胚乳中有效的植物启动子及其用途
阅读：254发布：2022-10-30
专利汇可以提供胚乳中有效的植物启动子及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供包含 植物 有效的启动子序列的材料的组合物，其赋予与它们有效连接的基因选择性地/特异性地胚乳表达，以及此类组合物赋予基因表达的用途，特别在发育的胚乳中赋予基因表达的用途。，下面是胚乳中有效的植物启动子及其用途专利的具体信息内容。
1.分离的启动子或者其活性片段或衍生物，所述分离的启动子或者其活性片段或衍生物能赋予与其有效连接的基因在发育的植物种子的胚乳中选择性地表达，其中所述启动子在其天然情况下赋予基因组基因胚乳选择性地表达或者优先的胚乳表达，所述基因组基因包含选自如下的序列：
(i)SEQ ID NO：1或2中所述的序列；
(ii)编码与由SEQ ID NO：1或2编码的多肽具有至少约50％同一性的多肽的序列，其中所述多肽在发育的种子的胚乳中选择性地表达；
(iii)在至少中等严格条件下与(i)或(ii)项的序列或者其互补序列杂交的序列，其中所述杂交序列在发育的种子的胚乳中选择性地表达；和
(iv)如通过用BLASTN算法，例如用至少-1的核苷酸错配罚分(-q)的同源检索测定的与(i)或(ii)项的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在发育的种子的胚乳中选择性地表达。
2.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物能赋予与其有效连接的基因在单子叶植物的发育的种子中胚乳选择性地表达或者优先的胚乳表达。
3.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其来自单子叶植物。
4.根据权利要求2或3所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述单子叶植物选自小麦、玉米、稻、大麦和高粱，以及它们的组合。
5.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、活性片段或衍生物在从授粉后(DAP)约5天至授粉后至少约25天期间，能赋予与其有效连接的基因胚乳选择性地表达或优先的胚乳表达。
6.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物在营养组织或器官中并不赋予可检测的表达。
7.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物在繁殖组织或器官中并不赋予可检测的表达。
8.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物在花组织或器官中并不赋予可检测的表达。
9.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物在胚中并不赋予可检测的表达。
10.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物在成熟种子的胚乳中并不赋予可检测的表达。
11.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子、片段或衍生物赋予、诱导或活化与其有效连接的基因胚乳特异性表达。
12.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子包含在表4和/或表5和/或表6和/或表7和/或表8中所述的一个或多个核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子包含表1中所述的一个或多个核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中所述启动子包含多个在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中的选自下组的各个元件：ARR1AT元件、ACGTATERD1元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件。
14.根据权利要求13所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中每一元件在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中出现至少2或3或4或5或6次。
15.根据权利要求13所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件和GT1CONSENSUS元件在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中各自出现至少4次。
16.根据权利要求13所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其中ARR1AT元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中各自出现至少4次。
17.根据权利要求13所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其进一步在翻译起始位点上游近端750bp中包含至少一种元件，所述元件选自IBOXCORE元件、MYB2CONSENSUS元件、MYBCORE元件和WRKY71OS元件。
18.根据权利要求13所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其进一步在翻译起始位点上游近端750bp中包含至少一种元件，所述元件选自MYBST1元件、MYBCOREATCYCB1元件和PRECONSCRHSP70A元件。
19.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：
(i)选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8的序列；
(ii)与(i)项的序列互补的序列；
(iii)与(i)或(ii)项的序列具有至少约70％序列同一性的序列；和
(iv)可以使用一个或多个扩增引物从基因组DNA中扩增的序列，其中每一所述引物包含来源于SEQ ID NO：1或2或者其互补序列的至少约12个连续核苷酸长度的序列。
20.根据权利要求1所述的分离的启动子、活性片段或衍生物，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：
(i)选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8的序列；和
(ii)与(i)项的序列互补的序列。
21.表达构建体，其包含与转基因有效连接的根据权利要求1所述的分离启动子或者其活性片段或衍生物。
22.表达载体，其包含根据权利要求1所述的分离启动子或者其活性片段或衍生物。
23.权利要求22的表达载体，其进一步包含转基因，其中所述启动子与所述转基因有效连接。
24.权利要求21的表达构建体或者权利要求23的表达载体，其中所述转基因包含编码多肽、siRNA、RNAi、反义RNA或微RNA的序列。
25.权利要求21的表达构建体或者权利要求22的表达载体，其用于植物的生物射弹转化。
26.权利要求21的表达构建体或者权利要求22的表达载体，其用于植物的农杆菌介导的转化。
27.用于产生表达构建体的方法，所述方法包括将根据权利要求1的分离启动子或者其活性片段或衍生物与转基因连接，以使所述启动子能赋予所述转基因在细胞中表达。
28.用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据权利要求1的分离启动子或者其活性片段或衍生物与空载体连接，从而产生表达载体。
29.用于产生表达载体的方法，所述方法包括将根据权利要求21的表达构建体与空载体连接，从而产生表达载体。
30.权利要求1的分离启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于产生表达构建体或表达载体。
31.转基因植物部分或植物，其包含根据权利要求1的分离启动子或者其活性片段或衍生物。
32.根据权利要求31所述的转基因植物部分或植物，其中所述启动子、活性片段或衍生物与所述植物细胞或植物部分或植物的内源核酸有效连接。
33.根据权利要求31所述的转基因植物部分或植物，其中所述启动子、活性部分或衍生物与转基因有效连接。
34.转基因植物部分或植物，其包含根据权利要求21所述的表达构建体或者权利要求
22所述的表达载体。
35.根据权利要求34所述的转基因植物部分或植物，其中所述表达构建体已经整合到植物细胞、植物部分或植物的核酸中。
36.根据权利要求34所述的转基因植物部分或植物，其中所述表达构建体或表达载体在附加体中或者在染色体外。
37.用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求1的分离启动子或者其活性片段或衍生物或者根据权利要求21的表达构建体或者权利要求22的表达载体引入到植物细胞中。
38.权利要求37所述的方法另外包括提供或获得根据权利要求1所述的分离启动子或者其活性片段或衍生物或者根据权利要求21的表达构建体或者权利要求22的表达载体。
39.用于产生转基因植物或小植株的方法，所述方法包括：
(i)进行权利要求37所述的方法，从而产生转基因植物细胞；和
(ii)从(i)项产生的转基因植物细胞中再生转基因植物或小植株或小植株，从而产生转基因植物或小植株或植物部分。
40.权利要求39所述的方法另外包括，在一段时间和在足够种子产生的条件下培养转基因植物。
41.权利要求40所述的方法进一步包括，获得包含引入的启动子、活性片段或衍生物的种子。
42.权利要求41所述的方法进一步包括，从包含引入的启动子、活性片段或衍生物的转基因植物或小植株中获得植物部分。
43.权利要求39所述的方法另外包括，提供所述植物和/或其子代植物和/或其种子和/或其繁殖物质和/或其繁殖材料和/或其种质，其中所述植物、子代植物、种子、繁殖物质、繁殖材料或种质包含引入到转基因植物细胞的启动子、其活性片段或衍生物。
44.根据权利要求1的启动子或者其活性片段或衍生物在产生转基因植物部分和/或转基因植物中的用途。
45.用于产生来自植物的转基因种子的方法，所述方法包括提供、产生或获得根据权利要求31的转基因植物，并在一段时间和在足够种子产生的条件下培养或者维持所述转基因植物。
46.根据权利要求45所述的方法另外包括获得种子，所述种子包含根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物或者根据权利要求21所述的表达构建体或者根据权利要求22所述的表达载体。
47.用于育种转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)通过进行根据权利要求39所述的方法产生转基因植物或者根据权利要求31获得转基因植物；和
(ii)育种(i)项产生的转基因植物，从而产生包含根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物或者权利要求21所述的表达构建体或者权利要求22所述的表达载体的合子。
48.根据权利要求47所述的方法，其另外包括培养合子以形成转基因胚和/或转基因小植株和/或转基因植物。
49.根据权利要求47所述的方法，其中获得的转基因植物包含获得的包含根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物或者权利要求21所述的表达构建体或者权利要求22所述的表达载体的种子，并培养所述种子从而获得转基因植物。
50.用于育种转基因植物的方法，所述方法包括：
(i)通过进行根据权利要求39所述的方法产生转基因植物或小植株或植物部分或者获得根据权利要求31的转基因植物；和
(ii)在一段时间和在足够所述植物无性繁殖的条件下维持所述转基因植物。
51.用于在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达核酸的方法，所述方法包括：
(i)提供、获得或产生转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分，所述转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分包含与核酸有效连接的根据权利要求1所述的分离启动子或者其活性片段或衍生物；和
(ii)在一段时间和在足够所述核酸表达的条件下维持所述转基因植物或子代。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述核酸对于植物、植物细胞或植物组织是内源的。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述核酸是转基因。
54.根据权利要求51所述的方法，包括提供、获得或产生转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分，所述转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分包含根据权利要求21所述的表达构建体或者根据权利要求22所述的表达载体。
55.权利要求54所述的方法进一步包括在发育的胚乳或者其细胞或组织中测定转基因的表达。
56.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物或者权利要求21所述的表达构建体或者权利要求22所述的表达载体的用途，用于在植物细胞或植物部分或植物中表达核酸。
57.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物或者权利要求21所述的表达构建体或者权利要求22所述的表达载体的用途，用于调节与其有效连接的转基因在发育的胚乳中的表达。
58.用于在植物部分或植物中调节或赋予表型或性状的方法，所述方法包括：
(i)提供、获得或产生转基因植物、植物细胞或植物部分，所述转基因植物、植物细胞或植物部分包含与核酸有效连接的根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物，所述核酸的表达在植物细胞和/或植物部分和/或植物中调节或赋予表型；和(ii)在一段时间和在足够核酸表达的条件下维持(i)项的转基因植物、植物细胞或植物部分。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述启动子、活性片段或衍生物与转基因有效连接。
60.根据权利要求59所述的方法，包括提供、获得或产生转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含权利要求21所述的表达构建体或者权利要求22所述的表达载体。
61.根据权利要求58所述的方法，用于改良植物的产量。
62.根据权利要求58所述的方法，用于赋予植物疾病抗性。
63.根据权利要求58所述的方法，用于赋予植物或植物部分营养特性。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述表型或性状产生或者增强工业、药物、兽医或农业产品的产生。
65.根据权利要求64所述的方法，用于产生或者增强淀粉、酿造或发酵饮料或食物、面粉、含面粉的产品、淀粉类食物、脂肪酸、食用油、纸张、纺织品、乙醇或工业聚合物的产量。
66.根据权利要求58所述的方法，用于调节植物形态。
67.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于在植物、植物细胞或植物部分中调节或赋予表型或性状。
68.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于赋予植物疾病抗性。
69.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于赋予植物或植物部分营养特性。
70.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于赋予植物或植物部分药物特性。
71.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于产生工业、药物、兽医或农业产品。
72.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于产生淀粉、酿造或发酵饮料或食物、面粉、含面粉的产品、淀粉类食物、脂肪酸、食用油、纸张、纺织品、乙醇或工业聚合物。
73.根据权利要求1所述的启动子或者其活性片段或衍生物的用途，用于调节植物形态。
胚乳中有效的植物启动子及其用途
[0001] 相关申请
[0003] 本发明涉及包含植物有效的启动子序列及其衍生的调节序列的物质组合物，并涉及此类组合物，特别地在发育的胚乳中赋予基因表达的用途。
[0004] 发明背景
[0005] 相关领域的描述
[0006] 到目前为止，已经因为多种原因基因修饰了植物，包括例如通过表达抗真菌或抗细菌蛋白质赋予虫害抗性，或者例如通过调节果实成熟改良农艺性状，或者在杂交植物中诱导不育，或用于大规族生产用于工业、药物、兽医和农业用途的蛋白质。在这方面，生物技术研究的进展已经产生了涉及大量经鉴定的核酸信息的爆炸，所述核酸，如果合适地表达，对产生改良的植物是有用的，例如，抗收获前发芽植物、具有改良的营养特性的植物、具有药物特性的植物、控制了繁殖发育的植物、具有改变的形状或大小特征的植物、收获后能快速再生的植物、或者具有对病原体改良的抗性的植物等等。
[0007] 然而，与农业上重要的植物如农作物的基因改良有关的问题是，基因表达的操纵产生了显示出新特征的植物。在这方面，通常期望的是在植物的一个或多个特定的细胞类型、组织或器官中，或者在特定的环境或发育条件下优先性或选择性表达，或者特异性表达，而不是组成型地表达在植物中待表达的核酸。
[0008] 此外，随着更多有希望的农艺学或药物价值的基因变得可用，对于具有多基因转化植物的需求将会呈指数增长。这些多外源基因一般必须受分别的调节序列控制，以提供合适的表达水平和模式，其对于待表达的每一结构基因或其他转基因可以是不相同的。例如，在转基因生物中，一些基因可能需要组成型地表达，而其他基因需要在某些发育阶段或部位表达。因此，需要多种具有不同作用的调节序列。
[0009] 如在说明书和权利要求中所用，“优先地(preferentially)”意为启动子在植物的一种或多种特定的细胞类型、组织或器官中或者在特定的环境或发育条件下比其在一种或多种其他细胞、组织或器官中或者在另一条件下赋予与其有效连接的核酸更大程度或更高水平的表达。然而，术语“优先地”并不将核酸的表达限于植物的一种或多种特定的细胞类型、组织或器官或者在特定的环境或发育条件下。相反地，仅需要将表达水平增加到更高的水平，和优选地显著地增加。
[0010] “选择性地”意为启动子在植物的一个或多个特定细胞类型、组织或器官中，或者在特定的环境或发育条件下赋予与其有效连接的核酸的表达。
[0011] “特异性地”意为专门地。
[0012] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，并且除非文中另外说明，词语“赋予”和其变化形式如“赋予的”应当意为启动子或者其活性片段或衍生物，例如在其他因子如DNA构象和/或顺式作用DNA序列和/或反式作用因子和/或信号通路和/或转录物结构和/或转录物加工的情况下，在应答一个或多个发育和/或环境和/或激素和/或其他刺激时产生与该启动子或活性片段或衍生物有效连接的核酸的表达或者表达模式的能力，所述一个或多个发育和/或环境和/或激素和/或其他刺激可以正常诱导与在其天然情况下的该启动子有效连接的核酸的表达或表达模式。
[0013] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“启动子”应取其广义并包括典型基因组基因的转录调节序列，包括含有TATA框的基础启动子调节区和任选的其他调节元件(例如，上游激活序列、增强子和沉默子)，所述TATA框对于需要或不需要CCAAT框序列的转录起始是必须的，所述其他调节元件在应答发育和/或激素和/或环境刺激时，或者以组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达。启动子通常但并非必须位于结构基因的上游或5’，在所述结构基因上其赋予表达。此外，包含启动子的调节元件通常位于植物基因转录的起始位点的2kb内。
[0014] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，并且除非文中另外指明，词语“包含”或其变化形式如“含有”或“包含的”应理解为指包括指定的步骤或元件或整体或者步骤或元件或整体的组群，但并不排除任一其他步骤或元件或整体或者元件或整体的组群。
[0015] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“活性片段”，在涉及启动子的情况下应指启动子的片段或区域或部分，其保留了其来源的启动子起始转录的能力。此类活性片段不需要以与其来源的启动子相同的方式，赋予与其有效连接的核酸表达和表达模式。例如，启动子的活性片段比其来源的启动子诱导更高或更低程度的核酸表达水平。备选地或另外地，启动子的活性片段在与其来源的启动子赋予表达的细胞、组织或器官不同的细胞、组织或器官中，或者在更少的组织中或其他的细胞、组织或器官中赋予表达。鉴定此种活性片段的方法对本领域技术人员和/或本文中所述是显而易见的。
[0016] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“衍生物”，在涉及启动子的情况下，应当指来源于如本文中所述根据任一实施方案的启动子的启动子，例如，包含一个或多个其他调节元件的启动子，以例如增加或降低或者另外地控制与其有效连接的核酸的表达。本发明也包括包含与另一启动子连接的如本文所述根据任一实施方案的启动子的衍生物，例如，双向启动子。在这方面，其他启动子也可以是如本文所述根据任一实施方案的启动子。术语“衍生物”也包括包含其序列与如本文所述根据任一实施方案的启动子有关的变体的启动子。例如，此种衍生物的序列可以包括一个或多个以下变异：在特定限制酶位点的删除、插入、单点或多点突变或者改变，只要衍生的启动子保留了起始和/或抑制与其连接的核酸的转录的能力。
[0017] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“表达(expression)”或类似的术语如“表达(express)”应当至少(de minimis)指核酸的转录以产生RNA，并任选地包括该转录和转录RNA的后续翻译以产生肽、多肽或蛋白质。该定义并不限于任一特定的细胞背景，并包含例如使用体外表达系统或者在分离的细胞、组织或器官中获得的此种表达。
[0018] 类似地，“表达模式”指如上文所定义的表达的时间、水平、细胞定位、亚细胞定位、组织选择性或器官选择性中的一个或多个，包括在一种细胞、组织或器官中与另一细胞、组织或器官比较的相对表达，并包括如在不同的发育阶段或对不同的环境或激素刺激应答时，表达的相对水平或相对时间。
[0019] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“有效的”应当理解为指规定的完整事物(stated integer)在特定的情况下发挥作用的能力，虽然并非必需在该规定的情况下。
[0020] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“有效连接”和“与......有效连接”意为本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的位置与另一核酸(例如，转基因包括结构基因、开放阅读框、报告基因、或编码核酶、小核酶、RNAi分子或其他RNA的核酸)在空间上相关，从而通过该启动子、活性片段或衍生物赋予所述其他核酸的表达。因此，启动子、活性片段或衍生物与其他核酸的相对位置产生了赋予其他核酸功能性表达模式的结构。启动子一般位于其控制表达的核酸的5’(上游)。为了构建异源的启动子/核酸组合(例如，启动子/转基因和/或启动子/选择标记基因组合)，一般优选地，启动子的位置与基因转录起始位点之间的距离与该启动子与在其天然情况下控制的核酸(即启动子源自的基因)之间的距离大约相同。如本领域已知，在不丢失启动子功能的情况下，可以对该距离进行一些改变。
[0021] 如本说明书中和随后的权利要求中所用，术语“天然情况(native context)”在本文中应当意为在植物基因组中，启动子天然存在的基因组基因，即，该启动子分离自的基因组基因。使用从例如在National Institutes of Health of the Government of the United States of America Bethesda，MD，20894，美国的National Library of Medicine的National Center for Biotechnology Information(NCBI)可得到的序列分析软件，可以鉴定和/或序列比对启动子天然定位的基因组基因。
[0022] 在被子植物中，种子胚乳形成了胚的营养组织。例如，谷物的胚乳来源于细胞化(cellularisation)前的一系列游离核分裂，并随后形成一系列的功能性细胞区域。该组织在结构和发育方面是复杂的，特别是在谷物中。通过生长胚乳摄取同化物，在种子发育中是关键的过程。胚乳的中心区域由大量的空泡细胞组成，其储存淀粉储备物和高度丰富的贮藏蛋白。
[0023] 期望将在胚乳中表达重组核酸的能力用于产生例如用于药物或工业目的的异源蛋白质。例如，胚乳已经进化以允许在小体积并稳定的环境中积累大量的贮藏蛋白。此外，胚乳的小尺寸允许重组蛋白质在小生物量中达到相对较高的浓度，这对于提取和下游加工是有利的。由于已知会干扰下游加工步骤的化合物(例如在烟叶中存在的酚醛塑料和生物碱，以及在苜蓿中存在的草酸)的低水平，所以也简化了该下游加工。此外，因为种子一般适合于人类和动物消耗，所以在发育的种子中积累蛋白质，对于产生口服递送给人类或动物的重组蛋白质是很有吸引力的方式，例如，用于产生具有药物特性的食物，如口服疫苗或者用于产生具有改良的营养特性的食物。
[0024] 在植物的种子中积累蛋白质也是特别有用的，因为收获种子已经是基于农作物的农业的主要特征，并且使用现存的技术可以相对容易的实施。与植物中组成型表达不同，胚乳中蛋白质的选择性表达降低了干扰营养植物生长的风险。此外，此种限制性表达限制了与非目标生物(例如生物圈中的微生物和食叶草食动物)的接触(Stoger等人，Current Opinion in Biotechnology，16：167-173，2005)。例如，因为到目前为止分离的大多数序列都是渗漏性或非选择性的，使得它们更通常在营养或花组织或者繁殖器官、成熟种子或胚组织中赋予表达和/或因为它们不可以在不同物种中有效或者不可以有效赋予跨物种的不同表达模式，所以对于能赋予在胚乳中选择性地或特异性地表达的调节序列仍存在需求。
[0025] 本领域仅已知几个胚乳启动子，并且大多数都来源于几个大量表达的贮藏蛋白基因。由于在植物中从相同的启动子表达多个基因存在困难，所以少量的可用启动子使得很难通过基因堆积即表达多个转基因来修饰或改良植物胚乳。例如，用于调节DNA结合蛋白质的顺式作用元件之间的竞争可以降低启动子的效率，使得当与应用不同的启动子比较时，在相同的细胞中，在相同的启动子控制下的多个转基因的表达可能是降低的。
[0026] 如前所述，对本领域技术人员显而易见的是，种子胚乳的基因操纵对于农业是有利的，其允许产生用于人类或兽医用途的药物和/或允许改良或改变产生自植物的食物营养特性。因此，为了提供这些益处，在发育的胚乳中赋予表达的启动子是明显需要的。
[0027] 例如，在以下教科书中描述了分子生物学、重组DNA技术的常规技术：
[0028] (i)Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，纽约，第二版(1989)，全部I、II和III卷；
[0029] (ii)DNA Cloning：A Practical Approach，I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)，IRL Press，Oxford，全部文本；
[0030] (iii)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(M.J.Gait 编 辑，1984)IRL Press，Oxford，全部文本，并且特别是其中Gait，第1-22页，Atkinson等人，第
35-81页；Sproat等人，第83-115页；和Wu等人，第135-151页的文本；
35-81页；Sproat等人，第83-115页；和Wu等人，第135-151页的文本；
[0031] (iv)Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach(B.D.Hames& S.J.Higgins编辑，1985)IRL Press，Oxford，全部文本；
[0032] (v)Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
[0033] 发明概述
[0034] 在产生本发明的工作中，本发明人试图通过应用微阵列技术提供该分离的启动子，并随后分离了在发育的胚乳细胞中赋予表达的启动子序列。如在本文中所示例，本发明人鉴定了以组织选择性和发育选择性方式在发育的胚乳中表达的两个小麦转录物。
[0035] 本发明人也使用小麦转录物序列通过同源检索，鉴定了在稻、大麦、玉米和高粱中具有类似表达谱的转录物。为了分离调节小麦和玉米转录物的表达的启动子，本发明人分别在小麦和玉米基因组DNA中，使用聚合酶链反应(PCR)的引物扩增了编码区上游的核酸。如在本文中示例，从稻和玉米基因组中获得了小麦启动子的变体。
[0036] 本发明人也显示，本发明的示例性小麦启动子在转基因小麦和玉米的发育胚乳中例如，从授粉后约5-10天至授粉后至少约25天期间，赋予与其有效连接的报告基因选择性地和可能的特异性地表达。
[0037] 因此，如本文中所述的示例性启动子及其分离的方法代表了一类启动子，它们在天然情况下，赋予与其有效连接的基因选择性地/特异性地胚乳表达。
[0038] 因此，本发明提供了能在发育的植物种子的胚乳中赋予与其有效连接的基因选择性地表达的分离启动子或者其活性片段或衍生物，其中所述启动子在其天然情况下赋予基因组基因胚乳选择性地表达或优先地胚乳表达，所述基因组基因包括选自以下的序列：
[0039] (i)SEQ ID NO：1或2中所述的序列；
[0040] (ii)编码与由SEQ ID NO：1或2编码的多肽具有至少约50％同一性的多肽的序列，其中所述多肽选择性地表达于发育种子的胚乳中；
[0041] (iii)在至少中等严格条件下，与(i)或(ii)项的序列或者它们的互补序列杂交的序列，其中所述杂交的序列选择性地表达于发育种子的胚乳中；和
[0043] 分离的启动子、活性片段或衍生物至少能在单子叶植物例如，小麦、玉米、稻、大麦或高粱的发育种子中赋予与其有效连接的基因胚乳选择性地表达或优先地胚乳表达。并不排除除在本文中特定列举的那些启动子之外的其他来源的本发明启动子。
[0044] 可以从单子叶植物例如，小麦、玉米、稻、大麦或高粱中分离启动子、活性片段或衍生物也是显而易见的。在一个实例中，分离的启动子、活性片段或衍生物能在从授粉后(DAP)约5天至授粉后至少约25天期间，赋予与其有效连接的基因胚乳选择性地表达或优先地胚乳表达。应当理解，这种选择性地表达意为，在一个或多个营养组织或器官和/或一个或多个繁殖组织或器官和/或一个或多个花组织或器官中，例如，如通过转录物谱或Northern杂交或PR-PCR的常规方法或者通过免疫学方法例如ELISA或者通过测定酶活性测定，与启动子、片段或衍生物连接的基因并不以可检测水平的转录物和/或蛋白质表达。例如，在叶和/或根和/或结节和/或茎节间体和/或颖片和/或花药和/或子房和/或花粉和/或外壳和/或穗丝和/或胚和/或成熟的种子胚乳中，如通过此类方法所测定的，本发明的启动子并不赋予可检测的表达。
[0045] 在另一实例中，本发明分离的启动子、活性片段或衍生物赋予、诱导或活化与其有效连接的基因胚乳特异性地表达，即表达严格定位于发育的胚乳中。
[0046] 序列分析表明，尽管不同启动子之间通常具有低序列同一性，但根据本发明所提供的分离启动子、其活性片段和衍生物拥有结构性保守特点，其允许将它们表征并鉴定为胚乳选择性地或胚乳特异性地调节序列的种类或亚类。在一个实例中，例如，如通过调节序列的PLACE分析鉴定其中的顺式作用元件所测定，本发明的启动子包含在表4和/或表5和/或表6和/或表7和/或表8中所述的一个或多个核苷酸序列。在另一实例中，本发明的分离启动子包含如在表1中所述的一个或多个核苷酸序列，即，对应于在5个示例性胚乳调节序列之间保守的顺式作用元件。又在另一实例中，本发明的分离启动子包含多个在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中的各个元件，元件选自ARR1AT元件、ACGTATERD1元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件。根据该实例，每一此种元件可以在其来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中出现至少2或3或4或5或6次。备选地或另外地，CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件和GT1CONSENSUS元件也都在所述启动子来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中出现至少4次。备选地或另外地，ARR1AT元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件都在所述启动子来源的相应基因组基因的翻译起始位点上游近端750bp中出现至少4次。备选地或另外地，分离的启动子、活性片段或衍生物另外包含在启动子的天然情况下与所述启动子有效连接的基因的翻译起始位点上游近端750bp中的至少一个元件，所述元件包括IBOXCORE元件、MYB2CONSENSUS元件、MYBCORE元件和WRKY71OS元件。选自MYBST1元件、MYBCOREATCYCB1元件和PRECONSCRHSP70A元件的至少一个元件也可以在启动子的天然情况下与所述启动子有效连接的基因的翻译起始位点上游近端750bp中出现。
[0047] 因此，本发明的启动子可以包含表1或4-8中所述的一个或多个拷贝的序列，例如，在具有或不具有间插序列(如串联重复序列)的启动子序列中重复，和/或以相反的方向例如在不同的物种或等位基因中重复。本发明的启动子也可以包括下文表1或4-8中所述的例如，在不同物种或等位基因中的任一序列的反向互补序列。
[0048] 表1中显示的在物种间或者在物种内不同的部分同源染色体或等位基因之间保守的序列可以单独地或者共同地促进由本发明启动子所赋予的表达模式的表达，从而解释在不同的或相同的物种中观察到的与该启动子有效连接的转录物的一种或多种保守表达模式。因此，本发明启动子的典型实例(而不是那些通过基因复制引起的实例)具有整体的低序列同一性，尽管都能在特定的时间或空间模式中和/或在应答一个或多个信号例如环境、激素等时具有赋予表达的保守能力。
[0049] 本领域技术人员也应意识到，此类短序列对于赋予与其有效连接的异源核酸表达或表达模式是有用的，例如激活、沉默、增强、抑制或另外地调节与其有效连接的核酸表达和/或细胞类型特异性地和/或发育特异性地表达。
[0050] 又在另外的实例中，本发明的分离启动子、活性片段或衍生物包含选自以下的核苷酸序列：
[0051] (i)选自SEQ ID NOs：3、4、5、6、7和8的序列；
[0052] (ii)与(i)项的序列互补的序列；
[0053] (iii)与(i)或(ii)项的序列具有至少约70％序列同一性的序列；和
[0054] (iv)使用一个或多个扩增引物可从基因组DNA中扩增的序列，其中每一所述引物包含衍生自SEQ ID NO：1或2或者其互补序列的至少约12个连续核苷酸长度的序列。
[0055] 对于命名的目的，在SEQ ID NO：3中所述的序列包含来自小麦的命名为“WP05”的启动子，在其天然情况下，所述启动子调节等同于SEQ ID NO：1中所述的转录物或其同源物的基因组基因的胚乳表达。SEQ ID NO：4中所述的序列包含来自小麦的命名为“WP07”的启动子的2400bp变体，在其天然情况下，所述启动子2400bp变体调节等同于SEQ ID NO：2中所述的转录物或其同源物的基因组基因的胚乳表达。SEQ ID NO：5中所述的序列包含来自小麦命名为“WP07”的启动子的2066bp变体，在其天然情况下，所述启动子2066bp变体调节等同于SEQ ID NO：2中所述的转录物和其同源物的基因组基因的胚乳表达。SEQ ID NO：6中所述的序列包含命名为“LOC_Os01g01290.1”的稻基因基因座的在其天然情况下的
330bp 5’上游调节序列，其中所述稻基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。SEQ ID NO：7中所述的序列包含命名为“ZmGSStuc11-12-04.64626.1”的玉米基因基因座的在其天然情况下的5’上游调节序列，其中所述玉米基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。SEQ ID NO：8中所述的序列包含命名为“ZmGSStuc11-12-04.16895.1”的玉米基因基因座的在其天然情况下的5’上游调节序列，其中所述玉米基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。应当理解，本发明明确包括分离的启动子、活性片段或衍生物，所述分离的启动子、活性片段或衍生物包含的核苷酸序列分别地或共同地选自：
330bp 5’上游调节序列，其中所述稻基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。SEQ ID NO：7中所述的序列包含命名为“ZmGSStuc11-12-04.64626.1”的玉米基因基因座的在其天然情况下的5’上游调节序列，其中所述玉米基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。SEQ ID NO：8中所述的序列包含命名为“ZmGSStuc11-12-04.16895.1”的玉米基因基因座的在其天然情况下的5’上游调节序列，其中所述玉米基因在发育的种子中表达并通过如在本文实施例中所述的同源检索鉴定。应当理解，本发明明确包括分离的启动子、活性片段或衍生物，所述分离的启动子、活性片段或衍生物包含的核苷酸序列分别地或共同地选自：
[0056] (i)选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8的序列；和
[0057] (ii)与(i)项序列的任意一个或多个互补的序列。
[0058] 也应当理解，加以必要的更改，本发明涉及包含核苷酸序列的分离启动子或者其活性片段或衍生物，在其天然情况下赋予核酸的胚乳表达，所述核酸编码由SEQ ID NO：1或2或LOC_Os01g01290.1或ZmGSStuc11-12-04.64626.1或ZmGSStuc11-12-04.16895.1或者所述核酸的任意一个或多个同源物编码的多肽。备选地或另外地，本发明的启动子包含在其天然情况下赋予核酸胚乳选择性地或胚乳特异性地表达的序列，所述核酸在至少中等严格条件和优选地高度严格条件下，与编码由SEQ ID NO：1或2或LOC_Os01g01290.1或ZmGSStuc11-12-04.64626.1或ZmGSStuc11-12-04.16895.1编码的多肽的核酸杂交。
[0059] 备选地或另外地，本发明的启动子包含在其天然情况下赋予核酸胚乳选择性地或胚乳特异性地表达的序列，所述核酸在至少中等严格条件和优选地高度严格条件下，与编码 由SEQ ID NO：1或2或 LOC_Os01g012690.1或ZmGSStuc11-12-04.64626.1或ZmGSStuc11-12-04.16895.1编码的多肽的核酸的互补物杂交。
[0060] 杂交条件是本领域技术人员已知的或者在本文中所述。由于在功能性相关的启动子之间识别的低整体序列同一性，低严格性杂交条件是优选的，但可以应用中等或高度严格性。
[0061] 更优选地，本发明的启动子或者其活性片段或衍生物包含使用一个或多个扩增引物从基因组DNA中扩增的核苷酸序列，其中每一所述引物包含来源于SEQ ID NO：1或2或者LOC_Os01g01290.1或者ZmGSStuc11-12-04.64626.1或者ZmGSStuc11-12-04.16895.1或者它们的互补序列中所述序列的至少约12个连续核苷酸长度的序列。
[0062] 在一个特别优选的实施方案中，本发明的启动子包含选自SEQ ID NO：3、4、5、6、7和8或它们的互补序列或者所述序列或互补序列的活性片段或衍生物的序列。
[0063] 本发明也提供了如在本文中所述的根据任一实施方案的启动子或者其活性片段或衍生物在产生表达构建体中的用途。
[0064] 例如，本发明的启动子在发育的胚乳中对于用于表达与其有效连接的核酸的表达构建体的产生是特别有用的，并且优选地其在胚乳和其细胞和组织中优先地或选择性地表达。
[0065] 术语“表达构建体”取其广义，并包括置于与转基因有效连接的分离启动子或者活性片段或衍生物。
[0066] 如本文中所用，术语“转基因”用于指除在其天然情况下，本发明的启动子赋予与其连接的核酸表达或表达模式之外的核酸，即“异源核酸。”本发明的一般应用并不限于转基因的性质。基于本文中所述，合适的转基因对本领域技术人员是显而易见的，并且包括在发育的胚乳或者其细胞或组织中编码待表达的多肽的核酸或者能在发育的胚乳或者其细胞或组织中减低核酸的表达的核酸，例如siRNA或RNAi或反义RNA或miRNA。优选地，核酸能调节涉及胚乳发育、淀粉或贮藏蛋白积累或生物合成或者涉及赋予种子疾病抗性或营养价值的多肽的表达。从前所述，应当理解，优选的是待通过启动子进行调节的此种表达，所述启动子在发生表达、阻抑、抑制或降低所需的一个或多个因子的情况下赋予表达。优选地，在这些条件下，表达是优先性或选择性地调节的。基于本文中所述，其他合适的转基因对于本领域技术人员是显而易见的，并且明确包括编码赋予发育胚乳的营养或药物特性的多肽或者编码用于生产有用的下游产物或副产物的多肽的转基因，所述有用的下游产物或副产物例如，淀粉、酿造或发酵饮料或食物、面粉、含面粉的产品例如面包、饼干、面团或面条、淀粉类食物、脂肪酸、食用油、纸张、纺织品、乙醇、聚合物或其它工业应用。
[0067] 本发明也提供用于产生表达构建体的方法，所述方法包括将如本文中所述根据任一实施方案的本发明启动子或者活性片段或衍生物与转基因连接，以使启动子能在发育的胚乳或者其细胞或组织中赋予所述转基因表达或表达模式。
[0068] 用于实施该实验方案的优选细胞组织或器官是植物细胞、组织或器官，例如，如来自小麦、大麦、玉米、稻、高粱、黑麦、栗(例如珍珠栗(pearl millet)或散穗黍(proso millet))、荞麦(例如，蓼科(Polygonaceae)的荞麦)、燕麦(例如，燕麦(Avena sativa))的单子叶植物细胞、组织或器官或者来自选自禾本科(Graminaceae、Gramineae或Poaceae)的任一其他植物的细胞、组织或器官。这包括具有如在本文以前所定义的在其天然情况下赋予与所述启动子有效连接的核酸表达之能力的任一植物细胞、组织或器官。
[0069] 启动子、活性片段或衍生物与转基因之间优选的连接是共价连接。应当理解，因为启动子、活性片段或衍生物可以在与其有效连接的转基因具有一定距离的情况下赋予表达，因此转基因并不需要与启动子、活性片段或衍生物紧邻，即，可以存在多达约2kb长度，优选地多达约1kb长度，更常见地约200-500bp长度的间插序列。也可以应用更短的间插序列如至多约100或200bp长度的内含子序列。
[0070] 用于连接核酸的合适方法对于本领域技术人员和/或本文中所述是显而易见的，并包括酶连接，例如T4 DNA连接酶、拓扑异构酶介导的连接，例如使用Vaccinia DNA拓扑异构酶I、顺式或反式重组，例如使用重组酶或者通过随机整合、从一个或多个引物序列的扩增包括引物延伸方法、从载体扩增或者化学连接，例如溴化氰介导的核酸凝集。
[0071] 在另一实例中，本发明也提供包含与转基因有效连接的如在本文中所述根据任一实施方案的本发明启动子的表达构建体。
[0072] 本发明也提供如本文中所述根据任一实施方案的启动子或者其活性片段或衍生物在产生表达载体中的用途。优选地，将所使用的启动子与转基因有效连接。本领域技术人员知道，表达载体包含足够的基因信息以允许从启动子、活性片段或衍生物起始表达，例如通过存在的启动子、活性片段或衍生物，和与其有效连接的一个或多个转录终止序列和/或增强子元件序列和/或内含子序列和/或内含子剪接界序列。表达载体通常也包括一个或多个序列以允许其在细胞中维持，例如一个或多个选择标记，例如以赋予包含该表达构建体的细胞抗生素或除草剂抗性，和一个或多个复制起始点，所述一个或多个复制起始点例如用于在细菌细胞或酵母中复制。表达载体也可以包括一个或多个重组酶位点序列，以允许切除细胞中其DNA的一部分和/或以有助于整合到宿主细胞DNA中。
[0073] 本发明也提供用于产生表达载体的方法，所述方法包含与空载体连接的如在本文中所述根据任一实施方案的本发明启动子或者活性片段或衍生物，从而产生表达载体。如本文中所用，术语“空载体”应用于指不具有本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的载体。本领域技术人员应当知道，示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、病毒基因组或亚基因组片段、噬菌体人工染色体例如，P1人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体或能染色体或染色体外维持和/或在细胞中复制的其他核酸。
[0074] 在一个实例中，该方法另外包括将转基因与表达载体连接，以使启动子、活性片段或衍生物与转基因有效连接。
[0075] 在另外的备选中，本发明提供了用于产生表达载体的方法，所述方法包括如本文中所述根据任一实施方案的空载体而连接表达构建体，从而产生表达载体。
[0076] 在本文中，应当理解，表达载体的多个组分之间的连接和用于实现此种连接的方法与用于产生本发明表达构建体的连接和方法相同。
[0077] 在一个实例中，该方法另外包括产生或获得本发明的表达构建体。
[0078] 在另一实例中，该方法包括获得本发明的启动子、活性片段或衍生物和/或转基因和/或空载体，用于产生本发明的表达载体。
[0079] 在另外的实例中，本发明也提供包含本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的表达载体。
[0080] 优选的表达载体包含本发明的表达构建体，即包括与转基因有效连接的本发明的启动子。例如，本发明人产生了用于生物射弹或者农杆菌介导的小麦转化的载体，例如包含SEQ ID NO：所述序列转化的小麦，例如，包含SEQ ID NO：10-17中所述序列，或者用于农杆菌介导的玉米的转化，例如，包含SEQ ID NO：18或19中所述序列。
[0081] 如本文中所述根据任一实施方案的启动子或者其活性片段或衍生物对于产生转基因植物或植物部分也是有用的，例如，包含与转基因有效连接的或者与内源核酸有效连接的本发明启动子、活性片段或衍生物。“内源核酸”指通过引入启动子、活性片段或衍生物，转基因制备的植物、植物细胞或植物部分中核或细胞器来源的核酸。例如，通过引入本发明的启动子、活性片段或衍生物，转基因制备在植物或植物部分中天然存在的此种“内源核酸”。
[0082] 因此，本发明提供了本发明的启动子、活性片段或衍生物在产生植物细胞、植物组织、植物器官或整个植物中的用途，例如，用于调节转基因的胚乳表达(即，赋予内源或异源转基因在发育的胚乳中优先地或者选择性地表达)和/或用于阻抑或降低内源转基因在发育的胚乳中的表达。
[0083] 术语“植物部分”应当理解为植物的细胞、组织或器官，或者植物的多个细胞、组织或器官，包括任一繁殖材料，例如种子、发育的胚乳，备选地包括盾片和/或糊粉，并优选发育的胚乳。本发明优选的植物部分包含本发明的启动子或者其活性片段或衍生物。
[0084] 备选地，本发明提供了本发明的启动子、活性片段或衍生物在制备表达载体或表达构建体中的用途，用于产生植物细胞、组织或器官或者整个植物，例如，用于赋予在发育的胚乳(任选地包括盾片和/或糊粉)中优先地或选择性地表达和/或用于阻抑或降低在发育的胚乳(任选地包括盾片和/或糊粉)中的表达。
[0085] 在一个实例中，将本发明的启动子、活性片段或衍生物用于产生其中改变了内源核酸的表达(即，将启动子、活性片段或衍生物与内源核酸有效连接)的植物或植物部分。例如，产生的此种植物部分或植物允许增强或降低内源核酸的表达。此种调节性表达对于例如，诱导产生目的表达产物例如，目的蛋白质或者用于控制目的表达产物的表达时间和/或定位、或者用于减低不想要的表达产物的水平或者推迟它们的表达是有用的。
[0086] 备选地，将启动子、活性片段或衍生物用于鉴定和/或分离诱导目的表型的核酸。例如，将该启动子、活性片段或衍生物引入到植物或植物部分的基因组中，以使其与基因组核酸有效连接，从而在所述植物或植物部分中产生与其他等基因材料或近等基因材料(near isogenic material)的表型不同的表型，所述其他等基因材料或近等基因材料在该基因组位置处缺少所述启动子、活性片段或衍生物。使用标准技术，例如cDNA末端的5’快速扩增(RACE)或3’RACE，可以任选地鉴定和/或分离在植物的基因组中与该启动子、活性片段或衍生物有效连接的核酸。
[0087] 在另一实例中，将本发明的启动子、活性片段或衍生物用于在植物部分中赋予转基因如上文中所定义的表达。应当理解，可以将本发明的表达构建体或表达载体用于产生植物细胞、植物部分或整个植物，用于赋予植物部分如上文中所定义的表达的目的。在包含表达构建体的转基因植物或转基因植物细胞或转基因植物部分的情况下，该表达构建体可以整合到植物、植物细胞或植物部分的基因组中或者可以在附加体中或者在染色体外。
[0088] 优选地，可以将本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体用于产生与不具有该启动子、活性片段、衍生物、表达载体或表达构建体的另外的等基因植物部分或植物比较，具有改变的表型的植物或植物部分。例如，转基因植物或植物部分包含本发明的表达构建体或表达载体，所述表达构建体或表达载体包含有效放置在本发明的启动子控制下的转基因或结构基因。
[0089] 在一个实例中，在本发明启动子控制下待表达的结构基因的开放阅读框赋予植物增强的疾病或害虫耐受性(例如，来自昆虫抗性基因、细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性基因的开放阅读框)。在另一实例中，在本发明启动子的控制下待表达的结构基因的开放阅读框赋予植物增强的除草剂耐受性(例如，草甘膦抗性基因或膦四菌素抗性基因)。在另一实例中，在本发明启动子的控制下待表达结构基因的开放阅读框修饰谷物组成(composition)或品质，例如胚乳大小、胚乳细胞数量、种子大小或其它产量特性。又在另外的实例中，在本发明启动子控制下待表达的结构基因的开放阅读框修饰营养利用率、改良对真菌毒素的耐受性、改良或增强环境或其他胁迫耐性抗性(例如，干旱耐性基因、热耐性基因、冷耐性基因、霜冻耐性基因、涝耐性基因、盐耐性基因或氧化胁迫耐性基因)、油数量和/或质量、氨基酸或蛋白质组成，以及用于表达来自植物、其他真核生物或原核生物的外源性产物如酶、辅因子和激素的基因。通过修饰改变淀粉或蛋白质的基因的表达也可以产生植物中的商业性状，用于产生具有工业用途的纸、纺织品、醇、聚合物或其他物质。
[0090] 在另一实例中，使用本发明的启动子，例如通过在本发明启动子的有效控制下在胚乳中表达一个或多个转基因，降低内源胚乳基因的表达，所述一个或多个转基因包括一个或多个反义分子、核酶(Haseloff等人Nature334，585-591，1988；Steinecke等人EMBO J.11，1525(1992)；Perriman等人Antisense Res.Dev.3，253(1993))、共抑制分子、RNAi分子(Napoli等人Plant Cell 2，279-289，1990；美国专利号5,034,323；Sharp等人，Genes Dev.13，139-141，1999；Zamore等人，Cell 101，25-33，2000；和Montgomery等人，PNAS USA95，15502-15507，1998)、发夹结构(Smith等人Nature 407，319-320，2000；WO 99/53050；
和WO 98/53083)、微RNA(Aukerman等人，Plant Cell 15，2730-2741，2003)、转录因子靶向基因(例如WO 01/52620；WO 03/048345和WO 00/42219)、阻抑物编码基因、转座子或显性失活突变。本发明明确包括使用其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的任意一个或多个的组合。
和WO 98/53083)、微RNA(Aukerman等人，Plant Cell 15，2730-2741，2003)、转录因子靶向基因(例如WO 01/52620；WO 03/048345和WO 00/42219)、阻抑物编码基因、转座子或显性失活突变。本发明明确包括使用其他方法或本领域技术人员已知的上述方法的任意一个或多个的组合。
[0091] 通过表达结构基因例如(开放阅读框)或者分子，以有效降低与本发明的启动子或者其活性片段或衍生物有效连接的内源胚乳基因的转录，可以将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物特别地用于修饰一个或多个谷物性状。优选的谷物性状包括例如，脂肪酸含量和/或组成、氨基酸含量和/或组成包括含赖氨酸或含硫蛋白质的含量，以及种子贮藏蛋白的含量和/或组成、淀粉含量和/或组成、生长调节蛋白质包括细胞周期调节蛋白质、凋亡或核仁败育(kernel abortion)和环境胁迫基因。在另一实例中，转基因编码抑制多肽在发育的胚乳中表达的siRNA或反义RNA或RNAi或miRNA。备选地，该核酸编码能结合并抑制在发育的胚乳中的多肽活性的抗体片段。
[0092] 在另外的实例中，将本发明的启动子、活性片段或衍生物或表达构建体或表达载体用于赋予植物部分或整个植物对疾病或害虫的抗性。例如，当表达例如来自小麦的壳多糖酶或奇甜蛋白样蛋白质、或者来自害虫的外被蛋白(例如，大麦条纹花叶病毒外被蛋白)时，包含转基因的表达构建体或表达载体赋予对植物疾病或植物害虫的抗性。
[0094] 本发明也包括本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的用途，以赋予植物或植物部分营养特性。例如，表达构建体或表达载体包含编码种子贮藏蛋白、脂肪酸途径酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶的转基因。在一个实例中，转基因编码巴西坚果蛋白质、钙结合蛋白质或铁结合蛋白质。
[0095] 本发明也包括本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体修饰植物或植物部分的形态的用途。例如，表达构建体或表达载体包含编码参与生长素合成或代谢或者细胞分裂素合成或代谢(例如，细胞分裂素氧化酶)的多肽的转基因。通过改变植物或植物部分中生长素和/或细胞分裂素的水平，修饰植物或植物部分的形态。
[0096] 应当理解，可以将本发明的启动子特别地用于基因堆积目的，例如当与不同的启动子一起使用以在植物的胚乳中表达多个结构基因或转基因时。在另外的实例中，将本发明的启动子与一个或多个其他启动子联合使用，以在相同或不同的植物细胞中表达多个结构基因或转基因，例如，其中此种表达是同时发生的、同时存在的或者同步发生的。例如，可以将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物用于表达不同的结构基因或转基因，其中当所述不同的结构基因或转基因表达时，修饰植物种子中相同的生物化学途径。备选地，可以将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物在植物种子中用于表达与在其他启动子控制下表达的结构基因或转基因功能性不同的或不相关的结构基因或转基因。如本领域技术人员已知，基因堆积可以通过涉及将待表达基因构建体引入的同时或依次转化方法进行。
[0097] 在基因堆积的一个实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的构建体引入到已经表达在另一启动子控制下的转基因或结构基因的植物胚乳中，所述另一启动子在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达。在另一实例中，应用双组分系统，其中产生两种亲本系，两个亲本系各自在启动子的控制下表达想要的转基因，以使一种植物株系包含根据本发明的启动子、其活性片段或衍生物，而另一个植物株系包含其他启动子，并且其中将两种转基因植物系杂交以产生表达两种转基因的子代植物。在另一实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的第一构建体与包含与不同的启动子有效连接的转基因或结构基因的第二构建体一起引入到植物胚乳中，所述不同的启动子在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达。在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达的示例性启动子是本领域已知的，例如p326启动子，YP0144启动子、YP0190启动子、p13879启动子、YP0050启动子、p32449启动子、21876启动子、YP0158启动子、YP0214启动子、YP0380启动子、PT0848启动子、PT0633启动子、CaMV 35S启动子、甘露氨酸合成酶(MAS)启动子、来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1’或2’启动子、玄参花叶病毒34S启动子、例如来自稻的肌动蛋白启动子和例如来自玉米的泛素启动子(Ubi-1)。
[0098] 在基因堆积的另一实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的构建体引入到已经表达在成熟胚乳启动子控制下的转基因或结构基因的植物胚乳中，所述成熟胚乳启动子在成熟胚乳中赋予或调节表达，尽管并不必需专门或主要在成熟的胚乳中。在另一实例中，应用双组分系统，其中产生两种亲本系，其各自在启动子的控制下表达想要的转基因，以使一种植物系包含根据本发明的启动子、其活性片段或衍生物，而另一植物系包含在成熟的胚乳中有活性的其他启动子，并且其中将两种转基因植物系杂交以产生在胚乳中表达两种转基因的子代植物。也在另一实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的第一构建体与包含与不同的启动子有效连接的转基因或结构基因的第二构建体一起引入到植物胚乳中，所述不同的启动子在成熟胚乳中赋予或调节表达，尽管并不必需专门或主要在成熟的胚乳中。
[0099] 在基因堆积的另一实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的构建体引入到已经表达在成熟胚乳启动子控制下的转基因或结构基因的植物胚乳中，所述成熟胚乳启动子在胚囊或早期胚乳中赋予或调节表达，尽管其并不必需专门或主要在胚囊/早期胚中。又在另一实例中，将包含与转基因或结构基因有效连接的本发明启动子或者其活性片段或衍生物的第一构建体与包含与不同的启动子有效连接的转基因或结构基因的第二构建体一起引入到植物胚乳中，所述不同启动子在胚囊或早期胚乳中赋予或调节表达，尽管其并不必需专门或主要在胚囊/早期胚中。“胚囊”或“早期胚乳”指极核和/或中央细胞，或者是极核的前体和细胞化前的前体(or in precursors to polar nuclei and preceding cellularization)。在胚囊或早期胚乳中有活性的示例性启动子包括例如，拟南芥属viviparous-1基因启动子(见，GenBank号U93215)；拟南芥属Atmyc1基因启动子(Urao等人，Plant Mol.Biol.，32：571-57，1996；Conceicao Plant，5，493-505，1994)；拟南芥属FIE基因启动子(见GenBank号AF129516)；
拟南芥属MEA基因启动子；拟南芥属FIS2基因启动子(见GenBank号AF096096)；拟南芥属FIE 1.1基因启动子(美国专利号6,906,244)；玉米MAC1基因启动子(Sheridan等人，Genetics，142，1009-1020，1996；和玉米Cat3基因启动子(见GenBank号L05934；Abler等人，Plant Mol.Biol.，22，10131-1038)，1993。
拟南芥属MEA基因启动子；拟南芥属FIS2基因启动子(见GenBank号AF096096)；拟南芥属FIE 1.1基因启动子(美国专利号6,906,244)；玉米MAC1基因启动子(Sheridan等人，Genetics，142，1009-1020，1996；和玉米Cat3基因启动子(见GenBank号L05934；Abler等人，Plant Mol.Biol.，22，10131-1038)，1993。
[0100] 本发明也提供用于产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括将本发明的启动子、活性片段或衍生物或者表达构建体或表达载体引入到植物细胞中。用于将核酸引入到植物细胞中的合适方法对本领域技术人员是显而易见的，例如，使用CaCl2的转化和其变体、PEG-介导的原生质体摄入、微粒轰击、电穿孔、显微注射、组织的真空渗入或农杆菌属介导的转化。例如，通过进行如在国际专利申请号PCT/AU2007/000021中所述的农杆菌属介导的转化方法产生转基因植物细胞。
[0101] 优选地，该方法另外包括产生、提供或获得启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体。
[0102] 在一个实例中，用于产生本发明的转基因植物细胞的方法另外包括，在一段时间和在足够产生愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞的条件下，将产生的转基因植物细胞与化合物接触，所述化合物诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞(或其衍生的细胞)的去分化和/或诱导来自所述转基因细胞的未分化细胞的产生。合适的化合物对本领域技术人员是显而易见的，例如合成的或天然的植物生长素如，例如，选自2，4-二氯苯氧乙酸、3，6-二氯-邻-甲氧基苯甲酸(3，6-dichloro-o-anisic acid)、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸和它们的混合物的化合物。“愈伤组织”指在不存在再生的情况下，由细胞分裂产生的一群或一组未分化细胞。
[0103] 本领域技术人员应当知道，在没有过多的实验的情况下，例如，通过再生，可以将转基因植物细胞用于产生转基因植物。“再生”指从转基因植物细胞产生植物或植物部分，特别是小植株的方法，例如，通过器官发生或者胚发生的方法。
[0104] 如本文中所用，术语“器官发生”应当用于指从分生组织中心依次发育成苗和根的过程。
[0105] 如本文中所用，术语“胚发生”应当用于指从体细胞或者配子，以协同的方式(非依次地)一起发育成苗和根的过程。
[0106] 如本文中所用，术语“小植株”应当用于指已经从植物细胞发育成的苗或根，例如，使用体外技术。例如，小植株是使用化合物从愈伤组织诱导生长的苗或根，所述化合物例如，吲哚-3-乙酸、苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、赛二唑素或激动素、2iP。
[0107] 基于前述，对本领域技术人员显而易见的是，本发明提供了包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物细胞用于产生转基因植物或小植株的用途。
[0108] 本发明也提供用于产生转基因植物或小植株的方法，所述方法包括：
[0109] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物细胞或愈伤组织；和
[0110] (ii)从(i)项转基因植物细胞或愈伤组织再生转基因植物或小植株，从而产生转基因植物或小植株。
[0111] 在一个实例中，该方法可用于产生转基因植物或小植株，其中本发明的启动子、活性片段或衍生物赋予核酸(例如转基因)优先地或选择性地在发育的胚乳(任选地包括糊粉和/或盾片)中如上文所定义的表达，和/或阻抑或降低核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中的表达。
[0112] 用于从植物细胞或愈伤组织再生植物或小植株的方法对本领域技术人员和/或本文中所述是显而易见的。例如，在一段时间和在足够产生愈伤组织和/或去分化细胞和/或未分化细胞的条件下，将转基因植物细胞与化合物接触，例如前述化合物，所述化合物诱导愈伤组织形成和/或诱导转基因细胞(或其衍生的细胞)的去分化和/或诱导来自所述转基因细胞的未分化细胞的产生。通常在一段时间和在用于小植株形成的条件下，将愈伤组织与诱导苗和/或根形成的化合物，例如前述用于产生小植株的化合物接触。为了产生整个植物，在一段时间和在用于其发育成整个植物(例如，生长到成熟)的条件下，培养小植株。
[0113] 在一个实例中，用于产生如本文中所述的根据任一实施方案的转基因植物或小植株的方法另外包括，从转基因植物或小植株提供或获得子代植物和/或种子和/或繁殖物质和/或繁殖材料和/或种质，其中所述子代植物、种子、繁殖物质或繁殖材料包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体。
[0114] 本发明另外提供了用于从植物中产生转基因种子的方法，所述方法包括提供、产生或获得如本文中所述根据任意实施方案的转基因植物或小植株，并在一段时间和在足够产生种子的条件下，培养或维持转基因植物或小植株。任选地，该方法另外包括获得包含引入的本发明启动子、活性片段或衍生物或者本发明的表达构建体或表达载体的种子。
[0115] 本发明也提供了包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物或小植株或植物部分或子代植物或种子或繁殖物质或繁殖材料或种质。在一个实例中，该植物或小植株或植物部分或子代植物或种子或繁殖物质或繁殖材料或种质包含与所述植物或小植株或植物部分或子代植物或种子或繁殖物质或繁殖材料或种质的内源核酸有效连接的启动子、活性片段或衍生物。
[0116] 在优选的实施方案中，本发明提供了包含与本发明的启动子、活性片段或衍生物有效连接的核酸的转基因植物或小植株或植物部分或子代植物或种子或繁殖物质或繁殖材料或种质，例如包含本发明的表达构建体或表达载体。优选地，该启动子、活性片段或衍生物赋予核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中表达和/或阻抑或降低核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中的表达。
[0117] 本发明另外提供了转基因植物、小植株或植物部分用于产生合子和/或子代小植株和/或子代植物的用途。
[0118] 另外地，本发明提供了用于育种转基因植物的方法。术语“育种”广义上用于指从亲代植物或其部分或者其细胞中或者使用亲代植物或其部分或者其细胞产生合子和/或子代小植株或植物的任一方法。例如，术语“育种”包括有性繁殖例如，杂交育种或异花授粉，从而将繁殖材料(例如，来自一个植物的花粉)用于受精繁殖材料(例如，来自另一植物的胚珠内的卵细胞)。术语“育种”也包括有性繁殖如自交或自体受精，从而将来自植物的繁殖材料(例如，花粉)用于受精繁殖材料(例如，来自相同植物的胚珠内的卵细胞)。术语“育种”也包括繁殖的营养体繁殖形式，例如，从匍匐茎或根茎或鳞茎或块茎或球茎或插条或移植物或芽产生植物。术语“育种”也包括体外方法，例如体外受精和合子培养。
[0119] 在有性繁殖的情况下，本发明提供了用于育种转基因植物的方法，所述方法包括：
[0120] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物；和
[0121] (ii)育种(i)项产生的转基因植物，从而产生包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子。
[0122] 备选地，该方法包括：
[0123] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的植物繁殖材料；和
[0124] (ii)将植物的繁殖材料与(i)项繁殖材料结合，使得产生包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子。
[0125] 优选地，该方法另外地包括培养合子以形成转基因发育的胚乳和/或转基因小植株和/或转基因植物和/或转基因植物部分，例如，发育的胚乳。
[0126] 在一个实例中，获得上述转基因植物的步骤包括，获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的种子或小植株或植物部分，并培养所述种子、小植株或植物或植物部分，从而获得转基因植物。
[0127] 在杂交育种的情况下，将转基因植物或转基因繁殖材料与转基因植物一起育种或者与转基因繁殖材料结合，以产生对于本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体纯合的或者杂合的合子、植物、小植株或植物部分。备选地，将野生型植物或野生型繁殖材料与转基因植物一起育种或者与转基因繁殖材料结合，以产生对于本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体杂合的合子、植物、小植株或植物部分。
[0128] 优选地，本发明的育种方法另外包括，选择或鉴定包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的合子、小植株、植物部分或整个植物。
[0129] 在一个实例中，本发明的育种另外包括，检测在小植株、植物部分或整个植物中与本发明的启动子、活性片段或衍生物有效连接的核酸的表达或表达模式。
[0130] 在无性繁殖的情况下，本发明提供的方法包括：
[0131] (i)提供、产生或获得包含本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的转基因植物、小植株或植物部分；和
[0132] (ii)在一段时间和在足够植物无性繁殖的条件下，维持转基因植物。
[0133] 合适的条件取决于无性繁殖的形式，并且这对本领域技术人员是显而易见的。例如，通过掩埋苗，可以诱导来自植物的侧枝形成不定根，并在不定根形成后，将该枝从亲本植物中分离，并种植新植物。备选地或另外地，例如通过切割植物、植物部分或小植株的一部分或者使用上述方法，可以诱导植物或小植株或植物部分形成愈伤组织，并在足够变成小植株或植物的条件下维持该愈伤组织。
[0134] 如本文中所示例，如本文中所述根据任一实施方案的启动子对于在植物或植物细胞或植物部分中，例如在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达核酸是有用的。因此，本发明提供了本发明的启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的用途，用于赋予核酸，例如转基因在植物细胞或植物部分中的表达，例如，用于赋予核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中表达，任选地包括和/或用于阻抑或降低核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中的表达。
[0135] 本发明也提供了用于在植物或植物细胞或植物部分中表达核酸的方法，所述方法包括：
[0136] (i)提供、产生或获得包含与核酸有效连接的如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段、衍生物的转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分；和[0137] (ii)在一段时间和在足够所述核酸表达的条件下，维持所述转基因植物或子代。
[0138] 在一个实例中，该启动子、活性片段或衍生物与植物细胞、植物部分或植物的内源核酸有效连接。备选地，该启动子、活性片段或衍生物与转基因有效连接，例如包含本发明的表达载体或表达构建体的转基因植物、转基因植物细胞或转基因植物部分。在本文中描述了合适的转基因，并加以必要的变更将其应用于本发明的实施方案。
[0139] 在一个实例中，将表达本发明的核酸的方法用于赋予核酸优先地或选择性地在发育的胚乳中表达，和/或阻抑或降低核酸在发育的胚乳中优先地或选择性地表达。
[0140] 优选地，该方法另外包括测定核酸在植物、植物细胞或植物部分中的表达或表达模式。
[0141] 基于前述，对本领域技术人员显而易见的是，通过调节核酸在植物细胞或植物部分中的表达，也可以调节植物细胞、植物部分、小植株或整个植物的表型或性状，或者可以将表型或性状赋予植物细胞、植物部分、小植株或整个植物。因此，本发明提供了启动子、活性片段、衍生物、表达构建体或表达载体的用途，用于在植物细胞、植物部分、小植株或整个植物中修饰表型或性状，或者用于将表型或性状赋予植物细胞、植物部分、小植株或整个植物。例如，该植物细胞、植物部分、小植株或整个植物具有改良的营养特性或具有药物特性。备选地或另外地，该植物部分、小植株或整个植物具有修饰的形态。在本文中描述了用于调节或赋予本文中上述的一个或多个性状的合适核酸，例如转基因，并加以必要的变更将其应用于本发明的实施方案。
[0142] 本发明也提供了用于在植物细胞、植物部分、小植株或植物中调节表型或性状，或者用于将表型或性状赋予植物细胞、植物部分、小植株或植物的方法，所述方法包括：
[0143] (i)提供、产生或获得包含与核酸有效连接的本发明启动子、活性片段或衍生物的植物细胞、植物部分、小植株或植物，所述核酸当表达时，在植物细胞、植物部分、小植株或植物中调节表型或性状，或者当表达时，将表型或性状赋予植物细胞、植物部分、小植株或整个植物；和
[0144] (ii)在一段时间和在足够表达核酸和修饰或赋予表型或性状的条件下，维持(i)项的植物细胞、植物部分、小植株或植物。
[0145] 在上文中描述了示例性性状、表型和核酸，并加以必要的变更将其应用于本发明的实施方案。
[0146] 本发明也提供了具有修饰的表型或性状或者新表型或性状的植物细胞、植物部分、小植株或植物，所述植物细胞、植物部分、小植株或植物包含与核酸有效连接的本发明启动子、活性片段或衍生物，所述核酸当表达时，在植物细胞、植物部分、小植株或植物中调节表型或性状，或者当表达时，将表型或性状赋予植物细胞、植物部分、小植株或整个植物。
[0147] 在上文中描述了示例性性状、表型和核酸，并加以必要的变更将其应用于本发明的实施方案。
[0148] 本发明也提供了用于分离新启动子的方法，例如能在发育的胚乳或者其细胞或组织中赋予核酸表达的启动子。例如，本发明提供了用于分离胚乳选择性启动子的方法，所述方法包括：
[0149] (i)鉴定基因的表达产物，与在吸涨种子或吸涨胚中表达产物的表达水平比较，所述基因的表达产物在休眠胚中的表达具有增加的水平；和
[0150] (ii)分离与所述基因有效连接的启动子，其中所述启动子赋予在胚乳中的选择性表达。
[0151] 优选地，用于分离如本文中所述根据任一实施方案的启动子的方法包括：
[0152] (i)在休眠胚中测定多个表达产物的表达水平；
[0153] (ii)在吸涨种子或吸涨胚中测定多个表达产物的表达水平；
[0154] (iii)将(i)项与(ii)项比较，鉴定以增加的水平表达的一个或多个表达产物；和
[0155] (iv)分离赋予(iii)项的一个或多个表达产物表达的启动子。
[0156] 优选地，检测的表达产物是由基因编码的转录物或mRNA。例如，使用微阵列检测转录物或mRNA。
[0157] 本说明书包括使用本文中权利要求后给出的PatentIn Version 3.5制作的核苷酸和氨基酸序列信息。每一核苷酸序列以数字指示符<210>列出的顺序鉴定，之后是序列标识符(例如<210>1、<210>2、<210>3等)。对于每一核苷酸序列，序列的长度和类型(DNA、蛋白质(PRT)等)，以及来源生物都分别通过在数字指示符区<211>、<212>和<213>提供的信息表明。通过术语“SEQ ID NO：”，然后通过序列标识符定义在说明书中提及的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1指在序列列表中指定为<400>1的序列)。
[0158] 在本文中所提及的核苷酸残基的命名为由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的那些核苷酸残基命名，其中A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶、Y表示嘧啶残基、R表示嘌呤残基、M表示腺嘌呤或胞嘧啶、K表示鸟嘌呤或胸腺嘧啶、S表示鸟嘌呤或胞嘧啶、W表示腺嘌呤或胸腺嘧啶、H表示除鸟嘌呤以外的核苷酸、B表示除腺嘌呤以外的核苷酸、V表示除胸腺嘧啶以外的核苷酸、D表示除胞嘧啶以外的核苷酸和N表示任一核苷酸残基。
[0159] 在该说明书中，除非另外特别说明或者上下文另外要求，提及的单一步骤、物质的组合物、步骤组合或者物质组合物的组合应当包括这些步骤、物质的组合物、步骤组合或物质组合物的组合的一个和多个(即一个或多个)。
[0160] 除非另外特别说明，加以必要的变更，可以将本文中所述的每一实施方案应用于每一个其他实施方案。
[0161] 本领域技术人员应当理解，本文中所述的发明容许除那些特定描述之外的改变和修改。应当理解，本发明包括全部此类变化和修改。本发明也单独地或共同地包括在该说明书中提及的或者指出的全部步骤、特征、组合物和化合物，和所述步骤或特征的任一和/或全部组合或者任意两个或多个。
[0162] 本发明并不受本文中所述的特定实施方案的范围限制，所述特定实施方案仅用于示例性目的。如本文中所述，功能性等同的产物、组合物和方法都明确包括于本发明的范围内。
[0163] 如本文中所用，术语“衍生自”应当用于指获自特定来源的具体的完整事物(integer)，尽管并不需要直接来自该来源。
[0165] 图1a提供了显示用于Affymetrix 小麦基因组阵列的未成熟胚总RNA、标记的cRNA和片段化cRNA样品的质量的图示。
[0166] 图1b提供了显示用于Affymetrix 小麦基因组阵列的24小时吸涨种子总RNA、标记的cRNA和片段化cRNA样品的质量的图示。
[0167] 图1c提供了显示用于Affymetrix 小麦基因组阵列的48小时吸涨种子总RNA、标记的cRNA和片段化cRNA样品的质量的图示。
[0168] 图2a是显示用于分离WP05启动子序列的琼脂糖凝胶图示的副本，其中已经分离TM了在GenomeWalker 测定法中扩增的来自小麦的核酸片段。在泳道6中分离了分子量标准。
[0169] 图2b是显示用于分离WP07启动子序列的琼脂糖凝胶的图示的副本，其中已经分TM离了在GenomeWalker 测定法中扩增的来自小麦的核酸片段。在泳道5中分离了分子量标准。
[0170] 图3是命名为pBSubi::bar-nos_R4R3(SEQ ID NO：10)的载体的示意图，其是用于克隆启动子和/或报告基因的基础载体。该载体包含Ubi::bar-nos选择盒和用于启动子、TM报告基因和终止序列Entry Clone的R4R3多点Gateway 进入点。该基础载体用于产生每一启动子的生物射弹转化载体。
[0171] 图4是载体pPZP200 35S hph 35S R4R3(SEQ ID NO：11)的示意图，其含有35S::hph-35St选择盒和用于启动子、报告基因和终止序列Entry Clone的R4R3多点TM
Gateway 进入点。该基础载体用于产生每一启动子的双元转化载体。
Gateway 进入点。该基础载体用于产生每一启动子的双元转化载体。
[0172] 图5是载体pMPB0098(SEQ ID NO：12)的示意图，其是用于使用农杆菌将WP05小麦启动子(SEQ ID NO：3)引入到细胞中的双元载体。该载体衍生自pPZP200 35S hph 35S R4R3，其中已经将小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子插入到了R4R3多TM点Gateway 进入点中。
[0173] 图6是显示载体pMPB0099(SEQ ID NO：13)的示意图，其是用于使用粒子轰击的方法将WP05小麦启动子(SEQ ID NO：3)引入到细胞中的载体。该载体衍生自pBSubi::bar-nos_R4R3，其中已经将小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止TM子插入到了R4R3多点Gateway 进入点中。
[0174] 图7是载体pMPB0084(SEQ ID NO：14)的示意图，其是用于使用农杆菌的方法将来自小麦的2066bp小麦启动子引入到细胞中的双元载体。该载体衍生自pPZP20035S hph35S R4R3，其中已经将2066bp小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子插入TM
到了R4R3多点Gateway 进入点中。
到了R4R3多点Gateway 进入点中。
[0175] 图8是显示载体pMPB0085(SEQ ID NO：15)的示意图，其是用于使用粒子轰击的方法将来自小麦的2066bp小麦启动子引入到细胞中的载体。该载体衍生自pBSubi::bar-nos_R4R3，其中已经将2066bp小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和TMNOS终止子插入到了R4R3多点Gateway 进入点中。
[0176] 图9是显示载体pMPB0086(SEQ ID NO：16)的示意图，其是用于使用农杆菌的方法将来自小麦的2400bp小麦启动子引入到细胞中的双元载体。该载体衍生自pPZP200 35S hph 35S R4R3，其中已经将2400bp小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和NOS终止子TM插入到了R4R3多点Gateway 进入点中。
[0177] 图10是显示载体pMPB0087(SEQ ID NO：17)的示意图，其是用于使用粒子轰击的方法将来自小麦的2400bp小麦启动子引入到细胞中的载体。该载体衍生自pBSubi::bar-nos_R4R3，其中已经将2400bp小麦启动子、合成的绿色荧光蛋白(sGFP)和TMNOS终止子插入到了R4R3多点Gateway 进入点中。
[0178] 图11是显示用于在转基因玉米中表达WP05::GUS-nos表达盒的载体RHF112qc(SEQ ID NO：18)的示意图。
[0179] 其包含与内含子和GUS报告基因有效连接的玉米pZMNP-20启动子。
[0180] 图12是显示用于在转基因玉米中表达表达盒WP07::GUS-nos(含有2400bp WP07启动子)的载体RHF121(SEQ ID NO：19)的示意图。
[0181] 图13是显示用于使用生物射弹转化方法转化小麦的方法示意流程图。
[0182] 图14提供了显示小麦(MPB Bobwhite 26)的生物射弹转化物的多个阶段的图示。图A显示供体植物产生；图B-D显示合子胚分离和轰击；图E-H显示愈伤组织诱导和在草铵膦选择下的再生；图I显示选择下的根形成；图J显示用于转基因子代回收的在控制的温室条件下的T0植物培养。
[0183] 图15提供了显示使用真空渗透的拟南芥(Arabidopsis thaliana)的农杆菌介导的转化的多个阶段图示。图A显示小麦(MPB Bobwhite 26)。图A显示在小篓中萌发的拟南芥Columbia种子；图B和C显示在真空下用于在农杆菌悬浮液中进行花浸染的大约4周龄幼苗；图D显示分离并培养成熟的拟南芥属植物；图E和F显示种子表面消毒和种植在选TM择培养基上，将推定的转基因植物转移到具有ARACON 基料的土壤和管中，用于T2种子收集。
[0184] 图16提供了显示在授粉后第10-14天，定位于转基因种子的胚乳而不是定位在胚或定位在非转基因种子中的由小麦WP05启动子驱动的GFP表达的图示。
[0185] 图17提供了显示在授粉后第25-30天，定位于转基因种子的胚乳而不是定位在胚或定位在非转基因种子中的由小麦WP05启动子驱动的GFP表达的图示。
[0186] 图18提供了显示在授粉后第10-14天，定位于转基因种子的胚乳而不是定位在胚或定位在非转基因种子中的由小麦WP07启动子驱动的GFP表达的图示。
[0187] 图19提供了显示在授粉后第25-30天，定位于转基因种子的胚乳而不是定位在胚或定位在非转基因种子中的由小麦WP07启动子驱动的GFP表达的图示。
[0188] 图20提供了显示在转基因玉米种子的胚乳中由小麦WP05启动子驱动的GUS报告基因的强空间表达的图示。在授粉后第5天在转基因种子的胚乳中可见表达。
[0189] 图21提供了显示在转基因玉米种子的胚乳中由小麦WP07启动子驱动的GUS报告子基因的强空间表达的图示。在授粉后第10天在转基因种子的胚乳中可见表达。
[0190] 图22提供了LOC_Os01g01290.1和ZmGSStuc11-12-04.64626.1之间序列比对的示意图，使用-1的核苷酸错配罚分，将LOC_Os01g01290.1用作为查询序列，通过BLASTn检索从玉米基因组集合(Maize Genomic Assemblies)获得ZmGSStuc11-12-04.64626.1。
[0191] 图23提 供 了 在 非 重 叠 玉 米 基 因 集 群ZmGSStuc11-12-04.16895.1 和ZmGSStuc11-12-04.7167.1之间序列比对的示意图，将DQ244863.1用作为查询序列，通过BLASTn检索从玉米基因组集合获得ZmGSStuc11-12-04.7167.1。
[0192] 图24提供了DQ244863.1和高粱基因集合SbGSStuc11-12-04.1189.1之间序列比对的示意图，将DQ244863.1用作为查询序列，通过BLASTn检索从高粱基因组集合(Sorghum Genomic Assemblies)获得SbGSStuc11-12-04.1189.1。
[0193] 优选实施方案的详述
[0194] 用于测定本发明启动子的序列分析参数
[0195] a)序列鉴定限制
[0196] 在测定两个氨基酸序列是否都属于本文所定义的百分比同一性限制范围内时，本领域技术人员应当知道，可以进行氨基酸序列的逐一对比。在此类对比或比对中，取决于进行比对所使用的算法，会在不相同的残基处产生差异。在本文中，提及的两个或多个氨基酸序列的百分比同一性或相似性应当用于指，使用本领域技术人员已知的标准算法测定的所述序列之间，分别的相同和相似残基数目。具体而言，使用美国Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Maddison，Wisconsin的软件，例如使用Devereaux等人的GAP程序，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984(其应用Needleman和Wunsch的算法，J.Mol.Biol.48，443-453，1970)计算氨基酸同一性和类似性。备选地，将Thompson等人的CLUSTAL W算法，Nucl.Acids Res.22，4673-4680，1994用于获得多个序列的比对，其中在比对中必需或期望最大化相同/类似残基的数目并最小化序列缺口的数目和/或长度。
[0197] 备 选 地，由 National Center for Biotechnology Information(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人J.Mol.Biol.215：403-410，1990)提供了一套通常使用的并且免费的序列对比算法，其可从几个来源得到，包括NCBI，Bethesda，Md.。BLAST软件套件包括多种序列分析程序，包括用于将已知核苷酸序列与来自多个数据库的其他多核苷酸序列比对的“blastn”和用于将已知氨基酸序列与来自一个或多个数据库的一个或多个序列比对的“blastp”。还可以得到的是用于两个核苷酸序列的直接两两对比的称为“BLAST 2 Sequences”的工具。
[0198] 在测定两个核苷酸序列是否都属于本文中所列出的特定百分比同一性限制内时，本领域技术人员应当知道，可以进行序列的逐一对比或多重比对。在此类对比或比对中，取决于进行比对所使用的算法，会在不相同的残基处产生差异。在本文中，提及的两个或多个核苷酸序列的百分比同一性应当用于指，使用本领域技术人员已知的标准算法测定的所述序列之间相同残基的数目。例如，使用BESTFIT程序或其他Computer Genetics Group，Inc.，University Research Park，Madison，Wisconsin，美国(Devereaux等人，Nucl.Acids Res.12，387-395，1984)合适的程序可以比对核苷酸序列并计算它们的同一性。如上所讨论，对于比对核苷酸序列和测定百分比同一性，BLAST也是有用的。
[0199] 本文中所提及的使用术语“至少”或“至少约”的序列同一性的特定水平应当用于包括序列同一性大于所列出的水平的任一水平。因此，本发明包括与所列出的序列至少约80％同一性、或者与所列出的序列至少约85％同一性、或者与所列出的序列至少约90％同一性、或者与所列出的序列至少约95％同一性、或者与所列出的序列至少约98％或99％同一性的核苷酸序列或氢基酸序列。
[0200] b)顺式作用元件的分析
[0201] 用于测定启动子是否包含顺式作用元件的方法对本领域技术人员是显而易见的。例如，使用本领域已知的和/或本文中所述的方法分离启动子，并使用本领域已知的和/或本文中所述的方法测定启动子的序列，例如在Ausube等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987中)和Sambrook等人(在Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001中)中述及的方法。例如，使用如基于PCR的基因组步移或者例如如在本文中所述通过筛选核酸文库，分离包含编码含有至少一个最小GILT结构域的多肽序列的核酸的启动子或其片段，并使用例如，基于双脱氧核苷酸的测序，测定启动子的序列。然后分析该序列以测定其是否包含上文中所述的顺式作用元件的一个或多个。
[0203] (i)如在Higo等人，Nucl.Acids Res.27：297-300，1999中所述的并可从National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，日本得到的PLACE(植物顺式作用DNA元件)；
[0204] (ii)如在Thijs等人，J Comput Biol.9：447-464，2002中所述的并可从Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology(VIB)，Zwijnaarde，比利时得到的Plant CARE(顺式作用调节元件)；和
[0205] (iii)如在Shahmuradov等人，Nucleic Acids Res.31：114-7，2003中所述的PlantProm数据库。
[0206] 如上文中所讨论，本发明人已经鉴定了多个启动子，并通过分析这些启动子的序列，已经鉴定了保守的顺式作用元件，例如来自能在休眠胚或者其细胞或组织中赋予核酸表达或表达模式的启动子的保守顺式作用元件。在示例性启动子序列中包含的示例性顺式作用元件在本文中描述于表4-8中。表1中描述了在5个示例之间保守的示例性顺式作用元件。因此，优选的是，如在本文中所述根据任一实施方案的启动子包含表1中所述的一个或多个顺式作用元件。
[0207] 表1
[0208]
[0209]
[0210]
[0211] 应当理解，根据长度可以改变本发明的启动子中任一特定的顺式作用元件的精确数目，并且允许有表1中特定指出的那些元件以外的其他元件。从本文中例如表4-8中提供的数据，本领域技术人员可以容易地确定表1中所显示的元件改变的任一数目。
[0212] 本发明启动子的植物来源
[0213] 在一个实例中，如本文中所述根据任一实施方案的启动子来自小麦例如，本文中SEQ ID No：3-5或者包含表4和/或表5中显示的顺式作用元件的所有组成成分或者在表4和表5中显示的那些元件之间保守的顺式作用元件的所有组成成分，而不需要考虑它们在每一单独的序列中的精确方向和/或位置。
[0214] 术语“小麦”在广义上用于指一年生或两年生禾本科植物，其能产生直立的花穗和浅棕色籽粒，并属于包括小麦属物种(Triticum sp.)和山羊草属物种(Aegilops sp.)的山羊草属-小麦属(Aegilops-Triticum)。因此，术语“小麦”涉及小麦属的多种一年生谷物禾本科植物的任意一种，例如那些通常在温带地区种植的一年生谷物禾本科植物，以它们的可食用籽粒用于产生面粉，例如在面包和/或饼干和/或面条和/或面团中使用。基于本文中的描述，合适的物种和/或栽培品种对本领域技术人员是显而易见的。
[0215] 术语“小麦”也包括任一四倍体、六倍体和异源多倍体(例如，异源四倍体和异源六倍体)山羊草属物种或小麦属物种，其携带异源六倍体普通小麦(Triticum aestivum)或其变体的A基因组和/或B基因组和/或D基因组。这包括A基因组二倍体(例如，一粒小麦(T.monococcum)和乌拉尔图小麦(T.urartu))、B基因组二倍体(例如，斯佩特状山羊草(Aegilops speltoides)和斯氏山羊草(T.searsii)和紧密相关的S基因组二倍体(例如，沙伦山羊草(Aegilops sharonensis))、D基因组二倍体(例如，T.tauschii和节节麦(Aegilops squarrosa))、四倍体(例如，圆柱小麦(T.turgidum)和二粒小麦(T.dicoccum)(AABB)、节节麦(Aegilops tauschii)(AADD))和六倍体(例如，普通小麦(T.aestivum)和密穗小麦(T.compactum))。术语“小麦”可以包括山羊草属物种或小麦属物种的品种、栽培品种和品系，但是除非另外特别说明，并不限于其任一特定的品种、栽培品种或品系。
[0216] 优选地，小麦是普通小麦或圆柱小麦(以前称为硬粒小麦(T.durum))或者它们的品种、栽培品种或品系，任选地针对种子质量性状进行选择，例如，产率、面包制作质量、饼干制作质量或面条/面团制作质量。从前所述，对本领域技术人员显而易见的是，小麦的许多品种是多倍体。因此，任一单个小麦基因组可以包含多个如本文中所定义成为本发明的一部分的启动子。本发明明确包括任一和/或全部这些启动子。
[0217] 在本发明的另一实例中，如本文中所述的根据任一实施方案的启动子来自玉米，例如本文中SEQ ID No：7和8或者包含表6和/或表8中显示的顺式作用元件的所有组成成分或者在表6和表8中显示的那些元件之间保守的顺式作用元件的所有组成成分，而不需要考虑它们在每一单独的序列中的精确方向和/或位置。术语“玉米”应当用于指玉蜀黍属的草类。优选地，术语玉米包括玉米(Zea mays)物种的任一植物。术语玉米包括此类物种如，例如硬质玉米(Z.mays indurata)、Z.mays indenta、爆裂型玉米(Z.mays everta)、甜玉米(Z.mays saccharata)、粉质型玉米(Z.mays amylacea)、有稃型玉米(Z. mays tunicata)和/或糯质型玉米(Z.mays Ceratina Kulesh)。
[0218] 在本发明的另一实例中，如本文中所述根据任一实施方案的启动子来自稻，例如本文中SEQ ID No：6或者包含表5中显示的顺式作用元件的所有组成成分，而不需要考虑它们在每一单独的序列中的精确方向和/或位置。术语“稻”应当用于指稻属的草类，包括印度型籼稻(indica rice)和日本型粳稻(japonica rice)物种及变种。优选地，术语稻包括稻(Oryza sativa)物种的任一植物。
[0219] 在另外的实例中，如本文中所述的根据任一实施方案的启动子来自大麦或高粱或燕麦或栗(例如珍珠栗或散穗黍)或者荞麦(例如，蓼科的荞麦)或者燕麦(例如，燕麦)或者来自选自禾本科(Graminaceae、Gramineae或Poaceae)的任一其他植物的细胞、组织或器官。
[0220] 启动子的分离
[0221] 使用多种分子生物学技术的任意一种可以分离如本文中所述根据任一实施方案的启动子。例如，如在SEQ ID NO：3-9的任意一个或多个中，使用基于本文中所述启动子的序列的引物，使用多聚酶链反应分离启动子。例如，产生包含至少约20至约30个核苷酸的引物对，所述引物对能与包含SEQ ID NO：3-9的任意一个或多个中所述序列的核酸杂交。优选地，引物的一个或两个都能与SEQ ID NO：3-9中所述的多个序列杂交，即，与保守区和/或杂交的引物是简并性的。设计和产生用于PCR的引物的合适方法是本领域已知的和/或描述于Dieffenbach(编辑)和Dveksler(编辑)(在PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratories，NY，1995中)。然后将这些引物与核酸模板，例如来自植物的基因组DNA的不同链杂交，并酶促扩增模板的特定核酸拷贝。扩增后，使用本领域已知的方法分离扩增的核酸，并优选地克隆到合适的载体中。该方法对于从核酸，优选地来自任一植物的基因组DNA中分离启动子是有用的。
[0222] 备选地或另外地，产生能与本文中所述根据任一实施方案的启动子杂交的寡核苷酸。优选地，该寡核苷酸能与如本文中所述根据任一实施方案的启动子的区域杂交，所述启动子的区域在多个启动子中是保守的。备选地或另外地，该寡核苷酸能在低或中等严格条件下与多个如本文中所述根据任一实施方案的启动子杂交。然后，使用本领域已知的和例如描述于Ausubel等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987中 )，Sambrook等 人 (在 Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中的方法，将该寡核苷酸用于筛选核酸文库，例如包含来自植物的基因组DNA的片段的文库。然后分离合适的片段，根据需要，从片段中分离启动子。
[0223] 基于其在发育的胚乳中赋予表达的能力，也可以分离合适的启动子。例如，使用与本发明的启动子杂交的一个或多个寡核苷酸引物，使用来自发育的胚乳的mRNA进行RT-PCR，以扩增包含该核酸的cDNA片段。然后，将该片段用于分离能赋予所述mRNA表达或表达模式的启动子。例如，如本文中所述，将基因组步移用于分离启动子。在该方法中，例如使用限制性内切核酸酶切割来自植物的基因组DNA，并随后与具有已知序列的接合体连接。然后使用能与接合体退火的引物和能与cDNA的片段退火的引物进行PCR。以这种方式，分离了在其天然情况下与启动子连接的上游序列或5’序列，包括该启动子序列。
[0224] 备选地，将寡核苷酸用于筛选来自植物的基因组DNA文库，以分离包含含有启动子的基因或其片段的基因组DNA的片段。然后，可以将来自分离的基因组DNA片段的序列用于分离其他基因组DNA片段。通过例如使用本文中所述的方法分析基因组DNA的核苷酸序列，测定启动子的序列。
[0225] 计算机(In-silico)筛选对于鉴定合适的启动子也是有用的。例如，本发明人已经鉴定了许多与如本文中所述根据任一实施方案的启动子天然有效连接的基因保守区。基于一个或多个这样的序列，检索了来自植物的序列的数据库，例如，包含基因组DNA序列的数据库，并鉴定了与保守区同源的序列。然后分析所鉴定区域的上游序列，以鉴定与其有效连接的启动子序列。启动子的计算机预测方法在本领域是已知的并例如描述于Shahmuradov等人，Nucleic Acids Research 33：1069-1076，2005中，或者使用从School of Biological Sciences，Royal Holloway University of London可得到的植物启动子预测软件。
[0226] 应当经验地测试使用任一上述方法鉴定的启动子，以测定其赋予核酸，例如在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达的能力。基于本文中描述，用于测试启动子的合适方法对于本领域技术人员是显而易见的。
[0227] 启动子、活性片段或衍生物赋予胚乳表达的能力
[0228] 用于测定启动子或者其片段或其衍生物赋予核酸表达的能力的方法，包括例如，测定启动子、片段、衍生物诱导报告基因在植物细胞、组织或器官中表达的能力。
[0229] 例如，将如本文中所述根据任一实施方案的启动子或片段或衍生物置于与报道基因(例如可以产生检测信号的报告基因)或者允许选择表达该基因的细胞的报告基因有效连接。
[0230] 报告基因对本领域技术人员是显而易见的，并包括，例如，bar基因(双丙氨酰膦抗性基因)、细菌新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因、潮霉素磷酸转移酶基因、aacC3基因、aacC4基因、氯霉素乙酰转移酶基因、编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的基因或编码膦四菌素合成酶的基因。这些基因的每一种都赋予除草剂或抗生素抗性。备选地，在化合物存在的情况下，报告基因赋予存活和/或生长的能力，其中未转化的植物细胞不能生长和/或存活，例如mana基因(Hansen和Wright，Trends in Plant Sciences，4：226-231，1999)、氰酰胺水合酶(Cah)基因(SEQ ID NO：26)(如在USSN 09/518,988中所述)或者D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因(Erikson等人，Nature Biotechnology，22：455-458，2004)。
[0231] 表达时，产生可检测的表达产物的报告基因包括，例如β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS；通过代谢5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡萄糖苷酸以产生蓝色沉淀检测其的表达)、细菌荧光素酶基因、萤火虫荧光素酶基因(在植物细胞与荧光素接触后可检测到)或者荧光报告基因例如，单体香菇珊瑚(discosoma)红色荧光蛋白质(Campbell等人，Proc Natl Acad Sci USA.99：7877-7882，1992)或者来自碗水母(Aequorea coerulescens)的单体GFP(Gurskaya等人，Biochem J.373：403-408，2003)。
[0232] 例如，使用如本文中所述的方法，在将如本文中所述根据任一实施方案的启动子或片段或衍生物与合适的报告基因连接后，将得到的表达构建体转化到植物细胞或植物部分或植物中。然后检测报告基因的表达。例如，在选择性报告基因的情况下，在合适的除草剂或抗生素存在的情况下培养转化的植物细胞、部分或植物，并且只有那些表达报告基因的胚或细胞才能生长。在可检测报告基因的情况下，分析植物细胞、植物部分或整个植物以检测可检测报告基因表达产物的表达，例如荧光或者底物代谢产生的可检测代谢产物。
[0233] 备选地，使用本领域已知的和/或本文中所述的方法转化植物细胞或组织。然后将转化的细胞或组织用于产生植物。备选地，育种该植物，并种植该植物的后代。由于该方法允许在多种组织和在多个发育阶段检测报告基因的表达水平，所以就此而言，其提供了另外的优点。在鉴定在发育的胚乳中赋予核酸表达的启动子的情况下，培养植物直到它们产生种子。然后分析来自休眠种子的胚乳，以检测报告基因的表达。该方法允许鉴定在发育的胚乳或者其细胞或组织中优先地或选择性地表达报告基因的启动子。
[0234] 使用例如Northern印迹、定量PCR、微阵列分析或免疫测定，可以通过测定与启动子天然连接的核酸的表达产物的表达模式，也可以测定赋予核酸，例如在发育的胚乳或细胞或组织中表达或表达模式的启动子的能力。合适的方法对本领域技术人员是显而易见的和/或描述于Ausubel等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)，Sambrook等人(在Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中。
[0235] 例如，如在本文中所示例，本发明人已经应用微阵列分析在多种组织中检测了与如本文中所述根据任一实施方案的启动子连接的核酸的表达水平。该方法包括，从来自植物的多种组织中分离mRNA，产生模板RNA(copy RNA)(cRNA)并标记cRNA，例如使用荧光标记如Cy5。将来自对照组织的模板RNA也用与用于标记测试cRNA(例如Cy5)不同的标记标记，并将两种样品混合。然后将标记的cRNA与在上面固定化了能与目地启动子连接的核酸特异杂交的寡核苷酸的固相基质接触。在标记的mRNA与寡核苷酸杂交足够的时间后，洗涤固相基质并检测每一标记的荧光水平。以这种方式，相对于对照样品中的水平，测定了在测试样品中目的核酸的表达水平。使用该方法，本发明人显示，由与如本文中所述根据任一实施方案的启动子有效连接的基因编码的转录物在发育的胚乳(测试样品)中相对于成熟种子、营养组织或繁殖组织(其中本发明的示例性启动子并不赋予显著的表达)(对照样品)以增加的水平表达。
[0236] 本发明人也使用定量RT-PCR测定了与如本文中所述根据任一实施方案的启动子连接的核酸的表达水平。用于进行该定量RT-PCR的合适方法对本领域技术人员是显而易见的和/或描述于例如US 6,174,670。
[0237] 活性启动子片段
[0238] 本发明也包括本文中所述根据任一实施方案的启动子的片段。在一个实例中，该活性片段保留了启动子赋予核酸在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达或表达模式的能力。在这点上，片段不需要赋予与其来源的启动子一样的表达或表达模式的水平。例如，片段比其来源的启动子较低程度地诱导与其有效连接的核酸的表达，例如，因为其缺少转录因子的结合位点。备选地，片段比其来源的启动子更大程度地诱导与其有效连接的核酸的表达，例如，因为其缺少抑制转录的蛋白质的结合位点。
[0239] 在一个实例中，本发明提供了如本文中所述根据任一实施方案的启动子的活性片段，所述活性片段包含例如来源于在序列表中所述的示例性启动子的至少约200个碱基对(bp)或至少约500bp或至少约700bp或至少约900bp或至少约1000bp。
[0240] 在另一实例中，本发明的活性启动子片段至少包含来自全长启动子的基础启动子调节区，例如对于在种子胚乳中转录起始必需和/或足够的最小序列。基础启动子调节区包含功能性TATA框元件，其例如位于转录起始位点上游约15至约50个核苷酸之间，并且优选地在转录起始位点上游约15至约40个核苷酸之间，更优选在转录起始位点上游约15至约30或35个核苷酸之间。出于命名的目的，本文中的基础启动子调节区包含SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补序列的最后100或90或80或70或60或50或40个核苷酸。
[0241] 优选的基础启动子调节区也包含CCAAT框元件(例如，序列CCAAT或GGGCG)，其位于转录起始位点上游约40至约200个核苷酸之间或者约50至约150个核苷酸之间或者约60至约120个核苷酸之间。出于命名的目的，本文中的基础启动子调节区包含SEQ ID No：
3-9的任意一个或其互补序列的最后200或190或180或170或160或150或140或130或120或110或100或90或80或70或60或50个核苷酸。
3-9的任意一个或其互补序列的最后200或190或180或170或160或150或140或130或120或110或100或90或80或70或60或50个核苷酸。
[0242] 本发明也提供了包含基础启动子调节区和天然启动的一个或多个上游元件的活性片段。例如，活性片段可以包含SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补序列的最后500个核苷酸或者最后400个核苷酸或最后300个核苷酸或最后200个核苷酸。备选地，该活性片段可以是与在SEQ ID No：3-9的任意一个中所述的启动子序列比较，在其3’端截短的，例如，通过删除转录起始位点下游的序列。例如，活性片段可以包含来自下述序列的序列：SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约500个核苷酸至约40个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约400个核苷酸至约40个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约300个核苷酸至约40个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约
200个核苷酸至约40个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约400个核苷酸至约50个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约500个核苷酸至约60个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约300个核苷酸至约70个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约200个核苷酸至约80个核苷酸。并不排除其他片段。此类活性片段优选地包含如本文中所述的一个或多个保守序列基序。
200个核苷酸至约40个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约400个核苷酸至约50个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约500个核苷酸至约60个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约300个核苷酸至约70个核苷酸，或者来自SEQ ID No：3-9的任意一个或其互补的序列的3’端上游约200个核苷酸至约80个核苷酸。并不排除其他片段。此类活性片段优选地包含如本文中所述的一个或多个保守序列基序。
[0243] 用于产生如本文中所述根据任一实施方案的启动子的片段的合适方法对本领域技术人员是显而易见的和/或描述于例如Ausubel等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)，Sambrook等人(在Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中。例如，使用任一已知的方法，例如使用一个或多个限制性内切核酸酶切割以前分离的启动子，并然后测试得到的片段以测定其赋予核酸在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达或表达模式的能力。备选地，使用核酸扩增反应，例如PCR扩增如本文中所述根据任一实施方案的启动子的片段。然后测试得到的片段以测定其是否能赋予核酸，例如在发育的胚乳中表达或表达模式。
[0244] 在本文中描述了用于测定片段赋予核酸表达或表达模式能力的合适方法。
[0245] 启动子衍生物
[0246] 本发明包括的启动子衍生物包括衍生自如本文中所述根据任一实施方案，但含有来源于示例性启动子或异源启动子的一个或多个其他调节元件的启动子。例如，该其他调节元件进一步增强与其有效连接的核酸的表达和/或改变与其有效连接的序列的表达时间。例如，通过包含来自不同胚乳有效的启动子的核酸，可以修饰包含SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8或9中所述核苷酸序列的该嵌合启动子，以进一步增强与该启动子有效连接的核酸在发育的胚乳或者其细胞或组织中的表达。过本领域技术人员可以容易地实现此类实施方案。
[0247] 本领域技术人员应当知道，通过突变在与核酸有效连接的启动子序列内的调节基因序列(例如，顺式作用元件或5’非编码区等)，也可以修饰植物或植物部分中结构基因表达的水平和/或结构基因表达的时间和/或结构基因表达的定位。例如，为了实现该目标，将本发明的启动子序列进行诱变以产生单一或多个核苷酸替换、删除和/或添加。
[0248] 备选地或另外地，可以改变启动子内特定调节序列的排列，包括缺失某些调节序列和/或添加来源于相同或不同启动子序列的调节序列。
[0249] 如本文中所述根据任一实施方案的启动子的优选衍生物包含在如本文中所述根据任一实施方案的启动子中存在的一个或多个功能性顺式作用元件，例如，对于赋予表达或表达模式所需的或者与赋予表达或表达模式相关的顺式作用元件。
[0250] 启动子的衍生物可以通过合成方法或备选地，从天然存在的来源衍生产生。
[0251] 例如，在不完全丧失功能的情况下，可以衍生启动子序列，以使其至少包含一个或多个以下序列：
[0252] (i)5’非编码区；和/或
[0253] (ii)一个或多个顺式作用元件，例如用于转录调节蛋白质或翻译调节蛋白质的一个或多个功能性结合位点、一个或多个上游激活序列、增强子元件或沉默元件；和/或[0254] (iii)TATA框基序；和/或
[0255] (iv)CCAAT框基序；和/或
[0256] (v)上游开放阅读框(uORF)；和/或
[0257] (vi)转录起始位点；和/或
[0258] (vii)翻译起始位点；和/或
[0259] (viii)编码前导序列的核苷酸序列。
[0260] 如本文中所用，术语“5’非编码区”在其广义上应当用于包括来源于基因，例如在发育的胚乳中表达的基因的上游区的全部核苷酸序列，而不是那些编码包含所述基因的多肽产物的氢基酸残基的序列。该区域包括内含子，例如来源于泛素基因的内含子。
[0261] 如本文中所用，术语“uORF”指在基因中定位在功能性翻译起始位点上游并通常在5’转录区(即前导序列)内的核苷酸序列，其编码氨基酸序列。尽管不被任一理论或作用方式所束缚，uORF的功能为阻止与其有效连接的结构基因序列过量表达或者备选地，降低或阻止该表达。
[0262] 本发明包括的其他启动子衍生物包括，例如包含如本文中所述根据任一实施方案的启动子的双向启动子。该双向启动子包含，例如(i)如本文中所述根据任一实施方案的启动子，并且其定位的位置为赋予例如与其3’端连接的核酸的表达或表达模式；和(ii)与(i)项的启动子的5’端连接的第二启动子，并且其定位的位置为赋予与第二启动子的5’端连接的核酸表达或表达模式。明确地，第二启动子也可以是如本文中所述根据任一实施方案的启动子。
[0263] 表达构建体和表达载体
[0264] 分离了如本文中所述根据任一实施方案的启动子后，可以产生表达构建体。该表达构建体包含与待表达的核酸(即转基因)有效连接的如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物，所述核酸例如编码目的多肽的核酸或者转录以编码例如siRNA、核酶、微RNA或RNAi的核酸。
[0265] 本发明考虑将如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物与任一转基因连接。转基因的合适实例对本领域技术人员是显而易见的和/或在本文中描述。
[0266] 用于将如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物和转基因连接的方法对本领域技术人员是显而易见的，并且包括例如，如使用T4 DNA连接酶，将启动子、活性片段或衍生物与转基因连接。备选地或另外地，使用重组方法，例如剪接-重叠延伸，产生启动子、活性片段或衍生物和转基因的融合。用于连接两个或多个核酸的合适方法也描述于，例如Ausubel等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience，ISBN 047 150338，1987)，Sambrook等人(在Molecular Cloning：
Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中。
Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版2001)中。
[0267] 该表达构建体可以包含另外的组分，例如，如编码靶向序列(targeting sequence)或可检测标记的序列。该另外组分可以定位在启动子和转基因之间，例如以使其与由转基因编码的多肽5’端融合表达。备选地，另外的组分可以定位于转基因的3’端。
[0268] 靶向序列是在多肽内的氨基酸序列，其指导多肽至特定的亚细胞定位。用于本发明的执行的靶向序列是本领域已知的，并描述于例如，Johnson等人，The Plant Cell 2：525-532，1990；Mueckler等 人Science 229：941-945，1985；Iturriaga等人The Plant Cell 1：381-390，1989；McKnight 等 人，Nucl.Acid Res.18：4939-4943，1990；Matsuoka和Nakamura，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834-838，1991。此外，题目为“Recombinant proteins from plants”的书，C.Cunningham和A.J.R.Porter编辑，1998 Humana Press Totowa，N.J.描述了用于在植物中产生重组蛋白质的多种合适方法和用于靶向蛋白质至植物细胞中不同区室的方法。
[0269] 合适的可检测标记包括，例如表位，例如，流感病毒红细胞凝集素(HA)、猿猴病毒5(V5)、多组氨酸、c-myc、FLAG。
[0270] 备选地或另外地，在表达载体中包括了如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物。在这方面，该表达载体可以包含与如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物有效连接的转基因。备选地或另外地，表达载体可以包含用于插入转基因的手段(means)，以使其与启动子、片段或衍生物有效连接。此类手段包括，例如包含一个或多个限制性内切酶切割位点的多克隆位点。其他手段包括一个或多个重组位点。
[0271] 表达载体的其他组分对本领域技术人员是显而易见的，并包括例如，复制起点，例如以允许载体在细菌细胞中复制，例如ColE1复制起点。
[0272] 表达载体也可以包含与启动子有效连接的例如如上文所述的选择标记。例如，与泛素启动子如来自泛素(ubi)或来自花椰菜花叶病毒例如CaMV 35S的启动子有效连接的选择标记。合适的启动子和选择标记对本领域技术人员是显而易见的。
[0273] 在使用基于农杆菌的转化将表达载体递送到植物中的情况下，载体优选地包含位于待递送到植物细胞中的转基因的侧翼的左边缘(LB)序列和右边缘(RB)序列，即转移DNA。该载体也可以包含合适的选择标记，用于选择含有例如，赋予对氨苄青霉素抗性的载体的细菌。
[0274] 优选地，载体是双Ti质粒或Ri质粒。双Ti质粒或Ri质粒基于这样的观察产生，即T-DNA(转移到植物细胞的核酸)和对于转移T-DNA必需的vir基因可以位于不同的质粒上(Hoekema等人，Nature，303：179-180，1983)。在这方面，vir功能通常由用于转化植物细胞的农杆菌菌株中的或者其内源的卸甲Ti质粒残留物提供。
[0275] 因此，双Ti质粒或Ri质粒包含定位于转移核酸(例如，T-DNA)内的转基因。该包含转基因的转移核酸的侧翼通常为LB和RB或者由LB和RB指示。
[0276] 合适的双质粒是本领域已知的和/或市售的。例如，双Ti载体的选择包括pBIN19(Bevan等 人，Nucleic Acids Res.，12：8711-8721，1984)；pC22(Simoens 等 人，Nucleic Acids Res.14：8073-8090，1986)；pGA482(An等人，EMBO J.4：277-284，1985)；pPCV001(Koncz 和 Schell Mol.Gen.Genet.204：383-396，1986)；pCGN1547(McBride 和Summerfelt 14：269-276，1990)；pJJ1881(Jones 等 人，Transgenic Res.1：285-297，
1992)；pPZP111(Hajukiewicz 等 人，Plant Mol.Biol.，25：989-994，1994)； 和pGreen0029(Hellens等人，Plant Mol.Biol.，42：819-832，2000)。
1992)；pPZP111(Hajukiewicz 等 人，Plant Mol.Biol.，25：989-994，1994)； 和pGreen0029(Hellens等人，Plant Mol.Biol.，42：819-832，2000)。
[0277] 其他双元载体描述于，例如Hellens和Mullineaux Trends in Plant Science 5：446-451，2000。也可以应用例如如本文中所述的或本领域已知的这些质粒的变体。
[0278] 合适的Ri质粒也是本领域已知的，并包括，例如pRiA4b(Juouanin Plasmid，12：91-102，1984)、pRi1724(Moriguchi 等 人，J.Mol.Biol.307：771-784，2001)、pRi2659(Weller等人，Plant Pathol.49：43-50，2000)或pRi1855(O ′Connell等人，Plasmid 18：156-163，1987)。
[0279] 转基因
[0280] 如上所述，本发明包括包含与任一转基因连接的如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物的表达构建体或表达载体。
[0281] 在一个实例中，转基因编码在植物的发育胚乳或者其细胞或组织中待表达的多肽。例如，转基因编码参与淀粉或贮藏蛋白生物生物合成的多肽。该转基因的表达对于延长谷物灌浆或增强产率特性、或者对增加种子的营养特性是有用的。该表达构建体对例如，改良终产物的性状是有用的，并且在不受限制的情况下，包括那些编码种子贮藏蛋白、脂肪酸通路酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的表达构建体。例如，合适的种子贮藏蛋白包括玉米醇溶蛋白(例如，如在美国专利号4,886,878、4,885,357和5,215,912中所述)、7S蛋白质(例如，如在美国专利号5,003,045，和5,576,203中所述)、巴西坚果蛋白质(例如，如在美国专利号5,850,024中所述)、无苯丙氨酸蛋白质(例如，如在PCT公开WO 96/17064中所述)、清蛋白(例如，如在PCT公开WO 97/35023中所述)。
[0282] 脂肪酸通路酶的实例包括，例如硫酯酶(例如，如在美国专利号5,512,482、5,530,186和5,945,585中所述)和去饱和酶(例如，如在美国专利号5,689,050、
5,663,068和5,614,393中所述)。在一个实例中，下调编码硬脂酰-ACP去饱和酶的基因的表达，从而增加种子的硬脂酸含量，例如Knultzon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，
2624(1992)和WO99/64579。在另一实例中，通过FAD-2基因修饰升高或增加油酸含量和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸含量，例如美国专利号6,063,947；6,323,392和
6,372,965和WO 93/11245。在另一实例中，缀合的亚麻酸的含量或者亚油酸含量是修饰的，例如WO 01/12800。在另一实例中，选自LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps和lpa基因(例如lpa1、lpa3、hpt或hggt)的一个或多个基因的表达是修饰的，例如WO 02/42424、WO98/22604、WO 03/011015、美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号
6,825,397、美国专利公开号20030079247、20030204870和WO02/057439和WO 03/011015，以及Rivera-Madrid，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.92，5620-5624，1995。
5,663,068和5,614,393中所述)。在一个实例中，下调编码硬脂酰-ACP去饱和酶的基因的表达，从而增加种子的硬脂酸含量，例如Knultzon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，
2624(1992)和WO99/64579。在另一实例中，通过FAD-2基因修饰升高或增加油酸含量和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸含量，例如美国专利号6,063,947；6,323,392和
6,372,965和WO 93/11245。在另一实例中，缀合的亚麻酸的含量或者亚油酸含量是修饰的，例如WO 01/12800。在另一实例中，选自LEC1、AGP、Dek1、Superal1、mi1ps和lpa基因(例如lpa1、lpa3、hpt或hggt)的一个或多个基因的表达是修饰的，例如WO 02/42424、WO98/22604、WO 03/011015、美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号
6,825,397、美国专利公开号20030079247、20030204870和WO02/057439和WO 03/011015，以及Rivera-Madrid，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.92，5620-5624，1995。
[0283] 在另一实例中，为了在转基因植物中实现相当高含量的多不饱和脂肪酸(PUFA；例如具有至少两个或三个或四个或五个或六个双键的C18-，C20-或C22-脂肪酸)，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下，表达一个或多个PUFA生物合成基因。任选地，在多个启动子、其活性片段或衍生物的控制下，分别表达多个此类基因，其中至少一个启动子、活性片段或衍生物是本发明的启动子、活性片段或衍生物，并且以基因堆积方法应用在胚和/或胚乳中有效的一个或多个其他启动子。例如，通过改变具有酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶活性的多肽的表达，例如其中由核酸序列编码的酰基辅酶A：溶血磷脂酰基转移酶特异性地转变C16-、C18-、C20-或C22-脂肪酸，并任选地改变一个或多个酰基辅酶A脱氢酶和/或一个或多个酰基-ACP[＝酰基载体蛋白]去饱和酶和/或一个或多个酰基-ACP硫酯酶和/或一个或多个脂肪酸酰基转移酶和/或一个或多个脂肪酸合成酶和/或一个或多个脂肪酸羟化酶和/或一个或多个乙酰辅酶A羧化酶和/或一个或多个酰基辅酶A氧化酶和/或一个或多个脂肪酸去饱和酶和/或一个或多个脂肪酸acetylenases和/或一个或多个脂氧化酶和/或一个或多个三酰甘油脂酶和/或一个或多个allenoxide合成酶和/或一个或多个氢过氧化物裂合酶和/或一个或多个脂肪酸延伸酶的表达，来增加PUFA含量。
在本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的控制下表达的特别优选的转基因包括，例如一个或多个Δ4-去饱和酶和/或一个或多个Δ5-去饱和酶和/或一个或多个Δ6-去饱和酶和/或一个或多个Δ8-去饱和酶和/或一个或多个Δ9-去饱和酶和/或一个或多个Δ12-去饱和酶和/或一个或多个Δ5-延伸酶(elongase)和/或一个或多个Δ6-延伸酶和/或一个或多个Δ9-延伸酶(美国专利公开号20090094707)。在此类涉及基因堆积的实例中，只有一个引入的转基因例如Δ4-去饱和酶或Δ5-去饱和酶或Δ6-去饱和酶或Δ8-去饱和酶或Δ9-去饱和酶或Δ12-去饱和酶或Δ5-延伸酶或Δ6-延伸酶或Δ9-延伸酶需要以正义或反义方向置于本发明的启动子的控制之下。在根据本发明的方法中合成的含有多不饱和脂肪酸的转基因植物可以直接进入市场(markerted)，而不需要分离合成的油类、脂类或脂肪酸。也可以使用来源于该转基因植物的收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物。也可以以油类、脂肪、脂质和/或游离脂肪酸的形式分离根据本发明的转基因植物的产物。由该方法产生的多不饱和脂肪酸可以通过收获来自它们生长的农作物的或者来自田地的有机组织，例如通过挤压或其他提取方法如冷搅打或冷挤压或者通过粉碎、蒸煮或烘烤和例如使用热己烷的基于溶剂的萃取预处理种子获得。因此，可以进一步加工得到的产物，即精炼以除去植物黏液和悬浮材料、脱泥和例如使用氢氧化钠的脂肪酸碱萃取、干燥、漂白和脱臭。
在本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的控制下表达的特别优选的转基因包括，例如一个或多个Δ4-去饱和酶和/或一个或多个Δ5-去饱和酶和/或一个或多个Δ6-去饱和酶和/或一个或多个Δ8-去饱和酶和/或一个或多个Δ9-去饱和酶和/或一个或多个Δ12-去饱和酶和/或一个或多个Δ5-延伸酶(elongase)和/或一个或多个Δ6-延伸酶和/或一个或多个Δ9-延伸酶(美国专利公开号20090094707)。在此类涉及基因堆积的实例中，只有一个引入的转基因例如Δ4-去饱和酶或Δ5-去饱和酶或Δ6-去饱和酶或Δ8-去饱和酶或Δ9-去饱和酶或Δ12-去饱和酶或Δ5-延伸酶或Δ6-延伸酶或Δ9-延伸酶需要以正义或反义方向置于本发明的启动子的控制之下。在根据本发明的方法中合成的含有多不饱和脂肪酸的转基因植物可以直接进入市场(markerted)，而不需要分离合成的油类、脂类或脂肪酸。也可以使用来源于该转基因植物的收获材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物。也可以以油类、脂肪、脂质和/或游离脂肪酸的形式分离根据本发明的转基因植物的产物。由该方法产生的多不饱和脂肪酸可以通过收获来自它们生长的农作物的或者来自田地的有机组织，例如通过挤压或其他提取方法如冷搅打或冷挤压或者通过粉碎、蒸煮或烘烤和例如使用热己烷的基于溶剂的萃取预处理种子获得。因此，可以进一步加工得到的产物，即精炼以除去植物黏液和悬浮材料、脱泥和例如使用氢氧化钠的脂肪酸碱萃取、干燥、漂白和脱臭。
[0284] 在另一实例中，在胚乳中，通过在启动子、其活性片段或衍生物的控制下表达编码植酸酶的基因，修饰胚乳的磷含量，从而增强植酸的分解并增加转化的植物对游离磷的可用性。例如，由Van Hartingsveldt等人，Gene 127：87(1993)公开了黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因。
[0285] 在另一实例中，在根据本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的控制下，有效表达了降低植酸含量的基因。在玉米中，这通过表达LPA等位基因(例如，Raboy等人，(1990)Maydica 35：383)和/或通过改变肌醇激酶活性(例如，WO 02/059324、美国专利公开号20030009011、WO03/027243、美国专利公开号20030079247、WO 99/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、WO2002/059324、美国专利公开号2003/0079247、WO 98/45448、WO 99/55882、WO01/04147)实现。
[0286] 也在另一实例中，将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物用于表达营养蛋白质例如植酸酶。也将来自禾本科植物的谷物广泛用作为非反刍动物的动物饲料，并且将黑曲霉的植酸酶用作为动物饲料中的补充剂以改进可消化性并也改进磷和矿物质的生物可利用性。在一个实例中，将如本文中所述的根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物用于在发育的胚乳中表达来自黑曲霉的phyA基因。
[0287] 在另一实例中，将本发明的启动子、活性片段或衍生物用于修饰三烯生育酚和/或生育酚含量。三烯生育酚是维生素E相关化合物，其在植物中的存在主要限于单子叶植物，例如棕榈、小麦、稻和大麦的种子中。三烯生育酚与生育酚，包括α-生育酚(其是维生素E的一种形式)在结构上类似。生育酚和三烯生育酚是有效的脂质可溶性抗氧化剂，在人类和动物饮食中具有相当高的营养价值，例如Packer等人J.Nutr.131：369S-373S(2001)，并且作为降低胆固醇的化合物，例如Theriault等人Clin.Biochem.32，
309-319，1999；Qureshii等人J.Biol.Chem.261，10544-10550，1986。通过在本发明的启动子的控制下有效表达2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(2-methyl-6-phytylbenzoquinol methyltransferase)(VTE3)和/或生育酚环化酶(VTE1)和/或γ-生育酚甲基转移酶(VTE4)、修饰了种子胚乳中一种或多种生育酚的水平。优选地，将编码选自VTE1、VTE3和VTE4的酶的基因在启动子、活性片段或衍生物的控制下有效表达，并在胚乳中的其他启动子的控制下有效表达生育酚生物合成途径的不同基因，例如通过基因堆积。在另一实例中，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下有效表达编码尿黑酸拢牛儿基转移酶(homogentisate geranylgeranyl transferase)(HGGT)的基因，以调节胚乳中三烯生育酚的水平。在另一实例中，在胚乳中调节编码HGGT和VTE3和VTE4多肽的转基因的表达，其中所述转基因的至少一种在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下是有效的。使用本发明的启动子调节表达的生育酚生物合成酶的其他例子包括，例如tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、GMT、MT1、tMT2、AANT1、slr 1737(Kridl等人，Seed Sci.Res.1：
209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等人，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992)；
Lois等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norris 等 人，Plant Physiol.117：
1317-1323(1998)；Bartley and Scolnik，Plant Physiol.104：1469-1470(1994)；Smith等人，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily等人，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等人，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。
309-319，1999；Qureshii等人J.Biol.Chem.261，10544-10550，1986。通过在本发明的启动子的控制下有效表达2-甲基-6-植基苯醌甲基转移酶(2-methyl-6-phytylbenzoquinol methyltransferase)(VTE3)和/或生育酚环化酶(VTE1)和/或γ-生育酚甲基转移酶(VTE4)、修饰了种子胚乳中一种或多种生育酚的水平。优选地，将编码选自VTE1、VTE3和VTE4的酶的基因在启动子、活性片段或衍生物的控制下有效表达，并在胚乳中的其他启动子的控制下有效表达生育酚生物合成途径的不同基因，例如通过基因堆积。在另一实例中，在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下有效表达编码尿黑酸拢牛儿基转移酶(homogentisate geranylgeranyl transferase)(HGGT)的基因，以调节胚乳中三烯生育酚的水平。在另一实例中，在胚乳中调节编码HGGT和VTE3和VTE4多肽的转基因的表达，其中所述转基因的至少一种在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下是有效的。使用本发明的启动子调节表达的生育酚生物合成酶的其他例子包括，例如tyrA、slr1736、ATPT2、dxs、dxr、GGPPS、HPPD、GMT、MT1、tMT2、AANT1、slr 1737(Kridl等人，Seed Sci.Res.1：
209：219(1991)；Keegstra，Cell 56(2)：247-53(1989)；Nawrath等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：12760-12764(1994)；Xia等人，J.Gen.Microbiol.138：1309-1316(1992)；
Lois等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)：2105-2110(1998)；Takahashi等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(17)，9879-9884(1998)；Norris 等 人，Plant Physiol.117：
1317-1323(1998)；Bartley and Scolnik，Plant Physiol.104：1469-1470(1994)；Smith等人，Plant J.11：83-92(1997)；WO 00/32757；WO 00/10380；Saint Guily等人，Plant Physiol.，100(2)：1069-1071(1992)；Sato等人，J.DNA Res.7(1)：31-63(2000))。
[0288] 又在另一实例中，通过在本发明的启动子或者其活性片段或衍生物的控制下，在胚乳中有效表达具有增强的营养价值的一种或多种蛋白质或者特异的氨基酸的含量，增加植物蛋白质的水平，特别是改良植物营养价值的经修饰的蛋白质的水平。例如hordothionin蛋白质修饰描述于WO94/16078；WO 96/38562；WO 96/38563和美国专利号5,703,409。美国专利号6,127,600和美国专利号6,080,913也描述了用于增加种子中基本氨基酸的积累的转基因。富含赖氨酸和/或富含硫的清蛋白也描述于WO97/35023和美国专利号5,990,389和美国专利号5,885,802(富含甲硫氨酸)和美国专利号5,939,599(富含硫)和美国专利号5,912,414(增加的甲硫氨酸)。美国专利号6,459,019描述了用于增加赖氨酸和苏氨酸含量的转基因，并且WO96/01905描述了用于增加苏氨酸含量的转基因。氨基酸合成酶的实例包括邻氨基苯甲酸合成酶(例如，如描述于美国专利号5,965,727、PCT公开WO 97/26366、WO 99/11800和WO 99/49058)、色氨酸脱羧酶(例如，如描述于PCT公开WO 99/06581)、苏氨酸脱羧酶(例如，如描述于美国专利号5,534,421和5,942,660；PCT公开WO 95/19442)、苏氨酸脱氨酶(PCT公开WO 99/02656和WO 98/55601)、二氢吡啶二羧酸合成酶(例如，如描述于美国专利号5,258,300)、二酰基甘油酰基转移酶(例如，如描述于美国专利公开20030115632A1和20030028923A1)和天冬氨酸激酶(例如，如描述于美国专利号5,367,110、5,858,749和6,040,160)。
[0289] 又在另一实例中，影响了改变的糖类代谢，例如，通过改变影响淀粉的分支模式的酶的基因表达或者改变硫氧还蛋白的基因例如NTR和/或TRX(例如，美国专利号6,531,648)和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖6-果糖基转移酶(levansucrase)基因(例如，Steinmetz，等人，(1985)Mol.Gen.Genet.200：220)和/或α-淀粉酶基因(例如，Pen，等人，(1992)Bio/Technology 10：292；Sogaard，等人，(1993)J.Biol.Chem.268：22480)和/或西红柿转化酶基因(Elliot，等人，(1993)Plant Mol.Biol.21：515)和/或淀粉分支酶(例如，美国专利号6,232,122和6,147,279和PCT公开WO97/22703)包括玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher，等人，(1993)Plant Physiol.102：1045)和/或UDP-D-木糖4-差向异构酶或Fragile-1或Fragile-2或Refl或HCHL或C4H基因(例如，WO 99/10498)和/或ADP-葡糖糖焦磷酸化酶(AGP；例如，美国专利号6,232,529)。
鉴于淀粉和油通路的相互关系，通过直接修饰淀粉或其他糖类含量实现脂肪酸水平或组成的间接修饰也在本发明的范围内，并且反之亦然。
鉴于淀粉和油通路的相互关系，通过直接修饰淀粉或其他糖类含量实现脂肪酸水平或组成的间接修饰也在本发明的范围内，并且反之亦然。
[0290] 又在另一实例中，将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物用于调节乙烯产生和/或感受和/或与乙烯产生和/或感受相关的胚乳凋亡。例如，通过下调乙烯产生和/或感知，推迟或阻抑谷物胚乳的凋亡，例如Campbell和Drew，Planta 157：350-357(1983)；Drew等人，Planta 147：83-88(1979)；He等人，Plant Physiol.112：1679-1685(1996)；
Young等人，Plant Physiol.119：737-751(1997)；Young和Gallie，Plant Mol.Biol.39：
915-926(1999)；Young和Gallie，Plant Mol.Biol.42：397-414(2000))。谷物中乙烯感受最可能涉及拟南芥属的膜定位受体ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4的同源物(Chang等 人，Science 262：539-544(1993)；Hua 等 人，Science 269：1712-1714(1995)，Hua等 人，Plant Cell 10：1321-1332(1998)，Sakai 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：
5812-5817(1998))，或者玉米乙烯受体基因ZmETR2和ZmERS1、ZmETR9和ZmETR40的产物。
谷物的胚乳用作为籽粒的主要贮藏器官，但是在中期至晚期种子发育期间经历由乙烯调节的细胞死亡。通过下调胚乳中乙烯受体基因的表达，可以推迟或降低或抑制器官的凋亡，从而延长谷物充盈和贮藏蛋白沉积的时间。
Young等人，Plant Physiol.119：737-751(1997)；Young和Gallie，Plant Mol.Biol.39：
915-926(1999)；Young和Gallie，Plant Mol.Biol.42：397-414(2000))。谷物中乙烯感受最可能涉及拟南芥属的膜定位受体ETR1、ERS1、ETR2、ERS2和EIN4的同源物(Chang等 人，Science 262：539-544(1993)；Hua 等 人，Science 269：1712-1714(1995)，Hua等 人，Plant Cell 10：1321-1332(1998)，Sakai 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：
5812-5817(1998))，或者玉米乙烯受体基因ZmETR2和ZmERS1、ZmETR9和ZmETR40的产物。
谷物的胚乳用作为籽粒的主要贮藏器官，但是在中期至晚期种子发育期间经历由乙烯调节的细胞死亡。通过下调胚乳中乙烯受体基因的表达，可以推迟或降低或抑制器官的凋亡，从而延长谷物充盈和贮藏蛋白沉积的时间。
[0291] 在另一实例中，将如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物用于表达治疗性蛋白质，例如，如疫苗或抗体片段。改进的‘植物抗体’载体(例如，如在Hendy等人，J.Immunol.Methods 231：137-146，1999中所述)和纯化策略，使得该方法成为产生重组免疫球蛋白的实用和有效手段，不仅可以用于人类和动物治疗，也可以用于工业应用(例如，催化性抗体)。此外，植物产生的抗体已经显示出是安全且有效的，并且由于避免了动物来源的材料的使用，并从而避免了传染性海绵样脑病(TSE)污染的风险。此外，植物和哺乳动物细胞产生的抗体的糖基化模式的差异对抗原结合或特异性具有很少或没有影响。此外，在接受了局部口服应用植物来源的分泌二聚体IgA抗体的患者中，还没有观察到毒性或人抗小鼠抗体(HAMA)的证据(见Larrick等人Res.Immunol.149：603-608，1998)。
[0292] 例如，可以将本发明的启动子或者其活性片段或衍生物应用于在胚乳中表达重组抗体，例如抗CD4抗体，其能抑制HIV-1病毒到细胞的传播或感染细胞到未感染细胞的传播或者用于抑制或降低炎症反应或者用于治疗CD-4自身免疫疾病例如类风湿性关节炎或银屑病。
[0293] 可以将多种方法用于在转基因植物中表达重组抗体。例如，可以单独地将抗体重链和轻链克隆到核酸构建体中，然后使用本发明的方法体外转化植物细胞。随后，在它们有性杂交前，再生表达各个链的整个植物，最终导致完全装配的并且有功能的抗体的产生(见，例如，Hiatt等人Nature342：76-87，1989)。在多个实例中，可以使用信号序列以通过指导链到合适的植物环境，促进未装配抗体链的表达、结合和折叠。
[0294] 在另一实例中，将编码在宿主细胞中能诱发免疫应答的肽或多肽的转基因与如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物连接。例如，使用本文中所述的根据任一实施方案的方法，将编码乙型肝炎表面抗原的转基因插入到本文中所述的核酸构建体中，并用于产生转基因植物。根据该实施方案，然后将使用植物或其部分产生的食物产品作为药用食物(medicinal foodstuff)或口服疫苗施用给人类(例如，喂饲给人类)。
[0295] 并不削弱本发明启动子、活性片段或衍生物的一般应用，本发明也包括将所述启动子、活性片段或衍生物与核酸连接，所述核酸编码赋予或增强针对植物病原体抗性的蛋白质，所述植物病原体如，例如种子传播的真菌、种子传播的病毒、种子传播的细菌或者以该种子为食的昆虫。此类蛋白质对本领域技术人员是已知的并包括，例如一系列结构上和功能上不同的植物防御蛋白质或发病机制相关的蛋白质(几丁质酶，特别是酸性几丁质酶或内切几丁质酶；β-葡聚糖酶，特别是β -1，3-葡聚糖酶；核糖体失活蛋白(RIP)；a-高梁醇溶蛋白多肽例如，α-高梁醇溶蛋白、β-高梁醇溶蛋白、γ-高梁醇溶蛋白；橡胶树(Hevea brasiliensis)橡胶蛋白；马铃薯win1或win2蛋白质，或者来自小麦的相关蛋白质例如，wheatwin或WPR4，或来自大麦的相关蛋白质，如barwin)；硫堇，特别是K-硫堇；奇甜蛋白或奇甜蛋白样蛋白质例如抗真菌蛋白(zeamatin)；蛋白酶抑制剂例如，如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶；或者sormatin、病毒外壳蛋白和将一种或多种病原体毒素转变成非毒性产物的蛋白质。编码此类蛋白质的核酸是公共可得到的和/或描述于科学文献中。此类基因的结构和它们编码的蛋白质完全描述于美国，8600 Rockville Pike，Bethesda，MD 20894的美国医学国家图书馆的生物信息学国家中心(National Center for Biotechnology Information of the US National Library of Medicine，8600Rockville Pike，Bethesda，MD 20894，USA)的数据库中。
[0296] 也可以将如本文中所述根据任一实施方案的启动子或活性片段或衍生物置于与编码多肽的核酸的有效连接中，以重组产生该多肽。如上所讨论，植物种子的组织，例如休眠胚对于产生重组多肽是有用的。因此，本发明提供了用于产生例如，用于商业目的的重组多肽的方法。
[0297] 应当理解，本发明也涉及转基因植物的产生，所述转基因植物表达不编码蛋白质的转基因。例如，该转基因编码干扰RNA、反义RNA、核酶、抗体酶、共抑制分子、基因沉默分子或基因靶向分子，其阻止或降低目的核酸的表达。
[0298] 用于产生干扰RNA或核酶、或抗体酶的合适方法是本领域已知的。
[0299] 例如，已经鉴定了许多种类的核酶。核酶的一个种类来源于许多在植物中能自我切割和复制的小型环状RNA。实例包括来自avocado sunblotch类病毒的RNA和来自烟草环斑病毒、苜蓿暂时性条斑病毒、绒毛烟斑驳病毒、茛菪斑驳病毒和地下三叶草斑驳病毒的卫星RNA。编码能选择性地切割靶RNA的核酶的转基因的设计和用途描述于，例如Haseloff等人Nature，334：585-591(1988)中。
[0300] 备选地，转基因表达能诱导正义抑制靶核酸的核酸。例如，产生的转基因包含以正义方向构型的作为靶核酸的启动子的核酸。该方法描述于，例如Napoli等人，The Plant Cell 2：279-2891990或者美国专利号5,034,323中。
[0301] 为了通过正义抑制降低或阻止核酸的表达，转基因并不需要与该核酸完全相同。此外，转基因不需要包含该核酸的全部序列，以通过正义抑制降低或阻止所述核酸的表达。
[0302] RNA干扰对于降低或阻止核酸的表达也是有用的。RNAi的合适方法描述于Marx，Science，288：1370-1372，2000。用于降低或阻止核酸表达的示例性方法描述于WO99/49029、WO 99/53050和WO0/75164中。简言之，产生的转基因表达与靶核酸中的核苷酸序列互补的核酸。该转基因另外表达与靶核酸中的所述核苷酸的序列基本上相同的核酸。
由转基因表达的两种核酸能杂交，并可能在转录后水平降低或者阻止靶核苷酸的表达。
由转基因表达的两种核酸能杂交，并可能在转录后水平降低或者阻止靶核苷酸的表达。
[0303] 微RNA或miRNA是小双链RNA，其通过mRNA切割、转录阻抑/抑制或者异染色质沉默，调节或调整靶信使RNA的表达(见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等人，2004，Nat.Rev.Genet.，5，522-531；和Ying等人，2004，Gene，342，25-28)。该微RNA可以使用如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物表达。备选地，使用如本文中所述根据任一实施方案的启动子、活性片段或衍生物能使核酸赋予miRNA表达或表达模式。
[0304] 植物转化或转染
[0305] 产生了合适的表达构建体或表达载体后，将该构建体或载体引入到植物细胞或组织中。用于将重组DNA引入到植物组织或细胞中的方法包括但不限于，使用CaCl2的转化和其变体，例如，如Hanahan(1983)所述，将DNA直接摄人到原生质体中(Krens等人，Nature 296，72-74，1982；Paszkowski等人，EMBO J.3，2717-2722，1984)、PEG-介导的原生质体摄入(Armstrong等人，Plant Cell Rep.9，335-339，1990)、微粒轰击、电穿孔(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)，82，5824-5828，1985)、DNA的显微注射(Crossway等人，Mol.Gen.Genet.202，179-185，1986)、组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等人，Plant Physiol.87，671-674，1988；Sanford，Part.Sci.Technol.5，27-37，1988)、用核酸的组织真空渗入、或者在植物的情况下，T-DNA介导的从农杆菌到植物组织的转移，如主要由An等人，EMBO J.4，277-284，1985；Herrera-Estrella等人，Herrera-Estella等人，Nature303，209-213，1983；Herrera-Estella等人，EMBO J.2，987-995，1983；或Herrera-Estella等人，在Plant Genetic Engineering，Cambridge University Press，N.Y.，第63-93页，
1985中所述。
1985中所述。
[0306] 粒子轰击介导的转化也可以递送裸核酸到植物细胞中(Sanford等人，J.Part.Sci.Technol.5：27，37，1987)。该技术涉及加速密集核酸包被的微粒子，例如金或钨粒子，以产生足够的速度刺穿植物细胞壁和细胞核。然后，引入的核酸掺入到植物基因组中，从而产生转基因植物。然后将该细胞用于再生转基因植物。示例性装置和方法由Stomp等人(美国专利号5,122,466)和Sanford和Wolf(美国专利号4,945,050)公开。也在本文中举例了合适的方法。适合于在该系统中使用个微粒的实例包括1至5微米金球。通过任一合适的技术，例如通过沉淀，DNA构建体可以沉积在微粒上。
[0307] 备选地，将表达构建体或表达载体引入到植物原生质体中。为了产生原生质体，需要从植物细胞中除去细胞壁。用于产生原生质体的方法是本领域已知的，并例如由Potrykus和Shillito，Methods in Enzymology 118，449-578，1986描述。通过物理或化学透化原生质体的质膜，将裸核酸(即，非包含在运载体、载体、细胞、噬菌体或病毒内的核酸)引入到植物原生质体中( 等人，Mol.Gen.Genet.199：178-182，1985和Fromm等人，Nature，319：791-793，1986)。
[0308] 用于将核酸引入到原生质体的优选物理方法是电穿孔，其包含对原生质体应用短暂的高电压电脉冲，从而在质膜中形成纳米大小的孔。核酸通过这些孔被摄人并进入细胞质。备选地，作为完成孔闭合的膜组分的重新分配的结果，经质膜摄入核酸。核酸从胞质运输到细胞核中，从而整合到基因组中。
[0309] 用于将核酸引入到原生质体的优选化学方法使用聚乙二醇(PEG)。PEG介导的转化通常包含在一段时间并在足够透化原生质体的质膜的条件下，在PEG溶液存在的情况下用核酸处理原生质体。然后通过在质膜上产生的孔将核酸摄人，并作为附加型质粒维持或者掺入到原生质体的基因组中。
[0310] 在本发明的另一实例中，通过电穿孔将表达载体或构建体引入到植物细胞中。(Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824，1985)。在该技术中，在质粒或含有核酸的相关基因构建体存在的情况下，电穿孔植物原生质体。高场强的电脉冲可逆地透化生物膜，以允许质粒的引入。经电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。使用表型标记可以实现具有转化基因的转化植物细胞的选择。
[0311] 花椰菜花叶病毒(CaMV)作为用于引入表达载体或构建体到植物细胞中的载体也是有用的(Hohn等人，(1982)“Molecular Biology of Plant Tumors，”Academic Press，New York，第549-560页；Howell，美国专利号4,407,956)。将CaMV病毒DNA基因组插入到亲本细菌质粒中产生了可以在细菌中繁殖的重组DNA分子。克隆后，再次克隆该重组质粒，并通过引入期望的核酸进一步修饰。然后将重组质粒的修饰病毒部分从亲本细菌质粒中切除，并用于接种植物细胞或植物。
[0312] 用于将表达构建体引入到植物细胞的另外方法是用表达构建体转化的根癌农杆菌感染植物细胞、外植体、分生组织或种子。在本领域已知的合适条件下，培养转化的植物细胞以形成苗、根，并进一步发育成植物。例如，通过根癌农杆菌的Ti质粒，将表达构建体引入到合适的植物细胞。基于根癌农杆菌感染，Ti质粒被转移到植物细胞，并稳定整合到植物基因组中(Horsch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803，1984)。
[0313] 用农杆菌转化植物细胞目前至少存在3中不同的方式：(1)将农杆菌与培养的分离原生质体共培养；(2)用农杆菌转化细胞或组织，或者(3)用农杆菌转化种子、顶点(apices)或分生组织。
[0314] 方法(1)使用已建立的培养系统，其允许培养原生质体，并从培养的原生质体中再生植物。
[0315] 方法(2)指(a)可以通过农杆菌转化植物细胞或组织和(b)可以诱导转化的细胞或组织以再生成整个植物。
[0316] 方法(3)使用微型繁殖。在双系统中，为了实现感染，需要两种质粒：含T-DNA的质粒和vir质粒。可以使用许多含T-DNA质粒的任意一种，主要问题是对于两种质粒的每一种，其能独立地选择。
[0317] 转化植物细胞或植物后，通过Ti质粒转化那些植物细胞或植物，以使可以通过转化载体表达的合适表型标记，选择已整合的想要的DNA片段。这些表型标记包括但不限于，抗生素抗性、除草剂抗性或通过视觉观察可检测的性状。其他表型标记是本领域已知的并可以在本发明中使用。
[0318] 备选地，通过使用根癌农杆菌的植物中(in planta)转化方法，例如，如由 Bechtold 等 人，CR Acad.Sci.(Paris，Sciences de la vie/Life Sciences)316，1194-1199，1993或Clough等人，Plant J 16：735-74，1998所述的方法产生转化的植物，其中将根癌农杆菌应用于发育的花芽的外部，并然后将双元载体DNA引入到发育的小孢子和/或大孢子和/或发育的种子中，以产生转化的种子。本领域技术人员应当知道，可以改变选择用于在该方法中使用的组织，然而，通常优选的是在合子形成阶段使用植物材料用于植物中转化方法。
[0319] 在另外的实例中，转化禾本科植物的方法包括，在一段时间和在足够将表达载体递送给成熟胚的一个或多个细胞的条件下，将成熟胚(例如来自完成籽粒充盈的种子的小TM麦胚)与包含表达载体的农杆菌接触。该转化可以另外包括除去种皮和或在Soytone 存TM
在的情况下进行转化，所述除去种皮和或在Soytone 存在的情况下进行转化二者都改进转化效率。可以将转化的细胞用于再生植物或植物部分。
在的情况下进行转化，所述除去种皮和或在Soytone 存在的情况下进行转化二者都改进转化效率。可以将转化的细胞用于再生植物或植物部分。
[0320] 本发明也包括应用转化的植物细胞或植物部分的转化重复循环的产物，所述转化的植物细胞或植物部分包含本发明的启动子、活性片段或衍生物或者在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效放置的转基因或者包含在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效的所述转基因的基因构建体。
[0321] 在一个实例中，依次地或同时地进行基因堆积。在同时基因堆积的一个实例中，用两种基因构建体转化植物细胞、植物组织、植物器官或整个植物，其中至少一种所述基因构建体包含本发明的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体。在依次基因堆积的实例中，将包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的已转化的第一植物细胞用与用于产生第一植物细胞、组织、器官或整个植物不同的第二基因构建体转化，例如其中第二基因构建体包含在与第一植物细胞、组织、器官或整个植物的第一启动子不同的第二启动子控制下有效放置的第二转基因。例如，第二基因构建体或第二转基因可以包含与在第一植物细胞、组织、器官或植物中本发明的第一启动子、活性片段或衍生物不同的本发明的第二启动子、活性片段或衍生物。在另一实例中，第二启动子在种子中，优选地在植物的胚乳中是有效的，例如，该启动子在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达或者主要或专门在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟胚乳)中调节此种表达。在另一实例中，第二启动子在植物种子的胚中是有效的。在另一实例中，第二基因构建体可以另外包含与第一转基因不同的第二转基因，即其中启动子调节的每一转基因是不同的。例如，将第一和第二转基因用于表达功能上不同或者结构上不同或者不相关的第一和第二结构基因或转基因。此类不同的转基因可以在相同的生物化学途径或者完全不同的生物化学途径中催化或调节不同的步骤，和/或它们可以发挥一致的作用，即协同产生一个或多个想要的性状。优选地，将不同的选择标记用于监测第一和第二以及随后的转化。
[0322] 用于此类基因堆积方法的第一和第二转基因的具体实例从本文公开的示例性启动子和本文公开的示例性转基因中是显而易见的，所述示例性启动子可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用，所述示例性转基因可以例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下有效地在植物中表达。应当理解，在基因堆积方法中，加以必要的变更，可以将在植物中表达的描述的转基因(例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的有效控制下的)应用于该实例的第二基因构建体和第二转基因。
[0323] 从转化的细胞/质体再生和繁殖植物
[0324] 根据本领域已知的方法，可以从转化或者转染的细胞中再生整个植物。可以用如本文中所述根据任一实施方案的载体或构建体转化能随后克隆性繁殖(通过器官发生或者胚发生)的植物组织。
[0325] 如本文中所用，术语“器官发生”指苗和根从分生组织中心依次发育的过程。
[0326] 如本文中所用，术语“胚发生”指苗和根从体细胞或者配子以协同的方式(并非依次)一起发育的过程。
[0327] 从培养的原生质体中植物再生描述于例如，Evans等人，“Protoplast Isolation and Culture-Handbook of Plant Cell Cultures 1”(MacMillan Publishing Co.，1983)和Binding“Regeneration of Plants”-Plant Protoplasts，第21-73页(CRC Press，Boca Raton，1985)中。再生随物种与物种的不同而异。通常，产生一转化的原生质体的悬浮液(例如，使用本文中所述的方法)。在一些物种中，然后诱导已转化的原生质体，以形成胚，并然后进入成熟和萌发阶段。该诱导涉及，例如，添加化合物到原生质体的培养基中，例如，在谷物或苜蓿的情况下为谷氨酸和/或脯氨酸。
[0328] 在实例中，使用本文中所述方法产生的转化禾木科植物细胞再生植物或植物部分或小植株。优选地，在一段时间和在足够愈伤组织形成的条件下，将转化的细胞与诱导愈伤组织形成的化合物接触。备选地或另外地，在一段时间和在足够细胞去分化的条件下，将转基因植物细胞与诱导细胞去分化的化合物接触。备选地或另外地，在一段时间和在足够未分化的细胞生长的条件下，将转基因植物细胞与诱导未分化的细胞生长的化合物接触。诱导愈伤组织形成和/或诱导未分化的和/或去分化的细胞产生的化合物对本领域技术人员是显而易见的，并且包括生长素，例如2，4-D，3，6-二氯-邻-甲氧基苯甲酸(dicambia)、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(picloram)或赛二唑素(TDZ)。
[0329] 该培养基可以另外包含有助于愈伤组织形成/去分化或未分化细胞生长的一种或多种化合物。例如Mendoza和Kaeppler(In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002)发现，在2，4-D存在的情况下，包含麦芽糖而不是蔗糖的培养基增强了愈伤组织的形成。
[0330] 备选地或另外地，将胚细胞与肌醇另外地接触。研究表明，在愈伤组织中，肌醇对于维持细胞分裂是有用的(Biffen和Hanke，Biochem.J.265：809-814，1990)。
[0332] 用于从成熟的胚性禾木科植物细胞中诱导愈伤组织形成和/或细胞去分化和/或未分化细胞生长的合适培养基和方法是本领域已知的和/或描述于Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002， 等 人，Plant Cell Reports，18：331-335，1998、Patnaik和Khurana BMC Plant Biology，3：1-11、Zale等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，2004和Delporte等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，80：139-149，2005中。
[0333] 在愈伤组织诱导、细胞去分化和/或未分化细胞生长后，在一段时间和在足够苗发育的条件下，将植物细胞和/或其来源的细胞(例如，其来源的愈伤组织或者其去分化的或未分化的细胞)与诱导苗形成的化合物接触。用于诱导苗的合适化合物和方法是本领域已知的和/或描述于，例如Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002、 等人，Plant Cell Reports，18：331-335，1998、Patnaik and Khurana BMC Plant Biology，3：1-11、Zale等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，
2004、Murashige和Skoog，Plant Physiol.，15：473-479，1962或者Kasha等人，(在：Gene manipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990中)。例如，将愈伤组织或者未分化的或去分化的细胞与诱导苗形成的一种或多种植物生长调节剂接触。合适的化合物的实例(即，植物生长调节剂)包括吲哚-3-乙酸(IAA)、苄基腺嘌呤(BA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素、a-萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(BAP)、赛二唑素、激动素、
2iP或者它们的组合。
2004、Murashige和Skoog，Plant Physiol.，15：473-479，1962或者Kasha等人，(在：Gene manipulation in plant improvement II，Gustafson ed.，Plenum Press，1990中)。例如，将愈伤组织或者未分化的或去分化的细胞与诱导苗形成的一种或多种植物生长调节剂接触。合适的化合物的实例(即，植物生长调节剂)包括吲哚-3-乙酸(IAA)、苄基腺嘌呤(BA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素、a-萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(BAP)、赛二唑素、激动素、
2iP或者它们的组合。
[0334] 包含用于诱导苗形成的化合物的培养基的合适来源是本领域已知的，并包括，例如Sigma-Aldrich Pty Ltd(Sydney，澳大利亚)。
[0335] 备选地或另外地，在一段时间和在足够诱导苗形成并产生小植株的条件下，在并不包含植物生长调节剂的培养基中或上维持愈伤组织或者未分化的或去分化的细胞。
[0336] 在苗形成时或者苗形成后，优选地在一段时间和在足够开始根生长和产生小植株的条件下，将愈伤组织或者未分化的或去分化的细胞与诱导根形成的化合物接触。
[0337] 诱导根形成的合适化合物是本领域技术人员已知的，并包括植物生长调节剂，例如如上所述。
[0338] 用于诱导根诱发的合适方法是本领域已知的和/或描述于Mendoza和Kaeppler，In vitro Cell Dev.Biol.，38：39-45，2002、 等 人，Plant Cell Reports，18：331-335，1998、Patnaik和Khurana BMC Plant Biology，3：1-11、Zale等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，76：277-281，2004、Murashige 和 Skoog，Plant Physiol.，
15：473-479，1962或者Kasha等人，(在Gene manipulation in plant improvement II，Gustafson编辑，Plenum Press，1990中)中。
15：473-479，1962或者Kasha等人，(在Gene manipulation in plant improvement II，Gustafson编辑，Plenum Press，1990中)中。
[0339] 在本发明的实例中，在一段时间和在足够诱导苗形成的条件下，将愈伤组织和/或去分化的细胞和/或未分化的细胞与包含玉米素的培养基接触，并在一段时间和在足够诱导根形成的条件下，与包含NAA的培养基接触。
[0340] 然后在盆栽(例如，在盆栽混合土和/或沙中)和生长前，培养小植株一段时间足够使根生长。
[0341] 可以通过多种方法繁殖产生的转化植物，例如通过克隆繁殖或者经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交以产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且通过经典的育种技术进一步繁殖T2植物。在这方面，本领域技术人员应当知道，术语“自交”指上述自交过程。
[0342] 本发明也包括应用植物材料重复循环转化的产物，所述植物材料用本发明的启动子、活性片段或衍生物或者在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效放置的转基因或者包含在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效的所述转基因的基因构建体转化。
[0343] 在一个实例中，进行了基因堆积。在基因堆积的一个实例中，将包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的第一植物细胞、第一植物组织或第一植物器官或第一整个植物用与用于产生第一植物细胞、组织、器官或整个植物不同的第二基因构建体转化，例如，其中第二基因构建体包含在与第一植物细胞、组织、器官或整个植物的第一启动子不同的第二启动子的控制下有效放置的第二转基因。例如，第二基因构建体或第二转基因可以包含与在第一植物细胞、组织、器官或植物中存在的本发明的第一启动子、活性片段或衍生物不同的本发明的第二启动子、活性片段或衍生物。在另一实例中，第二启动子在种子中，优选地在植物的胚乳中是有效的，例如，该启动子在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达或者主要或专门在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟胚乳)中调节此种表达。在另一实例中，第二启动子在植物种子的胚中是有效的。在另一实例中，第二基因构建体可以另外包含与第一转基因不同的第二转基因，即其中启动子调节的每一转基因是不同的。例如，将第一和第二转基因用于表达功能上不同或者结构上不同或者不相关的第一和第二结构基因或转基因。此类不同的转基因可以在相同的生物化学途径或者完全不同的生物化学途径中催化或调节不同的步骤，和/或它们可以发挥一致的作用，即协同产生一个或多个想要的性状。
[0344] 用于此类基因堆积方法的第一和第二转基因的具体实例从本文公开的示例性启动子和本文公开的示例性转基因中是显而易见的，所述示例性启动子可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用，所述示例性转基因可以例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下有效的在植物中表达。应当理解，在基因堆积方法中，加以必要的变更，可以将例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下在植物中有效表达的转基因的描述应用于该实例的第二基因构建体和第二转基因。
[0345] 本发明也包括应用植物材料的常规育种或无性繁殖或者克隆繁殖的产物，所述植物材料用本发明的启动子、活性片段或衍生物或者在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效放置的转基因或者包含在所述启动子、活性片段或衍生物的控制下有效的所述转基因的基因构建体转化。
[0346] 在一个实例中，进行了基因堆积。在基因堆积的一个实例中，将包含第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体的第一植物与表达一种或多种想要的性状或具有想要的遗传背景的第二植物有性杂交，并鉴定和任选地分离携带第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体并表达想要的性状的子代。如本领域技术人员所已知，如果该杂交的亲代的每个没有将相同的遗传材料贡献给它们的子代，那么此类子代植物对于亲代来源的第一启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体和想要的性状是杂合的。在另一实例中，然后将杂合的子代自交并鉴定和任选地分离纯合的子代。当此类杂交旨在将本发明的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体渐渗到想要的遗传背景中时，在每一杂交的子代和包含想要的遗传背景的植物之间进行重复的回交。通常进行足够的回交以确保最初转化引入的启动子、活性片段或衍生物或转基因或基因构建体存在于与想要的遗传背景基本上或显著性相同的遗传背景中。
[0347] 在另一实例中，通过与其他亲本的第一基因构建体不同的第二基因构建体或者通过在与其他亲本的第一启动子不同的第二启动子的控制下有效放置的第二转基因，赋予在该育种或杂交过程的亲本中存在的一种或多种想要的性状。例如，第二基因构建体或者第二转基因可以包含与第一启动子、活性片段或衍生物不同的本发明的第二启动子、活性片段或衍生物。在另一实例中，第二启动子在种子中，优选地在植物的胚乳中是有效的，例如，该启动子在许多不同的植物器官、组织或细胞(例如包括胚乳)中赋予或调节表达或者主要或专门在胚乳(包括早期胚乳和/或成熟胚乳)中调节此种表达。在另一实例中，第二启动子在植物种子的胚中是有效的。在另一实例中，第二基因构建体可以另外包含与第一转基因不同的第二转基因，即其中启动子调节的每一转基因是不同的。例如，将第一和第二转基因用于表达功能上不同或者结构上不同或者不相关的第一和第二结构基因或转基因。此类不同的转基因可以在相同的生物化学途径或者完全不同的生物化学途径中催化或调节不同的步骤，和/或它们可以发挥一致的作用，即协同产生一个或多个想要的性状。
[0348] 用于此类基因堆积方法的第一和第二转基因的具体实例从本文公开的示例性启动子和本文公开的示例性转基因中是显而易见的，所述示例性启动子可以与本发明的启动子、活性片段或衍生物组合使用，所述示例性转基因可以例如有效地在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下在植物中表达。应当理解，在基因堆积方法中，加以必要的变更，可以将例如在本发明的启动子、活性片段或衍生物的控制下在植物中有效表达的转基因的描述应用于该实例的第二转基因。
[0349] 从前述显而易见的是，本发明另外提供了本发明的基因修饰细胞或生物的子代或繁殖组织，条件是该子代或繁殖组织包含编码本发明的融合蛋白的核酸。
[0350] 本文所涵盖的产生的转化生物可以以多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，转化了全部细胞以含有表达构建体或载体)；转化和未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，将转化的根状茎嫁接到未转化的接穗)。
[0351] 其他启动子的鉴定
[0352] 如上文所讨论，本发明人也提供了用于鉴定或分离启动子的方法，所述启动子能赋予核酸例如在植物的发育胚乳或者其细胞或组织中表达或表达模式。在优选的实例中，该方法包括：
[0353] (i)测定多个表达产物在休眠胚中的表达水平；
[0354] (ii)测定多个表达产物在对照组织或细胞或植物部分中的表达水平；
[0355] (iii)将(i)项与(ii)项比较，鉴定以增加的水平表达的一个或多个表达产物；和
[0356] (iv)分离赋予(iii)项的一个或多个表达产物在发育的胚乳中表达的启动子。
[0357] 合适的对照植物部分、组织或细胞对本领域技术人员是显而易见的，并且包括非来自休眠胚的任一植物部分、组织或细胞。优选地，对照植物部分、组织或细胞来自非休眠的种子或胚，例如来自吸涨的胚或种子或者来自萌发的胚或种子。
[0358] 优选地，检测的表达产物是由基因编码的转录物或mRNA。例如，使用微阵列检测的转录物或mRNA。
[0359] 在一个实例中，将休眠胚中表达的水平与在多个对照组织、细胞或植物部分中表达的水平比较。例如，多个对照组织、细胞或植物部分包括来自非休眠的种子或胚的植物部分、组织或细胞和非胚植物部分、非胚组织或非胚细胞。由此鉴定赋予核酸优先地或选择性地在发育的胚乳或者其细胞或组织中表达的启动子。
[0360] 在一个实例中，如本文中所述根据任一方案的方法另外包括：
[0361] (v)任选地，测定启动子的结构，例如启动子的序列；
[0362] (vi)任选地，提供启动子的结构；和
[0363] (vii)提供启动子。
[0364] 在一个实例中，将启动子提供为表达载体。本发明明确涉及鉴定或分离本文中所述的启动子的任一方法的直接产物。
[0365] 本发明根据以下非限制性实例进行了进一步的描述。
[0366] 实施例1
[0367] I在发育的小麦种子中选择性地表达的小麦基因的鉴定
[0368] 该实例提供了两种小麦基因的种子选择性地表达的支持，所述两种小麦基因在其天然环境中受命名为WP05和WP07的本发明小麦启动子的调节。
[0369] 用来源于不同RNA样品(未成熟胚、来自吸涨了24小时或48小时的种子的胚)的探针查询(interrogate)Affymetrix 小麦基因组阵列，并鉴定显示出种子特异性地表达谱的候选基因。
[0370] 获取未成熟小麦胚(开花后12-14天)和吸涨种子(24小时或48小时)材料，提取RNA并进一步纯化，并确认RNA的质量和产率(图1a、1b、1c)。标记RNA并与小麦基因组阵列杂交，并分析数据以取得按等级次序排列的基因列表。
[0371] 使用AVADISTM软件(Strand Genomics Pvt.Ltd.Bangalore)分析微阵列表达。将全部微阵列分析的原始数据输入到AVADIS中，并且将RMA算法(Irazarry等人，Biostatistics 4(2)：249-264，2003)应用于背景校正、归一化和探针聚集。产生每一基因的绝对调用(absolute call)和p值，并且将整个阵列中不与样品中的核酸杂交，即不存在的(绝对调用)全部探针集从分析中去除。
[0372] 对于在种子中优先地或选择性地表达的转录物的测定，进行了两种不同的表达分析，其中将未成熟胚与已经吸涨了24小时的胚比较，或者备选地，将未成熟胚与已经吸涨了48小时的胚比较。对于在与24小时吸涨的胚比较的未成熟胚中的表达分析，只保留了在全部未成熟胚阵列中存在(绝对调用)并在24小时吸涨的胚中不存在(绝对调用)的基因。对于在与48小时吸涨的胚比较的未成熟胚中的表达分析，只保留了在全部未成熟胚阵列中存在(绝对调用)并在48小时吸涨的胚中不存在(绝对调用)的基因。将两组资料输出到Excel并组合以产生在未成熟胚中表达但是在24小时吸涨的或者48小时吸涨的胚中不表达的基因列表。计算了倍数改变值的平均值、标准差和％CV。将基因列表按照差异表达水平的p值排列，过滤以仅保留那些10倍以上差异表达基因，并且多于6000个平均信号在未成熟胚中表达。
[0373] 基于这些标准，制定了功能未知的候选基因的列表，并且对于这些候选基因，在公共域数据库中没有可用的对应上游基因组序列。
[0374] 通 过 NetAffx门 户 网 站 (http://www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx)获得了在Affymetrix 小麦基因座阵列上存在的候选基因的序列。
[0375] 下载Affymetrix序列和来自GenBank的对应公共序列，并使用SequencherTM软件比对。在明显的情况下，例如在序列的开始处具有长段的多聚胸腺嘧啶，将序列反向互补以产生“正义”方向，从SequencherTM中输出，并随后用于引物设计。在全部其它不明显的情况下，假定序列都是“正义”方向。将GenBank序列用作为引物设计的输入文件。
[0376] 使用用默认设置的PrimerExpressTM版本1.5的“TaqMan MGB探针和引物设计”组件设计用于RT-QPCR确认的引物。对于每一靶候选基因和内部标准，鉴定了两对引物。
[0377] 使用 Green荧光进行RT-QPCR，以检测来自用于微阵列实验的cDNA样品的候选基因序列的扩增。用于每一候选基因的标准实时PCR混合物含有1x Green主混合物、200-300nM的每一引物、2μl的cDNA(约20ng)和水至终体积25μl。用于PCR的热循环条件是：95℃持续10分钟的1个循环，然后95℃持续30秒，60℃持续1分钟的40个循环。在Stratagene MX3000p Real Time PCR仪器进行实时PCR和数据分析。将解离记录用于说明具有正确Tm的单一扩增子。
[0378] 将对应于克隆wdk2c.pk009.e4：fis的来自Affymetrix克隆Ta.10021.1_at的一种种子特异的候选基因的序列(来自普通小麦的完整插入mRNA序列(gb：BT008988.1/DB_XREF＝gi：32128539/TID＝Ta.10021.1/CNT＝38/FEA＝mRNA/TIER＝ConsEnd/STK＝1/UG＝Ta.10021))表示为SEQ ID NO：1。通过RT-PCR确认该基因的表达模式为种子特异性地。出于命名的目的，
[0379] 将对应于27K蛋白质的Tria27 mRNA的来自Affymetrix克隆Ta.9233.2.S1的另一种子特异性候选基因的序列(gb：CD906555/DB_XREF＝gi：32680884/DB_XREF＝G468.105B18R010929/CLONE＝G468105B18/TID＝Ta.9233.2/CNT＝132/FEA＝EST/TIER＝Stack/STK＝10/UG＝Ta.9233)表示为SEQ ID NO：2。也通过RT-PCR确认该基因的表达模式为种子特异性的。
[0380] 实施例2
[0381] 从在发育的小麦种子中选择性地表达的小麦基因中分离胚乳选择性启动子[0382] 该实例提供了分离命名为WP05和WP07的本发明小麦来源启动子的支持。
[0383] 出于命名的目的，在本文中以“WP05”命名的启动子在其天然情况下与Affymetrix克隆Ta.10021.1有效连接，并且在本文中以“WP07”命名的启动子在其天然情况下与Affymetrix克隆Ta.9233.2.S1有效连接。
[0384] 为了克隆Affymetrix克隆Ta.10021.1和Ta.9233.2.S1的启动子区，使用从TMClontech Laboratories，Inc，(Mountain View，CA，美国)可得到的Genome Walker 试剂盒进行基因组步移。简言之，从普通小麦栽培品种Bobwhite 26中提取基因座DNA并用平末端限制酶Ssp I、Sca I、EcoR V、Stu I、Dra I消化。然后将得到的片段用于产生包含小TM
麦基因组DNA的几个Genome Walker 文库。然后将消化的DNA用酚氯仿纯化并重新溶解TM
在TE缓冲液(10mM Tris HCl，0.1mM EDTA，pH 7.5)中，并与来自Genome Walker 试剂盒的接合体连接。将得到的文库命名为：
麦基因组DNA的几个Genome Walker 文库。然后将消化的DNA用酚氯仿纯化并重新溶解TM
在TE缓冲液(10mM Tris HCl，0.1mM EDTA，pH 7.5)中，并与来自Genome Walker 试剂盒的接合体连接。将得到的文库命名为：
[0385] 1.DL 1-Ssp I
[0386] 2.DL 2-Dra I
[0387] 3.DL 3-Sca I
[0388] 4.DL 4-EcoR V
[0389] 5.DL 5-Stu I
[0390] 用接合体和序列特异性引物在小麦DNA文库模板上进行嵌套式聚合酶链式反应。使用用0.7％(w/v)琼脂糖凝胶的电泳分辨PCR产物(图2a、2b)。从凝胶切除大小约或大于1.0kb长度的片段，纯化并基本上根据厂商说明(Promega Corporation，Madison，WI，美国)连接到载体pGEM-T Easy中。对于每一靶候选基因，测序片段并与来自Affymetrix和GenBank的序列数据比对。从比对中将命名为WP05和WP07的启动子序列鉴定为预测的开放阅读框的上游序列。
[0391] 对于Affymetrix clone Ta.10021.1.S1_at，分离了总共5个单独的PCR扩增产物，并且测定WP05启动子片段定位于1.60kb片段(片段WPR05.2.1)(表2)。对于Affymetrix克隆Ta.9233.2.S1_a_at，分离了总共6个单独的PCR扩增产物，并且测定WP07启动子片段定位于2.70kb片段(片段WPR07.5.1)(表2)。
[0392] WP05启动子的序列描述于SEQ ID NO：3，并且WP07启动子的两个变体的序列描述于SEQ ID NOs：4和5(分别为2400bp变体和2066bp变体)。
[0393] 表2
[0394]
[0395] 实施例3
[0396] 确认胚乳选择性启动子WP05和WP07的功能性
[0397] 该实施例通过启动子调节报告基因选择性地或特异性地在至少小麦和玉米转化体的发育胚乳中的表达，提供命名为WP05和WP07的本发明分离的小麦来源启动子在赋予发育的种子的胚乳中选择性地或特异性地表达的功能的支持。
[0398] 1.植物转化方法
[0399] a)小麦转化载体
[0400] 将基础载体pBSubn R4R3(图3；SEQ ID NO：10)用作为选择标记盒的来源，其中泛素启动子调节与胭脂碱合酶(NOS))基因终止子有效连接的bar选择标记基因的表达，即Ubi::bar-nos。将基础载体pPZP200 35Dhph 35S R4R3(图4；SEQ ID NO：11)用作为选择标记盒的来源，其中CaMV 35S启动子调节与CaMV 35S基因终止子有效连接的潮霉素磷酸转移酶(hph)选择标记基因的表达即，35S::hph-35S。从基础载体中产生双元载体用于转化植物。简言之，产生包含与绿色荧光蛋白基因(gfp)有效连接的每一小麦启动子(SEQ ID TMNO：4-6)和CaMV 35S或者NOS终止子的报告基因盒，通过使用Gateway (Invitrogen)接合体引物的PCR扩增，并克隆入进入载体(entry vector)中。随后使用重组将它们克隆入含有常规克隆选择标记盒的目的载体中。按照严格的质量保证步骤完全测序全部载体。
[0401] 产生的每一双元载体具有pPZP200载体骨架(Hajdukiewicz等人，Plant Mol Biol.25：989-94，1994)并含有如下嵌合报告基因盒和选择标记盒：
[0402] (i)WP05::sgfp-nos报告基因盒和35S::hph-35S选择标记盒(pMPB0098；图5；SEQ ID NO：12)；
[0403] (ii)WP05::sgfp-nos报告基因盒和Ubi::bar-nos选择标记盒(pMPB0099；图6；SEQ ID NO：13)；
[0404] (iii)WP07::sgfp-nos报告基因盒，其中WP07启动子是2066bp启动子片段，和35S::hph-35S选择标记盒(pMPB0084；图7；SEQ ID NO：14)；
[0405] (iv)WP07::sgfp-nos报告基因盒，其中WP07启动子是2066bp启动子片段，和Ubi::bar-nos选择标记盒(pMPB0085；图8；SEQ ID NO：15)；
[0406] (v)WP07::sgfp-nos报告基因盒，其中WP07启动子是2400bp启动子片段，和35S::hph-35S选择标记盒(pMPB0086；图9；SEQ ID NO：16)；和
[0407] (vi)WP07::sgfp-nos报告基因盒，其中WP07启动子是2400bp启动子片段，和Ubi::bar-nos选择标记盒(pMPB0087；图10；SEQ ID NO：17)。
[0408] b)玉米转化载体
[0409] 产生表达载体以确认WP05和WP07启动子在玉米中的功能性，扩增启动子(SEQ ID No：3和4)并克隆到pENTRTM 5’-TOPO TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)中。将得到的载体用作为Gateway进入载体以产生双元载体RHF112(图11；SEQ ID NO：18)，所述双元载体RHF112，其包含调节与NOS基因终止子有效连接的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达的WP05启动子，和RHF121(图12；SEQ ID NO：19)，其包含调节与NOS基因终止子有效连接的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达的2400bp WP07启动子。
[0410] c)小麦(普通小麦)的生物射弹转化
[0411] 将上文中所述的小麦转化载体用于小麦(普通小麦MPB Bobwhite 26)的生物射弹转化。图13中描述了转化方法的示意图。转化方法包括以下步骤：
[0412] 步骤1(供体植物产生)
[0413] 将普通小麦(Bobwhite 26)种子用于产生供体植物材料。在由松树皮堆肥、珍珠岩和蛭石组成的苗圃混合物中培养小麦植物，每盆五株植物，最大盆尺寸为20cm。在大约22-24℃的温室条件下维持植物12-16周(图14a)。一旦从旗叶中出现第一个穗状花序，则标记植物并在开花后12-15天从最高的顶部收集胚。
[0414] 步骤2(第一天)
[0415] 收获在发育的期望阶段的穗状花序。从穗状花序中取下颖果，并在0.8％(v/v)NaOCl溶液中消毒表面20分钟，并在无菌蒸馏水中漂洗至少4次。使用解剖显微镜将至多10mm长度的胚从每一颖果中无菌切除(除去胚轴)，并在补充了15％(w/v)麦芽糖、0.8％(w/v)Sigma-琼脂和2.5mg/L 2，4-D的由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养物和1×微量营养物和有机维生素、40mg/L硫胺素、150mg/L L-天冬酰胺组成的渗透培养基(E3maltose)上以胚轴侧向下的方式培养。将胚培养于具有15mL培养基的60mm×15mm干净的聚丙烯培养皿上。在轰击前，将培养板在24℃避光温育4小时。使用900psi和6cm的BioRad PDS1000基因枪，用沉淀在0.6μm金颗粒上的1μg载体质粒DNA轰击胚。轰击后，在渗透培养基上避光过夜温育胚。该步骤显示于图14b、14c和14d。
[0416] 步骤3(第2天)：
[0417] 将胚转移到补充了6％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)Sigma-琼脂和2.5mg/L2，4-D的由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养物和1×微量营养物和有机维生素、40mg/L硫胺素、150mg/L L-天冬酰胺组成的愈伤组织诱导培养基(E3calli)。在24℃避光培养胚两周。
[0418] 步骤4(第16天)：
[0419] 在E3 calli上培养2周后，将胚产生的胚发生愈伤组织继代培养于补充了2％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)Sigma-琼脂和5mg/L的D，L膦四菌素(phosphinothricin)(PPT)和没有植物生长调节剂的由2×Murashige和Skoog(1962)常量营养物和1×微量营养物和有机维生素、40mg/L硫胺素、150mg/L L-天冬酰胺组成的选择培养基(E3Select)上。在24℃，在光照和12小时的光周期下，将培养物在E3Select上温育另外14天。该步骤显示于图14e、14f。
[0420] 步骤5(第30天)：
[0421] 在E3Select上培养14天后，将胚发生愈伤组织在新鲜的E3Select上继代培养另外14天。
[0422] 步骤6(第44天)：
[0423] 在E3Select上约4周后，从胚发生愈伤组织团块中切除发育的小植株(图14g、14h)并如在图14i中所示，在含有根诱导培养基(RM)的65mm×80mm或65mm ×150mm聚碳酸酯组织培养皿中培养另外3周。根诱导培养基由补充了2％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)Sigma-琼脂和5mg/L的PPT的1×Murashige和Skoog(1962)常量营养物、微量营养物和有机维生素、40mg/L硫胺素、150mg/L L-天冬酰胺组成。将剩下的胚发生愈伤组织继代培养在E3Select上另外14天。
[0424] 步骤7(第65天+)：
[0425] 将在根诱导培养基上具有健康根形成的存活3周以上的再生小植株栽培到由泥炭土和沙子(1∶1)组成的苗圃混合物中，并在22-24℃用升高的湿度在苗圃湿度室系统下TM维持(图14h)。两周后，将植物从湿度室中移出并每周手动浇水和液体fed Aquasol 直到成熟。抽样T0植物用于基因组DNA和分子分析。收集T1种子并种植用于高通量Q-PCR分析。
[0426] c)农杆菌介导的拟南芥的转化
[0427] 将上文中所述的双元载体转化到根癌土壤杆菌菌株AGL1中，并通过花组织的真空渗透进行拟南芥的植物中转化。简言之，将容器(500或1,000mL容积)置于真空干燥器内并装满细菌悬浮液。倒置含有大约4周龄的拟南芥植物的小篓(punnet)并漫没在细菌悬浮液中，包括莲座叶。盖上干燥器的盖子并抽真空直到测量仪器读数为大约250mm(10英寸)Hg。将植物留在真空下2分钟。然后移出植物，并允许从植物中排干过多的细菌悬浮液。将植物返回生长室，用圆盖或保鲜膜覆盖并避免直接光照过夜。第二天，让植物返回直接光照并移去圆盖或保鲜膜。使植物生长，直到长角果完全发育并收获干种子。表面消毒拟南芥种子，并种植在选择性培养基上，并将假定的转基因拟南芥植物转移到土壤，用于回收T2转基因种子。该步骤显示于图15。
[0428] d)农杆菌介导的玉米转化
[0429] 使用例如，在国际专利公开号WO 2006/136596 A2和/或WO2007/014744 A2中描述的技术进行玉米的转化。
[0430] 步骤1：农杆菌的制备
[0431] 简言之，将来自甘油储备物的农杆菌接种物划线在含有合适抗生素(例如50mg/L壮观霉素和/或10mg/L四环素)的YP琼脂培养基上。在28℃避光孵育细菌培养物1至3天，或者直到可见单克隆。将获得的平板储存于4℃1个月，并用作为原始平板以挑出新鲜细胞。在转化前至少两天，从原始平板上的单克隆中挑取新鲜细胞划线到具有合适抗生素的YP琼脂上。将这些细菌培养物在28℃避光孵育1至3天。
[0432] 备选地，通过从冰冻储备物中划线农杆菌细胞到平板B-YP-002(YP+50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素)上制备冰冻农杆菌储备物，并在28℃培养2至3天。产生原始平板并保存于4℃至多1个月。从原始平板中挑选细胞并加入到含有补充了50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素的25ml液体B-YP-000培养基的摇瓶中。在28℃，在设定为300转/分钟的摇动器上温育摇瓶2至3天。通过用1份无菌的30％甘油混合1份得到的培养物制备冷冻的农杆菌储备物。然后旋转混合物以充分混合，并将10μl农杆菌/甘油混合物分配到Eppendorf管。将该储备物储存于-80℃。
[0433] 为了制备用于感染的细胞，将来自以上段落中所述细菌培养物的细胞悬浮于补充了100μM乙酰丁香酮的1.0至1.8mL LS-inf培养基中。这产生了具有大约0.5至2.0之间光密度(OD600)的细菌悬浮液。旋转该混合物0.5至3小时。在小杯中将大约100μL的农杆菌细胞悬浮液与900μL的LS-inf溶液混合，并测量光密度(OD600)。用LS-Inf(具有100μM乙酰丁香酮)溶液将农杆菌溶液的光密度(OD600)调整至约0.6至约2.0之间。在感染前，涡旋在LS-inf+乙酰丁香酮培养基中的农杆菌悬浮液至少0.5至3小时。
[0434] 备选地，如下制备用于玉米转化的农杆菌悬浮液，在转化前两天，将来自冷冻储备物的农杆菌溶液划线到含有B-YP-002(凝固化的YP+50mg/L壮观霉素+10mg/L四环素)的平板上，并在28℃避光培养两天。在转化前1至4小时，将细菌细胞样品加入到2ml Eppendorf管的1.5ml M-LS-002培养基(LSinf+200μM乙酰丁香酮)，并在约1000转/分钟旋转样品1至4小时。得到的溶液的OD600应当为约0.6至约1.0或者约108cfu/mL。
[0435] 对于以下实施例的目的，使用用含有乙酰羟酸合成酶(ahas基因)(作为选择标记)和GUS报告基因的二元载体转化的根癌农杆菌菌株LBA4404或者卸甲农杆菌菌株K599(NCPPB 2659)转化玉米。
[0436] 步骤2：玉米穗的表面消毒和未成熟胚的分离
[0437] 在授粉后8至12天，从温室中的一个或多个植物中获取玉米穗。去除全部皮和穗丝，并将穗运输到组织培养实验室中。将一双镊子插入到穗的基底端并将镊子用作为用于处理玉米穗轴的把手。
[0438] 任选地，当穗上存在昆虫/真菌时，用20％市售的漂白剂消毒穗10分钟(备选地30％Clorox溶液15分钟)，并然后用无菌水漂洗3次。当通过镊子握住玉米穗轴时，用
70％乙醇完全喷雾穗并然后用无菌ddH2O漂洗。
70％乙醇完全喷雾穗并然后用无菌ddH2O漂洗。
[0439] 步骤3：接种
[0440] 方法1：修饰的“Tube”方法
[0441] 将具有镊子把手的玉米穗轴置于大培养板中。例如，用解剖刀除去每一玉米仁的上部(大约三分之二)。然后例如，用解剖刀从玉米穗轴上的玉米仁中切除未成熟的胚。在这方面，将手术刀片以一个角度插入到核仁的一个末端，并且将胚乳向上提，使其离开位于胚乳下方的胚。将切除的胚收集在含有大约1.5至1.8mL农杆菌悬浮液的LS-inf液体培养基的microfuge管(或者小培养板)中，LS-inf液体含乙酰丁香酮。将含胚的管手动混合几次，并在室温(20至25℃)温育30分钟。用移液管从管/平板中除去过量的细菌悬浮液。将在残留的LS-inf培养基中的未成熟胚和细菌转移到含共培养琼脂培养基的培养板。将未成熟胚以平面向下(盾片朝上)置于共培养培养基上。用移液管除去大多数过量的细菌悬浮液。将少量的液体留在平板上以避免平板接种时胚变干。
[0442] 在无菌罩中使平板盖打开约15分钟，以蒸发覆盖未成熟胚的过量水分。密封培养皿并在22℃避光温育2至3天。如果将GUS构建体用于评估瞬时GUS表达，那么移除选择的未成熟胚(例如，3至5胚)用于GUS染色。
[0443] 方法2：“Drop”方法
[0444] 将切除的未成熟胚平面向下(盾片朝上)直接置于共培养培养基上。每一未成熟胚添加5微升稀释农杆菌细胞悬浮液。通过在无菌罩中使平板盖打开约15分钟，蒸发覆盖未成熟胚的过量水分。密封培养皿并在22℃避光温育2至3天。如果将GUS构建体用于评估瞬时GUS表达，那么选择未成熟胚(例如，3至5胚)用于随后分析GUS染色。
[0445] 步骤4：回收
[0446] 共培养后，将胚盾片面向上转移到回收培养基，在27℃避光温育约5至10天。
[0447] 步骤5：选择
[0448] 将未成熟胚转移到第一选择培养基中。密封培养皿并在27℃避光温育10至14天(第一次选择)。将产生了可见愈伤组织的全部未成熟胚传代培养到第二选择培养基中。在该步骤，除去任一已经形成的苗。然后，密封培养皿，并在与第一次选择相同的条件下，27℃避光温育约2周。然后在立体显微镜下从盾片中切除再生的愈伤组织。将愈伤组织转移到新鲜的第二选择培养基中，密封并在27℃避光温育约2周。
[0449] 步骤6：转化植物的再生和移栽
[0450] 以与第二次选择相同的方式切除繁殖的愈伤组织，并转移到在25×100mm平板中的再生培养基中。密封平板并在25℃或27℃置于光照(ca.2,000勒克司；14/10小时光照/避光)下2至3周，或者直到可见苗样结构。
[0451] 将具有再生的苗或苗样结构的愈伤组织部分转移到含生根培养基的Phytatray或Magenta箱中，并在以前段落中所讨论的相同条件下温育2周，或者直到发育成有根的小植株。在生根培养基上2至4周后，将仍具有绿色区域的愈伤组织转移到新鲜的生根Phytatray中。将幼苗样品用于TaqMan分析，以测定转化DNA(T-DNA)插入的数目。
[0452] 然后将有根的幼苗转移到温室中的Metromix土壤中，并用塑料圆盖覆盖直到幼苗建立(通常为约1周)。每日浇水并每周液体施肥两次维持植物。当植物达到3至4叶TM TM发育阶段时，用Osmocote 施肥。根据需要，用70至100g/ha Pursuit 喷雾假定的转基因植物，并在温室中培养另外两周。通常非转基因的植物发育成除草剂症状(herbicidal TM
symptom)或者在这段时间内死亡。将存活的植物移栽到具有Metromix和1茶匙Osmocote的10英寸盆中。
symptom)或者在这段时间内死亡。将存活的植物移栽到具有Metromix和1茶匙Osmocote的10英寸盆中。
[0453] 在开花期时，将转基因植物的雄花穗装到棕色纸袋中，以防止花粉漏出。在转基因植物上进行授粉。如果没有同步发生抽丝和开花，则将野生型花粉供体或具有与转基因T0植物相同遗传背景的受体植物用于异花授粉。收获T1种子，干燥并合适地保存于具有适当标签的种子袋中。在收获了转基因T1种子后，可以在高压灭菌器中通过热处理消毒包含T0植物的土壤和花盆。
[0454] 使用该方法，可以将双元载体pRHF112和pRHF121用于产生转化的玉米。
[0455] 2.植物转化结果
[0456] a)在WP05和WP07的控制下在小麦中表达报告基因
[0457] 将WP05::sgfp-nos和WP07::sgfp-nos转化载体用于小麦(普通小麦MPB Bobwhite 26)的生物射弹转化，并切开得到的转基因产物(transgenics)及分析GFP的存在以测定小麦启动子的空间表达(图16-19)。主要在授粉后(DAP)约10天并持续到授粉后约30天的发育种子的胚乳中，检测到在WP05和WP07启动子控制下的GFP表达(图47-50)。这相应与籽粒灌浆的时期。在营养器官例如，叶、根、茎节、茎节间或颖片中，或者在繁殖组织例如，花药、子房或花粉中，或者在成熟种子中没有明显的表达(数据未显示)。
这些数据表明，WP05启动子和WP07启动子都赋予与该启动子有效连接的基因在小麦的发育种子中胚乳选择性表达，和最可能地严格的胚乳特异性表达。
这些数据表明，WP05启动子和WP07启动子都赋予与该启动子有效连接的基因在小麦的发育种子中胚乳选择性表达，和最可能地严格的胚乳特异性表达。
[0458] b)在WP05和WP07的控制下在玉米中报告基因的表达
[0459] 将分别包含由小麦WP05启动子(载体RHF112)或小麦WP07启动子(载体RHF121)驱动的GUS表达盒的双元载体RHF112(图11；SEQ ID NO：18)和RHF121(图12；SEQ ID NO：19)用于转化玉米植物。切开得到的转基因产物(transgenics)及分析GUS表达。图20和
21显示的数据表明，在WP05启动子(图20)和WP07启动子(图21)的控制下的GUS报告基因的表达主要定位于胚乳。与由WP07启动子赋予的表达比较，WP05启动子赋予在玉米的胚乳中强表达。与由这些启动子在小麦中赋予的表达类似，在玉米胚乳中授粉后(DAP)5-10天，持续到整个籽粒发育至授粉后至少25天，观察到了GUS活性。检测到WP05启动子比WP07启动子稍微更早的表达，可能是由于WP05启动子在发育的玉米种子中的更强活性。
21显示的数据表明，在WP05启动子(图20)和WP07启动子(图21)的控制下的GUS报告基因的表达主要定位于胚乳。与由WP07启动子赋予的表达比较，WP05启动子赋予在玉米的胚乳中强表达。与由这些启动子在小麦中赋予的表达类似，在玉米胚乳中授粉后(DAP)5-10天，持续到整个籽粒发育至授粉后至少25天，观察到了GUS活性。检测到WP05启动子比WP07启动子稍微更早的表达，可能是由于WP05启动子在发育的玉米种子中的更强活性。
[0460] 与在小麦中的表达一样，在营养器官例如，叶、根或茎中，或者在繁殖组织例如，花药、子房或花粉中，或者在外皮或穗丝中没有明显的报告子表达。这些数据表明，WP05启动子和WP07启动子都赋予与该启动子有效连接的基因在玉米的发育种子中胚乳选择性表达，和最可能地严格的胚乳特异性表达。
[0461] 实施例4
[0462] 来自单子叶植物的WP05和WP07等同物的表征
[0463] 该实施例提供了单子叶植物中胚乳选择性启动子的亚属的支持，所述启动子等同于分离的小麦来源的启动子WP05和/或WP07，例如，通过调节结构上与在天然情况下WP05和/或WP07启动子控制的基因相关的基因。
[0464] 1.玉米、大麦和稻中WP05的等同物
[0465] 为了鉴定与WP05等同的启动子，将小麦Affymetrix共有序列Ta.10021.1.S1_at序列用作为BLASTN查询序列，搜索NCBI非冗余核苷酸数据库和从Plant Genome Database(http://www.plantgdb.org/)下载的装配的小麦EST数据库。该方法在GenBank非冗余数据库中鉴定了两个序列，一个小麦序列指定的检索号为BT008988.1，与WP05具有93％最大同一性，和一个大麦序列检索号为AK252536.1，与WP05具有87％最大同一性。装配的小麦EST的检索也鉴定了具有100％最大同一性的指定为检索号PUT-153a-小麦-124535序列。检索号BT008988.1和PUT-153a-小麦-124535与Affymetrix共有序列Ta.10021.1.S1_at序列的比对和基因组步移引物序列CTTCAACGACCGCATACTGC和GAGGACGGCATGATGATC的比对证实了它们的相关性(未显示)。
[0466] 使用具有-1的核苷酸错配罚分(-q)的BLASTN算法，将PUT-153a-小麦-124535序列用于检索从由TIGR Rice Genome Annotation Project(http://blast.jcvi.org/euk-blast/index.cgi)产生的稻假分子(pseudomolecule)数据库中提取的cDNA序列。鉴定了许多相关的序列，包括检索号LOC_Os01g01290.1，一种组蛋白样转录因子。在TIGR基因组浏览(genome browser)中可以见到LOC_Os01g01290.1的位置。稻LOC_Os01g01290.1的MPSS表达谱显示，在稻中，该基因在6日龄发育的种子文库中表达，例如与在其天然情况下由WP05启动子调节的SEQ ID NO：1的表达模式一致。
[0467] 下载了由Plant Genome Database(http://www.plantgdb.org/)装配的玉米基因组重叠群集群，并使用具有-1核苷酸错配罚分(-q)的LOC_Os01g01290.1完全基因组序列检索。鉴定了一个指定为检索号ZmGSStuc11-12-04.64626的玉米基因组DNA集群与LOC_Os01g01290.1的385-713残基具有紧密的序列同一性(图22)。显示出与PUT-153a-小麦-124535类似 的Affymetrix共有序 列Ta.10021.1.S1_at、检索 号PUT-153a-小麦-124535、检索号LOC_Os01g01290.1、检索号ZmGSStuc11-12-04.64626和另外的cDNA序列(检索号PUT-153a-小麦-124587)的多重比对，允许假定翻译起始密码子的鉴定(未显示)。WP05启动子序列(SEQ ID NO：3)的3’端与该假定翻译起始密码子上游的那些序列是一致的。
[0468] 这些数据显示检索号LOC_Os01g01290.1、检索号ZmGSStuc11-12-04.64626、检索号PUT-153a-小麦-124587和检索号PUT-153a-小麦-124535包含本文中所示例的WP05启动子的等同物，例如功能和/结构等同物。LOC_Os01g01290.1的5’上游区序列显示于SEQ ID NO：6。ZmGSStuc11-12-04.64626的5’上游区序列显示于SEQ ID NO：7。
[0469] 2.玉米、高粱和稻中WP07的等同物
[0470] 为了鉴定与WP07等同的启动子，将小麦cDNA(SEQ ID NO：2)用作查询序列，检索GenBank非冗余核苷酸数据库的BLASTN。该方法鉴定了8个序列(表3)。
[0471] 表3
[0472]检索号 描述 最大同一性
AB085212.1 小麦Tria27 93％
CT831595.1 Indica稻cDNA克隆：OSIGCSA059P08 87％
AK106050.1 Japonica稻cDNA克隆：001-206-F01 87％
CT832278.1 Indica稻cDNA克隆：OSIGCRA121J01 90％
NM 001056362.1 Japonica稻克隆：Os03g0295800 87％
AK071633.1 Japonica稻克隆：J023102J23 87％
DQ244863.1 玉米克隆11235 mRNA序列 85％
AC118670.2 Nipponbare稻克隆：OSJNBb0036D03 94％
AB085212.1 小麦Tria27 93％
CT831595.1 Indica稻cDNA克隆：OSIGCSA059P08 87％
AK106050.1 Japonica稻cDNA克隆：001-206-F01 87％
CT832278.1 Indica稻cDNA克隆：OSIGCRA121J01 90％
NM 001056362.1 Japonica稻克隆：Os03g0295800 87％
AK071633.1 Japonica稻克隆：J023102J23 87％
DQ244863.1 玉米克隆11235 mRNA序列 85％
AC118670.2 Nipponbare稻克隆：OSJNBb0036D03 94％
[0473] 使用BLASTN算法，将稻cDNA克隆OSIGCSA059P08a(GenBank检索号CT831595.1)用 于 检 索 从 由 TIGR Rice Genome Annotation Project(http://blast.jcvi.org/euk-blast/index.cgi)产生的稻假分子(pseudomolecule)数据库中提取的基因序列。该方法鉴定了检索号LOC_Os03g18454。LOC_Os03g18454的结构表明，两个转录物是备选地剪接的(未显示)，其中转录物2的外显子1与转录物1的外显子1类似。稻LOC_Os03g18454的MPSS表达谱显示，在稻中，该基因在6日龄发育的种子文库中表达，例如与在其天然情况下由WP07启动子调节的SEQ ID NO：1的表达模式一致。
[0474] 下载了由Plant Genome Database(http://www.plantgdb.org/)组装的高粱和玉米基因组重叠群集群，并使用GenBank检索号DQ244863.1的cDNA序列检索。鉴定了指定为检索号ZmGSStuc11-12-04.7167.1和ZmGSStuc11-12-04.16895.1的两个非重叠玉米基因组DNA集群(图23)，和指定为检索号SbGSStuc11-12-04.1189.1的一个高粱DNA集群(图24)，它们与查询序列具有紧密的序列同一性。SEQ ID NO：2和包含图23和24中所述的序列的玉米和高粱基因组序列，以及小麦其他cDNA(例如，表3)的多重比对表明与SEQ ID NO：2具有同一性，允许假定翻译起始密码子的鉴定(未显示)。
[0475] 这些数据显示检索号LOC_Os03g18454、检索号ZmGSStuc11-12-04.7167.1、检索号ZmGSStuc11-12-04.16895.1和检索号SbGSStuc11-12-04.1189.1包含本文中所示例的WP07启动子的等同物，例如功能和/结构等同物。ZmGSStuc11-12-04.16895.1的5’上游区序列显示于SEQ ID NO：8和9。
[0476] 实施例5
[0477] 启动子的结构分析
[0478] 该实施例提供了功能性胚乳启动子WP05(SEQ ID NO：3)和WP07(SEQ ID NO：4)与检索号LOC_Os01g01290.1(SEQ ID NO：6)、检索号ZmGSStuc11-12-04.64626(SEQ ID NO：7)和检索号ZmGSStuc11-12-04.16895.1(SEQ ID NO：8)的5’上游序列之间结构保守性的支持。
[0479] 简言之，使用如在Higo等人，Nucl.Acids Res.27：297-300，1999所述和从National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，日本可得到的PLACE(植物顺式作用DNA元件)分析小麦启动子的核苷酸序列，以测定启动子中的顺式作用元件。此分析的结果示于表4-8中。
[0480] 表4
[0481] WP05(1279bp)启动子的PLACE分析结果
[0482]位点名 位置 链 共有序列
-300ELEMENT 106 (+) TGHAAARK
-300ELEMENT 254 (-) TGHAAARK
2SSEEDPROTBANAPA 1283 (+) CAAACAC
ABRELATERD1 1023 (+) ACGTG
ABRELATERD1 1270 (+) ACGTG
ABRELATERD1 775 (-) ACGTG
ABRERATCAL 774 (-) MACGYGB
ABRERATCAL 980 (-) MACGYGB
ACGTATERD1 776 (+) ACGT
ACGTATERD1 1023 (+) ACGT
ACGTATERD1 1270 (+) ACGT
ACGTATERD1 776 (-) ACGT
ACGTATERD1 1023 (-) ACGT
ACGTATERD1 1270 (-) ACGT
ACGTOSGLUB1 1268 (+) GTACGTG
ANAERO2CONSENSUS 761 (-) AGCAGC
ANAERO2CONSENSUS 1027 (-) AGCAGC
ARFAT 419 (+) TGTCTC
ARR1AT 72 (+) NGATT
ARR1AT 936 (+) NGATT
ARR1AT 1239 (+) NGATT
ARR1AT 1258 (+) NGATT
ARR1AT 286 (+) NGATT
ARR1AT 414 (+) NGATT
ARR1AT 111 (-) NGATT
BIHD1OS 183 (+) TGTCA
BIHD1OS 387 (+) TGTCA
BOXIINTPATPB 10 (+) ATAGAA
BOXIINTPATPB 363 (+) ATAGAA
BOXIINTPATPB 468 (+) ATAGAA
BOXLCOREDCPAL 514 (+) ACCWWCC
BOXLCOREDCPAL 1110 (+) ACCWWCC
BOXLCOREDCPAL 233 (-) ACCWWCC
BP5OSWX 775 (-) CAACGTG
CAATBOX1 141 (+) CAAT
CAATBOX1 174 (+) CAAT
CAATBOX1 186 (+) CAAT
CAATBOX1 252 (+) CAAT
CAATBOX1 1011 (+) CAAT
CAATBOX1 53 (-) CAAT
-300ELEMENT 106 (+) TGHAAARK
-300ELEMENT 254 (-) TGHAAARK
2SSEEDPROTBANAPA 1283 (+) CAAACAC
ABRELATERD1 1023 (+) ACGTG
ABRELATERD1 1270 (+) ACGTG
ABRELATERD1 775 (-) ACGTG
ABRERATCAL 774 (-) MACGYGB
ABRERATCAL 980 (-) MACGYGB
ACGTATERD1 776 (+) ACGT
ACGTATERD1 1023 (+) ACGT
ACGTATERD1 1270 (+) ACGT
ACGTATERD1 776 (-) ACGT
ACGTATERD1 1023 (-) ACGT
ACGTATERD1 1270 (-) ACGT
ACGTOSGLUB1 1268 (+) GTACGTG
ANAERO2CONSENSUS 761 (-) AGCAGC
ANAERO2CONSENSUS 1027 (-) AGCAGC
ARFAT 419 (+) TGTCTC
ARR1AT 72 (+) NGATT
ARR1AT 936 (+) NGATT
ARR1AT 1239 (+) NGATT
ARR1AT 1258 (+) NGATT
ARR1AT 286 (+) NGATT
ARR1AT 414 (+) NGATT
ARR1AT 111 (-) NGATT
BIHD1OS 183 (+) TGTCA
BIHD1OS 387 (+) TGTCA
BOXIINTPATPB 10 (+) ATAGAA
BOXIINTPATPB 363 (+) ATAGAA
BOXIINTPATPB 468 (+) ATAGAA
BOXLCOREDCPAL 514 (+) ACCWWCC
BOXLCOREDCPAL 1110 (+) ACCWWCC
BOXLCOREDCPAL 233 (-) ACCWWCC
BP5OSWX 775 (-) CAACGTG
CAATBOX1 141 (+) CAAT
CAATBOX1 174 (+) CAAT
CAATBOX1 186 (+) CAAT
CAATBOX1 252 (+) CAAT
CAATBOX1 1011 (+) CAAT
CAATBOX1 53 (-) CAAT
[0483]位点名 位置 链 共有序列
CAATBOX1 74 (-) CAAT
CAATBOX1 88 (-) CAAT
CAATBOX1 288 (-) CAAT
CAATBOX1 1241 (-) CAAT
CACTFTPPCA1 260 (+) YACT
CACTFTPPCA1 331 (+) YACT
CACTFTPPCA1 357 (+) YACT
CACTFTPPCA1 390 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1117 (+) YACT
CACTFTPPCA1 272 (+) YACT
CACTFTPPCA1 311 (+) YACT
CACTFTPPCA1 327 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1058 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1231 (+) YACT
CACTFTPPCA1 116 (-) YACT
CACTFTPPCA1 153 (-) YACT
CACTFTPPCA1 527 (-) YACT
CACTFTPPCA1 630 (-) YACT
CACTFTPPCA1 771 (-) YACT
CACTFTPPCA1 1200 (-) YACT
CANBNNAPA 1283 (+) CNAACAC
CARGCW8GAT 1082 (+) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1154 (+) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1082 (-) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1154 (-) CWWWWWWWWG
CARGNCAT 1081 (+) CCWWWWWWWWGG
CARGNCAT 1081 (-) CCWWWWWWWWGG
CATATGGMSAUR 179 (+) CATATG
CATATGGMSAUR 179 (-) CATATG
CCAATBOX1 140 (+) CCAAT
CCAATBOX1 74 (-) CCAAT
CDA1ATCAB2 1289 (+) CAAAACGC
CGACGOSAMY3 711 (-) CGACG
CGCGBOXAT 978 (+) VCGCGB
CGCGBOXAT 980 (+) VCGCGB
CGCGBOXAT 978 (-) VCGCGB
CGCGBOXAT 980 (-) VCGCGB
CIACADIANLELHC 379 (-) CAANNNNATC
CMSRE1IBSPOA 632 (+) TGGACGG
CTRMCAMV35S 66 (-) TCTCTCTCT
CURECORECR 512 (+) GTAC
CURECORECR 772 (+) GTAC
CURECORECR 1268 (+) GTAC
CAATBOX1 74 (-) CAAT
CAATBOX1 88 (-) CAAT
CAATBOX1 288 (-) CAAT
CAATBOX1 1241 (-) CAAT
CACTFTPPCA1 260 (+) YACT
CACTFTPPCA1 331 (+) YACT
CACTFTPPCA1 357 (+) YACT
CACTFTPPCA1 390 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1117 (+) YACT
CACTFTPPCA1 272 (+) YACT
CACTFTPPCA1 311 (+) YACT
CACTFTPPCA1 327 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1058 (+) YACT
CACTFTPPCA1 1231 (+) YACT
CACTFTPPCA1 116 (-) YACT
CACTFTPPCA1 153 (-) YACT
CACTFTPPCA1 527 (-) YACT
CACTFTPPCA1 630 (-) YACT
CACTFTPPCA1 771 (-) YACT
CACTFTPPCA1 1200 (-) YACT
CANBNNAPA 1283 (+) CNAACAC
CARGCW8GAT 1082 (+) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1154 (+) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1082 (-) CWWWWWWWWG
CARGCW8GAT 1154 (-) CWWWWWWWWG
CARGNCAT 1081 (+) CCWWWWWWWWGG
CARGNCAT 1081 (-) CCWWWWWWWWGG
CATATGGMSAUR 179 (+) CATATG
CATATGGMSAUR 179 (-) CATATG
CCAATBOX1 140 (+) CCAAT
CCAATBOX1 74 (-) CCAAT
CDA1ATCAB2 1289 (+) CAAAACGC
CGACGOSAMY3 711 (-) CGACG
CGCGBOXAT 978 (+) VCGCGB
CGCGBOXAT 980 (+) VCGCGB
CGCGBOXAT 978 (-) VCGCGB
CGCGBOXAT 980 (-) VCGCGB
CIACADIANLELHC 379 (-) CAANNNNATC
CMSRE1IBSPOA 632 (+) TGGACGG
CTRMCAMV35S 66 (-) TCTCTCTCT
CURECORECR 512 (+) GTAC
CURECORECR 772 (+) GTAC
CURECORECR 1268 (+) GTAC
[0484]位点名 位置 链 共有序列
CURECORECR 1311 (+) GTAC
CURECORECR 512 (-) GTAC
CURECORECR 772 (-) GTAC
CURECORECR 1268 (-) GTAC
CURECORECR 1311 (-) GTAC
DOFCOREZM 15 (+) AAAG
DOFCOREZM 29 (+) AAAG
DOFCOREZM 40 (+) AAAG
DOFCOREZM 156 (+) AAAG
DOFCOREZM 161 (+) AAAG
DOFCOREZM 318 (+) AAAG
DOFCOREZM 408 (+) AAAG
DOFCOREZM 432 (+) AAAG
DOFCOREZM 446 (+) AAAG
DOFCOREZM 622 (+) AAAG
DOFCOREZM 652 (+) AAAG
DOFCOREZM 993 (+) AAAG
DOFCOREZM 1007 (+) AAAG
DOFCOREZM 1088 (+) AAAG
DOFCOREZM 1318 (+) AAAG
DOFCOREZM 4 (-) AAAG
DOFCOREZM 262 (-) AAAG
DOFCOREZM 333 (-) AAAG
DOFCOREZM 929 (-) AAAG
DPBFCOREDCDC3 737 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 948 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 1045 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 877 (-) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 1101 (-) ACACNNG
E2FCONSENSUS 403 (-) WTTSSCSS
EBOXBNNAPA 179 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 225 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 374 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 451 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 877 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 179 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 225 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 374 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 451 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 877 (-) CANNTG
GATABOX 379 (+) GATA
GATABOX 467 (+) GATA
CURECORECR 1311 (+) GTAC
CURECORECR 512 (-) GTAC
CURECORECR 772 (-) GTAC
CURECORECR 1268 (-) GTAC
CURECORECR 1311 (-) GTAC
DOFCOREZM 15 (+) AAAG
DOFCOREZM 29 (+) AAAG
DOFCOREZM 40 (+) AAAG
DOFCOREZM 156 (+) AAAG
DOFCOREZM 161 (+) AAAG
DOFCOREZM 318 (+) AAAG
DOFCOREZM 408 (+) AAAG
DOFCOREZM 432 (+) AAAG
DOFCOREZM 446 (+) AAAG
DOFCOREZM 622 (+) AAAG
DOFCOREZM 652 (+) AAAG
DOFCOREZM 993 (+) AAAG
DOFCOREZM 1007 (+) AAAG
DOFCOREZM 1088 (+) AAAG
DOFCOREZM 1318 (+) AAAG
DOFCOREZM 4 (-) AAAG
DOFCOREZM 262 (-) AAAG
DOFCOREZM 333 (-) AAAG
DOFCOREZM 929 (-) AAAG
DPBFCOREDCDC3 737 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 948 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 1045 (+) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 877 (-) ACACNNG
DPBFCOREDCDC3 1101 (-) ACACNNG
E2FCONSENSUS 403 (-) WTTSSCSS
EBOXBNNAPA 179 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 225 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 374 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 451 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 877 (+) CANNTG
EBOXBNNAPA 179 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 225 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 374 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 451 (-) CANNTG
EBOXBNNAPA 877 (-) CANNTG
GATABOX 379 (+) GATA
GATABOX 467 (+) GATA
[0485]位点名 位置 链 共有序列
GATABOX 803 (+) GATA
GATABOX 1020 (+) GATA
GATABOX 1229 (+) GATA
GATABOX 144 (-) GATA
GATABOX 239 (-) GATA
GATABOX 569 (-) GATA
GATABOX 675 (-) GATA
GATABOX 1202 (-) GATA
GT1CONSENSUS 366 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 604 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 605 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 255 (-) GRWAAW
GT1CONSENSUS 298 (-) GRWAAW
GT1CONSENSUS 567 (-) GRWAAW
GT1GMSCAM4 605 (+) GAAAAA
GT1GMSCAM4 255 (-) GAAAAA
GT1MOTIFPSRBCS 296 (-) KWGTGRWAAWRW
GTGANTG10 117 (+) GTGA
GTGANTG10 348 (+) GTGA
GTGANTG10 863 (+) GTGA
GTGANTG10 902 (+) GTGA
GTGANTG10 259 (-) GTGA
GTGANTG10 330 (-) GTGA
GTGANTG10 356 (-) GTGA
GTGANTG10 389 (-) GTGA
GTGANTG10 479 (-) GTGA
GTGANTG10 600 (-) GTGA
GTGANTG10 733 (-) GTGA
IBOX 803 (+) GATAAG
IBOXCORE 803 (+) GATAA
IBOXCORE 568 (-) GATAA
INRNTPSADB 250 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 329 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 258 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 1239 (-) YTCANTYY
MYB1AT 537 (+) WAACCA
MYB2AT 1250 (+) TAACTG
MYB2CONSENSUSAT 1250 (+) YAACKG
MYBCORE 1250 (-) CNGTTR
MYBCOREATCYCB1 957 (-) AACGG
MYBPZM 233 (-) CCWACC
MYBST1 675 (-) GGATA
GATABOX 803 (+) GATA
GATABOX 1020 (+) GATA
GATABOX 1229 (+) GATA
GATABOX 144 (-) GATA
GATABOX 239 (-) GATA
GATABOX 569 (-) GATA
GATABOX 675 (-) GATA
GATABOX 1202 (-) GATA
GT1CONSENSUS 366 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 604 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 605 (+) GRWAAW
GT1CONSENSUS 255 (-) GRWAAW
GT1CONSENSUS 298 (-) GRWAAW
GT1CONSENSUS 567 (-) GRWAAW
GT1GMSCAM4 605 (+) GAAAAA
GT1GMSCAM4 255 (-) GAAAAA
GT1MOTIFPSRBCS 296 (-) KWGTGRWAAWRW
GTGANTG10 117 (+) GTGA
GTGANTG10 348 (+) GTGA
GTGANTG10 863 (+) GTGA
GTGANTG10 902 (+) GTGA
GTGANTG10 259 (-) GTGA
GTGANTG10 330 (-) GTGA
GTGANTG10 356 (-) GTGA
GTGANTG10 389 (-) GTGA
GTGANTG10 479 (-) GTGA
GTGANTG10 600 (-) GTGA
GTGANTG10 733 (-) GTGA
IBOX 803 (+) GATAAG
IBOXCORE 803 (+) GATAA
IBOXCORE 568 (-) GATAA
INRNTPSADB 250 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 329 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 258 (+) YTCANTYY
INRNTPSADB 1239 (-) YTCANTYY
MYB1AT 537 (+) WAACCA
MYB2AT 1250 (+) TAACTG
MYB2CONSENSUSAT 1250 (+) YAACKG
MYBCORE 1250 (-) CNGTTR
MYBCOREATCYCB1 957 (-) AACGG
MYBPZM 233 (-) CCWACC
MYBST1 675 (-) GGATA
[0486]位点名 位置 链 共有序列
MYCCONSENSUSAT 179 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 225 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 374 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 451 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 877 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 179 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 225 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 374 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 451 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 877 (-) CANNTG
NODCON2GM 92 (+) CTCTT
NODCON2GM 392 (+) CTCTT
NODCON2GM 701 (+) CTCTT
NODCON2GM 65 (-) CTCTT
NTBBF1ARROLB 261 (+) ACTTTA
NTBBF1ARROLB 28 (-) ACTTTA
OSE2ROOTNODULE 92 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 392 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 701 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 65 (-) CTCTT
PALBOXAPC 633 (-) CCGTCC
POLASIG1 36 (+) AATAAA
POLASIG1 50 (-) AATAAA
POLASIG2 940 (-) AATTAAA
POLLEN1LELAT52 12 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 158 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 365 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 444 (+) AGAAA
POLIEN1LELAT52 470 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 620 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 716 (-) AGAAA
PREATPRODH 1118 (+) ACTCAT
PRECONSCRHSP70A 1103 (-) SCGAYNRNNNNNNNNNNNN
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 928 (+) CCTTTT
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 39 (-) CCTTTT
QARBNEXTA 774 (-) AACGTGT
RAV1AAT 1043 (+) CAACA
RAV1BAT 225 (-) CACCTG
RAV1BAT 877 (-) CACCTG
RBCSCONSENSUS 412 (-) AATCCAA
REALPHALGLHCB21 1214 (-) AACCAA
RHERPATEXPA7 1023 (-) KCACGW
MYCCONSENSUSAT 179 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 225 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 374 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 451 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 877 (+) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 179 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 225 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 374 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 451 (-) CANNTG
MYCCONSENSUSAT 877 (-) CANNTG
NODCON2GM 92 (+) CTCTT
NODCON2GM 392 (+) CTCTT
NODCON2GM 701 (+) CTCTT
NODCON2GM 65 (-) CTCTT
NTBBF1ARROLB 261 (+) ACTTTA
NTBBF1ARROLB 28 (-) ACTTTA
OSE2ROOTNODULE 92 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 392 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 701 (+) CTCTT
OSE2ROOTNODULE 65 (-) CTCTT
PALBOXAPC 633 (-) CCGTCC
POLASIG1 36 (+) AATAAA
POLASIG1 50 (-) AATAAA
POLASIG2 940 (-) AATTAAA
POLLEN1LELAT52 12 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 158 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 365 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 444 (+) AGAAA
POLIEN1LELAT52 470 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 620 (+) AGAAA
POLLEN1LELAT52 716 (-) AGAAA
PREATPRODH 1118 (+) ACTCAT
PRECONSCRHSP70A 1103 (-) SCGAYNRNNNNNNNNNNNN
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 928 (+) CCTTTT
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A 39 (-) CCTTTT
QARBNEXTA 774 (-) AACGTGT
RAV1AAT 1043 (+) CAACA
RAV1BAT 225 (-) CACCTG
RAV1BAT 877 (-) CACCTG
RBCSCONSENSUS 412 (-) AATCCAA
REALPHALGLHCB21 1214 (-) AACCAA
RHERPATEXPA7 1023 (-) KCACGW
[0487]位点名 位置 链 共有序列
RHERPATEXPA7 1270 (-) KCACGW
ROOTMOTIFTAPOX1 142 (-) ATATT
ROOTMOTIFTAPOX1 187 (-) ATATT
ROOTMOTIFTAPOX1 1157 (-) ATATT
RYREPEATBNNAPA 809 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 821 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 1279 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 55 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 505 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 811 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 819 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 823 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 1277 (-) CATGCA
RYREPEATGMGY2 809 (+) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 821 (+) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 810 (-) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 822 (-) CATGCAT
RYREPEATLEGUMINBOX 809 (+) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 821 (+) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 810 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 822 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 818 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 1276 (-) CATGCAY
RYREPEATVFLEB4 809 (+) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 821 (+) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 809 (-) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 821 (-) CATGCATG
S1FBOXSORPS1L21 1265 (+) ATGGTA
SEBFCONSSTPR10A 386 (+) YTGTCWC
SEBFCONSSTPR10A 418 (+) YTGTCWC
SEF3MOTIFGM 1127 (+) AACCCA
SEF4MOTIFGM7S 305 (-) RTTTTTR
SITEIIATCYTC 721 (-) TGGGCY
SORLIP1AT 1092 (+) GCCAC
SORLIP1AT 528 (-) GCCAC
SORLIP1AT 912 (-) GCCAC
SORLIP1AT 1300 (-) GCCAC
SORLIP2AT 954 (+) GGGCC
SORLIP2AT 721 (-) GGGCC
SURECOREATSULTR11 857 (+) GAGAC
SURECOREATSULTR11 420 (-) GAGAC
SV40COREENHAN 536 (-) GTGGWWHG
RHERPATEXPA7 1270 (-) KCACGW
ROOTMOTIFTAPOX1 142 (-) ATATT
ROOTMOTIFTAPOX1 187 (-) ATATT
ROOTMOTIFTAPOX1 1157 (-) ATATT
RYREPEATBNNAPA 809 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 821 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 1279 (+) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 55 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 505 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 811 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 819 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 823 (-) CATGCA
RYREPEATBNNAPA 1277 (-) CATGCA
RYREPEATGMGY2 809 (+) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 821 (+) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 810 (-) CATGCAT
RYREPEATGMGY2 822 (-) CATGCAT
RYREPEATLEGUMINBOX 809 (+) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 821 (+) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 810 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 822 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 818 (-) CATGCAY
RYREPEATLEGUMINBOX 1276 (-) CATGCAY
RYREPEATVFLEB4 809 (+) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 821 (+) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 809 (-) CATGCATG
RYREPEATVFLEB4 821 (-) CATGCATG
S1FBOXSORPS1L21 1265 (+) ATGGTA
SEBFCONSSTPR10A 386 (+) YTGTCWC
SEBFCONSSTPR10A 418 (+) YTGTCWC
SEF3MOTIFGM 1127 (+) AACCCA
SEF4MOTIFGM7S 305 (-) RTTTTTR
SITEIIATCYTC 721 (-) TGGGCY
SORLIP1AT 1092 (+) GCCAC
SORLIP1AT 528 (-) GCCAC
SORLIP1AT 912 (-) GCCAC
SORLIP1AT 1300 (-) GCCAC
SORLIP2AT 954 (+) GGGCC
SORLIP2AT 721 (-) GGGCC
SURECOREATSULTR11 857 (+) GAGAC
SURECOREATSULTR11 420 (-) GAGAC
SV40COREENHAN 536 (-) GTGGWWHG
[0488]位点名 位置 链 共有序列
T/GBOXATPIN2 775 (-) AACGTG
TAAAGSTKST1 28 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 155 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 431 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 1087 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 262 (-) TAAAG
TATABOX4 1083 (+) TATATAA
TATABOX5 35 (-) TTATTT
TATABOXOSPAL 33 (-) TATTTAA
TATAPVTRNALEU 1083 (-) TTTATATA
TBOXATGAPB 3 (+) ACTTTG
TBOXATGAPB 407 (-) ACTTTG
TRANSINITMONOCOTS 696 (-) RMNAUGGC
WBOXATNPR1 184 (-) TTGAC
WBOXHVISO1 213 (+) TGACT
WBOXNTCHN48 212 (+) CTGACY
WBOXNTERF3 213 (+) TGACY
WRKY71OS 213 (+) TGAC
WRKY71OS 184 (-) TGAC
WRKY71OS 388 (-) TGAC
T/GBOXATPIN2 775 (-) AACGTG
TAAAGSTKST1 28 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 155 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 431 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 1087 (+) TAAAG
TAAAGSTKST1 262 (-) TAAAG
TATABOX4 1083 (+) TATATAA
TATABOX5 35 (-) TTATTT
TATABOXOSPAL 33 (-) TATTTAA
TATAPVTRNALEU 1083 (-) TTTATATA
TBOXATGAPB 3 (+) ACTTTG
TBOXATGAPB 407 (-) ACTTTG
TRANSINITMONOCOTS 696 (-) RMNAUGGC
WBOXATNPR1 184 (-) TTGAC
WBOXHVISO1 213 (+) TGACT
WBOXNTCHN48 212 (+) CTGACY
WBOXNTERF3 213 (+) TGACY
WRKY71OS 213 (+) TGAC
WRKY71OS 184 (-) TGAC
WRKY71OS 388 (-) TGAC
[0489] 表5
[0490] WP07(2400bp)启动子的PLACE分析结果
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496] 表6
[0497] LOC_Os01g01290.1上游区的PLACE分析结果
[0498]
[0499]
[0500] 表7
[0501] ZmGSStuc11-12-04.64626.1上游区的PLACE分析结果
[0502]
[0503]
[0504]
[0505]
[0506]
[0507]
[0508] 表8
[0509] ZmGSStuc11-12-04.16895.1上游区的PLACE分析结果
[0510]
[0511]
[0512]
[0513]
[0514] 尽管分析了启动子和5’上游调节序列的长度的变化，但表4至表8中的数据显示，在翻译起始位点上游近端750bp中存在多个保守结构特征，例如包括由下述元件组成的群组中的各个元件的多个：ARR1AT元件、ACGTATERD1元件、CAATBOX1元件、CACFTPPCA1元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GATABOX元件、GT1CONSENSUS元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件。例如，这些元件每个可以在给定的序列中出现至少2或3或4或5或6次。备选地或另外地，这些元件可以在给定的序列中出现多至7或8或9或10或11或者更多次。这意味着，所述序列可以在任一DNA链上存在，仅需的要求是，它们是通过PLACE分析鉴定的。
[0515] 在这些元件中，CACFTPPCA1元件、DOFCOREZM元件和GT1CONSENSUS元件在每一分析的序列中都具有一致的高丰度(每个出现4次或更多次)。如果将较短的稻序列从分析中排除，那么对于玉米和小麦序列，在翻译起始位点上游近端750bp中仍可以观察到高丰度的(每个出现4次或更多次)ARR1AT元件、CURECORECR元件、DOFCOREZM元件、EBOXBNNAPA元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件。
[0516] 该序列也可以通过在翻译起始位点上游近端750bp中存在的至少一种元件表征，所述元件包括IBOXCORE元件(出现1次、2次或6次)、MYB2CONSENSUS元件(在每一序列中出现一次)、MYBCORE元件(出现1-3次)和WRKY71OS元件(出现1次或3次或5次或7次)。排除较短的稻序列，在玉米和小麦序列，即在翻译起始位点上游近端750bp中也可以发现低拷贝数(通常出现1次或2次或3次)的MYBST1和MYBCOREATCYCB1和PRECONSCRHSP70A元件的至少一次出现。
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