疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒
阅读：602发布：2020-05-11
专利汇可以提供疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，本发明提供了 疥螨 无机焦 磷酸 酶作为 疥螨病 诊断 抗原 的应用，相关实验结果显示，疥螨无机焦磷酸酶能被自然感染疥螨的兔阳性血清识别，兔疥螨总蛋白可以被兔抗疥螨无机焦磷酸酶的高免血清识别，具有良好的免疫原性，同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，对早期疥螨病具备极高的检出率，种种结果证明疥螨无机焦磷酸酶可以作为疥螨病的诊断抗原，特别是在对早期疥螨病的诊断中。，下面是疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒专利的具体信息内容。
1.疥螨无机焦磷酸酶在制备诊断疥螨病的试剂盒中的应用，所述试剂盒以疥螨无机焦磷酸酶为诊断抗原，且用于检测血清抗体。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疥螨病为早期疥螨病。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。
5.一种诊断早期疥螨病的ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有疥螨无机焦磷酸酶的固相载体，所述试剂盒用于检测血清抗体。
6.根据权利要求5所述ELISA试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液中的一种或两种以上。
7.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为HRP标记羊抗兔IgG。
8.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBS-T洗涤液。
9.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB显色液。
10.根据权利要求6所述ELISA试剂盒，其特征在于，所述封闭液为脱脂牛奶。
疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒
技术领域
背景技术
[0002] 疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨属的疥螨(Sarcoptes scabiei)寄生于人和其他哺乳动物皮肤表皮内，引起称为疥疮(又称疥癣、癞病)的一种顽固、接触性、传染性皮肤病，其以剧痒、结痂、脱毛和皮肤增厚为特征。该病被世界卫生组织列为六种在贫困地区最为流行的皮肤病之一，同时也列入了“忽视的热带疾病”。该病给公共卫生安全与畜牧业生产带来了巨大危害，因此建立准确、快速的疥螨病检测方法很有必要。
[0003] 对疥螨常用的诊断方法主要有临床诊断和显微镜检查，临床诊断根据宿主表现出的临床症状来判断，但是由于螨病与其他皮肤病，如湿疹、秃毛癣、虱和毛虱等有相似的临床症状，有时难以鉴别。显微镜检查虽然准确性很高，但是诊断灵敏度很低。因此，建立新的疥螨病诊断方法具有重要意义。
[0004] 目前，对疥螨病的诊断可以通过皮肤镜检查，但该方法对设备要求高，价格昂贵，无法用于大面积推广。也有研究建立了基于疥螨虫体粗蛋白的ELISA方法来诊断疥螨病，但由于疥螨虫体不能体外培养，因此难以获得大量的虫体粗蛋白；此外，对虫体粗蛋白没有标准的归一化方法，因此该方法也无法大量推广。最近几年，PCR技术也被用于疥螨病的诊断，该方法对较严重的疥螨感染效果较好，但对疥螨病早期，症状并不明显时，效果不佳。因此，探索发现有效的诊断方法是很有现实意义的。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)作为疥螨病，特别是早期疥螨病的诊断抗原的应用，以及在制备诊断疥螨病试剂盒中的应用，使得疥螨无机焦磷酸酶能被自然感染疥螨的兔阳性血清识别，兔疥螨总蛋白可以被兔抗疥螨无机焦磷酸酶的高免血清识别，具有良好的免疫原性，应用于ELISA检测具备高敏感性、特异性和检出率；
[0006] 本发明的另外一个发明目的在于提供一种诊断疥螨病，特别是早期疥螨病的ELISA试剂盒，使其具备较高的敏感性和特异性，并对早期疥螨病具备极高的检出率。
[0007] 在本文中，疥螨无机焦磷酸酶可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。
[0008] 无机焦磷酸酶(Inorganic pyrophosphatases,EC 3.6.1.1)是一种广泛分布的酶，催化无机焦磷酸(inorganic pyrophosphate,PPi)水解成正磷酸盐(orthophosphate)。无机焦磷酸酶在能量代谢、脂质代谢以及驱动生物合成反应例如核酸合成和蛋白质合成的实现。据报道，通过RNA干扰和酶活抑制试验表明猪蛔虫(Ascaris suum)的无机焦磷酸酶对虫体的发育和蜕皮起关键作用。进一步的研究表明，无机焦磷酸酶对秀丽隐杆线虫幼虫的发育和肠道功能起重要作用。此外，猪蛔虫和西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)的无机焦磷酸酶也被认为是潜在的疫苗候选。目前，疥螨无机焦磷酸酶在疥螨病以及早期疥螨病中的相关研究尚未见报道。
[0009] 本发明通过原核表达得到重组疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)，对其进行免疫印迹，ELISA以及早期诊断方法的建立。免疫印迹结果显示rSsc-PYP-1能被自然感染兔疥螨阳性血清识别，兔疥螨总蛋白可以被兔抗rSsc-PYP-1蛋白的高免血清识别到，具有良好的免疫原性。间接ELISA结果显示，该方法的cut-off值为0.2532，敏感性为92％(46/50)，特异性为93.6％(44/47)，优于使用重组切丝蛋白建立的ELISA方法(83.3％敏感性，87.9％特异性，数据来源于Zheng,Y.et al.Characterization of Sarcoptes scabiei cofilin gene and assessment of recombinant cofilin protein as an antigen in indirect-ELISA for diagnosis.BMC infectious diseases.16,1-7(2015))，提示该重组蛋白质可以作为潜在的诊断候选分子。对10只新西兰大白兔进行人工感染，感染前以及感染后每周采血，基于rSsc-PYP-1蛋白建立的间接ELISA方法能在感染后一周就检测到阳性，检出率为100％(50/50)，表明该蛋白具有早期诊断的潜力。
[0010] 基于上述内容，本发明提供了疥螨无机焦磷酸酶作为疥螨病的诊断抗原的应用，特别是作为早期疥螨病的诊断抗原。同时，本发明还提供了疥螨无机焦磷酸酶在制备诊断疥螨病的试剂盒中的应用，特别是在制备诊断早期疥螨病的试剂盒中的应用；其中，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒，更具体地，该ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。
[0011] 根据上述rSsc-PYP-1建立的ELISA方法的试验数据可以得知，ELISA试剂盒具备极高的敏感性、特异性和对早期疥螨病检出率。基于上述应用，本发明对应提供了一种诊断早期疥螨病的ELISA试剂盒，包括包被有疥螨无机焦磷酸酶的固相载体。在本发明具体实施方式中，所述固相载体可选择为96孔培养板或与其相似的固相载体，所述疥螨蛋白酪氨酸激酶包被浓度为1.45μg/well，可采用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释进行包被。
[0012] 在确定了试剂盒核心组分后，所述ELISA试剂盒还可包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液中的一种或两种以上。
[0013] 其中，所述酶标二抗优选为HRP标记羊抗兔IgG，在本发明具体实施方式中，所述酶标二抗采用购自于Bio-Rad公司的产品，酶标二抗稀释比例为1:4000；
[0014] 所述洗涤液优选为PBS-T洗涤液，在本发明具体实施方式中，所述PBS-T洗涤液组成为：0.01M PBS和0.05％吐温20；所述显色液优选为TMB显色液；
[0016] 由以上技术方案可知，本发明提供了疥螨无机焦磷酸酶作为疥螨病诊断抗原的应用，相关实验结果显示，疥螨无机焦磷酸酶能被自然感染疥螨的兔阳性血清识别，兔疥螨总蛋白可以被兔抗疥螨无机焦磷酸酶的高免血清识别，具有良好的免疫原性，同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，对早期疥螨病具备极高的检出率，种种结果证明疥螨无机焦磷酸酶可以作为疥螨病的诊断抗原，特别是在对早期疥螨病的诊断中。附图说明
[0017] 图1所示为重组Ssc-PYP-1与兔疥螨总蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹分析；其中，1：重组Ssc-PYP-1在BL21中表达；2：重组Ssc-PYP-1纯化结果；3：纯化的Ssc-PYP-1与兔自然感染疥螨血清孵育：4：纯化的Ssc-PYP-1和健康兔血清孵育；5：兔疥螨总蛋白与抗重组Ssc-PYP-1高免血清孵育；6：兔疥螨总蛋白与免前血清孵育；
[0018] 图2所示为感染兔疥螨血清、未感染兔疥螨血清以及感染其他虫体的兔血清的OD450值；其中，横坐标从左至右依次表示感染兔疥螨血清、未感染兔疥螨血清以及感染其他虫体的兔血清；**代表统计学差异极显著(**P<0.01)，“ns”代表差异不显著；
[0019] 图3所示为兔人工感染疥螨后不同时间段血清OD450值；其中，横坐标从左至右依次表示为感染前血清、感染1周后血清、感染2周后血清、感染3周后血清以及感染4周后血清；**代表统计学差异极显著(**P<0.01)，“ns”代表差异不显著。
具体实施方式
[0020] 本发明公开了疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用及试剂盒已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组合物和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0021] 在具体实施方式中，本发明记载了rSsc-PYP-1的克隆，表达与纯化。通过免疫印迹，探索了重组rSsc-PYP-1蛋白的免疫原性。本发明还评估了重组rSsc-PYP-1作为诊断抗原的潜力，建立了rSsc-PYP-1间接ELISA方法，并对早期感染疥螨的兔进行了血清学诊断。
[0022] 本发明通过提取兔疥螨总RNA，并逆转录为cDNA，从cDNA中扩增兔疥螨无机焦磷酸酶基因全长CDS序列。经T克隆后，将扩增产物以酶切连接的方式导入表达载体中，以大肠杆菌进行原核表达获得重组的rSsc-PYP-1。
[0023] 本发明建立的基于重组rSsc-PYP-1的ELISA，具有良好的诊断效果，敏感性为92％(46/50)，特异性为93.6％(44/47)，优于使用重组切丝蛋白建立的ELISA方法(83.3％敏感性，87.9％特异性)。在本发明的早期诊断实验(感染1周)中，通过建立的间接ELISA，可以检测到5份阳性血清样品中4份样品的特异性抗体IgG，并且与未感染血清样品抗体水平差异极显著(p<0.01)。这表明在疥螨感染的早期阶段，抗PYP-1抗体显着增加。
[0024] 此外，在交叉反应实验中，7份兔球虫阳性血清、7份兔豆状囊尾蚴阳性血清、9份兔痒螨阳性血清和另外24份阴性血清中，仅有3份感染兔痒螨阳性血清样品显示为阳性反应，交叉反应实验说明本发明可以区分开兔螨虫病的感染与兔其他寄生虫的感染。在不同寄生虫感染前后过程中，总IgG水平变化为明显的差异，未感染寄生虫兔血清抗体水平与感染艾美球虫，豆状囊尾蚴，兔痒螨的兔血清抗体水平呈现极显著差异(p<0.01)。种种实验结果说明，重组rSsc-PYP-1在疥螨感染早期阶段具有诊断潜力。
[0025] 在具体实施方的实验中，所有实验兔严格按照“中华人民共和国动物保护法”(2009年9月18日发布的草案)进行处理。所有程序严格按照“四川农业大学动物伦理委员会实验动物护理指南”(中国，雅安；批准号：2013-028)实施。所有方法均按照相关准则和规定进行，包括任何相关细节。
[0026] 此外，实验所涉及的虫体、血清、试剂、菌株和质粒按参考如下：
[0027] 兔疥螨采自四川农业大学寄生虫病研究中心患疥螨病的新西兰大白兔，液氮冻存备用。
[0028] 实验动物为15只健康新西兰大白兔(10只用于人工感染疥螨，雌性各半；5只做对照组)，2.5～3.0kg,购自四川农业大学实验动物中心。
[0029] 50份自然感染的兔疥螨阳性血清，采自四川省四个兔场。48份阴性血清(其中24份用于临界值的确定，24份用于特异性检测)，采自四川两个没有疥螨感染史的兔场。7份兔豆状囊尾蚴阳性血清，7份兔球虫阳性血清和9份兔痒螨阳性血清。-20℃保存备用。
[0030] 对10只新西兰大白兔进行人工感染，5只做对照组。于感染前采血一次，感染后每周采血，持续四周。因此人工感染组共采血50份，对照组25份。
[0031] 主要试剂：总RNA抽提试剂盒，QIAquick胶DNA回收试剂盒，质粒小提试剂盒、TMB、DAB显色液，蛋白质预染Marker III，2*Taq PCR master mixture，天根公司；IPTG，Sigma公司；逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthes is Kit)，Thermo公司；DNA Marker DL2000，大连宝生物公司；限制性内切酶(BamHI/XhoI)，TAKARA公司；十二烷基磺酸钠(SDS)和DEPC，TaKaRa公司；T4 DNA连接酶，MBI公司；HRP标记羊抗兔IgG，Bio-Rad公司；PCR引物，由上海英潍捷基公司合成；测序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它试剂均为国产分析纯。
[0032] 菌株和质粒：大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)，购自天根公司；TaKaRa pMD19-T Vector，购自大连宝生物工程有限公司；原核表达载体pET32a(+)，购自Invitrogen。
[0033] 数据分析按照如下方式进行：
[0034] 所有数据的表示方法都用平均数(mean)±标准差(SD)。使用Mann-Whitney U检验以及t检验进行统计分析。所有的统计分析都采用SPSS Statistics 20(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)来进行。P<0.05被认为是显著的。软件GraphPad Prism software(version 5.01)被用于作图。
[0035] 以下就本发明所提供的疥螨无机焦磷酸酶的应用以及诊断疥螨病的试剂盒做进一步说明。
[0036] 实施例1：重组rSsc-PYP-1蛋白的克隆、表达与纯化
[0037] 按照总RNA提取试剂盒说明书提取兔疥螨总RNA，并用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA。设计一对特异性PCR引物(上游：5′-CGGGATCCATGACAGCGAAATCCAAT-3′含BamHI的酶切位点；下游：5′-CCCTCGAGTTAAATTAATTTAACAAAATGCC-3′，含XhoI的酶切位点)，从cDNA中扩增兔疥螨无机焦磷酸酶基因全长CDS序列。经T克隆后，将扩增产物以酶切连接的方式导入pET32a(+)表达载体中；经测序验证正确后，将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导2+
表达。超声裂解重组细菌，取上清液，用Ni 柱亲和层析法纯化表达产物。SDS-PAGE检测表达产物和纯化产物。超滤管换液和浓缩之后，用BCA法测定纯化蛋白的浓度。
表达。超声裂解重组细菌，取上清液，用Ni 柱亲和层析法纯化表达产物。SDS-PAGE检测表达产物和纯化产物。超滤管换液和浓缩之后，用BCA法测定纯化蛋白的浓度。
[0038] 实施例2：rSsc-PYP-1高免血清以及兔疥螨总蛋白的制备
[0039] rSsc-PYP-1高免血清的制备：以重组疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)对2只10周龄雌性新西兰白兔进行3次皮下免疫，每次免疫间隔两周。免疫前采血作为阴性对照。首次免疫为200μg/mL的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，加强免疫为100μg/mL的重组蛋白与等体积的福氏不完全佐剂混合。免疫结束两周后采血，分离血清。将分离后的血清-20℃保存，用于总蛋白的免疫印迹分析。
[0040] 兔疥螨总蛋白的制备：取兔疥螨50mg，按照总蛋白提取试剂盒操作说明提取兔疥螨总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。
[0041] 实施例3：重组疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)的表达和识别
[0042] 将纯化后的重组蛋白质和兔疥螨总蛋白分别进行SDS-PAGE电泳，再将凝胶分别转移到硝酸纤维素膜上。经5％脱脂牛奶封闭2小时后，以兔疥螨阳性、阴性血清(均为1:200稀释)对重组蛋白质4℃孵育过夜；以重组蛋白质高免血清多克隆抗体和阴性血清(均为1:100稀释)对兔疥螨总蛋白4℃孵育过夜。经洗涤后，以HRP标记的山羊抗兔IgG分别孵育1小时。洗涤后，DAB显色液显色。
[0043] 编码兔疥螨无机焦磷酸酶的全长cDNA为894bp，被成功亚克隆到pET32a(+)表达载体上，重组蛋白表达在上清，除开约20KDa的融合肽蛋白，大小与通过氨基酸序列推导出的蛋白大小一致，约54kDa(图1，泳道1和2)。免疫印迹结果显示，使用自然感染的兔疥螨阳性血清孵育纯化的重组蛋白时，出现一条单一的条带，大小约54KDa(图1，泳道3)；用兔抗重组蛋白的高免血清孵育兔疥螨总蛋白时，出现四条带(图1，泳道5)。阴性没有条带。
[0044] 上述结果表明，重组兔疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)在原核表达系统中可溶性表达。纯化后的rSsc-PYP-1能够被兔疥螨病自然感染阳性血清特异性识别，表明rSsc-PYP-1具有良好的免疫原性。同时兔疥螨总蛋白也能够被抗rSsc-PYP-1的高免血清特异性识别，出现四条独立的条带，这可能是由于在兔疥螨无机焦磷酸酶存在不同的亚型，也表明兔疥螨无机焦磷酸酶具有良好的免疫原性。
[0045] 实施例4：重组疥螨无机焦磷酸酶(rSsc-PYP-1)间接ELISA方法的建立
[0046] 使用方阵滴定法测定抗原和血清的最佳工作浓度。向96孔板加入包被液梯度稀释的重组蛋白质100μL(即5.8μg/孔，2.9μg/孔，1.45μg/孔，0.73μg/孔，0.36μg/孔和0.18μg/孔)，4℃包被过夜。PBS-T(0.01M PBS+0.05％吐温20)洗涤后，加入5％脱脂牛奶(PBS稀释)300μL，37℃封闭2小时。再次洗涤后，分别加入梯度稀释的阳性和阴性血清(即1:40,1:80,
1:160,1:320,1:640和1:1280，PBS稀释)，37℃孵育1h。洗涤后，每孔加入100μl稀释好的酶标二抗(1:3000稀释，PBS稀释)，37℃孵育1h。再次洗涤后，每孔加入100μlTMB显色液，室温孵育15min后每孔加入100μl 2mol/L H2SO4终止反应。在酶标仪紫外波长450nm处测定吸光度值。计算P/N值，选择阳性OD450平均值在1左右时的抗原浓度为抗原最佳作用浓度。该点对应的血清稀释度为最佳的血清稀释度。
1:160,1:320,1:640和1:1280，PBS稀释)，37℃孵育1h。洗涤后，每孔加入100μl稀释好的酶标二抗(1:3000稀释，PBS稀释)，37℃孵育1h。再次洗涤后，每孔加入100μlTMB显色液，室温孵育15min后每孔加入100μl 2mol/L H2SO4终止反应。在酶标仪紫外波长450nm处测定吸光度值。计算P/N值，选择阳性OD450平均值在1左右时的抗原浓度为抗原最佳作用浓度。该点对应的血清稀释度为最佳的血清稀释度。
[0047] 确定好抗原和血清的最佳工作浓度之后，对最佳封闭液(5％脱脂奶粉、10％脱脂奶粉、1％BSA、2％BSA和1％明胶)、血清作用时间(30min、60min和90min)、酶标二抗稀释度(1:3000、1:4000、1:5000和1:6000)和酶标二抗作用时间(30min、45min、60min和90min)分别进行优化，计算P/N值，选择阳性OD450平均值在1左右时的条件为最优工作条件。每个条件优化时，每孔做三个重复并做对照。
[0048] 方阵滴定结果显示，当抗原为1.45μg/well、血清稀释度为1:640时，ELISA效果最优。优化后的间接ELISA条件如下：每孔包被1.45μg重组蛋白；5％脱脂牛奶封闭2小时；血清稀释度1:640，37℃孵育1小时；二抗最佳稀释度1:4000，37℃孵育1小时。其余步骤见本实施例上述记载。此外，可根据本实施例的间接ELISA试剂组成一种试剂盒。
[0049] 实施例5：临界值的确定
[0050] 用优化好的间接ELISA方法测定24份阴性兔血清OD450，计算出平均值(X)和标准偏差(SD)，从而得到阳性血清临界值X+3SD。对24份健康兔血清进行检测，得出临界值为0.2532(平均值0.1595，标准差0.0312)。
[0051] 实施例6：rSsc-PYP-1间接ELISA的重复性
[0052] 用同一批次包被的酶标板，取6份血清，在同一条件下进行检测，每个血清样本做6个重复，根据读数结果计算变异系数，判定批内重复性。取5个不同批次包被的酶标板，在同一条件下对6份血清进行检测，每个血清样本做2个重复，根据读数结果计算变异系数，判定批间重复性。
[0053] 结果显示，批内重复的变异系数(CVs)在0.29％到4.57％(平均1.85％)，批间重复的变异系数在0.98％到8.23％(平均3.62％)。所有变异系数均小于10％，表明本研究所建立的基于rSsc-PYP-1的间接ELISA方法是可信赖的。
[0054] 实施例7：rSsc-PYP-1间接ELISA方法的敏感性与特异性
[0055] 以最优工作条件，测定50份兔疥螨阳性血清的OD450。对7份兔球虫阳性血清、7份兔豆状囊尾蚴阳性血清、9份兔痒螨阳性血清和另外24份阴性血清分别测定OD450。每个样品做三个重复，OD450>临界值被认为是ELISA阳性。
[0056] 敏感性的计算：敏感性(％)＝ELISA阳性×100/真阳性；特异性(％)＝ELISA阴性×100/真阴性。
[0057] 图2结果显示，对50份自然感染的兔疥螨血清进行检测，有46份OD450大于临界值，因此该间接ELISA方法的诊断敏感性为92％(46/50)。对7份兔球虫阳性血清、7份兔豆状囊尾蚴阳性血清、9份兔痒螨阳性血清和另外24份阴性血清分别测定OD450，其中只有三份兔痒螨阳性血清OD450大于临界值，因此该方法的特异性为93.6％(44/47)。
[0058] 实施例8：rSsc-PYP-1间接ELISA的早期诊断
[0059] 对10只3月龄新西兰大白兔(雌雄各半)进行人工感染。方法是将先将后腿脚趾处剪毛，然后将0.0017-0.0020g的疥螨虫体(约2000只混合阶段的疥螨)敷在每只后腿，并用纱布包裹24h。感染前以及感染后1周，2周，3周和4周分别采血，分离血清，-20℃保存。对照组5只3月龄新西兰大白兔，采血时间同试验组。
[0060] 用本发明所建立的间接ELISA方法分别对试验组的50份血清和对照组25份血清进行检测。所有板中都包括标准阳性和标准阴性以及空白对照。
[0061] 图3结果显示，基于rSsc-PYP-1蛋白建立的间接ELISA方法能在感染后一周就能检测到血清学阳性，检出率为100％(50/50)，并且直到试验结束都一直能检测到，而对照组5只新西兰大白兔抗体水平始终保持在临界值以下。
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种治疗猪疥螨病的中药组合物 | 2020-05-14 | 165 |
| 一种治疗犬猫疥螨病的复方蜂胶组合物及其制备方法 | 2020-05-26 | 148 |
| 防治猪疥螨病的外用药酒及制备方法 | 2020-05-14 | 555 |
| 杀疥螨(癣)组合物及生产方法 | 2020-05-15 | 556 |
| 治疗家兔疥螨病的复方二嗪农组合物及其制备方法 | 2020-05-27 | 428 |
| 一种杀疥螨(癣)组合物的生产方法 | 2020-05-18 | 318 |
| 一种预防猪疥螨病的饲料 | 2020-05-19 | 53 |
| 一种用于治疗猪疥螨的杀螨剂 | 2020-05-21 | 756 |
| 用于治疗家兔疥螨病和兔舍环境杀螨的乳剂 | 2020-05-24 | 903 |
| 治疗动物疥螨病的外用中兽药组合物、应用及其制备方法 | 2020-05-27 | 535 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈