一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用
阅读：327发布：2020-05-27
专利汇可以提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用，在细胞膜颗粒上表达VSVG；细胞膜颗粒包裹 生物 大分子和细胞器；细胞膜颗粒不具有细胞核。制备方法：先用表达 水 疱性口炎病毒 蛋白质 粒对Ad293细胞瞬时 转染 ；转染48h后用胰酶消化细胞，再离心3min；将所得细胞悬液置于针筒，并将针筒安装到已安置聚 碳 酸酯膜的针头式 过滤器 中，推动针管使细胞悬液从过滤器一边推出到另外一边，获得表达VSVG的细胞膜颗粒。表达融膜蛋白的细胞膜颗粒应用于传递生物大分子和细胞器中。本发明膜颗粒颗粒更大，能包裹生物大分子和线粒体，在功能上传递蛋白质和线粒体。不添加额外化学 试剂 ，有效维持VSVG活性，提高膜颗粒进入内体后释放线粒体效率，从而提高线粒体转递效率。，下面是一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用专利的具体信息内容。
1.一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，其特征在于，所述细胞膜颗粒在细胞膜上表达水疱性口炎病毒糖蛋白；所述细胞膜颗粒包裹生物大分子和细胞器；所述细胞膜颗粒不具有细胞核。
2.根据权利要求1所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，其特征在于，所述细胞膜颗粒包裹蛋白质和线粒体。
3.根据权利要求1所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，其特征在于，所述细胞膜颗粒大小为3µm~5µm。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用表达水疱性口炎病毒蛋白质粒对Ad293细胞进行瞬时转染；
（2）转染48h后，用胰酶消化细胞，离心3min后得到悬浮的表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞；
（3）将步骤（2）所得细胞悬液置于针筒，并将针筒安装到已安置聚碳酸酯膜的针头式过滤器中，推动针管使细胞悬液从过滤器一边推出到另外一边，获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞膜颗粒。
5.根据权利要求4所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）包括以下步骤：
（11）将1mg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒加入离心管中，加入50μl无血清培养液将混匀；
（12）将3ml Polyjet转染试剂和50ml的无血清培养液加入另一离心管中，轻轻摇匀；
然后加入步骤（12）所得溶液中；得到转染混合液，室温静置5-10min；
（13）吸去培养液，并补加1ml新鲜无血清培养液，把转染混合液马上加入到Ad293细胞，轻轻摇匀；
（14）12h后更换新的培养液。
6.根据权利要求5所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，其特征在于，每
6
1x10的Ad293细胞，用1mg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒转染。
7.根据权利要求4所述的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，其特征在于，所述聚碳酸酯膜孔径大小为3µm；所述过滤器可换膜。
8.一种如权利要求1-3任一项所述表达融膜蛋白的细胞膜颗粒在传递生物大分子和细胞器中的应用。
一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用
技术领域
背景技术
[0002] 研究发现，某些疾病，例如苯丙酮尿症，由于缺乏相关的蛋白酶，导致了患者出现异常症状；而另外一些疾病，例如神经退行性阿尔茨海默病，俗称老人痴呆症，与线粒体功能异常有莫大的关系。虽然，利用药物投递系统来实现治疗的目的已经取得重大的进展，然而，这些系统还不能有效地解决现有问题。
[0003] 目前已经建立了多种药物投递系统，例如，纳米颗粒可以通过包装或者共轭结合的方式实现治疗性蛋白质和多肽的传递，但是，复杂的制作流程、药物活性的下降、和难以突破内体的障碍无不限制着这种系统的广泛应用；另外，蛋白的传递还可以通过外来体（exosome）和微泡（microvesicle）实现，从而克服操作流程繁琐的问题；而通过水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）纳米膜颗粒和利用逆转录基质蛋白Gag得到的VSV-G类病毒体来传递目的蛋白，克服了内体的障碍并提高了传递的效率。然而VSV-G纳米膜颗粒太小，不能包裹更大的物质，例如是线粒体，线粒体的大小可以到微米级。
[0004] 与生物大分子传递系统相比，细胞器传递系统进展十分缓慢和有限。研究发现，线粒体可以自发地通过细胞膜纳米管道（membrane nanotubles）在细胞之间传递，而且能够恢复线粒体缺陷型细胞的有氧呼吸功能；线粒体显微注射也可以实现线粒体传递，但是严格的操作要求和特殊的仪器设备不适用于批量制备；另外，利用放线菌素D（actinomycin D）可以使细胞功能性“去核”，成为含有线粒体的胞质体，但是有些细胞不受药物影响，仍然保留核功能；最近有研究报道，利用细胞穿膜肽（CPP）也可以有效传递体外分离的线粒体。但是传递效率比较低。
[0005] 由于目前传递生物大分子和细胞器的投递系统存在传递效率低，费时费力和生物安全性等问题，因此，建立一种高效传递生物大分子和细胞器的方法，对于治疗多种疾病有重大的意义。
发明内容
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，可实现生物大分子和细胞器的有效传递。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，所述细胞膜颗粒在细胞膜上表达水疱性口炎病毒糖蛋白；所述细胞膜颗粒包裹生物大分子和细胞器；所述细胞膜颗粒不具有细胞核、细胞核DNA和核蛋白。水疱性口炎病毒糖蛋白具有融膜功能。包裹生物大分子包括mRNA，microRNA，线粒体DNA，细胞质蛋白，细胞膜蛋白等生物大分子。
[0008] 进一步的，所述细胞膜颗粒包裹蛋白质和线粒体。能够有效包裹线粒体，并且传递到靶细胞中发挥功能。
[0009] 进一步的，所述细胞膜颗粒大小为3µm~5µm。在传递物质过程中，纳米颗粒的大小是比较适合传递物质的，例如是蛋白质和一些小分子药物，而颗粒越大，传递的效率会有所下降。但是，纳米颗粒大小的缺点是不能包裹更大的物质，例如是线粒体，线粒体的大小可以到微米级，为了解决这样的问题，必须要制备更加大的颗粒，才能有效包裹线粒体。本发明的细胞膜颗粒为3-5μm，虽然在传递效率上有所降低，但是可以包装更多的物质，同时保证一定的传递效率；而且在膜颗粒上包裹了水疱性口炎病毒蛋白融膜蛋白，提高了膜颗粒进入内体后释放线粒体的效率，从而大大地提高了线粒体的转递效率，解决了包裹线粒体的问题，实现高效快速的细胞器的传递。
[0010] 本发明的第二目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）用表达水疱性口炎病毒蛋白质粒对Ad293细胞进行瞬时转染；
（2）转染48h后，用胰酶消化细胞，离心3min后得到悬浮的表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞；
（3）将步骤（2）所得细胞悬液置于针筒，并将针筒安装到已安置聚碳酸酯膜的针头式过滤器中，推动针管使细胞悬液从过滤器一边推出到另外一边，获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞膜颗粒。
（2）转染48h后，用胰酶消化细胞，离心3min后得到悬浮的表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞；
（3）将步骤（2）所得细胞悬液置于针筒，并将针筒安装到已安置聚碳酸酯膜的针头式过滤器中，推动针管使细胞悬液从过滤器一边推出到另外一边，获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞膜颗粒。
[0012] 进一步的，所述步骤（1）包括以下步骤：（11）将1mg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒加入离心管中，加入50μl无血清培养液将混匀；
（12）将3ml Polyjet转染试剂和50ml的无血清培养液加入另一离心管中，轻轻摇匀；
然后加入步骤（12）所得溶液中；得到转染混合液，室温静置5-10min；
（13）吸去培养液，并补加1ml新鲜无血清培养液，把转染混合液马上加入到Ad293细胞，轻轻摇匀；
（14）12h后更换新的培养液。
（12）将3ml Polyjet转染试剂和50ml的无血清培养液加入另一离心管中，轻轻摇匀；
然后加入步骤（12）所得溶液中；得到转染混合液，室温静置5-10min；
（13）吸去培养液，并补加1ml新鲜无血清培养液，把转染混合液马上加入到Ad293细胞，轻轻摇匀；
（14）12h后更换新的培养液。
[0013] Polyjet转染试剂是一种可生物降解的高分子聚合物的DNA转染试剂，PolyJet试剂能在电泳期间低浓度固定脱氧核糖核酸迁移，并在5分钟内形成转染复合体。能够在转染聚合物细胞内吞后迅速并完全降解聚合物，这样可大大降低细胞毒性。
[0014] 进一步的，每1x106的Ad293细胞，用1mg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒转染。
[0015] 进一步的，所述聚碳酸酯膜孔径大小为3µm；所述过滤器为25mm可换膜针头式过滤器。聚碳酸酯膜上面布满直径大小为3µm的圆，有利于形成形态完整、大小均匀的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒。
[0016] 本发明的第三目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒在传递生物大分子和细胞器中的应用。将目的生物大分子和细胞器传递到生物大分子和细胞器缺陷的细胞中。表达融膜蛋白的细胞膜颗粒能够有效包裹线粒体，并且传递到靶细胞中发挥功能。可以把目的生物大分子和细胞器传递到生物大分子和细胞器缺陷的细胞中，恢复细胞的正常功能。
[0017] 与现有技术相比，本发明的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒颗粒更大，包裹和传递更多的物质，不但能包裹生物大分子和线粒体，而且在功能上能够传递蛋白质和线粒体，并使传递的物质行使正常的功能。制备时不需要添加额外化学试剂，有效维持了水疱性口炎病毒蛋白的生物活性，制备时采用的PolyJet转染试剂能在电泳期间低浓度固定脱氧核糖核酸迁移，并在5分钟内形成转染复合体，所形成的聚合物能够在转染聚合物细胞内吞后迅速并完全降解聚合物，这样可大大降低细胞毒性。制备得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的大小均匀、形态完整。本发明首次用25mm可换膜针头式过滤器、注射器和孔径大小为3 µm的聚碳酸酯膜快速方便制备直径大小约为3 µm的水疱性口炎病毒蛋白质粒细胞膜膜颗粒，这种膜颗粒可以包裹蛋白质和线粒体，降低蛋白质线粒体在体外传递过程中的降解，虽然颗粒比纳米颗粒更大，但可以包装更多的物质，同时保证一定的传递效率；而且在膜颗粒上包裹了融膜蛋白水疱性口炎病毒蛋白，提高了膜颗粒进入内体后释放线粒体的效率，从而大大地提高了线粒体的转递效率，这不但为研究生物大分子和细胞器缺陷相关的疾病奠定了基础，而且对于研究细胞核质关系有重要意义。附图说明
[0018] 图1为本发明表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法示意图；图2为本发明表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的表征图，其中293/EGFP，293/Mito，和293/H2B分别表示表达胞质绿色荧光蛋白的293细胞，表达线粒体绿色荧光蛋白的293细胞和表达细胞核H2B蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白的293细胞，最左边一排图为细胞拼合图，其它三排从左到右依次为细胞膜颗粒的明场、绿色荧光蛋白和拼合图；
图3为本发明pLP-VSVG（表达水疱性口炎病毒蛋白）和pDsRed-Expressed（表达红色荧光蛋白的质粒）共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与Ad293靶细胞孵育后的荧光鉴定图，a为孵育后5h的荧光照片，b为孵育后12h的荧光照片；
图4为本发明pLP-VSVG和pDsRed-Expressed共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的效率统计图；
图5为本发明pLP-VSVG和pCMV （CMC启动子）-CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DsRed/loxP2/DsRed（Loxp系统的报告基因）受体细胞孵育48h后的荧光照片，从左到右分别为DsRed（红色荧光蛋白）、EGFP（绿色荧光蛋白阳性）和拼合图；
图6为本发明pLP-VSVG和pCMV-CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DsRed/loxP2/DsRed受体细胞孵育48h后EGFP细胞与DsRed阴性细胞的比例统计鉴定图；
图7为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP（表达能进入线粒体的绿色荧光蛋白）共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与靶细胞孵育后5h和12h的荧光照片图8为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒传递的效率统计图；
图9为本发明去除溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0（线粒体缺陷型）与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体形态荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、线粒体染色试剂和拼合图；
图10为本发明去除溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体膜电位荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、绿色、红色和拼合图；
图11为本发明去掉溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行细胞的数量定量分析图；
图12为本发明去掉溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体膜电位的定量分析图；
其中图片中R代表红色，G代表绿色，B代表蓝色。
图3为本发明pLP-VSVG（表达水疱性口炎病毒蛋白）和pDsRed-Expressed（表达红色荧光蛋白的质粒）共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与Ad293靶细胞孵育后的荧光鉴定图，a为孵育后5h的荧光照片，b为孵育后12h的荧光照片；
图4为本发明pLP-VSVG和pDsRed-Expressed共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的效率统计图；
图5为本发明pLP-VSVG和pCMV （CMC启动子）-CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DsRed/loxP2/DsRed（Loxp系统的报告基因）受体细胞孵育48h后的荧光照片，从左到右分别为DsRed（红色荧光蛋白）、EGFP（绿色荧光蛋白阳性）和拼合图；
图6为本发明pLP-VSVG和pCMV-CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DsRed/loxP2/DsRed受体细胞孵育48h后EGFP细胞与DsRed阴性细胞的比例统计鉴定图；
图7为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP（表达能进入线粒体的绿色荧光蛋白）共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与靶细胞孵育后5h和12h的荧光照片图8为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒传递的效率统计图；
图9为本发明去除溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0（线粒体缺陷型）与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体形态荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、线粒体染色试剂和拼合图；
图10为本发明去除溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体膜电位荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、绿色、红色和拼合图；
图11为本发明去掉溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行细胞的数量定量分析图；
图12为本发明去掉溴化乙锭（EB）、丙酮酸（pyruvate）、 尿苷（uridine）后，线粒体缺陷型细胞HeLa Rho0与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体膜电位的定量分析图；
其中图片中R代表红色，G代表绿色，B代表蓝色。
具体实施方式
[0019] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
[0021] 制备方法如图1所示：于一个1.5ml离心管中加入1μg的pLP-VSVG质粒，加入50μl无血清培养液，混匀；在新的1.5ml离心管里面加入3μl Polyjet转染试剂和50ml的无血清培养液，并把其加到质粒溶液中去，充分混匀，得到转染混合液，室温静置
5-10min，吸去培养板细胞中的培养液，并补加1ml新鲜培养液，把转染混合液马上加入到细胞，轻轻摇匀。12h后更换新的培养液，48h后消化获得细胞悬液800g离心3min。正常情
6
况下，为了获得更多的细胞，最多可同时转染6x10的细胞，用5ml培养液重悬。
5-10min，吸去培养板细胞中的培养液，并补加1ml新鲜培养液，把转染混合液马上加入到细胞，轻轻摇匀。12h后更换新的培养液，48h后消化获得细胞悬液800g离心3min。正常情
6
况下，为了获得更多的细胞，最多可同时转染6x10的细胞，用5ml培养液重悬。
[0022] 把孔径大小为3µm的聚碳酸酯膜安置在25mm可换膜针头式过滤器中，并将过滤器旋紧，用10ml的注射器吸取细胞悬液于针筒，用力把细胞从过滤器一边推到另外一边，用15ml的离心管收集。
[0023] 再添加5ml的新鲜培养重复上述步骤。
[0024] 收集得到的VSV-G膜颗粒1000g离心10min，轻轻地吸取上清，留下大概100ml的培养液，并轻轻抖动离心管，得到大小相对均一、约为3µm的VSV-G细胞膜颗粒。
[0025] 制备得到的PMVs大小为3µm~5µm，在细胞膜上表达水疱性口炎病毒糖蛋白，包裹生物大分子和细胞器內吞受体细胞，通过低pH值下的膜融合，释放细胞质膜颗粒中的物质可以用于传递生物大分子和细胞器中。将目的生物大分子和细胞器传递到生物大分子和细胞器缺陷的细胞中。
[0026] 实施例2表达融膜蛋白细胞膜颗粒的表征。
[0027] 对Ad293细胞转染分别转染1 ug pEGFP-N1（表达绿色荧光蛋白的质粒），pMito-EGFP，pH2B-EGFP（表达核蛋白H2B和绿色荧光蛋白融合蛋白质粒），转染后48小时，并通过上述实施例1采用的挤膜方式而得到的细胞膜颗粒，在共聚焦显微镜下进行观察。另外还通过DNA分离技术、real-time PCR技术和western blotting等技术进行表征。从转染了pEGFP-N1，pMito-EGFP，pH2B-EGFP的细胞中得到的细胞膜颗粒，这三个质粒分别标记细胞胞质，细胞线粒体和细胞核。从图2可以看出膜颗粒包含线粒体DNA，细胞RNA和miRNA，细胞质蛋白质和膜蛋白质，但不包含细胞核DNA，细胞核蛋白质。因此膜颗粒包裹各种生物大分子和细胞器，但不具有细胞核。
[0028] 实施例3表达融膜蛋白细胞膜颗粒传递蛋白质的监测和功能验证。
[0029] 用1mg pLP-VSVG 和 1 ug pDsRed-Expressed（表达红色荧光蛋白的质粒）共转染4
Ad293细胞，转染后48h，利用上述实施例1挤膜获得VSV-G细胞膜颗粒，并且加入到1x10 Ad293当中去，5h后消化细胞，放到35mm共聚焦培养皿上，分在在2h和12h用 DAPI染核，并在共聚焦显微镜下观察。用1mg pLP-VSVG和1mg pCMV （CMC启动子）-CreER （Cre重组酶和雌激素受体融合蛋白）共转染Ad293细胞，转染后48h，利用上述挤膜获得VSV-G细胞
4
膜颗粒，并且加入到1x10 pCMV-DsRed/loxP2/DsRed （Cre-Loxp系统的报告基因）受体细胞中，在培养液添加10mM的4-羟基它莫昔芬（4-HT）。48h进行荧光显微镜观察。从图3和图4可以看出孵育5h后，在激光共聚焦显微镜下观察，约40%的细胞呈现红色荧光，而且大概12h，膜颗粒释放蛋白质到靶细胞细胞质上。从图5和图6可以看出PMVs能成功传递CreER融合蛋白，CreER融合蛋白可以从细胞质进入细胞核，并在loxP位点之间进行DNA重组，使受体细胞从红色转为绿色。48h后在荧光显微镜下观察，发现大约18%的细胞在它莫西芬(4-HT)的作用下从红色变为绿色。上述结果可见膜颗粒能成功进入靶细胞，而且进入细胞后，膜颗粒能成功释放红色蛋白质，证明了VSV-G细胞膜颗粒能够有效传递蛋白质并发挥生物学功能。
Ad293细胞，转染后48h，利用上述实施例1挤膜获得VSV-G细胞膜颗粒，并且加入到1x10 Ad293当中去，5h后消化细胞，放到35mm共聚焦培养皿上，分在在2h和12h用 DAPI染核，并在共聚焦显微镜下观察。用1mg pLP-VSVG和1mg pCMV （CMC启动子）-CreER （Cre重组酶和雌激素受体融合蛋白）共转染Ad293细胞，转染后48h，利用上述挤膜获得VSV-G细胞
4
膜颗粒，并且加入到1x10 pCMV-DsRed/loxP2/DsRed （Cre-Loxp系统的报告基因）受体细胞中，在培养液添加10mM的4-羟基它莫昔芬（4-HT）。48h进行荧光显微镜观察。从图3和图4可以看出孵育5h后，在激光共聚焦显微镜下观察，约40%的细胞呈现红色荧光，而且大概12h，膜颗粒释放蛋白质到靶细胞细胞质上。从图5和图6可以看出PMVs能成功传递CreER融合蛋白，CreER融合蛋白可以从细胞质进入细胞核，并在loxP位点之间进行DNA重组，使受体细胞从红色转为绿色。48h后在荧光显微镜下观察，发现大约18%的细胞在它莫西芬(4-HT)的作用下从红色变为绿色。上述结果可见膜颗粒能成功进入靶细胞，而且进入细胞后，膜颗粒能成功释放红色蛋白质，证明了VSV-G细胞膜颗粒能够有效传递蛋白质并发挥生物学功能。
[0030] 实施例4VSV-G膜颗粒传递线粒体的监测和功能验证。
[0031] 用1mg pLP-VSVG和1mg pMito-EGFP（表达能进入线粒体的绿色荧光蛋白）共转染Ad293细胞，转染后48h，利用上述实施例1挤膜获得VSV-G细胞膜颗粒，并且加入到4
1x10 Ad293当中去，5h后消化细胞，放到35mm共聚焦培养皿上，分在在2h和12h用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染核，并在共聚焦显微镜下观察。从图7到图8可以看出孵育5h后，在激光共聚焦显微镜下观察，约20%的细胞呈现绿色荧光，而且大概12小时后，出现了绿色的线粒体结构。
1x10 Ad293当中去，5h后消化细胞，放到35mm共聚焦培养皿上，分在在2h和12h用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染核，并在共聚焦显微镜下观察。从图7到图8可以看出孵育5h后，在激光共聚焦显微镜下观察，约20%的细胞呈现绿色荧光，而且大概12小时后，出现了绿色的线粒体结构。
[0032] 用1mg pLP-VSVG转染Ad293细胞，转染后48h，利用上述实施例1挤膜获得VSV-G4
细胞膜颗粒，并且加入到1x10 HeLa Rho0（线粒体缺陷型）细胞当中去，另外，去掉细胞中的溴化乙锭、丙酮酸、尿苷，在孵育12h后更换新鲜培养。5天后分别用1mM MitoTracker（线粒体染色试剂）和DAPI进行染色，并在共聚焦显微镜下进行观察；另外，为了检测细胞膜电位，用5mg/ml JC-1线（粒体膜电位染色试剂）进行染色，膜电位表示为红色光度值和绿色光度值之间的比值，并用ImageJ 软件进行统计分析。最后，用血球计数板进行细胞数量的统计。从图9到图12可以看出，发现细胞数量比对照组多了一倍，线粒体形态比对照组更加接近于正常细胞，而且细胞线粒体膜电位比对照组多出三倍。实验结果可见膜颗粒能成功进入靶细胞，而且进入细胞后，膜颗粒能成功释放线粒体，线粒体能够在靶细胞中发生复制。上述结果证明了VSV-G细胞膜颗粒能够有效传递线粒体并发挥生物学功能。
细胞膜颗粒，并且加入到1x10 HeLa Rho0（线粒体缺陷型）细胞当中去，另外，去掉细胞中的溴化乙锭、丙酮酸、尿苷，在孵育12h后更换新鲜培养。5天后分别用1mM MitoTracker（线粒体染色试剂）和DAPI进行染色，并在共聚焦显微镜下进行观察；另外，为了检测细胞膜电位，用5mg/ml JC-1线（粒体膜电位染色试剂）进行染色，膜电位表示为红色光度值和绿色光度值之间的比值，并用ImageJ 软件进行统计分析。最后，用血球计数板进行细胞数量的统计。从图9到图12可以看出，发现细胞数量比对照组多了一倍，线粒体形态比对照组更加接近于正常细胞，而且细胞线粒体膜电位比对照组多出三倍。实验结果可见膜颗粒能成功进入靶细胞，而且进入细胞后，膜颗粒能成功释放线粒体，线粒体能够在靶细胞中发生复制。上述结果证明了VSV-G细胞膜颗粒能够有效传递线粒体并发挥生物学功能。
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