一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用
阅读：478发布：2020-07-17
专利汇可以提供一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种仿生siRNA胶束纳米复合物及其制备方法，包括活性成分壳聚糖、阳离子材料、疏 水 长链烷 烃 、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。该siRNA胶束纳米载体充分利用阳离子 聚合物 易于修饰的优点，制备出具有 肿瘤 靶向、内涵体逃逸、胞内触发释放、长循环、高效稳定等多种性能的仿生型非病毒基因载体。，下面是一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用专利的具体信息内容。
1.一种仿生siRNA胶束纳米复合物，其特征在于：包括壳聚糖、阳离子材料、疏水长链醛、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链醛为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体；所述的壳聚糖的分子量为50000～200000；所述的阳离子材料为精氨酸、组氨酸或赖氨酸；所述的靶向配体为脱氧氨基葡萄糖、叶酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽或表皮细胞生长因子；
所述的PEG的分子量为1500～10000；所述的疏水长链醛为正丁醛、己醛、辛醛、癸醛或十二烷基醛；所述穿内涵体小肽为HA2、L2、蜂毒肽或E5。
2.权利要求1所述的仿生siRNA胶束纳米复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)胶束亲水外壳的构建：
1.1壳聚糖骨架上修饰羧基：将邻苯二甲酸酐溶于体积比为19:1的DMF/H2O溶液中，搅拌后按邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比为5～1:1加入壳聚糖，加热反应得到氨基保护的壳聚糖，氨基保护的壳聚糖单元体与溴代乙酸乙酯按摩尔比为1:1～5反应；
1.2 PEG-靶向配体复合物的制备：一端带有CHO的PEG与靶向配体按摩尔比为1:1～5混合，采用DCC/NHS体系进行催化羧基，形成酰胺键，得到CHO-PEG-靶向配体的复合物进一步与水合肼以摩尔比1:1～20反应，得到含腙键的PEG-配体复合物；
1.3将修饰了羧基的壳聚糖采用DCC/NHS体系进行活化后，按壳聚糖单元体与含腙键的PEG-配体复合物摩尔比为1～10:1反应，反应产物与水合肼以摩尔比1:3将产物中保护氨基的壳聚糖脱保护，得到壳聚糖-PEG-靶向配体溶液；
1.4穿内涵体小肽的修饰：选用EDC/NHS体系将小肽羧基活化后，以壳聚糖单元体与小肽的摩尔比为1:0.2～2加入到壳聚糖-PEG-靶向配体溶液中；
2)胶束疏水核心的构建：
2.1 Boc-L-赖氨酸与疏水长链醛按摩尔比1:3反应，搅拌过夜后再加入硼氢化钠反应后，用乙醚进行萃取分离，将反应产物溶于体积比7:3的二氯甲烷/三氟乙酸体系脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护；
2.2赖氨酸与长链醛的反应产物与带正电荷的氨基酸反应：按带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比1:1.2:1.5用EDC/NHS体系活化后，将步骤2.1产物与活化的带正电荷的氨基酸溶液按摩尔比为1:1～5反应过夜，加入足量乙酸乙酯萃取分离；
3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束：
将疏水核心用DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，按疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:0.5～3加入化学修饰壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳，反应12小时后透析，在水溶液中自组装成胶束。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1.1中邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比为3:1，氨基保护的壳聚糖单元体与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1.2中PEG与靶向配体的摩尔比为
1:2，PEG与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，所述的CHO-PEG-靶向配体复合物与水合肼的摩尔比为1:10。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1.3中所述的活化条件为修饰了羧基的壳聚糖单元体与DCC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，所述的壳聚糖单元体与含腙键的PEG-配体复合物摩尔比为2～5:1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2.2中赖氨酸与长链醛的反应产物与带正电荷的氨基酸的摩尔比为1:1.5。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3)中疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:1。
8.权利要求1所述的仿生siRNA胶束纳米复合物作为药物载体的应用。
一种仿生siRNA胶束纳米复合物及应用
技术领域
背景技术
[0002] 病毒是目前基因治疗领域应用最多的一种核酸药物载体，其转染效率高，但存在着制备困难、目的基因容量小、靶向特异性差，以及生物安全性等问题。特别是1998年美国宾州大学人类基因治疗中心发生一例使用腺病毒基因治疗导致死亡的病例后，人们对人体内使用病毒载体的安全性提出了质疑。尽管如此，病毒载体细胞外稳定存在，细胞内解组装且动态转染的特点依然为人工合成非病毒基因载体的设计提供了很好的启示。依据仿生原理，人工合成的非病毒基因载体也可以通过组装功能基团，响应外界环境的刺激，改变自身的空间构象，达到类似病毒的动态、精密、高效的转染效果。
[0003] 但到目前为止，非病毒基因载体的制备还存在以下几方面的问题：
[0006] 3)大多数的非病毒基因载体带正电荷，这大大增加了载体的生物毒性，不利于体内的应用。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种具备主动靶向、内涵体逃逸、触发释药、长循环、安全稳定等多种性能的仿生型siRNA胶束纳米复合物。
[0008] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0009] 一种仿生siRNA胶束纳米复合物，包括活性成分壳聚糖、阳离子材料、疏水长链烷烃、靶向配体和穿内涵体小肽，所述的复合物为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。该siRNA胶束纳米载体充分利用阳离子聚合物易于修饰的优点，制备出具有肿瘤靶向、内涵体逃逸、胞内触发释放、长循环、高效稳定等多种性能的仿生型非病毒基因载体。
[0010] 所述的壳聚糖的分子量优选50000～200000；所述的阳离子材料优选精氨酸(Arginine，Arg)、组氨酸(Histidine，His)、赖氨酸(Lysine，Lys)带正电荷的氨基酸；所述的靶向配体优选脱氧氨基葡萄糖(DG)、叶酸(FA)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)或表皮细胞生长因子(EGF)；所述的PEG的分子量优选1500～10000；所述的疏水长链烷烃优选正丁醛、己醛、辛醛、癸醛或十二烷基醛；所述的具有内涵体逃逸功能的小肽优选HA2、L2、蜂毒肽(Melittin，MEL)、E5。
[0011] 本发明siRNA胶束纳米复合物通过以下方法制备：
[0012] 1)胶束亲水外壳的构建：
[0013] 1.1壳聚糖骨架上修饰羧基：将邻苯二甲酸酐溶于DMF/H2O溶液中，搅拌后加入将壳聚糖，加热反应得到氨基保护的壳聚糖，与溴代乙酸乙酯反应。
[0014] 1.2PEG-配体复合物的制备：一端带有CHO的PEG与肿瘤靶向配体采用DCC/NHS体系进行催化羧基，形成酰胺键，得到CHO-PEG-配体的复合物进一步与水合肼反应，得到含腙键的PEG-配体复合物。
[0015] 1.3将修饰了羧基的壳聚糖采用DCC/NHS体系进行活化后，按摩尔比为1～10:1与含腙键的PEG-配体复合物反应，用水合肼将产物中保护氨基的壳聚糖脱保护，反应产物与水合肼的摩尔比为1:3，得到壳聚糖-PEG-肿瘤配体溶液。
[0016] 1.4穿内涵体小肽的修饰：选用EDC/NHS体系将小肽羧基活化后，加入到壳聚糖-PEG-肿瘤配体溶液中。
[0017] 2)胶束疏水核心的构建
[0018] 2.1Boc-L-赖氨酸与疏水长链烷烃按摩尔比1:3反应，搅拌过夜后再加入硼氢化钠反应后，用乙醚进行萃取分离，将反应产物溶于体积比7:3的二氯甲烷/三氟乙酸体系脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护。
[0019] 2.2赖氨酸与长链烷烃的反应产物与带正电荷的氨基酸反应：按带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比1:1.2:1.5用EDC/NHS体系活化后，将步骤2.1产物与活化的带正电荷的氨基酸溶液按摩尔比为1:1～5反应过夜，加入足量乙酸乙酯萃取分离。
[0020] 3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0021] 将疏水核心用DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，按疏水核心与壳聚糖的摩尔比为1:0.5～3加入化学修饰壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳，反应12小时后透析，在水溶液中自组装成胶束。
[0022] 本发明步骤1.1中DMF与H2O的体积比为19:1，邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比为5～1:1，优选为3:1，氨基保护的壳聚糖与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:1～5，优选为1:2。
[0023] 本发明步骤1.2中PEG与靶向配体的摩尔比为1:1～5，优选为1:2，所述的羧基与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，所述的CHO-PEG-配体复合物与水合肼的摩尔比为1:1～20，优选1:10。
[0024] 本发明步骤1.3中所述的活化条件为羧基与DCC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，所述的壳聚糖与PEG-配体复合物(含腙键)的摩尔比为2～5:1。
[0025] 本发明步骤1.4中小肽与EDC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，壳聚糖与小肽的摩尔比为1:0.2～2，优选0.7。
[0026] 本发明步骤2.2中赖氨酸与长链烷烃的反应产物与带正电荷的氨基酸的摩尔比为1:1.5。
[0027] 本发明步骤(3)中疏水核心与EDC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.5，疏水核心与壳聚糖的摩尔比1:1。
[0028] 本发明所述的复合物用于药物载体的用途。
[0029] 本发明的有益效果为：
[0030] 1)本项目将肿瘤靶向配体与穿内涵体肽共同修饰在siRNA纳米载体的表面，从而制备出具有肿瘤靶向摄取、内涵体逃逸等功能的仿病毒基因载体。该载体基因转染效率高，同时生物相容性好，解决了传统基因载体安全性能差、转染效率低的问题。
[0031] 2)在本项目设计的复合纳米载体中，细胞内siRNA的释放是一个智能的过程，可以通过细胞内低pH环境诱导。因此与传统的siRNA载体相比，siRNA在细胞内能更快更容易地从载体中释放，因而也具有更强的基因沉默的作用。
[0032] 3)本项目构建的siRNA载体核心是由阳离子聚合物壳聚糖、带正电荷的氨基酸与疏水基团共同组建的。与传统的非病毒载体相比，本项目构建的载体核心稳定性更强，并且增加了载体与siRNA之间的静电作用，更有利于siRNA的浓缩。附图说明
[0033] 图1为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的构建示意图；
[0034] 图2为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的粒径分布图；
[0035] 图3为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的Zeta电位图；
[0036] 图4为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的透射电镜示意图；
[0037] 图5为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的琼脂糖凝胶电泳图；
[0038] 图6为本发明制备的仿生型siRNA自组装胶束纳米粒的细胞转染图。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0040] 如图1所示，本发明原理为以壳聚糖为骨架，阳离子材料和疏水长链烷烃为核心，靶向配体和穿内涵体小肽通过PEG、腙键共价修饰的仿生型siRNA胶束纳米载体。
[0041] 实施例1
[0042] 1)胶束亲水外壳的构建：
[0043] ①壳聚糖骨架上修饰羧基：首先进行壳聚糖的氨基保护。将邻苯二甲酸酐(1380mg)溶于15ml DMF/H2O(DMF与H2O的体积比优选95:5)溶液中，搅拌10分钟后将壳聚糖(500mg)加入到上述溶液中(邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比3:1)，加热至120度反应10小时。然后将上述反应液透析三天，旋干得到氨基保护的壳聚糖。然后将氨基保护的壳聚糖(300mg)跟溴代乙酸乙酯反应。首先将氨基保护的壳聚糖溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴加溴代乙酸乙酯(450mg)到上述反应液中(氨基保护的壳聚糖单元体与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:2.5)，常温反应过夜。然后将上述反应液透析三天，旋干备用。
[0044] ②PEG-RGD复合物的制备：将CHO-PEG-COOH(300mg)溶于5ml DMF溶液后，与肿瘤靶向肽RGD(113.22mg)反应(PEG与RGD的摩尔比为1:1.2)，采用DCC/NHS体系进行催化，PEG与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应6小时。然后将上述溶液透析，旋干。得到的CHO-PEG-RGD复合物(170mg)进一步与水合肼反应形成腙键，首先将CHO-PEG-RGD复合物溶于5ml无水乙醇溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼(33mg)，CHO-PEG-RGD复合物与水合肼的摩尔比为1:10，常温反应过夜后旋干水合肼，得到PEG-RGD复合物(含腙键)。
[0045] ③修饰了羧基的壳聚糖骨架与PEG-RGD复合物(含腙键)反应：将修饰了羧基的壳聚糖(200mg)溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后，加入DCC、NHS，壳聚糖单元体与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，室温条件下搅拌过夜，离心去除副产物DCU，加入PEG-RGD复合物(含腙键)(314.5mg)到上述反应液中(壳聚糖单元体与PEG-RGD复合物(含腙键)的摩尔比为5:1)，常温反应过夜后将产物透析，旋干。然后将产物中壳聚糖上的氨基脱保护：将216.4mg壳聚糖与PEG-RGD复合物的连接产物溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼
11mg(反应产物与水合肼的摩尔比优选1:3)，常温反应过夜后透析，旋干处理。
11mg(反应产物与水合肼的摩尔比优选1:3)，常温反应过夜后透析，旋干处理。
[0046] ④穿内涵体融合肽HA2的修饰：首先要将氨基保护的HA2溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后加入EDC、NHS，HA2与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5。然后将上述壳聚糖与PEG-RGD的连接产物加入到上述溶液中(壳聚糖单元体与HA2的摩尔比为1:0.7)，常温反应数小时后透析，旋干。
[0047] 2)胶束疏水核心的构建
[0048] ①Boc-L-赖氨酸与辛醛的反应：将100mg Boc-L-赖氨酸溶于甲醇溶液中，然后缓慢滴加157.4mg辛醛到上述溶液中，Boc-L-赖氨酸与烷烃链的摩尔比为1:3。搅拌过夜后再加入一定量的46mg硼氢化钠，反应6小时后停止反应。往反应液中加入乙醚溶液搅拌均匀后用分液漏斗进行萃取分离，最后浓缩有机层，旋干。将Boc-L-赖氨酸与辛醛的反应产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸的体系(体积比优选7:3)，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护，旋干三氟乙酸后备用。
[0049] ②赖氨酸-辛醛复合物与精氨酸反应：将200mg精氨酸采用EDC/NHS体系活化，带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应过夜。将132mg赖氨酸-辛醛复合物与上述活化的精氨酸溶液混合(赖氨酸-辛醛复合物与精氨酸的摩尔比为1:1.5)，反应12小时。最后加入足量乙酸乙酯萃取，收集有机层，旋干备用。
[0050] 3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0051] 将壳聚糖胶束的亲水外壳跟疏水核心连：将核心用5ml DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，核心与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，将壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳加入到上述活化液中(疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:1)，反应12小时，生成的产物透析后在水溶液中可自组装成胶束。
[0052] 实施例2
[0053] 1)胶束亲水外壳的构建：
[0054] ①壳聚糖骨架上修饰羧基：首先进行壳聚糖的氨基保护。将邻苯二甲酸酐(1380mg)溶于15ml DMF/H2O(DMF与H2O的体积比优选95:5)溶液中，搅拌10分钟后将壳聚糖(500mg)加入到上述溶液中(邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比3:1)，加热至120度反应10小时。然后将上述反应液透析三天，旋干得到氨基保护的壳聚糖。然后将氨基保护的壳聚糖(300mg)跟溴代乙酸乙酯反应。首先将氨基保护的壳聚糖溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴加溴代乙酸乙酯(450mg)到上述反应液中(氨基保护的壳聚糖单元体与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:2.5)，常温反应过夜。然后将上述反应液透析三天，旋干备用。
[0055] ②PEG-DG复合物的制备：将CHO-PEG-COOH(300mg)溶于5ml DMF溶液后，与肿瘤靶向配体氨基葡萄糖DG(54mg)反应(PEG与DG的摩尔比为1:2)，采用DCC/NHS体系进行催化，PEG与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应6小时。然后将上述溶液透析，旋干。得到的CHO-PEG-DG复合物(142.6mg)进一步与水合肼反应形成腙键，首先将CHO-PEG-DG复合物溶于5ml无水乙醇溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼(33mg)，CHO-PEG-DG复合物与水合肼的摩尔比为1:10，常温反应过夜，然后旋干其中的水合肼，得到PEG-DG复合物(含腙键)。
[0056] ③修饰了羧基的壳聚糖骨架与PEG-DG复合物(含腙键)反应：将修饰了羧基的壳聚糖(200mg)溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后，加入DCC、NHS，壳聚糖单元体与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，室温条件下搅拌过夜，离心去除副产物DCU，加入PEG-DG复合物(含腙键)(261.9mg)到上述反应液中(壳聚糖单元体与PEG-DG复合物(含腙键)的摩尔比为5:1)，常温反应过夜后将产物透析，旋干。然后将产物中氨基保护的壳聚糖脱保护：将184.1mg产物溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼11mg(反应产物与水合肼的摩尔比优选1:3)，常温反应过夜后透析，旋干处理。
[0057] ④穿内涵体小肽L2的修饰：将氨基保护的L2溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后加入EDC、NHS，小肽与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5。然后将上述壳聚糖-PEG-DG反应产物加入到上述溶液中(壳聚糖单元体与L2的摩尔比为1:0.2～2，优选0.7)，常温反应数小时后透析，旋干。
[0058] 2)胶束疏水核心的构建
[0059] ①Boc-L-赖氨酸与癸醛的反应：将100mg Boc-L-赖氨酸溶于甲醇溶液中，然后缓慢滴加192.2mg癸醛到上述溶液中，Boc-L-赖氨酸与烷烃链的摩尔比为1:3。搅拌过夜后再加入一定量的46mg硼氢化钠，反应6小时后停止反应。往反应液中加入乙醚溶液搅拌均匀后用分液漏斗进行萃取分离，最后浓缩有机层，旋干。将Boc-L-赖氨酸与辛醛的反应产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸的体系(体积比优选7:3)，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护，旋干三氟乙酸后备用。
[0060] ②赖氨酸-癸醛复合物与组氨酸反应：将组氨酸采用EDC/NHS体系活化，带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应过夜。将赖氨酸与癸醛的反应产物与上述活化的组氨酸溶液混合(赖氨酸与癸醛的反应产物与组氨酸的摩尔比为1:1.5)，反应12小时。最后加入足量乙酸乙酯进行萃取，收集有机层，旋干。
[0061] 3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0062] 将壳聚糖胶束的亲水外壳跟疏水核心连：将核心用5ml DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，核心与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，将壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳加入到上述活化液中(疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:1.5)，反应12小时，生成的产物透析后在水溶液中可自组装成胶束。
[0063] 实施例3
[0064] 1)胶束亲水外壳的构建：
[0065] ①壳聚糖骨架上修饰羧基：首先进行壳聚糖的氨基保护。将邻苯二甲酸酐(1380mg)溶于15ml DMF/H2O(DMF与H2O的体积比优选95:5)溶液中，搅拌10分钟后将壳聚糖(500mg)加入到上述溶液中(邻苯二甲酸酐与壳聚糖单元体的摩尔比3:1)，加热至120度反应10小时。然后将上述反应液透析三天，旋干得到氨基保护的壳聚糖。然后将氨基保护的壳聚糖(300mg)跟溴代乙酸乙酯反应。首先将氨基保护的壳聚糖溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴加溴代乙酸乙酯(450mg)到上述反应液中(氨基保护的壳聚糖单元体与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:2.5)，常温反应过夜。然后将上述反应液透析三天，旋干备用。
[0066] ②PEG-FA复合物的制备：将CHO-PEG-NH2(300mg)溶于5mlDMF溶液后，与肿瘤靶向肽FA(132.4mg)反应(PEG与FA的摩尔比为1:2)，采用DCC/NHS体系进行催化，PEG与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应6小时。然后将上述溶液透析，旋干。得到的CHO-PEG-FA复合物(170mg)进一步与水合肼反应形成腙键，首先将CHO-PEG-FA复合物溶于5ml无水乙醇溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼(33mg)，CHO-PEG-FA复合物与水合肼的摩尔比为1:10，常温反应过夜，然后旋干其中的水合肼，得到PEG-FA复合物(含腙键)。
[0067] ③修饰了羧基的壳聚糖骨架与PEG-FA复合物(含腙键)反应：将修饰了羧基的壳聚糖(200mg)溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后，加入DCC、NHS，壳聚糖单元体与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，室温条件下搅拌过夜，离心去除副产物DCU，加入PEG-FA复合物(含腙键)(293.2mg)到上述反应液中(壳聚糖单元体与PEG-FA复合物(含腙键)的摩尔比为5:1)，常温反应过夜后将产物透析，旋干。然后将产物中氨基保护的壳聚糖脱保护：将203.3mg壳聚糖与PEG-FA复合物的连接产物溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼11mg(反应产物与水合肼的摩尔比优选1:3)，常温反应过夜后透析，旋干处理。
[0068] ④穿内涵体肽MEL的修饰：将MEL溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后加入EDC、NHS，小肽与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5。然后将上述壳聚糖-PEG-FA反应产物加入到上述溶液中(壳聚糖单元体与MEL的摩尔比为1:0.2～2，优选0.7)，常温反应数小时后透析，旋干。
[0069] 2)胶束疏水核心的构建
[0070] ①Boc-L-赖氨酸与十二烷基醛的反应：将100mg Boc-L-赖氨酸溶于甲醇溶液中，然后缓慢滴加226.7mg十二烷基醛到上述溶液中，Boc-L-赖氨酸与烷烃链的摩尔比为1:3。搅拌过夜后再加入一定量的46mg硼氢化钠，反应6小时后停止反应。往反应液中加入乙醚溶液搅拌均匀后用分液漏斗进行萃取分离，最后浓缩有机层，旋干。将Boc-L-赖氨酸与十二烷基醛的反应产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸的体系(体积比优选7:3)，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护，旋干三氟乙酸后备用。
[0071] ②赖氨酸-十二烷基醛复合物与赖氨酸反应：将赖氨酸采用EDC/NHS体系活化，带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应过夜。将赖氨酸-十二烷基醛复合物与上述活化的赖氨酸溶液混合(赖氨酸-十二烷基醛复合物与赖氨酸的摩尔比为1:1.5)，反应12小时。最后加入足量乙酸乙酯进行萃取，收集有机层，旋干。
[0072] 3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0073] 将壳聚糖胶束的亲水外壳跟疏水核心连：将核心用5ml DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，核心与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，将化学修饰壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳加入到上述活化液中(疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:1)，反应12小时后透析后在水溶液中自组装成胶束。
[0074] 实施例4
[0075] 1)胶束亲水外壳的构建：
[0076] ①壳聚糖骨架上修饰羧基：首先进行壳聚糖的氨基保护。将邻苯二甲酸酐(1380mg)溶于15ml DMF/H2O(DMF与H2O的体积比优选95:5)溶液中，搅拌10分钟后将壳聚糖(500mg)加入到上述溶液中(邻苯二甲酸酐与壳聚糖的摩尔比3:1)，加热至120度反应10小时。然后将上述反应液透析三天，旋干得到氨基保护的壳聚糖。然后将氨基保护的壳聚糖(300mg)跟溴代乙酸乙酯反应。首先将氨基保护的壳聚糖溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴加溴代乙酸乙酯(450mg)到上述反应液中(氨基保护的壳聚糖与溴代乙酸乙酯的摩尔比为1:2.5)，常温反应过夜。然后将上述反应液透析三天，旋干备用。
[0077] ②PEG-RGD复合物的制备：将CHO-PEG-COOH(300mg)溶于5ml DMF溶液后，与肿瘤靶向肽RGD(3mg)反应(PEG与RGD的摩尔比为1:2)，采用DCC/NHS体系进行催化，PEG与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应6小时。然后将上述溶液透析，旋干。得到的CHO-PEG-RGD复合物(170mg)进一步与水合肼反应形成腙键，首先将CHO-PEG-RGD复合物溶于5ml无水乙醇溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼(33mg)，CHO-PEG-RGD复合物与水合肼的摩尔比为1:10，常温反应过夜，然后旋干其中的水合肼，得到PEG-RGD复合物(含腙键)。
[0078] ③修饰了羧基的壳聚糖骨架与PEG-RGD复合物(含腙键)反应：将修饰了羧基的壳聚糖(200mg)溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后，加入DCC、NHS，壳聚糖与DCC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，室温条件下搅拌过夜，离心去除副产物DCU，加入PEG-RGD复合物(含腙键)(314.5mg)到上述反应液中(壳聚糖与PEG-配体复合物(含腙键)的摩尔比为5:1)，常温反应过夜后将产物透析，旋干。然后将产物中氨基保护的壳聚糖脱保护：将216.4mg壳聚糖与PEG-RGD复合物的连接产物溶于10ml DMF溶液中，搅拌数分钟后缓慢滴入水合肼11mg(反应产物与水合肼的摩尔比优选1:3)，常温反应过夜后透析，旋干处理。
[0079] ④穿内涵体肽E5的修饰：将E5溶于5ml DMF溶液中，搅拌10分钟后加入EDC、NHS，小肽与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5。然后将上述壳聚糖-PEG-RGD复合物加入到上述溶液中(壳聚糖与E5的摩尔比为1:0.2～2，优选1.2)，常温反应数小时后透析，旋干。
[0080] 2)胶束疏水核心的构建
[0081] ①Boc-L-赖氨酸与正丁醛的反应：将100mg Boc-L-赖氨酸溶于甲醇溶液中，然后缓慢滴加88.7mg正丁醛到上述溶液中，Boc-L-赖氨酸与烷烃链的摩尔比为1:3。搅拌过夜后再加入一定量的46mg硼氢化钠，反应6小时后停止反应。往反应液中加入乙醚溶液搅拌均匀后用分液漏斗进行萃取分离，最后浓缩有机层，旋干。将Boc-L-赖氨酸与正丁醛的反应产物溶于二氯甲烷/三氟乙酸的体系(体积比优选7:3)，室温搅拌过夜，脱去L-赖氨酸氨基上的Boc保护，旋干三氟乙酸后备用。
[0082] ②赖氨酸-正丁醛复合物与精氨酸反应：将精氨酸采用EDC/NHS体系活化，带正电荷的氨基酸与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，常温反应过夜。将赖氨酸与辛醛的反应产物与上述活化的精氨酸溶液混合(赖氨酸与长链烷烃的反应产物与精氨酸的摩尔比为1:1.5)，反应12小时。最后加入足量乙酸乙酯进行萃取，收集有机层，旋干。
[0083] 3)亲水疏水修饰壳聚糖自组装成胶束
[0084] 将壳聚糖胶束的亲水外壳跟疏水核心连：将核心用5ml DMF溶液溶解，然后使用EDC/NHS体系活化过夜，核心与EDC、NHS的摩尔比优选1:1.2:1.5，将上述化学修饰壳聚糖骨架得到的胶束亲水外壳加入到上述活化液中(疏水核心与壳聚糖单元体的摩尔比为1:2)，反应12小时后透析，最后在水溶液中自组装成胶束。
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