B糖蛋白的活性 比GalT1(40)(S96A+C342T)高。MBP-GalT1(D129)截短物对RNA酶B糖蛋白的活性 也比GalT1(40)(S96A+C342T)蛋白高。(数据未显示)
测定重折叠和纯化的MBP-GalT1(D70)蛋白糖基化RNA酶B的动力学，并与 NSO GalT1比较，NSO GalT1是在哺乳动物细胞体系中表达的牛GalT1蛋白的可溶 形式。如图34所示，与NSO GalT1蛋白相比，重折叠和纯化的MBP-GalT1(D70)动 力学有所改进。
实施例4：重折叠多种糖基转移酶的单罐方法。
真核ST3GalIII、GalT1和GnT1酶在糖蛋白上建立了N-聚糖链。可用 CMP-NAN-PEG作为供体底物进行其它修饰，例如糖基PEG化。一般在真核表达系 统如真菌或哺乳动物细胞中表达真核ST3GalIII、GalT1和GnT1酶。
在一个容器中将各自与麦芽糖结合蛋白(MBP)结构域融合的真核ST3GalIII、 GalT1和GnT1酶一起溶解、混合和重折叠。与MBP融合的重折叠酶有活性，可用 于将N-聚糖加到糖蛋白或糖基PEG化糖蛋白。重折叠缓冲液包含氧化还原对，如氧 化/还原性谷胱甘肽(GSH/GSSG)。通过加入精氨酸和聚乙二醇3350(PEG)促进重折 叠。IB可单独溶解以不同比例加入重折叠缓冲液中；或者IB可一起溶解直接加入重 折叠缓冲液中。也可利用MBP融合标记一步纯化或固定这些酶。
制备重折叠的糖基转移酶混合物(SuperGlycoMix)
制备糖基转移酶IB
用于产生真核ST3GalIII、GalT1和GnT1酶的细菌菌株见表5。该表也显示了 MBP融合蛋白的估计分子量。(MW根据氨基酸组成，Vector NTI软件)。编码真核 酶的所有核酸都用IPTG可诱导的表达载体表达。
表5
菌株/构建物 表达的蛋白质(IBS) MW(kD) M109/pCWori-MBP-GaT1(Δ129)C342T JM109/pCWIN2-MBP-GnT1(Δ103)C121A TR1/pMAL-ST3GalIII MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-GnT1(Δ103)C121A MBP-ST3 GalIII 74.2 82.4 82
用IPTG诱导大肠杆菌培养物后，用French Press或去污剂裂解细胞分离含有 GnT1、GalT1和ST3GalIII酶的IB(Novagen的Bugbuster试剂)。如上所述，离心后 回收沉淀，继续获得IB。用Novagen的IB洗涤缓冲液洗涤IB至少两次。将洗涤的 IB储存在-20℃，直到用于重折叠试验。
将含有ST3GalIII、GalT1或GnT1的IB单独溶于含有6M盐酸胍、50mM TrisHCl pH 8.0，5mM EDTA，10mM DTT的缓冲液中，4℃ 1小时。离心(Eppendorf微量 离心机的最大转速)后获得清澈的上清。通过测定280nm吸光度测定溶解的IB中蛋 白质含量。根据各MBP-糖基转移酶的消光系数确定表6蛋白质的含量。用Vector NTi 软件计算消光系数(参见表5)
表6.溶解的IB中蛋白质浓度。
蛋白质     1mg/ml的A280     mg/ml MBP-ST3 GalIII     1.49     4.23
MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-GnT1(Δ103)C121A     1.39     1.7     6.80     3.29
糖基转移酶的单罐重折叠
等量混合溶解的IB，如表7所示。
表7.在重折叠前按以下量混合溶解的IB。
蛋白质   V(mL)     mg     占总蛋白的％ MBP-ST3GalIII MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-GnT1(Δ103)C121A   0.8   0.5   0.8     3.4     3.4     2.6     36     36     28 总计   2.1   9.4     100
溶解的IB混合物的总蛋白浓度是4.5mg/ml。用重折叠缓冲液稀释该混合物约 20倍，使总蛋白混合物的终浓度为0.22mg/mL。重折叠缓冲液含有55mM MES， pH 6.5；550mM精氨酸；0.055％PEG3350；264mM NaCl；11mM KCl；1mM GSH； 和0.1mM GSSG。也可在含有Tris HCl，pH 8.2的缓冲液中进行重折叠，可用半胱 氨酸/胱胺氧化还原对替换GSH/GSSG。用重折叠缓冲液稀释IB混合物，4℃孵育过 夜(16-18小时)。估计重折叠反应物中糖基转移酶的浓度为：
MBP-ST3GalIII          0.081mg/mL
MBP-GalT1(Δ129)C342T  0.081mg/mL
MBP-GnT1(Δ103)C121A   0.062mg/mL
重折叠过夜后，透析重折叠的糖基转移酶混合物除去离液剂(即盐酸胍)。在透析 袋(蛇皮，MWCO：7kD，Pierce)中以50mM TrisHCl pH 8.0，4℃(每次透析20倍) 透析两次。用VivaSpin 6mL(MWCO：10kD)离心浓缩器将透析后的重折叠糖基转移 酶混合物(Superglycomix，SGM)浓缩6倍。浓缩后，如SDS-PAGE分析测定，所有 三种糖蛋白都存在于混合物中。(数据未显示)。浓缩SGM后，测定GnT1、GalT1和 ST3GalIII的酶活。
SuperGlycoMix的酶活
Superglycomix(SGM)，单罐重折叠糖基转移酶混合物含有三种糖基转移酶： ST3GalIII、GalT1和GnT1。分别测定这些酶的酶活，用以下方法分析。酶活见表8。
ST3 GalIII酶活试验
用HPLC/UV(带紫外线检测的高效液相色谱)进行ST3GalIII试验。ST3GalIII酶 用CMP-NAN(胞苷5’-一磷酸-β-D-唾液酸)将LNnT(乳糖-N-新丁糖)转变为LSTd(乳 糖唾液酸-四糖-d)的过程如下。在96孔微量滴定板中含有2mM CMP-NAN、30mM LNnT、10mM MnCl2和20μl重折叠酶的100μl 20mM MOPS，pH 6.5缓冲液中30℃ 反应120分钟。加热到98℃ 1分钟终止反应。3600rpm离心微量滴定板10分钟形 成沉淀。用75μl水1∶1稀释75μl上清液。用含有磷酸钠缓冲液/乙腈梯度液的 YMC-Pack聚胺II柱以LC/UV分析稀释的反应物，在200nm处检测。将样品产物 峰面积与LSTd校正曲线作比较，根据反应中每分钟每微升酶产生的LSTd量计算活 性。
GalTI酶活试验：
用HPLC/PAD(带脉冲安培计检测的高效液相色谱)进行酶试验。GalTI酶用 UDP-Gal(尿苷5’-二磷酸半乳糖)将LNT2(乳糖-N-丙糖-2)转变为LNnT(乳糖-N-新丁 糖)的过程如下。该反应在含有6mM UDP-Gal、5mM LNT-2、5mM MnCl2和100 μl重折叠酶的100μl 50mM Hepes，pH 7缓冲液中37℃进行60分钟。用水终止该 反应(1-10倍稀释)，离心通过10,000 MWCO离心滤器。然后1∶10稀释滤出液。采用 Dionex DX-500系统和含有氢氧化钠缓冲液的CarboPac PA1柱作HPLC分析此稀释 反应物。将样品产物峰面积与LNnT校正曲线比较，根据反应中每微升酶每分钟产 生的LNnT量计算活性。
GnTI酶活试验：
通过测定将氚化糖从UDP-3H-GlcNAc(尿苷二磷酸N-乙酰-D-葡糖胺[6-3H(N)]) 转移到正辛基3，6-二-O-(α-吡喃甘露糖基)β-D-吡喃甘露糖苷(OM3)(具有辛基尾的三 甘露糖基核心)测定GnTI的活性。在含有3mM UDP-GlcNAc，0.1mM UDP-3H-GlcNAc，0.5mM OM3，20mM MnCl2和10μl重折叠酶的20μl 100mM MES，pH 6.0缓冲液中37℃反应60分钟。用水终止该反应(1∶6稀释)，将反应物施 加到事先按厂商推荐条件化的96孔中的聚合性反相树脂上。用200μl水洗涤树脂两 次，用50μl 100％MeOH将产物洗脱到捕获板(capture plate)中。各孔中加入闪烁液 (200μL)，混合该板，用PerkinElmer TopCount NXT微量板闪烁计数器计数。根据 反应中每微升酶每分钟掺入产物的3H-GlcNAc量计算活性。
表8.SGM中重折叠糖基转移酶的酶活
酶活    mU/mL
            
GnT1    1
GalT1       165
ST3GalIII   10
上表报道的活性接近这些酶分别重折叠时的活性或在其活性范围内。GnT1和 GalT1活性接近用哺乳动物或杆状病毒表达系统获得的活性。ST3GalIII活性稍低于 真菌表达系统获得的ST3GalIII制剂活性。对本文所用的ST3GalIII试验步骤进行修 饰，本文报道的值比CE-LIF(毛细管电泳-激光诱导的荧光)方法获得的值低约4-5倍。
用Superglycomix重建RNA酶B-Man5
用SGM在UDP-糖(UDP-GlcNAc和UDP-Gal)存在下重建含有一个N连接Man5 糖的RNA酶B的小糖蛋白。用UDP-GlcNAc或者UDP-GlcNAc和UDP-Gal进行此 重建反应，以测定GnT1和GalT1的活性。将8μl SGM加入到含有5mM UDP-GlcNAc和/或5mM UDP-Gal，9μg RNA酶BMan5，5mM MnCl2的10mM MES缓冲液pH 6.5中形成25μl试验溶液，33℃孵育过夜至48小时。在反应结束时， 以H2O透析10μl等份，将1.5μl样品点样到MALDI-TOF平板上。用TFA和肉桂 酸(cinnapinic acid)处理后在MALDI-TOF上分析样品。
通过将GlcNAc和Gal转移到RNA酶B的Man5上重建了RNA酶Bman5。33℃ 孵育48小时后，大部分GlcNAc和Gal转移到RNA酶B上，如重建的RNA酶BMan5 的MALDI-TOF谱所示。表9小结了结果。
表9.SGM反应后物质的MALDI-TOF谱。
反应  m/z  RNA酶B  Man5  Man5-GlcNAc  Man5GlcNAc-Gal 无酶 SGM+UDP-GlcNAc SGM+UDP-GlcNAc+UDP-Gal  14983  14973  14982  -  15177  15170  -  -  15348
用SGM糖基PEG化EPO重建
在以下成分组成的单罐反应中进行糖基PEG化(20K)：10mM MES pH 6.5，5 mM MgCL2，5mM UDP-GlcNAc，5mM UDP-GalNAc，0.5mM CMP-SA-PEG(20 kDa)，24μg EPO，8μL浓缩的SGM。在对照反应中，用在哺乳动物细胞或昆虫细 胞或曲霉中重折叠或表达的一种酶替换SGM。孵育过夜后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶 上分析反应物。结果见图5。SGM将20K PEG加在EPO上。
评价多种糖基转移酶的单罐重折叠条件
评价重折叠多种糖基转移酶的条件，包括pH，和一次重折叠两种或三种酶。
糖基转移酶包含体的制备
以前描述了用糖基转移酶表达质粒转化的大肠杆菌菌株，有一个例外。在JM109 细胞中表达pCWori-ST3GalIII质粒中的MBP-ST3GalIII。如上所述分离并溶解包含 体。如上所述评估了蛋白质含量，如表10所示。
表10.重折叠前按以下用量混合溶解的IB。
蛋白质  A280  A280(1mg/ml)   mg   ％(溶解的蛋白) MBP-ST3GalIII MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-GnT1(Δ103)C121S  32.3  35.7  42.8  1.49  1.39  1.7   21.7   25.7   25.2   13.6   13.7   9.7
糖基转移酶IB混合物的单罐重折叠
测定蛋白质含量后，用重折叠缓冲液稀释前按所示量(表11)混合溶解的IB。在 44ml体积中用缓冲液A或B(见下)和0.1mM GSSG和1mM GSH在4℃静置地进行 GT的重折叠试验。缓冲液A：55mM MES pH 6.5、550mM精氨酸、0.055％PEG3350、 264mM NaCl、11mM KCl，补充有1mM GSH、0.1mM GSSG。缓冲液B：55mM TrisHCl pH 8、550mM精氨酸、0.055％PEG3350、264mM NaCl、11mM KCl，补 充有1mM GSH、0.1mM GSSG。
表11.在2mL IBSB中溶解的GT IB的混合量
在缓冲液A中重折叠
重折叠1(A-2x)   浓度(mg/mL)   V(mL)     mg MBP-GnT1(Δ103)C121S MBP-GalT1(Δ129)C342T IBSB   25.2   25.7   -   0.2   0.2   1.6     5     5     - 重折叠2(A-3x)   浓度(mg/mL)   V(mL)     mg MBP-GnT1(Δ103)C121S MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-ST3 GalIII IBSB 在缓冲液B中重折叠   25.2   25.7   21.7   -   0.2   0.2   0.4   1.2     5     5     8.7     - 重折叠3(B-2x)   浓度(mg/mL)   V(mL)     mg
MBP-GnT1(Δ103)C121S MBP-GalT1(Δ129)C342T IBSB 重折叠4(B-3x)   25.2   25.7   -   浓度(mg/mL)   0.2   0.2   1.4   V(mL)     5     5     -     mg MBP-GnT1(Δ103)C121S MBP-GalT1(Δ129)C342T MBP-ST3GalIII IBSB   25.2   25.7   21.7   -   0.2   0.2   0.4   1.2     5     5     8.7
对于双重折叠(2x，两种糖基转移酶)而言，将2ml 10mg总蛋白加入41mL重 折叠缓冲液(上述)，其含有0.45mL 100mM GSH，0.45mL 10mM GSSG。稀释后总 蛋白是0.44mg/ml。对于三重折叠(3x，三种糖基转移酶)而言，将2ml 18.7mg总蛋 白加入41mL重折叠缓冲液(上述)，其含有0.45mL 100mM GSH，0.45mL 10mM GSSG。稀释后总蛋白是0.83mg/ml。蛋白质浓度高于先前的三重折叠试验(在SGM 中0.22mg/ml)。估计重折叠反应中糖基转移酶的浓度如下：
MBP-ST3GalIII            0.39mg/mL
MBP-GalT1(Δ129)C342T    0.23mg/mL
MBP-GnT1(Δ103)C121S     0.23mg/mL
重折叠过夜后，透析重折叠的糖基转移酶混合物。在透析袋(蛇皮，MWCO：7kD， Pierce)中以50mM TrisHCl pH 8.0，4℃透析两次。透析后，用6mL VIVA-Spin(MWCO：10K)离心浓缩器将该糖基转移酶混合物浓缩9-12倍。
SDS-PAGE分析证明，经重折叠、透析和浓缩后存在该蛋白质。
重折叠的糖基转移酶混合物的酶试验
如上所述进行酶试验。结果见表12。
表12.双重和三重折叠试验后重折叠的糖基转移酶的酶活。
折叠    浓缩倍数 酶活  mU/mL 缓冲液A(A-2x) GnT1 GalT1  0.84  598 缓冲液A(A-3x) GnT1 GalT1 ST3GalIII  0.16  306  4 缓冲液B(B-2x) GnT1 GalT1  3.32  747 缓冲液B(B-3x) GnT1 GalT1 ST3GalIII  0.47  425  11
等量混合并在缓冲液B中重折叠的与MBP融合的GnT1和GalT1观察到最高活 性。加入不等量的与MBP融合的ST3GalIII由于总蛋白高而影响了重折叠效率。然 而，采用两种GT或三种GT的两种不同重折叠缓冲液可用于获得有活性的可溶性蛋 白。
实施例5：重折叠真核GalNAcT2。
在大肠杆菌中表达截短的人GalNAcT2酶，用于确定用上述方法溶解和重折叠 的最佳条件。图13A和B中提供了全长人GalNAcT2核酸和氨基酸序列。突变蛋白 GalNAcT2(D51)的序列见图14A和B。该突变体在大肠杆菌中表达为MBP融合蛋白 MBP-GalNAcT2(D51)。制备其它GalNAcT2突变体，在大肠杆菌中表达，并能够重 折叠：MBP-GalNAcT2(D40)、MBP-GalNAcT2(D73)和MBP-GalNAcT2(D94)。数据 未显示。构建其它缺失突变体的详述参见2004年6月3日提交的USSN 60/576,530 和2004年8月3日提交的USSN 60/598,584，都纳入本文作为参考用于所有目的。
如上所述培养和收获表达MBP-GalNAcT2(D51)的细菌培养物。如上所述纯化细 菌包含体。在pH 6.5或pH 8.0溶解包含体。溶解后，用缓冲液A和B在pH 6.5或 pH 8.0重折叠MBP-GalNAcT2(D51)蛋白，缓冲液A：55mM MES pH 6.5、550mM 精氨酸、0.055％PEG3350、264mM NaCl、11mM KCl，补充有1mM GSH、0.1mM GSSG；缓冲液B：55mM TrisHCl pH 8、550mM精氨酸、0.055％PEG3350、264mM NaCl、11mM KCl，补充有1mM GSH、0.1mM GSSG。重折叠后，透析 MBP-GalNAcT2(D51)蛋白，然后浓缩。图15说明了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)的蛋白浓度。
通过监测将放射标记的GalNAc加到肽受体上进行放射性标记 [3H]-UDP-GalNAc试验来测定大肠杆菌表达的重折叠MBP-GalNAcT2(D51)的活性。 该受体是具有序列MVTPTPTPTC的MuC-2-样肽。将该肽溶于1M Tris-HCl pH＝8.0。 参见例如，2004年6月3日提交的USSN 60/576,530；和2004年8月3日提交的美 国临时专利申请律师案卷号040853-01-5149-P1；都纳入本文作为参考用于所有目的。 图16说明了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后重折叠的 MBP-GalNAcT2(D51)的酶活。图17说明了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)的特异性活性。在pH 8.0溶解和在pH 8.0 重折叠时观察到MBP-GalNAcT2(D51)的活性水平最高。在pH 8.0溶解和在pH 8.0 重折叠时观察到的特异性活性水平也最高。
测定溶解和重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)能否将GalNAc加到G-CSF蛋白上。 该试验由等份酶和反应缓冲液(27mM MES，pH＝7，200mM NaCl，20mM MgCl2， 20mM MnCl2和0.1％吐温80)，G-CSF蛋白(2mg/ml的H2O溶液)和100mM UDP-GalNAc组成。对于各重折叠样品，将4.4μL样品加入15μL反应溶液中。对于 阳性对照而言，将1μL标准GalNAcT2杆状病毒以及3.4μL H2O加入到一个试管中。 在旋转摇床上32℃孵育反应物数天，期间在过夜时间点和5天时间点上用MALDI 测定。参见例如，2004年6月3日提交的USSN 60/576,530；和2004年8月3日提 交的美国临时专利申请律师案卷号040853-01-5149-P1；都纳入本文作为参考用于所 有目的。
图18A和18B提供了在pH 6.5或pH 8.0溶解和在pH 6.5或pH 8.0重折叠后用 重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)重建重组粒细胞集落刺激因子(GCSF)的结果。包括 阳性对照，即纯化的在杆状病毒中表达的MBP-GalNAcT2(D51)和阴性对照，即缺少 底物的反应混合物。用在pH 8.0溶解和在pH 8.0重折叠的MBP-GalNAcT2(D51)观 察到GCSF重建活性水平最高。
实施例6：重折叠和纯化真核GalNAcT2。
培养并收获4升表达重组MBP-GalNAcT2(D51)的细菌。分离包含体，洗涤，在 4℃将干重2克的包含体溶解于200mL增溶缓冲液(7M尿素/50mM Tris/10mM DTT/ 5mM EDTA，pH 8.0)中。溶解后，将混合物稀释到4L重折叠缓冲液(50mM Tris/550mM L-精氨酸/250mM NaCl/10mM KC1/0.05％PEG 3350/4mM L-半胱氨酸/1mM二盐酸胱 胺，pH 8.0)中。4-10℃重折叠约20小时，不停搅拌。然后用10SP CUNO滤器过滤 混合物，在4ft2膜上浓缩5倍，用10mM Tris/5mMNaCl，pH 8.0透析4次。最终重 折叠MBP-GalNAcT2(D51)溶液的电导率是1.4mS/cm。重折叠蛋白质4℃可贮存数 天。
将重折叠蛋白质施加于Q琼脂糖XL(QXL)柱(Amersham Biosciences， Piscataway，NJ)上。洗脱图见图19，特定柱组分的酶活见图20。合并活性组分施加 到I型羟基磷灰石(80μm)(BioRad，Hercules，CA)柱上。洗脱图见图21，I型HA洗 脱组分的活性见图22。联用QXL和I型HA层析产生了有活性、高度纯化的 MBP-GalNAcT2(D51)。
实施例7：纯化真核MBP-SBD ST3Gal3。
将Δ73 ST3GalIII截短物框内融合于麦芽糖结合蛋白和淀粉结合域形成双标记 蛋白：MBP-SBD-ST3Gal3(Δ73)。MBP位于氨基末端，然后是SBD，然后是截短的 ST3GalIII蛋白。比较MBP-SBD-ST3Gal3(Δ73)蛋白的重折叠和纯化与单标记蛋白 MBP-ST3GalIII(Δ73)。在大肠杆菌中两种蛋白表达为不溶性包含体，如本文所述溶 解、重折叠。然后，对蛋白质进行透析并用结合MBP和SBD标记的环式糊精柱亲 和纯化。结果见图23。透析后MBP-SBD-ST3Gal3(Δ73)蛋白特异性活性较高，用环 式糊精从柱上洗脱后保留了更多的特异性活性。
实施例8：重折叠MBP-ST3Gall和MBPSBD-ST3Gal1蛋白
将真核ST3Gal1与MPB或MBP和SBD融合。用猪ST3Gal1基因的DNA序列 作为设计本文所述pcWINMBP-pST3Gal1和pcWINMBP/SBD-pST3Gal1构建物的模 板。全长猪ST3Gal1序列见图37。为了在大肠杆菌中表达，优化密码子，采用截短 的pST3Gal1，即pST3Gal1Δ45。编码氨基酸序列见图24。接着消化ST3Gal1基因编 码序列，利用BamHI和XhoI克隆位点转移到pcWIN2-MBP和pcWINMBP/SBD载 体。通过限制性酶切和序列分析证实了这些构建物正确，然后用于转化大肠杆菌菌 株JM109，采用50μg/ml卡那霉素选择。用各构建物的单菌落接种2ml Maritone培 养基-10μg/ml卡那霉素，37℃培养16小时。将各培养物分别与50％甘油1∶1混合， -80℃冷冻，称为储存小瓶。取各储存小瓶中少量划线Maritone-Kan平板。37℃培养 16小时后，用各平板的单菌落接种25ml Maritone培养基-10μg/ml卡那霉素，37℃ 培养16小时。然后用25ml培养物接种1L Maritone培养基-10μg/ml卡那霉素，37℃ 培养并监测OD600。当OD600达到0.8时，加入1mM IPTG，再培养细胞16小时。 然后7000xG离心15分钟收获细胞。
然后分离包含体，溶解ST3Gal1融合蛋白，并重折叠。按每10mL 20mM Tris pH 8，5mM EDTA 1g湿细胞沉淀物的比例重悬细菌细胞沉淀，两次通过微流化床机 械破坏裂解细胞。在Sorvall RC3中7000xg 4℃离心30分钟沉淀不溶性物质即包含 体或IB，弃去上清。洗涤循环一般由用洗涤缓冲液完全重悬沉淀和重复离心15分钟 组成。用过量体积(每克初始细胞沉淀至少10 mL(高达20毫升))的高盐缓冲液(洗液I： 10mM Tris pH 7.4，1M NaCl，5mM EDTA)洗涤沉淀一次，用去污剂缓冲液(洗液II： 25mM Tris pH 8，100mM NaCl，1％Triton X100，1％去氧胆酸钠，5mM EDTA)洗 涤一次，用洗涤缓冲液(洗液III：10mM Tris pH 8，5mM EDTA)洗涤三次(除洗涤IB 外还去除痕量去污剂)。
将洗涤后的IB重悬于增溶缓冲液(8M尿素，50mM BisTris pH 6.5，5mM EDTA，10mM DTT)中，将蛋白质浓度调整为2mg/ml。重折叠方法如下：用重折叠 缓冲液(55mM Tris pH 8.2，10.56mM NaCl，0.44mM KCl，2.2mM MgCl2，2.2mM CaCl2，0.055％PEG3350，550mM L-精氨酸，1mM GSH，100mcM GSSG)快速稀释 20倍，4℃搅拌16小时。然后用G50 Sephadex脱盐将缓冲液换成50mM BisTris pH 6.5，75mM NaCl，0.05％吐温80。
为测定重折叠酶是否有活性，进行唾液酸转移酶试验。用放射性标记的 CMP-NAN监测唾液酸向供体(脱唾液酸-牛下颚粘蛋白)的转移。用杆状病毒系统中表 达的鸡ST6GalNacl作为阳性对照。
简要说，将40μL反应混合物加入10μL酶样品中，37℃孵育1小时。将100μL 磷钨酸/15％TCA加入反应物中搅拌沉淀糖蛋白。离心后，吸干并弃去上清。加入500 μL 5％TCA洗涤沉淀中未掺入的CMP-14C-唾液酸。再次离心反应物，吸干并弃去上 清。用100μL 10N NaOH重悬沉淀。将1mL 1M Tris缓冲液，pH 7.5加入重悬的沉 淀中，然后将混合物转移到闪烁小瓶中。加入5 mL闪烁液(Ecolume，ICN Biomedicals) 充分混合。将40μL反应混合物加入闪烁小瓶并加入100μL 10N NaOH，1mL水和 5mL闪烁液，充分混合测定加入反应的总计数。小瓶计数1分钟。反应条件见表13。
表13
 试剂 生产商 目录号 每试管 的量 试验中的终浓度  CMP[14C]唾液酸 Amersham CFB-165 4μL 100,000CPM  7mM CMP-唾液酸 Neose AES 533pg.42 1.4μL 0.2mM  25mg/mL脱唾液酸-牛下  颚粘蛋白 Sigma，在 Neose水解 M-3895 20μL 250-500μg  1M Bis/Tris缓冲液pH 6.5 Sigma B-9754 2.5μL 50mM  5MNaCl Sigma S-7653 1μL 100mM  dH2O N/A N/A 11.1μL
每试管中反应混合物总体积：40μL
结果见图25。重折叠的融合蛋白MBP-pST3Gal1和MBP-SBD-pST3Gal1具有可 检测的唾液酸转移酶活性。
实施例9：重折叠MBP-ST6GalNAc1蛋白
将真核ST6GalNAcI融合于MPB。简要说，产生了5个小鼠ST6GalNAcI构建 物：D32、E52、S127、S186和S201。从载体pcWin2-MBP的MBP-标记后表达各构 建物，其不同之处在于构建物中包括的‘主干’区长度。D32是最长形式，恰好从预计 的氨基末端跨膜结构域下游开始。S201最短，从保守催化结构域的预计起始点之前 不远处开始。
除小鼠构建物以外，人ST6GalNAc IK36也表达为MBP融合物。人构建物恰好 从跨膜结构域之后开始。用现有的杆状病毒表达载体作模板用PCR分离编码人 ST6GalNAc1中K36至其c末端的DNA，将其克隆入pcWin2-MBP的BamHI-XhoI 位点中。
在参考文献中，MBP-mST6GalNAcI S127和MBP-hST6GalNAcI K36的序列见 图26。此外，图38提供了人ST6GalNAcI和鸡ST6GalNAcI的全长氨基酸序列以及 从天然小鼠蛋白的残基32处开始的小鼠ST6GalNAcI蛋白序列。
除上述蛋白以外，还制备了缺失突变体，用于本发明的优选ST6GalNAcI的完 整列表见表14。图39提供了许多优选的人ST6GalNAcI截短突变体的示意图。图40 显示了包括人ST6GalNAcI截短突变体的MBP融合蛋白的示意图。
表14：ST6GalNAcI突变体
截短位点 突变   人 Δ35  K36 Δ124  K125 Δ257  S258 Δ35  K36 Δ72  T73 Δ109  E110 Δ133  M134 Δ170  T171 Δ232  A233 Δ272  G273   鸡 Δ48  Q49 Δ152  V153 Δ225  L226 Δ232  T233   小   鼠 Δ31  D32 Δ51  E52 Δ126  S127 Δ185  S186 Δ200  S201
图45显示了配对和未配对半胱氨酸残基在人ST6GalNAcI蛋白中的位置。也显 示了单半胱氨酸取代和双半胱氨酸取代，如C280S、C362S、C362T、 (C280S+C362S)和(C280S+C362T)。
初始表达研究证明，ST6GalNAcI融合蛋白表达为不溶性蛋白质。为了回收活性 重组酶，如上所述分离和重折叠无活性的不溶性蛋白：
用1mM IPTG 37℃过夜诱导对数生长的0.5L携带pcWin2-MBP-mST6GalNAcI D32、E52、S127、S186或pcWin2-MBP-hST6GalNAcI K36的JM109细胞培养物。 离心收集细胞，溶于100mL 20mM Tris pH 8，5mM EDTA溶液中，在微流化床中 机械破坏裂解细胞。7000xg离心20分钟收集不溶性物质。弃去上清，用高盐缓冲 液(20mM Tris pH7.4，1M NaCl，5mM EDTA)、去污剂缓冲液(25mM Tris pH 8，1％ 去氧胆酸钠，1％Triton x100，100mM NaCl，5mM EDTA)和TE(10mM Tris pH8， 1mM EDTA)洗涤沉淀。每次洗涤用100mL，如上所述离心收集沉淀。洗涤后，将包 含体沉淀分成等分，贮存在-80℃。
为筛选适合重折叠和恢复ST6GalNAc I活性的条件，将等份的小鼠和人 ST6GalNAcI融合蛋白包含体溶于6M胍、10mM DTT、1x TBS。蛋白浓度按 Bradford试验标准化，将溶解的蛋白质转移到一系列市售蛋白重折叠缓冲液中。在 96孔板中0.25mL 0.2mg/mL溶液中4℃振荡重折叠过夜。将重折叠产物转移到96 孔透析板(25000 MWCO)中，4℃以1x TBS，0.05％吐温-80透析4小时，然后在4℃ 以10mM BisTris pH 7.1，100mM NaCl，0.05％吐温-80透析过夜。
在384孔固相活性试验中测定重折叠的重组ST6GalNAcI融合蛋白的活性。简 要说，该活性试验在384孔板中检测ST6GalNAcI介导的生物素化唾液酸从生物素化 CMP-NAN转移到脱唾液酸-牛下颚粘蛋白包被的孔表面。各反应(13.5μL重折叠酶 +1.5μL 10x反应缓冲液)一式四份进行。10x反应缓冲液是0.2M BisTris pH6.7，25 mM MgCl2，25mM MnCl2，0.5％吐温-80和1mM供体。37℃孵育过夜后，用过量 1xTBS，0.05％吐温-20洗涤板孔，按照厂商说明书(Perkin Elmer)用铕标记的链霉抗 生物素蛋白检测生物素。保留在板孔中的铕荧光水平表明了ST6GalNAcI活性，用 Perkin Elmer Victor3V平板阅读器记录铕荧光水平，表15中小结了表达和活性的检 测结果。三种重折叠的ST6GalNAcI融合蛋白具有可检测的活性。
表15：用固相试验测定重折叠ST6GalNAcI融合蛋白活性的小结
构建物 SDS-PAGE检测的 重折叠蛋白 固相试验检测的重折叠蛋 白活性 MBP-mST6GalNAcI D32 + - MBP-mST6GalNAcI E52 ++ - MBP-mST6GalNAcI S127 +++ + MBP-mST6GalNAcI S186 +/- +/- MBP-hST6GalNAcI K36 +/- +
实施例10：重折叠Core 1 GalT1蛋白
将真核Core 1 GalT1融合于MPB或双标记MBPSPD。采用果蝇和人Core 1 GalT1蛋白。图41提供人Core 1 GalTl蛋白的全长序列。图42提供两种果蝇Core 1 GalT1蛋白的序列。从整个主干区，即从全长主干区开始，一次缺失一个氨基酸制备 各酶的截短物，最小截短物仅含Core 1 GalT1催化结构域。也将整个蛋白质催化结 构域中的半胱氨酸残基一次突变一个，成为丝氨酸残基或丙氨酸残基。用截短的蛋 白质、半胱氨酸突变体或二者联合制备MBP融合物。蛋白质在大肠杆菌中表达为包 含体，溶解，然后用本文所述方法重折叠。通过测量酶活测定重折叠(效果)。有活性 的酶是正确重折叠的。如Ju等，J.Biol.Chem.277：178-186(2002)所述测定Core 1 GalT1的酶活，将其纳入本文作为参考用于所有目的。
实施例11：O-连接糖基转移酶的单罐重折叠
O-连接糖基转移酶GalNAcT2、Core1和ST3Gal1可一起用于将包含末端唾液酸 或唾液酸-PEG的Core 1结构加到所选择蛋白(包括治疗性蛋白)的丝氨酸或苏氨酸残 基上。在大肠杆菌中表达这些酶和从重折叠的包含体中回收活性酶，用于开发成本 效率高的规模化方法。我们在本文中描述了同时重折叠大肠杆菌包含体的两种酶 (MBP-GalNAcT2和MBP-ST3Gal1)。同时重折叠的优点包括减少试剂用量和提高重 折叠效率。
选择两株卡那霉素抗性的JM109，确定携带用IPTG诱导后能将MBP-GalNAcT2 和MBP-ST3Gal1累积在包含体中的合适表达质粒。
用1mM IPTG分别诱导过夜后，以每10mL 20mM Tris pH 8，5mM EDTA 1g 湿细胞沉淀的比例重悬细菌细胞沉淀，两次通过微流化床机械破坏裂解细胞。在 Sorvall RC3中7000xg 4℃离心30分钟沉淀不溶性物质即包含体或IB，弃去上清。 洗涤循环一般由用洗涤缓冲液完全重悬沉淀和重复离心15分钟组成。用过量体积(每 克初始细胞沉淀至少10mL(高达20毫升))的高盐缓冲液(洗液I：10mM Tris pH 7.4， 1M NaCl，5mM EDTA)洗涤沉淀一次，用去污剂缓冲液(洗液II：25mM Tris pH 8， 100mM NaCl，1％Triton X100，1％去氧胆酸钠，5mM EDTA)洗涤一次，用洗涤缓 冲液(洗液III：10mM Tris pH 8，5mM EDTA)洗涤三次(除洗涤IB外还去除痕量去 污剂)。
将洗涤后的IB重悬于增溶缓冲液(8M Urea，50mM BisTris pH 6.5，5mM EDTA，10mM DTT)中，将蛋白质浓度调整为4mg/ml。14000xG离心5分钟使尿素 蛋白质溶液澄清。重折叠方法如下：用重折叠缓冲液(55mM Tris pH 8.2，10.56mM NaCl，0.44mM KCl，2.2mM MgCl2，2.2mM CaCl2，0.055％PEG3350，550mM L- 精氨酸，1mM GSH，100mcM GSSG)快速稀释至0.1mg/ml，4℃搅拌16小时。
试验系统设定如下：在MBP-GalNAcT2和MBP-ST3Gal1分别重折叠或在同一 容器中同时重折叠时保持重折叠条件恒定。重折叠后，用50mM BisTris pH 6.5， 75mM NaCl，0.05％吐温80平衡的G50 Sephadex低速离心使混合物脱盐。在微型离 心机中以最高转速离心后回收可溶性物质。
为确定重折叠后可溶性酶的产量，对各反应进行SDS-PAGE分析，然后用考马 斯蓝染色显示多肽(图27A)。结果表明，同时重折叠提高了可溶性酶的产量(见同时 重折叠与分别重折叠的泳道)。
在第二个试验中，对6μg治疗蛋白IFα-2b进行单罐三种酶的PEG化反应。用于 此反应的酶浓度是1.4μg MBP-GalNAcT2、0.5mu BV Corel和1.4μg MBP-ST3Gal1， 所用糖是1.2μg UDP-GalNac和1.2μg UDP-Gal和125μg 20K-PEG-CMP-NAN，在 20μl反应体系中用以下反应缓冲液(50mM MES pH 6.2，150mM NaCl，10mM MnCl2) 反应0小时或16小时。在反应一半时，通过SDS-PAGE后考马斯蓝染色(图27B)来 观察IFα-2b的PEG化程度。设计该试验是为了在保持所有其它组分和浓度不变的情 况下直接比较分别重折叠的混合酶与同时重折叠的酶的单罐PEG化(程度)。结果证 明，与分别重折叠相比，同时重折叠的酶在此反应中PEG化产物增加(泳道5与7)。
实施例12：MBP-SiaA融合蛋白表达增加
为在大肠杆菌中表达优化非典型性流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的 SiaA基因的密码子。用NdeI和EcoRI消化该基因，进行琼脂糖凝胶纯化，然后连接 到NdeI/EcoRI消化的pcWin2中，然后转化到大肠杆菌菌株JM109或W3110中。从 重组细菌中分离质粒DNA并用NdeI和EcoRI筛选。将含有正确构建物的各JM109 和W3110菌落接种到2ml含有10μg/ml硫酸卡那霉素的无动物(animal free)LB中， 以250RPM摇动37℃培养6小时。取出100μl等份，10,000xg离心2分钟，弃去 上清。将此沉淀冷冻在-20℃，代表未诱导细胞。将IPTG加入剩下的培养物中IPTG 终浓度为1mM，以250RPM摇动37℃培养2小时。取出100μl等份，如上所述进 行试验(代表诱导细胞)。
用PCR将SiaA基因末端的限制性位点改变为5’BamHI，3’末端保持为EcoRI。 用BamHI和EcoRI消化该PCR产物，琼脂糖凝胶电泳纯化，然后连接入BamHI/EcoRI 消化的pcWin2MBP中。用BamHI和EcoRI筛选质粒DNA。将含有正确构建物的三 个菌落接种到2ml含有10μg/ml硫酸卡那霉素的无动物LB中，以250RPM摇动37℃ 培养6小时。取出100μl等份，10,000xg离心2分钟，弃去上清。将此沉淀冷冻在 -20℃，代表未诱导细胞。将IPTG加入剩下的培养物中，IPTG终浓度为1mM，以 250RPM摇动37℃培养2小时。取出100μl等份，如上所述进行试验(代表诱导细胞)。
取各100μl等份在含50mM DTT的100μl SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸5分 钟。将样品加到4-20％丙烯酰胺Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上，电泳～2h，用 Invitrogen Simply Blue Safestain染色，用水脱色，并扫描。图X显示检测不到诱导后 天然SiaA的表达水平，而图Y显示IPTG诱导后融合于MBP的SiaA高水平表达。 此结果证明，pcWin2MBP载体提供的MBP驱使蛋白质高水平表达。
应理解，本文所述实施例和实施方式仅为了说明，本领域技术人员能据此进行 各种修改或改变，这些修改和改变应包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求 书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都以其全部内容纳入本文作 为参考用于所有目的。
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年2月4日提交的美国临时申请号60/542,210、2004年8月6 日提交的美国临时申请号60/599,406和2004年11月12日提交的美国临时申请号 60/627,406的优先权；各自纳入本文作为参考用于所有目的。