经改良的模块化抗原转运分子及其用途
阅读：225发布：2020-06-29
专利汇可以提供经改良的模块化抗原转运分子及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及(经分离)重组 蛋白质 ，也称作经改良的MAT(iMAT)分子，其包含至少一个移位模 块 、至少一个靶向模块及至少一个 抗原 模块，其中至少一个半胱胺酸残基经不同的 氨 基酸残基取代。此类iMAT分子特别可用作 疫苗 ，例如用于 治疗 和/或 预防 马 科动物 的变态反应和/或传染性 疾病 和/或防止 马科动物 中传染性疾病的传播。本发明还涉及编码此类iMAT分子的核酸、相应的载体及原代细胞或细胞系。，下面是经改良的模块化抗原转运分子及其用途专利的具体信息内容。
1.经改良的MAT(iMAT)分子，其包含：
(i)至少一个第一模块，其是使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部的氨基酸序列，
(ii)至少一个第二模块，其是使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经加工的抗原，及(iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其是衍生自至少一种抗原、优选至少一种变应原的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，其决定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性，
其特征在于至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代。
2.权利要求1的iMAT分子，其中在所述至少一个抗原模块中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代，其中优选在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基均经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代。
3.权利要求1或2的iMAT分子，其中所有此类模块彼此共价连接，任选是通过在所述第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个之间的、任选所有相邻模块之间的额外间隔模块而共价连接。
4.权利要求1或2的iMAT分子，其中所有此类模块彼此共价连接，且其中所述第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间不存在额外的间隔模块。
5.权利要求1-4任一项的iMAT分子，其中所述至少一个第二模块包含马科动物不变链，且优选是由SEQ ID NO:2、15、16的氨基酸序列中之一或多种所组成的。
6.权利要求1-5任一项的iMAT分子，其中所述至少一个抗原模块包含衍生自至少一种在马科动物中引发变态反应的变应原的至少一个完全或部分表位，优选至少一种衍生自食血昆虫变应原的至少一个完全或部分表位、更优选衍生自库蠓属(culicoides)变应原的至少一个完全或部分表位，和/或至少一种衍生自霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)、更优选来自树、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属(aspergillus)、链格孢菌属(alternaria)、灰霉菌属(botrytis)、尾孢菌属(cercospora)、枝孢菌属(cladosporium)、弯孢菌属(curvularia)、内脐蠕孢菌属(drechslera)、散囊菌属(eurotium)、麦类胡麻叶枯病菌属(helminthosporium)、附球孢菌属(epicoccum)、白粉菌属(erysiphe)、粉孢菌属(oidium)、镰孢菌属(fusarium)、横梗霉属(lichtheimia)、黑孢菌属(nigrospora)、青霉菌属(penicillium)、黑团孢菌属(periconia)、霜霉菌属(peronospora)、浪梗霉菌属(polythrincium)、糖多孢菌属(saccharopolyspora)(先前也称作干草菌属(faenia)或小多孢菌属(micropolyspora))、高温放线菌属(thermoactinomyces)、匍柄霉菌属(stemphylium)、圆酵母属(torula)的真菌和/或其孢子和/或粉螨属(acarus)、糖螨属(glycophagus)、食酪螨属(tyrophagus)、尘螨属(dermatophagoides)的螨(和/或其粪便)的变应原的至少一个完全或部分表位。
7.权利要求6的iMAT分子，其中所述至少一种抗原，优选至少一种变应原为Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4和/或Cul o7变应原。
8.权利要求1-5任一项的iMAT分子，其中所述至少一个抗原模块包含衍生自至少一种引起马科动物的一或多种传染性疾病的病原体的抗原的至少一个完全或部分表位，优选至少一种衍生自红球菌属(rhodococcus)、链球菌属(streptococcus)、环状病毒属(orbivirus)、黄病毒属(flavivirus)、毛癣菌属(trichophyton)、小孢癣菌属(microsporum)、隐孢子虫属(cryptosporidium)和/或圆线虫属(strongylus)的抗原的至少一个完全或部分表位，其中优选所述至少一个抗原模块也可以是参与马科动物的一或多种传染性疾病传播的载体的抗原，更优选是库蠓属、库蚊属(culex)和/或硬蜱属(ixodes)唾液组分。
9.权利要求1-8任一项的iMAT分子，其进一步包含至少一个标签模块，优选至少一个His-标签，其中该至少一个标签模块优选存在于N-末端和/或C-末端，更优选为一个标签模块，优选为在一个甲硫氨酸残基后N-末端的一个His-标签。
10.权利要求1-9任一项的iMAT分子，其中所述至少一个第一模块包含HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白的氨基酸序列或其部分序列，优选由其所组成，前提条件为所述至少一个第一模块功能是作为使iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部中的模块。
11.权利要求1-10任一项的iMAT分子，其以单体形式和/或线性形式存在。
12.权利要求1-11任一项的iMAT分子，其包含SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、17、
20、21、22、23的氨基酸序列中一或多种，优选是由其所组成。
13.疫苗或免疫原性组合物或药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项的iMAT分子。
14.权利要求1-12任一项的iMAT分子、或者权利要求13的疫苗或免疫原性组合物或药物组合物，其用于预防和/或治疗马科动物的一或多种过敏，优选昆虫叮咬过敏反应(IBH)、荨麻疹和/或复发性气管阻塞(RAO)的方法中。
15.权利要求1-12任一项的iMAT分子、或者权利要求13的疫苗或免疫原性组合物或药物组合物，其用于预防和/或治疗马科动物的一或多种传染性疾病和/或防止马科动物的一或多种传染性疾病传播和/或防止马科动物的一或多种传染性疾病经载体，优选经食血苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊，更优选红球菌肺炎、腺疫、非洲马疫、西尼罗河病毒感染、皮癣菌病和/或消化道和/或其他器官的寄生虫和/或隐孢子虫病、蠕虫和/或其潜隐期传播的方法中。
16.核酸，其编码权利要求1至12中任一项的经分离重组蛋白质。
17.载体，其包含至少一种权利要求16的核酸。
18.原代细胞或细胞系，其包含至少一种权利要求15的核酸和/或至少一种如权利要求
17的载体。
经改良的模块化抗原转运分子及其用途
发明领域
[0001] 本发明涉及(经分离)重组蛋白质，也称作经改良的MAT(iMAT)分子，其包含至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块，其中至少一个半胱胺酸残基经不同的氨基酸残基取代。此类iMAT分子可以通过大大的减少的制造努力来生产，并且具有物种特异性、更安全以及在免疫上非常有效。此类(经分离)重组蛋白质特别适于作为一秒，例如用于治疗和/或预防马科动物的变态反应和/或感染和/或防止感染传播。
[0002] 发明背景
[0003] 通过抗原呈递细胞(APC)加工抗原是经由两种不同的途径发生。细胞内所产生的抗原经细胞表面上的MHC I(I类主要组织相容性复合体，I类MHC)分子来呈递，而细胞外抗原是经由细胞表面上的MHC II(II类主要组织相容性复合体，II类MHC)分子来呈递。这两种机制都由宿主引发对抗原的免疫应答。抗原从吸收进入细胞中直至以MHC II-抗原复合体形式呈递于细胞表面上所采用的途径是通过各种细胞器，尤其通过内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、反面高尔基体管网状结构(trans-Golgi network)、溶酶体、内涵体及通过II类MHC隔室(MIIC)继续进行。MIIC在MHC II介导的抗原呈递中发挥重要作用。在细胞的这些细胞器中，II类MHC分子负载了低分子量抗原或蛋白质的蛋白水解片段。在此过程中，在一开始时结合至MHC II分子的不变链(也称作MHC IIγ链或Ii)经历蛋白水解降解，并且抗原在直接或间接结合MHC II的各种蛋白质的调节下结合至MHC II分子。人体中的这些调节分具体包括HLA-DM、HLA-DO、LAMP-1、LAMP-2、CD63、CD83等这些蛋白质的确切功能部分仍原因不明，但其中有许多具有可促使将其转运至溶酶体、转运至内涵体、转运至反面高尔基体管网状结构、转运至MIIC等的信号序列。许多蛋白酶为参与蛋白水解处理时所必需，使得抗原可呈递于MHC II分子上。存在于MIIC中的蛋白酶具体包括组织蛋白酶家族的各个成员，诸如(例如)组织蛋白酶S及组织蛋白酶L。在除人之外的物种中，同源的II类MHC分子具有不同的氨基酸序列。在马科动物中，MHC系统的组织类似于具有邻接I类、III类、及II类区域的人类(Kelley J等人，Immunogenetics 2005,56:683–695)。
[0004] 提供用于调节免疫应答的模块化抗原转运(MAT)分子、相关构建物、方法及其用途的概念公开于WO 2004/035793(美国等同申请US 2005/0281816)中。此文献描述了一种三部分分子的有用性，该MAT分子用于引入抗原的表位至细胞中从而确定要经过该MAT分子调节的免疫应答。其中，描述了各种移位模块、标靶模块及抗原模块。该技术及其方法使得以下成为可能：首先，可有效地从细胞外空间将抗原传送进入标靶细胞的细胞内空间中，以及其次使得此类抗原可在到达细胞内部中之后有效地到达细胞器以便随后处理用于抗原呈递。一般而言，两步法可用于靶向地、有效地调节个体的免疫应答。MAT分子的用途公开于(例如)Martínez-Gómez JM等人[Allergy 2009,64(1):172-178]；Rose H(Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess,2009,96,319-327)及最近Senti G等人[J Allergy Clin Immunol.,2012,129(5):1290-1296]中。基于MAT技术，主要猫变应原Fel d1被融合至TAT衍生的蛋白质移位结构域以及被融合至人截短的不变链以靶向II类MHC路径。在小鼠中评估了免疫原性，而可能的安全性问题则是通过基于猫毛变态反应患者的嗜硷细胞反应性的适宜测试来进行评估。已证实此模型化合物的可能用途。其中描述了，预期MAT分子相较于重组变应原或变应原萃取物在常规变应原特异性免疫疗法(SIT)中可更安全且更有效地诱导期望的免疫应答(也即，脱敏作用
(hyposensitization))。在Senti G.等人最新公开的申请中，描述了针对人的猫毛变态反应的淋巴内免疫疗法于三次注射后诱导耐受性。在其中描述使用MAT-Fel d1的人类首次(first-in-human)临床研究，证实仅在淋巴内注射的三次注射后的安全性及诱导变应原耐受性。
(hyposensitization))。在Senti G.等人最新公开的申请中，描述了针对人的猫毛变态反应的淋巴内免疫疗法于三次注射后诱导耐受性。在其中描述使用MAT-Fel d1的人类首次(first-in-human)临床研究，证实仅在淋巴内注射的三次注射后的安全性及诱导变应原耐受性。
[0005] 其他现有技术如下：
[0006] Gadermaier G等人(Molecular Immunology 2010,47:1292-1298)描述将经半胱氨酸稳定的Art v1折叠靶向用于艾属(Artemisia)花粉变态反应的免疫治疗。作者使用靶向Art v1翻译后修饰作用的遗传工程方法，旨在产生出低致敏性分子：(i)通过定点诱变破坏防卫素结构域的二硫键及(ii)在大肠杆菌中表达的突变体构建物以产生出非糖基化蛋白。然而，明显地，该目标仅操纵Art v1防卫素结构域的三维折叠以通过用丝氨酸交换单一半胱氨酸残基，同时保持完整(即，未修饰)所识别的T-细胞表位(即使其包含半胱氨酸残基)，来消除IgE-结合(换言之，产生出低致敏性分子)。
[0007] 第3届Havemeyer马变应性疾病研讨会(3rd Havemeyer workshop on allergenic diseases of the Horse)报告(Hólar,Iceland,2007年6月，Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008,126:351-361)聚焦于昆虫叮咬过敏(IBH)及复发性气管阻塞(RAO)的免疫学及遗传方面。在此研讨会上，讨论了新颖的对抗IBH的SIT方法，尤其论述具有偶合至模块化抗原移位(MAT)分子的变应原的病毒载体或蛋白质疫苗接种的用途。
[0008] 在2010年及2011年SIAF年度报告中，Crameri R报告了MAT技术在感染IBH的马的疫苗接种中的用途。
[0009] 然而，当生产及制造现有技术中所述的MAT分子时出现了主要问题。具体而言，在开发用于根据优良制造规范(GMP)制造的MAT分子的下游方法(DSP)中所使用的标准方法可能不适用。无法纯化MAT分子的均质分子种类，这明显由于MAT分子的异常物理化学性质。
[0010] 对于现有技术中所述的MAT分子而言，虽然测试了不同分离原理(例如，大小排阻层析、RP-HPLC)，但是若干纯化方法可能不适用(参见本文实施例5)。用于测定重组蛋白质纯度的方法一般包括层析分离(例如，RP-HPLC)及电泳分离(例如，毛细管区带电泳、等电聚焦、还原或非还原条件下的SDS-PAGE)。另外，这些分析方法不能应用于未有分子特异性调适的MAT分子。为了评估纯度，必须开发一种经调适的特异性SDS-PAGE测试程序。此测试程序包括利用还原剂及十二烷基硫酸锂(LDS)并加热至75℃的样品生产，在电泳分离后获得多个可再现明显谱带。以考马斯蓝(Coomassie blue)染料染色导致凝胶的线性定量行为(密度测定法)。使用容许检测MAT分子中之变应原模块的单株抗体，展现一条主要谱带及若干次要谱带。所有谱带也在使第二凝胶重新负载第一凝胶的切除谱带后可再现地迁移至原始凝胶的相同位置。出乎意料地，在所有这些具有较低及较高表观分子量的谱带中，通过从凝胶中切除谱带，胰蛋白酶消化并随后通过质谱(nanoLC/ESI-MS-MS)对其进行分析，来识别全长MAT分子。可从此类实验得出在SDS-PAGE中MAT分子的不同折叠变化的异常行为(“凝胶迁移”)的结论。另外，在所有批次的MAT分子中，可检测到蛋白质的多聚体形式，其难以与单体形式分离。
[0011] 就例如经济观点以及就监管要求而言，必需改良(i)MAT分子的制造方法及(ii)其用于纯度测定的标准分析方法的适合性。另外，就调适MAT分子适于特异性标靶物种(如马)而言，需要调适在MAT技术中的免疫学靶向。
[0012] 另外，MAT分子可轻易地用于由已知主要变应原诱导的变态反应(例如，由Fel d1引发的对猫毛的变态反应)中。然而，现有技术的MAT分子似乎很难用于临床设定如变态反应中，其中，例如，已知涉及各种非交叉反应性变应原，但尚不知晓这些变应原在诱导变态反应时的重要性(换言之，尚不知晓主要变应原)。
[0013] 本发明的基本目标是提供经改良的MAT分子，其可用作医药组合物如疫苗中的活性剂，可克服现有技术的问题。
[0014] 发明的公开
[0015] 发明概述
[0016] 在一个方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供(经分离)重组蛋白质、优选经改良的MAT(iMAT)分子而得以解决，所述经分离重组蛋白质包含：
[0017] (i)至少一个第一模块，其为使得iMAT分子自细胞外空间移位进入细胞内部中的氨基酸序列，
[0018] (ii)至少一个第二模块，其为使得iMAT分子在细胞内物种特异性地靶向至细胞器的氨基酸序列，其中所述细胞器参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原(优选系经加工的抗原)，及
[0019] (iii)至少一个第三模块作为抗原模块，其为衍生自至少一种抗原、优选至少一种变应原的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，从而确定由该iMAT分子调节的免疫应答的特异性，
[0020] 其特征在于，至少在所述抗原模块中，至少一个半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0021] 优选地，在所述至少一个抗原模块中，所有半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代。更优选地，在整个iMAT分子中，所有半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代。
[0022] 优选地，如果不是全部半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代，则在整个iMAT分子中会留下偶数个半胱氨酸。
[0023] 优选地，所有此类模块彼此共价连接，任选通过所述第一、第二和/或第三模中的两个或更多个(任选所有的)相邻模块之间的额外间隔模块共价连接。
[0024] 更优选地，所有此类模块彼此共价连接，且该第一、第二和/或第三模块中的两个或更多个相邻模块之间根本不存在额外间隔模块。
[0025] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含如本文中所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的疫苗或免疫原性组合物或医药组合物而得以解决。
[0026] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供如本文中所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质或如本文中所公开并要求保护的疫苗或免疫原性组合物或医药组合物而得以解决，其用于预防和/或治疗马科动物的一或多种变态反应，优选昆虫叮咬过敏(IBH)、荨麻疹和/或复发性气管阻塞(RAO)的方法中。预防和/或治疗有此需要的马科动物的相应方法以及制备用于预防和/或治疗马科动物的医药组合物/药物的用途也会属于本发明的范畴内。
[0027] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供如本文中所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质或如本文中所公开并要求保护的疫苗或免疫原性组合物或医药组合物而得以解决，其用于预防和/或治疗马科动物的一或多种传染性疾病和/或防止马科动物的一或多种传染性疾病传播和/或防止马科动物的一或多种传染性疾病通过载体传播的方法，其中所述通过载体优选是通过食血苍蝇、蠓(midge)、壁虱(tick)和/或蚊，更优选红球菌肺炎、腺疫、非洲马疫、西尼罗河病毒感染、皮癣菌病和/或消化道和/或其他器官的寄生虫和/或隐孢子虫病、蠕虫和/或其潜隐期。预防和/或治疗有此需要的马科动物的相应方法以及制备用于预防和/或治疗马科动物的医药组合物/药物的用途也会属于本发明的范畴内。
[0028] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供编码如本文中所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的核酸而得以解决。
[0029] 在另一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含至少一种如本文中所公开并要求保护的核酸的载体而得以解决。
[0030] 在又一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供包含至少一种如本文中所公开并要求保护的核酸和/或至少一种如本文中所公开并要求保护的载体的原代细胞或细胞系而得以解决。
[0031] 出乎意料地，如本文中所公开并要求保护的根据本发明的iMAT分子确实具有使其优于相关现有技术MAT分子的物理化学和/或免疫学特性：
[0032] (i)抗原模块，优选整个iMAT分子中至少一个半胱氨酸残基，优选所有半胱氨酸经不同的氨基酸残基取代，其经计算机模拟方式选择为不损失最终iMAT分子的稳定性，使得根据本发明的iMAT分子出乎意料地适合应用用于生物医药的标准纯化程序及标准分析方法。
[0033] (ii)iMAT分子的模块(即第一移位模块、第二靶向模块及第三抗原模块)的优选直接共价连接，而无任何额外间隔模块介于此类模块之间，即，根本无其他间隔模块介于该第一、第二和/或第三模块的两个或更多个相邻模块之间，除了上述(i)外还造成根据本发明的iMAT分子的优异特性：这些被认为是三维结构更刚性且因此无法形成构象IgE表位的iMAT分子甚至更具低致敏性，如本文实施例2所显示，实质上没有检测到变态反应性。
[0034] (iii)(准)N-端His-标签的优选存在导致，根据本发明的iMAT分子可用作用于监测免疫性和/或免疫性持续时间的替代物标记，这是因为该标签模块任选连同一或多个来自移位模块的相邻氨基酸残基一起可用于诱导目标个体的对iMAT分子一般结构具特异性的特异性免疫上可检测信号(例如抗体)(参见本文实施例1)。另外，该标签模块的存在可用于分离包含根据本发明的iMAT分子的样品中的蛋白质，例如，使用载锌或载钴的固体支持物，且因此进一步增加制造本发明的iMAT分子而在纯化制程期间无聚积的可能性。
[0035] (iv)根据本发明的iMAT分子中的至少一个靶向模块优选具物种特异性，即，就此类iMAT分子对马科动物的预期应用而言，选择马科动物靶向模块，例如，马科动物不变链。通过该物种特异性靶向，可成功地达成本发明iMAT分子对II类MHC分子的最佳化结合特性。
[0036] (v)根据本发明的iMAT分子中的至少一个抗原模块优选为变应原。其可衍生自霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)，优选来自树、草、草本、豚草的花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属(aspergillus)、链格孢菌属(alternaria)、灰霉菌属(botrytis)、尾孢菌属(cercospora)、枝孢菌属(cladosporium)、弯孢菌属(curvularia)、内脐蠕孢菌属(drechslera)、散囊菌属(eurotium)、麦类胡麻叶枯病菌属(helminthosporium)、附球孢菌属(epicoccum)、白粉菌属(erysiphe)/粉孢菌属(oidium)、镰孢菌属(fusarium)、横梗霉属(lichtheimia)、黑孢菌属(nigrospora)、青霉菌属(penicillium)、黑团孢菌属(periconia)、霜霉菌属(peronospora)、浪梗霉菌属(polythrincium)、糖多孢菌属(saccharopolyspora)(此前也称作干草菌属(faenia)或小多孢菌属(micropolyspora))、高温放线菌属(thermoactinomyces)、匍柄霉菌属(stemphylium)、圆酵母属(torula)的真菌和/或其孢子和/或粉螨属(acarus)、糖螨属(glycophagus)、食酪螨属(tyrophagus)、尘螨属(dermatophagoides)的螨(和/或其粪便)。
本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块更优选为库蠓(culicoides)变应原。依照以下标准来选择变应原：在尚不知晓诱导个体变态反应的主要变应原时，可通过本文实施例6及7中示例性地且详细描述的生物信息方法来选择本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防马科动物变态反应的疫苗的经改良MAT分子。本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一或多种传染性疾病的病原体的抗原。其可衍生自红球菌属(rhodococcus)、马链球菌属(streptococcus)、环状病毒属(orbivirus)、黄病毒属(flavivirus)、毛癣菌属(trichophyton)、小孢癣菌属
(microsporum)、隐孢子虫属(cryptosporidium)和/或圆线虫属(strongylus)。本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一或多种传染性疾病传播的载体的抗原，例如，库蠓属、库蚊属和/或硬蜱属的唾液组分。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防马科动物传染性疾病和/或防止马科动物传染性疾病传播的疫苗的经改良MAT分子。
本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块更优选为库蠓(culicoides)变应原。依照以下标准来选择变应原：在尚不知晓诱导个体变态反应的主要变应原时，可通过本文实施例6及7中示例性地且详细描述的生物信息方法来选择本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防马科动物变态反应的疫苗的经改良MAT分子。本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一或多种传染性疾病的病原体的抗原。其可衍生自红球菌属(rhodococcus)、马链球菌属(streptococcus)、环状病毒属(orbivirus)、黄病毒属(flavivirus)、毛癣菌属(trichophyton)、小孢癣菌属
(microsporum)、隐孢子虫属(cryptosporidium)和/或圆线虫属(strongylus)。本发明iMAT分子中的至少一个抗原模块也可以是参与一或多种传染性疾病传播的载体的抗原，例如，库蠓属、库蚊属和/或硬蜱属的唾液组分。依此方式可获得特别适用作例如用于治疗和/或预防马科动物传染性疾病和/或防止马科动物传染性疾病传播的疫苗的经改良MAT分子。
[0037] 具体而言，本发明提供展现经改良溶解度的(经分离)重组蛋白质，其可轻易地应用于层析分离技术且显示经改良的稳定性。
[0038] 此外，根据本发明的(经分离)重组蛋白质优选呈递在诱导期望的免疫学效应方面的高活性及效力，也即有利地以物种特异性调节对象(优选马科动物)的抗变应原的免疫应答。例如，依此方式，使得治疗及减轻感染IBH的马科动物的症状变成可行。
[0039] 发明详述
[0041] 除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语具有如本发明所属技术领域的技术人员所通常了解的含义。除非另有指示或以其他方式为本领域技术人员已知，否则所有的给定范围及数值可改变1至5％，因此，术语“约”通常从描述及权利要求省去。虽然类似于或等效于那些如本文所述者的任何方法及材料可用于实施或测试本发明，但现将描述优选的方法、装置、及材料。本文中述及的所有公开的申请是出于如可结合本发明使用的公开申请中所报告般描述并揭示物质、赋形剂、载剂、及方法的目的而援引加入本文中。本文任何内容均不应被解释为承认本发明无权先于藉助在线发明的这些揭示内容。
[0042] 术语“经分离重组蛋白质”、“重组蛋白质”和/或“经改良MAT(iMAT)分子”可在本发明过程中互换使用。其均具有相同含义。
[0043] 在本发明过程中，术语“模块”指具体的氨基酸序列，例如多肽的一部分、单元或部分，通常是具有所定义功能的短氨基酸/肽序列。
[0044] 本文中术语“第一模块，其为使得(经分离)重组蛋白质，优选经改良MAT(iMAT)分子从细胞外空间移位进入细胞内部中的氨基酸序列”也可互换地称作“移位模块”或“移位序列”，在本发明过程中是指促使货物分子(cargo molecule)例如氨基酸序列、肽、多肽、蛋白质及其他类别物质如核酸或医药活性成分(API)转运至细胞，具体而言真核细胞，更具体而言如文献中已知的表面上表达II类MHC分子和/或表面上表达I类MHC分子的细胞内部中的具体氨基酸序列。
[0045] 移位模块的存在，可促使该货物分子进入至此类细胞中。
[0046] 适用作移位模块的氨基酸序列述于现有技术中。例如，US 7,653,866公开了若干有用的移位序列，其包含衍生自单纯疱疹病毒的HIV-tat分子或蛋白质VP22。促使指定标靶分子进入细胞内部中的该原理多数地述于相关专利申请及非专利申请文献中的不同研究中。此外，适宜的移位序列包括同源异型蛋白质(homeoprotein)序列、亮氨酸拉链序列、富含精氨酸和/或富含赖氨酸的序列、及(不管缺乏分泌信号序列)分泌的蛋白质或多肽的各种其他序列。特别有用的是病毒肽序列，例如蛋白质HIV转录活化蛋白(HIV tat)。已在现有技术中描述Tat序列或Tat肽(包括各种不同修改)。现有技术中所述的Tat的肽序列的所有变型一般适用作移位模块。其他实例包括VP22肽及衍生自果蝇同源蛋白触角足蛋白的触角足蛋白肽。此外，可使用其他同源异型蛋白质。适宜同源异型蛋白质的各种实例述于现有技术中。此外，可使用亮氨酸拉链蛋白质，例如人cFos-(139-164)、或人cJun-(252-279)。除此之外，富含精氨酸和/或富含赖氨酸的肽适用作包含例如HIV-1rev(34-50)或衍生自病毒或酵母的其他肽之序列的移位模块。当然，富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可以合成方式制得。此类富含聚精氨酸和/或富含聚赖氨酸的肽可包含其他氨基酸。适宜的实例述于相关现有技术中。在优选实施方案中，该至少一个移位模块包括(优选由)不是由如上所说明的完全蛋白质序列组成而是由仍旧具功能性(即，可有效地促进细胞进入)的最小序列组成的氨基酸序列(组成)。适宜的最小序列为(例如)根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
[0047] 在另一优选实施方案中，该至少一个移位模块包括(优选由)HIV-tat、VP22和/或触角足蛋白或其部分序列(组成)，限制条件为该至少一个移位模块作用为用于从细胞外空间移位进入细胞内部中的模块。
[0048] 本文中术语“第二模块，其为使得(经分离)重组蛋白质，优选经改良MAT(iMAT)分子在细胞内物种特异性靶向参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原，优选经处理之抗原的细胞器的氨基酸序列”也可互换地称作“靶向模块”或“靶向序列”，在本发明过程中，是指容许/促进将本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质细胞内转运至此类参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原的细胞器的具体氨基酸序列。
[0049] 具体而言，此类细胞器包括内质网、高尔基体、反面高尔基体管网状结构、溶酶体、内涵体及MHC II隔室。这些细胞内细胞器参与诸如(例如)转运和/或处理抗原、制造和/或使MHC II分子加载抗原或经加工的抗原、和/或转运加载此类抗原的MHC II分子至细胞表面的过程。
[0050] 相关技术中已知多种序列。有用的靶向序列的突出实例包括II类MHC分子的不变链，也称作Ii不变链或MHC IIγ链。不变链的各种变体述于专利申请及非专利申请文献中。
[0051] 在本发明的优选实施方案中，不变链选自应当调节免疫应答的物种和/或选自应当细胞内靶向iMAT分子的物种。
[0052] 例如，就马科动物如马而言，所选的优选不变链为马科动物不变链，包括(优选由)SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段(组成)，限制条件为此类片段维持其细胞内转运功能。优选的此类片段为根据SEQ ID NO：15和/或16的氨基酸序列。
[0053] 靶向序列的其他适宜实例包括溶酶体膜蛋白，其包含适用作靶向模块的序列。即，许多膜蛋白产生于溶酶体中，其具有容许靶向溶酶体的序列基序。蛋白质的此类组别尤其包括lamp 1、lamp 2、lamp 3、limp II及lap。此外，四跨膜蛋白在现有技术中已知为靶向模块。其他蛋白质可在显示靶向性质的内涵体/溶酶体隔室中发现。本领域技术人员明了如何据此确定适宜的靶向序列。
[0054] 在另一优选实施方案中，所述至少一个靶向模块包括(优选由)马科动物不变链(组成)及优选由SEQ ID NO：2、15、16的氨基酸序列中之一或多者组成。
[0055] 本文中术语“第三模块作为抗原模块，其为衍生自至少一种抗原，优选至少一种变应原的至少一个完全或部分表位，从而确定由该(经分离)重组蛋白质，优选经改良MAT(iMAT)分子调节(对象优选马科动物)的免疫应答的特异性的氨基酸序列”也可互换地称作“抗原模块”或“抗原序列”，在本发明的过程中是指容许调节对象，优选马科动物的抗表位/抗原的免疫应答及确定对象优选马科动物的免疫应答的特异性的具体氨基酸序列。
[0056] 在此背景下，此(类)抗原模块包括至少一个经不同的氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代的半胱氨酸残基。因此，所述免疫应答与暴露于抗原的未经改变的氨基酸序列的对象优选马科动物的免疫应答相比不同。
[0057] 在该方法基础上，不存在与抗原相关的限制。该方法可(例如)用于活化对象的针对病原体的免疫系统，如(例如)针对病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物等，即，最常见是用作疫苗。另外，该方法不仅可用于直接针对此类病原体，而且可用于活化宿主免疫系统以防止涉及病毒、细菌、真菌、寄生虫、原生动物等的载体传播疾病的传播。此外，该方法可用于活化抗退化细胞如(例如)肿瘤细胞等的免疫系统。然而，该方法另一方面也可用于对象抗如(例如)衍生自食物、霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、动物毛发、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)、昆虫毒素等的变应原的免疫系统的脱敏或用于免疫系统的靶向抑制，例如，假若存在自体免疫应答，如(例如)关节炎、风湿病、糖尿病、SLE(全身性红斑狼疮)等，及用于抑制移植排斥反应。未具体提及但与过强或过弱的免疫应答相关联的其他疾病可同样地经本文公开并要求保护的iMAT分子治疗。
[0058] 原则上，可调节免疫应答的所有类型的抗原都可以作为抗原模块用于本发明的目的。目前已经知晓的抗原及会在将来发现的抗原均适宜。在一些情况中，抗原也可是利用目前相关技术中已知的常规免疫接种方法不会导致免疫应答但在独享应用本发明所述的新颖方法时导致免疫应答的那些。另外，术语抗原涵盖包含抗原决定簇(也称作表位)的抗原片段。因此，抗原模块可为整体分子，例如蛋白质，或为分子包含至少一个抗原决定簇或表位的部分，也即其片段，例如肽。所述至少一个抗原决定簇或表位可引起针对抗原的免疫应答。表位可包含一个或多个氨基酸或肽或可引起免疫应答的其他结构(如糖结构、磷酸化氨基酸等)或其组合。抗原可为连续表位(即，不依赖于构象，例如呈(例如)天然及变性蛋白质存在)或不连续表位(即，依赖于构象，例如仅呈天然、折叠形式存在，但不以变性蛋白质存在)。不仅可使用蛋白质及肽，而且可使用糖结构、脂质(例如脂多糖)、脂磷壁酸及细菌膜的其他组分(CD1b与例如糖结构及脂质结合)、核酸(如(例如)包含CpG基元之DNA)、有机物质(如(例如)乳胶或用作用于本发明目的的抗原的医药活性物质)。抗原可衍生自所有可能的生命形式，如(例如)人、动物、植物、真菌、寄生虫、单细胞或多细胞微生物、病毒及其他生命形式。抗原可从生物材料分离，已制成重组抗原或已通过合成，例如通过肽合成制得。以合成方式制得的抗原可为自然生成或非自然生成而是通过化学合成获得的物质。非自然生成物质(但在一些情况中适用作抗原)的实例有：例如存在于药物中的以合成方式制得的物质、或具有非自然生成的氨基酸序列的合成肽、或模拟肽(peptidomimetic)等。自然生成或合成或重组抗原可通过分子生物学方法、酶方法、化学方法和/或其他方法修饰以赋予其更有利地用于特定应用的性质。此类有利的性质可以具体是：作为抗原的更高或更低活性、作为抗原的更宽广或更特异性的作用、在亲水性或疏水性溶剂中更优选的溶解度、抗原模块对细胞膜、对细胞器膜、对血脑障壁、对血液-CSF障壁等的更大渗透性、更长或更短体内或体外半衰期、更低或更高毒性、施用呈iMAT分子形式的抗原后体内或体外抗原更优选的可检测性等。另外，可出于本发明的目的而将多种抗原组合在一个抗原模块中。为此，相同抗原可呈多于一个复本存在于抗原模块中，或例如相同抗原的不同变体可在抗原模块中组合。抗原模块中抗原(例如抗原1)及其他抗原(例如抗原2)的组合也是可以的。如(例如)呈多于一个复本的抗原1及呈单一复本的抗原2的其他组合也可在抗原模块中组合等。另外，一或多个不同和/或一或多个相同抗原模块也可存在于一个iMAT分子中。原则上，衍生自一或多种不同抗原的抗原单一及多重存在的相同或改变复本所有可能的组合可出于本发明目的而进行组合。
[0059] 在一优选实施方案中，抗原模块包含衍生自至少一种抗原的至少一个完全或部分表位，其中该抗原为变应原。至少一个表位可引起针对变应原的免疫应答，由此该表位可包含一种或多于一种可引起免疫应答的结构，例如肽。表位可以是变应原的连续表位或不连续表位。表位优选为至少八个氨基酸长度，优选为至少十个氨基酸长度，更优选为至少13个氨基酸长度。抗原模块包含至少一个完全或部分表位，但也可包含两个或更多个可彼此相同或相异的完全或部分表位。另外，抗原模块可包含邻接该至少一个完全或部分表位的额外氨基酸序列。表位可以是自然生成的表位或可以是经修饰的表位，在其氨基酸序列中修饰和/或通过一或多次翻译后修饰来修饰。
[0060] 在一实施方案中，所述至少一个第三抗原模块包含衍生自参与一或多种传染性疾病的病原体的至少一种抗原的至少一个完全或部分表位。其可衍生自红球菌属、马链球菌属、环状病毒属、黄病毒属、毛癣菌属、小孢癣菌属、隐孢子虫属和/或圆线虫属。本发明iMAT分子中的所述至少一种抗原模块也可以是参与一或多种传染性疾病的传播的载体的抗原，例如，蠓、库蚊属和/或硬蜱属唾液组分。
[0061] 在另一优选实施方案中，所述至少一个第三抗原模块包含衍生自至少一种引起马科动物的一或多种变态反应的变应原的之至少一个完全或部分表位。这可以是至少一种衍生自霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其粪便)，优选来自树、草、草本、豚草之花粉和/或十字花科花粉和/或曲霉菌属、链格孢菌属、灰霉菌属、尾孢菌属、枝孢菌属、弯孢菌属、内脐蠕孢菌属、散囊菌属、麦类胡麻叶枯病菌属、附球孢菌属、白粉菌属/粉孢菌属、镰孢菌属、横梗霉属、黑孢菌属、青霉菌属、黑团孢菌属、霜霉菌属、浪梗霉菌属、糖多孢菌属(先前也称作干草菌属或小多孢菌属)、高温放线菌属、匍柄霉菌属、圆酵母属之真菌和/或其孢子和/或粉螨属、糖螨属、食酪螨属、尘螨属之螨(或其粪便)的变应原的至少一个完全或部分表位。
[0062] 在一优选实施方案中，即优选至少一种衍生自食血昆虫，更优选衍生自库蠓属的变应原的至少一个完全或部分表位。
[0063] 库蠓属变应原的实例显示于图1中，识别物种、变应原及uniprot寄存号(数据库发行为UniProt发行2013_09)。
[0064] 在另一优选实施方案中，事实至少一种抗原为Cul n4、Cul o1、Cul o2、Cul o3、Cul o4和/或Cul o7变应原。抗原模块的优选具体序列为根据SEQ ID NO：3、4、5、6、18、19的氨基酸序列。
[0065] 在本发明过程中的术语“通过……调节的免疫应答”或可互换的“免疫调节免疫应答”与“(经分离)重组蛋白质”和/或“iMAT分子”搭配时是指免疫原性和/或致耐受性免疫应答。
[0066] 在本发明之过程中，术语“变应原”是指一类呈天然形式产生出异常显著免疫应答，其中免疫系统消除所有感知威胁，否则将对对象无害的抗原。典型地，此类类型的反应导致称作变态反应的表型。现有技术中描述了各种类型的变应原，包括食物、药物、动物产品或天然或合成物质。优选地，当蛋白质呈天然形式引起至少五种独享，优选马科动物的特异性IgE反应时，蛋白质被认为是变应原。为避免疑义，“变应原”与“至少一个包含衍生自至少一种变应原的至少一个完全或部分表位的第三抗原模块”搭配时不再必需呈天然形式，此点亦优选，换言之，在本发明过程中术语“变应原”也具体是指作为如本文所描述并要求保护的iMAT分子之部分的非天然氨基酸序列，其不引起至少五种个体优选马科动物的特异性IgE反应。
[0067] 本文中术语“表位”也可以互换地称作“抗原决定簇”，在本发明过程中是指抗原可通过免疫系统(无论通过B-细胞或T-细胞)所识别的部分。表位借助其所结合的MHC分子呈递于抗原呈递细胞的表面上。
[0068] 本文中术语“对象”也可以互换地称作“个体”和/或“生物体”，在本发明过程中，优选是指马科动物。
[0069] 本文中术语“马科动物(equine)”也可以互换地称作“马(horse)”，在本发明过程中，包含马属(Equus)的任何成员。其包含(例如)任何马、小型马和/或驴，分类指示为：野马(Equus ferus)和/或家马(Equus caballus)、和/或子种马(Equus ferus caballus)。马可为(例如)家养马。
[0070] 术语“肽”及“蛋白质”在本发明过程中并列用作等效物。肽或蛋白质出于本发明目的意指至少两个氨基酸经肽键的共价连接。术语“氨基酸”及术语“氨基酸残基”在本申请中用作等效物，即，此两术语的含义相同。术语氨基酸/氨基酸残基及肽/蛋白质在本申请中呈最宽广可能定义形式进行使用。
[0071] 就此而言，术语“重组蛋白质”是指可通过遗传工程及在真核或原核系统中表达获得的多肽。此外，该术语包含通过人工(例如，固相)合成获得的多肽。
[0072] 如本文所用，术语“不同氨基酸残基”除非另有指示，否则是指除了半胱氨酸之外的已知氨基酸残基。例如，该氨基酸残基可以是自然生成的氨基酸残基，如丝氨酸或异亮氨酸。
[0073] 如本文所用，术语“线性形式”是指根据本发明的缺乏二级结构的蛋白质。此类蛋白质通常假设为展现随机卷取构象，其中唯一的固定关系是由肽键将相邻氨基酸残基接合。
[0074] 在优选的实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质系呈单体形式和/或线性形式存在。
[0075] 如本文所用，术语“治疗”是指施用本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质、和/或相应的疫苗和/或免疫原性组合物和/或医药组合物以获得所需的临床结果，包括预防和/或治疗性治疗。
[0076] 如本文所用，术语“免疫治疗”是指(例如)通过预防性和/或治疗性疫苗接种来治疗性和/或预防性治疗对象。
[0077] 如本文所用，术语“载体”与“一或多种传染性疾病的传播”搭配时是指活生物体，及在本文中可与术语“生物学载体”、“生物学携带者”和/或“疾病携带者”如食血苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊互换使用。
[0078] 另外，可能且优选地，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质另外包含至少一个标签模块。即，可能且优选地，一或多个不同和/或相同标签模块是本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的部分。标签模块通常是由至多20个氨基酸或由非氨基酸组成的官能团所组成的短肽，如(例如)生物素或毛地黄毒苷(digoxigenin)。适宜的标签模块包括熟知且优选的包含4至12个或更多个组氨酸序列，优选直接连续组氨酸残基，优选5、6或7个连续组氨酸残基的His-标签。其他适宜的标签模块包括HA-标签、FLAG-标签、GST-标签或Strep-标签。虽然标签可存在于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的任何位置，但是在优选的实施方案中，标签模块存在于(经分离)重组蛋白质的N-端和/或C-端。
[0079] 标签模块适用于分离出本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质，及此外可检测体外或体内此类(经分离)重组蛋白质的存在。另外，可使用任选连同来自相邻模块的一或多个相邻氨基酸残基或间隔开不同模块的接头一起的标签模块以引起目标对象中可用作免疫性和/或免疫性持续时间的替代标记的特异性免疫上可检测信号(例如抗体)。利用本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质进行免疫治疗，引发目标对象的抗原-特异性，优选变应原-特异性免疫应答，其在暴露于自然存在的抗原(优选变应原)后可与自然免疫应答定性区别。因此，结合至抗原模块的抗体不适用于作为iMAT诱导的免疫调节效应的效之替代标记。该障碍可通过确定通过C-端和/或N-端标签模块(任选连同相邻氨基酸残基一起)获得的独特抗原特异性免疫学信号来消除。因此，可相应地提供适宜的替代标记。
[0080] 在优选的实施方案中，本文所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质进一步包含至少一个标签模块，优选至少一个His-标签，其中该至少一个标签模块优选存在于(经分离)重组蛋白质的N-端和/或C-端，更优选是紧随一个甲硫氨酸残基后面的N-端。
[0081] 除此之外，本文所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的模块，即，至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块，可任选由一或多个位于至少两个此类模块之间的间隔模块所间隔开。
[0082] 此类间隔模块可具体而言是肽序列或有机分子。现有技术中已知许多可用于本发明目的的间隔分子。此外，也可以使用将会出于本发明目的而开发或发现的间隔分子。适宜的间隔模块可以具体而言是肽间隔物、交联剂、天然或合成聚合物(如(例如)核酸)、经取代或未经取代的烃等。
[0083] 偶合不但可通过共价连接(优选)而且可通过非共价连接来进行。间隔模块尤其具有这样的作用：其使本文所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的各个不同模块空间上彼此分离使得其对彼此在其功能性方面无不良影响。用于本发明目的的(经分离)重组蛋白质的模块可通过一或多个可经化学和/或酶促反应例如通过蛋白酶裂解的间隔模块来偶合。因此可视需要使本文所公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的经间隔模块连接的模块彼此分离。
[0084] 然而，在优选的实施方案中，具体而言，若抗原模块衍生自至少一种抗原(至少一种变应原)的至少一个完全或部分表位的氨基酸序列，则在所述第一、第二和/或第三模块的两个或更多个相邻模块之间根本不存在任何此类额外间隔模块，即，不存在额外间隔模块。
[0085] 本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的个别模块的任何期望配置一般是可行的。各模块可一或多次地存在于(经分离)重组蛋白质中。最低要求存在至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块。额外模块如标签模块、间隔模块等可任选存在但并非必需存在。所有模块可一或多次地存在于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质中。假若模块多于一次地存在，则其可呈相同复本形式存在，或模块的不同变型可在各情况中呈单一复本或呈多于一个复本形式存在。相同类别模块的完全不同的模块例如His-标签模块及生物素-标签模块也可以存在于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质中。这两个模块在(经分离)重组蛋白质中功能上发挥相同的作用(标签模块)，但并非必需在分子结构方面有任何共同之处。
[0086] 在优选的实施方案中，此类模块中之一的两个或更多个复本可存在于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质中。即，可存在相同或不同抗原模块的两个或更多个复本。或者，(经分离)重组蛋白质可包含两个不同抗原模块以调节对象的免疫应答。
[0087] 重组蛋白质中的抗原模块的两个或更多个相同复本可(例如)对所述相关抗原引起增强的免疫应答。两个或更多个不同抗原模块可(例如)经组合在一个(经分离)重组蛋白质中以同时地对两个或更多个不同抗原调节免疫应答。两个或更多个不同移位模块可用于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质中。例如，Tat序列及VP22序列可用来使得移位更有效，这是因为(经分离)重组蛋白质的移位接着可有效地在更广范围的不同细胞类型或组织类型中发生。也可以(例如)使用两个或更多个标签模块于(经分离)重组蛋白质中，例如，His-标签及FLAG-标签，在该情况中，例如His-标签可用于分离重组蛋白质及例如FLAG-标签用于检测(经分离)重组蛋白质。可使用两个或更多个不同靶向模块于(经分离)重组蛋白质中，例如，衍生自MHC II分子的不变链的序列，及使用甘露糖6磷酸基作为另一靶向模块。例如，不变链作为进入MIIC中的靶向模块，及甘露糖6磷酸基团介导靶向进入溶酶体中，因此，可增加抗原呈递的效率或总体上通过抗原呈递细胞呈递的抗原不同表位的数量。此外，本发明iMAT分子可包含两条或更多条不同的源于相同或不同物种的不变链，因此，容许将本发明的蛋白质用于不同物种中。
[0088] 本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质中个别模块的位置也可以视需要改变，只要存在至少一个移位模块、至少一个靶向模块及至少一个抗原模块即可。(经分离)重组蛋白质的所有或某些模块也可以(例如)不是以模块的线性连续配置形式存在，而是呈圆形或呈分支化模块结构象式或呈树枝状聚合物形式、或呈线性和/或分支化和/或圆形和/或树枝状聚合物分子部分的组合形式存在。存在表达载体的商业供应商，其可供应使得可通过这些机制产生圆形融合蛋白质的特定载体，如(例如)来自美国马萨诸塞州比佛利New England Biolabs的IMPACTTM-TWIN系统。分支化模块可例如通过从聚L-赖氨酸开始，将新赖氨酸残基附着至随后赖氨酸残基各者之两个游离胺基合成肽来制得。依此方式可建立具有实质上任何分支化程度之肽结构。接着可于随后合成(例如)移位模块和/或靶向模块至该分支化肽基本结构上。其他模块也可以通过蛋白质接合偶合至线性、圆形或分支化肽基本结构上。也可以在肽合成期间将(例如)生物素基团引入至肽基本结构中，及可接着经由(例如)链霉亲和素Strep标签系统或经由PinPointTM系统(分别来自德国哥廷根IBA GmbH及美国加州圣路易斯奥比斯波Promega Biosciences Inc.)将模块附着至此类生物素基团。依此方式附着的模块接着经由非共价连接偶合至肽的基本结构。
[0089] 在优选的实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质包含(优选由)根据SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、17、20、21、22、23之氨基酸序列中之一或多者(组成)。
[0090] 本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有昆虫叮咬过敏(IBH)和/或荨麻疹的马科动物的方法中。
[0091] 昆虫叮咬过敏可能是由引起对象全身反应的其他无害昆虫唾液、毒液、身体部分、外分泌物或内分泌物所诱导。实际上，IBH是一种痛苦的常见马科动物变态反应皮肤疾病并表现为通常因在世界各地发现的库蠓属昆虫叮咬而引起的慢性复发季节性变态反应皮肤炎。IBH在全世界以不同名称报道如甜痒、夏痒、夏疹、卡森(Kasen)、昆士兰痒(Queensland itch)、季节性皮肤炎或库蠓属变态反应性反应。被感染的个体极痒且非常痛苦，并强烈地擦摩及啃咬自身。典型临床症状为瘙痒症，飞虫叮咬起泡，所起泡可能渗液，从而引起结硬皮、疥疮及剥落。长时间的擦摩及啃咬尤其导致毛发损失及损伤皮肤，有时伴随溃疡性出血。偶尔可发生二次细菌感染。马擦摩掉其鬣毛及上尾毛也并不罕见。长远而言，可能发生皮肤增厚及毛发损失的色素沉着。鬣毛及尾最常受感染；然而，具有严重症状的马可在整个身体的大部分区域上具有病灶。诊断以临床检查及典型、季节性发生症状为基础。
[0092] 对马中IBH的病理生理学所知甚少。与其他物种相比，就皮肤的表现症状而变态反应似乎显著不同。因此，其对治疗的反应也不同，例如，组氨酸受体拮抗剂无法改善临床症状(Olsen等人，Vet.J.2011,187:347–351)。也已使用变应原特异性免疫治疗(SIT)，在过去于马的IBH方面并未取得成功(Ginel等人，Vet.Derm.2014,25:29–e10)。为解决该医疗问题，本文公开并要求保护的IBH专用(经分离)重组蛋白质中的至少一个抗原模块选自目前发现的自库蠓属(双翅目：蠓科)不同物种的蠓所分离的变应原的群租。另外，感染IBH的马具有增加7.1倍的也患有荨麻疹的风险[Kehrli D等人，J Vet Intern Med 2015,29(1):320-326]。荨麻疹(也称作“麻疹(hives)”/“风疹(nettle rash)”)的特征为出现在皮肤中的离散型肿胀。此类离散型肿胀可以是圆形斑块、环形病灶，模拟马蹄形或具有其他非寻常形状。大多数病例为荨麻疹的复发性、突然发作并在24至48小时或数天内自发地恢复。
[0093] 有良好的证据证明存在涉及荨麻疹相的IgE介导变态反应组分。然而，仍旧很少知晓病理生理学。在易感性对象，例如，患有IBH和/或另外对环境变应原易感皮肤过敏反应的马中，直接的诱因可以是昆虫之叮或咬、膳食、药物反应、草垫、化学品等。因此，成功的(例如)抗IBH的免疫治疗可减少此类对象中复发性荨麻疹的发生。
[0094] 在另一实施方案中，如本文所公开的并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别可用于具体解决治疗和/或预防患有复发性气管阻塞(RAO)的马科动物的方法中。
[0095] 马科动物中的复发性气管阻塞(RAO)(一种类似于人哮喘的呼吸系统疾病)为全球范围内感染中年及老年马肺中最常见确诊病症之一。其也称作气喘病、或慢性支气管炎/细支气管炎，或在早期时称作慢性阻塞性肺部疾病。当在例如马处于放牧饲养时的夏日存在时，使用术语与夏日放牧饲养相关联的阻塞性肺部疾病或与夏日放牧饲养相关联的RAO。RAO为1型速发型过敏反应性变态反应疾病，其包括一系列典型事件，以反应抗体(主要为IgE)开始，导致肥大细胞去颗粒而致产生出组织胺及可共同用来诱导气管发炎及可逆性气管阻塞的其他化学介质。恶化期间所观察到的临床症状可以是严重的并包括运动无耐力、咳嗽、流鼻涕及增加的休息时呼吸努力。诊断程序如肺功能测定、血液气体分析或支气管肺泡灌洗可提供额外关于疾病的信息。典型治疗仅涉及缓解性治疗(例如支气管扩张剂和/或肾上腺皮质类固醇)，但目前尚没有病因治疗可以采用(Leclere等人，Respirology 2011,
16:1027–1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46:276–288)。
16:1027–1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46:276–288)。
[0096] 目前已声明利用克瑞拉细胞(Clara Cell)10kDa蛋白质(CC10)的治疗可有效地保护或适用作患有RAO的马的被动式免疫治疗。CC10为主要产生于人及动物气管上皮中的抗炎症防御蛋白质家族成员之一。该发明述于US2014/0105906中。
[0097] RAO是一种复杂疾病，但显然地，暴露于空气变应原在病因方面起关键作用。通常通过免除暴露于空气变应原来达成临床缓解。然而，迄今为止尚未清楚地识别触发RAO相关的主要抗原。许多可能的作用剂存在于例如有机尘埃中，其主要以马厩或干草尘埃存在于关在马厩中的马中或存在于另外与花粉有关的牧马中(Leclere等人，Respirology 2011,16:1027–1046，Pirie,Equine Vet J 2014,46:276–288)。
[0098] 可依照如本文中实例6及7中示例性且详细地论述的生物信息方法来选择本发明iMAT分子的抗原模块。依此方式可使得iMAT分子特别适用作例如用于治疗和/或预防对象优选马科动物的RAO疫苗。
[0099] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别适用于具体解决治疗和/或预防患有由细菌引起的传染性疾病的马科动物的方法中。
[0100] 马红球菌(Rhodococcus equi)为引发肺及肺外化脓性肉芽肿性感染(马红球菌炎)的长在土壤中的致病原性放线菌。幼马特别容易患病并发展为威胁生命的肺部疾病。然而，偶尔观察到溃疡性小肠结肠炎、骨髓炎及败血性关节炎。已尝试过许多免疫接种方法来预防小马的红球菌炎，没有成功或仅有限成功。抗生素治疗非一致性地有效且昂贵，且新近的研究已揭示抗生素抗性菌株的出现。
[0101] 感染主要经由吸入带有病原体的空气尘埃。在进入至宿主中时，马红球菌在吸入后被肺中局部巨噬细胞(特别是齿槽巨噬细胞)吸收。其扩散并伴有肺功能缓慢渐进性地损失，使得早期临床诊断困难。早期临床症状通常仅由轻度发热、偶尔咳嗽、或呼吸速率轻微增加(该增加可能不明显，除非通过处理使小马运动或受压)组成。另外，诊断并非那么容易，目前，用于监测农场中地方性马红球菌肺炎的推荐工具是分析白血球浓度及培养来自经气管洗液的细菌并且通过PCR或细胞学检查从该材料识别出马红球菌(van Bargen,K及Haas,A.FEMS Microbiol Rev 2009,33:870–891，Vazquez-Boland,JA等人，Vet Microbiol 2013,167:9–33)。
[0102] 为解决该医学问题，本文公开并要求保护的红球菌炎专用(经分离)重组蛋白质中的至少一个抗原模块可选自衍生自马红球菌的抗原，例如，毒性相关联蛋白质A(VapA)、免疫显性表面表达的脂蛋白、或其他表面蛋白质，其也可以衍生自受马红球菌感染的噬菌体。经改良MAT分子可达成具体用作(例如)用于治疗和/或预防马红球菌炎的疫苗。治疗可能涉及施用iMAT分子给小马和/或也可以包括根据本发明来治疗怀孕母马。
[0103] 腺疫是马感染的另一实例。腺疫，其特征为头颈部淋巴结化脓，是由马链球菌(Streptococcus equi)引且为最频繁确诊的马传染性疾病之一并且仍急需开发新的预防性疫苗。
[0104] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别适用于具体解决治疗和/或预防患有由病毒引起的传染性疾病的马科动物的方法中。
[0105] 非洲马疫(AHS)为高度传染性且致命性疾病。其通常感染马、骡及驴。其是由属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)的环状病毒属(Orbivirus)病毒引起。AHS不是直接传染，然而，已知通过昆虫载体，主要通过库蠓、以及库蚊、按蚊(Anopheles)及斑蚊(Aedes)扩散，或已描述通过壁虱(例如璃眼蜱属(Hyalomma)或扇头蜱属(Rhipicephalus))传播。迄今，尚无针对AHS的有效治疗，就24小时的感染而言，受感染的马中有接近90％主要死于呼吸衰竭。因此，对该疾病的控制仰赖于预防性疫苗接种。
[0106] 西尼罗河病毒(WNV)属于黄病毒科中黄病毒属的日本脑炎病毒血清型群的经蚊传播的正链RNA病毒。WNV为疾病综合征的致病物，也称作西尼罗发热。鸟类为自然贮存宿主，且WNV在自然中维持蚊–鸟–蚊传播循环。然而，当马受感染时，其常常仍未被识别出。马因重度神经症状(包括轻瘫、失调、仰卧及肌肉颤动)而死亡或安乐死，其他马展现轻度至重度脑脊髓灰质炎。WNV感染的诊断及证实可直接地通过识别病毒或直接地通过测试临床样本中的抗体来进行。然而，其通常受到马病毒血症的短持续时间及低程度所妨碍。
[0107] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别适用于具体解决防止马科动物的传染性疾病经载体(例如食血苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊)传播的方法中。
[0108] 病原体连同包含多种生物活性分子的节肢动物唾液一起递送至哺乳动物宿主皮肤中。此类唾液组分可改变止血及免疫应答及可促成病原体建立感染的能力。食血节肢动物自身唾腺中传染性微生物的存在会改变唾液组成，如，受感染蚊中腺苷三磷酸双磷酸酶或抗凝血酶浓度的改变。此类或其他抗原极适合用于本发明iMAT分子的抗原模块中并可具体适用作用于活化宿主免疫系统以防止马科动物经载体传播传染性病原体的疫苗。
[0109] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别适用于具体解决治疗和/或预防患有由真菌引起的传染性疾病的马科动物的方法中。
[0110] 皮癣菌病或轮廯是发生在动物及人毛发及皮肤表面角质化细胞层的真菌感染。属于亲动物性或亲土壤性皮癣菌病群组的小孢癣菌属或毛癣菌属的若干物种可引起动物的临床感染。真菌和/或其孢子的多种表面抗原极适合用于本发明iMAT分子的抗原模块中，并可具体用作(例如)用于治疗和/或预防马科动物皮癣菌病的疫苗。
[0111] 在另一实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质特别适用于具体解决治疗和/或预防患有因寄生虫引起的传染性疾病的马科动物的方法中。
[0112] 感染寄生虫的普遍存在并在全球具临床重要意义。威胁马健康的主要寄生虫为小型圆线虫(cyathostomins)、马蛔虫(parascaris equorum)、叶状裸头绦虫(anoplocephala perfoliata)、及寻常圆线虫(strongylus vulgaris)。全球报告在马寄生虫中驱虫药耐药性程度渐增。就原生虫例如隐孢子虫属而言，很少药物可始终抑制宿主中寄生虫再现。主要是小马受感染且结果仰赖于先天及适应性免疫应答。
[0113] 衍生自成年寄生虫的抗原及潜隐期(prepatent stage)为要用于本发明iMAT分子的抗原模块的另一实例及可具体用作(例如)用于治疗和/或预防马科动物寄生虫感染的疫苗。
[0114] 具体而言，就调节马的免疫应答而言，至少一个靶向模块优选为马不变链，更优选为一或多个根据SEQ ID NO:2、15、16的氨基酸序列。
[0115] 在一有利实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质呈单体形式存在，这是因为(例如)重组引入的变应原倾向于形成聚积物，尤其假若经由包含体产生。通过取代(经分离)重组蛋白质的整体序列中的至少一个、优选全部半胱氨酸残基，优选通过取代为丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸，可防止形成分子间二硫键，因此，避免任何聚积，具体而言，避免任何非自然形成分子间-和/或分子内键。即，整体缺乏半胱氨酸残基的(经分离)重组蛋白质不会聚积。因此，蛋白质可轻易地表达并展现经改良的靶向及MHC呈递。
[0116] 另外，(例如)变应原的此类不含半胱氨酸的变体，其中野生型变应原氨基酸序列中的半胱氨酸残基已单独地或以组合方式突变，显示与相应的野生型变应原相比降低的IgE反应性且同时实质上保持对T-淋巴细胞反应性及因此具低变应原性。
[0117] 本发明因此关于诱导马中(例如)IBH的变应原的此类低变应原性变体，其中在此类变体中，野生型变应原的半胱氨酸残基已单独地或以组合方式突变。
[0118] 另外，用于分离包含本发明iMAT分子的样品中蛋白质的标签模块的存在，(例如)使用载锌或载钴固体支持物，进一步提高产生出融合蛋白质而不在纯化过程期间聚积的可能性。典型地，标签模块包括5至6个连续组氨酸残基的聚组氨酸标签。
[0119] 本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质可用于医药组合物中。例如，(经分离)重组蛋白质用于疫苗中。因此，本发明提供包含一或多种本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的疫苗组合物。该疫苗组合物可治疗上和/或预防上用于患有昆虫叮咬过敏(IBH)、荨麻疹和/或马复发性气管阻塞(RAO)、由病原体诱导的传染性疾病(例如红球菌肺炎、腺疫、非洲马疫、西尼罗河病毒感染、皮癣菌病)和/或消化道或其他器官的寄生虫(例如隐孢子虫病、蠕虫和/或其潜隐期)的马科动物中。另外，该方法可不仅针对抗此类病原体使用，而且可用于活化宿主免疫系统以防止经载体例如食血苍蝇、螨、壁虱和/或蚊传播。
[0120] 因此，在本发明优选实施方案中，提供用于对象如马科动物的疫苗以治疗和/或预防因对例如库蠓和/或其他食血昆虫的叮咬反应而引起的IBH。另外，成功地抗IBH的免疫治疗一般可降低对环境变应原的皮肤过敏反应及因此可降低此类易感性对象的复发性荨麻疹的发生。
[0121] 在本发明另外的实施方案中，提供用于对象如马科动物的疫苗以治疗和/或预防因对例如霉菌(真菌和/或其孢子)、花粉、室内尘埃或饲料螨(和/或其孢子)反应而引起的RAO。
[0122] 在本发明另外的实施方案中，提供用于对象如马科动物的疫苗以治疗和/或预防与例如红球菌属、马链球菌属、环状病毒属、黄病毒属、毛癣菌属、小孢癣菌属、隐孢子虫属和/或圆线虫属相关的传染性疾病。另外，可提供疫苗以活化宿主免疫系统来防止疾病经载体例如库蠓属、库蚊属和/或硬蜱属和/或其他食血昆虫传播。
[0123] (经分离)重组蛋白质例如呈疫苗形式的医药组合物优选经设计用于舌下施用、皮下和/或皮内注射、注射至淋巴结中和/或用于经粘膜，具体而言经胃肠道或呼吸系统的粘膜施用。
[0124] 在本发明的优选实施方案中，医药组合物以非经肠方式施用。
[0125] 本发明iMAT分子可用作医药或用作疫苗来调节(例如)过敏性疾病。例如，昆虫叮咬过敏(IBH)可通过此类iMAT分子来治疗。
[0126] 少量(1至1000μg是指仅一或多个抗原模块的重量)包含诱导IBH的昆虫例如库蠓属变应原的重组制得的iMAT分子，例如经皮下、经皮内或直接注射至淋巴结中1至5次，引发马科动物的强力且持久免疫应答，从而导致缓解临床症状。
[0127] 在优选的实施方案中，本发明iMAT分子以与至少一种佐剂组合的方式施用。该佐剂包括(但不限于)以下中之一或多者：明矾、BCG、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、脂质乳液、脂质或聚合纳米-或微球体、胶束、脂质体、皂苷、脂质A、或胞壁酰二肽、细菌产物、趋化激素、细胞激素及激素、甲壳素、淀粉、海藻盐、纤维素衍生物(例如，乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、核酸、或核酸构建物。可添加此类组分中之一或多者以增进或改良免疫应答。或者，iMAT分子可在不含佐剂下或呈水溶液形式施用。
[0128] iMAT分子可以约1μg至1000μg(该剂量及随后的剂量是指仅一或多个抗原模块的重量)的剂量及更优选以约10μg至约100μg的剂量及甚至更优选以约20μg至约50μg的剂量施用，然而，最佳剂量可根据注射的抗原(优选变应原)、对象体重、对象的免疫系统等改变。在许多情况中，有效的治疗可通过一次施用来实现。在一些实施方案中，治疗包括1至15次施用。在优选实施方案中，治疗包括1至5次施用及更优选包括1至3次施用。就初始治疗而言，施用可例如在数天中定期进行，每月或每年一次或两次、或每年数次。就维持免疫应答而言，施用可以数月至数年的时间间隔进行。
[0129] 在本发明的优选实施方案中，本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质是经设计用于淋巴结内施用。在直接注射至淋巴结中的过程中，各淋巴结可在注射程序期间例如通过超音波可视化，以监测针头位置及淋巴结改变(如肿胀)。注射至下颌、腋、腹股沟和/或腘肌淋巴结中优选，这归因于便于超音波导引定位及注射。
[0130] 现有技术中已知食血昆虫唾液中有若干(>20)种识别的蛋白质诱导马科动物的IgE反应性及病理皮肤反应[Schaffartzik,Veterinary Immunology and Immunopathology 2012,147:113-126；Allergome(www.allergome.org)]。因此，预期治疗可仅在大多数相关变应原包含于用于特异性免疫治疗的药物中的情况下成功。然而，出乎意料地，根据本发明的各包含(例如)昆虫唾液的不同抗原模块或仅表位的类镶嵌结构的此类iMAT分子中仅1个、2个、3个或4个足以引起患病对象的免疫调节和/或临床改善，假若此类iMAT分子经皮下、经皮内和/或直接注射至淋巴结中1至5次。
[0131] 在优选的实施方案中，单一iMAT分子经使用且足以诱导治疗效应和/或预防发展出马科动物的昆虫叮咬过敏(IBH)、荨麻疹和/或马科动物复发性气管阻塞(RAO)。
[0132] 在另一优选实施方案中，2个、3个或4个iMAT分子的组合通过同时、连续和/或时序交错地共同施用进行使用。
[0133] 在优选的实施方案中，单一iMAT分子经使用且足以诱导治疗效应和/或预防和/或防止马科动物的传染性疾病(例如红球菌肺炎、腺疫、非洲马疫、西尼罗河病毒感染、皮癣菌病和/或消化道或其他器官的寄生虫例如隐孢子虫病、蠕虫和/或其潜隐期)传播和/或此类传染性疾病通过例如食血苍蝇、蠓、壁虱和/或蚊传播。
[0134] 在另一优选实施方案中，2个、3个或4个iMAT分子的组合通过同时、连续和/或时序交错地共同施用进行使用。
[0135] 基于本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质的热动力评估，稳定性受到半胱氨酸突变(即，不同氨基酸残基的取代)影响。例如，该取代可以是Cys或Ser取代。然而，使用除Ser氨基酸外的不同氨基酸残基，稳定性可更高以达成期望的稳定性及溶解性。即，尽管第一选择可以是改由Ser取代Cys，然而，在不稳定的情况下，应改由除Ser外的其他氨基酸残基置换Cys。
[0136] 为选择稳定氨基酸残基作为标靶序列中半胱氨酸的替代，选用三步法：
[0137] 1.将包含末端六聚组氨酸标签、iMAT序列及受关注蛋白质的一级氨基酸序列的靶向蛋白质的三级结构模型化。模型化可利用天然序列且并与半胱氨酸取代来进行。
[0138] 2.基于单点取代，如改由不同氨基酸残基例如Ser和/或Ile取代半胱氨酸残基来反覆测定蛋白质稳定性，并评分以通过分析所有可取得的三维结构来确定稳定的替代。
[0139] 3.再模型化经稳定结构及通过重复步骤1及2验证稳定性。
[0140] 三维蛋白质结构对于在分子水平上明了蛋白质功能具关键性且对于许多不同类型的生物实验如定点诱变产生的合理设计受到极大关注。然而，经结构表征的蛋白质的数目与已知蛋白质序列的数目相比很小。对于给定蛋白质序列(标靶)，可识别具有已知结构的同源蛋白质(模板)。在此类情况中，已证实同源模型化选择性地自蛋白质一级氨基酸序列产生出其可靠3D模型的方法。建构同源模型，包括四个主要步骤：(1)识别结构模板，(2)将标靶序列及模板结构比对，(3)构建模型及(4)模型质量评估。可重复此类步骤直到达成令人满意的模型化结果。在无法确定准确同源模型的情况中，使用计算方法以自一级结构(氨基酸序列)确定蛋白质结构。“重新(De novo)”或“从头开始(ab initio)”方法基于物理原理及尝试模拟折叠过程。此类方法必须对大量构象取样及需要极准确能量函数以识别在总体自由能最小的结构。许多方法利用此类所述原理的组合。
[0141] 产生合理地准确估计氨基酸取代对蛋白质稳定性影响的计算工具的可利用性在广泛范围应用中具关键重要性。具体而言，此类工具具有刺激并支持专门用于产生出经修改蛋白质的蛋白质工程及设计工程的潜力。
[0142] 可在就可逆地快速去折叠及再折叠的蛋白质的热动力稳定性方面考虑蛋白质稳定性。在此类情况中，蛋白质稳定性是折叠及去折叠状态之间的吉布斯(Gibbs)自由能差。影响稳定性的唯一因素为折叠及去折叠状态的相对自由能。折叠自由能差越大且为越大的正值，则蛋白质的变性更稳定。折叠自由能差通常很小，对于球蛋白而言，在5至15kcal/mol级别。然而，另一方面，蛋白质稳定性可被认为是耐受苛刻温度或溶剂条件的蛋白质性质。
此与热动力稳定性相关而又与折叠/去折叠的可逆性或不可逆性(动力学稳定性)相关。
此与热动力稳定性相关而又与折叠/去折叠的可逆性或不可逆性(动力学稳定性)相关。
[0143] 为预测因蛋白质中单点取代所引起的热动力稳定性改变，可应用数种不同方法以研究此类取代对蛋白质结构及功能的影响[Pires DE等人，Bioinformatics 2014,30(3):335-342]。此类方法可大致被归类为那些寻求明了自仅蛋白质的氨基酸序列取代的效应者、以及那些利用大量结构信息者。基于结构的方法通常尝试基于取代或实际自由能值(ΔΔG)中来预测蛋白质稳定性改变。
[0144] 就特定取代出现的次数而言使用评分系统对各特异性蛋白质及其对应模型的结果作统计分析，该评分系统基于在使用的模型中的出现及蛋白质稳定性自由能改变(ΔΔG)而对取代评级，因而确定输入结构及可能取代中最不稳定的残基(若有的话)。通过测定各模型中受关注各位置处的最低ΔΔG(ΔΔG<0)及对各可能取代位置指派相应的线性值及累积ΔΔG值来计算分数且接着评估结果以确定模型之间的一致性。由于经过计算的蛋白质模型具有不同质量(预测正确三维结构的可能性)，故可实施加权因子以优先排序更准确模型的结果。明显(基于ΔΔG而言)不稳定的残基(若有的话)经取代；产生出新颖模型且反覆再分析直到达成稳态。通过主要组分分析法分析xyz坐标来评估额外产生出的模型以确定由于在特定位置取代氨基酸所致的可能结构错误折叠。
[0145] 在又一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供一种识别预定氨基酸序列中的氨基酸取代使得此类预定氨基酸序列稳定的方法得以解决，该方法包括以下步骤：
[0146] (i)将标靶预定氨基酸序列的三维/三级结构模型化，
[0147] (ii)基于单点取代，如改由不同氨基酸残基，优选丝氨酸和/或异亮氨酸残基取代半胱氨酸残基来反覆确定蛋白质稳定性，及基于蛋白质稳定性自由能改变(ΔΔG)的评分系统通过分析所有可取的三维/三级氨基酸序列结构来确定稳定的取代，
[0148] (iii)将经取代的三维/三级氨基酸序列结构再模型化及通过重复步骤(ii)及(iii)来计算得其稳定性直到达成稳态。
[0149] 在又一方面中，本发明基本目标已出乎意料地通过提供本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质得以解决，其中其完全或部分氨基酸序列系通过本文公开并要求保护的识别预定氨基酸序列中的氨基酸取代方法而稳定化(参见本文中实施例5)。
[0151] 图1：显示库蠓属变应原的实例，识别物种、变应原及uniprot寄存号(数据库发行为UniProt发行2013_09)。
[0152] 图2：显示MAT-Fel d1(IVN201)在还原条件下的SDS-PAGE；A)初始SDS-PAGE(10μg蛋白质/泳道，考马斯染色)及B)具有已从凝胶A中切除及重新加载于SDS-PAGE上的谱带的SDS-PAGE(银染色)。
[0153] 图3：显示Fel d1在还原条件下的SDS-PAGE； 4至12％Bis-Tris凝胶。泳道：1)标记物：SeeBlue Plus2预染色标准；2)5μg Fel d1；3)5μg Fel d1。
[0154] 图4：显示RP-HPLC层析图，0.1％TFA/乙腈梯度a)不含添加剂的天然蛋白质(MAT-Fel d1)(左图)；b)通过添加氯化胍加上DTT变性的MAT-Fel d1(右图)。
[0155] 图5：描绘MAT-Fel d1分子及其Kyte Doolittle疏水性图。
[0156] 图6：显示 SDS-PAGE-系统(4至12％Bis-Tris凝胶，1×MES-运行缓冲液，35分钟，200V)。泳道：1)溶菌酶，1μg蛋白质ox。2)PageRuler预染色蛋白梯；3)经碘乙酰胺氧化的MAT-Fel d1(5μg)(ox.)；4)iMAT-Cul o4(ox.)；5)PageRuler预染色蛋白梯；6)还原的MAT-Fel d1(5μg)；7)还原的iMAT-Cul o4；8)还原的溶菌酶。
[0157] 图7：显示RP-HPLC层析图，0.1％TFA/乙腈梯度。峰反映不含添加剂之天然(经氧化)蛋白质(iMAT-Cul o4)。
[0158] 图8：描绘了展现所选定库蠓变应原的局部比对对应计数与所测量的敏化进行比较的实例(详细内容请参见说明书)。该图描绘在一组IBH马群中就严重度(每一变应原的总评分值)方面的HRT测试中的抗原预测(浅灰色及右Y轴)与结果(深灰色及左Y轴)之间的比较。严重度以半定量标度(左Y轴)描述该测试中反应的程度。来自预测的数据是通过设定等于最高严重度评分的最高出现率评分来缩放。
[0159] 图9：显示随后实验的结果：在RT下培养30分钟同时轻轻地混合的蛋白质及在培养之后，将样品离心3分钟并在随后进行SDS-Page分析：泳道1)pageRuler预染色蛋白梯；2)iMAT-Cul o3上清液；3)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；4)iMAT-Cul o3上清液；5)在尿素中的iMAT-Cul o3细胞小球；6)空白；7)iMAT-Cul o2上清液；
8)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；(2、3、7、8、12、13w/o冻融)；(4、
5、9、10、14、15系在两次冻融制程之后)。
8)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；9)iMAT-Cul o2上清液；10)在尿素中的iMAT-Cul o2细胞小球；11)空白；12)iMAT-Cul o4上清液；13)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；14)iMAT-Cul o4上清液；15)在尿素中的iMAT-Cul o4细胞小球；(2、3、7、8、12、13w/o冻融)；(4、
5、9、10、14、15系在两次冻融制程之后)。
[0160] 图10：显示5种浓度的iMAT-Cul o2及iMAT-Cul o3及多重致变态反应化的马(马1)中的各个变应原的组织胺释放测试(分析的详细内容可参见实例2)。
[0161] 图11：显示各个融合蛋白质室温一般部分[即，不含各个抗原模块]中MAT分子相对iMAT分子室温Kyte-Doolittle疏水性图。疏水性指数相对在X轴上的氨基酸位置显示在Y轴上。指数的正数值指示疏水性。在疏水性图开始处iMAT分子的图相对MAT分子的图的位移归因于iMAT分子中N端额外存在His-标签及一个甲硫氨酸残基及不存在任何间隔模块所致。
[0162] 图12：该图显示正规数据库中的Cul o3(M4X062，SEQ ID NO:6)的每个具有13个氨基酸长度的肽的非随机对应数及其在相应前体蛋白质中的位置。y轴描绘对应数而x轴描绘参考前体蛋白质的氨基酸位置。垂直点线指示半胱氨酸残基，点虚线描绘非随机发现的同源性数的平均移动及水平实线对应于经计算机模拟裂解的肽。实施例
[0163] 下列实例用来进一步说明本发明，但其不应解释成限制本文所揭示之本发明的范畴。
[0164] 实施例1:免疫性/免疫性持续时间的替代标记
[0165] 将本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质施用给马科动物，而对存在于抗原模块中的变应原和/或表位产生出免疫学反应。另外，可使用C-或N-端标签模块连同来自相邻模块的相邻氨基酸残基一起以检测可用作用于免疫性或免疫性持续时间的替代标记的目标对象中独特的产物特异性免疫学信号(例如，抗体-或T-细胞反应)。作为治疗特异性免疫学参数，该替代标记可实现评估施用后的免疫性或免疫调节或免疫性持续时间或免疫调节持续时间。因此，用于由根据本发明的(经分离)重组蛋白质所触发的免疫应答的特异性指示为诱导末端-标签(任选与相邻氨基酸残基)特异性抗体，如IgG抗体。或者或另外，指示为诱导对间隔物及本文公开并要求保护的模块的接合或两个模块之间的接合特异性的抗体。
[0166] 实施例2:低变应原性
[0167] 准备患有IBH的马的新抽取的血液以测试对本文公开并要求保护的(经分离)重组蛋白质/iMAT分子的嗜碱细胞反应性。此可通过Kaul的改良方法[Kaul,S.,1998.Type I allergies in the horse:Basic development of a histamine release test(HRT).Doctoral thesis.Veterinary School Hannover，德国]来测定。简言之，iMAT分子和/或重组变应原的10倍系列稀释(例如，范围自10nM至0.001nM最终变应原浓度)在PIPES缓冲液(AppliChem，德国达姆斯塔特)(pH 7.4)中制得。在37℃利用个别稀释液培养自Na-EDTA凝结抑制的血液获得的经洗涤的红血球及白血球1小时。通过在冰上培养20分钟停止反应及在离心之后自各样品收集包含所释放组织胺的上清液。通过在水浴中煮沸血液细胞维持10分钟，获得最大组织胺含量(最大释放)。以经洗涤的血液细胞培养释放缓冲液作为阴性对照组(自发释放)。使用竞争性RIA(LDN Nordhorn，德国)按照制造商指示来测定组织胺浓度。
[0168] 或者，另一嗜碱细胞活化测试为细胞抗原刺激测试 ELISA，其也可以被视为是体外变态反应激发测试。根据制造商指示(Bühlmann Laboratories AG，瑞士阿勒斯海姆)来进行此试验。在 中，从变态反应对象血液沉淀出的白血球同时获得细胞激素IL-3并通过iMAT分子和/或重组变应原刺激。嗜碱细胞等产生出变态反应性介质、硫化白细胞三烯(sulfidoleukotriene)LTC4、及其代谢产物LTD4及LTE4。于随后以ELISA测试法(酶联免疫吸附分析法)测定此类新合成的硫化白细胞三烯(sLT)。
[0169] 可利用此类试验，通过仅比较iMAT分子(包含变应原)及仅各个重组变应原的效应来体外评估iMAT分子引起不良事件例如作为施用副作用的激发变态反应性反应的可能性。
[0170] 与重组变应原相比，通过iMAT分子降低的嗜碱细胞去颗粒(例如，组织胺和/或硫化白细胞三烯释放)，显示不良效应的较低可能性，即，iMAT分子的安全性特性更优选。
[0171] 该HRT(或 )可用作用于马的1型过敏反应的体外激发测试。变应原特异性组织胺释放指示各个变应原针对嗜碱细胞活化的相关性及因此可用作用于对象的变应原特异性敏化的定量参数。
[0172] 就现有技术中所述的MAT分子而言，在细胞抗原刺激测试(CAST)分析及真皮内及皮内测试中证实与相应的天然变应原(Fel d1)相比的低变应原性[Senti G等人，J Allergy Clin Immunol.2012,129(5):1290-1296]。变应原及包含Fel d1的MAT分子之间的敏感性定量差异分别为100、23及16倍。尽管MAT-Fel d1清楚地为低变应原性，但保留部分变态反应性。
[0173] 关于本发明，测试2种根据本发明制得的在抗原模块中分别包含Cul o2及Cul o3之iMAT分子的安全性。在如上所述的组织胺释放测试(HRT)中使用患有IBH的多重敏化马的新抽取的血液。
[0174] 如图10中所显示，天然变应原诱导强力的组织胺释放，然而，出乎意料地，这两种不同iMAT分子(iMAT-Cul o3及iMAT-Cul o2)显示实质上根本没有反应。因此，iMAT分子与如现有技术中所述的MAT分子(参见上述)相比显示在就安全性方面的明显优势。
[0175] 可预期假若患有IBH的马通过此类iMAT分子处理，则不发生与变应原相关的不良反应。
[0176] 与MAT分子不同，iMAT分子这种出乎意料的安全性特性的结果是，用作脱敏蛋白质的iMAT分子可类似于抗病原体疫苗使用。不需要扩大典型治疗性变应原的剂量，这是因为包含iMAT分子的疫苗不显示在就变态反应不良事件方面的变应原性质。治疗过程中iMAT分子的首次注射剂量可已经仅基于疗效考量来选择而不须要考虑可能的变态反应不良反应。这不可使用现有技术中所述的MAT分子来进行，这是因为与天然变应原相比MAT得过敏性仅降低至特定水平。然而，MAT分子仍旧是变应原；相反地，iMAT分子不是。此类改良的性质的优点是可通过例如以高生物医药含量三次皮下或经淋巴注射(例如，3次，20μg至50μg iMAT蛋白质)实现更有效的治疗疗程。
[0177] 所测试的这两种iMAT分子的致敏性的缺乏可由与现有技术中所述的MAT分子不同不使用接头氨基酸残基[即，介于第一、第二和/或第三模块之间的间隔模块]以分离此类iMAT分子中的不同模块的事实来解释。现有技术中已知包含两种或更多种经肽或蛋白质接头接合的功能性多肽的改造融合蛋白质对于蛋白质的功能(例如，通过免疫系统识别表位)具重要作用[Klein JS等人，Protein Eng Des Sel.2014,27(10):325-330]。功能性单元之间的分离距离可影响表位进入及以抗体亲抗原性结合能力。假若模块之间，具体而言靶向结构与与抗原模块之间缺失氨基酸残基接头，则获得更刚性的结构，可能因不正确折叠而无法形成变应原模块的构象表位。必需使嗜碱细胞(例如IgE)表面上以其高亲和力受体结合的抗体交联以引发活化及组织胺释放。然而，错误折叠的变应原可能无法引发该交联。因此，不含接头的iMAT分子可不形成构象IgE表位，这使得iMAT分子不具有致变态反应性。
[0178] 实施例3:变应原/生物标记的计算机模拟检测
[0179] 如本发明在IBH方面的叙述中详细地描述，尚未描述引发IBH的主要变应原，可使用针对靶向IBH的iMAT抗原模块的生物信息工程来电脑模拟评估某些变应原的相关性(参见本文中实施例6)。例如，如图8所显示，Cul o3的计算机模拟及体外功能性HRT测试结果似乎显示Cul o3为主要变应原。经测试的大多数马(然而并非全部)显示明显的抗Cul o3过敏反应。
[0180] 此点出乎意料，如在其他实验中，例如，通过van der Meide等人(Vet J 2014,200:31–37)，不同重组变应原在其针对疾病相关性中不可区分：患有IBH的马中有约80％至
90％显示对所测试各种变应原敏感。
90％显示对所测试各种变应原敏感。
[0181] 因此，出乎意料地，在本发明过程中，可证实Cul o3(i)事实上为IBH的主要变应原(即，>50％的动物敏化)及(ii)与其他变应原相比具优越相关性。
[0182] 除用于iMAT抗原模块中外，各个变应原也可以用于通过在开始治疗前研究抗该变应原的变态反应的强度使得治疗成就最佳化。且在整个治疗过程中，可监测免疫系统的不同组分的变应原特异性调节，例如，变应原特异性IgE及IgG抗体效价的改变可指示治疗和/或预防效应。
[0183] 因此，计算机模拟检测到的变应原和/或各个变应原特异性免疫球蛋白可用作诊断和/或治疗诊断生物标记。
[0184] 实施例4：马科目动物中IBH的治疗性疫苗/预防
[0185] 根据本发明包含不同抗原模块的单一iMAT分子或iMAT分子的组合可用于预防性或治疗性地治疗患有或意欲处在引起IBH的昆虫叮咬风险中的马。本发明iMAT分子可施用至马的下颚下淋巴结中(Landholt等人，Vet Rec 2010,167:302-304)。简言之，夹住位于淋巴结上的毛发并做好手术准备。使用触诊和/或超音波引导，将25G针头插入至淋巴结中。注射的iMAT分子被吸附至佐剂。佐剂是由(例如)磷酸铝组成( Brenntag Biosector，丹麦)。iMAT分子原液为小瓶中的375μg/mL蛋白质浓度的冷冻溶液，各小瓶装纳
500μL，意欲在使用前解冻。
500μL，意欲在使用前解冻。
[0186] 在解冻iMAT分子溶液后，取400μL溶液与例如200μL磷酸铝凝胶悬浮液混合。让该最终调配物在室温下静置60分钟再经淋巴内注射以容许iMAT分子吸附至 例如，将200μL的包含50μg iMAT分子的混合物移至500μL针筒中以用于淋巴结注射。通常在第
0天、第28天及第56天以每次注射介于20μg与50μg(是指仅一或多个抗原模块之重量)之间的剂量及iMAT分子首次施用该制剂。
0天、第28天及第56天以每次注射介于20μg与50μg(是指仅一或多个抗原模块之重量)之间的剂量及iMAT分子首次施用该制剂。
[0187] 在整个治疗期中和/或于此后，可临床上通过定量、半定量或定性评估皮肤病灶(例如，断发、掉发、结壳/磨砂及湿区域)来研究治疗或预防IBH的疗效。可对磨砂/痒的强度评分。
[0188] 可将此类临床参数与先前IBH季节中各个马的临床症状和/或在开始治疗干预前的严重度进行比较。或者，与未经治疗或经安慰剂治疗的感染IBH的马的比较证实iMAT分子介导的治疗和/或预防IBH的临床症状的疗效。
[0189] 例如，利用HRT或 (关于细节请参见上述实施例3)，此类马的新鲜血液可用于马的1型变态反应性反应的体外激发测试。与iMAT分子施用前相比在iMAT分子施用后回应于某些库蠓变应原的挑战，嗜碱细胞去颗粒降低，例如组织胺和/或硫化白细胞三烯释放指示治疗和/或预防效应。
[0190] 或者或另外，利用某些库蠓变应原的真皮内激发测试[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2):126-37]可用于此类马中。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)指示iMAT分子施用的治疗和/或预防效应。
[0191] 另外，可监测免疫系统不同组分的调节，例如，变应原特异性IgE及IgG抗体效价的改变可指示治疗和/或预防效应。
[0192] 利用此类iMAT分子治疗马的IBH时，除了IgE含量改变外，可出乎意料地发现变应原特异性IgG的增加。此类抗体可阻断体内IgE介导的变态反应性反应及似乎不仅抑制变应原引发的发炎介质自嗜碱细胞及肥大细胞释放，而且抑制IgE介导的变应原对T细胞呈递。在iMAT引起的特异性结合至变应原的IgG抗体中，已表明一些变应原特异性亚型发挥重要“保护”作用，这是因为其与变应原特异性IgE抗体竞争及可通过抑制IgE介导的抗原呈递来防止活化CD4+T细胞。另外，所分泌的IgG子集促使肥大细胞及嗜酸细胞显著减少，伴随着发炎介质减少释放[Senna G等人，Curr Opin Allergy Clin Immunol.2011,11(4):375-
380]。
380]。
[0193] 如通过抑制FcεRI依赖性嗜碱细胞组织胺释放测定的血清“阻断”IgG活性[Niederberger V等人，Proc Natl Acad Sci U S A 2004,101:14677–14682]和/或抑制FcεRII(CD23)依赖性IgE-变应原复合物与B细胞结合的功能分析似乎可更好地预测个别临床反应(Wacholz PA等人，J Allergy Clin Immunol 2003；112:915–922)。
[0194] 变应原特异性免疫治疗可调节免疫系统的不同组分。细胞修饰由降低变应原引起的T-细胞增殖所组成，指示诱导变应原特异性T细胞中的外周耐受性及抗原特异性Th2主导的免疫应答的降低，随着IFN-γ生成增加有利于Th1反应(Durham SR等人，J Allergy Clin Immunol 1996,97:1356–1365)。负责配位此免疫学切换的重要细胞类型为异质T-细胞群体，称作调节T细胞(Treg)。在细胞层级上，成功的变应原免疫治疗的关键因素是1型Treg细胞的外周诱导。对在识别抗原上具特异性的1型Treg细胞的功能性研究显示，通过1型Treg细胞来调节Th1及Th2反应主要取决于具有免疫抑制特性的细胞激素IL-10的分泌。事实上，IL-10抑制外周T细胞抗特异性变应原的增殖反应且在诱导T细胞无反应性中具有重要作用(James LK、Durham SR,Clin Exp Allergy 2008,38:1074–1088)。体外IL-10增进调节因子FoxP3的表达，调节嗜伊红血球功能及减少由肥大细胞释放之前发炎性介质(Mobs C等人，Int Arch Allergy Immunol 2008,147:171–178)。
[0195] 经此类iMAT分子介导的免疫治疗的杰出临床疗效的另一可能标记是检测变应原特异性T细胞的数量或性质的改变。基于(例如)Bet v1四聚物染色研究的基础上，循环桦树花粉特异性CD4+T细胞的含量及特性可潜在性地在SIT之前及之后进行比较(van Overtvelt L等人，J Immunol 2008,180:4514-4522)。最近，转变生长因子(TGF)-β也已识别为成功SIT中的重要细胞激素。诸多作用可说明其相关性，如，特异性Th1、Th2及Th17细胞的抑制、FoxP3的诱导及Tregs的功能抑制。此外，TGF-β下调兰格罕(Langherhans)细胞上的FcεRI表达并抑制IgE合成(Akdis CA,Akdis MJ,Allergy Clin Immunol 2009,123:735–
746)。
746)。
[0196] 实施例5：本发明iMAT分子与根据WO 2004/035793(US等同申请US 2005/0281816)的现有技术MAT分子之间的比较
[0197] 就评估MAT蛋白质的纯度而言，已建立十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测试程序(Thompson J等人，J Biol Chem 2002,277:34310-34331)。该方法包括利用还原剂十二烷基硫酸锂(LDS)制备样品及在75℃下加热，在电泳分离后产生可再现多条明显谱带。在负载有200至1000ng蛋白质的凝胶中利用考马斯蓝(Coomassie blue)染色可提供线性定量(密度测定法)特征。使用单株抗体，在具有Fel d 1作为变应原模块的MAT分子(MAT-Fel d1)中检测变应原模块，已显示主要谱带及13条次要谱带均包含MAT-Fel d1蛋白质。小型谱带也在重新装载于凝胶上之后迁移到如在初始凝胶上得相同位置(图2)。在PAGE之前用于制备样品的数种不同方法，如不同温度及缓冲剂组合物方案产生出相同谱带图谱。
[0198] 在所有此类谱带中，在各谱带从凝胶中切出之后，通过胰蛋白酶消化及于随后通过质谱法(nanoLC/ESI-MS)分析，可证实存在全长(完全)MAT-Fel d1蛋白质及仅微量的宿主细胞蛋白质。从此类实验可得出结论SDS-PAGE中MAT-Fel d1的例如不同折叠变体的异常特征(凝胶迁移)。此意指所分析的制剂中的MAT-Fel d1不适合用作具体而言用于临床和/或商业生物医药制造的生物医药分子，这是因为其纯度不可用标准方法(例如SDS-PAGE)来测定，而仅可通过上文所阐述的改良程序测定。
[0199] 与该MAT-Fel d1分子的凝胶迁移现象不同，Fel d1本身不显示SDS PAGE中的该异常特征(图3，泳道2及3)。Fel d1在预期分子量(19.6kD)下呈现单一明显谱带。
[0200] 可在RP-HPLC分析中观察到另一异常特征。在该分析方法中未见到MAT-Fel d1的单峰(图4)，在蛋白质的天然构象中或在通过离液(chaotropic)及还原条件诱导的变性形式中均未看到。然而，就经GMP验证的生物医药制造而言，所销售医药制剂中生物分子的单一同种型是必需的。
[0201] SDS-PAGE及RP-HPLC分析中的此类观察结果可通过基于氨基酸序列的物理化学性质来解释。Kyte及Doolittle疏水性图分析[Kyte J、Doolittle RF,Journal of Molecular Biology 1982,157(1),105-132]显示相邻极端疏水性及亲水性结构域(图5)，此可造成此异常行为结果。
[0202] 具体而言，融合蛋白质的靶向结构与的疏水性区域类似于现有技术中已知可引起该异常特征的膜蛋白的跨膜片段[Rath A等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106(6):1760-1765]。
[0203] SDS-PAGE上与化学式分子量无关联的迁移(称作“凝胶迁移”)显示对于膜蛋白而言常见。此意指仅根据其分子量分离分子而与其天然2D-或3D结构无关的SDS-PAGE方法的先决条件不适用于此类情况。在上文引述的公开(PNAS文章)中，作者使用衍生自人囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)的跨膜片段3及4的野生型及突变体螺旋-环-螺旋(“发夹(hairpin)”)序列库(包括疾病-表型残基取代)，来研究螺旋状膜蛋白的异常凝胶迁移。其发现此类发夹以相对其实际化学式的分子量-10％至+30％的速率在SDS-PAGE上迁移及以范围自3.4至10g SDS/g蛋白质的比装载清洁剂。其另外证实突变体凝胶迁移与发夹SDS装载能力改变、及发夹螺旋度有强烈相关性，指明凝胶迁移行为源自于清洁剂结合的改变。在某些情况中，此通过SDS的差别性溶剂化作用可能由于蛋白质-清洁剂接触改为蛋白质-蛋白质接触替代所引起，此意味着清洁剂结合及折叠紧密地联结。
[0204] MAT及iMAT蛋白质的SDS PAGE(图6)及RP-HPLC分析(图4及7)分别显示迁移图谱或洗脱方面的实质差异。MAT-Fel d1的氧化形式没有显示SDS-PAGE凝胶上单一明显谱带(泳道3)，然显示若干离散的具有比MAT-Fel d1的实际分子量32.2kD更大及更小表观分子量的谱带。相反地，iMAT-Cul o4在氧化条件下展现单一明显谱带(M＝41.6kD)。此外，RP-HPLC层析图显示单一峰(图7)。
[0205] 在还原条件下，SDS-PAGE中的MAT-Fel d1显示大约在已知分子量处迁移的主要谱带，但此外图2中所述已知包含MAT-Fel d1的完全序列的某些次要谱带再次出现(图6，泳道6)。这是表征MAT-Fel d1异常特征的属性。另外，MAT-Fel d1在还原条件下的RP-HPLC层析图(图4，右图)显示MAT-Fel d1的至少3种不同同型物。相反地，iMAT分子显示明显指示SDS-PAGE(图6，泳道7)及RP-HPLC(图7)中的单一同型物的特征。
[0206] 此类还原条件导致MAT分子中的二硫键裂解，因此，MAT及iMAT分子在还原条件下的行为应相似，假若二硫键是唯一造成MAT异常特征的原因。然而，此并非是该种情况，这是因为在还原条件下仍旧存在MAT分子的异常凝胶迁移及在RP-HPLC中出现同型物。
[0207] 然而，呈蛋白质的天然(氧化)形式的iMAT分子不显示该凝胶迁移但在RP-HPLC层析图中展现峰值。另外，MAT及iMAT分子的Kyte-Doolittle图(Kyte,J.及Doolittle,R.1982.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.J.Mol.Biol.157:105-132)在涵盖His-标签、TAT及靶向域之序列的N-端处几近相同(图11)。因此，本领域技术人员将不欲依照现有技术改由其他氨基酸残基取代半胱氨酸残基以克服现有技术的缺点来建构MAT分子。
[0208] 所产生的三种iMAT分子已通过依照以下实施例6的“生物信息工程”程序进行建构及通过在大肠杆菌中的重组表达技术产生出。所有这三种iMAT分子在冻融两次后于缓冲液(20mM柠檬酸盐、1M精氨酸，pH 6.0)中稳定及可吸附至作为佐剂的(Brenntag，丹麦)，使得此类iMAT分子可用作疫苗。此类蛋白质可自 解吸附而
不在相同缓冲液系统中降解(图9)。
不在相同缓冲液系统中降解(图9)。
[0209] 实施例6：靶向马中IBH的iMAT分子的“生物信息工程”
[0210] 为例如有效地使用iMAT技术来治疗患有过敏性昆虫叮咬变态反应性反应(IBH)的马，进一步地强制以：
[0211] a)将库蠓蛋白质选作iMAT分子中的变应原模块，其是主要变应原病因此高普遍性地在受感染的马中引起变态反应性反应及因此也可以是用于耐受性诱导的标靶，及[0212] b)建构具有此类主要变应原的iMAT分子，其是热力学稳定且可有效地通过蛋白质工程制得且可另外利用标准方法分析以确保足够的质量(即，同一性、纯度及效力)。
[0213] 为满足此类要求，选择一种生物信息方法以选择欲包含于本发明iMAT分子中的变应原。选择的目标为(i)选择一或多种预期具IBH相关性的变应原(即，患有IBH的马中大多数对各个变应原敏感)，及(ii)选择具有最高概率的包含变应原特征的线性表位的变应原，也即，那些已公开的变应原的包含最大数目之短肽序列(7至13个氨基酸残基)的同系物。
[0214] 目前，已知来自库蠓属(沙诺氏库蠓(Culicoides sonorensis)、云斑库蠓(Culicoides nubeculosus)、不显库蠓(Culicoides obsoletus))的在唾液中发现的约230种蛋白质可潜在地引起对象例如马的变态反应。为选择用于医药制剂的适宜抗原，选择基于与已知非库蠓变应原的局部序列比对的同源性比较。通常，用于抗体识别的表位(主要是构象表位)的检测是通过功能性分析(例如肽微阵列)来达成或T-细胞表位(线性表位)的检测是通过计算与MHC分子的肽结合概率来达成。iMAT技术的治疗原理具体是以内涵体中酸依赖性蛋白酶的内吞及降解接着II类MHC结合及抗原呈递为基础。目前马中此类系统的特征并未全面地进行探讨，这是因为与人系统相比对马MHC基因的等位基因多样性的研究少得多且因此实验上无法轻易地取得。另外，仅在最近开始对呈I类变态反应的IBH及诱导症状的病因性变应原进行研究。直到2008年才描述特征为效应细胞(即，嗜碱细胞粒细胞)中变应原活性的第一蛋白质[Langner等人，Vet Immunol Immunopathol 2008,122(1-2):126-137。
[0215] 因此，选用不同的用于变应原选择的非实验但为生物信息的方法，该方法是基于相对已知非库蠓变态反应性蛋白对衍生自库蠓蛋白质的肽进行局部同源性研究，已知其中的大多数可使人产生变态反应。从可公开取得的数据库(例如UNIPROT)输出疑似具有致变态反应性质的蛋白质氨基酸序列，并通过分析所输出数据集中的序列同源性来确定富足性。消除高度同源序列对应物且所得的其余序列作为可能有效抗原的正规序列数据库用于随后分析。为确定具有推定高致变态反应可能性的库蠓蛋白质，将蛋白质计算机模拟裂解成具有6至15个氨基酸长度的肽，其中一个氨基酸移位。接着，在各库蠓蛋白质及对应肽与正规序列数据库之间进行局部逐对比对。于此之后，通过设定给定库蠓蛋白质相对一者的自比对评分及相应地对应肽的比对对应来进行所获得比对对应的缩放。接着，对各肽计数超出给定阈值的比对对应数量及以局部逐对比对方式与不具有已知致变态反应性质的随机产生的蛋白质序列数据库进行比较，并于随后缩放并计数。所得“非变态反应性蛋白质”计数是从变应原结果中其计数被减去及基于所有对应肽的对应数量来计算得各库蠓蛋白质的累积对应评分(图12)。具有最高计数的蛋白质选作候选iMAT抗原模块。
[0216] 就验证生物信息抗原选择方法而言，在13只患有临床确诊的IBH的马中测量抗5种库蠓变应原的致敏化发生。在半定量功能性体外实验中，以释放自血液样品分离的马嗜碱细胞的变应原特异性组织胺为基础，来测试所有选定抗原(组织胺释放测试＝HRT，实验的详细内容：参见实施例2)。以3种浓度测试重组变应原且各变应原的评分值范围在0(无敏化)至6(最高敏化)之间。将所有13只马的数据与生物信息计算结果比较(图8)。该分析显示致敏化(每一变应原群组的总体评分值)与预测评分之间的极佳总体相关性(r＝0.97)。从该相关性分析可得出的结论是，生物信息抗原选择方法适用于选择相关库蠓变应原用于iMAT分子中的抗原模块。因此，感染IBH的马可利用根据本发明的包含选定变应原的iMAT分子进行治疗以在大比例的患病对象子群中以高概率诱导抗此类变应原的耐受性。
[0217] 已基于生物信息分析选择3种变应原以意欲包含于三种不同iMAT分子(即，Cul o3、Cul o2及Cul o4)中。
[0218] 将每个选定的变应原作为抗原模块整合入单独iMAT分子中并于随后通过三维蛋白质结构的迭代建模并计算单氨基酸取代后自由能改变，从而将热动力稳定性优化。通过于一级氨基酸序列中取代不同氨基酸残基，可影响物理化学性质及稳定性。
[0219] 将本文所述分析(抗原研究及模型化)的结果转换成适用于马科动物的药理学制造及应用的iMAT氨基酸序列中以治疗(例如)IBH。
[0220] 实施例7：根据本发明的类镶嵌iMAT分子的构建
[0221] 如果多于一种变应原的组分包含于抗原模块中，则预期可进一步改良本发明iMAT分子。就此目的而言，可以不同方式应用上述生物信息选择方法(实施例6)的基本原理。代替基于在变应原数据库中发现的变应原肽的对应计数来选择完全变应原，仅使用数种此类变应原的最富足的肽来改造iMAT抗原分子。因此，该iMAT分子由源于数种变应原的肽的抗原模块组成。此容许加宽单一iMAT分子在就其靶向变态反应特性方面的范围并因此对药理学药物开发有益。
[0222] 为寻求具有该类镶嵌iMAT蛋白质资格的短肽序列，通过如上文所述的同源性比较(参见实施例6)来分析在唾液中发现的衍生自库蠓物种(沙诺氏库蠓、云斑库蠓、不显库蠓)的230种蛋白质。简言之，将经计算机模拟裂解的具有6至15个氨基酸残基的肽长度的库蠓蛋白质局部地与变应原相关蛋白质的正规序列数据库及非变态反应相关蛋白质的随机数据库进行比对。确定在正规数据库中发现的各肽的显著同源性差异数。随后，将各肽局部地与大小三倍于正规数据库的随机数据库比对以减少假阳性对应。各肽长度的残余同源性的顶部(例如，前10％)尤其适合作为用于构建带有类镶嵌或混合变应原的iMAT分子的基底。为构建类镶嵌iMAT分子，将蛋白质前体选择(例如，从对应于最高等级肽的之前体蛋白质清单)作为用于包埋最高等级肽的骨架蛋白质。自骨架蛋白质移除信号肽序列及可将具有额外相邻N-或C-端氨基酸的最高等级肽插入至骨架蛋白质的初始序列中或可替代骨架蛋白质的初始序列部分。使用相似比对或对应前体蛋白质中肽的参考位置来确定插入或取代的位置。作为下一步骤，新增His-标签、TAT及靶向域。最终，如上所述改由最稳定的残基取代半胱氨酸残基。
[0223] 在该方法的示例性实例中，将沙诺氏库蠓(UniProt数据库条目“Q66U13”)的唾液蛋白质用作骨架蛋白质。确定该蛋白质中最具致变态反应性的结构以保留序列的该部分。移除信号肽序列及于随后新增UniProt数据库条目“Q5QBI9”、“Q5QBK6”、“Q5QBL6”、“Q5QBJ4”及“Q5QBI2”的序列。之后，将类镶嵌变应原整合至iMAT一般分子结构中。最终，半胱氨酸残基改由其他氨基酸残基，优选丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和/或天冬氨酸取代，这不减损所构建iMAT分子(融合蛋白质)的稳定性。
[0224] SEQ ID NO:17描绘了根据本发明得示例性类镶嵌(混合)iMAT分子的整体序列[氨基酸残基1：N-端甲硫氨酸，氨基酸残基2至7：His-标签，氨基酸残基8至18：TAT序列，氨基酸残基19至128：靶向结构域，氨基酸残基129至333：混合变应原(不含信号肽及经插入/取代序列的骨架蛋白质Q66U13；经插入/取代之序列：氨基酸残基137至151：Q5QBI9；氨基酸残基155至166：Q66U13；氨基酸残基185至200：Q5QBK6；氨基酸残基215至229：Q5QBL6：氨基酸残基235至250；Q5QBL6；氨基酸残基265至278：Q5QBJ4；氨基酸残基318至333：Q5QBI2；经取代的半胱氨酸(丝氨酸)：46、146、158、173、222、225、246、273、283、329；经取代的半胱氨酸(亮氨酸)：295；经取代的半胱氨酸(异亮氨酸)：299；经取代的半胱氨酸(天冬氨酸)：181]。
[0225] 实施例8：马科动物中复发性气管阻塞(RAO)的治疗性疫苗/预防
[0226] 根据本发明的包含不同抗原模块的单一iMAT分子或iMAT分子的组合可用于预防性或治疗性地治疗患有或处在RAO和/或与夏日放牧饲养相关联RAO风险的马。在马中，可如实施例4中所述施用本发明iMAT分子。
[0227] 将使用具有已知RAO病史的成年马。在治疗之前，马经调理(例如)以使其在原地穿戴面罩站立而可实现全身气管检查，包括呼吸速度描记器测量、上气管内视镜及支气管肺泡灌洗(BAL)以分析例如BAL流体中嗜中性细胞百分比。进行全血计数及生物化学特性以排除相伴医学病状的存在。
[0228] 可研究以下参数以检查呼吸系统并测量以iMAT分子的治疗性和/或预防性治疗的疗效：肺功能变量例如呼吸速率、最大经肺压力、肺抗性、肺弹性的改变。另外，参数可并入至加权临床评分系统中，例如，也评估呼吸努力(breathing effort)/抬高腹部、流鼻涕和/或鼻翼搧动、咳嗽和/或肺功能异常、支气管和/或气管音的临床评分。
[0229] 因此，贯穿治疗期间和/或之后，可临床上通过定量、半定量或定性评估来研究治疗或预防RAO的疗效。
[0230] 可将此类临床参数与在先前季节个别马的临床症状和/或在开始治疗干预之前的严重度进行比较。或者，与未经治疗或经安慰剂治疗的感染RAO的马的比较可证实，iMAT分子介导的治疗和/或预防RAO临床症状的疗效。
[0231] 此类马的支气管肺泡灌洗(BAL)流体和/或新鲜血液可(例如)利用HRT或用于针对马的1型变态反应性反应的体外激发测试中(关于详细内容请参见实施例2和/或Hare等人的Can J Vet Res 1998；62:133-139)。与在iMAT分子治疗之前相比，在iMAT分子治疗之后，响应于某些变应原挑战的肺肥大细胞和/或嗜碱细胞去颗粒减少，例如组织胺和/或硫化白细胞三烯释放，指示治疗和/或预防效应。
[0232] 或者或另外，利用某些重组变应原，可在此类马中监测真皮内激发测试、皮肤刺伤测试或者BAL流体或血清中变应原特异性IgE和/或IgG测定(Tilley P等人，J Equine Vet Sci 2012,32:719-727)。降低的反应(速发和/或后期阶段反应性)和/或抗体效价的改变指示iMAT分子治疗的治疗和/或预防效应。
[0233] 参考文献
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[0274] SEQ ID NO:1涉及本发明的一个移位模块仍具功能性的适宜最短氨基酸序列，所述具功能性也即可有效地促进细胞进入；
[0275] SEQ ID NO:2涉及完全马不变链氨基酸序列；
[0276] SEQ ID NO:3涉及完全Cul n4变应原氨基酸序列；
[0277] SEQ ID NO:4涉及完全Cul o1变应原氨基酸序列；
[0278] SEQ ID NO:5涉及完全Cul o2变应原氨基酸序列；
[0279] SEQ ID NO:6涉及完全Cul o3变应原氨基酸序列；
[0280] SEQ ID NO:7涉及本发明的Cul n4 iMAT分子；
[0281] SEQ ID NO:8涉及本发明的Cul n4 iMAT分子；
[0282] SEQ ID NO:9涉及本发明的Cul o1 iMAT分子；
[0283] SEQ ID NO:10涉及本发明的Cul o1 iMAT分子；
[0284] SEQ ID NO:11涉及本发明的Cul o2 iMAT分子；
[0285] SEQ ID NO:12涉及本发明的Cul o2 iMAT分子；
[0286] SEQ ID NO:13涉及本发明的Cul o3 iMAT分子；
[0287] SEQ ID NO:14涉及本发明的Cul o3 iMAT分子；
[0288] SEQ ID NO:15涉及马不变链氨基酸序列具有维持细胞内转运功能的具体片段；
[0289] SEQ ID NO:16涉及马不变链氨基酸序列具有维持细胞内转运功能的具体片段；
[0290] SEQ ID NO:17涉及本发明的示例性类镶嵌iMAT分子的完整序列；
[0291] SEQ ID NO:18涉及完全Cul o4变应原氨基酸序列；
[0292] SEQ ID NO:19涉及完全Cul o7变应原氨基酸序列；
[0293] SEQ ID NO:20涉及本发明的Cul o4 iMAT分子；
[0294] SEQ ID NO:21涉及本发明的Cul o4 iMAT分子；
[0295] SEQ ID NO:22涉及本发明的Cul o7 iMAT分子；
[0296] SEQ ID NO:23涉及本发明的Cul o7 iMAT分子。
[0297] 本文所引述的所有现有技术参考及随附本申请的序列表彼此独立地以其全文引用之方式并入本文中。
[0298] 条目：
[0299] 1.经分离的重组蛋白质，其包含至少可自细胞外空间转运重组蛋白质进入细胞内部中的第一模块、至少可细胞内转运重组蛋白质至参与加工抗原或使MHC分子加载抗原的细胞器的第二模块、及至少确定对象中通过该重组蛋白质调节的免疫应答的特异性的抗原模块，其中此类模块彼此共价连接，任选在至少一个此类模块之间包含间隔模块，其中[0300] a.)该第一模块是使自细胞外空间移位进入细胞内部中的氨基酸序列，
[0301] b.)该第二模块事使得该重组蛋白质在细胞内物种特异性靶向参与加工抗原和/或使MHC分子加载抗原的细胞器的氨基酸序列，
[0302] c.)该抗原模块是衍生自抗原(变应原)的至少一个表位的氨基酸序列，
[0303] 其中至少在该抗原模块中，所述经分离重组蛋白质中的至少一个半胱氨酸残基经丝氨酸或不同氨基酸残基取代。
[0304] 2.根据条目1的经分离重组蛋白质，其中在所述抗原模块或在整个经分离重组蛋白质中，所有半胱氨酸残基经不同的氨基酸残基取代。
[0305] 3.根据条目1或2的经分离重组蛋白质，其中所述半胱氨酸残基是经丝氨酸残基取代。
[0306] 4.根据条目1或2的经分离重组蛋白质，其中所述第二模块为马科动物不变链，如SEQ ID.No：2、15、16的氨基酸序列，和/或该抗原模块包含衍生自引起马科动物过敏的变应原的表位。
[0307] 5.根据条目1或2的经分离重组蛋白质，其中所述抗原模块包含衍生自食血昆虫，具体而言衍生自库蠓亚属的变应原的至少一个表位。
[0308] 6.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其中所述变应原为Cul n 4、Cul o 1、Cul o 2或Cul o 3变应原中的至少一种。
[0309] 7.根据前述条目中任一条目的重组蛋白质，其进一步包含标签模块，例如His-标签，其中所述标签模块可存在于N-端和/或C-端。
[0310] 8.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其中所述第一模块为HIV-tat、VP22或触角足蛋白(Antennapedia)或其功能为用作移位模块的部分序列。
[0311] 9.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其以单体形式存在。
[0312] 10.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其以线性形式存在。
[0313] 11.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其包含Seq.ID-No：7至14的序列的任何之一或者由其所组成。
[0314] 12.根据前述条目中任一条目的经分离重组蛋白质，其用于医药组合物中。
[0315] 13.用于条目12用途的经分离重组蛋白质，其中所述医药组合物为疫苗。
[0316] 14.用于条目12至13中任一条目用途的经分离重组蛋白质，其设计用于舌下施用、皮下或皮内注射、注射至淋巴结中或用于经粘膜施用(具体而言经胃肠道或呼吸系统的粘膜施用)。
[0317] 15.编码根据条目1至11中任一条目的经分离重组蛋白质的核酸。
[0318] 16.包含至少一种根据条目15的核酸序列的载体。
[0319] 17.原代细胞或细胞系，其包含至少一种根据条目15所要求保护的载体或根据条目15的核酸。
[0320] 18.识别预先确定的氨基酸序列中使得所述预先确定的氨基酸序列稳定化的氨基酸取代的方法，该方法包括以下步骤：
[0321] i.将靶向蛋白的三级结构模型化；
[0322] ii.基于单点取代(如由不同氨基酸残基取代半胱氨酸)迭代(iterative)测定蛋白质稳定性，并评分以通过分析所有可用的三维结构来确定稳定化取代；
[0323] iii.将新结构再模型化并通过重复步骤i.)及ii.)验证稳定性。
[0324] 19.根据条目18的方法，其中在步骤ii.)中，评估折叠自由能的改变。
[0325] 20.根据条目18或19的方法，其中在步骤ii.)中，出现特异性取代的次数，使用基于在所使用模型中出现率及蛋白质稳定性自由能改变ΔΔG而对置换分级的评分系统。
[0326] 21.根据条目1至11中任一条目的重组蛋白质，其通过条目18至20中任一条目的方法获。
[0327] 22.根据条目1至14中任一条目的重组蛋白质，其用于预防和/或治疗马科动物的昆虫叮咬过敏反应。
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