本发明涉及用于诱导或抑制外源基因在动物和植物细胞中表达的 非甾族配位体。

在基因工程领域里，对基因表达的精确暂时控制，即，激活或抑制 基因的能力，在研究、操作和控制发育以及其它生理过程方面是有价值 的工具(例如参见，Evans和PCT国际申请PCT/US97/05330，并在本文 中引证参考)。在哺乳动物中，其应用包括诱导基因寻靶，有毒和致畸 基因的过表达、反义RNA表达和基因治疗。在植物中，其应用包括控 制植物性状、雄性或雌性繁殖；植物保护剂过表达；包括固有和非固有 物质的所需植物产品的生产和改性。对动物和植物，对外源蛋白质例如 治疗蛋白质、工业酶、聚合物等的诱导作用是有价值的。

用于控制基因表达的试剂是重要的，通常它被称作“基因开关”， 它是一种在控制所述基因的生物体中通常不存在的物质。这是为了避免 基因的不期望表达和抑制。例如发明了一种可诱导的受四环素调节的系 统，并应用到转基因小鼠中，使得在抗体不存在时诱导基因活性，而在 抗体存在时抑制基因活性。在这种情况下，不幸的是，它作为一种有效 的“开-关”型基因开关会干扰四环素的药用机理。

国际专利申请PCT/GB96/01195中，公开了一种从美洲菸夜蛾 (Heliothis virescens)(“HEcR”)中分离的昆虫甾族受体，它对甾族(例如， 20-羟基蜕皮激素和Muristerone A)和一些非甾族诱导剂能作为基因开 关而产生应答反应。在这一和许多其它对甾族和非甾族诱导剂都有反应 的系统中，非甾族诱导剂比甾族诱导剂具有明显的优点，这是由于以下 几种原因，例如包括：生产低成本、代谢稳定性、不存在于昆虫、植物 或哺乳动物体内和环境的可接受性。该PCT申请公开了应用两种二苯 甲酰基肼，1，2-二苯甲酰基-1-叔丁基肼和tebufenozide(N-(4-乙基苯甲酰 基)-N-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N-叔丁基肼)作为HEcR系统的基因开关， 并提示其它的如在美国专利U.S.5,117,057中公开的二苯甲酰肼也可在 此系统中作为基因开关而使用。尽管上述是真实的，上述二苯甲基肼的 活性是不清楚的。特别是，在5,117,057中说明了一大类二苯甲酰肼， 其中的许多种作为基因开关是无效的。GB96/01195中表明，当试验20 种上述二苯甲酰肼时，只有7种有活性。

国际申请PCT/EP96/00686公开了使用tebufenozide作为黑猩猩果 蝇蜕皮激素受体的化学配位体。这一受体在转基因植物中用来控制基因 的表达，由此控制重要农作物的多种性状。

不幸的是，尽管上述具体说明的配位体在分离的细胞中显示出报告 基因诱导活性，在整个植物体如整体植物和动物中使用却没有相应的作 用。

因此，仍需要开发与已知配位体相比其活性提高或一致，并对整体 植物和动物具有活性的非甾族配位体。我们先已发现一小类二苯甲酰肼 衍生物不仅在分离的细胞中显示出报告基因诱导活性，而且优于已知的 二酰基肼，1，2-二苯甲酰基-1-叔丁基-肼和tebufenozide，当应用在整体 植物和动物上时，由于其具有改善的输送和分布性质，它们具有代谢稳 定性，持效性，对受体的亲和力，和没有副作用的优点。

本发明涉及调整外源基因表达的改进方法，包括使含有：

a)DNA结合域；

b)配位体结合域；

c)反式激活域；和

d)配位体； 的蜕皮激素受体复合物与含有：

a)外源基因；和

b)应答元件； 的DNA构建体接触，

其中

a)外源基因受应答元件的控制；和

b)在配位体存在下DNA结合域与应答元件结合，由此激活或抑制 所述的外源基因；

该方法的改进包括：

从式I化合物中选择配位体：

其中：

E为含有叔碳原子的(C4-C6)烷基或含有叔碳原子的氰基(C3-C5)烷 基；

R1为H，Me，Et，异丙基，F，甲酰基，CF3，CHF2，CHCl2，CH2F， CH2Cl，CH2OH，CH2OMe，CH2CN，CN，C≡CH，1-丙炔基，2-丙炔 基，乙烯基，OH，OMe，OEt，环丙基，CF2CF3，CH＝CHCN，烯丙基， 叠氮基，SCN，或SCHF2；

R2为H，Me，Et，正丙基，异丙基，甲酰基，CF3，CHF2，CHCl2， CH2F，CH2Cl，CH2OH，CH2OMe，CH2CN，CN，C≡CH，1-丙炔基， 2-丙炔基，乙烯基，Ac，F，Cl，OH，OMe，OEt，O-正丙基，OAc， NMe2，NEt2，SMe，SEt，SOCF3，OCF2CF2H，COEt，环丙基，CF2CF3， CH＝CHCN，烯丙基，叠氮基，OCF3，OCHF2，O-异丙基，SCN，SCHF2， SOMe，NH-CN，或与R3相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚 乙二氧基、带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基或带有与苯基 碳原子相邻的氧原子的二氢吡喃基；

R3为H，Et，或与R2相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成 亚乙二氧基、带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基或带有与苯 基碳原子相邻的氧原子的二氢吡喃基；

R4，R5，和R6各自独立地为H，甲基，乙基，F，Cl，Br，甲酰基， CF3，CHF2，CHCl2，CH2F，CH2Cl，CH2OH，CN，C≡CH，1-丙炔基， 2-丙炔基，乙烯基，OMe，OEt，SMe或SEt；

条件是

a)当R1为Me和R2为OMe时；

  则R3为氢，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基，3，5-二甲氧基 -4-甲基，3，5-二氯，或3，5-二氟；

b)当R1为Me和R2为OEt时；

  则R3为氢，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基，3，5-二甲氧基 -4-甲基，3，5-二氯，3，5-二氟，2，4-或2，5-二氟，2，4-或2，5-二氯；

c)当R1为Et和R2为OMe或OEt时；

  则R3为氢，而R4、R5和R6的组合是：

 i)3，5-二-甲氧基-4-甲基，3，5-二氯，3，5-二氟，2，4-或2，5-二氟， 2，4-或2，5-二氯，3-甲氧基，2-氯-5-甲基，2-溴-5-甲基，2-氯，2-溴，或 3-甲基；或

 ii)R6为H，R4为甲基，而R5为乙基，F，Cl，Br，甲酰基，CF3， CHF2，CHCl2，CH2F，CH2Cl，CH2OH，CN，C≡CH，1-丙炔基，2- 丙炔基，乙烯基，OMe，OEt，SMe，或SEt；

d)当R1是异丙基；

  则R2是OMe或OEt，R3是H，而R4、R5和R6的组合是3，5-二 甲基；

e)当R3为Et；

  则R2为H，R1为F或Cl，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基；

f)当R2、R3和它们各自相连的苯基上的碳原子一起形成亚乙基二 氧基环时；

  则R1是Me或Et，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基；

g)当R2、R3和它们各自相连的苯基上的碳原子一起形成二氢呋喃 基或二氢吡喃基环时；

  则R1是Et，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基；

h)当R1为甲酰基，CF3，CHF2，CHCl2，CH2F，CH2Cl，CH2OH， CH2OMe，CH2CN，CN，C≡CH，1-丙炔基，2-丙炔基，乙烯基，OH， 环丙基，CF2CF3，CH＝CHCN，烯丙基，叠氮基，SCN或SCHF2时；

  则R2为OMe或OEt，R3为H，而R4、R5和R6的组合是3，5-二 甲基；和

i)当R2为甲基，乙基，正丙基，异丙基，甲酰基，CF3，CHF2， CHCl2，CH2F，CH2Cl，CH2OH，CH2OMe，CH2CN，CN，C≡CH，1- 丙炔基，2-丙炔基，乙烯基，Ac，F，Cl，OH，O-正丙基，OAc，NMe2， NEt2，SMe，SEt，SOCF3，OCF2CF2H，COEt，环丙基，CF2CF3，CH＝CHCN， 烯丙基，叠氮基，OCF3，OCHF2，O-异丙基，SCN，SCHF2，SOMe或 NH-CN时；

则R1为Et，R3是H，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基。

本发明还涉及调整外源基因表达的方法，其中包括使含有：

a)DNA结合域；

b)配位体结合域；

c)反式激活域；和

d)由式I化合物组成的配位体 的蜕皮激素受体复合物与含有：

a)外源基因；和

b)应答元件； 的DNA构建体接触，

其中

a)外源基因受应答元件的控制；和

b)在配位体存在下DNA结合域与应答元件结合，由此激活或抑制 所述的基因。

为了获得在a)配位体结合和所得基因开关活性，和b)在整体植物 和动物中输送、系统性、毒性和代谢稳定性之间的最佳平衡，式I化合 物取代基的位置和大小是重要的。当E为叔丁基，R1为乙基，R2为乙 氧基，R3是氢，而R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基时，出现最佳的平 衡性质。上述“R”基各自的组成可以有相当大的变化。可是，这种变 化将导致式I化合物的大小、形状和整体极性的明显改变，这将降低最 佳平衡，结果改变化合物的性质。由于这种原因，当任一特定R基的组 成从最佳态发生改变时，组合中其它R基的变化将受到限制。

优选，E为(C4-C5)烷基。更优选，E为叔丁基。

优选，R1为甲基，乙基，异丙基，F，CF3，CHF2，CHCl2，CH2F， CH2Cl，CH2OH，CH2OMe，CH2CN，CN，C≡CH，或CF2CF3。更优 选R1为甲基，乙基，异丙基，F，CF3，CHF2，CH2F，CH2OMe，CH2CN， C≡CH，或CF2CF3。更加优选R1为甲基，乙基，异丙基，或F。最优 选R1为甲基或乙基。

优选的R2为乙基，CF3，CHF2，CHCl2，CH2F，CH2Cl，CH2OH， CH2OMe，CH2CN，CN，OH，OMe，OEt，O-正丙基，CF2CF3，叠氮 基，OCF3，或与R3相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚乙二 氧基、带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基或带有与苯基碳原 子相邻的氧原子的二氢吡喃基。更优选的R2为乙基，CF3，CHF2，CHCl2， CH2F，CH2Cl，CH2OH，CH2OMe，CH2CN，CN，OH，OMe，OEt， CF2CF3，或与R3相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚乙二氧 基或带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基。更加优选的R2为 OH，OMe，OEt，或与R3相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚 乙二氧基或带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基。最优选R2 为OMe或OEt。

优选地，R3为H，Et，或与R2相连并和与R2和R3连接的苯基 碳原子形成亚乙二氧基、带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基 或带有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢吡喃基。更优选的R3为H， Et，或与R2相连并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚乙二氧基或带 有与苯基碳原子相邻的氧原子的二氢呋喃基。更加优选的R3与R2相连 并和与R2和R3连接的苯基碳原子形成亚乙二氧基或带有与苯基碳原子 相邻的氧原子的二氢呋喃基。

优选地，R4、R5和R6各自独立地为甲基，F，Cl，CH2OH，或 OMe。更优选地，R4、R5和R6各自独立地为甲基，F，Cl，CH2OH， 或OMe。更加优选地，R4、R5和R6各自独立地为甲基，F，Cl。更特 别优选地，R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基，3，5-二氯，或3，5-二氟。 最优选地，R4、R5和R6的组合是3，5-二甲基。

术语“Me”，“Et”，“n-Pr”，“i-Pr”，和“Ac”分别意为甲 基，乙基，正丙基，异丙基，和乙酰基。在提及R4、R5和R6时所用的 术语“2，4”，“2，5”，“3，5”等表示基团在苯环上连接的相对位置。

术语“卤素”意为氟、氯、溴或碘。

术语“调整”意为给定的配位体/受体复合物诱导或抑制外源基因 的转活。

术语“外源基因”意为相对于主体的一种外来基因，即，通过转化 方法将其引入主体的一种基因或内源突变基因的未突变形式。在本发明 中，转化方法不是关键的，且是现有技术中已知的对主体而言适合的任 何方法。例如，从转化细胞再生获得转基因植物。许多种转化方法可从 文献中获知如使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或其T1质 粒的农杆菌侵染，电穿孔，植物细胞和原生质体的微注射和微粒转化。 动物细胞的转化和这种转化细胞在转基因动物中再生的其它技术是已 知的。外源基因可以是天然或合成的基因和治疗基因，且所述治疗基因 以DNA或RNA形式被引入主体并通过DNA中间体如通过反转录酶发挥 作用。上述基因可被引入靶细胞，直接引入主体物，或通过将转化细胞转 移至主体物而非直接地引入。术语“治疗基因”意为在其表达的宿主细胞 中发挥有益作用的基因。治疗基因不是在宿主细胞中自然存在的。

术语“蜕皮激素受体复合物”通常指由甾族受体家族的两个成员， 蜕皮激素受体(“EcR”)和超气门(“USP”)蛋白质组成的杂二聚物蛋白 质复合物(参见Yao，T.-P.，等人(1993)自然(Nature)366，476-479；Yao，T.-P. 等人，(1992)细胞(Cell)71，63-72)。具有蜕皮甾族受体复合物功能的物质 还包括其它蛋白质，如亲免素。其它已知作为转录因子的甾体受体类的 蛋白质(如DHR38，β-FTZ-1或其它昆虫同系物)，也可以是对EcR和/ 或USP配位体独立或不独立的配偶体。蜕皮激素受体复合物还可以是 蜕皮激素受体蛋白质和超气门蛋白质的脊椎动物同系物，视黄酸-X受体 蛋白质(“RXR”)的杂二聚体。蜕皮激素受体蛋白质或USP的同型二聚 体复合物在一些情况下也具有作用。

活性蜕皮甾体或非甾体配位体与复合物中的蛋白质之一(其中包括 EcR，但并不排除复合物中的其它蛋白质)接触可以活化蜕皮甾体受体复 合物。

蜕皮激素受体复合物包括蛋白质，它们是甾体受体超家族的成员， 其中所有成员的特征在于存在由绞链区隔开的氨基末端反式激活域、 DNA结合域(“DBD”)和配位体结合域。在该家族中的一些成员在LBD 的羧基末端那侧还具有另一反式激活域。DBD特征在于在两个氨基酸 基元P-box和D-box间存在两个半胱氨酸锌指，它们赋予对蜕皮激素应 答元件的特异性。上述域可以是天然的，改性的，或异源受体蛋白质不 同区的嵌合体。

术语“应答元件”(“RE”)意为一或多种顺式-作用DNA元件，它 在与外源激素受体复合物的DNA结合域相互作用的介导下对启动子产 生应答反应。这种DNA元件可以在其序列中有回文结构(完全或不完全) 或由被不同的核苷酸分隔开的序列基元或半位点组成。半位点可以相似 或相同，并且可以正向或反向重复排列。存在或不存在配位体时，蜕皮 激素受体复合物与RE的DNA序列结合，在这种应答元件的调节下引 发或抑制下游基因的转录。天然蜕皮激素受体的RE的DNA序列的实 例包括：RRGG/TTCANTGAC/ACYY(参见：Cherbas L.，等人， (1991).Genes Dev.5，120-131)；AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N(n)可以是 一个或多个间隔核苷酸(参见：D Avino PP等人，(1995)， Mol.Cell.Endocrinol，113，1-9)；和GGGTTGAATGAATTT(参见： Antoniewski C.等人，(1994)Mol.Cell Biol.14.4465-4474)。

可将组成外源基因的DNA序列、应答元件和蜕皮激素受体复合物 输入原核细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，或其它肠杆菌。可是，由于许多蛋白质的基因表达在细菌中不 能准确进行，所以优选真核细胞。外源基因的核苷酸序列、应答元件和 受体复合物也以RNA分子的形式，优选以在有功能的烟草花叶病毒的 病毒RNAs中的形式输入。对于真核细胞，脊椎动物的细胞是优选的， 这是由于它们本身缺少对蜕皮激素受体的配位体有应答能力的分子。因 此，它们对本发明的配位体不敏感。因此，本发明配位体对转化细胞或 整个生物体的生理或其它作用可以忽略。因此，细胞可以生长和表达所 需的产品，基本上不受配位体存在的影响。

术语“主体”意为整体植物或动物，或植物或动物的细胞。还应期 望的是当主体是真菌或酵母时，配位体的作用同样的好。当主体是整体 动物时，优选动物是脊椎动物，最优选是哺乳动物。

当本发明的配位体与蜕皮激素受体复合物(所述复合物结合到连接 外源基因的应答元件上)一起使用时，提供外源基因表达的外部临时调 节机制。各种成分彼此结合的顺序，即，配位体与受体复合物结合和受 体复合物与应答元件之间的结合顺序不是关键的。典型地，外源基因表 达的调整是蜕皮激素受体复合物与具体的DNA控制或调节元件结合的 反应。蜕皮激素受体蛋白质，象其它类的甾族受体一样，至少具有三个 域，一个反式激活域，一个DNA结合域和一个配位体结合域。这种受 体，象甾体受体家族的亚类一样，还具有导致杂二聚体性质的未充分定 义的区。配位体与蜕皮激素受体蛋白质的配位体结合域结合，在与USP 或RXR蛋白质形成二聚体后，能使该杂二聚体蛋白质的DNA结合域与 活化型的应答元件结合，由此得到外源基因的表达和抑制。这种机理不 排除配位体与EcR或USP结合的可能性，结果形成活性同二聚体复合 物(例如：EcR+EcR或USP+USP)。优选的，受体的一或多个域可以不 同，生成嵌合的基因开关。典型的，三个域中的一个或多个选自不同于 其它域的来源时，在选择转活性的宿主细胞或生物体、配位体的互结合 和识别具体应答元件方面，嵌合受体是最佳的。另外，应答元件本身可 被改变或用其它DNA结合蛋白域的应答元件取代以得到嵌合蜕皮激素 受体复合物，所述其它DNA结合蛋白域例如为源自酵母的GAL-4蛋白 质(参见Sadowski，等人，(1988)Nature，335，563-564)或源自大肠杆菌 的LexA蛋白质(参见Brent和Ptashne(1985)，Cell，43，729-736)。嵌合 系统的其它优点是它们允许选择一个启动子，用于根据所需最终结果来 驱动外源基因。上述双重控制在基因治疗区特别重要，特别是当生产细 胞毒素蛋白质时更是如此，这是因为表达的时间以及其中出现表达的细 胞都可被控制。术语“启动子”意为被RNA聚合酶识别的一种具体的 核苷酸序列。该序列是在适当条件下转录可被特定引发的位点。当可操 作地与适合启动子连接的外源基因，被引入主体细胞时，通过本发明配 位体的存在控制外源基因的表达。启动子可被组成性或可诱导性地调节 或可以是组织特异性(即，仅在特定细胞类型中表达)或对生物体一定的 发育阶段是特异的。

本发明其它方面是调整一或多种外源基因在生物体中表达，其中包 含向生物体给药有效量，即，引起目的基因表达或抑制的所需量的含有 式I化合物的配位体，且其中生物体细胞含有：

a)蜕皮激素受体复合物，其中包含：

  1)DNA结合域；

  2)配位体结合域；和

  3)反式激活域；和

b)DNA构建体，其中包含：

  1)外源基因；和

  2)应答元件；和

  其中

  a)外源基因受应答元件控制；和

  b)在配位体存在下DNA结合域与应答元件结合，由此激活或抑制 基因。

本发明的相关方面是在转基因生物体中调节内源或异源基因的表 达的方法，其中包括使含有式I化合物的配位体与生物体细胞中的蜕皮 激素受体接触，其中所述细胞含有与蜕皮激素受体结合的DNA结合序 列，而且其中蜕皮激素-配位体-DNA结合序列复合物的形成诱导基因的 表达。

本发明第四方面是生产多肽的方法，其中包括下述步骤：

a)选择对暴露在含有式I化合物的配位体下基本上不敏感的一种 细胞；

b)向细胞中引入：

 1)一种DNA构建体，其包含：

  a)编码多肽的外源基因；和

  b)应答元件；

  其中所述基因在应答元件的控制下；和

2)一种蜕皮激素受体复合物，其中包含：

  a)DNA结合域；

  b)配位体结合域；和

  c)反式激活域；和

c)将细胞暴露于所述配位体。

关于通过细胞临时控制多肽生产的优点，本发明在此方面提过了进 一步的优点，由于多肽积聚会损害细胞，因此多肽的表达被限制在短期 内。当外源基因是治疗基因时，上述控制特别重要。可用治疗基因生产 控制所需功能的多肽，如生产糖尿病人需要胰岛素。它们还用来生产有 害或甚至致死的蛋白质，如对癌细胞致死的蛋白质。当生产出的蛋白质 水平对生长或繁殖构成代谢负担时，上述控制也是重要的，例如在转基 因植物中的情形。

编码多种多肽的许多基因组和cDNA核苷酸序列是现有技术中已 知的。与本发明配位体一起使用的外源基因包括编码有价值的生物活性 蛋白质的基因，例如：可从细胞中释放出的分泌蛋白质；可将一种底物 从毒性物质代谢为无毒物质或从无活性物质代谢为有活性物质的酶；调 节蛋白质；细胞表面受体等。有用的基因还包括编码凝血因子、激素如 胰岛素、甲状旁腺激素、促黄体激素释放因子、α和β精子抑制素和人 体生长激素的基因；编码蛋白质如酶的基因，缺少酶会导致出现不正常 状态；编码细胞分裂素或淋巴激活索，如干扰素、粒性白细胞状的巨噬 细胞种群刺激因子、种群刺激因子-1、肿瘤坏死因子和促红细胞生成素 的基因；编码抑制剂物质如α1-抗胰蛋白酶的基因，编码具有药物功能 的物质的基因，如编码白喉和霍乱毒素的基因；等。使用的基因还包括 用于癌症治疗和治疗遗传紊乱的基因。本领域技术人员从事实上所有已 知的基因中可以获得核酸序列资料，且可直接从公共保藏单位，公开所 述序列的研究机构来获得核酸分子或使用常规方法制备分子。

对于基因治疗的用途，本文中所述的配位体可被适于药用的载体吸 收，例如被溶液，悬浮液，片剂，胶囊，软膏，甘香酒剂和注射组合物 等吸收。药用制剂可含有0.01％至99％重量的配位体。制剂可以是单独 或多种剂量形式。在任何特定药用制剂中配位体的量将取决于有效剂 量，即，得到目的基因表达或抑制的所需剂量。

药物制剂适合的给药途径包括口服，经肠，局部(包括经皮，经口 和经舌)，阴道，肠胃外(包括皮下，肌肉内，静脉，表皮，胸膜和硬膜) 和鼻-胃管。本领域技术人员应理解的是，优选的给药途径将依赖于处 理条件，且根据不同因素如赋形剂条件而变化。

本文中所述的配位体还可与其它药用活性化合物结合给药。本领域 技术人员应理解的是本文中与配位体组合使用的药用活性化合物将选 择避免对赋形剂存在有害作用或在化合物之间发生反应的物质。与配位 体组合使用的其它药用活性化合物的实例包括，例如：艾滋病化疗剂， 氨基酸衍生物，止痛剂，麻醉剂，厌食剂，抗酸剂和抗肠胃气胀剂，抗 生素，抗凝结剂，解毒剂，抗纤维蛋白溶解剂，抗组氨剂，抗炎剂，抗 肿瘤剂，抗寄生虫剂，抗原生动物剂，退烧药，抗败血病药，镇痉药， 和抗胆碱能药，抗病毒剂，厌食剂，关节炎药物，生物反应调节物，骨 代谢调节剂，肠排泄剂，心血管病药剂，中枢神经系统刺激剂，脑代谢 增强剂，防耳垢剂，胆碱脂酶抑制剂，感冒和咳嗽制剂，种群刺激因子， 避孕药，植物保护剂，牙制剂，去味剂，皮肤病药，解毒剂，糖尿病药 剂，诊断试剂，腹泻药，多巴胺受体拮抗剂，电解质，酶和消化剂，麦 角制剂，致育因子，纤维补充剂，抗真菌剂，半乳糖抑制剂，胃酸分泌 抑制剂，胃肠道激酶剂，促性腺激素，头发生长刺激剂，补血药，出血 剂，止血剂，组胺，H2受体拮抗剂，激素，高甘氨酸血症药剂，高血脂 药剂，免疫抑制剂，缓泄剂，麻风病药剂，leukapheresis adjunts，肺表 面活性剂，周期性偏头疼药剂，粘液溶解剂，肌肉放松拮抗剂，肌肉放 松剂，麻醉拮抗剂，鼻喷雾剂，恶心药剂，核苷类似物，营养补剂，骨 质疏松制剂，催产素，类副交感神经功能药剂，震颤性麻痹药物，青霉 素助剂，磷脂，血小板抑制剂，卟啉症药剂，前列腺炎类似物，前列腺 炎药剂，质子泵抑制剂，瘙痒精神治疗药物，喹诺酮，呼吸刺激剂，唾 液刺激剂，盐取代剂，硬化剂，皮肤创伤制剂，戒烟助剂，磺酰胺，交 感剂，凝血剂，Tourette′s综合症药剂，震颤制剂，结核病制剂，尿毒症 药剂，尿道药剂，子宫收缩剂，子宫放松剂，阴道药剂，眩晕剂，维生 素D类似物，维生素，和医疗成像用造影剂。在一些情况下，配位体可 以用作药物治疗的辅剂，例如，用于“关闭”产生代谢特定药物的酶的 基因。

对于农业应用，除了上述应用外，本发明配位体还可用来控制杀虫 剂蛋白质如苏云芽胞杆菌毒素(Bt)的表达。上述表达可以是组织或植物 特异性的。另外，特别是当还需要控制植物害虫时，一或多种杀虫剂可 与本文中的配位体组合，由此提供了其它的优点和效果，包括比单独施 用杀虫剂减少使用总量。当使用与杀虫剂的混合物时，在组合物中各种 成分的相对比例将根据对被处理作物、害虫和/或杂草的相对效力和每种 杀虫剂所需使用剂量而确定。本领域技术人员将认识到杀虫剂混合物可 提供如比使用一种农药宽的活性谱的优点。在组合物中与本文所述配位 体混合使用的农药的实例包括杀真菌剂，除草剂，杀虫剂，杀螨剂和杀 生剂。

使用常规方法可将本文中所述的配位体水喷雾液施用到植物叶面 上，上述常规方法包括高容量喷雾，低容量喷雾，吹雾和飞机喷雾。稀 释和使用剂量将根据使用设备的类型，所需使用的方法和频率和配位体 的施用剂量而确定。在喷雾桶中还可加入其它所需助剂，例如所述助剂 包括表面活性剂，分散剂，扩展剂，粘合剂，防泡剂，乳化剂，和在 McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents，McCutcheon′s Emulsifiers and Detergents/Functional Materials，和McCutcheon′s functional Materials(Mc出版公司(新泽西)的McCutcheon分社按年度出版)中所述 的其它类似物质。在使用前，配位体还可与肥料或肥料物质混合。配位 体和固体肥料物质还可在混合设备中混合，或它们可与肥料在颗粒制剂 中混合。所使用肥料的相对比例只要适于作物和被处理的杂草即可。本 文所述的配位体通常含有5％至50％的肥料组合物。上述组合物提供的 肥料物质促进所需植物的快速生长，同时控制基因的表达。

本发明配位体是已知化合物或本领域技术人员采用美国专利US 5,117,057，US5,530,028，和US5,378,726中所述方法简单制备的化合 物。典型的使用两步方法。第一步，式II的取代苯甲酰氯与式III的取 代肼反应得到式IV的单酰基肼。在第二步中，式IV的单酰基肼与式V 所示另一苯甲酰氯反应，得到式I化合物。

下述实施例证明了本发明配位体活性。

评价了下述配位体和对比配位体： 配位体     R1     R2     R3     3-     R4     5-     R5     4-     R6   CE-1     H     H     Et     Me     Me   CE-2     H     H     H     H     H   CE-3     1     Et   OMe     H    OMe     H     2     Me     -OCH2CH2O-     Me     Me     3     Me   OMe     H     Me     Me     4     Et   OMe     H     F     F     5     Et   OMe     H     Me    Me     6     Me   OEt     H     Me    Me     7     Et     -OCH2CH2O-     Me    Me     8     Et     -CH2CH2O-     Me    Me     9     Me   OMe     H     Cl    Cl     10     Et   OMe     H     Cl    Me     11     i-Pr   OMe     H     Me    Me     12     Et   OEt     H     Me    Me     13     Et   OMe     H     Cl    Cl     14     Me   OH     H     Me    Me     15     Me   OH     H     Me  CH2OH     17     F    H     Et     Me    Me     18     Me   OMe     H    OMe    OMe   Me

CE-1＝tebufenozide

CE-2＝1，2-二苯甲酰基-1-叔丁基肼

CE-3＝muristerone A

基因构建体

pVgRXR(Invitrogen Corp.，Carlsbad，California)是一种8728kb质 粒，它表达VgEcR和RXR形成改性杂二聚体报告基因(参见No，D.， 等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，3346-3351)。蜕皮激素受体 (VgEcR)是从天然果蝇蜕皮激素受体衍生来的，并变成了含有VP16反 式激活域(参见：Cress，W.D.，和Triezenberg，S.J.(1991)，Science 251，87-90；Sadowski，I.，等人(1988)Nature 335，563-564；Triezenberg， S.J.，等人.(1988)，Genes Dev 2，718-729；Triezenberg，S.J.等人(1988)， Genes Dev 2，730-742)。RXR是USP(超气门)的哺乳动物的同源物，USP 是果蝇蜕皮激素受体的天然配偶体(参见Yao，T.-P.，等人，(1993)，Nature 366，476-479；Yao，T.-P.，等人，(1992)，Cell 71，63-72)。VgEcR DNA结 合域的P-box区被改性了，以识别杂合蜕皮激素应答元件，后者由一个 葡糖类皮质激素应答元件(参见：Umesono，K.和Evans，R.M.(1989)， Cell 57，1139-1146)半位点和一个天然蜕皮激素应答元件半位点组成。 这种杂合应答元件降低与farsenoid X受体任何相互作用的可能性，后者 可结合到天然蜕皮激素应答元件(EcRE)上。细胞肥大病毒增强子-启动 子驱动VgEcR的表达，且劳氏肉瘤病毒启动子驱动RXR表达。载体 pIND(Invitrogen Crop.)是一种以pcDNA 3.1为基础的5024bp载体。它含 有五个杂合E/GRE，后者由从pVgRXR表达的被改性蜕皮激素受体和 一个最小热休克启动子识别(参见Yao，T.P.，等人，(1993)，Nature， 366，476-479)。pIND/lacZ(Invitrogen Crop.)是一种8170bp的质粒，它含 有β-半乳糖苷酶基因作为报告基因。pIND/lacZ和pVgRXR的共转染导 致在加入蜕皮激素兴奋剂如muristerone A时诱导β-半乳糖苷酶的表 达。报告质粒pIND/luc是通过将作为Nhe I-BamHI片段的来自 pGL3(Promega/E1741)的萤火虫荧光素酶基因亚克隆入pIND，接着用 NheI和BamHI消化构建成的。 保持哺乳动物细胞系和转染

将CHO细胞(ATCC#CCL-61)保存在F-12营养混合物中(Ham的介 质)(Gibco/BRL，11765-054)，其中补加有10％胎牛血清(FBS，完全培养 基；Gibco/BRL，16000-036)。这些细胞保持在37℃，5％二氧化碳和95 ％空气中。

将CHO细胞接种于12-孔组织培养板中，浓度为每孔每毫升 0.5×105个细胞。脂质体Pfx-8(Invitrogen，T930-18)用来瞬时性地转染可 诱导的蜕皮激素表达系统(Invitrogen目录K1000-01号)。可诱导的蜕皮 激素表达系统由编码受体亚单元的pVgRXR，和pIND/lacZ或pIND/luc 组成，其含有应答元件和分别编码β-半乳糖苷酶或荧光素酶的报告基 因。接种细胞24小时后，在灭菌水中用0.5mg/ml的VgRXR和0.5mg/ml pIND/lacZ或pIND/luc DNA来制备脂质体/DNA溶液。在消毒的 17×100mm聚苯乙烯试管中用1.5ml的Opti-MEM培养基(Gibco/BRL， 31986)稀释36μl的Pfx-8。将6μl DNA质粒母液与1.5ml的Opti-MEM 培养基在另一个聚苯乙烯试管中混合。将DNA和脂质体溶液合并，得 到3ml的转染溶液(足够一个处理的三次重复)。用磷酸缓冲液冲洗细胞 三次(PBS；Gibco/BRL，14190-144)，通过将培养基从细胞中吸出。向 每孔加入1ml转染溶液。将细胞温育四小时，并将转染培养基用同样体 积的完全培养基置换。继续温育20小时。 稳定转化的哺乳动物细胞系

用pVgRXR和pIND/LacZ(SPI)(Invitrogen Corp.)稳定转化的CHO 细胞保存在含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、300μg/ml Zeocin(Invitrogen Corp.)和300μg/ml潮霉素B.的Hams F-12培养基中。由于3个顺式作 用SPI元件的存在，pIND载体的替代物pIND(SPI)可被诱导至完全表达 水平，其水平高于pIND水平的5。基础表达水平也相应较高。 用配位体处理

分别在乙醇和丙酮中制备muristerone A和本发明非甾体配位体的 母液(10-2M)，并在-20℃储藏。转染24小时后，向每个1ml细胞培养物 孔加入最终浓度10μM(10-5M)的供试化合物。将10μM浓度的 Muristerone A(Sigma M7888)用作阳性对照。单独的丙酮用作阴性对照。 报告基因检测

在用供试配位体处理瞬时转染细胞24-48小时后或处理稳定转化 的细胞系24小时后评价报告基因表达。β-半乳糖苷酶或是通过将固定 细胞染色测定或在细胞溶解产物中测定酶活性。β-半乳糖苷酶催化β- 乳糖苷，X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖吡喃苷)的水解，在固定的 细胞中生成蓝色(Invitrogen，K1465-01)，在显微镜下可看到。另外，可 用报告细胞溶解缓冲液(RLB；Promega/E397A)溶解细胞，应用化学发光 底物，Galacto-Star(Tropix/BM100S)测定β-半乳糖苷酶活性。每个12- 孔板中的细胞用250μl的RLB溶解。20μl的各提取物用100μl的底 物测定。

为了测定荧光素酶活性，用PBS冲洗细胞两次，每孔用250μl RLB 溶解细胞。10分钟后，在-80℃下冷冻培养板10分钟，并使之恢复到 室温。20μl细胞溶解物样品与100μl荧光素酶检测试剂(Promega， E1500)混合。对β-半乳糖苷酶和荧光素酶进行检测。在室温下，用装有 释放底物的自动注入器的DYNEX MLX微滴定板荧光计测定荧光。 从Kc果蝇细胞制备胞质蜕皮激素受体提取物

来源于果蝇胚的双翅目细胞系Kc167(参见：Echalier，G.和 Ohanessian，A.(1969)C.R.Acad.Sci.，268，1771)从Peter Cherbas博士 处得到(印第安纳大学)并根据说明保存(Cherbas，L.，等人，(1994)，Method sin Cell Biology，44，161-179)。在室温下，于700xg离心400ml的Kc 细胞培养物(3x107细胞/ml)10分钟，得到细胞团。吸走上清液，将细胞 团再次悬浮于70ml的冷TM缓冲液中(10mM Tris，5mM MgCl2，1mM DTT，pH7.2)。在冰中培育10分钟后，在2,300xg下离心。去掉上清 液。在-20℃冷冻细胞团1小时。将冷冻的细胞团在冰上缓慢解冻，并 在冷的Potter-Elvehjem匀浆器中匀浆，在Caframo匀浆器马达上使用聚 四氟乙烯杵，设置为500与10次上、下冲程，4℃。将浆液在最大速转 子中，以100,000xg离心60分钟。含有胞质蛋白质提取物的上清液用 T缓冲液(10mM Tris，1mM DTT，pH7.2)稀释，得到蛋白质的浓度为 5mg/ml。将此提取物立即用来作配位体结合检测。 从印度谷螟(Plodia interpunctella)细胞制备核内蜕皮激素受体

从鳞翅目印度谷螟成虫翅膀中域获得的IAL-PID2细胞系，是从 H.Oberlander处得到的并根据说明保存(Lynn，E.E.和Oberlander， H.(1983)，J.Insect Physiology，29，591-96)。将300ml印度谷螟细胞静 止相培养物在700xg下离心10分钟得到细胞团。吸走上清液，将细胞 团再次悬浮于35ml TMT缓冲液中(TM缓冲液和0.1％ Triton X-100)。用 20次上下冲程的Dounce匀浆器在冰上匀浆悬浮液。在冰中培育匀浆液 10分钟，然后在900xg下离心15分钟。将细胞团再悬浮于15ml TM缓 冲液中，并在2,300xg离心。在TMK缓冲液(TM缓冲液和800mM KCl) 中提取这种细胞团，用玻璃棒压榨细胞团，直到形成明胶样浆液，在冰 中培育15分钟。将浆液在最大速转子中，以100,000xg离心60分钟。 将由核提取物组成的上清液，在10DG脱盐柱上脱盐(Bio-Rad，732- 2010)，用T缓冲液平衡。溶液用含有1mM DTT的T-缓冲液，将在核 提取物中的总蛋白浓度调节到5mg/ml。 制备细菌谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质

云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)的仅含有CDEF区的细菌谷 胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白质EcR(CfEcR)和超气门蛋白质(CfUSP) 也用来进行放射性配位体置换检测。使用含有BamH1和EcoRI位点的 引物进行PCR扩增后，编码CfEcR的CDEF区的cDNA被构建(Perera SC，M Sundaram，Krell PJ，Retnakaran A，Dhadialla TS，SR Palli，1999 Arch.Insect Biochem.Physiol.41，正在付印中)。用BamHI和EcoRI消化 PCR产物，并克隆入从Pharmacia Biotech获得的载体pGEX-3X中。使 用含有BamHI和EcoRI位点的引物扩增CfUSP编码区，并克隆入从 Pharmacia Biotech获得的pGEX-2T载体中。使使用两种载体中的一种 转化的大肠杆菌生长，并如Pharmacia Biotech GST-技术简报中的详述 方法生产融和的蛋白质。 蜕皮激素受体竞争结合检测

3H松甾酮A，一种有效的植物蜕皮甾体，(66,000dpm，比活性 170ci/mmol；NEN Life Science Products，Boston，Massachussetts)与100 μl Kc胞质或谷螟核内蜕皮激素受体提取物在0.8×50mm玻璃试管中混 合，在存在或不存在10μM未标记20-羟基蜕皮激素(20E)下分别评价总 的和非特异的与氚标记的松甾酮A的结合。对Kc胞质提取物的试管进 行涡旋并在4℃培育过夜，或使谷螟核内提取物进行1.5小时的结合反 应以到达平衡。在结合平衡结束时，分别向Kc或谷螟提取物反应中加 入冰冷的600μl或300μl炭包被的葡聚糖溶液(500mg的Sigma HCl-冲 洗活性炭，50mg药用葡聚糖T70，50ml T-缓冲液)，以此将与氚结合的 松甾酮与未结合的那些分离开。将试管短时间涡旋，并在7,000xg下离 心得到碳团。用于Kc或谷螟提取物的反应上清液中含有600μl或300 μl与氚标记松甾酮A结合的蛋白质。将上清液吸入装有5ml闪烁化合 物液体(ReadySafe，Beckmann)的闪烁试管中。涡旋混合物，用60％氚 计数效率的Beckman LS500液体闪烁计数器测定总的或非特异性的结 合放射活性。 测定3H-松甾酮A的竞争抑制剂Kd值，其在Kc或谷螟细胞提取物和细 菌融合蛋白质中结合于蜕皮激素受体复合物

抑制50％的氚标记松甾酮A结合的竞争剂的浓度(IC50)的测定是通 过在一定浓度的供试化合物(0.1nM至10μM)存在下，培养Kc或谷螟 核提取物或生产CfEcR(CDEF)-GST和CfUSP-GST融合蛋白质的细菌提 取物与3H-松甾酮A(66,000dpm每反应)。在使用细菌融合蛋白质的结合 反应中，每个结合反应中分别包括20或1μl生产CfEcR(CDEF)-GST 或CfUSP-GST融合蛋白质的细菌提取物。检测条件和对总的和非特异 性结合的测定如上所述。在溶剂中竞争化合物的体积，象20E或溶剂本 身一样，通过使用100倍浓缩母液(即，稀释母液100倍)，保持为1％ 总反应体积。如上述进行其余的检测。每个反应对每个浓度每个供试化 合物进行一次重复。3H-松甾酮A的特异性结合的确定是从总量(无竞争 者)中减去非特异性结合(在10μM 20E存在下获得)或竞争的放射活性 得到的。每个试验化合物的数据用IGRO Pro软件分析(WaveMetrics， Lake Oswego，OR)计算IC50值。对试验化合物的结合常数(以μM表 示的Kd)通过结合Cheng-Prusoff公式(参见：Munson PJ.和Rodbard D.(1980)Anal.Biochem.107，220-239)在IGOR Pro软件中计算。

表1-3归纳了获得的数据：

                              表1     配位体     Kc   Log(1/EC50)     谷螟    log(1/IC50)     细菌     CfECR    Log(1/IC50)      CE-1      6.55      8.7      CE-2      5.52      6.48      CE-3      7.96       1      7.36      8.52     2     7.16     9.14     3     6.73     9.04     8.76     4     7.41     8.51     5     7.70     9.49     6     8.82     7     8.78     8     8.85     9     9.00     10     8.80     11     8.93     12     8.10     9.63     13     7.44     9.06     14     8.61     15     8.49     17     9.24     18     8.82

                           表2

在瞬时转染的CHO细胞中荧光素酶活性     配位体    10μM  荧光素酶活性1     诱导比2 Kc细胞的Kd    (nM)     无     42     CE-1     89     2     110     CE-2     36     1     2000     CE-3     316     8     2.3     CE-4     418     10     0.7      1     275     7     39.5      2     204     5     60      3     324     8     124      4     251     6     47      5     313     8     13.3      12     305     7     5.3      13     226     5     65

CE-4＝松甾酮A

1以相对光单位(RLU)表示-两个重复样品的平均

2存在或不存在配位体时的RLU比例

                   表3

在稳定转化的CHO细胞中β-半乳糖苷酸基因活性     配位体     10mM  β-半乳糖苷酶      活性1     诱导比2   Kc细胞Kd     (nM)     无     200     CE-1     323     2     192     CE-2     145     1     2000     CE-3     9830     49     2     CE-4     10386     52     0.7     1     1123     6     40     2     536     3     47     3     681     3     124     4     1963     10     26     5     11599     58     13     12     9830     49     5     13     6667     33     24

1以相对光单位(RLU)表示-两个重复样品的平均

2存在或不存在配位体时的RLU比例

上述数据表明，在相当或少于上述已知化合物CE-1和CE-2浓度 下，本发明配位体能够诱导基因表达。

除了改进基因表达调整能力外，由于其具有优越的传输和代谢性 质，预期对于整体植物和动物本发明配位体具有较大的活性。下述实施 例证明在植物中与已知配位体(CE-1)相比，植物促进本发明配位体(配位 体3)的传输。 转层运动

进行研究以评价两种化合物在棉叶上的转层运动，使用新生甜菜夜 蛾(Spodoptera exigua)作为模型系统。

评价两个处理：CE-1的乳油和配位体3(分别5％和19％)浓度， 以100μg/ml模拟喷雾桶浓度。然后将上述处理与已知具有极好转层运 动的化学标准(齐墩螨素苯甲酸酯，0.16％EC[20μg/ml]，Merck & Co.) 和与未处理植物比较。

处理四周大小的棉花(Gossypium hirsutum L.品种Stoneville)植株， 每个处理是用相应的处理通过涂刷单独重复叶/植物顶部表面进行。将植 物放置在控制环境的温室中，保持在27℃，直到使用。残留作用是通过 用新生甜菜夜蛾攻击处理和未处理叶片而评价，在3天，即处理后的第 1、7、14天(DAT)进行评价。在抽样的各天，从每五个重复植物中切下 单独处理叶/植物。叶片然后固定在塑料培替氏培养皿(10×20mm)的顶盖 上，然后用10个一龄幼虫侵染。一龄甜菜夜蛾幼虫通常从叶的下表面 取食，且通常不贯穿到达上表面而全部取食。因此，由于化合物仅施用 到叶顶表面，物质的转层运动将影响幼虫。侵染4天后记录幼虫死亡率。 另外，观察活虫的对蜕皮加速化合物特征的表现(形成新的几丁质和/或 蜕落头顶膜)。每个处理重复5次。

将死亡百分率数据转换为平方根，然后使用JMP(Ver.3.2.1)通过 ANOVA分析。通过Tukey-Kramer试验(P＝0.05)分离平均数。

在杀死甜菜夜蛾幼虫方面，结果显示由于转层运动，配位体3明显 地比CE-1有效，因此，预期在植物上有较高的系统性作用。

                        表4

                      死亡百分率

                         浓度           施药后天数 处理                       (μg/ml)    1        7       14 CE-1，5％乳油                  100     2.5      0.0    22.7 3，19％乳油                   100    100.0     93.8   100.0 齐墩螨素苯甲酸酯0.16EC+AG-98  20     100.0     100.0  100.0 未处理对照                           11.6      6.5    8.1

AG-98＝0.12％的非离子表面活性剂Latron AG-98表面活性剂(罗姆 和哈斯公司)

本申请是U.S.申请号09/210,010，申请日1998年12月11日的申 请的后续申请。