一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法
专利汇可以提供一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 蜂毒 肽反序类似物及其制备方法，所述 蜂毒肽 反序类似物的 氨 基酸序列为RKRKRWSILAPLG。蜂毒肽反序类似物的制备方法包括取料、反应、纯化、质谱分析鉴定等步骤。本发明蜂毒肽反序类似物及其制备方法提高抑菌活性。，下面是一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG。
2. 根据权利要求1所述蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物为采用固相化学合成技术合成的多肽产品。
3. 一种蜂毒肽反序类似物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
（1）将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin 两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为
10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得肽树脂；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到蜂毒肽反序类似物；
（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin 两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为
10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得肽树脂；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到蜂毒肽反序类似物；
（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
具体实施方式
菌活性和稳定性均优于单一蜂毒肽分子。该反序肽经过杀菌活性检测，对Gram 菌、Gram菌及真菌等均有明显的抑制作用，而且溶血活性很小。
（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF（Dimethyl Fumarate，富马酸二甲酯）冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；
（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；
（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；
（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；
（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；
（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；
（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin 两次；
（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；
（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为
10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得Peptide-Resin（肽树脂）；
（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；
（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；
（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；
（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1（体积比）的比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；
（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；
（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；
（17） NH4HCO3 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH4HCO3（pH8.2）溶液，按多肽终浓度
0.3mg/ml 的比例加入NH4HCO3溶液至粗肽中，室温搅拌过夜。之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；
（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定（具体如后面的“二、 蜂毒肽（Melittin）反序类似物的反向高效液相色谱纯化及质谱鉴定”所述），并得到蜂毒肽（Melittin）反序类似物；
（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽（Melittin）反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。
时间(min) 流速(ml/min) A﹪B﹪曲线
﹡ 1 95 5 ﹡
28 1 5 95 6
29 1 5 95 6
三、蜂毒肽（Melittin）反序类似物的抗菌活性检测
3.1蜂毒肽（Melittin）反序类似物的抗菌活性测定：
琼脂培养基在水浴中加热熔化，冷却至50℃左右，用无菌操作法吸取60 μL的生测菌（OD600＝0.3），加入20 mL琼脂培养基中，迅速混匀，倾倒入直径为9 cm的无菌平面皿内，厚度约为1.5 mm，水平放置待凝固。在琼脂上打直径为2.7 mm的圆孔，分别在孔中加入已纯化的蜂毒肽（Melittin）反序类似物样品各10μL，用无菌水做阴性对照，用Amp做阳性对照。
加样后将平皿放入4℃冰箱中，待样品充分扩散到琼脂后，将平皿倒置于37℃培养过夜，次日观察结果如图2所示。本试验中供试细菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
金黄色葡萄球菌 0.5
大肠杆菌K12D31 1
铜绿假单胞菌 1
猪伤寒沙门氏菌 1
溶血葡萄球菌 2
大肠埃希菌 4
腐生葡萄球菌 4
沃氏葡萄球菌 5
尿肠球菌（耐药） 5
摩根氏菌 40
创伤弧菌 150
3.3溶血活性实验
将人血红细胞用PBS缓冲液(35mmol/L磷酸盐缓冲液，含150 mmol/L NaCl，pH=7.4)洗4次后悬浮在PBS缓冲液中，得血红细胞悬浮液(体积分数2.5% )。将反序肽溶解在PBS缓冲液中，配成储备液，取不同体积的多肽储备液于0.5 mL 2.5%血红细胞悬浮液中，补加PBS缓冲液至终体积1 mL，摇匀，于37℃保温60min后，以4000r/min离心10 min，取上清夜在414 nm下比色，以血红细胞悬浮在PBS缓冲液中为空白，以血红细胞悬浮在TritonX
100中为100%溶血。经试验检测，制备的反序肽无明显溶血活性。
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