昆虫是世界上最大的生物种群，除海洋外，其它的生态环境都有昆虫分布。 和高等动物不同，它没有完善的免疫系统，但是它们的先天性或获得性免疫能力 却是惊人的。许多昆虫都有很强的抗病力。昆虫抗菌肽是昆虫防御体系的主要成 分。来源于昆虫的抗菌肽具有广泛的生物学活性，应用前景广阔，因此，对抗菌 肽的研究日益受到人们的重视。
抗菌肽是昆虫感染细菌后，由血细胞及脂肪细胞在瞬时分泌的抗菌物质。具 有广谱抗菌活性和抑杀耐药菌株等优点抗菌肽不仅抗菌谱广，而且对某些真菌、 原虫、病毒及肿瘤有一定的杀灭和抑制作用，还能加速免疫和伤口愈合过程。
现已从昆虫免疫机制的模式种—果蝇中克隆到10个免疫反应基因。包括(1) 广谱性的抗菌肽，如cecropin、Sapecin、defensin等，它们的杀菌活性很强， 能杀死或溶解大多数供试菌。(2)杀菌谱较窄的抗菌肽，如Attacin、 SarcotoxinII、Diptercin及coloptericin等，它们只能部分抑制G-细菌；此 外，还有含脯氨酸的杀菌肽，如Apideacin、Abaecin、Drosocin等。
抗菌肽在医学和农业上均有广泛的应用前景。现已有实验证明天蚕素B具有 杀伤癌细胞的作用。也有有关抗菌肽对宫颈癌细胞、直肠癌细胞及肝癌细胞的杀 伤作用与剂量相关的效应的报道。天蚕素A对多种真菌均具有很强的杀伤作用。 防御素(defensin)是哺乳动物中研究最多的抗菌肽。防御素最早是从兔的肺泡 巨噬细胞中发现两个阳离子性极强的小分子抗菌肽，由美国加利福尼亚大学 R.L.Lehrer等于1980年首次命名的，以后又从很多哺乳动物中性粒细胞、小肠 潘氏细胞、人白细胞及尿、颈部粘液等组织中分离纯化出一系列一级结构相似的 小肽分子，是最大的抗菌肽家族之一。防御素抗微生物谱比较广泛，包括革兰氏 阳性菌和阴性菌分枝杆菌、螺旋体、真菌和一些被膜病毒，此外，近期得研究 发现其对恶性细胞也具有毒杀作用。昆虫防御素类是富含精氨酸残基的阳离子多 肽，具有特征的反向平行β2折叠结构，分子中含有6～8个Cys残基，并形成3～ 4对分子内二硫键，具有稳定的分子结构和广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌有强 的抗菌活性。
近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因，细菌耐药问题日益严重，再加 上传统抗生素的毒副作用，迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂。由于抗菌肽的 独特的作用使它无蓄积毒性，不易产生抗药性。因此，潜在的治疗性肽类可能建 立在防御素等肽类的基础上。防御素能够快速的杀死广谱病原微生物，且作用机 理特殊，相对地不具有免疫原性，展示了其在应用方面的广阔前景。
但是，抗菌肽要成为产品应用还需要解决一系列问题，首先是来源问题，由 于昆虫抗菌肽的天然资源有限，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手 段。化学合成肽类，成本较高。因此对于抗菌肽的研究和生产主要是通过基因工 程来完成的。目前对于体外的表达多选用大肠杆菌的融合表达，如人β防御素3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达]以及酵母表达系统，如天蚕素的酵母表达已获得 国家发明专利[ZL01 1 07584.8]，其产品为酵母制剂，主要作为饲料添加剂进行 应用。
抗菌肽基因是一种典型的真核基因，其蛋白是以前体的形式转录，在成熟蛋 白前有一段2-35个氨基酸残基的前导序列。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基 因，虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。如何提高抗菌肽的生产 效率，降低成本，是应用抗菌肽必须解决的问题。
目前尚未有昆虫防御素defensin的真核表达。因此，对昆虫防御素defensin 进行真核表达，有可能大量获得昆虫防御素defensin的真核表达产物。
发明内容：
本发明的目的是提供一种昆虫防御素在毕赤酵母中的表达方法，表达产物直 接分泌到胞外，提取发酵液，离心所得的上清液中即含有表达的蛋白产物——昆 虫防御素。它具有提纯工艺简单，成本低，适宜大量表达，同时也易于检测的优 点，为以后的药学分析研究及工业批量生产奠定了基础。
本发明的技术方案：昆虫防御素在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：将 昆虫防御素基因与载体质粒pHBM905B重组，将所得到的重组质粒 pHBM905B/defensin转入毕赤酵母，经“三明治”夹心平板筛选得含有重组质粒 的防御素毕赤酵母工程菌，经甲醇诱导表达，表达产物直接分泌到胞外，提取发 酵液，离心所得的上清液中即含有表达的蛋白产物——昆虫防御素。
如上所述的昆虫防御素在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：
i、重组表达质粒的构建：
根据黑腹果蝇的防御素基因基因序列设计引物；
合成设计引物：5’ GTCAAGTTCTTCGTTCTCGTGGC3’，
              5’ GGCCAGCAAACGAGAGGCCTTGT3’
经引物PCR(聚合链反应)合成266碱基对的昆虫防御素基因与载体质 粒pHBM905B重组，转化大肠杆菌，通过氨苄青霉素抗性基因的筛选及其菌 落PCR的验证得到重组子，重组质粒为pHBM905B/defensin；
本发明选用的pHBM905B载体是经过改造的pPIC9K载体，较pPIC9K常 规载体引入了Cpo I和Not I两个酶切位点，在Cpo I和Not I位点之间有一 个含卡那霉素抗性的1.2kb的DNA片段；有利于这两个酶充分酶切，琼脂糖 凝胶电泳也可以区分开没有酶切、单酶切和双酶切的载体片段，回收双酶切 的载体片段，连接转化后载体背景几近为零；
ii、将重组质粒pHBM 905B/defensin转入毕赤酵母，通过“三明治”夹心平板 筛选得含有重组质粒的转化子即防御素毕赤酵母工程菌：
pHBM 905B/defensin转化入巴斯德毕赤酵母后平铺于MD平板上，将 MD平板上的单菌落转接到BMMY平板上，倒置培养BMMY平板，在培养 皿盖上加甲醇诱导其表达，每12小时补加一次；诱导2-3天后，平铺一层混 有大肠杆菌菌液的LB培养基，选取抑菌圈较明显的菌落；
iii、防御素毕赤酵母工程菌的鉴定：
选取抑菌圈较明显的菌落，挑取MD备份平板上的相应单菌落，用无菌 水稀释后作为模板进行菌落PCR鉴定目的基因整合入酵母染色体；
iv、防御素毕赤酵母工程菌的高密度诱导表达：
挑取待表达的防御素毕赤酵母工程菌的单菌落，接种于BMGY液 体培养基，摇床培养至对数中期；收集菌体，去上清，细胞沉淀全部转移 至BMMY液体培养基中，摇床培养；每隔24小时补加100％甲醇至终浓度 为0.5％；从细胞沉淀转至BMMY液体培养基诱导开始；提取发酵液，离 心所得的上清液中即含有表达的蛋白产物——昆虫防御素。
V、产物的抗菌谱的鉴定：通过对各种革兰氏阳性菌及阴性菌、霉菌等的抗菌性 检测确定该产品的抗菌谱。
如上所述的昆虫防御素在毕赤酵母中的表达方法，其特征在于：在PCR产 物的接头处理时，将Cpo I及Not I酶切后的pHBM905B载体片段与经T4DNA 聚合酶处理的266个碱基的目的基因片段以T4DNA连接酶连接。
本发明的优点
作为基因工程中的表达系统，分泌外源蛋白的能力是一个十分重要的特性， 因为产物的分泌避免了产物的大量积累，而产物的大量积累常常会影响细胞的正 常生长及产物的稳定性。其次，产物的分泌有利于产物的分离和纯化。此外，许 多基因工程的产物，特别是和医药有关的产品，多数是分泌蛋白，它们合成后只 有经过伴随蛋白质的分泌过程进行加工(包括切除信号肽、糖基化及空间折叠等) 才能成为有活性的物质。
首先，本发明旨在通过基因工程的手段在真核表达系统中表达天然的抗菌肽 ——defensin，获得有生物学活性的表达产物。选用Pichia pastoris(毕赤酵母)作 为基因表达系统，可以避免融合表达所带来的问题，如必须在表达后切除信号肽 序列等复杂操作，具有许多优点。而且，与已往的真核基因表达系统相比，毕赤 酵母表达系统具有操作简便，快速，以及高密度发酵的特性，已被认为是最具有 发展前景的生产蛋白质的工具之一。而且，本发明选用改造pPIC9K载体得到的 pHBM905B载体为表达载体，pHBM905B载体自身带有信号肽，转化的酵母感 受态细胞以摇瓶方式培养，可以将表达产物直接分泌到胞外，提取发酵液，离心 所得的上清液中即含有表达的蛋白产物，其提纯工艺简单，成本低，适宜大量表 达，同时也易于检测，为以后的药学分析研究及工业批量生产奠定了基础。
其二，应用巴斯德毕赤酵母表达系统表达外源基因具有以下优点：(1)其表 达载体含有特有的乙醇氧化酶(AOX)基因启动子，通过甲醇诱导AOX1调控外 源基因的表达；(2)可以高密度连续发酵培养，外源蛋白表达量高；(3)根据载体 类型，外源基因表达产物既可以在胞内积聚又可以被分泌到培养基中，而分泌的 外源蛋白占酵母细胞分泌蛋白的量大，利于工业生产和分离纯化；(4)巴斯德毕 赤酵母能对所分泌的蛋白进行N-、O-糖基化修饰且糖基化程度适中。
其三，本研究选用的pHBM905B载体较pPIC9K常规载体引入了Cpo I和 Not I两个酶切位点，在Cpo I和Not I位点之间有一个含卡那霉素抗性的1.2kb 的DNA片段，有利于这两个酶充分酶切，琼脂糖凝胶电泳也可以区分开没有酶 切、单酶切和双酶切的载体片段，回收双酶切的载体片段，连接转化后载体背景 几近为零。大大缩短了得到正确的载体及其表达产物所需的时间。
经Cpo I和Not I酶切后，pHBM905B载体粘性末端分别为：
——CG    GGCCGC——
——GCCAG     CG——
其四，在PCR产物的接头处理上，利用T4DNA聚合酶不仅具有5′→3′方 向的聚合活性，而且还具有3′→5′方向的外切活性，它能从DNA链3′末端开始， 向5′方向依次切割单个核苷酸，如果在反应体系中存在某种dNTP，例如本研究 所用到的dTTP，那么，当T4DNA聚合酶遇到胸腺嘧啶T时，它就会在外切和 聚合作用下达到一个动态平衡，其直观表征就是切割作用在胸腺嘧啶T处停止。
因此，当我们分别在PCR引物两端引入“GTAC”和“GGCCA”两段核苷酸序 列后，可得到如下结构：
GTCA——TGGCC
CAGT——ACCGG
在dTTP存在的条件下，用T4DNA聚合酶处理PCR产物，就可得到如下 结构：GTCA-——T
    T——ACCGG
T4DNA聚合酶和dTTP处理得到的PCR产物粘性未端，正好分别与 pHBM905B载体经Cpo I和Not I酶切后的粘性末端匹配。
这样的克隆方式有以下优点：
1)避免了限制性内切酶的操作。
由于PCR产物无须限制性内切酶的处理，因此在设计PCR引物时不用考虑 基因内部酶切位点的影响。这正好解决了多基因平行操作最大的瓶颈，我们只需 在每条基因的两条PCR引物的5′端做相同的处理，就可以平行处理其PCR产物， 平行克隆。
在PCR引物两端引入特定的酶切位点时一定要加上几个额外的保护碱基， 否则该限制性内切酶的正确切割能力会急剧下降。而且对于许多限制性内切酶而 言，即使加上十几个保护碱基也不好切。这样一来，就使PCR产物修饰增加了 不少难度，这又直接导致了克隆效率低下等问题。
而本研究所用的T4DNA聚合酶处理的方法就不存在以上问题。首先，易于 多基因的平行操作。其次，易于PCR产物的修饰。此方法不仅反应迅速，而且 易于达到目的要求。能为以后的克隆表达提供必要的保障。
2)解决了克隆时基因接入的方向性和正确性的问题。
本研究所采用的T4DNA聚合酶处理的方法，因为它处理后的PCR产物具 有不同的突出末端，是和载体上不同酶切位点所产生的粘性末端相匹配而连接 的。因此，在设计引物时，重组克隆中基因的接入方向就了然于胸。而且由于采 用高保真DNA聚合酶，可以将PCR引入的突变降至最低来保证PCR产物的正 确性。
其五，产生的防御素产物在100℃加热10分钟后仍然有很强的抗菌活性， 显示了广阔的开发前景。
附图说明
图1，果蝇防御素基因PCR扩增图。其中，11.DNA标准分子量(DL-15000)； 12成功扩增出目的基因；13.负对照；箭头所示为克隆的目的片段。
图2，重组质粒pHBM905B/defensin的构建。
图3，pHBM905B经Cpo I及Not I酶切后的电泳图。其中，31.DNAMarker (DL15000)；32.为双酶切样品，箭头所示为线性载体。
图4，阳性克隆的经BamHI酶切验证。41.非重组子；42，43.经BamHI 切下一条500bp左右的片段，为重组子；44.DNAMarker(λ/HindIII digest)。
图5，菌落PCR验证。其中，51.DNA标准分子量(DL15000)；52，53.图 4的阳性克隆扩增出大小约270bp的片段；箭头所示为扩增产物。
图6，15％SDS-PAGE电泳图谱。其中，61为空载体对照；62为低分子量标 准蛋白质(由上至下97kD，66kD，43kD，31kD，20kD，14kD)； 63为阳性克隆在诱导后3天的上清液，64为没有诱导的对照组；65 为BM201(低分子量)标准蛋白质。
图7，表达产物的活性检测。A：诱导表达3天的上清提取液，B：诱导表达 7天的上清提取液；X：pHBM905空载负对照，4、5、7：阴性克隆， 8：阳性克隆。
图8，载体质粒pPIC9K。
具体的实施方案：
1、果蝇防御素在毕赤酵母中的表达载体的构建：
1.1果蝇总DNA提取。用传统的酚仿法提取果蝇的总DNA。
1.2防御素基因的PCR扩增
根据防御素的DNA序列(GeneBank accession No.NT033778)，设计合成特 异引物，(由于果蝇的防御素基因内没有内含子，所以可以直接通过基因组DNA 的与mRNA的PCR克隆产物是相同的)。
引物合成：5’ GTCAAGTTCTTCGTTCTCGTGGC3’
          5’ GGCCAGCAAACGAGAGGCCTTGT3’
(下划线为加入的酶切连接接头)。
PCR反应条件为：95℃预变性2分钟；94℃45秒，60℃1分钟，72℃30 秒，30个循环后，进行72℃充分延伸7分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳，得到270碱基左右的片段(图1)。并用试剂盒回收。
1.3PCR回收产物的接头处理
回收产物利用T4DNA聚合酶在单一dNTP存在的条件下表现出3’至5’的外 切酶活性，将接头削成粘性末端。本发明在dTTP的体系中，处理后的接头可与 经Cpo I及Not I酶切后的表达载体正确连接。
1.4重组质粒pHBM905B/difensin的构建
用碱裂解法抽提表达载体pHBM905B质粒，纯化后用Cpo I及Not I 37℃酶 切。将Cpo I及Not I酶切后的pHBM905B载体片段与经T4DNA聚合酶处理的 266个碱基的目的基因片段以T4DNA连接酶连接。
将连接物转化大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素抗性基因筛选得到多个重 组质粒的阳性克隆，后经酶切鉴定和菌落PCR验证后得到正确的重组质粒，经 序列测定其所含重组片段确为果蝇的防御素基因。由此重组质粒命名为 pHBM905B/defensin。
重组质粒pHBM905B/defensin的构建过程见图2。酵母表达载体pHBM905B 经Cpo I和Not I双酶切后，得到的线性载体的大小为8kb(图3)。将目的基因 连入载体后构建得到重组酵母表达载体pHBM905B/defensin。转化酵母感受态 GS115后，涂布不含His的MD平板，筛选得到数个阳性克隆。由于defensin基 因和pHBM905B载体上均有一个BamHI酶切位点，pHBM905B/defensin经BamH I酶切应该产生约500bp的片段。图4所示质粒经BamHI酶切后筛选出含有 defensin基因的阳性克隆。
1.5重组质粒pHBM905B/defensin转化酵母
用碱裂解法抽提重组pHBM905B/defensin质粒，纯化后用SalI酶切，使重 组质粒线性化。转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布不含His的MD平板， 筛选出发生同源重组的His+克隆。
毕赤酵母的转化具体步骤：
在未解冻的感受态细胞上加入待转化重组酵母表达载体 pHBM905B/defensin；37℃水浴，5分钟，其间轻柔混合样品1～2次；加入Buffer B1.5毫升，充分混匀后，30℃水浴1小时；4000rpm离心3分钟，去上清，菌体 用1.5毫升Buffer C悬浮；400rpm离心3分钟，去上清，菌体用0.2毫升Buffer C悬 浮；将悬浮的菌液涂布相应的选择性平板；28℃倒置培养，2～4天后可长出转化 子。
1.6“三明治”夹心平板筛选得重组质粒的转化子。
将MD平板上的单菌落转接到BMMY平板上，并用MD平板备份；倒置培 养BMMY平板，在培养皿盖上加甲醇诱导其表达，每12小时补加一次；诱导 2-3天后，平铺一层混有大肠杆菌菌液的LB培养基，37℃培养12小时后观察抑 菌圈的大小。有抑菌圈的菌落可能是重组质粒的转化子——防御素毕赤酵母工程 菌。
1.7菌落PCR鉴定目的基因整合入酵母染色体：
选取抑菌圈较明显的菌落，挑取MD备份平板上的相应单菌落，用无菌水稀 释后作为模板；用1.2中的引物进行PCR反应。PCR反应条件为：95℃预变性5 分钟，94℃45秒，60℃1分钟，72℃30秒，30个循环；72℃充分延伸7分钟。 将PCR产物进行琼脂糖电泳，显示有270个碱基的片段产生的则可以确定为含 有重组酵母表达载体pHBM905B/defensin的防御素毕赤酵母工程菌。(如图5)
1.8防御素毕赤酵母工程菌的高密度诱导表达：
待表达的防御素毕赤酵母工程菌单菌落，接种于BMGY液体培养基(按 ≤10％装瓶)28～30℃，摇床培养至对数期(OD600＝2～6)；接1毫升培养液至100 毫升BMGY液体培养基(按≤10％装瓶)，28～30℃，摇床培养至对数中期 (CD600＝20～30)。4000rpm室温离心5分钟，收集菌体，去上清，细胞沉淀全部 转移至100毫升BMMY液体培养基中，25℃，摇床培养；每隔24小时补加100％ 甲醇至终浓度为0.5％。从细胞沉淀转至BMMY液体培养基诱导开始，每隔24 小时取样1毫升，分析表达水平；2000～5000rpm离心2～5分钟取上清液，收集 菌体，得到果蝇防御素蛋白。
2表达产物的鉴定及生物活性检测
2.1SDS-PAGE鉴定表达产物：
鉴定防御素蛋白的表达：取10微升上清液等体积加入2倍SDS上样缓冲液。 电泳参照《分子克隆手册》用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
选取阳性克隆经BMMY培养液28℃摇瓶培养。甲醇诱导3天后，其上清夜 进行SDS-PAGE电泳(4％浓缩胶，15％分离胶)，经银染可看到有一条清晰的 表达蛋白条带，大小为10kD，与防御素基因产物的大小相符(图6)。上清液的 蛋白含量经A280检测在每微升50.167毫克/毫升，其中约70％以上为防御素表达 产物。
2.2琼脂孔穴扩散法鉴定其生物活性：
将处于对数生长期的大肠杆菌菌液(A650＝0.3)与固体LB培养基在45℃左 右混合均匀，平铺在平板中，待其凝固后4℃保存。使用时在平板中打直径为5mm 的小孔，滴入100℃水浴10分钟后的上清液50微升，37℃培养过夜，观察抑菌 活性(以pHBM905B空载体的表达蛋白为阴性对照)。抑菌实验显示了阳性克隆 8号在第3天开始对大肠杆菌产生抑菌活性，到第7天出现明显的抑菌圈，蛋白 表达达到峰值，而阴性克隆4、5、7和负对照X未出现抑菌圈(图7)。
2.3表达产物的抗菌谱的确定
将处于对数生长期的待检菌平铺在平板中。使用时在平板中打直径为5mm 的小孔，滴入水浴后的上清液50微升，适当温度培养过夜，观察抑菌活性(以 pHBM905B空载体的表达蛋白为阴性对照)。确定抑菌谱。