在遗传载体上表面展示蛋白的方法
阅读：918发布：2020-07-22
专利汇可以提供在遗传载体上表面展示蛋白的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法，目的蛋白的改进方法，目的物质的分离、 生物 转化以及生产 抗体 的方法。更具体而言，本发明涉及在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法，其包含下列步骤：(a)用含有编码目的蛋白基因的载体转化内有选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(b)培养转化的宿主细胞和在宿主细胞中表达目的蛋白；和(c)让表达蛋白和遗传载体表面之间形成非共价键，从而目的蛋白展示在遗传载体表面上。，下面是在遗传载体上表面展示蛋白的方法专利的具体信息内容。
1.一种制备在遗传载体上表面展示的目的蛋白的方法，其包括 下列步骤：
(a)用含有编码目的蛋白基因的载体转化内含选自孢子和病毒的 遗传载体的宿主细胞；
(b)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白；和
(c)使表达蛋白和遗传载体表面之间形成非共价键，以便目的蛋 白展示在遗传载体表面上。
2.一种改进目的蛋白的方法，其包括下列步骤：
(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因文库；
(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；
(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细 胞；
(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；
(e)通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以 便使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体文库；和
(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载 体。
3.一种从混合物中分离目的物质的方法，其包括下列步骤：
(a)通过突变编码作为目的蛋白的结合蛋白或结合区的基因，构 建编码结合蛋白变体或其结合区的基因文库；
(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；
(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细 胞；
(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达结合蛋白或结合区 的变体；
(e)通过在表达的结合蛋白变体或结合区变体和遗传载体表面之 间形成非共价键以使变体展示在遗传载体表面上，从而获取遗传载体 文库；
(f)将遗传载体文库与预定的物质接触，并通过选择在其表面上 展示结合预定物质的变体来筛选改进的结合蛋白或其结合区；和
(g)将在其表面上展示改进的结合蛋白或其结合区的遗传载体与 混合物接触以从混合物中分离目的物质。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中目的蛋白选自激素、 激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、 单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调 节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物 防卫—诱导蛋白。
5.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白或其结合区为抗 体或其抗体结构域。
6.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白或其片段为抗体 或其抗体结构域。
7.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白或结合区选自蛋 白酶抑制剂、芥菜素、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核 酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋白酶抑制剂、卵 类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。
8.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白或结合区选自蛋 白酶抑制剂、芥菜素、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽溶菌酶、核糖核 酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋白酶抑制剂、卵 类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。
9.根据权利要求3所述的方法，其中结合蛋白为单体或多聚体。
10.根据权利要求4所述的方法，其中结合蛋白为单体或多聚体。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中目的蛋白是一 种修饰蛋白，其增强与遗传载体的非共价键。
12.根据权利要求11所述的方法，其中目的蛋白的修饰方法有： (i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白 或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的 非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机 诱变。
13.根据权利要求12所述的方法，其中缺失一部分目的蛋白的 氨基酸的操作是使离子型氨基酸从目的蛋白的N-端序列中缺失。
14.根据权利要求12所述的方法，其中融合寡肽是阳离子型肽。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中遗传载体具有 修饰的表面蛋白，以增强与目的蛋白的非共价键。
16.根据权利要求15所述的方法，其中遗传载体的修饰方法有： (i)将寡肽或多肽与遗传载体表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增强了目 的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(ii)使遗传载体表面蛋白进行定点 诱变；或(iii)将遗传载体表面蛋白进行随机诱变。
17.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中内含孢子的宿 主选自孢子形成革兰氏阴性菌、孢子形成革兰氏阳性菌、孢子形成放 线菌(Actionmycete)、孢子形成酵母和孢子形成真菌。
18.根据权利要求17所述的方法，其中孢子形成革兰氏阳性细 菌选自梭状芽孢杆菌(Clostridium)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和芽孢 杆菌(Bacillus)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中芽孢杆菌选自枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大 芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
20.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中病毒是噬菌体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中噬菌体位于宿主细胞的 周质，以及目的蛋白结合于噬菌体的表面。
22.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中宿主细胞为一 种突变细胞，其消除了胞内蛋白酶或胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶 参与降解表面展示的目的蛋白。
23.根据权利要求2所述的方法，其中筛选步骤的操作方式是将 孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化剂、干燥、表面活性剂 和蛋白酶中的一种或多种进行处理，然后对在其表面上展示目的蛋白 变体、具有处理抗性的孢子加以选择。
24.根据权利要求2所述的方法，其中遗传载体是孢子，以及筛 选步骤的操作方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化 剂、干燥和表面活性剂中的一种或多种首先进行处理，接着用蛋白酶 进行二次处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有蛋白酶抗 性的孢子加以选择。
25.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括对在其表面上展 示目的蛋白的遗传载体进行筛选的步骤。
26.根据权利要求2、3或25所述的方法，其中筛选步骤的操作 依靠：(i)展示在遗传载体表面上的目的蛋白的活性；(ii)能够识别标记 目的蛋白的物质的蛋白；(iii)能够结合目的蛋白的标记配体；或(iv)能 够与目的蛋白特异性结合的抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中筛选采用能够结合于目 的蛋白的标记配体或能够特异性结合于目的蛋白的抗体，由流式细胞 仪来实施。
28.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其还包括使遗传载 体表面和目的蛋白之间的键稳定的步骤，所述稳定步骤的操作途径是 使用物理、化学或生化方法在遗传载体表面和目的蛋白之间形成共价 键，接着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其中形成共价键的化学法是 戊二醛处理，物理法是紫外线处理，以及生化法是酶处理，以确保共 价键的形成。
30.一种用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的载体，其包括复 制起点、抗生素抗性基因、限制性位点、编码目的蛋白的基因，其中 当目的蛋白在宿主细胞中表达时，其能够与遗传载体表面形成非共价 键。
31.根据权利要求30所述的载体，其中编码目的蛋白的基因是 一种突变基因，以增强遗传载体表面和目的蛋白之间的非共价键。
32.根据权利要求31所述的载体，其中将编码目的蛋白的基因 突变成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目 的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体 之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进 行随机诱变。
33.一种微生物转化子，其特征在于转化子的生产方法是用根据 权利要求30-32中任一项所述的载体转化内含孢子或病毒的宿主细 胞。
34.根据权利要求33所述的转化子，其中宿主细胞是一种突变 细胞，以消除胞内蛋白酶或胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解 表面展示的目的蛋白。
35.一种遗传载体和目的蛋白之间的复合体，其特征在于复合体 的制备方法是根据权利要求1所述的方法在遗传载体表面上展示激 素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其 片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋 白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白 或植物防卫-诱导蛋白。
36.根据权利要求35所述的复合体，其中目的蛋白是一种修饰 蛋白，修饰方法有：(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多 肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋 白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv) 将目的蛋白进行随机诱变。
37.根据权利要求35所述的复合体，其中复合体具有其他共价 键以使遗传载体表面和目的蛋白之间的键稳定，其中共价键的形成是 采用物理、化学或生化方法，接着通过非共价键在遗传载体表面上展 示目的蛋白。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的复合体，其中遗传载体 为孢子。
39.根据权利要求38所述的复合体，其中孢子是非再生孢子， 其是通过选自遗传方法、化学方法和物理方法中的一种或多种获得 的。
40.根据权利要求39所述的复合体，其中使孢子成为非再生性 的遗传方法是通过缺失参与宿主细胞的孢子再生的基因来进行的。
41.根据权利要求38所述的复合体，其中孢子衍生自突变体， 以通过选自遗传方法、化学方法或物理方法中的一种或多种来增加其 凝集特性。
42.根据权利要求35所述的复合体，其中目的蛋白为单体或多 聚体。
43.根据权利要求35-37中任一项所述的复合体，其中遗传载体 是噬菌体。
44.一种在其表面上展示目的蛋白变体的遗传载体文库，其制备 方法包含下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白 的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库 转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主 细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；(e)通过在表达的蛋白变体 和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展示在遗传载体表面上， 从而获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目 的蛋白变体的遗传载体。
45.根据权利要求44所述的遗传载体文库，其中遗传载体为孢 子。
46.根据权利要求44所述的遗传载体文库，其中遗传载体为噬 菌体，以及目的蛋白变体为结合蛋白或结合区的变体。
47.一种利用具有转化反应活性的蛋白进行生物转化的方法，其 特征在于该方法采用根据权利要求35-37中任一项所述的遗传载体和 目的蛋白之间的复合体。
48.根据权利要求47所述的方法，其中具有转化反应活性的蛋 白为酶或抗体。
49.一种生产针对脊椎动物抗原的抗体的方法，其特征在于该方 法包括给脊椎动物施用一种组合物，所述组合物含有免疫有效量的根 据权利要求35-37中任一项所述的遗传载体和目的蛋白之间的复合 体，以及从所述脊椎动物中分离所述抗体。
50.一种蛋白微阵列，其包括固相基底和固定到所述基底上的物 质，其特征在于固定到基底上的物质选自根据权利要求35-37中任一 项所述的遗传载体和目的蛋白之间的复合体以及根据权利要求44-46 中任一项所述的遗传载体文库。
技术领域
本发明涉及表面展示蛋白的方法，具体涉及在孢子等的表面上展 示目的蛋白的、改进目的蛋白和分离目的物质的方法。
背景技术
生物体在其表面上展示所需的拟蛋白(proteinaceous)物质如肽和 多肽的表面展示技术有更广的应用领域，这取决于所展示蛋白或宿主 生物体的类型(Georgiou等，1993，1997；Fischetti等，1993；和Schreuder 等，1996)。这种常规表面展示技术已通过采用若干单细胞生物体如噬 菌体、细菌、酵母和哺乳动物细胞开发出来。
把待展示蛋白的基因含在宿主生物体中，由此利用所展示蛋白的 特征可选择性地筛选宿主，从而容易地从所选择的宿主中获得所需的 基因。所以，这种表面展示技术对蛋白的分子进化可确保有强大的工 具(参见WO 9849286；和美国专利号5,837,500)。
高通量筛选
例如，将在其表面上展示具有所需结合亲和性的抗体的噬菌体与 固定化抗原结合，然后洗脱，接着使洗脱的噬菌体增殖，由此获得编 码噬菌体靶抗体的基因(美国专利号5,837,500)。上述的生物摇摄方法 通过在大量的噬菌体表面上表面展示抗体文库，可提供筛选靶抗体的 工具，以及包含如下的连续步骤：(1)构建文库；(2)表面展示文库；(3) 与固定化抗原结合；(4)洗脱结合的噬菌体；最后(5)使选择的克隆增殖。
已发现噬菌体表面展示技术在从大量文库中获取所需的单克隆变 体方面是有用的(例如，106-109变体)，并因此应用到抗体的高通量筛 选的领域。抗体已用于各种领域如治疗、诊断、分析等，并且其需求 已日益增长。就此而论，对新物质具有结合亲和性或催化生化反应的 新型抗体一直存在着需要。生产单克隆抗体的杂交瘤技术已普遍使用 以满足需求。然而，常规方法的实施需要高的成本和长的时间，但抗 体的产量却很低。除此以外，为了筛选新型抗体，一般使用超过1010 个抗体文库，结果，杂交瘤技术已被认为在发现显示新的结合特性的 抗体方面是不够的。
许多研究已集中在较容易和更有效的新方法上，如上述的生物摇 摄方法，然后开发了以此方式进行的新技术，该方式是将文库展示在 细菌或酵母的表面上，然后展示靶蛋白的细胞用流式细胞仪以高通量 方式分类。根据此技术，将标记有荧光染料的抗原与表面—展示细胞 结合，以及具有所需的结合亲和性的抗体用每小时能分析超过108细 胞的流式细胞仪分离。通过揭示表面展示单克隆抗体可用流式细胞仪 以超过105的速率被浓缩，最终超过79％经证明是所需的细胞 (Daugherty等，1998)，Francisco等已证实微生物展示技术的有用性。 活疫苗
上述的表面展示技术可展示抗原或其片段，因此提供重组活疫苗 的递送系统。迄今为止，减毒的病原体或病毒已被主要用作疫苗。特 别地，已发现细菌在胞内或胞外或其细胞膜上表达抗原，由此给宿主 细胞递送抗原。表面展示的活疫苗诱导潜在的免疫反应，并在宿主细 胞的增殖过程中连续表达抗原；所以，它已成为突出的疫苗的新递送 系统。具体而言，展示在非病原性大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌 (Salmonella)的表面上的病原体衍生的抗原性表位以活体形式口服，然 后显示以更连续或强大的方式诱导免疫反应(Georgiou等，1997；和Lee 等，2000)。
全细胞生物转化
全细胞作为生物催化剂，在其表面上展示的酶能催化化学反应， 可避免酶的直接表达、分离和稳定的必要性。在细胞中表达酶用于生 物转化的情况下，迫使细胞回收及化学(例如甲苯)处理以确保对底物 的不通透性。此外，持续使用致使酶失活或者带来底物和产物转移上 的问题，由此降低整个过程的生产率。
利用展示在细胞表面上的酶可克服上述的缺陷(Jung等，1998a： 1998b)。采用在其表面上展示磷酸二酯酶的全细胞，具有更高毒性的 有机磷种类对硫磷和对氧磷可被降解，这是个典型的例子，表示展示 酶的细胞对环境纯化过程的应用性(Richins等，1997)。
抗肽抗体
Martineau等报道了利用大肠杆菌的表面展示技术生产抗肽抗体 的高度简便的方法(Martineau等，1991)。正如所述，把所需的肽展示 在MalE和外膜蛋白Lamb的突出区域，然后，全细胞或片段化的细 胞施用给动物以生成抗肽抗体。该方法使得生产抗体的同时避免肽的 化学合成及其与载体蛋白的键合成为可能。
全细胞吸附剂
为了使抗体或多肽固定于合适的载体上，这在吸附层析中是有用 的，必须进行随后的若干步骤，例如，发酵生长蛋白，纯化纯的蛋白 以及固定于载体上。一般而言，难以制备生物吸附剂。
作为吸附剂，已开发出了展示吸附蛋白的全细胞。最有名的全细 胞吸附剂是在其表面上自然展示蛋白A的金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，它与哺乳动物抗体的Fc区具有高的结合亲和 性。当前，已提出了去除和回收重金属的新方法，其采用大量展示在 微生物细胞表面上的金属硫蛋白或金属吸附蛋白(Sousa等， 1996，1998；和Samuelson等，2000)。与利用吸附金属微生物的常规 方法比较，该方法可更有效地从污染源中去除和回收重金属。
正是基于对上述事实的了解，为了在细胞表面上展示外源蛋白， 合适的表面蛋白和外源蛋白必须在基因水平是相互连接的以表达融合 蛋白，以及融合蛋白应稳定地越过细胞内膜以附着于细胞表面。优选 地，具有下列特征的表面蛋白推荐为表面展示基元：1)有能通过细胞 内膜的分泌信号，2)有能稳定附着于细胞表面上的靶信号，3)细胞表 面上的高表达水平，和4)不管蛋白大小都可稳定表达(Georgiou等， 1993)。
同时，根据上述现有的表面展示方法，为了把目的蛋白整合到表 面蛋白的N-端或C-端或中心区，表面展示的基元需要进行遗传修饰。 所有表面展示的蛋白以与表面展示基元融合的方式表达。所以，所得 表面展示的蛋白是修饰蛋白而非野生型蛋白。
迄今为止，所开发的表面展示系统如下：噬菌体表面展示系统 (Chiswell和McCarferty，1992)、细菌表面展示系统(Georgiou等，1993； Little等，1993；和Georgiou等，1997)、革兰氏阴性细菌表面展示系 统(Francisco等，1992；Fuchs等，1991；Klauser等，1990，1992；和 Hedegaard等，1989)、革兰氏阳性细菌表面展示系统(Samuelson等， 1995；Palva等，1994；和Sleytr和Sara，1997)和酵母表面展示系统 (Ferguson，1988；和Schreuder等，1996)。此外，还已开发出了与芽 孢外被蛋白融合的目的蛋白展示在孢子表面上。例如，美国专利号 5,766,914公开了利用枯草芽孢杆菌的芽孢外被蛋白中的cotC或cotD 与作为报道蛋白的lacZ的融合蛋白来生产和纯化酶的方法。美国专利 号5,837,500和5,800,821也表明cotC和cotD作为优选的表面展示基 元，但其实验演示未加以说明。
根据革兰氏阴性细菌的表面展示系统，外源多肽整合到表面结构 不仅导致位的限制使得不可能具有稳定的膜蛋白(Charbit等，J. Immunol，139：1644-1658(1987)；和Agterberg等，Gene，88：37-45(1990)) 而且导致细胞外膜的稳定性及其生存力的降低。大肠杆菌作为展示宿 主，其已被深入地进行了研究，通常利用细胞外膜蛋白作为表面展示 基元。然而，与外源蛋白融合的细胞外膜蛋白的过表达可能带来细胞 外膜结构的不稳定，结果使宿主细胞的生存力突然下降(Georgiou等， 1996)。
上述常规展示方法中存在的问题是由于目的蛋白和用于展示的表 面展示基元之间的融合蛋白的制备。如果融合蛋白以少量表达，则全 细胞生物转化的反应效率、蛋白阵列和抗体产量降低；但如果过表达， 很可能导致上述的缺陷。另外，利用融合蛋白的表面展示方法依赖于 表面展示基元整合到细胞、孢子或噬菌体表面中的程度，引起展示蛋 白量的限制。
如上所述，常规表面展示技术根本上取决于目的蛋白和表面展示 基元之间的融合蛋白的形成。因此，在常规表面展示系统中存在若干 缺陷：(1)必须得知表面展示基元的基因序列；(2)必须克隆表面展示基 元的基因；(3)表面展示基元很可能影响目的蛋白的三级结构；(4)当 仅有多聚体形式的目的蛋白具有活性以及融合蛋白是独立表面展示 时，致使目的蛋白失活；(5)由于利用融合蛋白的表面展示方法依赖于 表面展示基元整合到宿主细胞表面中的程度，限制所展示蛋白的量；(6) 当目的蛋白过量表面展示时，诱导宿主细胞的结构不稳定，从而降低 了宿主细胞对环境的抗性和生存力。
因此，为了开发新表面展示系统，该系统能够克服常规方法中的 缺陷，下列特征应得以实现：(1)能够构建系统而无需知道表面展示基 元的基因序列；(2)能够构建系统而无需克隆表面展示基元的基因；(3) 在目的蛋白形成其内在结构后，能够在宿主细胞表面上进行展示；(4) 通过非选择性键合，能够增加表面展示的蛋白的量；和/或(6)即使在 目的蛋白过量表面展示时，也不降低宿主细胞对环境的抗性和生存 力。
在整个申请中，参考了各种各样的专利和出版物，文献引用在括 号内。为了更充分说明本发明以及本发明涉及的技术领域状态，这些 专利和出版物以其全文在此引作参考。
把待展示蛋白的基因含在宿主生物体中，由此利用所展示蛋白的 特征可选择性地筛选宿主，从而容易地从所选择的宿主中获得所需的 基因。所以，这种表面展示技术对蛋白的分子进化可确保有强大的工 具(参见WO 9849286；和美国专利号5,837,500)。
高通量筛选
例如，将在其表面上展示具有所需结合亲和性的抗体的噬菌体与 固定化抗原结合，然后洗脱，接着使洗脱的噬菌体增殖，由此获得编 码噬菌体靶抗体的基因(美国专利号5,837,500)。上述的生物摇摄方法 通过在大量的噬菌体表面上表面展示抗体文库，可提供筛选靶抗体的 工具，以及包含如下的连续步骤：(1)构建文库；(2)表面展示文库；(3) 与固定化抗原结合；(4)洗脱结合的噬菌体；最后(5)使选择的克隆增殖。
已发现噬菌体表面展示技术在从大量文库中获取所需的单克隆变 体方面是有用的(例如，106-109变体)，并因此应用到抗体的高通量筛 选的领域。抗体已用于各种领域如治疗、诊断、分析等，并且其需求 已日益增长。就此而论，对新物质具有结合亲和性或催化生化反应的 新型抗体一直存在着需要。生产单克隆抗体的杂交瘤技术已普遍使用 以满足需求。然而，常规方法的实施需要高的成本和长的时间，但抗 体的产量却很低。除此以外，为了筛选新型抗体，一般使用超过1010 个抗体文库，结果，杂交瘤技术已被认为在发现显示新的结合特性的 抗体方面是不够的。
许多研究已集中在较容易和更有效的新方法上，如上述的生物摇 摄方法，然后开发了以此方式进行的新技术，该方式是将文库展示在 细菌或酵母的表面上，然后展示靶蛋白的细胞用流式细胞仪以高通量 方式分类。根据此技术，将标记有荧光染料的抗原与表面—展示细胞 结合，以及具有所需的结合亲和性的抗体用每小时能分析超过108细 胞的流式细胞仪分离。通过揭示表面展示单克隆抗体可用流式细胞仪 以超过105的速率被浓缩，最终超过79％经证明是所需的细胞 (Daugherty等，1998)，Francisco等已证实微生物展示技术的有用性。 活疫苗
上述的表面展示技术可展示抗原或其片段，因此提供重组活疫苗 的递送系统。迄今为止，减毒的病原体或病毒已被主要用作疫苗。特 别地，已发现细菌在胞内或胞外或其细胞膜上表达抗原，由此给宿主 细胞递送抗原。表面展示的活疫苗诱导潜在的免疫反应，并在宿主细 胞的增殖过程中连续表达抗原；所以，它已成为突出的疫苗的新递送 系统。具体而言，展示在非病原性大肠杆菌(E.coli)或沙门氏菌 (Salmonella)的表面上的病原体衍生的抗原性表位以活体形式口服，然 后显示以更连续或强大的方式诱导免疫反应(Georgiou等，1997；和Lee 等，2000)。
全细胞生物转化
全细胞作为生物催化剂，在其表面上展示的酶能催化化学反应， 可避免酶的直接表达、分离和稳定的必要性。在细胞中表达酶用于生 物转化的情况下，迫使细胞回收及化学(例如甲苯)处理以确保对底物 的不通透性。此外，持续使用致使酶失活或者带来底物和产物转移上 的问题，由此降低整个过程的生产率。
利用展示在细胞表面上的酶可克服上述的缺陷(Jung等，1998a： 1998b)。采用在其表面上展示磷酸二酯酶的全细胞，具有更高毒性的 有机磷种类对硫磷和对氧磷可被降解，这是个典型的例子，表示展示 酶的细胞对环境纯化过程的应用性(Richins等，1997)。
抗肽抗体
Martineau等报道了利用大肠杆菌的表面展示技术生产抗肽抗体 的高度简便的方法(Martineau等，1991)。正如所述，把所需的肽展示 在MalE和外膜蛋白Lamb的突出区域，然后，全细胞或片段化的细 胞施用给动物以生成抗肽抗体。该方法使得生产抗体的同时避免肽的 化学合成及其与载体蛋白的键合成为可能。
全细胞吸附剂
为了使抗体或多肽固定于合适的载体上，这在吸附层析中是有用 的，必须进行随后的若干步骤，例如，发酵生长蛋白，纯化纯的蛋白 以及固定于载体上。一般而言，难以制备生物吸附剂。
作为吸附剂，已开发出了展示吸附蛋白的全细胞。最有名的全细 胞吸附剂是在其表面上自然展示蛋白A的金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，它与哺乳动物抗体的Fc区具有高的结合亲和 性。当前，已提出了去除和回收重金属的新方法，其采用大量展示在 微生物细胞表面上的金属硫蛋白或金属吸附蛋白(Sousa等， 1996，1998；和Samuelson等，2000)。与利用吸附金属微生物的常规 方法比较，该方法可更有效地从污染源中去除和回收重金属。
正是基于对上述事实的了解，为了在细胞表面上展示外源蛋白， 合适的表面蛋白和外源蛋白必须在基因水平是相互连接的以表达融合 蛋白，以及融合蛋白应稳定地越过细胞内膜以附着于细胞表面。优选 地，具有下列特征的表面蛋白推荐为表面展示基元：1)有能通过细胞 内膜的分泌信号，2)有能稳定附着于细胞表面上的靶信号，3)细胞表 面上的高表达水平，和4)不管蛋白大小都可稳定表达(Georgiou等， 1993)。
同时，根据上述现有的表面展示方法，为了把目的蛋白整合到表 面蛋白的N-端或C-端或中心区，表面展示的基元需要进行遗传修饰。 所有表面展示的蛋白以与表面展示基元融合的方式表达。所以，所得 表面展示的蛋白是修饰蛋白而非野生型蛋白。
迄今为止，所开发的表面展示系统如下：噬菌体表面展示系统 (Chiswell和McCarferty，1992)、细菌表面展示系统(Georgiou等，1993； Little等，1993；和Georgiou等，1997)、革兰氏阴性细菌表面展示系 统(Francisco等，1992；Fuchs等，1991；Klauser等，1990，1992；和 Hedegaard等，1989)、革兰氏阳性细菌表面展示系统(Samuelson等， 1995；Palva等，1994；和Sleytr和Sara，1997)和酵母表面展示系统 (Ferguson，1988；和Schreuder等，1996)。此外，还已开发出了与芽 孢外被蛋白融合的目的蛋白展示在孢子表面上。例如，美国专利号 5,766,914公开了利用枯草芽孢杆菌的芽孢外被蛋白中的cotC或cotD 与作为报道蛋白的lacZ的融合蛋白来生产和纯化酶的方法。美国专利 号5,837,500和5,800,821也表明cotC和cotD作为优选的表面展示基 元，但其实验演示未加以说明。
根据革兰氏阴性细菌的表面展示系统，外源多肽整合到表面结构 不仅导致位的限制使得不可能具有稳定的膜蛋白(Charbit等，J. Immunol，139：1644-1658(1987)；和Agterberg等，Gene，88：37-45(1990)) 而且导致细胞外膜的稳定性及其生存力的降低。大肠杆菌作为展示宿 主，其已被深入地进行了研究，通常利用细胞外膜蛋白作为表面展示 基元。然而，与外源蛋白融合的细胞外膜蛋白的过表达可能带来细胞 外膜结构的不稳定，结果使宿主细胞的生存力突然下降(Georgiou等， 1996)。
上述常规展示方法中存在的问题是由于目的蛋白和用于展示的表 面展示基元之间的融合蛋白的制备。如果融合蛋白以少量表达，则全 细胞生物转化的反应效率、蛋白阵列和抗体产量降低；但如果过表达， 很可能导致上述的缺陷。另外，利用融合蛋白的表面展示方法依赖于 表面展示基元整合到细胞、孢子或噬菌体表面中的程度，引起展示蛋 白量的限制。
如上所述，常规表面展示技术根本上取决于目的蛋白和表面展示 基元之间的融合蛋白的形成。因此，在常规表面展示系统中存在若干 缺陷：(1)必须得知表面展示基元的基因序列；(2)必须克隆表面展示基 元的基因；(3)表面展示基元很可能影响目的蛋白的三级结构；(4)当 仅有多聚体形式的目的蛋白具有活性以及融合蛋白是独立表面展示 时，致使目的蛋白失活；(5)由于利用融合蛋白的表面展示方法依赖于 表面展示基元整合到宿主细胞表面中的程度，限制所展示蛋白的量；(6) 当目的蛋白过量表面展示时，诱导宿主细胞的结构不稳定，从而降低 了宿主细胞对环境的抗性和生存力。
因此，为了开发新表面展示系统，该系统能够克服常规方法中的 缺陷，下列特征应得以实现：(1)能够构建系统而无需知道表面展示基 元的基因序列；(2)能够构建系统而无需克隆表面展示基元的基因；(3) 在目的蛋白形成其内在结构后，能够在宿主细胞表面上进行展示；(4) 通过非选择性键合，能够增加表面展示的蛋白的量；和/或(6)即使在 目的蛋白过量表面展示时，也不降低宿主细胞对环境的抗性和生存 力。
在整个申请中，参考了各种各样的专利和出版物，文献引用在括 号内。为了更充分说明本发明以及本发明涉及的技术领域状态，这些 专利和出版物以其全文在此引作参考。
发明内容
在此情形下，本发明人进行了深入研究以克服常规表面展示方法 的缺陷，结果我们开发了无需表面展示基元的新型展示系统。令人惊 奇的是，开发的系统发现能够在表面上展示任何蛋白，而同时维持其 内在结构，并且当过量展示时，遗传载体可保持其生存力以及对周围 环境的抗性。
因此，本发明的一个目的是提供在遗传载体上表面展示的目的蛋 白的制备方法。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法改进 目的蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法从混 合物中分离目的物质的方法。
本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法进 行生物转化的方法。
本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法生 产针对脊椎动物抗原的抗体的方法。
本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的 载体。
本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的 微生物转化子。
本发明的进一步目的是提供遗传载体和目的蛋白之间的复合体。
本发明的进一步目的是提供展示在表面目的蛋白变体上的遗传载 体文库。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法所制 备的蛋白微阵列。
附图简述
图1示意性说明本发明的原理；
图2表示展示在孢子表面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂肪酶活性；
图3表明在宿主细胞中表达的野生型脂肪酶在孢子表面上的展 示；
图4显示流式细胞仪分析的结果，用于证实野生型羧甲基纤维素 酶的孢子表面展示；
图5是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCase-hp的遗传图；
图6显示流式细胞仪分析的结果，用于证实含有修饰的分泌信号 的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示；
图7是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCasehis的遗传图； 和
图8示出流式细胞仪分析的结果，用于证实含有融合序列、阳离 子区的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示。
实施本发明的最佳方式
首先在此使用的术语“遗传载体”是指在其表面上展示目的蛋白 并具有下列特征的生物体：(1)选自孢子和病毒；(2)具有与目的蛋白形 成非共价键的能力，所述目的蛋白具有所需的解离常数，在内含遗传 载体的宿主细胞中表达；和(3)如果需要，其表面特性能够通过遗传工 程方法进行修饰。
此处所用的术语“宿主细胞”意思不同于涉及蛋白表面展示的现 有出版物所公开和显示的含义。在此所用的术语“宿主细胞”是指表 达目的蛋白并具有下列特性的细胞：(1)能够被编码目的蛋白的基因转 化；(2)能够内含遗传载体如孢子和病毒以及增殖遗传载体；和(3)如果 需要，能够进行遗传操作。
如上所述，在本说明书中，术语“遗传载体”在其表面上展示目 的蛋白，以及“宿主细胞”表达目的蛋白，它们具有严格不同的含义。
在本发明的一个方面，提供了在遗传载体上表面展示的目的蛋白 的制备方法，所述方法包含下列步骤：(a)用含有编码目的蛋白的基因 的载体转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(b)培养转化 的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白；和(c)使表达蛋白和遗传载 体表面之间形成非共价键，以便目的蛋白展示在遗传载体表面上。
在本发明的另一方面，提供了改进目的蛋白的方法，所述方法包 括下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因 文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内 含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并 在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；(e)通过在表达的蛋白变体和遗传 载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体表面上，从而 获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋 白变体的遗传载体。
在本发明的另一方面，提供了从混合物中分离目的物质的方法， 所述方法包括下列步骤：(a)通过突变编码结合蛋白或作为目的蛋白的 结合区的基因，构建编码结合蛋白或其结合区的基因文库；(b)制备含 有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和 病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中 表达结合蛋白或结合区的变体；(e)通过在表达的结合蛋白变体或结合 区变体和遗传载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体 表面上，从而获取遗传载体文库；和(f)将遗传载体文库与预定的物质 接触，并通过选择在其表面上展示变体结合预定的物质来筛选改进的 结合蛋白或其结合区；(g)将在其表面上展示改进的结合蛋白或其结合 区的遗传载体与混合物接触以从混合物中分离物质。
本发明方法已根据新的概念开发出来，其与常规表面展示方法大 大不同。本发明方法利用了在遗传载体表面上组分的特性，具体利用 了在遗传载体表面上的蛋白和目的蛋白之间的非共价键。本发明的原 理路线利用孢子作为遗传载体，说明性示例在图1中。参照图1，宿 主细胞被携带编码目的蛋白的序列的载体转化，目的蛋白在形成孢子 过程中或之前胞内或胞外表达，并且凭借目的蛋白和宿主细胞中形成 的孢子表面之间的非共价键最终实现目的蛋白的表面展示。
如上所述，本发明的显著特征在于无需表面展示的基元，所述基 元在常规表面展示蛋白的方法中是必需的。由于本发明方法规避了表 面展示基元的必要性，因此蛋白在宿主细胞中表达时，发现难以越过 细胞膜，可在遗传载体表面上充分展示，当宿主细胞裂解露出遗传载 体时，可回收在其表面上展示蛋白的遗传载体。这种回收的目的蛋白 和遗传载体的复合体具有广泛的用途。
根据本发明方法，孢子或病毒可作为遗传载体使用。孢子是优选 的遗传载体，这是由于其具有如下特性(Driks，1999)：(1)较高的热稳 定性；(2)对放射性显著的稳定性；(3)对毒素的稳定性；(4)对酸和碱 较高的稳定性；(5)对溶菌酶显著的稳定性；(6)抗干燥性；(7)对有机 溶剂较高的稳定性；(8)无代谢活性；和(9)较短的获取孢子的时间，例 如几小时。
根据本发明方法，当病毒用作遗传载体时，优选使用噬菌体，以 及在原核宿主细胞中表达的目的蛋白是通过非共价键结合到噬菌体的 外被蛋白而得到表面展示的。如果噬菌体位于宿主细胞的周质中，可 将信号肽与目的蛋白融合，以允许向周质中分泌，从而确保表面展示。 如果目的蛋白不能与噬菌体的外被蛋白自然结合，则为了进行表面展 示，可将其融合到能与噬菌体的外被蛋白结合的基元上。
根据一优选的实施方案，遗传载体具有修饰的表面蛋白以增强与 目的蛋白的非共价键。遗传载体的修饰方法包括：(i)将寡肽或多肽与 遗传载体表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增强了目的蛋白与遗传载体 之间的非共价键；(ii)使遗传载体表面蛋白进行定点诱变；和(iii)把遗 传载体表面蛋白进行随机诱变，但不限于此。
在本发明方法中，目的蛋白包括任何蛋白和肽，如激素、激素类 似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链 抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋 白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物防卫 一诱导蛋白，但不限于此。
本发明所用的结合蛋白或其结合区包括任何能够结合预定的物质 的蛋白或其结构域，例如当分离某种抗原物质时，所述结合蛋白或其 结合区是抗体或其抗体结构域。结合蛋白或结合区包括但不限于蛋白 酶抑制剂、芥菜素(crambin)、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽(apaminm) 溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋 白酶抑制剂、卵类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。
根据本发明方法，单体或多聚体(包括同型多聚体和异型多聚体) 可被表面展示。多聚体蛋白一般只有其所有单体结合时才具有完整的 活性。在常规方法中，已发现多聚体蛋白是以失活形式进行表面展示 的，因为其单体是彼此独立表面展示的。根据本发明方法，多聚体蛋 白可以展示在遗传载体表面上而同时维持其整体结构。
根据优选的实施方案，待表面展示的目的蛋白可以被修饰，以便 增强与遗传载体的非共价键。修饰方法包括：(i)缺失一部分目的蛋白 的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所 述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的 蛋白进行定点诱变；和(iv)将目的蛋白进行随机诱变，但不限于此。
使一部分目的蛋白氨基酸缺失的方法可以各种各样的方式进行， 例如通过从目的蛋白的N-端序列(例如信号肽)缺失离子型氨基酸。 由此修饰的目的蛋白增强了与遗传载体的疏水性相互作用，因此可以 较低的解离常数被表面展示。有报道孢子表面携带阴离子电荷。所以 优选阳离子肽与用于表面展示的目的蛋白进行融合。
在本发明方法中，作为编码待转化目的蛋白的基因，两个或更多 个重复序列也是有用的。在两个或更多个重复序列中，重复序列可以 彼此相同或不同。其他组合也可用于融合序列中。此外，转化中所用 的基因可以质粒独立存在于宿主细胞中，或整合到宿主细胞的染色体 中。
目的蛋白的表达可以依靠其自身的启动子或其他可在宿主细胞中 诱导的适当的启动子进行诱导。
根据本发明方法，非共价键，尤其是疏水键、离子键、氢键和范 德瓦耳斯键中的一种或多种，使得目的蛋白与遗传载体之间相互作 用。
根据一优选的实施方案，内含孢子的宿主细胞包括但不限于孢子 形成革兰氏阴性菌如粘球菌(Myxococcus)；孢子形成革兰氏阳性菌如 梭状芽孢杆菌(Clostridium)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和芽孢杆菌 (Bacillus)；孢子形成放线菌(Actionmycete)；孢子形成酵母如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)和汉逊酵母(Hansenulla) 和孢子形成真菌。更优选地，宿主细胞是孢子形成革兰氏阳性菌，以 及最优选地，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽 孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 具体而言，枯草芽孢杆菌在某种意义上是有利的，因为对其孢子形成 的遗传知识和实验方法以及培养方法是众所周知的。
根据一优选的实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其删除了胞 内和胞外蛋白酶的生成，所述蛋白酶参与表面展示的目的蛋白的降 解。
虽然本发明方法主要针对通过遗传载体和目的蛋白之间非共价键 的表面展示，但如果需要更稳定的连接，其它共价键也可使用。使遗 传载体表面和目的蛋白之间的键稳定的操作方法可以是使用物理、化 学或生化方法在遗传载体表面和目的蛋白之间形成共价键，接着通过 非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。在形成共价键的方法中， 化学法戊二醛处理(DeSantis G.和Jones J.B.Curr.Opin.Biotechnol.10： 324-330(1999))是优选的，物理法紫外线处理(Graham L.，和Gallop P.M. Anal.Biochem.217：298-305(1994))是优选的，以及生化法酶处理确保 了共价键的形成(Gao Y.，和Mehta K.，J.Biochem.129：179-183 (2001))。
在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法中，优选方法进一 步包含筛选在其表面上展示目的蛋白的遗传载体的步骤。
在改进目的蛋白的方法中，通过突变野生型目的蛋白基因来构建 基因文库的步骤是利用：DNA改组方法(Stemmer，Nature，370：389-391 (1994))、StEP方法(Zhao，H.等，Nat.Biotechnol.，16：258-261(1998))、 RPR方法(Shao，Z.等，Nucleic acids Res.，26：681-683(1998))、分子繁 殖方法(Ness，J.E.等，Nat.Biotechnol.，17：893-896(1999))、ITCHY方 法(Lutz S.和Benkovic S.，Current Opinion in Biotechnology，11：319-324 (2000))、易错PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2： 28-33(1992))和点诱变(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
根据改进目的蛋白方法的一优选实施方案，遗传载体是孢子，以 及筛选步骤的方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化 剂、干燥、表面活性剂和蛋白酶中的一种或多种进行处理，然后对在 其表面上展示目的蛋白变体、具有处理抗性的孢子加以选择。
根据改进目的蛋白方法的另一优选实施方案，遗传载体是孢子， 以及筛选步骤的方式是将孢子文库先用选自有机溶剂、热、酸、碱、 氧化剂、干燥、表面活性剂中的一种或多种进行处理，接着用蛋白酶 进行二次处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有蛋白酶抗 性的孢子加以选择。
在本发明方法中，筛选步骤的操作依靠：(i)展示在遗传载体表面 上的目的蛋白的活性；(ii)能够识别标记目的蛋白的物质的蛋白；(iii) 能够结合目的蛋白的标记配体；或(iv)能够与目的蛋白特异性结合的 抗体，但不限于此。优选地，通过能够与目的蛋白结合的标记配体或 能够与目的蛋白特异性结合的抗体，将流式细胞仪用于筛选中。例如， 一级抗体结合于展示在孢子表面上的目的蛋白，然后与标记有荧光化 学物质的二级抗体反应以染色孢子，接着用荧光显微镜观察或用流式 细胞仪分析。如果二级抗体是金标记的，则能用电子显微镜观察。通 过测量由此蛋白催化的比色反应，利用目的蛋白的活性进行筛选。
在本发明制备表面展示的目的蛋白以及改进目的蛋白的方法中， 优选的是在所筛选的遗传载体增殖后，具有所需特性的蛋白变体或编 码它们的基因得到回收。
根据利用孢子作为遗传载体的一优选实施方案，孢子回收的操作 方式是通过控制培养时间，使目的蛋白在孢子表面上的展示最大化， 其后培养终止，然后回收孢子。适当的培养时间是变化的，这取决于 所用的细胞类型，例如在使用枯草芽孢杆菌作为宿主的情形下，优选 的培养时间为16-25小时。根据本领域一名技术人员已知的常规方法， 更优选renografin梯度方法(C.R.Harwood等，″Molecular Biological Methods for Bacillus.″John Wiley & Sons，New York，第416页 (1990))，可进行孢子回收。
改进蛋白的方法以高通量方式从野生型中提供(1)催化非生物反应 的酶(例如第尔斯—阿尔德缩合)；(2)具有非自然立体选择性或区域选 择性的酶；(3)在有机溶剂或有机溶剂—水溶液两相体系中具有活性的 酶；和(4)在极端条件如高温或高压下具有活性的酶。此外，为了选择 具有增强的结合亲和性的抗体变体，通常是使pH突然发生变化或调 整碱的浓度，从而洗脱变体。在利用噬菌体或细菌作为载体的方法中， 这种洗脱条件有可能降低噬菌体或细菌在培养基中的生存力。然而， 利用孢子表面展示系统改进蛋白的方法克服了这种障碍。
在本发明的进一步方面，提供了在遗传载体表面上展示目的蛋白 的载体，所述载体包含复制起点、抗生素抗性基因、限制性位点、编 码目的蛋白的基因，其中当目的蛋白在宿主细胞中表达时，其能够与 遗传载体的表面形成非共价键。
根据一优选实施方案，编码目的蛋白的基因是一种突变基因，其 增强遗传载体表面和目的蛋白之间的非共价键。将编码目的蛋白的基 因突变成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的 目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载 体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白 进行随机诱变。
在本发明的进一步方面，提供了微生物转化子，其特征在于转化 子的制备方法是用本发明载体转化内含孢子或病毒的宿主细胞。根据 一优选实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其消除了胞内蛋白酶或 胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解表面展示的目的蛋白。
在本发明的另一方面，提供了遗传载体和目的蛋白之间的复合 体，其特征在于复合体的制备是根据权利要求1所述的方法在遗传载 体表面上展示激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其 片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘 着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、 血液凝固蛋白和植物防卫—诱导蛋白。
根据一优选实施方案，目的蛋白是一种修饰蛋白，其修饰方法是 (i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白 或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的 非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机 诱变。
此外，本发明复合体可具有其它共价键以使遗传载体表面和目的 蛋白之间的键稳定，其中使用物理、化学或生化方法形成共价键，接 着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。
在本发明复合体中，孢子是优选的遗传载体。如果孢子用作遗传 载体，孢子优选的是非繁殖孢子，其获得途径是选自遗传方法(Popham D.L.等，J.Bacteriol.，181：6205-6209(1999))、化学方法(Setlow T.R. 等，J.Appl.Microbiol.，89：330-338(2000))和物理方法(Munakata N等， Photochem.Photobiol.，54：761-768(1991))中的一种或多种。本发明复 合体仅利用孢子作为目的蛋白的展示手段可排除繁殖孢子的必要性。 可考虑的是经遗传工程改造的生物体有可能受到法律和规章的控制； 因此非繁殖孢子是优选的。造成孢子非繁殖的遗传方法可通过缺失参 与宿主细胞的孢子再生的基因来实施。例如，缺乏cwlD基因的枯草 芽孢杆菌优选用于本发明中。另外，孢子优选衍生自突变的变体，所 述变体通过选自物理方法(Wienc K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56： 2600-2605(1990))、化学方法和遗传方法中的一种或多种增加了其凝 集特性。具有增加的凝集特性的孢子可在以工业规模进行的生物转化 中从所得产物方便地分离出来。
在优选的实施方案中，遗传载体是噬菌体。
在本发明另一方面，提供了在其表面上展示目的蛋白变体的遗传 载体文库，该文库的制备方法包含下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋 白的基因，构建目的蛋白的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的 载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主 细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白变体；(e) 通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展 示在遗传载体表面上，获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示 具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。
根据一优选实施方案，遗传载体是孢子或噬菌体。
在本发明的进一步方面，提供了利用具有转化反应活性的蛋白来 进行生物转化的方法，其特征在于所述方法采用遗传载体和目的蛋白 之间的本发明复合体。能够催化(生物)化学反应的任何蛋白包括酶和 酶活性抗体，可用于此生物转化中。
同时，利用表面展示的酶的生物转化方法要求表面展示的遗传载 体在极端条件下的生理化学的稳定性，这是因为所述方法通常在高温 和/或有机溶剂下进行。特别地，在当今工业中有价值的化学合成主要 在有机溶剂中进行，以及手性化合物的合成或外消旋混合物的分辨也 是在高度苛刻的生理化学条件下进行的。所以，表面展示的酶以及展 示酶的生物体被迫在如此极端条件下具有稳定性。就此而论，本发明 利用表面展示的孢子或病毒的生物转化方法显示是大为有利的。
利用表面展示酶的化学方法已有人提出(Georgiou等，1993)。然 而，这种方法一般要求细胞表面用交联剂固定化，因为展示酶的宿主 在此过程中很不稳定(Freeman等，1996)。本发明生物转化方法不含有 上述的缺陷。由于表面展示的酶以及展示酶的遗传载体大都稳定，因 此本发明方法避免了固定化。本发明生物转化方法也可应用于任意类 型的酶，如脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、糖基转移酶、氧化还原酶和 醛缩酶。此外，本发明方法在单步或多步反应以及水溶液或非水溶液 中是有用的。本发明生物转化方法采用遗传载体作为游离或固定的形 式，可采用其他微生物或酶来实施。
在本发明的进一步方面，提供针对脊椎动物抗原的抗体的生产方 法，其特征在于所述方法包含给脊椎动物施用一种组合物，所述组合 物含有免疫学上有效量的在遗传载体和目的蛋白之间的本发明复合 体。根据本发明生产抗体的方法，组合物含有免疫学上有效量的复合 体，优选另包含佐剂，如不完全和完全弗氏佐剂。在本发明方法中， 给药可通过口服和静脉内、腹膜内、皮下和肌内注射进行。第一次给 药后，在适当的期间内加强给药是优选的，以生成足够量的抗体。
与DNA微阵列相似，蛋白质微阵列提供用于分析某些细胞中靶 蛋白的表达或表达水平的手段。为了制造蛋白质阵列，必须获得适当 的待阵列的蛋白，然后固定于固相表面。在利用蛋白质阵列的分析过 程中，清洗步骤必须进行以除去非结合的蛋白，以及各种处理如高温、 高盐浓度和pH调节得以实施；所以，关键是保证拟蛋白物质在这种 有害环境中具有较高的稳定性。此外，制备蛋白质阵列的常规方法需 要乏味和重复的工作，如克隆数千到数万种蛋白的基因并且固定所表 达的蛋白。所以，有需要对该工作的简便和快速进行改进。
根据本发明蛋白质阵列的制备方法，上述工作可确保以更迅速的 方式进行。在本发明方法中，将前述的本发明复合体或遗传载体文库 固定于固相基底上。本发明蛋白质阵列的制备方法是使在其表面上展 示目的蛋白的遗传载体固定于固相基底上。在制备蛋白质阵列的方法 中，可使用常规的方法(参见WO 0061806、WO 0054046、US 5807754、 EP 0818467、WO 9742507、US 5114674和WO 9635953)。由本发明 制造的蛋白质微阵列具有各种各样的可应用领域，包括诊断、基因表 达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配体之间的相互作用 的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合的生化合成和生物 传感器。
本发明方法中适当的固相基底包括但不限于玻璃(例如，功能化 的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO、SiN4、改性的硅氧烷硝化纤维 素、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、聚苯乙烯(polystylene)、聚 四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龙、纤维及其组合。遗传载体通过接头分子 可任选连接到阵列基底。阵列表面未被点击的区域优选加以封闭。施 用到各个点(或地址)的遗传载体的量依赖于阵列的种类。连接到固相 基底的遗传载体上展示的蛋白和所施加的样品之间的相互作用可根据 它们固有的特征(例如免疫原性)加以检测或通过标记有独立可检测的 标志(例如荧光、化学发光或放射分子和表位)给予检测。利用已知的 电脑化的系统如“读数仪”和“扫描仪”对用本发明的蛋白质阵列所 产生的数据进行分析。
正如从本申请的所有说明中所了解的，本发明表面展示方法利用 适合于所有本发明方法的遗传载体，具有若干优点：(1)避免需要表面 展示的基元；(2)确保目的蛋白具有其完整的活性，其作用方式是目的 蛋白在表达后形成其固有的结构，并且展示在表面上；(3)增加目的 蛋白表面展示的量，这是因为蛋白通过非共价键即以非选择的方式加 以展示；和(4)尽管表面展示的蛋白量得到增加，但是对遗传载体的存 活力和周围环境的抗性没有或很少有影响。
下列特定的实施例旨在说明本发明，不应理解成如所附权利要求 所限定的那样限制本发明的范围。
实施例
实施例1：对孢子表面展示纯的分离的脂肪酶的确认
胞质蛋白能否如以前报道的外被蛋白或结构蛋白(形态发生素)那 样结合和展示在孢子表面仍有待证实。根据孢子表面的疏水特性 (Wiencek，K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56：2600-2605(1990))， 本发明人假设含有疏水区的蛋白如脂肪酶(Brockerhoff H.，Chem.Phys. Lipids，10：215(1973))可通过疏水键连接并展示在孢子表面上。该假设 的证实是在脂肪酶附着到从枯草芽孢杆菌中分离的纯孢子上后测定其 酶活性，该酶纯化自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
首先，将枯草芽孢杆菌DB104菌株(Kawamura F.和Doi R.H.，J. Bacteriol.，160：442-444(1984))在GYS培养基((NH4)2SO42g/l、酵母 提取物2g/l、K2HPO40.5g/l、葡萄糖1g/l、MgSO4·H2O 0.41g/l、 CaCl2·2H2O 0.08g/l、MnSO4·5H2O 0.07g/l)中摇床(37℃，250rpm) 培养24小时，以及利用renografin梯度方法仅分离纯化的孢子(C.R. Harwood等，″Molecular Biological Methods for Bacillus.″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))。在显微镜下验证纯的分离的孢子 (1000x，ALPHAPHOT-2，Nikon)。
将2mg纯的分离的芽孢杆菌孢子和94μg部分纯化的假单胞菌 脂肪酶(Ahn，J.H.等，J.Bacteriol.，181：1847-1852(1999))混合到2001 的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，4℃下无搅动反应12小时，然后离 心使孢子从缓冲液中分离出来。接着，分离的孢子用0.5ml的50mM Tris缓冲液(pH8.0)漂洗三次，最后将脂肪酶附着的孢子进行纯化。为 了测定附着在孢子上的脂肪酶活性，将脂肪酶附着的孢子悬浮在添加 有10％橄榄油的PBS缓冲液中反应48小时，上清液用0.2ml铜酸 (cupric acid)处理，以及在715nm处测定最终的OD。上清液的结果显 示脂肪酶活性通过橄榄油从脂肪酶附着的孢子中释放出来(图2)。在图 2中，线(1)代表脂肪酶附着的孢子，线(2)代表无脂肪酶附着的对照， 以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。
这些结果显示由于疏水作用，脂肪酶仅能通过吸附结合到孢子表 面。
这些结果举例说明具有疏水性的任何蛋白都可展示在孢子上，本 领域的那些技术人员应理解，当蛋白在细胞中表达或分泌到胞外时， 具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面上。
实施例2：野生型脂肪酶在孢子表面上的展示
对宿主细胞中表达的野生型脂肪酶的孢子展示进行如下检查：质 粒pBS：lipA(Bell P.J.L.等，Biotechnol.Lett.，21：1003-1006(1999))由 澳大利亚的Bergquist博士赠送。利用lipl(SEQ ID NO：1)和lip2(SEQ ID NO：2)为引物及pBS：lipA质粒为模板进行PCR。Taq聚合酶购自 Boehringer Mannheim，PCR共35次循环，条件为94℃变性30秒、55 ℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。
然后，将各个扩增的PCR产物用BamHI和KpnI限制性酶切， 并克隆到切去预先克隆的羧甲基纤维素酶基因后的质粒pCrylP- CMCase同样的限制性位点中，并通过自然转化方法(C.R.Harwood 等，″枯草芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological methods for Bacillus)″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))将该克隆的 质粒转化到枯草芽孢杆菌DB104中。在以实施例1相同的方式从转化 的芽孢杆菌菌株分离孢子后，测定纯的分离的孢子中的脂肪酶活性(图 3)。在图3中，线(1)代表展示有野生型脂肪酶的孢子，线(2)为对照孢 子的结果，以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。这些结果显示， 利用本发明的孢子展示系统，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面。
该实施例中表达的脂肪酶的N-端含有分泌信号肽，导致胞外分 泌。分泌的酶可附着到在孢子形成后暴露于培养基的孢子表面。此外， 尽管存在分泌性信号肽，非分泌酶在孢子形成过程中由于疏水特性 (Bron S.，J.Biotechnol.，64：313(1998))也可附着到孢子表面上。
结果一目了然，具有疏水性的蛋白可展示到孢子表面，不管蛋白 是胞内表达还是胞外分泌。
实施例3：野生型羧甲基纤维素酶在孢子表面上的展示
为了在孢子表面上展示羧甲基纤维素酶，将分离自枯草芽孢杆菌 BSE616菌株的羧甲基纤维素酶基因(Park S.H.等，Agric.Biol.Chem.， 55：441-448(1991))克隆在苏云金芽孢杆菌菌株的crylAa毒素基因的启 动子的控制之下。
首先，利用1AP1(SEQ ID NO：3)和1AP2(SEQ ID NO：4)为引物， 通过Kalman S.等方法(Appl.Environ.Microbiol.，59：1131-1137(1993)) 从购自BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，Ohio，USA)的苏云金芽孢 杆菌库斯塔基亚种(Bacillus thurigiensis kurstaki)HD1菌株中分离的 DNA为模板，以实施例2相同的条件，由PCR扩增crylAa启动子。 将PCR产物克隆到购自Promega公司(USA)的载体pGemT-easy中， 随后用SphI和SalI消化，并克隆到质粒pUC19(GenBank X02514)同 样的限制性位点中。质粒pUC19再次用HindIII和BamHI限制性酶切 割，并把所得的片段插入到pCPaC3(KCTC 0831BP)同样的限制性位 点中，由此构建pCrylP-CMCase。pCrylP-CMCase是一种穿梭载体， 其在大肠杆菌和芽孢杆菌菌株中均可复制。
将最终构建的质粒pCrylP-CMCase通过自然转化方法转化到枯草 芽孢杆菌DB104菌株中。其他方法如接合或转导也可用于使重组载体 导入到芽孢杆菌菌株中。其后，由pCrylP-CMCase转化的芽孢杆菌菌 株在GYS培养基中摇床(37℃，250rpm)培养24小时，并利用renografin 梯度方法仅分离纯的孢子。
对分离的孢子中的羧甲基纤维素酶活性进行如下测定：首先，将 100μl密度为OD(600nm)＝1.4的孢子悬浮液的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)与200μl的1％羧甲基纤维素的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)混合， 然后50℃反应40分钟。反应后，向反应溶液中加入900μl的DNS 溶液(20％酒石酸钾钠、1％NaOH、0.05％NaHSO3、0.2％苯酚、1％3，5- 二硝基水杨酸)，加热5分钟，然后在冷水中冷却。离心后上清液的光 密度在波长575nm处进行测定。与对照0mU比较，展示在孢子表面 上的羧甲基纤维素酶的活性为1.96mU。
在另一确认方法中，当通过Kim等(Appl.Environ，Microbiol.，66： 788-793(2000))的方法利用羧甲基纤维素酶特异抗体(Kim等，Appl. Environ，Microbiol.，66：788-793(2000))来操作流式细胞仪(FACSort， Becton Dickinson，USA)时，流式细胞仪也显示在转化有pCrylP- CMCase的芽孢杆菌菌株的孢子表面上展示羧甲基纤维素酶(图4)。在 图4中，线1代表对照孢子，线2是指由pCrylP-CMCase转化的芽孢 杆菌菌株的孢子，垂直线表示孢子数，以及水平线为荧光强度。如图 4所示，与对照比较，在展示羧甲基纤维素酶的孢子中峰移向右边， 这说明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合在转化有质粒 pCrylP-CMCase的孢子表面上。结果，羧甲基纤维素酶附着在转化有 pCrylP-CMCase的孢子表面上。
该实施例中表达的羧甲基纤维素酶的N-端含有分泌信号肽，导 致胞外分泌。虽然分泌的酶有可能附着到在孢子形成后暴露于培养基 的孢子表面，但是非分泌酶尽管存在分泌性信号肽(Bron S.，J. Biotechnol.，64：313(1998))，由于信号肽的疏水特性也可附着到孢子 上。因此可以理解，任何具有分泌信号的蛋白通过本发明的孢子表面 展示系统能在孢子表面上得以展示。
实施例4：具有修饰的分泌信号的羧甲基纤维素酶的孢子展示
N-端分泌信号肽一般包含N-端2-3个阳离子型氨基酸残基，接着 是疏水区，阳离子型氨基酸通过与细胞膜的阴离子磷脂结合使得蛋白 分泌(Tjalsma H.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64：515-547(2000))。另外， 用中性氨基酸取代阳离子型氨基酸已知会导致分泌降低(Chen M.和 Nagarajan V.，J.Bacteriol.，176：5796-5801(1994))。基于上述事实，本 发明人假设蛋白分泌的降低会增加胞内蛋白，并且由于蛋白的N-端疏 水区，导致蛋白在孢子表面上更高的展示。为了试图证明此假设，进 行了如下实验。
为了用仅含有疏水区而不含阳离子型氨基酸残基的分泌信号克隆 羧甲基纤维素酶，将法国巴斯德研究所(Pasteur Institute in France)的F. Kunst博士赠送的枯草芽孢杆菌168菌株的DNA(Nature，390：249-256 (1997))通过Kalman等方法分离。其后，利用引物cmc-hp(SEQ NO：5) 和另一引物(SEQ NO：6)以及与实施例2同样条件分离的DNA为模板 进行PCR。
随后，用BamHI和SacI消化PCR产物，并克隆到已切去CMCase 基因的pCrylP-CMCase中。通过自然转化方法，将pCrylP-CMCase-hp (图5)转化到枯草芽孢杆菌DB104中。所得转化子命名为“枯草芽孢 杆菌BSK209”，于2000年12月2日保藏在国际保藏机构韩国典型 培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 0902BP。SEQ ID NO：7是 指在其信号肽中缺乏阳离子型氨基酸的CMCase的DNA序列，而SEQ ID NO：8是指其CMCase的氨基酸序列。
然后，将转化的芽孢杆菌菌株BSK209培养在摇床(37℃，250rpm) 中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。
与对照0mU比较，以实施例3所述的同样方法，分离孢子的羧 甲基纤维素酶活性为4.74mU。该结果比野生型高出2.4倍，并显示 比野生型有更多的酶得到展示。此外，以实施例3的同样方式，流式 细胞仪利用羧甲基纤维素酶，显示有更多的酶展示在转化有pCrylP- CMCase-hp的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图6)。
在图6中，线1是指对照孢子，而线2是用质粒pCrylP-CMCase-hp 转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图6所示，与图4所示的野生型羧甲 基纤维素酶比较，峰移向右边，这显示有更多的羧甲基纤维素酶结合 到孢子表面。结果，其分泌信号仅含疏水区而不含阳离子残基的羧甲 基纤维素酶是孢子展示的中意形式。
从这些结果中可以理解，N-端阳离子信号氨基酸的缺失或中和在 孢子展示中可利用来得到更多的便利。此外，信号肽的疏水区或其他 不含信号肽的目的蛋白的疏水区显然可用于孢子展示。再者，通过选 择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，或通过融合其他增强 载体蛋白和目的蛋白之间的非共价键合的寡肽或多肽，疏水性增加， 显然也会在孢子表面上增强目的蛋白的展示。
实施例5：利用离子结构域进行孢子表面展示羧甲基纤维素酶
如实施例1所示，尽管芽孢杆菌的孢子表面是疏水的，但是也有 阴离子型氨基酸残基(Nishihara T.等，Microbiol.Immunol.，25：763771 (1981))。本发明人假设目的阳离子蛋白可由离子键展示，而阳离子基 元融合到无阳离子特性的目的蛋白将能在孢子表面上展示目的蛋白。 为了试图证实这种假设，实施了如下实例。
为了使阳离子结构域融合到羧甲基纤维素酶上，利用下列引物将 6个组氨酸残基融合到酶的成熟形式的N-端。首先，利用引物cmc-his (SEQ ID NO：9)和引物cmc-ter(SEQ ID NO：10)以及枯草芽孢杆菌168 的DNA为模板在与实施例2相同的条件下进行PCR。
随后，PCR产物用BamHI和SacI限制性酶切，并克隆到实施例 3所述的pCrylP-CMCase而非CMCase基因中。把构建的质粒pCrylP- CMCase-his(图7)通过自然转化方法转化到枯草芽孢杆菌DB104中。 SEQ ID NO：11是指在其N-端区域融合有6个组氨酸残基的CMCase 的基因序列，而SEQ No.12是指其氨基酸序列。
然后，将转化有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌菌株培养在摇床 (37℃，250rpm)中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。
以实施例3所述的相同方法，与对照0mU比较，分离孢子的羧 甲基纤维素酶活性为1.90mU，以及利用羧甲基纤维素酶特异的抗体 以实施例3相同的方式操作流式细胞仪，显示酶展示在用pCrylP- CMCase-his转化的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图8)。
在图8中，线1是指对照孢子，线2代表用质粒pCrylP-CMCase-his 转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图8所示，与对照比较，峰移至右边， 这表明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合于孢子表面。这些 结果显示其N-端含有其他阳离子结构域的羧甲基纤维素酶结合于转化 有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌的孢子表面。
所以，通过选择性或随机诱变基因或通过与任何蛋白中的阳离子 结构域融合，阳离子特性增加显然会增强孢子展示。此外，融合其他 寡肽或多肽，增强遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间的非共价键，或 通过选择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，增加阴离子特 性，会提高孢子表面展示阳离子目的蛋白。
根据实施例的结果，显示通过融合其他序列增加表面展示，可以 想象的是把结合配偶体如抗体—抗原或配体—受体融合到目的蛋白和 遗传载体表面蛋白有助于表面展示。
另应理解，通过戊二醛、紫外线或酶处理，催化共价键的形成， 由此在遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间形成其他共价键，所展示的 目的蛋白会更加得以稳定。
实施例6：在噬菌体表面上展示目的蛋白
根据上述实施例所证实的事实和发现，能够与噬菌体的外被蛋白 结合的目的蛋白可展示在噬菌体表面上是一目了然的。这种可能性证 实如下：而且，不能结合于噬菌体表面的目的蛋白通过融合能结合于 外被蛋白的基元可在噬菌体表面上加以展示，这也是很有可能的。
首先，把疏水结构域融合到噬菌体的外被蛋白和目的蛋白上。此 外，还融合向胞质分泌的信号肽。当它们在宿主细胞中表达时，所分 泌的目的蛋白通过与位于胞质中的噬菌体的外被蛋白疏水作用，在噬 菌体表面上得以展示。
根据此实施例中的发现，通过其他键合而非疏水作用能够展示的 修饰对本领域那些技术人员来说是一目了然的。
实施例7：利用在遗传载体上的展示方法定向进化目的蛋白
利用本发明中设计的展示系统，有可能实施目的蛋白的定点进 化，其中表面展示由目的蛋白和遗传载体表面之间的相互作用来实 现。首先，以羧甲基纤维素酶基因为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C. 和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。采用特异于羧甲 基纤维素酶基因的引物和以实施例3中所述的质粒pCPaC3为模板， 进行PCR。
PCR混合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、 PCR溶液(10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v) 明胶)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15 mM MnCl2、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。 在下列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30 秒以及72℃延伸1分钟。
随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制载体中，并通 过自然转化方法用克隆的载体转化枯草芽孢杆菌DB104，以及通过在 摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24小时，将羧甲基纤维素酶在孢子 表面上得以展示，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。其后， 如实施例3所述，利用羧甲基纤维素酶活性的变化或采用特异于羧甲 基纤维素酶的抗体的流式细胞仪的变化，对具有改性羧甲基纤维素酶 的孢子加以选择。
实施例8：利用遗传载体表面展示目的蛋白进行生物转化
利用有机溶剂中的脂肪酶进行生物转化已有报道(Zaks，A.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)；和Klibanow，A.M.，CHEMTECH， 16：354(1986))。没有酶的失活对实施反应是必不可少的。为了达到此 目的，按惯例一直采用脂肪酶的固定(Mustranta，A.Forssell等，Enz. Microb.Technol.，15：133(1993)；和Reetz，M.T.等，J.Biotechnol. Biogen.，49：527(1996))。根据这些报道，固定的脂肪酶在有机溶剂中 保持高的稳定性，并与游离的脂肪酶比较，合成增加。
首先，根据本发明将脂肪酶展示孢子的表面上，以及如所述进行 生物转化(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)； Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16；354(1986))。
本发明的生物转化也可通过在抗有机溶剂的病毒表面上展示目的 蛋白来进行。
实施例9：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白的蛋白质阵列
采用自动化阵列装置，将106-109个展示抗特异表面抗原的单克 隆抗体的孢子附着到玻璃基底上用于在其表面上含有醛官能团的蛋白 质阵列(BMS，Germany)。附着以共价键的形式进行，所述共价键是孢 子表面上蛋白的氨基和载玻片表面上的醛基之间的席夫碱。虽然在固 相表面上附着的展示蛋白有可能是失活的，但它们可具有方向性。
根据本发明制造的蛋白质阵列试剂盒具有各种各样的应用领域， 包括诊断、基因表达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配 体之间的相互作用的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合 的生化合成和生物传感器。
实施例10：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白生产抗体
通过展示能够体内诱导免疫应答的抗原，抗体可被诱导。
首先，通过自然转化方法，将实施例3中所用的含有羧甲基纤维 素酶的pCrylP-CMCase作为抗原转化到枯草芽孢杆菌DB104中。然 后，通过在补充有GYS培养基的摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24 小时，将羧甲基纤维素酶展示在孢子表面上。随后，通过renografin 梯度方法分离纯的孢子。将抗原—展示的孢子重悬浮于PBS中，并加 入相同体积的佐剂。其后，通过旋涡混合上述溶液，并静脉内注射到 出生后6-8周龄的BALB/c小鼠中。4周后，进行第二次注射。通过2-3 次加强诱导抗体。
实施例11：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白分离特异物质
利用遗传载体展示结合区从混合物中分离特异物质是可能的。首 先，采用编码结合区的基因作为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C.和 Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。利用特异于目的基 因的引物以及含有目的基因或染色体的质粒模板，进行PCR。PCR混 合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、PCR溶液 (10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v)明胶)、 0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mM MnCl2、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。在下 列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30秒 以及72℃延伸1分钟。
随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制的载体中以在 宿主细胞中构建文库。用克隆载体文库转化宿主细胞，使结合区在宿 主细胞中表达并在遗传载体表面上展示，并对具有目标特性的载体展 示修饰的结合区进行筛选。通过与混合物混合，将筛选的遗传载体分 离、繁殖、表达并用于分离特异物质。
如上所述，本发明方法用于制备在遗传载体上表面展示的目的蛋 白，可用来在缺乏展示基元的情况下在遗传载体表面上展示各种各样 的蛋白，目的蛋白在形成其固有结构后，由于展示可获取完全的活性， 并且目的蛋白表达和展示的量的增加从来不降低对环境的抗性和遗传 载体的生存力。
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根据布达佩斯条约用于专利程序的微生物保藏国际识别
国际表格
原始保藏收据
根据第7.1条颁布
授予人：潘在龟
大韩民国大田广域市305-340儒城区道龙洞380-43 I.微生物的识别 保藏者给出的识别号： 枯草芽孢杆菌BSK209 国际保藏单位给出的登记号： KCTC 0902BP II.科学描述和/或建议的分类名称 有关I识别的微生物： (×)科学描述 ()建议的分类名称 (×表示适用) III.接收 国际保藏单位已接收I识别的微生物，收到日：2000年12月2日 IV.国际保藏单位 名称：韩国典型培养物保藏中心 地址：大韩民国大田广域市305-333 韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB) 国际保藏单位授权官签名： DAE Kyung Sook，Director 日期：2000.12.7.
序列表
<110>格诺福库斯株式会社(GENOFOCUS Co.，Ltd.)
<120>在遗传载体上表面展示蛋白的方法
(Method for Surface Display of Proteins on Genet ic Carriers)
<130>SCT031940-47
<150>KR2001-2156
<151>2001-01-15
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对脂肪酶基因进行PCR的有义引物
<400>1
ggggatccgt tggaaggaga gggagaac 28
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对脂肪酶基因进行PCR的反义引物
<400>2
gcggtacctt tttgtccgtt ctcctga 27
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对crylAa启动子进行PCR的有义引物
<400>3
tccccgcggg actcttccta tatttactt 29
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对crylAa启动子进行PCR的反义引物
<400>4
atttgtacag gaaatgcgtc 20
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>5
ggatccgggg aggagaatca tgatctctat ttttattacg tg 42
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变CMCase基因进行PCR的反义引物
<400>6
gagctccagt at ttcatcca caacgc 26
<210>7
<211>1491
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有突变的信号序列以增强其疏水性的CMCase基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1488)
<400>7
atg atc tct att ttt att acg tgt tta ttg att acg tta ttg aca atg 48
Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met
1 5 10 15
ggc ggc atg ctg gct tcg ccg gca tca gca gca ggg aca aaa acg cca 96
Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro
20 25 30
gta gcc aag aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac 144
Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn
35 40 45
cga gac ggt aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg 192
Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu
50 55 60
caa tgg tat gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg 240
Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg
65 70 75 80
gac gat tgg ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat 288
Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp
85 90 95
ggc ggt ata att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg 336
Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala
100 105 110
gtt gaa gcg gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat 384
Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His
115 120 125
atc tta aat gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa 432
Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu
130 135 140
ttc ttc aag gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att 480
Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile
145 150 155 160
tat gaa att gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat 528
Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp
165 170 175
att aaa ccg tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat 576
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp
180 185 190
cca gac aac att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg 624
Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
195 200 205
aat gat gct gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca 672
Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala
210 215 220
ctt cat ttt tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca 720
Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala
225 230 235 240
aac tat gca ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga 768
Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly
245 250 255
aca agc gac gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg 816
Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg
260 265 270
gaa tgg ctg aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg 864
Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp
275 280 285
aat ctt tct gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca 912
Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala
290 295 300
tct aaa aca ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca 960
Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr
305 310 315 320
ttc gtt aga gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att 1008
Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile
325 330 335
cct gaa acg cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct 1056
Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser
340 345 350
gta caa tac aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt 1104
Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg
355 360 365
ccg cag ctt caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa 1152
Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys
370 375 380
gat gtc act gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac 1200
Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn
385 390 395 400
gtt gac tgt gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag 1248
Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys
405 410 415
ttt gtg acg ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa 1296
Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
420 425 430
ctt gga ttt aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat 1344
Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn
435 440 445
att cag ctt cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc 1392
Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser
450 455 460
ggc gat tat tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa 1440
Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys
465 470 475 480
atc aca tta tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat 1488
Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
485 490 495
ta g 1491
<210>8
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met
1 5 10 15
Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro
20 25 30
Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn
35 40 45
Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg
65 70 75 80
Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp
85 90 95
Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala
100 105 110
Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His
115 120 125
Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu
130 135 140
Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile
145 150 155 160
Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp
165 170 175
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp
180 185 190
Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
195 200 205
Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala
210 215 220
Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly
245 250 255
Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg
260 265 270
Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp
275 280 285
Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala
290 295 300
Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile
325 330 335
Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser
340 345 350
Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg
355 360 365
Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys
370 375 380
Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn
385 390 395 400
Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys
405 410 415
Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
420 425 430
Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn
435 440 445
Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser
450 455 460
Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys
465 470 475 480
Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
485 490 495
<210>9
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变的CMCase基因进行PCR的有义引物
<400>9
ggatccgggg aggagaatca tgcaccatca ccaccaccac gcagggacaa aaacgcca 58
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变的CMCase基因进行PCR的反义引物
<400>10
gagctccagt atttcatcca caacgc 26
<210>11
<211>1434
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有额外的组氨酸编码序列的CMCase基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1431)
<400>11
atg cac cat cac cac cac cac gca ggg aca aaa acg cca gta gcc aag 48
Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys
1 5 10 15
aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac cga gac ggt 96
Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly
20 25 30
aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg caa tgg tat 144
Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr
35 40 45
gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg gac gat tgg 192
Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp
50 55 60
ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat ggc ggt ata 240
Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile
65 70 75 80
att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg gtt gaa gcg 288
Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala
85 90 95
gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat atc tta aat 336
Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn
100 105 110
gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa ttc ttc aag 384
Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys
115 120 125
gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att tat gaa att 432
Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile
130 135 140
gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat att aaa ccg 480
Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro
145 150 155 160
tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat cca gac aac 528
Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn
165 170 175
att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg aat gat gct 576
Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala
180 185 190
gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca ctt cat ttt 624
Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe
195 200 205
tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca aac tat gca 672
Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala
210 215 220
ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga aca agc gac 720
Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp
225 230 235 240
gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg gaa tgg ctg 768
Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu
245 250 255
aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg aat ctt tct 816
Lys Tyr Leu Asp Scr Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Lcu Ser
260 265 270
gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca tct aaa aca 864
Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr
275 280 285
ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca ttc gtt aga 912
Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg
290 295 300
gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att cct gaa acg 960
Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr
305 310 315 320
cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct gta caa tac 1008
Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr
325 330 335
aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt ccg cag ctt 1056
Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu
340 345 350
caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa gat gtc act 1104
Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr
355 360 365
gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac gtt gac tgt 1152
Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys
370 375 380
gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag ttt gtg acg 1200
Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys Phe Val Thr
385 390 395 400
ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa ctt gga ttt 1248
Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe
405 410 415
aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat att cag ctt 1296
Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu
420 425 430
cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc ggc gat tat 1344
Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr
435 440 445
tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa atc aca tta 1392
Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu
450 455 460
tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat tag 1434
Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
465 470 475
<210>12
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys
1 5 10 15
Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly
20 25 30
Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr
35 40 45
Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp
50 55 60
Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala
85 90 95
Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn
100 105 110
Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys
115 120 125
Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile
130 135 140
Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn
165 170 175
Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala
180 185 190
Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe
195 200 205
Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala
210 215 220
Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu
245 250 255
Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser
260 265 270
Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr
275 280 285
Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg
290 295 300
Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr
305 310 315 320
Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr
325 330 335
Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu
340 345 350
Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr
355 360 365
Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys
370 375 380
Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys Phe Val Thr
385 390 395 400
Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe
405 410 415
Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu
420 425 430
Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr
435 440 445
Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu
450 455 460
Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
465 470 475
因此，本发明的一个目的是提供在遗传载体上表面展示的目的蛋 白的制备方法。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法改进 目的蛋白的方法。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法从混 合物中分离目的物质的方法。
本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法进 行生物转化的方法。
本发明的进一步目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法生 产针对脊椎动物抗原的抗体的方法。
本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的 载体。
本发明的另一目的是提供用于在遗传载体表面上展示目的蛋白的 微生物转化子。
本发明的进一步目的是提供遗传载体和目的蛋白之间的复合体。
本发明的进一步目的是提供展示在表面目的蛋白变体上的遗传载 体文库。
本发明的另一目的是提供利用在遗传载体上表面展示的方法所制 备的蛋白微阵列。
附图简述
图1示意性说明本发明的原理；
图2表示展示在孢子表面上的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂肪酶活性；
图3表明在宿主细胞中表达的野生型脂肪酶在孢子表面上的展 示；
图4显示流式细胞仪分析的结果，用于证实野生型羧甲基纤维素 酶的孢子表面展示；
图5是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCase-hp的遗传图；
图6显示流式细胞仪分析的结果，用于证实含有修饰的分泌信号 的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示；
图7是用于孢子表面展示的载体pCrylp-CMCasehis的遗传图； 和
图8示出流式细胞仪分析的结果，用于证实含有融合序列、阳离 子区的羧甲基纤维素酶的孢子表面展示。
实施本发明的最佳方式
首先在此使用的术语“遗传载体”是指在其表面上展示目的蛋白 并具有下列特征的生物体：(1)选自孢子和病毒；(2)具有与目的蛋白形 成非共价键的能力，所述目的蛋白具有所需的解离常数，在内含遗传 载体的宿主细胞中表达；和(3)如果需要，其表面特性能够通过遗传工 程方法进行修饰。
此处所用的术语“宿主细胞”意思不同于涉及蛋白表面展示的现 有出版物所公开和显示的含义。在此所用的术语“宿主细胞”是指表 达目的蛋白并具有下列特性的细胞：(1)能够被编码目的蛋白的基因转 化；(2)能够内含遗传载体如孢子和病毒以及增殖遗传载体；和(3)如果 需要，能够进行遗传操作。
如上所述，在本说明书中，术语“遗传载体”在其表面上展示目 的蛋白，以及“宿主细胞”表达目的蛋白，它们具有严格不同的含义。
在本发明的一个方面，提供了在遗传载体上表面展示的目的蛋白 的制备方法，所述方法包含下列步骤：(a)用含有编码目的蛋白的基因 的载体转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(b)培养转化 的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白；和(c)使表达蛋白和遗传载 体表面之间形成非共价键，以便目的蛋白展示在遗传载体表面上。
在本发明的另一方面，提供了改进目的蛋白的方法，所述方法包 括下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋白的基因，构建目的蛋白的基因 文库；(b)制备含有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内 含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并 在宿主细胞中表达目的蛋白的变体；(e)通过在表达的蛋白变体和遗传 载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体表面上，从而 获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示具有所需特性的目的蛋 白变体的遗传载体。
在本发明的另一方面，提供了从混合物中分离目的物质的方法， 所述方法包括下列步骤：(a)通过突变编码结合蛋白或作为目的蛋白的 结合区的基因，构建编码结合蛋白或其结合区的基因文库；(b)制备含 有构建的基因文库的载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和 病毒的遗传载体的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中 表达结合蛋白或结合区的变体；(e)通过在表达的结合蛋白变体或结合 区变体和遗传载体表面之间形成非共价键以便使变体展示在遗传载体 表面上，从而获取遗传载体文库；和(f)将遗传载体文库与预定的物质 接触，并通过选择在其表面上展示变体结合预定的物质来筛选改进的 结合蛋白或其结合区；(g)将在其表面上展示改进的结合蛋白或其结合 区的遗传载体与混合物接触以从混合物中分离物质。
本发明方法已根据新的概念开发出来，其与常规表面展示方法大 大不同。本发明方法利用了在遗传载体表面上组分的特性，具体利用 了在遗传载体表面上的蛋白和目的蛋白之间的非共价键。本发明的原 理路线利用孢子作为遗传载体，说明性示例在图1中。参照图1，宿 主细胞被携带编码目的蛋白的序列的载体转化，目的蛋白在形成孢子 过程中或之前胞内或胞外表达，并且凭借目的蛋白和宿主细胞中形成 的孢子表面之间的非共价键最终实现目的蛋白的表面展示。
如上所述，本发明的显著特征在于无需表面展示的基元，所述基 元在常规表面展示蛋白的方法中是必需的。由于本发明方法规避了表 面展示基元的必要性，因此蛋白在宿主细胞中表达时，发现难以越过 细胞膜，可在遗传载体表面上充分展示，当宿主细胞裂解露出遗传载 体时，可回收在其表面上展示蛋白的遗传载体。这种回收的目的蛋白 和遗传载体的复合体具有广泛的用途。
根据本发明方法，孢子或病毒可作为遗传载体使用。孢子是优选 的遗传载体，这是由于其具有如下特性(Driks，1999)：(1)较高的热稳 定性；(2)对放射性显著的稳定性；(3)对毒素的稳定性；(4)对酸和碱 较高的稳定性；(5)对溶菌酶显著的稳定性；(6)抗干燥性；(7)对有机 溶剂较高的稳定性；(8)无代谢活性；和(9)较短的获取孢子的时间，例 如几小时。
根据本发明方法，当病毒用作遗传载体时，优选使用噬菌体，以 及在原核宿主细胞中表达的目的蛋白是通过非共价键结合到噬菌体的 外被蛋白而得到表面展示的。如果噬菌体位于宿主细胞的周质中，可 将信号肽与目的蛋白融合，以允许向周质中分泌，从而确保表面展示。 如果目的蛋白不能与噬菌体的外被蛋白自然结合，则为了进行表面展 示，可将其融合到能与噬菌体的外被蛋白结合的基元上。
根据一优选的实施方案，遗传载体具有修饰的表面蛋白以增强与 目的蛋白的非共价键。遗传载体的修饰方法包括：(i)将寡肽或多肽与 遗传载体表面蛋白融合，所述寡肽或多肽增强了目的蛋白与遗传载体 之间的非共价键；(ii)使遗传载体表面蛋白进行定点诱变；和(iii)把遗 传载体表面蛋白进行随机诱变，但不限于此。
在本发明方法中，目的蛋白包括任何蛋白和肽，如激素、激素类 似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其片段、抗体或其片段、单链 抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘着蛋白、结构蛋白、调节蛋 白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、血液凝固蛋白和植物防卫 一诱导蛋白，但不限于此。
本发明所用的结合蛋白或其结合区包括任何能够结合预定的物质 的蛋白或其结构域，例如当分离某种抗原物质时，所述结合蛋白或其 结合区是抗体或其抗体结构域。结合蛋白或结合区包括但不限于蛋白 酶抑制剂、芥菜素(crambin)、肠毒素、芋螺毒素、蜂毒明肽(apaminm) 溶菌酶、核糖核酸酶、卡律蝎毒素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、水蛭蛋 白酶抑制剂、卵类粘蛋白、天青蛋白、肿瘤坏死因子和CD4。
根据本发明方法，单体或多聚体(包括同型多聚体和异型多聚体) 可被表面展示。多聚体蛋白一般只有其所有单体结合时才具有完整的 活性。在常规方法中，已发现多聚体蛋白是以失活形式进行表面展示 的，因为其单体是彼此独立表面展示的。根据本发明方法，多聚体蛋 白可以展示在遗传载体表面上而同时维持其整体结构。
根据优选的实施方案，待表面展示的目的蛋白可以被修饰，以便 增强与遗传载体的非共价键。修饰方法包括：(i)缺失一部分目的蛋白 的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白或其缺失形式融合，所 述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的非共价键；(iii)将目的 蛋白进行定点诱变；和(iv)将目的蛋白进行随机诱变，但不限于此。
使一部分目的蛋白氨基酸缺失的方法可以各种各样的方式进行， 例如通过从目的蛋白的N-端序列(例如信号肽)缺失离子型氨基酸。 由此修饰的目的蛋白增强了与遗传载体的疏水性相互作用，因此可以 较低的解离常数被表面展示。有报道孢子表面携带阴离子电荷。所以 优选阳离子肽与用于表面展示的目的蛋白进行融合。
在本发明方法中，作为编码待转化目的蛋白的基因，两个或更多 个重复序列也是有用的。在两个或更多个重复序列中，重复序列可以 彼此相同或不同。其他组合也可用于融合序列中。此外，转化中所用 的基因可以质粒独立存在于宿主细胞中，或整合到宿主细胞的染色体 中。
目的蛋白的表达可以依靠其自身的启动子或其他可在宿主细胞中 诱导的适当的启动子进行诱导。
根据本发明方法，非共价键，尤其是疏水键、离子键、氢键和范 德瓦耳斯键中的一种或多种，使得目的蛋白与遗传载体之间相互作 用。
根据一优选的实施方案，内含孢子的宿主细胞包括但不限于孢子 形成革兰氏阴性菌如粘球菌(Myxococcus)；孢子形成革兰氏阳性菌如 梭状芽孢杆菌(Clostridium)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和芽孢杆菌 (Bacillus)；孢子形成放线菌(Actionmycete)；孢子形成酵母如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)和汉逊酵母(Hansenulla) 和孢子形成真菌。更优选地，宿主细胞是孢子形成革兰氏阳性菌，以 及最优选地，芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽 孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。 具体而言，枯草芽孢杆菌在某种意义上是有利的，因为对其孢子形成 的遗传知识和实验方法以及培养方法是众所周知的。
根据一优选的实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其删除了胞 内和胞外蛋白酶的生成，所述蛋白酶参与表面展示的目的蛋白的降 解。
虽然本发明方法主要针对通过遗传载体和目的蛋白之间非共价键 的表面展示，但如果需要更稳定的连接，其它共价键也可使用。使遗 传载体表面和目的蛋白之间的键稳定的操作方法可以是使用物理、化 学或生化方法在遗传载体表面和目的蛋白之间形成共价键，接着通过 非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。在形成共价键的方法中， 化学法戊二醛处理(DeSantis G.和Jones J.B.Curr.Opin.Biotechnol.10： 324-330(1999))是优选的，物理法紫外线处理(Graham L.，和Gallop P.M. Anal.Biochem.217：298-305(1994))是优选的，以及生化法酶处理确保 了共价键的形成(Gao Y.，和Mehta K.，J.Biochem.129：179-183 (2001))。
在遗传载体上表面展示的目的蛋白的制备方法中，优选方法进一 步包含筛选在其表面上展示目的蛋白的遗传载体的步骤。
在改进目的蛋白的方法中，通过突变野生型目的蛋白基因来构建 基因文库的步骤是利用：DNA改组方法(Stemmer，Nature，370：389-391 (1994))、StEP方法(Zhao，H.等，Nat.Biotechnol.，16：258-261(1998))、 RPR方法(Shao，Z.等，Nucleic acids Res.，26：681-683(1998))、分子繁 殖方法(Ness，J.E.等，Nat.Biotechnol.，17：893-896(1999))、ITCHY方 法(Lutz S.和Benkovic S.，Current Opinion in Biotechnology，11：319-324 (2000))、易错PCR(Cadwell，R.C.和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2： 28-33(1992))和点诱变(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
根据改进目的蛋白方法的一优选实施方案，遗传载体是孢子，以 及筛选步骤的方式是将孢子文库用选自有机溶剂、热、酸、碱、氧化 剂、干燥、表面活性剂和蛋白酶中的一种或多种进行处理，然后对在 其表面上展示目的蛋白变体、具有处理抗性的孢子加以选择。
根据改进目的蛋白方法的另一优选实施方案，遗传载体是孢子， 以及筛选步骤的方式是将孢子文库先用选自有机溶剂、热、酸、碱、 氧化剂、干燥、表面活性剂中的一种或多种进行处理，接着用蛋白酶 进行二次处理，然后对在其表面上展示目的蛋白变体、具有蛋白酶抗 性的孢子加以选择。
在本发明方法中，筛选步骤的操作依靠：(i)展示在遗传载体表面 上的目的蛋白的活性；(ii)能够识别标记目的蛋白的物质的蛋白；(iii) 能够结合目的蛋白的标记配体；或(iv)能够与目的蛋白特异性结合的 抗体，但不限于此。优选地，通过能够与目的蛋白结合的标记配体或 能够与目的蛋白特异性结合的抗体，将流式细胞仪用于筛选中。例如， 一级抗体结合于展示在孢子表面上的目的蛋白，然后与标记有荧光化 学物质的二级抗体反应以染色孢子，接着用荧光显微镜观察或用流式 细胞仪分析。如果二级抗体是金标记的，则能用电子显微镜观察。通 过测量由此蛋白催化的比色反应，利用目的蛋白的活性进行筛选。
在本发明制备表面展示的目的蛋白以及改进目的蛋白的方法中， 优选的是在所筛选的遗传载体增殖后，具有所需特性的蛋白变体或编 码它们的基因得到回收。
根据利用孢子作为遗传载体的一优选实施方案，孢子回收的操作 方式是通过控制培养时间，使目的蛋白在孢子表面上的展示最大化， 其后培养终止，然后回收孢子。适当的培养时间是变化的，这取决于 所用的细胞类型，例如在使用枯草芽孢杆菌作为宿主的情形下，优选 的培养时间为16-25小时。根据本领域一名技术人员已知的常规方法， 更优选renografin梯度方法(C.R.Harwood等，″Molecular Biological Methods for Bacillus.″John Wiley & Sons，New York，第416页 (1990))，可进行孢子回收。
改进蛋白的方法以高通量方式从野生型中提供(1)催化非生物反应 的酶(例如第尔斯—阿尔德缩合)；(2)具有非自然立体选择性或区域选 择性的酶；(3)在有机溶剂或有机溶剂—水溶液两相体系中具有活性的 酶；和(4)在极端条件如高温或高压下具有活性的酶。此外，为了选择 具有增强的结合亲和性的抗体变体，通常是使pH突然发生变化或调 整碱的浓度，从而洗脱变体。在利用噬菌体或细菌作为载体的方法中， 这种洗脱条件有可能降低噬菌体或细菌在培养基中的生存力。然而， 利用孢子表面展示系统改进蛋白的方法克服了这种障碍。
在本发明的进一步方面，提供了在遗传载体表面上展示目的蛋白 的载体，所述载体包含复制起点、抗生素抗性基因、限制性位点、编 码目的蛋白的基因，其中当目的蛋白在宿主细胞中表达时，其能够与 遗传载体的表面形成非共价键。
根据一优选实施方案，编码目的蛋白的基因是一种突变基因，其 增强遗传载体表面和目的蛋白之间的非共价键。将编码目的蛋白的基 因突变成(i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的 目的蛋白或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载 体之间的非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白 进行随机诱变。
在本发明的进一步方面，提供了微生物转化子，其特征在于转化 子的制备方法是用本发明载体转化内含孢子或病毒的宿主细胞。根据 一优选实施方案，宿主细胞是一种突变细胞，其消除了胞内蛋白酶或 胞外蛋白酶的产生，所述蛋白酶参与降解表面展示的目的蛋白。
在本发明的另一方面，提供了遗传载体和目的蛋白之间的复合 体，其特征在于复合体的制备是根据权利要求1所述的方法在遗传载 体表面上展示激素、激素类似物、酶、酶抑制剂、信号转导蛋白或其 片段、抗体或其片段、单链抗体、结合蛋白或其片段、肽、抗原、粘 着蛋白、结构蛋白、调节蛋白、毒素蛋白、细胞因子、转录调节蛋白、 血液凝固蛋白和植物防卫—诱导蛋白。
根据一优选实施方案，目的蛋白是一种修饰蛋白，其修饰方法是 (i)缺失一部分目的蛋白的氨基酸；(ii)将寡肽或多肽与(i)中的目的蛋白 或其缺失形式融合，所述寡肽或多肽增强目的蛋白与遗传载体之间的 非共价键；(iii)将目的蛋白进行定点诱变；或(iv)将目的蛋白进行随机 诱变。
此外，本发明复合体可具有其它共价键以使遗传载体表面和目的 蛋白之间的键稳定，其中使用物理、化学或生化方法形成共价键，接 着通过非共价键在遗传载体表面上展示目的蛋白。
在本发明复合体中，孢子是优选的遗传载体。如果孢子用作遗传 载体，孢子优选的是非繁殖孢子，其获得途径是选自遗传方法(Popham D.L.等，J.Bacteriol.，181：6205-6209(1999))、化学方法(Setlow T.R. 等，J.Appl.Microbiol.，89：330-338(2000))和物理方法(Munakata N等， Photochem.Photobiol.，54：761-768(1991))中的一种或多种。本发明复 合体仅利用孢子作为目的蛋白的展示手段可排除繁殖孢子的必要性。 可考虑的是经遗传工程改造的生物体有可能受到法律和规章的控制； 因此非繁殖孢子是优选的。造成孢子非繁殖的遗传方法可通过缺失参 与宿主细胞的孢子再生的基因来实施。例如，缺乏cwlD基因的枯草 芽孢杆菌优选用于本发明中。另外，孢子优选衍生自突变的变体，所 述变体通过选自物理方法(Wienc K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56： 2600-2605(1990))、化学方法和遗传方法中的一种或多种增加了其凝 集特性。具有增加的凝集特性的孢子可在以工业规模进行的生物转化 中从所得产物方便地分离出来。
在优选的实施方案中，遗传载体是噬菌体。
在本发明另一方面，提供了在其表面上展示目的蛋白变体的遗传 载体文库，该文库的制备方法包含下列步骤：(a)通过突变编码目的蛋 白的基因，构建目的蛋白的基因文库；(b)制备含有构建的基因文库的 载体文库；(c)用载体文库转化内含选自孢子和病毒的遗传载体的宿主 细胞；(d)培养转化的宿主细胞并在宿主细胞中表达目的蛋白变体；(e) 通过在表达的蛋白变体和遗传载体表面之间形成非共价键以使变体展 示在遗传载体表面上，获取遗传载体文库；和(f)筛选在其表面上展示 具有所需特性的目的蛋白变体的遗传载体。
根据一优选实施方案，遗传载体是孢子或噬菌体。
在本发明的进一步方面，提供了利用具有转化反应活性的蛋白来 进行生物转化的方法，其特征在于所述方法采用遗传载体和目的蛋白 之间的本发明复合体。能够催化(生物)化学反应的任何蛋白包括酶和 酶活性抗体，可用于此生物转化中。
同时，利用表面展示的酶的生物转化方法要求表面展示的遗传载 体在极端条件下的生理化学的稳定性，这是因为所述方法通常在高温 和/或有机溶剂下进行。特别地，在当今工业中有价值的化学合成主要 在有机溶剂中进行，以及手性化合物的合成或外消旋混合物的分辨也 是在高度苛刻的生理化学条件下进行的。所以，表面展示的酶以及展 示酶的生物体被迫在如此极端条件下具有稳定性。就此而论，本发明 利用表面展示的孢子或病毒的生物转化方法显示是大为有利的。
利用表面展示酶的化学方法已有人提出(Georgiou等，1993)。然 而，这种方法一般要求细胞表面用交联剂固定化，因为展示酶的宿主 在此过程中很不稳定(Freeman等，1996)。本发明生物转化方法不含有 上述的缺陷。由于表面展示的酶以及展示酶的遗传载体大都稳定，因 此本发明方法避免了固定化。本发明生物转化方法也可应用于任意类 型的酶，如脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、糖基转移酶、氧化还原酶和 醛缩酶。此外，本发明方法在单步或多步反应以及水溶液或非水溶液 中是有用的。本发明生物转化方法采用遗传载体作为游离或固定的形 式，可采用其他微生物或酶来实施。
在本发明的进一步方面，提供针对脊椎动物抗原的抗体的生产方 法，其特征在于所述方法包含给脊椎动物施用一种组合物，所述组合 物含有免疫学上有效量的在遗传载体和目的蛋白之间的本发明复合 体。根据本发明生产抗体的方法，组合物含有免疫学上有效量的复合 体，优选另包含佐剂，如不完全和完全弗氏佐剂。在本发明方法中， 给药可通过口服和静脉内、腹膜内、皮下和肌内注射进行。第一次给 药后，在适当的期间内加强给药是优选的，以生成足够量的抗体。
与DNA微阵列相似，蛋白质微阵列提供用于分析某些细胞中靶 蛋白的表达或表达水平的手段。为了制造蛋白质阵列，必须获得适当 的待阵列的蛋白，然后固定于固相表面。在利用蛋白质阵列的分析过 程中，清洗步骤必须进行以除去非结合的蛋白，以及各种处理如高温、 高盐浓度和pH调节得以实施；所以，关键是保证拟蛋白物质在这种 有害环境中具有较高的稳定性。此外，制备蛋白质阵列的常规方法需 要乏味和重复的工作，如克隆数千到数万种蛋白的基因并且固定所表 达的蛋白。所以，有需要对该工作的简便和快速进行改进。
根据本发明蛋白质阵列的制备方法，上述工作可确保以更迅速的 方式进行。在本发明方法中，将前述的本发明复合体或遗传载体文库 固定于固相基底上。本发明蛋白质阵列的制备方法是使在其表面上展 示目的蛋白的遗传载体固定于固相基底上。在制备蛋白质阵列的方法 中，可使用常规的方法(参见WO 0061806、WO 0054046、US 5807754、 EP 0818467、WO 9742507、US 5114674和WO 9635953)。由本发明 制造的蛋白质微阵列具有各种各样的可应用领域，包括诊断、基因表 达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配体之间的相互作用 的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合的生化合成和生物 传感器。
本发明方法中适当的固相基底包括但不限于玻璃(例如，功能化 的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO、SiN4、改性的硅氧烷硝化纤维 素、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride)、聚苯乙烯(polystylene)、聚 四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龙、纤维及其组合。遗传载体通过接头分子 可任选连接到阵列基底。阵列表面未被点击的区域优选加以封闭。施 用到各个点(或地址)的遗传载体的量依赖于阵列的种类。连接到固相 基底的遗传载体上展示的蛋白和所施加的样品之间的相互作用可根据 它们固有的特征(例如免疫原性)加以检测或通过标记有独立可检测的 标志(例如荧光、化学发光或放射分子和表位)给予检测。利用已知的 电脑化的系统如“读数仪”和“扫描仪”对用本发明的蛋白质阵列所 产生的数据进行分析。
正如从本申请的所有说明中所了解的，本发明表面展示方法利用 适合于所有本发明方法的遗传载体，具有若干优点：(1)避免需要表面 展示的基元；(2)确保目的蛋白具有其完整的活性，其作用方式是目的 蛋白在表达后形成其固有的结构，并且展示在表面上；(3)增加目的 蛋白表面展示的量，这是因为蛋白通过非共价键即以非选择的方式加 以展示；和(4)尽管表面展示的蛋白量得到增加，但是对遗传载体的存 活力和周围环境的抗性没有或很少有影响。
下列特定的实施例旨在说明本发明，不应理解成如所附权利要求 所限定的那样限制本发明的范围。
实施例
实施例1：对孢子表面展示纯的分离的脂肪酶的确认
胞质蛋白能否如以前报道的外被蛋白或结构蛋白(形态发生素)那 样结合和展示在孢子表面仍有待证实。根据孢子表面的疏水特性 (Wiencek，K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.，56：2600-2605(1990))， 本发明人假设含有疏水区的蛋白如脂肪酶(Brockerhoff H.，Chem.Phys. Lipids，10：215(1973))可通过疏水键连接并展示在孢子表面上。该假设 的证实是在脂肪酶附着到从枯草芽孢杆菌中分离的纯孢子上后测定其 酶活性，该酶纯化自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
首先，将枯草芽孢杆菌DB104菌株(Kawamura F.和Doi R.H.，J. Bacteriol.，160：442-444(1984))在GYS培养基((NH4)2SO42g/l、酵母 提取物2g/l、K2HPO40.5g/l、葡萄糖1g/l、MgSO4·H2O 0.41g/l、 CaCl2·2H2O 0.08g/l、MnSO4·5H2O 0.07g/l)中摇床(37℃，250rpm) 培养24小时，以及利用renografin梯度方法仅分离纯化的孢子(C.R. Harwood等，″Molecular Biological Methods for Bacillus.″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))。在显微镜下验证纯的分离的孢子 (1000x，ALPHAPHOT-2，Nikon)。
将2mg纯的分离的芽孢杆菌孢子和94μg部分纯化的假单胞菌 脂肪酶(Ahn，J.H.等，J.Bacteriol.，181：1847-1852(1999))混合到2001 的50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，4℃下无搅动反应12小时，然后离 心使孢子从缓冲液中分离出来。接着，分离的孢子用0.5ml的50mM Tris缓冲液(pH8.0)漂洗三次，最后将脂肪酶附着的孢子进行纯化。为 了测定附着在孢子上的脂肪酶活性，将脂肪酶附着的孢子悬浮在添加 有10％橄榄油的PBS缓冲液中反应48小时，上清液用0.2ml铜酸 (cupric acid)处理，以及在715nm处测定最终的OD。上清液的结果显 示脂肪酶活性通过橄榄油从脂肪酶附着的孢子中释放出来(图2)。在图 2中，线(1)代表脂肪酶附着的孢子，线(2)代表无脂肪酶附着的对照， 以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。
这些结果显示由于疏水作用，脂肪酶仅能通过吸附结合到孢子表 面。
这些结果举例说明具有疏水性的任何蛋白都可展示在孢子上，本 领域的那些技术人员应理解，当蛋白在细胞中表达或分泌到胞外时， 具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面上。
实施例2：野生型脂肪酶在孢子表面上的展示
对宿主细胞中表达的野生型脂肪酶的孢子展示进行如下检查：质 粒pBS：lipA(Bell P.J.L.等，Biotechnol.Lett.，21：1003-1006(1999))由 澳大利亚的Bergquist博士赠送。利用lipl(SEQ ID NO：1)和lip2(SEQ ID NO：2)为引物及pBS：lipA质粒为模板进行PCR。Taq聚合酶购自 Boehringer Mannheim，PCR共35次循环，条件为94℃变性30秒、55 ℃退火30秒以及72℃延伸1分钟。
然后，将各个扩增的PCR产物用BamHI和KpnI限制性酶切， 并克隆到切去预先克隆的羧甲基纤维素酶基因后的质粒pCrylP- CMCase同样的限制性位点中，并通过自然转化方法(C.R.Harwood 等，″枯草芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological methods for Bacillus)″John Wiley & Sons，New York，第416页(1990))将该克隆的 质粒转化到枯草芽孢杆菌DB104中。在以实施例1相同的方式从转化 的芽孢杆菌菌株分离孢子后，测定纯的分离的孢子中的脂肪酶活性(图 3)。在图3中，线(1)代表展示有野生型脂肪酶的孢子，线(2)为对照孢 子的结果，以及水平线是指脂肪酶活性的反应时间。这些结果显示， 利用本发明的孢子展示系统，具有疏水性的蛋白可展示在孢子表面。
该实施例中表达的脂肪酶的N-端含有分泌信号肽，导致胞外分 泌。分泌的酶可附着到在孢子形成后暴露于培养基的孢子表面。此外， 尽管存在分泌性信号肽，非分泌酶在孢子形成过程中由于疏水特性 (Bron S.，J.Biotechnol.，64：313(1998))也可附着到孢子表面上。
结果一目了然，具有疏水性的蛋白可展示到孢子表面，不管蛋白 是胞内表达还是胞外分泌。
实施例3：野生型羧甲基纤维素酶在孢子表面上的展示
为了在孢子表面上展示羧甲基纤维素酶，将分离自枯草芽孢杆菌 BSE616菌株的羧甲基纤维素酶基因(Park S.H.等，Agric.Biol.Chem.， 55：441-448(1991))克隆在苏云金芽孢杆菌菌株的crylAa毒素基因的启 动子的控制之下。
首先，利用1AP1(SEQ ID NO：3)和1AP2(SEQ ID NO：4)为引物， 通过Kalman S.等方法(Appl.Environ.Microbiol.，59：1131-1137(1993)) 从购自BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，Ohio，USA)的苏云金芽孢 杆菌库斯塔基亚种(Bacillus thurigiensis kurstaki)HD1菌株中分离的 DNA为模板，以实施例2相同的条件，由PCR扩增crylAa启动子。 将PCR产物克隆到购自Promega公司(USA)的载体pGemT-easy中， 随后用SphI和SalI消化，并克隆到质粒pUC19(GenBank X02514)同 样的限制性位点中。质粒pUC19再次用HindIII和BamHI限制性酶切 割，并把所得的片段插入到pCPaC3(KCTC 0831BP)同样的限制性位 点中，由此构建pCrylP-CMCase。pCrylP-CMCase是一种穿梭载体， 其在大肠杆菌和芽孢杆菌菌株中均可复制。
将最终构建的质粒pCrylP-CMCase通过自然转化方法转化到枯草 芽孢杆菌DB104菌株中。其他方法如接合或转导也可用于使重组载体 导入到芽孢杆菌菌株中。其后，由pCrylP-CMCase转化的芽孢杆菌菌 株在GYS培养基中摇床(37℃，250rpm)培养24小时，并利用renografin 梯度方法仅分离纯的孢子。
对分离的孢子中的羧甲基纤维素酶活性进行如下测定：首先，将 100μl密度为OD(600nm)＝1.4的孢子悬浮液的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)与200μl的1％羧甲基纤维素的0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)混合， 然后50℃反应40分钟。反应后，向反应溶液中加入900μl的DNS 溶液(20％酒石酸钾钠、1％NaOH、0.05％NaHSO3、0.2％苯酚、1％3，5- 二硝基水杨酸)，加热5分钟，然后在冷水中冷却。离心后上清液的光 密度在波长575nm处进行测定。与对照0mU比较，展示在孢子表面 上的羧甲基纤维素酶的活性为1.96mU。
在另一确认方法中，当通过Kim等(Appl.Environ，Microbiol.，66： 788-793(2000))的方法利用羧甲基纤维素酶特异抗体(Kim等，Appl. Environ，Microbiol.，66：788-793(2000))来操作流式细胞仪(FACSort， Becton Dickinson，USA)时，流式细胞仪也显示在转化有pCrylP- CMCase的芽孢杆菌菌株的孢子表面上展示羧甲基纤维素酶(图4)。在 图4中，线1代表对照孢子，线2是指由pCrylP-CMCase转化的芽孢 杆菌菌株的孢子，垂直线表示孢子数，以及水平线为荧光强度。如图 4所示，与对照比较，在展示羧甲基纤维素酶的孢子中峰移向右边， 这说明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合在转化有质粒 pCrylP-CMCase的孢子表面上。结果，羧甲基纤维素酶附着在转化有 pCrylP-CMCase的孢子表面上。
该实施例中表达的羧甲基纤维素酶的N-端含有分泌信号肽，导 致胞外分泌。虽然分泌的酶有可能附着到在孢子形成后暴露于培养基 的孢子表面，但是非分泌酶尽管存在分泌性信号肽(Bron S.，J. Biotechnol.，64：313(1998))，由于信号肽的疏水特性也可附着到孢子 上。因此可以理解，任何具有分泌信号的蛋白通过本发明的孢子表面 展示系统能在孢子表面上得以展示。
实施例4：具有修饰的分泌信号的羧甲基纤维素酶的孢子展示
N-端分泌信号肽一般包含N-端2-3个阳离子型氨基酸残基，接着 是疏水区，阳离子型氨基酸通过与细胞膜的阴离子磷脂结合使得蛋白 分泌(Tjalsma H.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64：515-547(2000))。另外， 用中性氨基酸取代阳离子型氨基酸已知会导致分泌降低(Chen M.和 Nagarajan V.，J.Bacteriol.，176：5796-5801(1994))。基于上述事实，本 发明人假设蛋白分泌的降低会增加胞内蛋白，并且由于蛋白的N-端疏 水区，导致蛋白在孢子表面上更高的展示。为了试图证明此假设，进 行了如下实验。
为了用仅含有疏水区而不含阳离子型氨基酸残基的分泌信号克隆 羧甲基纤维素酶，将法国巴斯德研究所(Pasteur Institute in France)的F. Kunst博士赠送的枯草芽孢杆菌168菌株的DNA(Nature，390：249-256 (1997))通过Kalman等方法分离。其后，利用引物cmc-hp(SEQ NO：5) 和另一引物(SEQ NO：6)以及与实施例2同样条件分离的DNA为模板 进行PCR。
随后，用BamHI和SacI消化PCR产物，并克隆到已切去CMCase 基因的pCrylP-CMCase中。通过自然转化方法，将pCrylP-CMCase-hp (图5)转化到枯草芽孢杆菌DB104中。所得转化子命名为“枯草芽孢 杆菌BSK209”，于2000年12月2日保藏在国际保藏机构韩国典型 培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 0902BP。SEQ ID NO：7是 指在其信号肽中缺乏阳离子型氨基酸的CMCase的DNA序列，而SEQ ID NO：8是指其CMCase的氨基酸序列。
然后，将转化的芽孢杆菌菌株BSK209培养在摇床(37℃，250rpm) 中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。
与对照0mU比较，以实施例3所述的同样方法，分离孢子的羧 甲基纤维素酶活性为4.74mU。该结果比野生型高出2.4倍，并显示 比野生型有更多的酶得到展示。此外，以实施例3的同样方式，流式 细胞仪利用羧甲基纤维素酶，显示有更多的酶展示在转化有pCrylP- CMCase-hp的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图6)。
在图6中，线1是指对照孢子，而线2是用质粒pCrylP-CMCase-hp 转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图6所示，与图4所示的野生型羧甲 基纤维素酶比较，峰移向右边，这显示有更多的羧甲基纤维素酶结合 到孢子表面。结果，其分泌信号仅含疏水区而不含阳离子残基的羧甲 基纤维素酶是孢子展示的中意形式。
从这些结果中可以理解，N-端阳离子信号氨基酸的缺失或中和在 孢子展示中可利用来得到更多的便利。此外，信号肽的疏水区或其他 不含信号肽的目的蛋白的疏水区显然可用于孢子展示。再者，通过选 择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，或通过融合其他增强 载体蛋白和目的蛋白之间的非共价键合的寡肽或多肽，疏水性增加， 显然也会在孢子表面上增强目的蛋白的展示。
实施例5：利用离子结构域进行孢子表面展示羧甲基纤维素酶
如实施例1所示，尽管芽孢杆菌的孢子表面是疏水的，但是也有 阴离子型氨基酸残基(Nishihara T.等，Microbiol.Immunol.，25：763771 (1981))。本发明人假设目的阳离子蛋白可由离子键展示，而阳离子基 元融合到无阳离子特性的目的蛋白将能在孢子表面上展示目的蛋白。 为了试图证实这种假设，实施了如下实例。
为了使阳离子结构域融合到羧甲基纤维素酶上，利用下列引物将 6个组氨酸残基融合到酶的成熟形式的N-端。首先，利用引物cmc-his (SEQ ID NO：9)和引物cmc-ter(SEQ ID NO：10)以及枯草芽孢杆菌168 的DNA为模板在与实施例2相同的条件下进行PCR。
随后，PCR产物用BamHI和SacI限制性酶切，并克隆到实施例 3所述的pCrylP-CMCase而非CMCase基因中。把构建的质粒pCrylP- CMCase-his(图7)通过自然转化方法转化到枯草芽孢杆菌DB104中。 SEQ ID NO：11是指在其N-端区域融合有6个组氨酸残基的CMCase 的基因序列，而SEQ No.12是指其氨基酸序列。
然后，将转化有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌菌株培养在摇床 (37℃，250rpm)中，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。
以实施例3所述的相同方法，与对照0mU比较，分离孢子的羧 甲基纤维素酶活性为1.90mU，以及利用羧甲基纤维素酶特异的抗体 以实施例3相同的方式操作流式细胞仪，显示酶展示在用pCrylP- CMCase-his转化的芽孢杆菌菌株的孢子表面上(图8)。
在图8中，线1是指对照孢子，线2代表用质粒pCrylP-CMCase-his 转化的芽孢杆菌菌株的孢子。如图8所示，与对照比较，峰移至右边， 这表明有更多的特异于羧甲基纤维素酶的抗体结合于孢子表面。这些 结果显示其N-端含有其他阳离子结构域的羧甲基纤维素酶结合于转化 有pCrylP-CMCase-his的芽孢杆菌的孢子表面。
所以，通过选择性或随机诱变基因或通过与任何蛋白中的阳离子 结构域融合，阳离子特性增加显然会增强孢子展示。此外，融合其他 寡肽或多肽，增强遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间的非共价键，或 通过选择性或随机诱变编码遗传载体表面蛋白的基因，增加阴离子特 性，会提高孢子表面展示阳离子目的蛋白。
根据实施例的结果，显示通过融合其他序列增加表面展示，可以 想象的是把结合配偶体如抗体—抗原或配体—受体融合到目的蛋白和 遗传载体表面蛋白有助于表面展示。
另应理解，通过戊二醛、紫外线或酶处理，催化共价键的形成， 由此在遗传载体表面蛋白和目的蛋白之间形成其他共价键，所展示的 目的蛋白会更加得以稳定。
实施例6：在噬菌体表面上展示目的蛋白
根据上述实施例所证实的事实和发现，能够与噬菌体的外被蛋白 结合的目的蛋白可展示在噬菌体表面上是一目了然的。这种可能性证 实如下：而且，不能结合于噬菌体表面的目的蛋白通过融合能结合于 外被蛋白的基元可在噬菌体表面上加以展示，这也是很有可能的。
首先，把疏水结构域融合到噬菌体的外被蛋白和目的蛋白上。此 外，还融合向胞质分泌的信号肽。当它们在宿主细胞中表达时，所分 泌的目的蛋白通过与位于胞质中的噬菌体的外被蛋白疏水作用，在噬 菌体表面上得以展示。
根据此实施例中的发现，通过其他键合而非疏水作用能够展示的 修饰对本领域那些技术人员来说是一目了然的。
实施例7：利用在遗传载体上的展示方法定向进化目的蛋白
利用本发明中设计的展示系统，有可能实施目的蛋白的定点进 化，其中表面展示由目的蛋白和遗传载体表面之间的相互作用来实 现。首先，以羧甲基纤维素酶基因为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C. 和Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。采用特异于羧甲 基纤维素酶基因的引物和以实施例3中所述的质粒pCPaC3为模板， 进行PCR。
PCR混合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、 PCR溶液(10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v) 明胶)、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15 mM MnCl2、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。 在下列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30 秒以及72℃延伸1分钟。
随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制载体中，并通 过自然转化方法用克隆的载体转化枯草芽孢杆菌DB104，以及通过在 摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24小时，将羧甲基纤维素酶在孢子 表面上得以展示，并通过renografin梯度方法分离纯的孢子。其后， 如实施例3所述，利用羧甲基纤维素酶活性的变化或采用特异于羧甲 基纤维素酶的抗体的流式细胞仪的变化，对具有改性羧甲基纤维素酶 的孢子加以选择。
实施例8：利用遗传载体表面展示目的蛋白进行生物转化
利用有机溶剂中的脂肪酶进行生物转化已有报道(Zaks，A.等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)；和Klibanow，A.M.，CHEMTECH， 16：354(1986))。没有酶的失活对实施反应是必不可少的。为了达到此 目的，按惯例一直采用脂肪酶的固定(Mustranta，A.Forssell等，Enz. Microb.Technol.，15：133(1993)；和Reetz，M.T.等，J.Biotechnol. Biogen.，49：527(1996))。根据这些报道，固定的脂肪酶在有机溶剂中 保持高的稳定性，并与游离的脂肪酶比较，合成增加。
首先，根据本发明将脂肪酶展示孢子的表面上，以及如所述进行 生物转化(Zaks，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：3192(1985)； Klibanow，A.M.，CHEMTECH，16；354(1986))。
本发明的生物转化也可通过在抗有机溶剂的病毒表面上展示目的 蛋白来进行。
实施例9：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白的蛋白质阵列
采用自动化阵列装置，将106-109个展示抗特异表面抗原的单克 隆抗体的孢子附着到玻璃基底上用于在其表面上含有醛官能团的蛋白 质阵列(BMS，Germany)。附着以共价键的形式进行，所述共价键是孢 子表面上蛋白的氨基和载玻片表面上的醛基之间的席夫碱。虽然在固 相表面上附着的展示蛋白有可能是失活的，但它们可具有方向性。
根据本发明制造的蛋白质阵列试剂盒具有各种各样的应用领域， 包括诊断、基因表达的分析、蛋白质之间相互作用的分析、蛋白和配 体之间的相互作用的分析、代谢的研究、筛选新型或改进的酶、组合 的生化合成和生物传感器。
实施例10：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白生产抗体
通过展示能够体内诱导免疫应答的抗原，抗体可被诱导。
首先，通过自然转化方法，将实施例3中所用的含有羧甲基纤维 素酶的pCrylP-CMCase作为抗原转化到枯草芽孢杆菌DB104中。然 后，通过在补充有GYS培养基的摇床中培养转化的芽孢杆菌菌株24 小时，将羧甲基纤维素酶展示在孢子表面上。随后，通过renografin 梯度方法分离纯的孢子。将抗原—展示的孢子重悬浮于PBS中，并加 入相同体积的佐剂。其后，通过旋涡混合上述溶液，并静脉内注射到 出生后6-8周龄的BALB/c小鼠中。4周后，进行第二次注射。通过2-3 次加强诱导抗体。
实施例11：利用遗传载体上表面展示的目的蛋白分离特异物质
利用遗传载体展示结合区从混合物中分离特异物质是可能的。首 先，采用编码结合区的基因作为模板进行易错PCR(Cadwell，R.C.和 Joyce，G.F.，PCR Methods Appl.，2：28-33(1992))。利用特异于目的基 因的引物以及含有目的基因或染色体的质粒模板，进行PCR。PCR混 合物的制备方法是混合0.3μM各种引物、5ng DNA模板、PCR溶液 (10mM Tris(pH8.3)、50mM KCl、7mM MgCl2、0.01％(w/v)明胶)、 0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dTTP、1mM dCTP、0.15mM MnCl2、5U Bioneer(Korea)的Taq聚合酶和蒸馏水补至100μl。在下 列条件下共进行13个循环的PCR：94℃变性30秒、50℃退火30秒 以及72℃延伸1分钟。
随后，将上述PCR扩增的插入片段克隆到可复制的载体中以在 宿主细胞中构建文库。用克隆载体文库转化宿主细胞，使结合区在宿 主细胞中表达并在遗传载体表面上展示，并对具有目标特性的载体展 示修饰的结合区进行筛选。通过与混合物混合，将筛选的遗传载体分 离、繁殖、表达并用于分离特异物质。
如上所述，本发明方法用于制备在遗传载体上表面展示的目的蛋 白，可用来在缺乏展示基元的情况下在遗传载体表面上展示各种各样 的蛋白，目的蛋白在形成其固有结构后，由于展示可获取完全的活性， 并且目的蛋白表达和展示的量的增加从来不降低对环境的抗性和遗传 载体的生存力。
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根据布达佩斯条约用于专利程序的微生物保藏国际识别
国际表格
原始保藏收据
根据第7.1条颁布
授予人：潘在龟
大韩民国大田广域市305-340儒城区道龙洞380-43 I.微生物的识别 保藏者给出的识别号： 枯草芽孢杆菌BSK209 国际保藏单位给出的登记号： KCTC 0902BP II.科学描述和/或建议的分类名称 有关I识别的微生物： (×)科学描述 ()建议的分类名称 (×表示适用) III.接收 国际保藏单位已接收I识别的微生物，收到日：2000年12月2日 IV.国际保藏单位 名称：韩国典型培养物保藏中心 地址：大韩民国大田广域市305-333 韩国生物科学和生物技术研究所(KRIBB) 国际保藏单位授权官签名： DAE Kyung Sook，Director 日期：2000.12.7.
序列表
<110>格诺福库斯株式会社(GENOFOCUS Co.，Ltd.)
<120>在遗传载体上表面展示蛋白的方法
(Method for Surface Display of Proteins on Genet ic Carriers)
<130>SCT031940-47
<150>KR2001-2156
<151>2001-01-15
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对脂肪酶基因进行PCR的有义引物
<400>1
ggggatccgt tggaaggaga gggagaac 28
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对脂肪酶基因进行PCR的反义引物
<400>2
gcggtacctt tttgtccgtt ctcctga 27
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对crylAa启动子进行PCR的有义引物
<400>3
tccccgcggg actcttccta tatttactt 29
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对crylAa启动子进行PCR的反义引物
<400>4
atttgtacag gaaatgcgtc 20
<210>5
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>5
ggatccgggg aggagaatca tgatctctat ttttattacg tg 42
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变CMCase基因进行PCR的反义引物
<400>6
gagctccagt at ttcatcca caacgc 26
<210>7
<211>1491
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有突变的信号序列以增强其疏水性的CMCase基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1488)
<400>7
atg atc tct att ttt att acg tgt tta ttg att acg tta ttg aca atg 48
Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met
1 5 10 15
ggc ggc atg ctg gct tcg ccg gca tca gca gca ggg aca aaa acg cca 96
Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro
20 25 30
gta gcc aag aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac 144
Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn
35 40 45
cga gac ggt aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg 192
Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu
50 55 60
caa tgg tat gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg 240
Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg
65 70 75 80
gac gat tgg ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat 288
Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp
85 90 95
ggc ggt ata att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg 336
Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala
100 105 110
gtt gaa gcg gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat 384
Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His
115 120 125
atc tta aat gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa 432
Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu
130 135 140
ttc ttc aag gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att 480
Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile
145 150 155 160
tat gaa att gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat 528
Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp
165 170 175
att aaa ccg tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat 576
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp
180 185 190
cca gac aac att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg 624
Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
195 200 205
aat gat gct gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca 672
Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala
210 215 220
ctt cat ttt tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca 720
Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala
225 230 235 240
aac tat gca ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga 768
Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly
245 250 255
aca agc gac gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg 816
Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg
260 265 270
gaa tgg ctg aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg 864
Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp
275 280 285
aat ctt tct gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca 912
Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala
290 295 300
tct aaa aca ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca 960
Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr
305 310 315 320
ttc gtt aga gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att 1008
Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile
325 330 335
cct gaa acg cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct 1056
Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser
340 345 350
gta caa tac aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt 1104
Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg
355 360 365
ccg cag ctt caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa 1152
Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys
370 375 380
gat gtc act gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac 1200
Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn
385 390 395 400
gtt gac tgt gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag 1248
Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys
405 410 415
ttt gtg acg ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa 1296
Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
420 425 430
ctt gga ttt aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat 1344
Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn
435 440 445
att cag ctt cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc 1392
Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser
450 455 460
ggc gat tat tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa 1440
Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys
465 470 475 480
atc aca tta tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat 1488
Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
485 490 495
ta g 1491
<210>8
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met Ile Ser Ile Phe Ile Thr Cys Leu Leu Ile Thr Leu Leu Thr Met
1 5 10 15
Gly Gly Met Leu Ala Ser Pro Ala Ser Ala Ala Gly Thr Lys Thr Pro
20 25 30
Val Ala Lys Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn
35 40 45
Arg Asp Gly Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu
50 55 60
Gln Trp Tyr Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg
65 70 75 80
Asp Asp Trp Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp
85 90 95
Gly Gly Ile Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala
100 105 110
Val Glu Ala Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His
115 120 125
Ile Leu Asn Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu
130 135 140
Phe Phe Lys Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile
145 150 155 160
Tyr Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp
165 170 175
Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp
180 185 190
Pro Asp Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
195 200 205
Asn Asp Ala Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala
210 215 220
Leu His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly
245 250 255
Thr Ser Asp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg
260 265 270
Glu Trp Leu Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp
275 280 285
Asn Leu Ser Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala
290 295 300
Ser Lys Thr Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile
325 330 335
Pro Glu Thr Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser
340 345 350
Val Gln Tyr Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg
355 360 365
Pro Gln Leu Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys
370 375 380
Asp Val Thr Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn
385 390 395 400
Val Asp Cys Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys
405 410 415
Phe Val Thr Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu
420 425 430
Leu Gly Phe Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn
435 440 445
Ile Gln Leu Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser
450 455 460
Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys
465 470 475 480
Ile Thr Leu Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
485 490 495
<210>9
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变的CMCase基因进行PCR的有义引物
<400>9
ggatccgggg aggagaatca tgcaccatca ccaccaccac gcagggacaa aaacgcca 58
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对突变的CMCase基因进行PCR的反义引物
<400>10
gagctccagt atttcatcca caacgc 26
<210>11
<211>1434
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>含有额外的组氨酸编码序列的CMCase基因
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1431)
<400>11
atg cac cat cac cac cac cac gca ggg aca aaa acg cca gta gcc aag 48
Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys
1 5 10 15
aat ggc cag ctt agc ata aaa ggt aca cag ctc gtt aac cga gac ggt 96
Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly
20 25 30
aaa gcg gta cag ctg aag ggg atc agt tca cac gga ttg caa tgg tat 144
Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr
35 40 45
gga gaa tat gtc aat aaa gac agc tta aaa tgg ctg agg gac gat tgg 192
Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp
50 55 60
ggt atc acc gtt ttc cgt gca gcg atg tat acg gca gat ggc ggt ata 240
Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile
65 70 75 80
att gac aac ccg tcc gtg aaa aat aaa atg aaa gaa gcg gtt gaa gcg 288
Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala
85 90 95
gca aaa gag ctt ggg ata tat gtc atc att gac tgg cat atc tta aat 336
Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn
100 105 110
gac ggt aat cca aac caa aat aaa gag aag gca aaa gaa ttc ttc aag 384
Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys
115 120 125
gaa atg tca agc ctt tac gga aac acg cca aac gtc att tat gaa att 432
Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile
130 135 140
gca aac gaa cca aac ggt gat gtg aac tgg aag cgt gat att aaa ccg 480
Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro
145 150 155 160
tat gcg gaa gaa gtg att tcc gtt atc cgc aaa aat gat cca gac aac 528
Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn
165 170 175
att atc att gtc gga acc ggt aca tgg agc cag gat gtg aat gat gct 576
Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala
180 185 190
gcc gat gac cag cta aaa gat gca aac gtt atg gac gca ctt cat ttt 624
Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe
195 200 205
tat gcc ggc aca cac ggc caa ttt tta cgg gat aaa gca aac tat gca 672
Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala
210 215 220
ctc agc aaa gga gca cct att ttt gtg aca gag tgg gga aca agc gac 720
Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp
225 230 235 240
gcg tct ggc aat ggc ggt gta ttc ctt gat caa tcg agg gaa tgg ctg 768
Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu
245 250 255
aaa tat ctc gac agc aag acc atc agc tgg gtg aac tgg aat ctt tct 816
Lys Tyr Leu Asp Scr Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Lcu Ser
260 265 270
gat aag cag gaa tca tcc tca gct tta aag ccg ggg gca tct aaa aca 864
Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr
275 280 285
ggc ggc tgg cgg ttg tca gat tta tct gct tca gga aca ttc gtt aga 912
Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg
290 295 300
gaa aac att ctc ggc acc aaa gat tcg acg aag gac att cct gaa acg 960
Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr
305 310 315 320
cca gca aaa gat aaa ccc aca cag gaa aac ggt att tct gta caa tac 1008
Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr
325 330 335
aga gca ggg gat ggg agt atg aac agc aac caa atc cgt ccg cag ctt 1056
Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu
340 345 350
caa ata aaa aat aac ggc aat acc acg gtt gat tta aaa gat gtc act 1104
Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr
355 360 365
gcc cgt tac tgg tat aac gcg aaa aac aaa ggc caa aac gtt gac tgt 1152
Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys
370 375 380
gac tac gcg cag ctt gga tgc ggc aat gtg aca tac aag ttt gtg acg 1200
Asp Tyr Ala Gln Leu Gly Cys Gly Asn Val Thr Tyr Lys Phe Val Thr
385 390 395 400
ttg cat aaa cca aag caa ggt gca gat acc tat ctg gaa ctt gga ttt 1248
Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe
405 410 415
aaa aac gga acg ctg gca ccg gga gca agc aca ggg aat att cag ctt 1296
Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu
420 425 430
cgt ctt cac aat gat gac tgg agc aat tat gca caa agc ggc gat tat 1344
Arg Leu His Asn Asp Asp Trp Ser Asn Tyr Ala Gln Ser Gly Asp Tyr
435 440 445
tcc ttt ttc aaa tca aat acg ttt aaa aca acg aaa aaa atc aca tta 1392
Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu
450 455 460
tat gat caa gga aaa ctg att tgg gga aca gaa cca aat tag 1434
Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
465 470 475
<210>12
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Met His His His His His His Ala Gly Thr Lys Thr Pro Val Ala Lys
1 5 10 15
Asn Gly Gln Leu Ser Ile Lys Gly Thr Gln Leu Val Asn Arg Asp Gly
20 25 30
Lys Ala Val Gln Leu Lys Gly Ile Ser Ser His Gly Leu Gln Trp Tyr
35 40 45
Gly Glu Tyr Val Asn Lys Asp Ser Leu Lys Trp Leu Arg Asp Asp Trp
50 55 60
Gly Ile Thr Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ile Asp Asn Pro Ser Val Lys Asn Lys Met Lys Glu Ala Val Glu Ala
85 90 95
Ala Lys Glu Leu Gly Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile Leu Asn
100 105 110
Asp Gly Asn Pro Asn Gln Asn Lys Glu Lys Ala Lys Glu Phe Phe Lys
115 120 125
Glu Met Ser Ser Leu Tyr Gly Asn Thr Pro Asn Val Ile Tyr Glu Ile
130 135 140
Ala Asn Glu Pro Asn Gly Asp Val Asn Trp Lys Arg Asp Ile Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ala Glu Glu Val Ile Ser Val Ile Arg Lys Asn Asp Pro Asp Asn
165 170 175
Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val Asn Asp Ala
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Ala Asp Asp Gln Leu Lys Asp Ala Asn Val Met Asp Ala Leu His Phe
195 200 205
Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Phe Leu Arg Asp Lys Ala Asn Tyr Ala
210 215 220
Leu Ser Lys Gly Ala Pro Ile Phe Val Thr Glu Trp Gly Thr Ser Asp
225 230 235 240
Ala Ser Gly Asn Gly Gly Val Phe Leu Asp Gln Ser Arg Glu Trp Leu
245 250 255
Lys Tyr Leu Asp Ser Lys Thr Ile Ser Trp Val Asn Trp Asn Leu Ser
260 265 270
Asp Lys Gln Glu Ser Ser Ser Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ser Lys Thr
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Gly Gly Trp Arg Leu Ser Asp Leu Ser Ala Ser Gly Thr Phe Val Arg
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Glu Asn Ile Leu Gly Thr Lys Asp Ser Thr Lys Asp Ile Pro Glu Thr
305 310 315 320
Pro Ala Lys Asp Lys Pro Thr Gln Glu Asn Gly Ile Ser Val Gln Tyr
325 330 335
Arg Ala Gly Asp Gly Ser Met Asn Ser Asn Gln Ile Arg Pro Gln Leu
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Gln Ile Lys Asn Asn Gly Asn Thr Thr Val Asp Leu Lys Asp Val Thr
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Ala Arg Tyr Trp Tyr Asn Ala Lys Asn Lys Gly Gln Asn Val Asp Cys
370 375 380
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Leu His Lys Pro Lys Gln Gly Ala Asp Thr Tyr Leu Glu Leu Gly Phe
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Lys Asn Gly Thr Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Gly Asn Ile Gln Leu
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Ser Phe Phe Lys Ser Asn Thr Phe Lys Thr Thr Lys Lys Ile Thr Leu
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Tyr Asp Gln Gly Lys Leu Ile Trp Gly Thr Glu Pro Asn
465 470 475
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 蜂毒肽在制备治疗和/或预防糖尿病的药物或保健品中的用途 | 2020-05-21 | 745 |
| 一种生产蜂毒肽的方法 | 2020-05-11 | 552 |
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| 一种低溶血活性的改良型蜂毒肽及其应用 | 2020-05-19 | 674 |
| 蜂毒肽及其应用 | 2020-05-11 | 280 |
| 蜂毒阴离子抗菌肽AcHy-a2、其制备方法及应用 | 2020-05-18 | 302 |
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