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stapled-RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用

阅读：190发布：2020-07-07

专利汇可以提供stapled-RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属药学领域，涉及一种stapled‑RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用。本发明采用装订肽环化技术设计并制备了具备与整合素高结合活性、跨生物膜屏障能力的多功能靶向多肽分子stapled‑RGD，及其修饰的荧光素和药物、高分子载体材料的制备及其在肿瘤影像和靶向治疗用递药系统构建中的应用，结果显示：本发明的stapled‑RGD所携带的模型药物被表达整合素的阳性细胞、肿瘤拟态血管和肿瘤球组织特异性摄取，具有更强的肿瘤靶向和影像功能和亲和生物膜屏障组成细胞的能力；stapled‑RGD修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统可更有效地将所包载模型药物递送至靶组织，显著提高抗肿瘤药效，该stapled‑RGD可介导药物或纳米递药系统跨生物膜屏障、主动寻靶、在肿瘤诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。，下面是stapled-RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种stapled-RGD多肽，其特征在于，通过stapled多肽策略将序列中含精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的RGD多肽组装成环状多肽，具有特异性靶向整合素和穿生物膜效应。
2.按权利要求1所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，其含有连续的精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和一对可通过烯烃加成成环的非天然氨基酸，以及其序列中任何其它氨基酸。
3.按权利要求2所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述含有连续的精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的RGD多肽序列长度为5-10，所述含有一对可通过烯烃加成成环的非天然氨基酸的stapled序列长度为5-10。
4.按权利要求1所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，以共价键与影像物质X连接得到的stapled-RGD-X复合物。用于高表达整合素的实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪。
5.按权利要求4所述的stapled-RGD-X复合物，其特征在于，所述复合物中X是荧光分子Fluorescein和近红外染料分子cy5.5、IR820、DiR。
6.按权利要求1所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，以共价键与抗肿瘤药物Y连接得到的stapled-RGD-Y复合物。用于高表达整合素的实体瘤和脑肿瘤的靶向治疗。
7.按权利要求6所述的stapled-RGD-Y复合物，其特征在于，所述复合物中Y是阿霉素、表阿霉素含酮或醛基的抗肿瘤药物。
8.按权利要求6所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-Y复合物中Y是紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱或长春新碱含羟基或氨基的抗肿瘤药物。
9.按权利要求6所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-Y复合物中Y是硼替佐米含硼酸基团的抗肿瘤药物。
10.按权利要求6所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-Y复合物中Y是p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素的多肽抗肿瘤药物。
11.按权利要求1所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，以共价键与聚乙二醇-Z复合物连接得到stapled-RGD-聚乙二醇-Z复合物。
12.按权利要求11所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-聚乙二醇-Z复合物中Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)。
13.按权利要求12所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-聚乙二醇-磷脂复合物在用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统中的用途。
14.按权利要求12所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的stapled-RGD-聚乙二醇-聚乳酸复合物、stapled-RGD-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、stapled-RGD-聚乙二醇-聚己内酯复合物在用于制备聚合物胶束递药系统、纳米粒递药系统中的用途。
15.按权利要求13、14所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统在用于包载诊断药物，进行高表达整合素的外周实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪中的用途。
16.按权利要求15所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的递药系统所包载诊断药物是5-羧基荧光素5-FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD。
17.按权利要求13、14所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统在用于制备包载抗肿瘤药物及靶向治疗高表达整合素的外周实体瘤和脑肿瘤的药物中的用途。
18.按权利要求17所述的stapled-RGD环肽，其特征在于，所述的递药系统所包载抗肿瘤药物是阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽。

说明书全文

stapled-RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用

技术领域

[0001] 本发明属药学领域，涉及stapled-RGD多肽及其应用，具体涉及stapled-RGD多肽及其在肿瘤靶向递送中的应用，尤其涉及一种具有靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，并且具有跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)和血脑肿瘤屏障(BBTB)的多功能靶向多肽分子，及其修饰的复合物、纳米递药系统及其在外周肿瘤和脑肿瘤的诊断与治疗中的用途。

背景技术

[0002] 据资料显示，肿瘤已是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷。为此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来纳米递药系统得到越来越多的关注。纳米递药系统具有载药量高、体内循环时间长等优势，其可利用肿瘤的EPR效应，能使药物被动地富集于肿瘤部位，但效率较低。

[0003] 近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中。常用的对应配体包括单克隆抗体、多肽、核酸适体、小分子化合物等。配体修饰后的纳米递药系统可通过EPR效应富集于肿瘤部位，再通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现纳米递药系统对肿瘤的主动靶向目标。

[0004] 整合素是一种重要的黏附分子，整合素αVβ3是整合素家族中的重要成员。作为内皮细胞与细胞外基质的桥梁，整合素αVβ3通过调节内皮细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等功能，在肿瘤血管生成、肿瘤生长及转移中发挥重要的作用。整合素αVβ3主要高表达于新生血管内皮细胞和绝大数肿瘤细胞。研究表明，整合素αVβ3不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，也在多种肿瘤细胞上过度表达，包括神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤等。因此，研究靶向整合素及其对纳米递药系统富集肿瘤组织的促进作用，对提高药物的肿瘤治疗效果具有重要价值。RGD肽是一类含有精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)保守序列的多肽，能与整合素αVβ3的特异性结合。整合素αVβ3在肿瘤新生血管和脑胶质瘤细胞上高表达，RGD肽与其特异性结合后，能增强肿瘤组织的摄取和肿瘤内化程度。

[0005] Stapled多肽技术是一种目前广受关注的环肽策略，具有促进多肽药物跨膜转运能力，在线性多肽链特定位点通过适合的非天然氨基酸烯烃加成成环，使其形成稳定的α螺旋结构，增强与目标蛋白结合活性的同时，因其stapled的碳链侧链具有深度穿透、跨生物膜屏障功能，也增加了细胞转运能力。基于此，本申请的发明人，拟提供一种特异性靶向整合素和穿生物膜效应的stapled-RGD环肽及其在肿瘤靶向递送中的应用。将RGD肽经stapled环肽策略修饰得到stapled-RGD，使其同时具有靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，以及肿瘤深度穿透、跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)和血脑肿瘤屏障(BBTB)的多重靶向功能，实现stapled-RGD修饰的复合物、纳米递药系统在肿瘤，特别是脑部肿瘤诊断与治疗中的用途。

发明内容

[0006] 本申请的目的在于提供一种特异性靶向整合素和穿生物膜效应的stapled-RGD环肽及其在肿瘤靶向递送中的应用。尤其涉及一种具有靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，且具有跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)和血脑肿瘤屏障(BBTB)的多功能靶向多肽分子，及其修饰的复合物、递药系统在外周肿瘤、脑部肿瘤的诊断与治疗中的用途。

[0007] 本发明中，将RGD肽经stapled环肽策略修饰得到stapled-RGD，使其同时具有靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，以及肿瘤深度穿透、跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)和血脑肿瘤屏障(BBTB)的多重靶向功能，实现stapled-RGD修饰的复合物、纳米递药系统在肿瘤，特别是脑部肿瘤诊断与治疗中的用途。

[0008] 本发明采用stapled环肽策略，设计并制备了stapled-RGD环肽，所设计的和连接半胱氨酸的stapled-RGD，可以共价键修饰在含马来酰亚胺功能基团的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于stapled-RGD修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统的构建。

[0009] 本发明中，stapled-RGD修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇，阿霉素、表阿霉素，喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新碱，硼替唑米、卡非佐米，p53激活肽如PMI、sPMI和DPMI等，蜂毒肽，蝎毒肽等抗肿瘤药物；也可包载荧光物质，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD等。

[0010] 本发明中，stapled-RGD修饰药物包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及药物硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及药物p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)等的多肽-药物复合物。

[0011] 本发明中的stapled-RGD可介导药物或纳米递药系统靶向整合素高表达的细胞及其组织，对肿瘤组织穿透能力强，且具有跨生物膜屏障的能力，特别是跨血脑屏障(BBB)和血脑肿瘤屏障(BBTB)能力，可用于外周肿瘤、脑部肿瘤的靶向诊断和治疗。

[0012] 本发明提供了stapled-RGD的制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊断和治疗的物质基础。本发明的试验结果表明：stapled-RGD与整合素蛋白的亲和性强，在模型动物体内具有很好的肿瘤组织靶向能力和影像效果；与c(RGDyK)修饰的纳米递药系统相比，stapled-RGD修饰的纳米递药系统显示出了更好的肿瘤靶向性能、肿瘤组织穿透能力，更好的脑部靶向和更强的抗肿瘤效果。

[0013] 更具体的，本发明中公开了：

[0014] 1.stapled-RGD(sRGD)及其荧光标记物(sRGD-FAM)的合成

[0015] 采用stapled多肽技术，采用固相合成方法制备stapled-RGD环肽(sRGD)，通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了sRGD-FAM；同法制备c(RGDyK)环肽(cRGD)及其荧光素标记物(cRGD-FAM)。通过HPLC、MS表征其结构。

[0016] 2.sRGD亲和性评价

[0017] 采用表面等离子共振法评价sRGD和cRGD与两种受体蛋白的结合能力，比较sRGD-FAM和cRGD-FAM对整合素蛋白高表达的细胞(如：脐静脉内皮细胞HUVEC)、模型肿瘤细胞(如：脑胶质瘤细胞U87)和模型生物膜屏障细胞(如：脑毛细管内皮细胞bEnd.3)的体外靶向性，比较体外肿瘤拟态血管模型和肿瘤球对sRGD-FAM和cRGD-FAM的摄取能力。

[0018] 3.sRGD对药物修饰

[0019] 连接半胱氨酸后的sRGD与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物；

[0020] 连接半胱氨酸后的sRGD与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物；

[0021] sRGD通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物；

[0022] sRGD通过固相合成直接与多肽药物缩合制成融合多肽，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。

[0023] 4.sRGD-PEG-PLA、sRGD-PEG-DSPE、sRGD-PEG-PLGA合成

[0024] 通过sRGD上的游离巯基与Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLGA所含马来酰亚胺的反应实现sRGD-PEG-PLA、sRGD-PEG-PLA、sRGD-PEG-DSPE、sRGD-PEG-PLGA的合成，并进行纯化和冻干。

[0025] 5.sRGD-PEG-PLA、sRGD-PEG-DSPE、sRGD-PEG-PLGA纳米递药系统制备[0026] 称取一定量的sRGD-PEG-PLA或sRGD-PEG-PLGA或sRGD-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如紫杉醇、阿霉素、p53激活肽sPMI)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得sRGD-PEG-PLA或sRGD-PEG-PLGA聚合物胶束或纳米粒递药系统、sRGD-PEG-DSPE聚合物胶束递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径；

[0027] 称取一定量的sRGD-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA、磷脂、胆固醇和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、蜂毒肽)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得sRGD-PEG-DSPE聚合物圆盘递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径；

[0028] 称取一定量的sRGD-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA、磷脂、胆固醇和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、p53激活肽PMI)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得sRGD-PEG-DSPE脂质体递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径。

[0029] 6.sRGD修饰的纳米递药系统体内肿瘤靶向性和跨生物膜屏障能力评价[0030] 通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉分别注射sRGD修饰的纳米递药系统、cRGD修饰的纳米递药系统和对照组mPEG化的纳米递药系统，比较不同递药系统在各时间点的肿瘤内分布；

[0031] 通过正常小鼠(如昆明种，约20g)，尾静脉注射sRGD修饰的纳米递药系统、cRGD修饰的纳米递药系统和对照的mPEG化纳米递药系统，比较不同递药系统在各时间点的脑组织分布。

[0032] 7.sRGD修饰的纳米递药系统的体内抗肿瘤效果评价

[0033] 通过荷U87脑原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射sRGD修饰的纳米递药系统、cRGD修饰的纳米递药系统、mPEG化纳米递药系统、游离药物和生理盐水，以模型裸鼠的平均生存时间和肿瘤组织细胞凋亡为指标评价不同sRGD修饰的纳米递药系统的体内抗肿瘤效果。

[0034] 本发明采用装订肽环化技术设计并制备了具备与整合素高结合活性、跨生物膜屏障能力的多功能靶向多肽分子stapled-RGD，并提供了stapled-RGD修饰的荧光素和药物、高分子载体材料的制备及其在肿瘤影像和靶向治疗用递药系统构建中的应用。本发明经试验结果显示：所述的stapled-RGD所携带的模型药物被表达整合素的阳性细胞(如肿瘤细胞、脐静脉内皮细胞)、肿瘤拟态血管和肿瘤球组织特异性摄取，具有更强的肿瘤靶向和影像功能；具有亲和生物膜屏障组成细胞(如血脑屏障内皮细胞)的能力；stapled-RGD修饰的高分子载体材料所构建的纳米递药系统(如脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等)可更有效地将所包载模型药物递送至靶组织(如肿瘤新生血管、拟态血管、肿瘤组织，脑组织)，显著提高抗肿瘤药效。

[0035] 本发明的stapled-RGD可介导药物或纳米递药系统跨生物膜屏障、主动寻靶、在肿瘤诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。附图说明

[0036] 图1、sRGD的HPLC和ESI-MS图谱，

[0037] 其中的色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：5％B～65％B30min；流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测：UV 214nm。ESI-MS：sRGD：1070.5道尔顿；与理论分子量相符合。

[0038] 图2、sRGD-FAM的HPLC和ESI-MS图谱，

[0039] 其中的色谱方法同上，保留时间：14.3min。ESI-MS：1498.6道尔顿，与理论分子量相符合。

[0040] 图3、sRGD-PEG-PLA的1H-NMR图谱，

[0041] 其中的Mal-PEG-PLA的核磁图谱于6.7ppm显示出马来酰亚胺峰，而sRGD-PEG-PLA的核磁图谱中该峰消失，显示Mal-PEGP-PLA中的马来酰亚胺基团已反应完全。

[0042] 图4、sRGD与整合素蛋白结合能力，

[0043] 其中的表面等离子共振结果显示，sRGD能特异性结合整合素αVβ3蛋白，结合常数为17.8μM；cRGD与整合素αVβ3蛋白的结合常数为45.4μM。提示sRGD多肽与整合素αVβ3蛋白的结合能力是cRGD多肽的2.55倍。

[0044] 图5、脑胶质瘤细胞U87对荧光素标记多肽的摄取，

[0045] 其中，与U87细胞作用3h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果表明，U87细胞对sRGD和cRGD的摄取程度没有明显差异。

[0046] 图6、脐静脉内皮细胞HUVEC对荧光素标记多肽的摄取，

[0047] 其中，与HUVEC细胞作用3h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果表明，HUVEC细胞对sRGD的摄取程度明显高于cRGD。

[0048] 图7、HUVEC新生血管体外模型对荧光素标记多肽的摄取，

[0049] 其中显示了sRGD-FAM、cRGD-FAM和FAM分别与HUVEC新生血管体外模型作用4h后的荧光显微镜照片，可见HUVEC新生血管体外模型对sRGD的摄取程度明显高于cRGD。

[0050] 图8、脑毛细血管内皮细胞bEnd.3细胞对对荧光素标记多肽的摄取，

[0051] 其中显示，与bEnd.3细胞作用3h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果表明，bEnd.3细胞对sRGD的摄取程度明显高于cRGD。

[0052] 图9、载近红外荧光染料DiR的胶束递药系统脑组织分布，

[0053] 其中显示sRGD-PEG-PLA/DiR和cRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统在1h和4h后的脑组织分布，表明，sRGD-PEG-PLA胶束递药系统在脑部荧光分布显著高于cRGD-PEG-PLA胶束，提示sRGD可促进纳米递药系统跨血脑屏障(BBB)。

[0054] 图10、载近红外荧光染料DiR的胶束递药系统对原位脑胶质瘤靶向性，[0055] 其中显示sRGD-PEG-PLA/DiR、cRGD-PEG-PLA/DiR和mPEG-PLA/DiR胶束递药系统在荷脑胶质瘤原位肿瘤模型鼠的体内分布。在考察的时间内，sRGD-PEG-PLA胶束递药系统在脑部荧光分布显著高于cRGD-PEG-PLA胶束和mPEG-PLA胶束。提示sRGD可促进纳米递药系统跨BBB和血脑肿瘤屏障(BBTB)靶向至脑胶质瘤。

[0056] 图11、载紫杉醇的胶束递药系统透射电镜表征，

[0057] 其中显示sRGD-PEG-PLA/紫杉醇、cRGD-PEG-PLA/紫杉醇和mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统的透射电镜，各组胶束大小和形态均无显著差异，粒径范围在30-40nm。标尺为50μm。

[0058] 图12、载紫杉醇的胶束递药系统体外抗U87细胞活性曲线，

[0059] 其中显示sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统对U87细胞的IC50为3.09nM，相比cRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束(IC50＝7.08nM)、mPEG-PLA/紫杉醇(IC50＝19.5nM)胶束和泰素组(IC50＝23.4nM)，药效更佳。体外药效结果显示，sRGD能够介导胶束递药系统有效递送紫杉醇入胞，发挥其抑制肿瘤细胞生长的活性。

[0060] 图13、载紫杉醇的胶束递药系统体内抗原位脑胶质瘤药效，

[0061] 其中显示sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、cRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、泰素组和生理盐水组的平均生存时间分别为39.5天、29天、25天、24天和23.5天，相比生理盐水组、泰素组和mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组，sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组显著延长了模型鼠的生存时间(p<0.001)；
相比cRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组，sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组也显著延长原位脑胶质瘤模型鼠的生存时间(p＝0.02)。

[0062] 图14、TUNEL染色结果，其中，

[0063] 图A为sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、cRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、泰素组和生理盐水组促进脑胶质瘤凋亡的TUNEL染色照片，其中凋亡的阳性细胞被染成绿色；图B为凋亡阳性率的统计结果，与cRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统组、泰素组和生理盐水组相比，sRGD-PEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统能显著促进肿瘤组织的凋亡。

具体实施方式

[0064] 通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

[0065] 实施例1 制备sRGD、sRGD-FAM和sRGD-抗肿瘤药物复合物、sRGD-PEG-PLA[0066] 1.制备sRGD

[0067] 采用固相合成法，制备了氨基酸序列为c(XRGDX)GSSGC的环形stapled RGD多肽(sRGD)。其中，X＝R8/S8或R5/S5，两个X通过Grubbs催化剂催化烯烃复分解反应连接；

[0068] 将Rink-Amide-MBHA树脂用20％哌啶N,N-二甲基甲酰胺(DMF)脱保护15min，两次，将Fmoc保护氨基酸溶解在0.45M的HBTU和HoBt(溶剂为DMF)中，室温反应45min，DMF洗涤，20％哌啶脱除Fmoc保护，按照氨基酸序列依次反应。对于特殊氨基酸R8/S5，氨基酸和HBTU、HoBt量减半，反应时间延长至2h。序列反应完成后，通过10mM Grubbs一代催化剂(溶剂为1,
2-二氯乙烷)催化烯烃复分解反应2h，两次。反应完成后，用20％的哌啶DMF溶液脱除Fmoc保护基，醋酐乙酰化氨基端15min，两次。完成后，用三氟乙酸切割液(TFA/H2O/TIS＝95％:
2.5％:2.5％)将多肽从树脂上切割下来2h，乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。HPLC和ESI-MS结果如附图1所示，sRGD的纯度为95％，分子量为1070.5道尔顿，与理论分子量相符；

[0069] 2.制备sRGD-FAM

[0070] 通过sRGD-SH的巯基与荧光素的马来酰亚胺的加成反应，合成sRGD-FAM。将多肽sRGD与马来酰亚胺荧光素(1.2倍过量)溶解于少量DMF中，加1％体积DIEA，反应2h，高效液相监测反应，制备液相纯化，ESI-MS质谱表征。结果如附图2所示，sRGD的纯度为97％，分子量为1498.6道尔顿，与理论分子量相符；

[0071] 3.制备sRGD-抗肿瘤药物复合物

[0072] 以sRGD-阿霉素复合物制备作为sRGD连接含酮或醛基药物的实施例。9.4mg巯基化sRGD多肽溶于磷酸盐3mL缓冲液(0.1mM，pH7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于4℃搅拌20min。加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用C18制备柱进行分离(色谱柱：waters X bridge 19×300mm；流动相：A纯水，B乙腈；洗脱方法：100％A～100％B线性梯度)，收集相应组分，冷冻干燥得sRGD-阿霉素复合物；

[0073] 以sRGD-紫杉醇复合物作为sRGD以二硫键连接药物的实施例。200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0～5℃，先后加入39.99mg DCC及60.4mg 3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜。反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1～15:1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物。紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在
5mL DMF中，1.5倍摩尔量的sRGD-Cys溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至巯基多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相制备冻干得多肽-紫杉醇复合物；

[0074] 以sRGD-硼替佐咪复合物作为sRGD氮端修饰药物的实施例。依照sRGD的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h。树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得多肽-多巴胺衍生物。在pH7.4的缓冲液中，多肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得多肽-硼替佐咪复合物；

[0075] 以sRGD-p53激活肽PMI复合物作sRGD融合多肽药物的实施例。直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定sRGD-PMI多肽序列后，按与制备SRGD相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得sRGD-PMI融合多肽；

[0076] 4.制备sRGD-PEG-PLA

[0077] 通过多肽的游离巯基与Mal-PEG-PLA所含马来酰亚胺的反应实现膜材料的合成。将40mg Mal-PEG-PLA溶解在5mL乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入3mL PBS(pH8.0，0.2M)在37℃水化形成胶束。8h内加入9.6mg sRGD-SH并反应过夜，HPLC检测反应。过量的sRGD-SH通过透析除去，冻干备用；1H-NMR表征，如附图3所示。

[0078] 实施例2 sRGD与整合素蛋白结合活性试验

[0079] 测定仪器为Biacore T100型表面等离子共振仪，缓冲液为PBS，测定温度恒定为25℃。将整合素αVβ3蛋白固定在芯片上，采用直接法测定sRGD和cRGD与整合素αVβ3蛋白的结合常数，测定分两步：

[0080] (1)制备芯片：芯片表面经EDC/NHS活化后，加入整合素αVβ3蛋白与之反应，反应结束后洗去未连接上的整合素αVβ3蛋白并检测其连接量；

[0081] (2)测定与计算：采用PBS缓冲液配制不同浓度的sRGD多肽进样检测。仪器测定出不同sRGD多肽浓度下的结合响应值(单位为RU)，根据方程Y＝Bmax×X/(Kd+X)非线性回归计算其结合常数。其中X为sRGD多肽浓度(nM)，Y为结合响应值(RU)，Bmax为最大结合响应值(RU)；

[0082] 按同样操作对cRGD多肽与整合素αvβ3蛋白的结合常数进行测定；

[0083] 结果如图4所示，提示sRGD与cRGD一样也具有特异性结合整合素αvβ3蛋白的功能。

[0084] 实施例3 sRGD的体外细胞靶向性验证

[0085] 1.sRGD-FAM对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性试验

[0086] 取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的sRGD-FAM、cRGD-FAM、及FAM溶液；将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图5A；另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图5B所示；

[0087] 2.sRGD-FAM对人脐静脉内皮细胞HUVEC的体外靶向性试验

[0088] 取对数生长期的单层培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的sRGD-FAM、cRGD-FAM、及FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片见附图6A；另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图6B所示；

[0089] 3.sRGD-FAM对HUVEC体外新生血管模型的体外靶向性试验

[0090] 取24孔培养板每孔加入50μL基质胶，平铺于24孔板内，37℃培养箱内孵育30min待其凝固。0.25％胰酶消化HUVEC细胞，用含10％FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h后血管样结构形成。用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的sRGD-FAM、cRGD-FAM、及FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液；用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，荧光显微镜观察，照片如图7所示；

[0091] 4.sRGD-FAM对人脑毛细血管内皮细胞bEnd.3的体外靶向性试验

[0092] 取对数生长期的单层培养的人脑毛细血管内皮细胞(bEnd.3细胞)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的sRGD-FAM、cRGD-FAM、及FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h，吸弃上清液。用PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察，细胞内化照片如图8A所示；另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图8B所示。

[0093] 实施例 4sRGD修饰的纳米递药系统体内跨血脑屏障能力验证

[0094] 小白鼠(体重约25g)尾静脉分别注射sRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统和cRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统，分别在1h和4h用乙醚麻醉，生理盐水心脏灌流，4％多聚甲醛固定，取各脑组织和各主要脏器组织器官(心、肝、脾、肺和肾)，通过活体成像观察，如图9所示，在脑组织分布中，sRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统荧光强度显著大于cRGD-PEG-PLA/DiR胶束，说明sRGD可介导胶束递药系统穿透血脑屏障，蓄积于脑组织内。

[0095] 实施例5 sRGD修饰的纳米递药系统体内肿瘤靶向性验证

[0096] 建立原位脑胶质瘤模型鼠：取对数生长期的U87细胞，每只裸小鼠接种5×105个细胞(分散于5μL PBS缓冲液中)。裸小鼠麻醉后，用脑立体定位仪固定，细胞接种于纹状体右部(前囟前0.6mm，侧1.8mm，深3mm)。定期观察裸小鼠状态；

[0097] 裸鼠接种肿瘤细胞后第5天进行试验，尾静脉分别注射sRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统、cRGD-PEG-PLA/DiR胶束递药系统和mPEG-PLA/DiR胶束递药系统，于注射后8h活体成像仪摄像记录DiR荧光体内分布。然后心脏灌流，取荷瘤脑组织和心、肝、脾、肺、肾组织于活体成像仪成像，如图10所示，在考察的时间内，sRGD-PEG-PLA胶束递药系统在脑肿瘤组织荧光分布显著高于cRGD-PEG-PLA胶束和mPEG-PLA胶束。提示其可促进包载药物跨血脑屏障(BBB)、血脑肿瘤屏障(BBTB)向脑胶质瘤靶向递送。

[0098] 实施例6 载药sRGD修饰纳米递药系统体外药效学试验

[0099] 1.载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统的制备及表征

[0100] 称取1mg sRGD-PEG-PLA，9mg mPEG-PLA和2mg紫杉醇，溶解在2mL乙腈中，37℃水浴，减压(～0.085MPa)蒸干，成膜，室温真空干燥过夜，加入2mL生理盐水水化，CL-4B柱层析除去游离模型药物，制得包载紫杉醇的sRGD-PEG-PLA胶束递药系统，4℃避光保存，备用；负染色电镜法观察胶束形态(如图11所示)；

[0101] 2.载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统的体外药效试验

[0102] 以4.0×103个/孔将U87细胞接种于96孔板，24h后，将培养液吸出，加入200μL一系列浓度的sRGD-PEG-PLA/紫杉醇、cRGD-PEG-PLA/紫杉醇和mPEG-PLA/紫杉醇胶束和紫杉醇，共培养72h，后加入MTT溶液继续培养4h，弃去培养液，加入150μL DMSO，振荡至紫色颗粒溶解，用酶标仪在590nm处测定吸光度值。采用MTT法测定细胞存活率，计算细胞存活率和半数致死剂量(如图12所示)。

[0103] 实施例7 载药sRGD修饰纳米递药系统体内药效学试验

[0104] 1.载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统体内药效学试验

[0105] sRGD-PEG-PLA(1mg)与PEG-PLA(19mg)溶解在3mL乙腈中，加入4mg紫杉醇，减压成膜2h，水化，过G-50柱子除去游离紫杉醇，制备得到包载紫杉醇的sRGD修饰的胶束递药系统，同法制备cRGD-PEG-PLA和mPEG-PLA载紫杉醇的胶束递药系统；原位胶质瘤模型鼠尾静脉分别注射生理盐水、泰素、sRGD-PEG-PLA/紫杉醇、cRGD-PEG-PLA/紫杉醇和mPEG-PLA/紫杉醇胶束递药系统各100μL。紫杉醇制剂的给药剂量为6mg/kg，分别在肿瘤种植后第5、7、9、11和13天给药，记录裸鼠的生存时间，裸鼠生存曲线如图13所示，与其他组别相比，载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间；

[0106] 2.载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统促凋亡试验

[0107] 原位脑胶质瘤模型鼠在给药完成后的第14天，处死取出荷瘤脑组织进行固定，作冰冻切片，通过TUNEL法检测脑肿瘤凋亡情况。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡程度。阳性结果标记为绿色(FITC染色)，通过共聚焦荧光显微镜观察，结果表明与其他组别相比，载紫杉醇sRGD-PEG-PLA胶束递药系统显著诱导肿瘤细胞凋亡(如图14所示)。

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