专利汇可以提供一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法,利用融合技术在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽LL-37-Melittin,人工设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin,在两端加入了EcoR I和BamH I酶切位点,合成的融合基因与表达载体pGJ148连接,成功构建了重组表达载体,转化至枯草芽抱杆菌WB800N中,得到表达工程菌。在培养基中,经麦芽糖诱导表达,表达产物采用Ni-NAT亲和层析法进行纯化,利用SDS-PAGE检测其正确性,SUMO蛋白酶酶切得到抗菌肽LL-37-Melittin。本发明方法在枯草芽抱杆菌中表达了抗菌肽,分离纯化简单,易操作。表达产物对多种细菌有抑菌活性,热 稳定性 好,适于大规模工业化生产,可应用于医药、食品、 畜牧业 等领域。,下面是一种抗菌肽LL-37-Melittin及其应用和在枯草芽抱杆菌中的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种抗菌肽LL-37-Melittin,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽LL-37-Melittin,其特征在于,编码所述抗菌肽LL-37-Melittin的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽LL-37-Melittin在制备治疗细菌、真菌疾病药物、动物饲料添加剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述的抗菌肽LL-37-Melittin为能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酿酒酵母菌的药物或添加剂。
5.一种在枯草芽抱杆菌中制备权利要求1所述抗菌肽LL-37-Melittin的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、截取人源抗菌肽LL-37第14~21位氨基酸,蜂毒素Melittin第5~12位氨基酸,设计融合基因SUMO-LL-37-Melittin;
S2、将步骤S1所述融合基因SUMO-LL-37-Melittin与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌质粒载体pGJ148进行EcoR I和BamH I双酶切,切胶回收目的基因和载体骨架,在T4DNA ligase,过夜连接,构建重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin;
S3、将步骤S2构建的重组质粒pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin电转化至克隆菌株大肠杆菌DH5α中,蓝白斑筛选获得阳性菌株,提取质粒,酶切、菌落PCR鉴定;
S4、将步骤S3鉴定正确的重组菌株提取质粒后转化至表达菌株枯草芽孢杆菌WB800N中,获得重组表达工程菌pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N;
S5、将步骤S4所得重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N以麦芽糖为诱导剂诱导,获得表达产物;
S6、将步骤S5所得表达产物进行分离纯化和SUMO蛋白酶酶切,获得抗菌肽LL-37-Melittin。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S2中,酶切体系为:10×Buffer 5uL,目的片段/载体35uL,水5uL,EcoR I 2.5uL,BamH I 2.5uL,37℃孵育3h。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,连接体系为:10×DNA连接buffer 1uL,酶切后载体2uL,酶切后目的基因片段6uL,T4DNA ligase 1uL,4℃过夜连接。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S5中,将重组表达工程菌株pGJ148-SUMO-LL-37-Melittin/WB800N的阳性单菌落接入含有氯霉素的培养基中过夜培养,按1%的接种量接种至LB培养基中,37℃,220rpm,摇床培养4h,添加终浓度为5%的麦芽糖进行诱导表达24h,12000rpm,离心15min收集胞外上清液作为表达产物。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤S6具体为:将收集的表达产物和Binding Buffer等体积混匀后上柱;适量Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白;使用适量Elution Buffer洗脱,收集洗脱峰,获得纯化后的融合蛋白SUMO-LL-37-Melittin,进行SUMO蛋白酶1酶切,冷冻干燥获得抗菌肽LL-37-Melittin。
10.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,将大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的单菌落接于各自适宜的培养基中,37℃、220rpm,培养过夜,并分别稀释至2×105~7×
105CFU/ml,将步骤S6所得抗菌肽LL-37-Melittin稀释为200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml和0.39μg/ml浓度梯度,将稀释好的大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌三种实验菌液分别滴加到96孔细胞培养板中,每行的1号孔到11号孔中每孔加50μL,12号孔不加实验菌液而加50μL的LB培养基作为阴性对照组,1号孔至10号孔按稀释抗菌肽浓度由大到小的顺序依次加入抗菌肽50μL,在37℃,
150rpm过夜培养,波长为490nm的条件下检测其吸光度。
制备方法
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