抗绿盲蝽蜕皮激素受体蛋白的单克隆抗体及其用途
阅读：350发布：2020-05-16
专利汇可以提供抗绿盲蝽蜕皮激素受体蛋白的单克隆抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种特异性结合绿盲蝽AlEcR‑A蛋白的单克隆 抗体 。本发明还公开了一种小鼠杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C2016206。本发明制备的单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及AlEcR‑A重组蛋白特异性结合。本发明还公开了单克隆抗体在绿盲蝽综合治理方面的应用。本发明还公开了一种检测 试剂 盒 ，该检测试剂盒包含上述的单克隆抗体。，下面是抗绿盲蝽蜕皮激素受体蛋白的单克隆抗体及其用途专利的具体信息内容。
抗绿盲蝽蜕皮激素受体蛋白的单克隆抗体及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 从上世纪90年代年转Bt棉花的在我国大面积商业种植以来，其靶标磷翅目害虫如棉铃虫(Helicoverpa armigera H.)等得到有效控制，棉田化学农药频率及使用量大幅度降低，从而使得棉田害虫的生态位发生了一系列的演替变化，绿盲蝽(Apolygus lucorum M.)已上升成为我国长江、黄河流域及新疆棉区上的主要致灾性害虫。目前，防治绿盲蝽还主要以化学农药为主，但也随之带来了诸多问题，如抗药性的产生带来防效的下降、污染环境及食品安全等。因此绿盲蝽的防控减灾亟需开拓新靶标的有效防控技术。与化学农药相比，昆虫生长调节剂类杀虫剂具有高毒力且与环境友好的优点，其作用机理多为干扰昆虫蜕皮激素或保幼激素，导致昆虫不能蜕皮而死亡。类固醇激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)是昆虫蜕皮激素的主要活性形式，在昆虫的变态发育过程中起着重要的调控作用。已有研究表明，昆虫蜕皮激素受体(ecdysone receptors，EcR)为20E的作用靶标受体，在蜕皮激素信号传导中扮演着关键角色，已成为开发新型农药的重要靶标。
[0003] 因此研究一种抗绿盲蝽蜕皮激素受体蛋白的单克隆抗体在害虫综合治理显得尤为重要。
发明内容
[0004] 发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种特异性结合绿盲蝽AlEcR-A蛋白的单克隆抗体。本发明还要解决的技术问题是提供了一种小鼠杂交瘤细胞株。
[0005] 本发明还要解决的技术问题是提供了上述单克隆抗体在制备用于检测绿盲蝽AlEcR-A蛋白的检测工具中的应用。
[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供了上述单克隆抗体在绿盲蝽综合治理方面的应用。
[0008] 技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种特异性结合绿盲蝽AlEcR-A蛋白的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C2016206的小鼠杂交瘤细胞株产生。
[0009] 本发明内容还包括一种小鼠杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC NO：C2016206，该菌株分类命名为杂交瘤细胞株8H7，已于2016年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072。
[0010] 本发明所述的单克隆抗体的制备方法包括：
[0011] 1、pCzn1-AlEcR-A重组表达质粒的构建；
[0012] 根据AlEcR-A的基因序列(SEQ ID NO：1)设计引物进行PCR扩增，同时引入限制性内切酶位点Nde I和Xba I，并在末端引入His标签，插入表达载体pCzn1质粒，构建pCzn1-AlEcR-A重组表达质粒。
[0013] 2、pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的表达及纯化；具体内容参见实施例1。
[0014] 3、单克隆抗体的制备；具体内容参见实施例1。
[0015] 本发明内容还包括上述的单克隆抗体在制备用于检测绿盲蝽AlEcR-A蛋白的检测工具中的应用。
[0016] 其中，上述检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
[0017] 本发明内容还包括上述的单克隆抗体在绿盲蝽综合治理方面的应用。
[0018] 本发明内容还包括一种检测试剂盒，所述试剂盒中含有所述的单克隆抗体。
[0019] 其中，上述检测试剂盒为免疫组化检测试剂盒或免疫荧光检测试剂盒。
[0020] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明的AlEcR-A基因在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55kD的蛋白，并且该重组蛋白主要以包涵体形式存在，收集含有目的基因的菌株进行Ni-IDA亲和层析，最后在55KD附近仅出现1条清晰的特异性条带，表明已得到纯化的靶蛋白。本发明进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备，获得了1株能稳定传代并分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株，命名为8H7，该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及AlEcR-A重组蛋白特异性结合。附图说明
[0021] 图1部分序列比对结果图；
[0022] 图2酶切鉴定电泳图；M：DL10000；1：:酶切前质粒2：酶切后质粒；
[0023] 图3pCzn1-AlEcR-A诱导表达的SDA-PAGE分析；M:蛋白分子量标准物；1:对照(无IPTG诱导、沉淀)；2:37℃过夜培养(总蛋白1)；3:37℃过夜培养(总蛋白2)；4:37℃过夜培养(沉淀)；5:37℃过夜培养(上清液)；
[0024] 图4pCzn1-AlEcR-A蛋白的分子筛纯化；
[0025] M、蛋白分子量标准物；1、未纯化的包涵体；2、未与Ni柱结合的杂蛋白；3、与Ni柱结合的目的蛋白；
[0026] 图5单克隆抗体的Western-blot特异性分析；M、蛋白分子量标准物；1、3龄绿盲蝽若虫；2、重组蛋白pCzn1-AlEcR-A；
[0027] 图6应用制备的单克隆抗体分析蜕皮激素诱导下AlEcR-A的蛋白表达差异。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0029] 本发明中所采用的主要试剂和耗材：pCzn1质粒(南京钟鼎生物技术有限公司购买)、TOP10菌株(南京钟鼎生物技术有限公司购买)、Arcticexpress菌株(南京钟鼎生物技术有限公司购买)、限制性内切酶(购自TaKaRa)、Pfu DNA聚合酶(购自zoonbio，货号PC12)、Protein Marker(Thermo公司)、福氏佐剂(购自Sigma公司)、IPTG、Acr、Bis、Tris(购自Sigma公司)、SDS(购自Amresco公司)、TEMED(购自BIO-RAD公司)、Tyrptone、Yeast Extract(购自OXOID公司)、0.22μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司)、Ni2+IDA亲和层析胶购买于Novagen公司、Agarose(购自上海基因公司)、DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司)、
[0030] 高糖DMEM培养基(购自Gibco公司)、细胞计数板(购自Improved Neubauer)、液体石蜡(南京钟鼎生物技术有限公司)、PEG(购自sigama)、96细胞培养板(购自Costar，批号3599)、PCR管、枪头等耗材(购自Fisher公司)、6～8周龄雌性BALB/c小鼠购于扬州大学兽医学院，20E为Sigma公司产品，SYBR Premix Ex Taq Kit为TaKaRa产品，iCycler iQ为Bio-Rad产品，其它试剂均为国产分析纯或化学纯；
[0031] Allegra 21R台式高速冷冻离心机(美国BECKMAN公司)、台式高速离心机(德国SORVAL公司)、Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统(美国BIO-RAD公司)、PTC-200基因扩增仪(美国MJ Research公司)、320-S pH计(美国Mettler Toledo公司)、AR5120电子天平(美国AHOM S公司)、MultiTemp III恒温水浴锅、HoferΜV-25紫外透射仪(美国Amersham Pharmacia公司)、雪花状制冰机(日本SANYO公司)、JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所)、超净工作台(中国苏净集团)、NANODROP2000(Thermo公司)。
[0032] 本实验初始绿盲蝽采自早春的江苏大丰及东台蚕豆(Vicia faba L.)田，于室内用四季豆(Phaseolus vulgaris L.)豆荚继代饲养，饲养条件为温度(25±1)℃，相对湿度70％±5％，光周期12L﹕12D，成虫期补充10％蜂蜜水。
[0033] 实施例1抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的制备
[0034] 一、pCzn1-AlEcR-A重组表达质粒的构建
[0035] 采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，将基因AlEcR-A通过克隆位点Nde I和Xba I连入表达载体pCzn1；获得的重组质粒pCzn1-AlEcR-A转入TOP10克隆菌株；挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期序列进行比对，截取部分比对序列如图1所示；测序结果表明，T4DNA成功连接了经双酶切后的表达载体pCzn1及含有AlEcR-A序列的T载体，说明AlEcR-A已经亚克隆到pCzn1载体上，将其命名为pCzn1-AlEcR-A(图2)；同时进行质粒酶切鉴定(AlEcR-AD260/OD280:1.84)酶切鉴定)，酶切体系如下：
[0036]
[0037] 酶切鉴定结果如图2。将测序正确的重组质粒pCzn1-AlEcR-A转化至大肠杆菌Arctic express表达菌株中：将重组质粒pCzn1-AlEcR-A 1μl加入100μl感受态细胞中，置冰上20min；42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜得到的阳性克隆即为重组基因工程菌。
[0038] 测序结果拼接如下所示：单划线区域AlEcR-A基因区域。灰色区域为酶切位点；
[0039] TGCATCACCGCATGCGTGCTATGCACATCCAATTGTGGAGCGGATACATTGATGTGCTAGCGCATATCCAGTGTAGTAGGCAGTCCTCAGAGTTATCGTTGATACCCCTCGTAGTGCACATTCCTTTAACGCTTCAAAATCTGTAAAGCACGCCATATCGCCGAAAGGCACACTTAATTATTAAGAGGTAATACACCATGGGCGAGGAGAAGCGGGCAGACGATGACTGGATGGTGAGCGGTGGCCCCCCCAGAAACTATCAGACCAACGGGGGCTATCCGTCCCCAACTATGTCCAGCAACAGCTACGACCCTTACAGCCCCAACTCTAAACTAGGTCGTGAGGATTTGAGCCCGCCCAACTCGCTAAACGGCTACAGCGCCGATAGCTGTGATGGCTCGAAGAAGAAGAAGGGGACGGCCACCCGGCAGCAAGAAGAGCTCTGCCTCGTTTGCGGAGATCGAGCTTCGGGTTACCATTATAATGCTCTCACGTGCGAGGGCTGTAAGGGGTTCTTTAGACGGAGTATAACGAAAAACGCGGTCTACCAGTGCAAGTACGGGAACAACTGTGAAATCGACATGTACATGCGGCGGAAATGTCAGGAATGTCGGCTCAAAAAGTGCCTCAGCGTCGGGATGAGGCCTGAATGTGTGGTACCGGAGTACCAATGCGCGGTGAAACGAAAAGAGAAGAAGGCGCAGAAGGAGAAGGACAAGCCTGTGAGCACGACAACCATCCCCCCTGAGGCAGTCAAACCTGAGCCTGAACCCCACAGGGTCAGTTTCACATCAAGCCTCTTTCAATCTGTGATTAAAGAGCCAACCAAACTGTTGCCGGAAAGCGGTGCTGAAGTTGCGCTCAAACATTCGCCCCCCTACGGCATAAAACCGGTGAGCCCTGAGCAGCAGGAACTCATCAACAGGCTCGTCTACTTTCAAAGCGAGTACGAACACCCCTCGGAGGAAGATGTCCGGAGAATTAACTCACCTAACGAAGATGAGGAGCAGATAGACTTTAGGTTTAGGCATATAACAGAAATCACAATACTCACCGTTCAACTTATCGTAGAGTTCGCGAAGAGGCTGCCGGGTTTCGATAAAATTATTAAAGAAGATCAAATAGCCTTACTAAAGGCGTGTTCAAGCGAAGTGATGATGCTGCGGACAGCGCGGAAGTACGACGCGAGTACGGACTCCATAGTGTTCGCGGACAACCAGCTGTACTCTCGAGAGTCGTACAACCTTGCCGGAATGGGGGACGTGGTCGATGACATCCTCAAGTTCTGTCGGCACATGTACCGAATGAAGGTTGACAACGCCGAGTACGCCCTCCTTACCGCCATCGTTATCTTTTCGGAGAGACCGTCCCTCATGGAGAGTTGGAAAGTCGAAAAGATCCAGGAGACCTACCTAGAAGCCCTCAAGTCCTACGTGGACAACCGAACGAAGTCTCGGTCTCCCACACTCTACGCTAAACTTCTTTCTGTCCTCACGGAGCTTCGAACCCTCGGAAACCAAAACTCCGAAATGTGCTTCTCCCTGAAACTTCAGAACAAGAAGCTACCGCCCTTCCTAGCCGAGATCTGGGACGTCAACTCGTAA TAGGTAATCTCTGCTTAAAAGCACAGAATCTAAGATCCCTGCCATTTGGCGGGGATTTTTTTATTTGTTTTCAGGAAATAAATAATCGATCGCGTAATAAAATCTATTATTATTTTTGTGAAGAATAAATTTGGGTGCAATGAGAATGCGCAGGCCGTTA
[0040] 二、pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的表达及纯化
[0041] 1、IPTG诱导pCzn 1-AlEcR-A载体融合蛋白的表达
[0042] 1)挑取上述转化平板上的阳性单克隆接种于含50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；
[0043] 2)次日按1：100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；
[0044] 3)取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
[0045] 4)向步骤3)剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导AlEcR-A His融合蛋白表达；
[0046] 5)取出步骤4)诱导后得到的培养物1ml，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
[0047] 6)进行12％SDS-PAGE分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图3所示。SDS--1PAGE电泳显示，经0.5mmol·L IPTG诱导的pCzn1-AlEcR-A重组质粒可特异性表达一个约
55kD的蛋白，与理论大小相符，说明AlEcR-A基因已在大肠杆菌Arctic Express细胞中成功表达，而不经IPTG诱导的pCzn1-AlEcR-A重组质粒无此条带的蛋白表达。此外，此诱导表达的重组AlEcR-A蛋白主要分布在沉淀体中，上清液中几乎没有表达，说明AlEcR-A重组蛋白主要以包涵体的形式存在。
55kD的蛋白，与理论大小相符，说明AlEcR-A基因已在大肠杆菌Arctic Express细胞中成功表达，而不经IPTG诱导的pCzn1-AlEcR-A重组质粒无此条带的蛋白表达。此外，此诱导表达的重组AlEcR-A蛋白主要分布在沉淀体中，上清液中几乎没有表达，说明AlEcR-A重组蛋白主要以包涵体的形式存在。
[0048] 2、融合蛋白的Ni柱亲和纯化
[0049] 1)将上述诱导表达后的培养菌液低温6000g离心10min，菌体在lysis buffer中进行沉淀重悬与超声破碎；将超声破碎的细胞裂解液于4℃，10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH＝8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH＝8.0)，按比例溶解包涵体，将上述溶液滴加20mM Tris-HCL及5mM EDTA Buffer(PH＝7.8)缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于PBS(pH＝7.4)溶液中透析过夜。
[0050] 2)利用低压层析系统，将上述包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；
[0051] 3)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
[0052] 4)再用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
[0053] 5)最后用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
[0054] 6)将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜，蛋白定量试剂盒测定该蛋白浓度为1.3mg/mL；
[0055] 7)取适量透析液进行12％SDS-PAGE分析，结果如图4所示。利用SDS-PAGE电泳分析了经Ni柱亲和纯化后pCzn1-AlEcR-A基因重组蛋白的纯化情况。经缓冲液洗脱、透析后，上诉含有pCzn1-AlEcR-A基因重组蛋白的包涵体纯度有较大程度的改善，仅在55kD附近有一条明显的特异性条带，并未见其他条带，说明已得到纯化的AlEcR-A重组蛋白。蛋白理论分子量为：54.95KD左右(含HIS-tag)，翻译后氨基酸序列如下：
[0056] MNHKVHHHHHHMMGEEKRADDDWMVSGGPPRNYQTNGGYPSPTMSSNSYDPYSPNSKLGREDLSPPNSLNGYSADSCDGSKKKKGTATRQQEELCLVCGDRASGYHYNALTCEGCKGFFRRSITKNAVYQCKYGNNCEIDMYMRRKCQECRLKKCLSVGMRPECVVPEYQCAVKRKEKKAQKEKDKPVSTTTIPPEAVKPEPEPHRVSFTSSLFQSVIKEPTKLLPESGAEVALKHSPPYGIKPVSPEQQELINRLVYFQSEYEHPSEEDVRRINSPNEDEEQIDFRFRHITEITILTVQLIVEFAKRLPGFDKIIKEDQIALLKACSSEVMMLRTARKYDASTDSIVFADNQLYSRESYNLAGMGDVVDDILKFCRHMYRMKVDNAEYALLTAIVIFSERPSLMESWKVEKIQETYLEALKSYVDNRTKSRSPTLYAKLLSVLTELRTLGNQNSEMCFSLKLQNKKLPPFLAEIWDVNS
[0057] 三、单克隆抗体的制备
[0058] 1、动物免疫
[0059] 选取5只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将上述纯化后的AlEcR-A蛋白与弗氏佐剂等体积混合，于腹部和背部皮下注射50～100μg/只，每隔14d用弗氏不完全佐剂乳化重组蛋白AlEcR-A免疫2次，2-3周加强免疫一次(剂量加倍)。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对AlEcR-A蛋白的效价，待效价大于1:10,000(4免结果见表1)，用四免后抗血清进行western blotting检测(筛选结果见图5)，针对重组蛋白呈阳性，则选择1-2只阳性小鼠进行细胞融合安排。
[0060] 4免后小鼠血清效价ELISA结果：经免疫后小鼠均产生高效价抗体，具体结果如下：
[0061] 包被抗原：蛋白AlEcR-A
[0062] 包被浓度：5μg/ml，100μl/孔
[0063] 包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
[0064] 二抗：羊抗鼠-HRP，1/5000
[0065] 表1:4免后鼠抗血清间接Elisa结果
[0066]
[0067]
[0068] 起始稀释度:1:500
[0069] 效价即样品OD/空白OD>＝2.1的最高稀释度。
[0070] 2、细胞融合
[0071] 1)骨髓瘤细胞制备
[0072] 融合前一周，用含10％FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50ml离心管中，1000rpm,5min离心。弃上清，然后再加入20ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。
[0073] 2)脾细胞制备
[0074] 四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100μg。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75％酒精浸泡5min，无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mlDMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次，1000rpm离心5min，收集脾细胞计数。
[0075] 3)细胞融合
[0076] 混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50％PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。1000rpm 5min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基(购买于武汉普诺赛生命科技有限公司)，把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50％以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。
[0077] 3、融合筛选及亚克隆
[0078] 1)融合筛选
[0079] 在检测的前一天，用PBS包被5μg/ml抗原于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100μl/孔进行ELISA检测根据ELISA结果，判断阳性孔(样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。
[0080] 融合筛选结果：选取效价较高的及WB检测阳性的2#小鼠进行细胞融合，经ELISA筛选阳性克隆结果如下表2：
[0081] 包被抗原：蛋白AlEcR-A
[0082] 包被浓度：5μg/ml，100μl/孔
[0083] 包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)
[0084] 二抗：羊抗鼠-HRP，1/5000
[0085] 表2：2#小鼠融合后细胞上清Elisa结果
[0086] ①号板
[0087]
[0088] ②号板
[0089]
[0090] ③号板
[0091]
[0092] ④号板
[0093]
[0094] ⑤号板
[0095]
[0096] 2)亚克隆
[0097] 吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4ml(N是指阳性克隆孔的数量)DMEM培养基，取100μl细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100μl(约2滴)在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。
[0098] 亚克隆细胞定株后结果：选取8株阳性细胞(表2中OD值高的，用灰色区域标示的)进行亚克隆，经ELISA筛选后定11株结果如下表3：
[0099] 包被抗原：蛋白AlEcR-A
[0100] 包被浓度：5μg/ml，100μl/孔
[0101] 包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
[0102] 二抗：羊抗鼠-HRP，1/5000
[0103] 表3：定株后细胞上清Elisa结果：
[0104]细胞株名称 OD值(450nm)
3D6 2.710
3G5 2.388
5D9 2.333
7D9 2.648
7G3 2.816
7G4 3.009
8B8 2.884
8D11 3.243
8H7 3.122
8H9 3.118
8G12 3.043
3D6 2.710
3G5 2.388
5D9 2.333
7D9 2.648
7G3 2.816
7G4 3.009
8B8 2.884
8D11 3.243
8H7 3.122
8H9 3.118
8G12 3.043
[0105] 通过用大肠杆菌表达的重组蛋白pCzn1-AlEcR-A免疫小鼠，经细胞融合10d后，包被抗原后ELISA检测的阳性克隆率均达到了100％，且不同时期收集的杂交瘤细胞上清的OD 450nm值几乎没有变化。得到1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为8H7，该细胞株保藏编号为CCTCC NO：C2016206，已于2016年12月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
[0106] 将此细胞株扩增培养定株，进行抗体的特异性鉴定。
[0107] 4、腹水制备、琼脂糖亲和介质Protein A纯化抗体及抗体鉴定
[0108] 1)、腹水制备
[0109] 从上表3看，这个OD并不是最高的，最高的是8D11，3.243，但是该单克隆细胞8D11细胞融合效果不好，所以选择8H7。最终选择8H7单克隆细胞进行腹水制备，将0.2mL弗氏不完全佐剂注射至小鼠腹腔，于7d后再注入适量的上述阳性杂交瘤细胞后收集腹水。
[0110] 2)、ProteinA纯化抗体
[0111] 将8H7制备得到的腹水进行琼脂糖亲和介质Protein A纯化。取Protein A琼脂糖亲和介质，填装层析柱，将腹水与PBS按1:1混匀后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，隔日进行纯度、浓度和效价检测；其中，抗体浓度：0.5mg/ml；抗体体积：10.0ml。抗体纯度鉴定：纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，参见图6。
[0112] 3)、抗体鉴定
[0113] 抗血清间接ELISA效价检测，具体操作如下：1)根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；2)包被：用PBS包被液将AlEcR-A蛋白按5μg/ml稀释，混匀后加入板条中，每孔100μl，4℃冰箱过夜；其中，包被抗原：AlEcR-A蛋白；包被浓度：按5μg/ml稀释，100μl/孔；包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)；3)封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μl封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次；4)一抗反应：纯化抗体按1/500，2倍稀释，每孔100μl，37℃恒温箱1h；5)二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μl稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗小鼠-HRP，1/5000。37℃恒温箱1小时；6)显色：取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μl TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min；7)终止反应每孔加入100μl 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价(参见表4)。
[0114] 表4抗体间接Elisa结果
[0115]
[0116] 起始稀释度:1:500
[0117] 效价即样品OD/空白OD>＝2.1的最高稀释度
[0118] 4)Western-blot检测单克隆抗体的特异性
[0119] Western-blot测定方法按照Song et al.(2012)的方法进行并做小量常规修改。将原核表达的AlEcR-A重组蛋白及新鲜孵化的绿盲蝽3龄若虫进行SDS-PAGE分析。转印PVDF膜后封闭，一抗为上述AlEcR-A重组蛋白单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠HRP，ECL显色。
[0120] 参见图5，制备的AlEcR-A重组蛋白单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及重组蛋白特异性结合，而与其他蛋白无交叉反应。
[0121] 应用例
[0122] 将制备的AlEcR-A重组蛋白单克隆抗体用于分析蜕皮激素(20E)对AlEcR-A蛋白表达量的影响。随着20E处理时间的延长，绿盲蝽AlEcR-A蛋白表达量呈现出逐渐上升的趋势。此外，与蒸馏水处理组(CK)相比，20E处理的绿盲蝽AlEcR-A蛋白表达量均有一定富集效果。
参见图6。
参见图6。
[0123] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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