本发明的目的是提供一种具有明显利胆作用且具有一定水溶性的可用 于急性胆囊炎、慢性胆囊炎急性发作、急性胆道感染(包括结石性、寄生 虫性)和急慢性肝炎的治疗的化合物及这种化合物的制备方法和用途,以 及这种化合物药学上可接受的盐及其制备方法和用途,如
钾盐、钠盐、钙 盐和镁盐等,以及与碱性氨基酸形成的盐包括赖氨酸盐和精氨酸盐。
本发明具体提供了一种新型的化合物亮菌甲素琥珀酸单酯,化学名为 4-(3-乙酰基-7-羟基-2-
氧代-2H-色烯-5-基)甲氧基-4-氧代丁酸,其结构 式为:
分子式为C16H14O8,分子量为334.28。
同时本发明提供了一种上述亮菌甲素琥珀酸单酯的制备方法,其特征 在于:以亮菌甲素为原料,琥珀酸酐等为酰化剂,在碱存在条件下,于溶 剂中进行酰化反应制得,反应式为:
酰化反应的
温度为25℃~150℃;亮菌甲素与琥珀酸酐用量摩尔比为1∶ 1~5;亮菌甲素与碱用量摩尔比为1∶1~5;所用的碱为
碳酸钾、碳酸钠、
碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钾或氢氧化钠等;所用溶剂为N,N-二甲基甲 酰胺、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲醇、
乙醇等或它们的混合溶剂。
本发明所提供的亮菌甲素琥珀酸单酯具有利胆作用,可用于制备用于急 性胆囊炎、慢性胆囊炎急性发作、急性胆道感染、急慢性肝炎的治疗的药 物。
本发明还提供了上述亮菌甲素琥珀酸单酯的药学上可接受的盐,包括钾 盐、钠盐、钙盐、镁盐、或者与碱性氨基酸形成的盐包括赖氨酸盐和精氨 酸盐。
本发明所提供的上述亮菌甲素琥珀酸单酯的药学上可接受的盐可以采 用如下方法制备,将亮菌甲素琥珀酸单酯与相应的碱进行反应得到;所用 的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、或碱性氨基酸,所用的溶剂为水、乙醇、四 氢呋喃、甲醇、丙
酮等或它们的混合溶剂。
本发明提供的亮菌甲素琥珀酸单酯的药学上可接受的盐同样具有利胆 作用,可以用于制备可用于急性胆囊炎、慢性胆囊炎急性发作、急性胆道 感染、急慢性肝炎的治疗的药物。
最后,本发明提供了一种具有利胆作用的药用组合物,其特征在于: 以亮菌甲素琥珀酸单酯或其药学上可接受的盐为活性成分,与相应的药用 敷料组合制成供口服和静脉给药用的制剂,包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、 口服液以及注射液和冻干粉针剂,单位制剂活性成分的含量为1~50mg。
为解决亮菌甲素水溶性差的问题,本发明采用了前药的药物设计方法, 用琥珀酸酐将其结构中的羟甲基酰化制成琥珀酸单酯,这样可有效改善其 水溶性,制成相应的盐可使水溶性进一步提高,从而有效解决了上述问题。 另外,文献报道亮菌甲素在体内的代谢速度较快(姚勤学,山西医药杂志, 1988,17(1):57-58.),因此需多次给药。转变成前药后可有效地改善其 药代动力学性质,延长在体内的作用时间,从而减少给药次数,可为临床 提供一个新型安全有效的药物。
具体实施方式:
实施例1亮菌甲素琥珀酸单酯的制备(方法1)
将亮菌甲素20g(0.085mol)、无水碳酸钾46.9g(0.34 mol)、乙酸乙酯 300ml和无水N,N-二甲基甲酰胺100ml加入到500ml圆底烧瓶中,油浴 109℃回流1小时。反应液渐有黄色固体析出。将丁二酸酐34g(0.34mol) 加入,反应液中固体部分溶解,回流反应30小时,冷至室温,抽滤,所得固 体用少量乙酸乙酯洗涤,
滤饼溶于适量水中,用10%
盐酸调至PH3.5,搅拌 0.5小时,抽滤得部分产品。浓缩滤液回收乙酸乙酯,浓缩液加水200ml, 用10%盐酸调到PH3.5,搅拌0.5小时,抽滤得部分产品。合并两次所得产 品,室温自然干燥得粗品24g,收率84%。将24g粗品加入到130ml乙酸乙 酯和40ml甲醇的混和溶剂中,加热回流至全溶,缓慢搅拌下降至室温,放 置过夜,析出淡黄色固体,抽滤,
真空50℃干燥4小时得淡黄色粉末状固 体15.6g,mp 173-175℃,收率65%。
ESI-MS:m/z 333[M-1]-
′H-NMR(CD3COCD3,600MHz)δ:2.58(s,3H),2.63(m,2H),2.66(m,2H),
5.44(s,2H),6.76(d,1H),7.00(d,1H),8.63(1,1H)。
13C-NMR(CD3COCD3,600MHz)δ:29.07,29.60,30.29,63.17,102.92,
110.54,115.67,121.01,139.37,144.35,
159.25,159.63,164.04,172.43,173.50,195.17。
亮菌甲素琥珀酸单酯的制备(方法2)
将亮菌甲素2.34g(0.01mol)、碳酸氢钠3.36g(0.04mol)、丁二酸酐4g (0.04mol)、乙酸乙酯30ml和无水N,N-二甲基甲酰胺15ml加入到100ml 圆底烧瓶中,搅拌下油浴109℃回流反应24小时。将反应液浓缩至剩余五 分之一,加入60ml水,抽滤,将滤液用稀盐酸调PH至3-3.5,析出淡黄色 固体,抽滤,水洗滤饼,干燥得产品2.7g,收率80%。
对所得产品进行药理和药效学试验,结果如下:
药理试验(亮菌甲素琥珀酸单酯以代号LMJG表示)
一、急性毒性试验(LD50的测定)
【实验材料及方法】
1.受试药物:LMJG。
2.受试动物:KM小鼠,体重18~20g,40只,雌雄各半,由沈阳药科大学 实验动物中心提供,合格证号码SCXK(辽)2003-008。实验开始前一周接收 动物使其适应环境,对一般体征进行观察,选用健康状况良好的动物供实 验使用。
动物在条件设定为温度22±2℃,湿度55±10%,照明时间为7时至19 时的饲养室饲养,每5只一笼(同性),固体
饲料及饮水自由摄取。
3.给药方法及给药量
采用灌胃方式给药,将药物加到2%羧甲基
纤维素钠溶液中配成 0.05g/ml的悬浊液,以最大给药体积0.4ml/10g给药。
4.观察及检查项目
①一般状态
给药当天频繁观察,以后每天至少观察一次,时间为2周,记录小鼠 死亡情况及一般状态。
②体重及
摄食、摄水量
给药当天及给药后每天测体重、食量、水重。摄食量、摄水量为每笼 饲养的5只小鼠的平均值。
③病理学检查
解剖死亡小鼠,检查其是否有病理学异常。
【实验结果】
1.一般状态及死亡情况
给药后小鼠在10分钟内出现活动减少现象,很快恢复,无见其它异常 情况。40只全部存活。
2.体重及摄食摄水量
小鼠给药后2周内摄食、摄水量正常,体重增加正常,大小便正常, 毛色正常,口、鼻、眼、外
耳等处无异常分泌物,呼吸均匀,反应正常, 活动良好。
3.最大耐受量
由以上结果可知,LMJG的LD50>2g/kg。
[实验评述]
提示LMJG安全、低毒。
二、药效学试验
【实验材料】
1、受试药物:LMJG;亮菌甲素
2、受试动物:健康成年杂种家犬,体重8~15kg,雌雄兼用;SD大鼠,体 重280~300g,雌雄各半。以上动物均由沈阳药科大学实验动物中心提供, 合格证号码SCXK(辽)2003-008。
3、实验
试剂与试药:
戊巴比妥钠:北京化学试剂公司,批号020919。
氯化钠注射液:沈阳志英制药厂产品,批号:06050801
总胆红素
试剂盒:南京建成
生物工程研究所,批号:20060615。
4、实验仪器:
722光栅分光光度计 上海第三分析仪器厂
TG-328A电光分析天平 上海天平仪器厂
T-500型
电子天平 常熟双杰测试仪器厂
100μL微量进样器 宁波市镇海玻璃仪器厂
【实验方法与结果】
1.对胆汁分泌比率的影响
将健康雄性大鼠随机分为五组,每组10只:NS对照组,亮菌甲素组 (30mg/kg),LMJG高剂量组(135mg/kg),中剂量组(45mg/kg)和低剂量组 (15mg/kg)。实验前禁食不禁水12h,实验时
腹腔注射3%戊巴比妥钠(4ml/kg) 进行麻醉后,行腹部手术,在十二指肠降部肠系膜处分离胆管,结扎
乳头 部,向肝脏方向插入1mm的塑料
导管引流并收集1h内胆汁的流量。按10ml/kg 进行十二指肠给药(对照组给等体积的NS),收集给药后1、2、3h的胆汁流 量(用100μL微量进样器测量各大鼠各次所收集的胆汁量并记录),计算 胆汁分泌比率(给药后每1小时胆汁分泌量/给药前1小时胆汁分泌量)。胆汁 分泌增加率(%)=(D-C)/C×100%,D=给药组给药后每1小时胆汁分泌量/给 药组给药前1小时胆汁分泌量,C=对照组给药后每1小时胆汁分泌量/对照 组给药前1小时胆汁分泌量,实验数据均采用student’s t-test进行统计学处理。
实验结果表明,LMJG高、中、低剂量组及亮菌甲素组给药后,肝脏分 泌胆汁量均有明显增加(P<0.01,P<0.05)。LMJG高剂量组在各时间点的 增加率分别为42.1%、40.3%、31.1%,而亮菌甲素组在各时间点的增加率 则为40.2%、33.7%、20.6%,提示LMJG的增加胆汁分泌作用较亮菌甲素 强,维持时间较长。结果见表1。
表1 LMJG对大鼠胆汁分泌比率的影响
组别 剂量 (mg/kg) 观察时间 给药前1小时 (ml) 给药后(h,%) 1 2 3 NS 1.28±0.25 91.5±7.9 82.7±6.9 76.1±6.4 亮菌甲 30 0.91±0.27 128.3±35.9** 110.6±31.8* 91.8±20.0*
素
LMJG 135 0.82±0.25 130.0±33.1** 116.8±31.0** 99.8±21.0** 45 0.97±0.32 126.0±38.2* 106.9±30.1* 85.4±10.9* 15 1.04±0.37 115.8±27.2* 98.8±20.0* 84.9±14.9
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.对胆汁胆红素含量的影响
按照总胆红素试剂盒的方法,于实验终点分别将末次胆汁与给药前的 胆汁于722分光光度计测定胆汁中总胆红素的含量,并计算给药前后胆汁中 总胆红素的比值变化(给药后的胆红素含量/给药前胆红素的含量)。实验数 据均采用student’st-test进行统计学处理。
实验结果表明,LMJG高、中、低剂量组及亮菌甲素组给药后当胆汁 分泌量增加时,单位时间排出的胆红素则有明显增加(P<0.05,P<0.01, P<0.001)。结果见表2。
表2 LMJG对大鼠胆汁胆红素含量的影响( ,n=10)
组别 剂量 (mg/kg) 胆汁中胆红素含量(μmol/L) 胆红素比值 给药前 给药后3h NS 224.2±26.6 234.2±22.9 1.05±0.11 亮菌甲 素 30 245.1±28.31 310.1±41.38*** 1.28±0.22** LMJG 135 235.6±29.79 333.2±42.0*** 1.44±0.27** 45 242.2±25.7 311.7±60.7** 1.29±0.24** 15 251.7±30.26 299.4±32.3*** 1.20±0.17*
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
3.对麻醉犬总胆管末端括约肌紧张度的影响
实验用犬,体重8~15kg,随机分为4组,每组6只:即亮菌甲素组(9mg/kg), LMJG高剂量组(45mg/kg),中剂量组(15mg/kg)和低剂量组(5mg/kg)。 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。开腹,结扎胆囊胆管,引流总胆管内胆汁。 通过总胆管至十二指肠灌流0.9%NaCl溶液,记录单位时间内灌流液流过的 滴数,测定总胆管末端括约肌的紧张度。
实验结果表明,LMJG高、中、低剂量组及亮菌甲素组给药后均可使流 经总胆管末端括约肌的灌流液滴数明显增加,剂量增加,效应增加,持续 时间较长。提示受试药物对总胆管末端括约肌具有松弛效应。结果见表3。
表3 LMJG对麻醉犬总胆管末端括约肌紧张度的影响
组别 剂量 (mg/kg) 灌流液流过滴数 增加率 (%) 给药前20分 给药后20分 钟 钟 亮菌甲素 9 39.8±10.9 110.3±32.5 177.0 LMJG 45 57.2±17.9 162.7±47.6 184.5 15 62.3±20.3 163.2±43.7 161.8 5 44.3±14.9 94.3±18.7 112.8**
注:与亮菌甲素组比较,**P<0.01。
[实验评述]
利胆实验结果提示,LMJG具有显著的利胆作用。LMJG给药后能明显 增加胆汁分泌量,促进胆汁中胆红素的排泄,降低总胆管末端括约肌(奥 狄氏括约肌)的紧张度,且低、中、高剂量之间存在一定的剂量关系。LMJG 中剂量组与亮菌甲素组相比较效果相接近,LMJG高剂量组比亮菌甲素组作 用更强,持续时间更长。
实施例2亮菌甲素琥珀酸单酯钠的制备
将1.67g(5mmol)亮菌甲素琥珀酸单酯溶于60ml甲醇中,搅拌下于室温 加入0.42g(5mmol)碳酸氢钠粉末,室温搅拌20分钟后析出大量黄绿色固体, 继续搅拌反应3小时,抽滤,滤饼用少量甲醇洗涤,真空干燥后得测得黄 绿色粉末状固体1.44g,mp197-198.5℃,收率81%。
实施例3亮菌甲素琥珀酸单酯赖氨酸盐的制备
将1.67g(5mmol)亮菌甲素琥珀酸单酯溶于30ml四氢呋喃中,搅拌下 于室温加入 0.82g(5mmol)赖氨酸,室温下搅拌反应12小时,快速抽滤得淡 黄色固体,立即转入真空干燥器,50℃真空干燥4小时得产品 2.2g,mp 175-177℃,收率90%。
实施例4亮菌甲素琥珀酸单酯注射液的制备
处方亮菌甲素琥珀酸单酯 7.5g
赖氨酸 3.3g
氯化钠 18.0g
注射用水 加至2000
ml
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制成1000支
制备工艺:
称取处方量的氯化钠和赖氨酸,加入1800ml注射用水,搅拌使溶解。 另称取处方量的亮菌甲素琥珀酸单酯,加至上述溶液中搅拌使溶解制成澄 明溶液,加1.8g
活性炭,60℃搅拌
吸附20分钟,过滤脱炭使药液澄明,加 入注射用水至全量,搅拌均匀,0.45m微孔滤
膜过滤,分装于安瓶中每 支2ml,封口,100℃流通
蒸汽灭菌30分钟,即得。
实施例5注射用硫普罗宁赖氨酸的制备
处方:
亮菌甲素琥珀酸单酯 7.5g
赖氨酸 3.3g
甘露醇 100g
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制成1000支
制备工艺:
称取处方量的主药、赖氨酸及甘露醇倒入1800mL注射用水中,搅拌至 全部溶解。加1.8g活性炭,60℃搅拌吸附20分钟,过滤脱炭使药液澄明, 加入注射用水至全量,搅拌均匀,0.22um膜过滤。罐装,冻干,轧盖即可 (2mL/支)。
实施例6亮菌甲素琥珀酸单酯片剂的制备 处方
亮菌甲素琥珀酸单酯 7.5g
乳糖 114g
微晶
纤维素 142g
羧甲基
淀粉钠 24g
硬脂酸镁 5g
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制成 1000片
包衣液处方:
欧巴代(03B28796) 21g
95%乙醇 适量
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制成约430ml
制备工艺
将已过100目筛的辅料与主药过60目筛混合,以95%乙醇制软材,以 18目筛制粒,60℃通
风干燥,以16目筛整粒后与硬酯酸镁混合均匀,打片。
包衣溶液的配制:在适宜容器中加入适量的95%乙醇,开动
搅拌机, 将处方量的欧巴代固体粉末均匀地加入到
旋涡中,同时尽量避免有粉末飘浮 在液体表面,必要时,可以提高转速以保持适当的旋涡,待所有的欧巴代全 部加入后,降低搅拌速度,使旋涡消失,继续搅拌45min,即得。
薄膜包衣片的制备:将片芯置
包衣锅内,保持温度60℃±5℃,进行包 衣,即得。